JPH06500768A - 親脂質性活性物質の取込みにより変性されたリポ蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 親脂質性活性物質の取込により変性されたリボ蛋白質の製造法 本発明は、親脂質性（１ｉｐｏｐｈｉｌｉｃ）活性物質の取込みより変性されな リポ蛋白質を作る方法、ならびに活性成分としてこの方法で変性されなリポ蛋白 質を含む医薬又は化粧品組成物に関する。

医薬研究の現在の目的の一つは、副作用を低減しながら治療効果を高めるために 、標的器官及び／又は細胞に医薬を向けることであることが知られている。この 目的を達成する手段の一つは、医薬のキャリア（つまりベクター）の役割を演じ うる分子、たとえばマクロ分子に医薬を結合すること及びそれを標的器官又は標 的細胞へと特異的に運ぶことより成る。

多数のマクロ分子又は分子組合せ、たとえばリポソーム、ナノカブセル、ＤＮＡ 、レクチン、抗体、及びリポ蛋白質が、生物学的に活性なキャリア物質として既 に用いられ又は提案されている。

リボ蛋白質は、特にリン脂質及び特定の蛋白質（アポリボ蛋白質）を含むエンベ ロープにより囲まれた脂質コアより成る血清蛋白質の重要な一部を成すことが知 られている。

リボ蛋白質は、脂質特にコレステロールを貯めそして運ぶ系である。

リボ蛋白質は、密度により分類されることが知られている。下記のものが区別さ れる。

０．９６未満の密度を持つ粒子であるキロミクロン０．９６〜１．００６０／ｃ ｍ　３の密度をもつ超低密度リボ蛋白質（ＶＬＤＬ） 約１．０１９〜１．０６３の密度をもつ低密度リボ蛋白質（ＬＤＬ） 約１．０６３〜１．２１の密度を持つ高密度リボ蛋白質（ＨＤＬ）。

リボ蛋白質は、アポリボ蛋白質レセグターを持つ種々の細胞に対し著しい親和性 （ｔｒｏｐｉｓｍ　）を持つ、また、ある場合にはリボ蛋白質は、細網内皮系統 中の細胞（食細胞）により捕われうる。

従って、リボ蛋白質は、有用な医薬キャリアでありうることが判る。医薬ベクタ ーとしてリボ蛋白質特にＬＤＬを用いることが既に提案されている（たとえば国 際特許出願Ｐ　ＣＴ　Ｎｏ、１４０８６１０７５４０およびヨーロッパ特許出願 Ｎｏ。

０２７７８４９参照）。

医薬ベクターとして最も研究された低密度リボ蛋白質（ＬＤＬ）は、約２０ｎｎ の直径を持つ球形粒子である。各粒子は、約１５００のコレステロールエステル 分子より成るコア、及びコレステロール、リン脂質及びアポリボ蛋白質（アポリ ボ蛋白質ＢまたはａｐｏＢ）より成るエンベロープを持つ。

哺乳類細胞は、ａｐｏ　Ｂを認識しかっＬＤＬを表面に結合するところのレセプ ターを有する。細胞の膜表面に結合した後、ＬＤＬは、エンドサイトシスによっ て取入れられ、リポソームに運ばれ、そこでそれは細胞の需要とくにコレステロ ール需要を満すように分解される。

もし天然のＬＤＬすなわち化学的に変性されていないＬＤＬが用いられるなら、 ＬＤＬ−医薬複合体は天然のＬＤＬのように挙動する。すなわち、それは血流中 に２〜３日間留まり、ａｐｏ　Ｂレセプターを持つ細胞により認識される（Ｓ、 Ｍ、ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）とＪ、Ｌ、ゴールドスティン（Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ ）　、サイｘ、ンス、２３２．３４−４７．１９８６）、このことは、ａｏｏ　 Ｂレセプターを多く持つガン細胞の場合に特にそうである。

化学的に変性されたリボ蛋白質（アセチレート、アセトアセチレート、オキサイ ド化合物、ラフトシレートなど）は、細網内皮系統内の細胞とくにマクロファー ジにより認識され、捕われることも知られている。ここでもまた、（化学的に変 性された）リボ蛋白質−医薬複合体は、器官中で元の変性されたリボ蛋白質のよ うに挙動し、アセチル化ＬＤＬレセプター（スカベンジャーレセプター）の仲介 によりマクロファージにより捕われる（たとえばＪ、Ｍ。

ショウ（Ｓｈａｗ）ら、グロシーデイングズ　サン　ナショナル　アカデミ−オ プ　サイエンス　ニーニス−ニー（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃ ｉ、　ＵＳＡ）８５巻、６１１２−６１１６ページ、１９８８およびＭ、に、ビ ーステルポック（８１ｊｓｔｅｒｂｏｃｋ）ら、モレキュラー　ファーマコロジ ー、３６．４８４−４８６ページ、１９８９参照）。

生物内で、種々の頭のリボ蛋白質（ＬＤＬ、ＶＬＤＬ、ＨＤＬ及びキロミクロン ）の間でのトリグリセリド、コレステロールのエステル及びリン脂質の転移は、 トランスファー蛋白質として知られる蛋白質により実行され、これはリボ蛋白質 より高い密度を有し、従ってリボ蛋白質の分離後の遠心分離されたヒト又は動物 血漿の残渣中に含まれる。

そのような遠心分離残渣は、ＬＰＤＳ　（リボ蛋白質欠損血清）として知られる 両分を成し、これは特にそれが含むトランスファー蛋白質の特性を有する。これ らトランスファー蛋白質のいくつかは、すでに単離され、記載されている（たと えばＡ、Ｓ、ジャーナギン（Ｊａｒｎａｇｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８４巻、１８５４−５７．１９８７．カド−ら、 Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌ、（ＵＳ）、２６４．ＮＯ，７，４０８２−４０８７ ，１９８９；およびパスティラス（ｅａｓｔ　１ｒａｓ）、およびカルバート（ Ｃａｌｖｅｒｔ　）　、Ｊ、　ＣｈｒｏｍａｔＯｇｒ、　Ｂｉｏｉｅｄ、　Ａｐ ｐｌ、　３８３、Ｎｏ、　１．２７−３４−１９８６参照）。

トランスファー蛋白質は、たとえばＶＬＤＬからＬＤＬへのトリグリセリドの転 移を与えることができる。それはまた、人工的トリグリセリドエマルジョンから ＬＤＬへトリグリセリドを転移させうる（たとえばＥ、グラノ（Ｇｒａｎｏｔ） ら、Ｂｉｏｃｈｅｎｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｏｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、　８３３ ．３０８−３１５．１９８５参照）。

ＬＰＤＳに含まれる蛋白質は、トリグリセリド及びコレステロールエステル以外 の親脂質性の生物学的活性物質、特に非生理的剤を、そのような親脂質性物質を 含む脂質エマルジョンからリボ蛋白質へとインビトロに転移させることができ、 これら物質はリボ蛋白質中に取込まれることが令兄い出された。

リボ蛋白質への生物学的活性物質の取込みのこのプロセスは、有用である。なぜ なら、それは、望ましくない物質使用の故にＬＤＬ生物活性の変化を回避するか らである。

従って、本発明の目的は、トリグリセリド及びコレステロールエステル以外の少 くとも一つの親脂質性活性物質の取込みにより変性されたリボ蛋白質を作る方法 において、水性連続相中の脂質相から成るエマルジョンに上記活性物質を入れ、 該エマルジョンに原料リボ蛋白質及び少くとも一つの脂質トランスファー蛋白質 を加えて攪拌し、該混合物をインキュベートし、そして活性物質を含むところの リボ蛋白質を分離することを特徴とする方法を提供することである。

リボ蛋白質中に取込まれるべき親脂質性活性物質は、エマルジョンの脂質相の成 分とは異なる。しかし、本発明に従う方法の上記定義は、脂質相中に存在しても よいトリグリセリド及びコレステロールエステルのような親脂質性物質が上記活 性物質と同時にリボ蛋白質中に取込まれないであろうことを意味するものではな い、事実、脂質相中に存在するこれら親脂質性物質のある割合は、一般に、活性 物質の同時にリボ蛋白質中に取込まれる。

本発明方法はまた、下記の特徴を、夫々または組合せて、有することができる。

本発明方法によりリボ蛋白質中に取込まれうる親脂質性活性物質は特に、抗腫瘍 性、免疫刺激性、免疫抑制性、抗ビールス性、抗バクテリア性、抗真菌性、抗寄 生体性などの医薬又は脂肪可溶性の化粧活性物質のうちから選ばれる。

もし剤がエマルジョンの脂質相中に自発的に取込まれるのに十分なほど親脂質性 でないなら、それは公知法により親脂質性基たとえば少くとも８つの炭素原子を 持つ脂肪酸のアシル残基、又はコランあるいはコレスタンから誘導され、かつ取 込まれるべき活性物質にグラフトされることを可能にする反応性基を有するステ ロイド基をグラフトすることにより親脂質性に（又はより親脂質性に）するよう に化学的に変性されうる。

エマルジョンの脂質相は、任意の適当な脂質エマルジョンであることができる。

たとえば、脂質相は、少くとも一つの脂肪酸トリグリセリド、及び特に食用油を 含む又はそれより成る。注射による腸管外投与のために用いられる市販の注射可 能な脂質エマルジョン、たとえばプルノー（ＢｒｔＪｎ１３ａＬｌ）社（フラン ス）のＥｎｄｏｌｉｐｉｄｅ　（商標）及びカビビトラム（ＫａｂｉＶｉｔｒｕ ｍ）のＩｎｔｒａｌ　１ｐｉｄｅ（商標）を特に用いることができる。

少くとも一つのコレステロールエステル（たとえば１〜２４個の炭素原子を持つ カルボニル酸から誘導されたコレステロールエステル）を含む又はそれから成る 脂質相を用いることもできる。

また、リポソームなどの脂質小胞を脂質相として用いることもできる。そのよう な脂質小胞の組成は知られており、ここでは重要でない。

本発明方法でリボ蛋白質中に取込まれうる医薬のうち、下記のものを挙げること ができる。エリブチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｉ）　、フィトキサントロン （ｉ　ｉ　ｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、アメタントロン（ａｌｅｔａｎｔｒｏｎｅ ）　、メトトレキサート（ｉｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ドキソルビシン（ｄｏ ｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）　、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂ　ｉｃ　ｉｎ）、 ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）など、ならびに脂肪酸によるそれら のアシル化誘導体：ゲトコナゾール（又はそのアセチル基が脂肪酸アシルで置き 代えられた類似物）；ムラミルジペプチドの（脂肪酸による）アシル化誘導体： 及び光活性化できるポルフィリン誘導体（Ｐｈｏｔｏｆｒｉｎ　ＩＩ）。

リボ蛋白質中に取込まれうる活性化粧品物質の例は、脂肪可溶ビタミン（特にビ タミンＡとＥ）である。

活性物質へのグラフト化がリボ蛋白質へのその取込みを促進する脂肪酸のうち、 ４〜２４個、特に８〜２４個の炭素原子を持つ飽和又は不飽和脂肪酸、たとえば パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リルン酸、リグノセリン酸などが特 に挙げられる。

脂質エマルジョンは、乳化剤、特に蛋白質を減成しないリン脂質たとえばレシチ ンにより安定化されることができる。

出発の原料リボ蛋白質は、天然のリボ蛋白質、特にＬＤしてあることができる。

天然のリボ蛋白質は、公知法特に超遠心分離により血漿から分離されうる。それ はまた、中空繊維膜を通す濾過により血漿から分離されうる。ＬＤＬ及びＶＬＤ Ｌはまた、たとえばデキストランスルフェート−セルロースビーズ上の選択吸着 により分離されうる（Ｓ、ヨコヤマ、ＰｌａＳＩｌａＤｈＯｒｅＳｉＳ：　Ｎｅ Ｗ　ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｐｐＩｉｃａｔｉｏｎｓ、 　Ｎ　、　Ｙ　、　ｖルゲスキー（Ｈａ　Ｉｃｈｅｓｋｙ）とＪ、Ｗ、スミス（ Ｓｌｌｉｔｈ）編、クリープランド、ｌ５ＡＯグレス、２３１−２３７．１９８ ３　、およびＳ、ヨコヤマら、Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、　ｖｏｌ、 　５．　Ｎｏ、　６．６１３−６２２．１９８５参照）。

１ＩＩＨ網内皮系統により認識されるように化学的に変性されたリボ蛋白質を出 発のリボ蛋白質として用いることもできことができる（特にＪ、Ｍ、ショウ、上 記：バス（Ｂａ５ｕ　）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ ＳＡ　７３　、３１７８−３１８２．１９７６；Ｊ、ステインプレヅヒエルト（ Ｓｔｅｉｎｂｒｅｃｈｅｒｔ　＞　＋　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｎ、　２６２．３７０３．１９８７参照）。

本発明の方法で用いられるトランスファー蛋白質は、公知のヒト脂質トランスフ ァー蛋白質（上記文献参照）、あるいは一般に動物又は植物の脂質トランスファ ー蛋白質であることができる。後者の蛋白質は、特にバスら、Ｂｉｏｃｈｉｌｉ ｃａ　ｅｔ　８ｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ　、９５９　、Ｎｏ、２．１３４ −１４２．１９８８及びグロスボイス（Ｇｒｏｓｂｏｉｓ）ら、Ｐｌａｎｔ　Ｐ ｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、９０、Ｎ０１４．１５６０−１５６４．１９８９に記載さ れている。

トランスファー蛋白質はまた、上記で定義されたＬＰＤＳ血漿画分の形で加える こともできる。

本発明の方法を実施するために、脂質エマルジョンを慣用の方法で調整すること ができ、あるいは注射による腸管外投与のために通常用いられる出来合いの市販 の脂質エマルジョンを用いることができる。

親脂質性活性物質をエマルジョンに加えてもよく、あるいは逆でもよい、脂質相 への活性物質の良好な溶解を保証するために強く攪拌することが好ましい。

水に可溶なトランスファー蛋白質（又はＬＰＤＳ画分）を次に、適当な均一性を 保証するために撹拌下に加える。

次に混合物を、親脂質性活性物質がリボ蛋白質中に取込まれるのに十分な時間、 インキュベーションに付す。

親脂質性活性物質及びリボ蛋白質の量が決められると、リボ蛋白質への親脂質性 活性物質の十分な取込みを達成するのに必要なトランスファー蛋白質又はＬＰＤ Ｓの量を実験的に決めるのは容易である。

同様に親脂質性活性物質の十分な又は最大の取込みを達成するのに必要なインキ ュベーション時間は、簡単なルーチーンの実験により各場合について決定できる 。

たとえば、混合物は、３７℃の温度で１５〜２０時間インキュベーションされる 。

親脂質性活性物質の取込みにより変性されたリボ蛋白質は次に、通常の方法たと えば密度勾配超遠心分離又はアフイニティ　クロマトグラフィによって分離され うる。

このことは、何らかの不純物又は残留反応剤を除去して、出発物をほとんど除い た生成物を得ることを保証する。

本発明の別の目的は、少くとも一つの親脂質性活性物質の取込みにより変性され たリボ蛋白質特にＬＤＬであり、これは上記の方法により得られる。このように 変性されたリボ蛋白質は、取込まれた親脂質性活性物質の存在のみならず、出発 のリボ蛋白質に比べてコレステロール（遊離及びエステル化された）及びトリグ リセリドの変更された濃度により特徴づけられる。

本発明はまた、その中に親脂質性活性物質が取込まれている上記の少くとも一つ の変性リボ蛋白質を活性成分として含む、少くとも一つの親脂質性活性物質の投 与または施与を意図した医薬又は化粧品組成物である。

本発明の医薬組成物はもちろん、リボ蛋白質に取込まれた刑に対応する治療分野 でヒトまたは獣医薬で用いられる。

投与量（活性物質により計算）は、取込まれた剤の投与量と最大等しく、通常は より少い。

これら医薬組成物は、腸管外投与される。

本発明の変性リボ蛋白質はまた、化粧品組成物で使用しうる親脂質性活性物質、 たとえば脂肪可溶性ビタミン、及び皮膚の美的外観を改善すると知られている他 の親脂質性活性物質成分を含みうる。これら化粧品組成物は特に、本発明の変性 リボ蛋白質がそれに入れられている水性懸濁物又はエマルジョンの形でありうる 。

以下の実施例は本発明を例示するものであって、限定するものではない。

実施例Ｉ ＬＤＬへの脂肪鎖親脂質性剤の取込み Ａ、装置 ＬＤＬを分離するために、肝炎及びＨＩＶビールスに対し陰性血清反応を示すと 検証された血漿から出発する。

１．０２０〜１　、０６３の間の密度の血漿のゾーン超遠心分離により、ＬＤＬ を分離する。これを次に０．３ｍＨＥＤＴＡの水性溶液（ｐＨ８）に対して２４ 時間透析し、次に滅菌濾過（０，２２μ）し、そして窒素雰囲気に貯蔵する。

Ｅｎｄｏｌｉｐｉｄｅ“２０％″（プルノー社）のＸマルジョンは、下記の組成 を持つ。

大豆油　２０ｇ レシチン　１．２ｇ グリセロール　２．５ｇ 水　全量１００ｉ１へ Ｅｎｄｏｌｉｐｉｄｅエマルジョンは、同体積の生理的食塩水（８ｇ／ｌのＮａ ＣＩ）で洗われ、次に１０℃、３０，０００　ｒ＋ｏｇで３０分間超遠心分離さ れる０次に脂質画分を同体積の生理的食塩水で希釈する。

Ｅｎｄｏｌｉρｉｄｅエマルジョンのこの洗滌の目的は、十分量よりも多く実際 に存在するリン脂質（レシチン）の一部を除去することである（Ｅ、グラノ（Ｇ ｒａｎｏｔ）ら、上述を参照）。

１．２１より大きい密度を持つトランスファー蛋白質を含有するＬＰＤＳ画分は 、ＫＢｒを加えることにより密度１．２１１Ｊ／Ｃ［１２とされた血漿を４℃、 ４０．００ＯｒＤＩＩで２４時間超遠心分離して得られる（密度は２０°Ｃで測 定）０次にこのＬＰＤＳ画分は、１（ＩＩＨＴｒｉｓ　Ｈ新液、１４０　ＩＩＨ ＮａＣｌ　、１　１ＨＥＤＴＡ、ｐＨ８に対して１２時間三度透析され、そして 蛋白質濃度を６０　（］／ｌに調節する。

ＬＤＬに取込まれる剤は、エリグチニウムの脂肪酸エステル（ステアレート、パ ルミテート又はオレエート）、アメタントロンの脂肪酸エステル（モノステアレ ート、ジステアレート、モノパルミテート、ジパルミテート、モノオレエート、 ジオレエート、モノオレエ−ト、シリルナート）、又はマイトキサントロンの脂 肪酸エステル（シリルナート）である、これらエステルは、サマデーバボリシチ イ　サン　ツルーズ　ＩＩＩ　、１９８９）により調整された。

Ｂ、方法 １■の剤を最小量の有機溶剤（クロロホルｌ＼）に溶解し、次に減圧化で溶剤を 気化させる。

次に２００μｍの洗ったＥｎｄｏｌｉｐｉｄｅを加える。

試験管を１分間回転させて激しく振とうし、剤を脂質相に溶解する０次にＬＤＬ を、１■の蛋白質を含む量（ピーターリン（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ）により変更され たローリイ（Ｌｏｗｒｙ）の方法（ローリイら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｌｌ 、　１９３．２６５−２７５．１９５１により評価）で加え、そして５［１１の ＬＰＤＳを加える。

撹拌後、混合物を３７℃で１８時間インキュベートする。

次にＫＢｒ密度勾配に従い超遠心分離によりＬＤＬを分離する（４℃、４０．０ ００ｒｐｍで２４時間の遠心分離）。

アフィニテイ　りロマトグラフイにより変性されたＬＤＬもまた、公知法で単離 される。

変性されたＬＤＬを次に、Ｓａｃ　＋溶液（１４０ｉＨ，ｐＨ８）に対して透析 し、次に滅菌条件（０，２２μ）で濾過し、窒素下で貯蔵する。

下記のようにして得られるマイクロエマルジョンでＥｎｄｏｌｉｐｉｄｅを置き 代えることにより、類似の変性されたＬＤＬが得られる：２ｒａＱの剤、１１１ １１１のコレステロールステアレート及び２１ｇのリン脂質をｌｉｔのクロロホ ルムに溶解する。混合物を、完全に均質化するまで攪拌し、次に溶剤を気化させ る。残渣を２００μｌのインプロパツールで処理し、得た溶液を、激しい攪拌下 に３１の緩衝液（０，２Ｍ　リン酸塩、０．１５Ｍ　ＮａＣ１、ｐＨ７，４）中 に注入し、少くとも１分間回転させる。最終工程は、リン酸塩緩衝液中でのゲル 濾過（Ｇ２６）である。

Ｃ１分析 変性されたＬＤＬ及び天然のＬＤＬについて、下記のテストを行った。

蛋白質：ピーターリンにより変更されたローリイ法に従う。

脂質（遊離のコレステロール、エステル化されたコレスチロール、トリグリセリ ド、リン脂質）：酵素法によりテストした（Ｊ、Ｃ，フルカート（Ｆｒｕｃｈａ ｒｔ）ら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　Ｂｉｏｌ、、２４．２２７−２２９．１９８ ０　；　Ｊ　、　ツィーゲンホーン（、ｉ！１ｅａｅｎｈｏｒｎ）ら、Ｃｌ１ｎ 、　Ｃｈｅｍ、　２６．９７３−９７９．１９８０　、　Ｍ　、タカヤマら、Ｃ １１ｎｉｃａ　ＣｈｉＩｌ、　Ａｃｔａ、　７９．９３−９８．１９７７参照） 。

剤（変性されたＬＤＬ上の）ニアメタントロン　エステルは、イソプロパツール によるアポリボ蛋白質Ｂの沈殿の後にテストされた。この目的のために、１００ μｍのＬＤＬを１００μｍのイソプロパツールに加え、１分間攪拌し、次に攪拌 下に１０℃で１夜置く、混合物を次に３００ｒｌ）Ｉｍで３０分間遠心分離する 。上澄を取り、気化させる。残渣をｉｌｌのクロロホルムで処理する。６１４　 ｎｉの波長で光学密度を読み取り、剤の対照範囲と比べる。

エリグチニウム　エステルは、サマデーバボリ（上記の論文）記載の方法により ＨＰＬＣでテストされる。

Ｄ、薬理学的研究 変性されたＬＤＬの代謝は、ラビットにおいて血流中に注入された天然ＬＤＬ及 び変性ＬＤＬの血漿クリアランスの動的挙動を比較することにより研究された。

エリブチニウム　オレエートの取込みにより変性されたＬＤＬの細胞毒作用は、 増大する剤濃度の存在下でＬ　１２１０細胞において研究された。細胞成育は、 コールタ−カウンターでのカウントにより４８時間インキュベーション後に測定 された。

得られた結果を下記にまとめて示す。

Ｅ、蛋白質： 変性蛋白質からのアポリボ蛋白質Ｂは、抗ＬＤＬ抗体に対するその抗原特性を保 持する。

脂質： 脂質組成は、蛋白質（ａｐｏＢ）濃度の関数として与えられる。天然ＬＤＬのａ ｐｏ　Ｂ含量は、ＬＤＬ粒子粒子一つのａｐｏ　８分子である。この含量は、本 発明方法に従う変性後に不変である。

上記方法で変性されなＬＤＬの総コレステロール含量は、１３％であり、原料天 然ＬＤＬでは３９％である。

トリグリセリド含量は増大される（変性ＬＤＬにおいて４１％、天然ＬＤＬで８ ％）。

リン脂質含量は実際上不変である（変性ＬＤＬでは１８％、出発の天然ＬＤＬで は２２％）。

電気泳動易動度： 変性ＬＤＬの易動度は、出発のＬＤＬと同じである。

アポリボ蛋白質ＢとＥレセプターの認識：マイトキサントロン　シリルナートの 取込みにより変性されたＬＤＬが、天然のＬＤＬと全く同じに、Ｍｅｇａ細胞の ａｏｏ　Ｂ及びＥレセプターに結合することをチェックするために、競合法を用 いた。

同様にエリ１チニウム　オレエートの取込みにより変性されなＬＤＬでは、天然 ＬＤＬと変性ＬＤＬの間に結合、内部化（１ｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）、 又は減成における有為な差はない（ヒト皮膚線維芽細胞でテスト）。

ＬＤＬに取込まれた剤の量： 下記の取込みが得られた。

エリブチニウム ステアレート：蛋白質１（Ｊ当り　３７μ■パルミテート；蛋白質■当９５８μ ９ オレエート：蛋白質ｎａｇ当り　８３μｇアメタントロン 非エステル化：ＬＤＬ粒子粒子−１分子モノステアレート：粒子当り　１分子 ジステアレート二粒子当り　１分子 モノパルミテート二粒子当り　２分子 ジパルミテート二粒子当り　２分子 モノオレエート二粒子当り　２分子 ジ　オ　し　−　ト二粒子当り　２分子モノリルナート二粒子当り　８０分子 ジリルナート二粒子当り　９０分子 マイトキサントロン 非エステル化二粒子当り　１分子 ジリルナート二粒子当り　２２分子 代謝： この研究は、ヨウ基１３１でラベルされた変性ＬＤＬ（マイトキサントロン　シ リルナート−ＬＤＬ）の血漿濃度の減少が、ヨウ基１２５でラベルされた天然Ｌ ＤＬの血漿減少のカーブに近いことを示した。この研究は、剤の取込みにより変 性されたＬＤＬが４ｉＩＮ４内皮系統により捕われないことを示す。

細胞毒性： この研究は、Ｌ１２１０細胞で行われた（サマデーバボリの上記論文参照）。

エリブチニウムオレエートを含む変性ＬＤＬの増加する投与量の付与は、変性Ｌ ＤＬが、同濃度のエリブチニウムオレエート単独よりも明瞭により毒性であるこ とを示した。

この細胞毒性は、アポリボ蛋白質のためのレセプターに依存する。なぜなら、一 定濃度の変性ＬＤＬに加えられた過剰の天然ＬＤＬは細胞成育を回復させ、一方 、レセプターに結合できない過剰のメチル化ＬＤＬは効果を有しないからである 。

本発明に従うリボ蛋白質は、伝統的な生薬の又は医薬の形態たとえばローション 、溶液などを作るために、任意の医薬的にまたは化粧品的に許容される成分と処 方されることができる。

リボ蛋白質は、局所的に又は腸管外的に投与でき、後者の場合、注射しつる緩衝 剤中に、好ましくは０．０５〜１％、特に０．１〜０．４％の割合で処方されう る。

たとえば、酸化を防ぐのに十分な量で酸化防止剤たとえばビタミンＥ又は１０ブ コールを含むことができるリン酸塩又は炭酸塩緩衝剤を用いることができる。

処方例 ａ、エリグチニウム　オレエート 実施例１の変性ＬＤＬ　Ｏ，５％ ２０ｉＨのビタミンＥを含むリン酸塩 緩衝液１０ｍＨ，ｐＨ７，４１００％への残部す、アメタントロン　モノリルナ ート 実施例１の変性ＬＤＬ　Ｏ，２％ ２０ｎＨのビタミンＥを含むリン酸塩 績ｔｉ液１（ｌｎＨ，ｐＨ７，４１００％への残部Ｃ，アメタントロン　シリル ナート 実施例１の変性ＬＤＬ　０．２％ ２０ｎＨのビタミンＥを含むリン酸塩 緩衝液１０ｎ＋Ｈ，ｐＨ７，４１００％への残部国際調査報告 １、ｖＡ、に、Ｉｍ　＋１．、　ＰＣＴ／ＦＲ９１１００５７３国際調査報告 ＦＲ９１００５７３ Ｓ＾　４９３９２ フロントページの続き （７２）発明者　デュリエ、パトリックフランス国、　５９８００　リル、アベ ニュ　デラ　レピュブリク　６６０Ｄ （７２）発明者　モナール、フランスワズフランス国、　５９８００　リル、エ ンパースデレクロワ　１４／６ （７２）発明者　メディ、サマディーバポリフランス国、　３１８１０　ベネル ク、アベニュデュ　ムーランーピュ　１１ （７２）発明者　スーラ、ジョルジュ フランス国、　３１４００　ツルーズ、リュ　ボナ６０ （７２）発明者　フリユシャー、ジャンーシャルルフランス国、　５９３２０　 アネティールーアンーウェペ、ドマン　デ　ラ　オラーンド

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．トリグリセリド及びコレステロールエステル以外の少くとも一つの親脂質性 活性物質の取込みにより変性されたリポ蛋白質を作る方法において、水性連続相 中の脂質相から成るエマルジョンに上記活性物質を入れ、該エマルジョンに原料 リポ蛋白質及び少くとも一つの脂質トランスファー蛋白質を加えて撹拌し、該混 合物をインキュベートし、そして活性物質を含むところのリポ蛋白質を分離する ことを特徴とする方法。
2. ２．脂質相が少なくとも一つの脂肪酸トリグリセリドを有する請求項１の方法。
3. ３．脂質相が少くとも一つのコレステロールエステルを含む請求項１又は２の方 法。
4. ４．脂質相がリボソーム又は他の脂質小胞を含む請求項１の方法。
5. ５．エマルジョンが乳化剤により安定化されている請求項１〜４のいずれか一つ の方法。
6. ６．乳化剤がりン脂質である請求項５の方法。
7. ７．乳化剤がレシチンである請求項６の方法。
8. ８．原料リボ蛋白質が天然のリポ蛋白質である請求項１〜７のいずれか一つの方 法。
9. ９．天然リポ蛋白質が低密度リポ蛋白質（ＬＤし）である請求項８の方法。
10. １０．原料リポ蛋白質が化学的に変性されたリポ蛋白質である請求項１〜７のい ずれか一つの方法。
11. １１．原料リポ蛋白質が、細網内皮系統により認識されうるように化学的に変性 されたＬＤＬである請求項１０の方法。
12. １２．原料ＬＤＬが、アセチル化、アセトアセチル化、ラクトシル化、又は酸化 しＤしである請求項１１の方法。
13. １３．原料リポ蛋白質がヒトリポ蛋白質である請求項１〜１２のいずれか一つの 方法。
14. １４．脂質トランスファー蛋白質が動物又は植物リポ蛋白質である請求項１〜１ ３のいずれか一つの方法。
15. １５．トランスファー蛋白質がリポ蛋白質欠損血清（ＬＰＤＳ）画分の形で加え られる請求項４の方法。
16. １６．活性物質が抗腫瘍性、増殖抑制性、抗寄生体性、抗真歯性、抗バクテリア 性、又は抗ビールス性物質又は脂肪可溶性ビタミンである請求項１〜１５のいず れか一つの方法。
17. １７．親脂質住活性物質が、化学的に変性されてより親脂質性とされた親水性剤 である請求項１〜１６のいずれか一つの方法。
18. １８．請求項１〜１７のいずれか一つの方法により得られた、少くとも一つに親 脂質性活性物質を取込んで変性されたリポ蛋白質。
19. １９．原料リポ蛋白質が天然のしＤし又は化学的に変性されたＬＤＬである請求 項１８のリポ蛋白質。
20. ２０．非生理的な親脂質性活性物質を含む変性されたリボ蛋白質。
21. ２１．活性物質がエリアチニウム、アメタントロン及びマイトキサントロン、及 びそれらの脂肪酸エステル又は他の誘導体から選択される請求項１８〜２０のい ずれか一つの変性されたリポ蛋白質。
22. ２２．原料の天然リポ蛋白質の抗原特注を保持している請求項１８〜２１のいず れか一つの変性されたリポ蛋白質。
23. ２３．トランスファー蛋白質を実質上含まない請求項１８〜２２のいずれか一つ の変性されたリポ蛋白質。
24. ２４．親脂質性活性物質が取込まれている請求項１８〜２３のいずれか一つの変 性リポ蛋白質を含むことを特徴とする、少くとも一つの親脂質性活性物質の投与 又は施与のための医薬又は化粧品組成物。