JPH06500852A - 螢光化合物からの発光信号増幅方法 - Google Patents

螢光化合物からの発光信号増幅方法

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 螢光化合物からの発光信号増幅方法 この発明は、螢光化合物からの発光信号を増幅する方法に関する。さらに、この 発明は、螢光化合物からの発光信号を増幅する方法が適用された、アナライトを 含む可能性のある媒質中におけるアナライトの検出及び／又は測定を螢光を利用 して行う方法にも関する。
現在、各種の免疫分析が生体液中の化合物の定性分析あるいは定量分析に広く用 いられている。現行の技術にあっては、螢光定量分析が重要になってきている。
実際に、螢光定量分析には、測定を高感度をもって迅速に行えること、螢光化合 物により標識化された試薬が安定していて安全であること、比較的低コストで行 えること等の多くの利点がある。
螢光を利用する検出方法は、本質的に非常に高感度であり、特に、変調可能なレ ーザ光源を使用する場合には、放射性標識試薬を用いる免疫分析に比して、検出 下限をより低くすることができるものであることが知られている（［、Ｗｉｅｄ ｅｒ、　”Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅ−ｓｃｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ 　５ｔａｉｔ＋４ｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”、　１９７８．　Ｅｌｓｅｖｉ ｅｒ）。
しかしながら、斯かる技術についての感度は、多数のパラメータに依るものとな る。従来技術からして、螢光を利用する検出方法においてトレーサとして選定さ れる螢光分子は、・生体分子に、それを変成することなく、あるいは、その免疫 学的特性を変えることなく、結合することができる化学的官能基を含んでいるこ と、 ・螢光分子についてのモル分子吸収効率ができるだけ高いこと、・螢光について の量子収量ができるだけ高いこと、・ストークス遷移ができるだけ大であること 、・可能であれば、発光波長か５００ｎｍより長いこと、・螢光分子が水あるい は緩衝液に溶解するものであること、等の特性を具えていなければならない。
これらの条件については、例えば、イー・ソイニ／他（Ｅ、　５０１−Ｎｌ　ｅ ｔ　ａｌ、）による論文：　Ｃ１１ｎ、　Ｃｈｅｍ、　２５．３５３　（１９７ ９）、あるいは、アイ・ヘミラ（１，ＨＥＭＭＩＬＬＡ）による論文：Ｃｌ１ｎ 、　Ｃｈｅｍ、　３１／３．３５９　（１９８５）に詳述されている。
螢光免疫分析の分野、特に、均質免疫分析の分野においては、高感度分析を実現 するため必要とされる諸条件の一つが、高量子収量を有し、測定媒質中における 低希釈のもとにあっても安定である螢光マーカーを使用することである。
均質免疫分析は、測定前に、測定媒質中において自由状態におかれる複数の標識 分子をそれらが結合せしめられるものから分離することを要することなく、配位 子がレセプタと結合するとき、あるいは、二つの配位子がレセプタと結合する（ いずれか一方は分析されるべき分子である）とき、トレーサ分子からの信号が変 化せしめられることになる分析を意味するものと解される。
エネルギ転移を利用する均質螢光免疫分析の場合には、ドナーについての量子収 量が転移効率を決定し、それゆえ、測定対象とされるアクセプタからの発光量を 決定することになるので、ドナーについての量子収量が高いという条件が最も重 要である（エイ・アール・リス（Ａ、　Ｒ，Ｌｉ５ｓ）により編集されたＵｌ１ ｍａｒ＋　ｅｔ　ａｌ、。
Ｃ１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂ、　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　１９８ ０’ｓ、　１９８０．１３〜４３）。
これらの螢光トレーサの選択に係る判断基準は、燐光分子を利用する分析に対し ても同様に適用される。
測定感度は、また、試験に供されるサンプル中に存在し、螢光トレーサと同時に 励起されて測定対象波長に等しい波長の光を発する、他の分子からの発光による “背景光”の影響を少なからず受ける。この問題は、測定に対する干渉を生じ易 いものとされる多数の分子（蛋白質等）が存在する血清媒質中における分析の場 合に取分は深刻である。
螢光免疫分析の場合には、螢光測定にあたって時分割法（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌ ｖｅｄ　ｍｅｔｈｏｄ）をとることにより、上述の不都合をある程度軽減するこ とができる。この方法の原理は、比較的長い発光寿命を有したトレーサ分子が発 する螢光を、他の存在分子の発光寿命が尽きた後となる時間遅れをもって、測定 することにある。そして、斯かる場合には、希土類キレートの如くの比較的長い 寿命を有した螢光トレーサ分子を用いることが必要とされる。この技術は、特に 、エネルギ転移を利用する均質螢光免疫分析の場合に用いられるに好適である。
米国特許４８２２７３３　には、夫々異なる発光寿命を有した螢光分子により標 識化されたレセプタとアナライトとを用いたサンプルにおけるアナライトを検出 するための均質方法が記載されている。エネルギ転移に起因した螢光の測定は、 最短の発光寿命を有した分子の発光寿命が尽きた後に行われる。
斯かる状況にもかかわらず、時分割螢光測定のみによるのでは、エネルギ転移を 利用する均質螢光免疫分析によりもたらされる重大な問題の一つ、即ち、トレー サからの残余信号の存在が、測定中のもとての螢光ドナー分子をアクセプタから の螢光波長のもとで発光させるという問題を解決することはできない（Ｍａｒｒ ｉ−ｓｏｎ。
Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　１７４．１１９．１９８８）　ａこの現象は、 サンドイッチ技術の場合の如くに、分析処理が過剰なトレーサを巻き込んでなさ れるとき、もしくは、競争分析処理が行われるとともに標識抗原が混じり物があ るものとされるときにおいて、一層重大となる。
検出感度を制限するごとになる斯かる重大な問題は、溶液中の自由トレーサを抑 制する抗トレーサ抗体の使用を提唱するウルマン／他（Ｕｌｌｒ＋ａｎ　ｅｔ　 ａｌ、）によって取り上げられている（エイ・アール・リス（Ａ、　Ｒ，Ｌｉ５ ｓ）により編集されたＣ１１ｎｉｃａｌ　Ｌａｂ、　Ｔｅｃｈｎｉ−ｑｕｅｓ　 ｆｏｒ　ｔｈｅ　１９８０’ｓ、　１９８０．１３〜４３）。
そして、この現象は、測定されるアクセプタからの発光の寿命に比してドナーか らの発光の寿命が長いときには、一層悪質なものとなる。
従来においては予期されていなかったことであるが、この発明によって、螢光ド ナー化合物として、低い総合量子収量を有し、それゆえ、従来にあっては、分析 、特に、螢光免疫分析に用いるには適していないとされている分子を用いること により、螢光トレーサからの残余信号の残余信号の問題を、転移効率を低下させ ることなく解決することができ、その結果、分析感度を高めることができること が見出された。
実際、文献において高量子収量を有したドナー化合物と共に使用することが指摘 されているアクセプタ化合物と同等の濃度のアクセプタ化合物の使用のもとに、 低い総合量子収量を有したドナー化合物を用いて、高転移効率を得ることができ ることが観測されており、また、アクセプタが用いられたもとで測定される信号 の強度が、ドナー化合物のみのもとで測定される信号の強度より大とされること が観測されている。このような観測は、従来技術に照らしてみると意外に思われ ることであるが、低い総合量子数ことかできることを示している。
これよりして、上述の如くの螢光ドナー化合物として低い総合量子収量を有した 分子を用いる方法は、螢光ドナー化合物からの発光信号を増幅する方法というこ とになる。そして、螢光ドナー化合物からの発光信号の増幅は、螢光ドナー化合 物の総合量子収量が低い程、大なる意義を有することになる。
斯かる現象のメカニズムを説明する一つの仮説にあっては、低い総合量子収量を 有した螢光ドナー化合物が用いられるとき観測される高転移効率は、ドナーの発 光準位における放射性不活性化についての収量のみに関わり、その総合量子収量 には関わらないということができる。
螢光ドナーとして希土類キレートあるいは希土類クリブテートが用いられる場合 、希土類元素における吸光と発光との間の光物理メカニズムは、例えば、ブイ・ バルザーニ（Ｖ、　Ｂａ１ｚａｎｉ）により編集された、エヌ・サバチー二／他 　（Ｎ、　５ａｂｂａｔｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、）による「超分子生化学Ｊ　（Ｓ ｕｐｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、ライデル　ドルド レヒト（Ｒｅｉｄｅｌ　Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）、　１９８７．　ｐ、１８７〜２ ０６に述べられているように、下記の如くにあられされる。
励起エネルギは、項間遷移により三重項を集団化させるｓ１準位の集団化を促す 。三重項は、そのエネルギを、放射性もしくは非放射性不活性化を受ける希土類 元素の発光準位に転移する。総合量子終了φ１は、各ステップにおける収量φ２ ．φ２及びφ３の積であられされ、 φ１＝φ１×φ２×φ。
とされる。
最終ステップは、希土類元素の発光準位の不活性化であり、異なるレートをもっ て行われる複数種の不活性化が包含される。
希土類元素の発光準位の放射性不活性化についての収量φ３は、式： によってあられされる。ここで、ｋＲは放射性不活性化のレートであり、ｋＮｌ ｌは非放射性不活性化のレートである。これら二つの不活性化レートの和はｋＤ としてあられさ゛れる。そして、ドナーとアクブタとの間におけるエネルギ転移 の場合には、転移効率Ｅによってあられされる。
一般に、転移レートｋｒは、総合量子収量φ１に応じたものとなり、そのことは 、例えば、ディ・トーマ入／他（Ｄ、　Ｔｈｏｍａｓ　ｅｔａｌ、）によりピー ・エヌーエイ・ニス（ＰＮＡＳ）、　１９７８．７５．５７４６〜５７５０　に 、下記の関係をもってあられされている。
ｋｙ＝ｋ。（ｒ／　Ｒｏ）−’ ここで、ｒはドナーとアクセプタとの間の相互離隔距離であって、Ｒｏは転移効 率が５０％のもとてのドナーとアクセプタとの間の相互離隔距離であり、また、 ｋｏは総合量子収量Ｑ０の関数である。
燐光トレーサ分子の場合、不活性化メカニズムは、放射性不活性化が三重項準位 から行われることを除いて、上述と同様である。
螢光ドナー分子からの発光信号が増幅されたものを得るため用いられる螢光アク セプタ化合物は、螢光ドナー分子の発光準位の放射性非活性化についての収量の 関数とされる。
実際、螢光ドナー分子からの発光信号の増幅は、下記の関係が成立するもとで行 われる。
Ｅφ６〉　φ３ ここで、Ｅは転移効率であり、φ、はアクセプタ化合物の量子収量であり、φ、 は発光準位の放射性不活性化についての収量であこれらの変数は、下記の式によ ってあられされる。
ｋＴ＝　ｋ、ＪＲ−’に ここで、Ｅ、ｋア＋ｋＲ及びに０は上述の通りであり、また、Ｊはスペクトルの 総合積分値であり、Ｒはドナーとアクセプタとの間の相互離隔距離であり、Ｋは ｎを媒質の屈折率として、ｋ＝ｎ−’Ｘ　５．８７　Ｘ　ｔｏ”としてあられさ れる値である。また、Ｒの単位は人であり、Ｊの単位はｃｍ’Ｍ−’である。
従って、Ｅは、 という関係をもってあられされる。
Ｅφえ〉　φ、という関係は、 としてあられされ、さらに としてあられされる。
従って、値φ、、φ、及びＪはアクセプタとドナーとの組合せにより定められる 特性であるので、 という関係が、ドナー化合物の関数としてのアクセプタ化合物の選定を支配する ことになる。
スペクトルの総合積分値Ｊは、コンラッド／他（Ｃｏｎｒａｄ　ｅｔ　ａｌ、） によるｒ生化学Ｊ　（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、　１９６８．７．　７７７ 〜７７８において示されている如くにして算出される。また、発光準位の放射性 不活性化についての収量φ、は、例えば、ブイ・バルザーニ（Ｖ。
Ｂａ１ｚａｎｉ）により編集された、エヌ・サバチー二／他（Ｎ、　５ａ−ｂｂ ａｔｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、　）によるｒ超分子生化学Ｊ　（Ｓｕｐｒａｍｏｌｅ ｃｕｌａｒ　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）ライデル　ドルドレヒト（Ｒｅｉｄ ｅｌ　Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ）、　１９８７゜ｐ、　１８７〜２０６において述べ られているようにして算出される。
これよりして、この発明は、螢光分析においてドナー化合物として用いられる螢 光化合物からの発光信号を増幅する方法に関する。そして、その際、螢光分析に あっては螢光アクセプタ化合物も用いられ、この発明に係る方法は、螢光ドナー 化合物が低い総合量子収量を有し、かつ、螢光ドナー化合物の発光準位の放射性 不活性化についての量子収量が螢光アクセプタ化合物の量子収量より低いことを 特徴とする。
螢光分析に用いられる螢光ドナー化合物は、望ましくは、螢光希土類クリブテー ト、螢光希土類キレート、あるいは、その他の燐光分子の如くの、長い発光寿命 を有する化合物とされる。
この発明の好ましい態様は、螢光ドナー化合物と螢光アクセプタ化合物とが用い られる螢光分析において螢光ドナー化合物が希レートもしくは希土類クリプテー トからの発光信号を増幅する方法に関し、希土類キレートもしくは希土類クリプ テートが低い総合量子収量を有し、かつ、希土類キレートもしくは希土類クリブ テートの発光準位の放射性不活性化についての量子収量が螢光アクセプタ化合物 の量子収量より低いことを特徴とする。
この発明の他の好ましい態様は、アナライトを含む可能性のある媒質中における アナライトの検出及び／又は測定を、ｌ）媒質に、少なくとも一個のアナライト に対するレセプタを含んで成る第１の試薬を添加するステップ；２）媒質に、ア ナライト及び少なくとも一個のレセプタのうちから選択された第２の試薬を添加 するステップ：　及び、３）第１及び第２の試薬の夫々が添加された媒質を、螢 光ドナー化合物に対する励起波長に相当する波長を有した光によって励起した後 、螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ； をもって、アナライトと少なくとも一つの対応するレセプタとの反応による生成 物を螢光を利用して検知することにより行う均質方法であって、螢光ドナー化合 物が希土類キレートもしくは希土類クリブテートから成り、第１及び第２の試薬 のうちの一方が螢光ドナー化合物と結合したものとされるとともに他方が螢光ア クセプタ化合物と結合したものとされ、第１の試薬を添加するステップと第２の 試薬を添加するステップとが順序が可逆のものとされたもとで、螢光ドナー化合 物を成す希“土類キレートもしくは希土類クリブテートが低い総合量子収量を有 すものとされ、希土類発光準位の放射性不活性化についての量子収量が螢光アク セプタ化合物の量子収量より低くされたことを特徴とするものに関する。
本願の記載においては、′アナライト”は、検出及び／又は測定の対象とされる 物質あるいは類似する物質群を意味し、また、“レセプタ”は、特にアナライト の一部に結合することができる物質を意味し、“螢光化合物”は、所定の波長の 光によって励起されることにより螢光を発する状態をとり得る物質を意味する。
この発明における好ましい特徴に従えば、この発明に係るアナライトを含む可能 性のある媒質中におけるアナライトの検出及び／又は測定を行う均質方法は、 ■）鑑識されるアナライトを含む媒質に、少なくとも一個のアナライトに対する レセプタから成り、螢光希土類キレートもしくは螢光希土類クリプテートから成 る螢光ドナー化合物と結合した第１の試薬を添加するステップ； ２）媒質に、−個もしくは複数個のアナライトに対する他のレセプタから成り、 螢光アクセプタ化合物と結合した第２の試薬を添加するステップ； ３）第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、第１及び第２の試薬 の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当す る波長を有した光源からの光によって励起するステップ：　及び、 ５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ： を含む過剰分析方法とされる。
そして、好ましくは、上述の過剰分析方法においては、螢光ドアナライトに対す る単一のレセプタが用いられる。
また、この発明におけるさらに好ましい特徴に従えば、この発明に係るアナライ トを含む可能性のある媒質中におけるアナライトの検出及び／又は測定を行う均 質方法は、１）鑑識されるアナライトを含む媒質に、アナライトに対するレセプ タから成り、螢光希土類キレートもしくは螢光希土類クリブテートから成る螢光 ドナー化合物と結合した第１の試薬を添加するステップ； ２）媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合したアナライトを成す第２の試薬を添 加するステップ： ３）第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、第１及び第２の試薬 の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ： ４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当す る波長を有した光によって励起するステップ；及び、 ５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ； を含む競争分析方法とされる。
さらに、この発明に係るアナライトの検出及び／又は測定を行う均質方法は、 １）鑑識されるアナライトを含む媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合した、ア ナライトに対するレセプタから成る第１の試薬を添加するステップ： ２）媒質に、螢光希土類キレートもしくは螢光希土類クリプテートから成る螢光 ドナー化合物と結合したアナライトを、第２の試薬として添加するステップ； ３）第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、第１及び第２の試薬 の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ： ４）インキュベートされた媒質を、螢光ドナー化合物に対する励起波長に相当す る波長を有した光によって励起するステップ；及び、 ５）螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ； を含む競争分析方法にも適用され得るものである。
この発明における好ましい特徴に従えば、上述のアナライトの検出及び／又は測 定を行う方法において用いられる第１の試薬及び第２の試薬は、鑑識されるアナ ライトを含む媒質に同時に添加されてもよい。
螢光ドナー化合物としては、テルビウム・キレート、テルビウム・クリブテート ユーロビウム・キレートユーロピウム・クリプテート、ジスプロシウム・キレー ト、ジスプロシウム・クリプテート、サマリウム・キレート、サマリウム・クリ プテート。
ネオジミウム・キレート、ネオジミウム・クリプテート等が用いられ得るものと され、好ましくは、テルビウム・キレート　テルビウム・クリブテート、ユーロ ピウム・キレートあるいはユーロピウム・クリプテートが用いられる。
この発明に係る方法において好ましく用いられるものとされる複数の希土類クリ プテートが、ヨーロツノく特許出願０１８０４９２ｉこ記載されている。これら の化合物は、下記の一般式であられされる巨大多環式化合物によって錯体化され た少なくとも一つの希土類塩から成る。
ここで、Ｚは窒素、炭素もしくは燐の如くの３価もしくは４価の原子をあられし 、Ｒは水素、水酸基、アミノ基又は炭化水素基、あるいは、なにも無いことをあ られす。また、２価の基■。
■及び■のうちの少なくとも一つが、少なくとも一つの分子単位を含有して成る ものか、あるいは、本質的に一つの分子単位から成るのとされ、その分子単位が 錯体化された希土類イオンの発光準位より大である三重項エネルギを有するもの とされる。
この発明にとって特に好ましい分子単位は、フェナントロリン。
アントラセン、ベンゼン、ナフタレン、ビフェニル及びテルフェニル、ビピリジ ン及びビキノリン、特にビイソキノリン、例えば、２．２゛−ビピリジン、アゾ ベンゼン、アゾピリジン、ピリジン又は２．２′−ビイソキノリンである。
エネルギドナ一単位を含む基■、■及び■の例としては、下記の連鎖が挙げられ る。
−Ｃ，Ｈ，−Ｘ、−Ｃ，Ｈ，−Ｘ２−Ｃ２Ｈ，−ここで、Ｘｌ及びＸ２は、同一 であっても相違してもよく、酸素。
窒素もしくは硫黄を示す； −Ｃ２Ｈ，−Ｘ、−ＣＨ２−Ｃｓ　Ｈ，−ＣＨ２−Ｘ２−ここで、Ｘｌ及びＸ２ は、同一であっても相違してもよく、酸素。
窒素もしくは硫黄を示す； ここで、Ｘは酸素もしくは水素である。
ヨーロッパ特許出願０１８０４９２に記載されているこの発明に係る方法におい て好ましく用いられる化合物としては、テルビウム・クリプテート：Ｔｂトリス ビピリジン、あるいは、ユーロピウム・クリプテート：Ｅｕｈリスビピリジンが 挙げられる。
また、この発明に係る方法に用いることができる他の希土類クリブテートがヨー ロッパ特許出願０３２１３５３に記載されている。
それらは、下記の式Ｉもしくは式■によりあられされる巨大多環式化合物によっ て錯体化された少なくとも一つの希土類塩から成る。
式： であられされる環は、下記の複数の環のうちの一つである。
上述において、 ・Ｙは、一つもしくは複数の二重結合を含んだ、及び／又は、一つもしくは複数 の酸素、窒素、硫黄もしくは燐の如くのへテロ原子によってＣ６〜Ｃ，シクロア ルキレン基もしくは０６〜Ｃ５４アリレン基から分断された線状もしくは分枝状 ０１〜Ｃ２゜アルキレン基から選択された２価の有機基から成る基もしくはスペ ース・アームであり、斯かるアルキレン基、シクロアルキレン基あるいはアリレ ン基は、アルキル基、アリル基あるいはサルフォネート基による置換される状態 あるいは置換されない状態をとるものとされる。
・Ｚは、生体物質と共有結合することができる官能基である。
・Ｒは、メチル基あるいは−Ｙ−Ｚ基である。
・Ｒ″は、水素あるいは一〇〇〇Ｒ″基であって、Ｒ″′はＣ３〜Ｃｏｏアルキ ル基及び、好ましくは、メチル基、エチル基あるいはテルト−ブチル基であり、 さもなくば、−Ｒ’　は−〇〇−ＮＨ−Ｙ−Ｚ基である。
適切な官能基の例としては、アミノ基、チオ基、シアン基、イソシアン基、イソ チオシアン基、チオシアン基、カルボキシル基。
水酸基、マレイミド基、スクシンイミド基９　メルカプト基、イミダシル基、ア ルデヒド基、エポキシド基、ハロゲン基、チオニル基、サルフォニル基、ニトロ ベンゾイル基、カルボニル基、無水酸基、ハロゲノアセテート基、ヒドラジノ基 及びアクリジン基等が挙げられる。
特に好ましい基は、生体物質との共有結合前に活性化されたアミノ基、チオ基及 びカルボキシル基、及び、生体物質に直接結合できるマレイミド基、スクシンイ ミド基及びイソチオシアネート基である。
ヨーロッパ特許出願０３２１３５３に記載されているこの発明に係る方法におい て好ましく用いられる化合物としては、ユーロピウム・クリプテート：Ｅｕ）リ スビピリジンジアミン及びテルビウム・クリプテート：Ｔｂトリスビピリジンジ アミンが挙げられる。
上述の希土類クリブテートは、好ましいことに、数十μｓオーダーの長い発光寿 命を有しており、それゆえ、一方では、時分割測定の技術を用いることができて 、干渉発光を打ち消すことができ、また、他方では、従来からの測定装置を使用 することができることになる。
発光ドナー化合物として、エオシンもしくはエリトロジンの如くの燐光化合物を 用いることもできる。
この発明に係る方法において用いられる発光アクセプタ化合物は、ドナー化合物 についての官能基として選定される。
発光ドナー化合物が螢光ユーロピウム・クリブテートとされる場合には、アロフ ィコシアニン、アロフィコシアニンＢ、フィコシアニンＣ及びフィコシアニンＲ のうちから選択された螢光アクセプタ化合物が用いられることが望ましい。
テルビウム・クリブテートがドナー化合物として用いられる場合には、ローダミ ン、チオニン、フィコシアニンＲ，フィコエリトロシアニン、フィコエリトリン Ｃ，フィコエリトυンＢ及びフィコエリトリンＲのうちから選択された螢光アク セプタ化合物が用いられることが望ましい。
発光ドナー化合物として、エオシンもしくはエリトロジンの如くの燐光化合物が 用いられる場合には、ヨーロッパ特許出願００７１９９１及び０３１４４０６に 記載されている如くのクロロフィル、ヨーロッパ特許出願００７１９９１に記載 されている如くのポルフィリン、及び、国際特許出願ＰＣＴ／ＷＯ８８０４７７ ７に記載されている如くのフタロシアニンのうちから選択された螢光アクセプタ 化合物が用いられることが望ましい。
燐光ドナー化合物が用いられた液媒にお（する分析の場合には、結果は、固形担 体が用いられて評価され、あるいは、測定媒質に酸素吸収分子が加えられて評価 される。このような技術は、当該技術分野の当業者に知られていることである。
クロロフィル及びフタロシアニンも、ドナー化合物としてのユーロピウム・キレ ートもしくはユーロピウム・クリブテートと共に、螢光アクセプタ化合物として 用いられ得るものである。
ラコウィッツ（Ｌａｋｏｗｉｃｚ）によるｒ螢光分光法の原理Ｊ　（Ｐｒｉｎ− ｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）　 、ブレニウム　プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク　（Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ）、　１９８３．　ｐ、　９６〜１００゜に記述されている如くの変調 光源が、螢光ドナー化合物の励起のための光源として使用される。
この発明に係る増幅方法にあっては、均質槽もしくは不均質相中における、所謂 、競争分析法あるいは過剰分析法に従った螢光免疫分析への適用が特に重要であ り、斯かる螢光免疫分析については、従来の文献に記述されている（Ｌａｎｄｏ ｎ、　Ａｎｎ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、　１９８１．１８．２５３　 、及び、Ｅ、　５ＯＩＮＩ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｃｌ１ｎ、　Ｃｈｅｍ。
１９７９、２５．３５３　）。
この発明に係る増幅方法は、通常では元来の背景発光の影響を受ける感度が高い ことを要求する血清媒質中における免疫分析に適用されることが、特に望まれる 。実際、この発明に係る増幅方法によれば、低い総合量子収量を有し、その残余 信号が弱いものとされるトレーサの使用が可能とされる。
この発明は、この発明を制限するものではない下記の実施例が参照されることに より、一層明確に理解される。
実施例　１： 二通りの動的増幅試験が行われ、一方においては、ヨーロッパ特許出願０１８０ ４９２　（実施例５）に記述されている如くにして用意されたユーロピウム・ク リブチ−）：Ｅｕ）リスビピリジン（ＥｕＴＢＰ）がドナー化合物として用いら れるとともに、アロフィコシアニン（アンチルシム、フランス）がアクセプタ化 合物として用いられ、また、他方においては、Ｅｕ）リスビピリジンと同様にし て用意されたテルビウム・クリプテート：Ｔｂトリスビピリジン（ＴｂＴＢＰ） がドナー化合物として用いられるとともに、ローダミンＢ（フル力、スイス）あ るいはフイコエリトリンＢ（シグマ、米国）がアクセプタ化合物として用いられ た。
ドナー化合物は、下記の如くの異なる緩衝液中における濃度が１０−’　ｍｏｌ ／ｊ’とされて用いられる。
・ｐＨ７，４の０．１Ｍ燐酸塩緩衝液 ・ｐｆ（８の０，１Ｍトリスアミノメタン緩衝液・ｐＨ７，１の０．ＩＭ）リス アミノメタンＨＣ１緩衝液これらの緩衝液の夫々は、異なる濃度のアクセプタ化 合物が存在するもとで、濃度１ｇ＃’の人間の血清アルブミンも含むものとされ る。そして、螢光は、アクセプタ化合物からの発光に対しての干渉フィルタが備 えられたＡＲＣＵＳ螢光光度計（エル・チー・ビー、スウェーデン）が用いられ 、時分割法によって測定される。
上述の試験においては、螢光についての時分割測定は、以下に述べられる如くの 試作品のレーザ螢光光度計が使用されて行われた。
レーザ螢光光度計においては、窒素パルスレーザ（レーザ　サイエンス　社製、 モデルＬＳＩ　−３３７ＮＯ）が励起光源（波長３３７．１ｎｎ）として用いら れる。パルス幅が３ｎｓとされ、また、パルス反復周波数は１ＯＨｚである。発 せられたレーザ光ビームはフィルタ（コーニング）を通過するものとされて、波 長を３３７止とする光以外のノイズ光成分が除去される。そして、窒素パルスレ ーザからのレーザ光ビームは、測定室に入射した後、４５度の角度をもって設置 された、紫外線を反射して可視光を透過させる特性を有するダイクロイック・フ ィルタによって反射される。ダイクロイック・フィルタによって反射されたレー ザ光ビームは、シリカレンズによって、マイクロプレートに設けられた測定ウェ ル上に集束せしめられる。
アクセプタ化合物からの螢光は、同じレンズにより２０度の立体角をもって集め られて平行化され、ダイクロイック・フィルタを直接的に透過する（可視螢光） 。そして、信号（アクセプタ化合物が発する螢光）は、検出対象とされる螢光波 長に応じたものとされる特性を有した干渉フィルタによってノイズ光成分が除去 されたものとされた後、その光度が光電増倍器（ハママツ　Ｒ２９４９）が用い られて測定される。
信号光度の測定に用いられる光子カウンタは、５Ｒ−４００（スタンフォード　 リサーチ　システムズ）であり、その動作及びレーザとの同期状態は、Ｒ３−２ ３２形式の出力端を有したＩＢＭ　ＰＣ−ＡＴタイプのコンピュータによって制 御される。光電増倍器からのパルスは、光子カウンタによって充電増倍器におけ る信号対雑音比に対する要求を小にできるように選定された弁別レベルを越えた 部分が、所定の遅れ時間（ｔ、）後、所定のタイムウィンドウ（ｔ５）に亙って 記録される。
ＩＢＭ　ＰＣ−ＡＴタイプのコンピュータによる駆動のもとに測定用マイクロプ レートの位置を変えるステップモータを備えたＸ−Ｙテーブルが用いられ、その Ｘ−Ｙテーブルによって、励起用のレーザ光ビームが、自動的に、マイクロプレ ートに設けられた９６個の測定ウェルの夫々についての評価を順次行ってマイク ロプレートから離隔することになる状態がとられる。
２００μｌの作業緩衝液及び２００μｌの下記の溶液のいずれが、２００μｆの ２．１０−＠Ｍ　ＥｕＴＢＰ溶液もしくは２００μ４７の２．１０−”ｆｉｌＴ ｂＴＢＰ溶液に加えられる。
・作業緩衝液中において１．２４　・１０−’Ｍの濃度を有するアロフ２−１０ −”Ｍ、　１．６−１０−５Ｍ　モＬ＜ハ１．２・１０−’Ｍ　ノ濃度を有する ローダミンＢ ・＋）Ｒ７，ｌの０．１Ｍトリスアミノメタン　ＨＣＩ　緩衝液中において１， ５４　・１０−’Ｍもしくは９．６・１０−’Ｍの濃度を有するフィコエリトリ ンＢ２ 化合物のみの状態のもとで、ＥｕＴＢＰについては、透過率が８０％で通過波長 域を６１０〜６３０ｎｍとする干渉フィルタが用いられて、波長を６２０ｎｍと する螢光が測定され、また、ＴｂＴＢＰについては、透過率が８０％で通過波長 域を５３５〜５５５ｎｍとする干渉フィルタが用いられて、波長を５４５ｎｍと する螢光が測定される。
第２のステップにおいては、混合液に対する波長を３０７ｎｍとする光による励 起がなされた後、混合液が発する螢光の測定が、アロフィコシアニンを含んだア クセプタ化合物が存在するもとでは波長を６７０ｎｍとする螢光が測定され、ロ ーダミンを含んだアクセプタ化合物を含んだアクセプタ化合物が存在するもと、 及び、フィコエリトリンＢを含んだアクセプタ化合物が存在するもとでは、波長 を５８０ｎｍとする螢光が測定されることにより行われる。
そして、それらの結果は、夫々、０．１ｍｓ及び０．０５ｍ５の遅れ時間を経た 後評価され、さらに、発光信号の寿命も測定される。
その結果については、以下に示される如くである。
１）ｐＨ７，４の０．１Ｍ燐酸塩緩衝液中にＥｕ）リスビピリジンが存在する場 合 ２）ｐＨ８，０の０．１Ｍトリスアミノメタン緩衝液中にＥｕトリスビピリジン が存在する場合 ３）ｐＨ７，１の０．１ＭトリスアミノメタンＨＣＩ緩衝液中にＴｂトリスビピ リジンが存在する場合 ４）ｐＨ７，１の０．１ＭトリスアミノメタンＨＣＩ緩衝液中にＴｂトリスビピ リジンが存在する場合 τは発光信号の寿命 ｔ４は評価遅れ時間 Ａは増幅度 上述の如くに得られる結果は、いずれの場合にも、ドナー化合物のみのときに比 して、アクセプタ化合物により発せられる信号についての所定の増幅度が得られ ていることをあられしている。
そして、斯かる増幅度は１．８から５．９まで変化するものとされている。
実施例　２： 動的増幅試験が、水中あるいはｐＨ７，４の０．１Ｍ燐酸塩緩衝液中において、 ユーロピウム・クリブテート：Ｅｕｈリスビピリジン（ヨーロッパ特許出願０１ ８０４９２の実施例５に従って用意された）が、濃度が１０−”　ｍｏ１７１と されたドナー化合物として用いられるとともに、アロフィコシアニン（サイアノ チック、米国）が、濃度が６．２・１０−’　Ｍとされたアクセプタ化合物とし て用いられたもとで、実施例１の場合と同様にして行われた。
第１のステップにおいては、希土類元素についての不活性化収量（φ５Ｅｕ）が 、二種の緩衝液中において、下記の式に従ってめられた。
τ　フッ ここで、τは実験条件のもとで測定されたユーロピウム・クリプテート：Ｅｕト リスビピリジンの発光寿命であり、また、τ、７は絶対温度７７度のもと（液体 窒素冷却）での重水中におけるユーロピウム・クリブテート：Ｅｕ）リスビピリ ジンの発光寿命である。
また、総合量子収量（φｔｏｔａｌ　）が、従来知られた方法によって、例えば 、ラコウィッツ（Ｌａｋｏｗｉｃｚ）によるｒ螢光分光法の原理Ｊ　（Ｐｒｉｎ ｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　５ｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）、 ブレニウムブレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク（Ｎｅｗ　Ｙｏｒ ｋ）、　１９８３．　に記述されている如くにしてめられた。
その後、螢光についての時分割測定が、゛クリブチーｈ　：　Ｅｕ　トリスビピ リジンとアロフィコシアニンとが実施例１に関連して記述された如くにして接触 せしめられたもとで、実施例１に関連して記述された如くの試作品のレーザ螢光 光度計が使用されて行われた。転移効率は、ディ・トーマ入／他（Ｄ、　Ｔｈｏ ｍａｓ　ｅｔ　ａｌ、）によりビー・エヌーエイ・Ｉス（ＰＮＡＳ）、　１９７ ８．７５．５７４６〜５７５０にあられされた式：Ｅ＝１−τ／τ。（τはアク セプタが存在するもとてのドナーの発光寿命であり、τ。はドナーのみの場合の ドナーの発光寿命である）に従って算出された。
その結果は、表工に示される如くである。
表Ｉ 表−■に示される結果は、低い総合量子収量を有したドナー化合物を用いても、 ドナー化合物からの信号の増幅作用を生じさせる、高い転移効率が得られること をあられしている。
実施例　３： 動的増幅試験が、ヨーロッパ特許出願０１８０４９２に記述されている如くにし て用意されたテルビウム・クリプテート：Ｔｂトリスビピリジンがドナー化合物 として用いられるとともに、フィコエリトリンＢ（シグマ、米国）あるいはロー ダミンＢ（フル力、スイス）がアクセプタ化合物として用いられる実施例１と同 様な状況のもとで、５０％の転移効率が得られることになるアクセプタ濃度をめ るべく行われた。
ディ・トーマ入／他（Ｄ、　Ｔｈｏｍａｓ　ｅｔ　ａｌ、）によりピーーｚヌ・ エイ・ニス（ＰＮＡＳ）、　１９７８．７５．５７４６〜５７５０　に記述され ている如くの、１００％の量子収量を有したテルビウム・キレートＴｂ（ＤＰＡ ）＊が対照標準として用いられた。
結果は、略２％の量子収量を有したテルビウム・クリプテート：Ｔｂトリスビピ リジンがドナーとして用いられたもとで、５０％の転移効率を得ることができる アクセプタ（フィコエリトリンＢあるいはローダミンＢ）の濃度は、１００％の 量子収量を有したテルビウム・キレートＴｂ（ＤＰＡ）　３が用いられて測定さ れた濃度と同じオーダー（６・１０−’　Ｍ）であることをあられしている。こ のことは、ドナーとして用いられたＴｂトリスビピリジンからの信号の増幅がも たらされることになる。
実施例　４−　プロラクチンの分析 上述された信号増幅の原理のプロラクチンの分析に対する適用を示す均質免疫分 析が、ヨーロッパ特許出願　０３２１３５３　（実施例３及び４）に記載されて いる如くにして用意されたユーロピウム・クリブテート：Ｅｕトリスビピリジン ジアミンがドナー化合物として用いられるとともに、アロフィコシアニン（シア ノテッり、米国）がアクセプタとして用いられ、ユーロピウム・クリプテート： Ｅｕ）リスビピリジンジアミン及びアロフィコシアニンめられている抗プロラク チンＥｌ及び３Ｄ３（セ・ア・ニス　バイオ　アンテルナシイオナル、フランス ）に、夫々、結合したものとされた状態のもとに行われた。
下記においては、次の如くの省略表記が用いられる。
ＡＰＣ＝　アロフィコシアン（ａｌ　１ｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎｅ）ＤＴＴ　 ＝　ジチオトレイトール（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）ＥｕＴＢＰ　＝　ユ ーロピウム・クリプテート：Ｅｕトリスビビリジンジアミ：／　Ｃｅｕｒｏｐｒ ｕｔｎ　ｃｒｙｐｔａｔｅ：　Ｅｕｔｒｉｓｂｉｐｙｒｉｄｉｎｅｄｉａｍｉｎ ｅ）ＨＳＡ　＝　人間血清アルブミン（ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉ ｎ）ＩｇＧ　＝　免疫グロブリンＧ　（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ　Ｇ）Ｓ ＰＤＰ　＝Ｎ−スクシンイミジル　３−（ピリジン−２−イリジチオ）プロピオ ナート（Ｎ−ｓｕｃｃｉｎ−ｉｍｉｄｙｌ　３−（１）Ｙｒｉｄｙｌ−２−ｄｉ ｔｈｉｏ）ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）ｓｕｌｆａ　−ＳＭＣＣ＝　サルフォスフシ ンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）−サイクロヘキサン−１−カルボキシ レート（ｓｕｌｆｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉ−ｄｙｌ　４−（Ｎ−ｍａｌｅｉｍｉｄ ｏｍｅｔｈｙｌ）−ｃｙｃｌｏｈｅｘａ−ｎｅ−１−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ） 市販されている硫酸アンモニウムの６０％水溶液中の沈殿物として得られるＡＰ Ｃ（３ｍｇ）が遠心分離器にかけられる。そして、上澄液が除去されて得られる 残りの部分が、２５０μｌのｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液とされ、その 燐酸塩緩衝液が０．８μｍのフィルタが用いられて濾過されて、その中の懸濁粒 子が除去される。
さらに、濾過液が、ｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中に置かれたＧ２５微 細イオン交換樹脂柱（ファーマシア、スウェーデン）を用いた排斥クロマトグラ フィによって精製される。排斥イオン交換樹脂柱内で溶離されたＡＰＣの濃度は 、波長を６５０ｎｍとする光に対すルモル吸光係数が７３１，０００　（ε８Ｓ Ｏｎ＋ａ　＝＝　７３１，０００　Ｍ−’ａｍ−’）となるように設定される。
得られたＡＰＣは、ｐｌ（７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中の濃度が６゜９ｔ ｎＭとされた５ｕｌｆａ　−Ｓ　Ｍ　ＣＣ溶液が添加され、１時間に亙って緩や かに攪拌されるもとて反応が促進される状態におかれることによって活性化され る（ＡＰＣに対する５ｕｌｆｏ　−Ｓ　Ｍ　ＣＣのモル比は７５対１５とされる ）。そして、ＡＰＣ−マレイミドが、５ｍＭのＥＤＴＡを含むｐＨ６，５の１０ ０ｍＭ燐酸塩緩衝液中に置かれたＧ２５微細イオン交換樹脂柱が用いられて精製 され、ＩｇＧ　３Ｄ３との結合まで摂氏４度に維持される。
ｂ’）ＳＰＤＰによるＩｇＧ　３Ｄ３の活性化ｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩 衝液に５ｍｇのＩｇＧ　３Ｄ３が溶解されて得られた濃度を１０　ｍｇ／ｍｌと するＩｇＧ　３Ｄ３が、それに対してジオキサン中の濃度が６．４ｍＭとされた ５ＰＤＰ溶液（ピアース、米国）が、ＩｇＧ　３Ｄ３に対する５ＰＤＰのモル比 が７゜５対ｌとなるように加えられて活性化される。そして、室温のもとて３５ 分間活性化された後、ＩｇＧ−ピリジン−２−チオンが、５ｍＭのＥＤＴＡを含 むｐＨ６，５の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中に置かれたＧ２５微細イオン交換樹脂 柱が用いられて精製される。
その後、室温のもとにおかれた１５分間において、蛋白質が濃縮されるとともに 、ピリジン−２−イエール　ジスルファイド基がＤＴＴ溶液（シグマ、米国）に よって最終濃度が１９ｍＭとなるように希釈される。そして、ＤＴＴ及びピリジ ン−２−チオンが、５１１１Ｍ（７）ＥＤＴＡを含む１７）１８．５の１００＋ ＩＩＭ燐酸塩緩衝液中に置かれたＧ２５微細イオン交換樹脂柱が用いられて精製 されることにより除去される。Ｉ　ｇＧ−３Ｈの濃度は、波長を２８０ｎｍとす る光に対するモル吸光係数が２１０，０００　（ε２＠Ｏ，、、＝　２１０，０ ００　Ｍ　−’　Ｃ１１ｌ−’）となるように設定される。
ｃ）ＡＰＣ−マレイミドによるＩｇＧ　３Ｄ３−ＳＨの共役化チオール基は、１ ｍｇのＩｇＧ　３Ｄ３−ＳＨに対して２．５１ｍｇの活性化されたＡＰＣが加え られることによってマレイミドと結合せしめられる。暗い場所に摂氏４度の状態 で置かれ、緩やかに攪拌されるもとで、１８時間に亙ってインキュベートされた 後、室温のもとて１時間に亙り、自由状態のままで残ったチオール基が１００ｍ Ｍ　Ｎ−メチルマレイミド溶液（シグマ、米国）が加えられることにより捕獲さ れる状態とされ、最終濃度が２０＋ｏＭとなるようにされる。その後、反応媒質 が、ｐＨ７，０の１００ｄ燐酸塩緩衝液中に置かれたＴＳＫ　Ｇ３０００ＳＷイ オン交換樹脂柱（ベックマン、米国）が用いられたゲル濾過によって精製される 。
このようにして溶離される精製された共役溶液中におけるＡＰＣ及びＩｇＧ　３ Ｄ３の夫々の濃度は、波長を２８０ｒ＋ｕ＋及び６５０ｎｍとする光に対する吸 収度合いによって設定され、下記の計算式によりあられされる。
ＣＡＰＣ］、。ｌ／ｌ　＝　Ａｓｓ。、、、　／　７１０．０００（Ｉ　ｇＧ） 、。ｌ／ｌ　＝（Ａｚｓ。ｎｍ　Ａ’２ａ。、、　）／　２１０，０００ここで 、Ａ′２８゜、は、波長を２８０ｎｍとする光に対してのＡＰＣ−マレイミドの 貢献をあられす。
人間血清アルブミン（ＨＳＡ）は、１ｇ／ｌの量をもって共役溶液に加えられ、 その後、共役溶液は小分けされて摂氏−２０度のもとて凍結せしめられる。
２）ＩｇＧ　Ｅ、−ＥｕＴＢＰ共役溶液の用意ＩｇＧ　ＥＩ　ＳＨは、ＩｇＧＥ ＋に対する５ＰＤＰのモル比が１６対４　から変えられることを除いて、上述の ＩｇＧ　３Ｄ３に関する場合と同様にして用意される。
１０％（Ｖ／Ｖ）のジメチルフォルムアミドを含むｐｉ（７，０の２０ｍＭ燐酸 塩緩衝液中における濃度が２５ｍＭとされた５ｕｌｆａ　−Ｓ　Ｍ　ＣＣ溶液が 、５ｍｇ　（５−１０−’　ｍｏｌ）のＥｕＴＢＰに、ＥｕＴＢＰの１ｍ。
１に対して活性化剤が２．５ｍｏｌとされる割合となるように加えられる。そし て、室温のもとて４５分間活性化された後、反応媒質が０．８μｍのフィルタが 用いられて濾過され、生成された沈殿物が除去される。さらに、不所望な反応生 成物（５ｕｌｆａ　−ＳＭＣＣ。
Ｎ−ハイドロオキシスクシンイミド、（Ｎ−マレイミドメチル）カルボキシル酸 ）が、　１０％（Ｖ／Ｖ）のジメチルフォルムアミドを含むｐＨ７，０の２０ｍ Ｍ燐酸塩緩衝液中に置かれたイオン交換樹脂柱（Ｍｏｎｏ　Ｑ　：　ファーマシ ア、スウェーデン）を用いたイオン交換クロマトグラフィによって除去される。
ＥｕＴＢＰ−マレイミドの濃度は、波長を３０７止とする光に対するモル吸光係 数が２５．０００　（εｙｏｔａａ　＝　２５．０００　Ｍ−’Ｃｍ−’）とな るように設定され、また、比：Ａ、。Ｔｎａ　／　Ａ２ｍ。。１　が算出される 。
上述と同様にして、マレイミド基が抗体に結合したチオール基と反応せしめられ て、ＩｇＧ　Ｅ＋　ＳＨに対するＥｕＴＢＰ−マレイミドのモル比が３０対１０ から変化せしめられる。
−暗い場所に摂氏４度の状態で置かれ、緩やかに攪拌されるもと　。
で、１８時間に亙ってインキュベートされた後、室温のもとて１時間に亙り、自 由状態のままで残ったチオール基が１００ｍＭ　Ｎ−メチルマレイミド溶液が加 えられることにより捕獲される状態とされる。その後、非結合状態にあるＥｕＴ ＢＰが、摂氏４度とされたｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中での透析によ り、消尽状態（透析槽内において螢光が発せられなくなる状態）となるように除 去されていく。
このようにして得られる共役溶液の特性は、波長を３０７ｎｍ及び２８０ｎｍと する光に対する吸収度合いによって設定され請求められた比：Ａ３゜＋＋＋ａ／ 　Ａ２ｍ。、１によって定められるクリプテートの内在吸収が考慮され、下記の 如くの値によりあられされる。
ＥｕＴＢＰ−マレイミドのモル吸光係数：ε１ＯＴｌｌ＋＋＋　＝２５，０００ 　Ｍ　−’Ｃｍ−’Ａ３゜ｔｆｉｌＲ／Ａ２１゜。、、：実験的にめられるＩｇ Ｇ　Ｅ、−３Ｈのモル吸光係数： εｆｅ１１、＝　２１０，０００　Ｍ　−’　Ｃｍ−’ε５ｏｒｎＩＩ＝　ＯＭ 　−’　Ｃｍ−’３）プロラクチンの分析への適用 以下のものが、３５０μ１−９６個の測定ウェルが設けられたポリスチレン類の マイクロプレート（ダイナチック、米国）上に順次加えられる。
・１００μｌの濃度が分かている標準プロラクチン溶液−１００μｊ’の濃度が ０．５μｇ／＋１とされたＩｇＧＥ＋　＝ＥｕＴＢＰＥｕＴＢＰ共役溶液 ・１００　ｔｔ　ｌの濃度が３μｇ／ｍｌとされたＩｇＧ　３Ｄ３−ＡＰＣ共役 溶液（アクセプタ） 二つの共役溶液は、濃度１ｇ＃のＨＳＡを含むｐＨ７，４の５０ｍＭ燐酸塩緩衝 液中において希釈される。
室温のもとに１時間に亙ってインキュベートされた後、結果が、実施例１に関連 して記述された如くのレーザ螢光光度計（試作品）が用いられて評価される。こ のレーザ螢光光度計においては、通過波長域を６４０〜６６０ｎｍとするフィル タが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が５０μｓとされ、測定用タイムウ ィンドウが１００μｓとされたもとで行われる。測定結果は、表■にｃｏｕｎｔ ｓ／５ｅａｏｎｄ　（ｃｓｐ）によりあられされて示される如くである。
表■ 表Ｈに示される測定結果は、測定されたドナー−アクセプタ転移に起因する信号 が、媒質中のプロラクチンの濃度の増加に比例して増大する関係にあることをあ られしている。従って、この発明に基づく低い量子収量を有したドナー化合物は 、斯かる形式の免疫分析に取り分は好適である。
実施例　５−　プロラクチンの分析 能の分析が、実施例４とは異なるアクセプタ化合物：フィコシアニンＣ（シアノ チック、米国）が用いられたもとで、実施例４に関する３）の欄に記載された過 程と同様の過程を経て行われた。
以下のものが、３５０μ１−９６個の測定ウェルが設けられたポリスチレン類の マイクロプレート（ダイナチック、米国）上に順次加えられる。
・１００μｌの濃度が分かっている標準プロラクチン溶液・１００μｌの濃度が ０．１もしくは０．５μｇ／ＩＩｌとされたＩｇＧ　Ｅ、−ＥｕＴＢＰ共役溶液 （ドナー）−ｘｏｏμｚの濃度が３μｇ／ｍｌとされたＩｇＧ　３Ｄ３−フィコ シアニン共役溶液 二つの共役溶液は、濃度１ｇ／ｌのＨＳＡを含むｐＨ７，４の５０ｍＭ燐酸塩緩 衝液中において希釈される。
室温のもとに１時間に亙ってインキュベートされた後、測定が実施例１に関連し て記述された如くのレーザ螢光光度計が用いられて行われる。このレーザ螢光光 度計においては、通過波長域を６３７〜８５７ｎｍとするフィルタが備えられる 。測定結果は、表■にｃｏｕｎｔｓ／５ｅｃｏｎｄ　（ａｓｐ）によりあられさ れて示される如くである。
表■ 表■に示される測定結果は、測定されたドナー−アクセプタ転移に起因する信号 が、媒質中のプロラクチンの量の増加に比例して増大する関係にあることをあら れしている。
実施例　６−　抗原１９．９の分析 抗原１９．９は、結腸癌を代表する炭水化物である。抗１９．９抗体についての 部位は反復的抗原決定基とされるので、同一の抗体がドナーを伴って標識化され る態様とアクセプタを伴って標識化される態様とのいずれをもとり得ることにな る。
実施例４に関連して記述された如くに方法により用意された抗体−ＥｕＴＢＰ共 役溶液及び抗体−ＡＰＣ共役溶液が、抗原１９．９の分析としての均質免疫分析 に用いられる。抗原１９．９及び抗１９．９抗体は、米国の“セントコール”か ら入手できる。二つの共役溶液の夫々は、１５０ｍＭのＮａＦ及びＩｇ＃のＨＳ Ａを含んだｐＨ６，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中において希釈される。抗原１ ９．９の標準溶液は、抗原１９．９の濃縮溶液が新生子牛の血清中において希釈 されることによって生成される。
そして、以下のものが、９６個の測定ウェルが設けられたポリスチレン製のマイ クロプレート（ダイナチック、米国）上に順次加えられる。
・５０μｌの抗原１９．９の標準溶液 ・５０μｌの希釈緩衝液 一１００μｊ’の濃度が０．５μｇ／ｍｌとされた抗体−ＥｕＴＢＰ共役溶液 ・１００μｌの濃度が５μｇ／ｍｌとされた抗体／ＡＰＣＡＰＣ共 役溶液もとに３時間３０分に亙ってインキュベートされた後、結果が、実施例１ に関連して記載された如くのレーザ螢光光度計が用いられて評価される。このレ ーザ螢光光度計においては、通過波長域を６４０〜６６０ｎｍとするフィルタが 備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が５０μｓとされ、測定用タイムウィン ドウが４００μｓとされたもとで行われる。測定結果は、表■にアービトレーシ ョン単位（ＡＵ）によりあられされて示される如くである。
表■に示される測定結果は、測定された信号が測定媒質中における抗原！９．９ の量の増加に比例して増加する関係にあることをあられしている。
実施例　７−　初期癌抗原（ＣＥＡ）の分析初期癌抗原の分析としての均質免疫 分析には、二つのモノクロナル抗体Ｇ１２及びＧ１５（セ・ア・ニス　バイオ　 アンチルナジオナル、フランス）が用いられ、これらモノクロナル抗体Ｇ１２及 びＧ１５は、夫々、ユーロピウム・クリブチ−）　：　ＥｕＴＢＰ及びアロフィ コシアニンに結合したものとされる。
二つの共役溶液、即ち、Ｇ１２−ＥｕＴＢＰ及びＧ１５−ＡＰＣの夫々は、１５ ０ｍＭのＮａＦ及びＬｇ／ｌのＨ３Ａを含んだ１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中におい て希釈される。
そして、以下のものが、ポリスチレン製のマイクロプレート（ダイナチック、米 国）上に順次加えられる。
・１００ｕＡの標準溶液 ・１００μｌの濃度が０．５μｇ／ｍｌとされたＧ１２−クリブテート共役溶液 一１００μｆの濃度が５μｇ／ｍｌとされたＧＩ５−ＡＰＣ共役溶液 摂氏３７度のもとて３時間に亙ってインキュベートされた後、結果が、実施例１ に関連して記載された如くのレーザ螢光光度計が用いられて評価される。このレ ーザ螢光光度計においては、通過波長域を６４０〜６６０ｎｍとするフィルタが 備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が５０μｓとされ、測定用タイムウィン ドウが４００μｓとされたもとで行われる。測定結果は、表Ｖにアービトレーシ ョン単位（ＡＵ）によりあられされて示される如くである。
表Ｖ 表Ｖに示される測定結果は、発せられた信号がＣＥＡの濃度の増加に比例して増 加する関係にあることをあられしている。さらに、信号の増幅により、ＣＥＡの 検出がｎｇ／ｍ　ｌオーダーの高感度をもって行われることになる。
実施例　８−　ジゴキシンの分析 ジゴキシンは、心不全に対処するための薬品の活性素成分として用いられる強心 配糖体である。
２６８μｌのＮ　ａ　Ｉ　Ｏａ溶液（フル力、スイス）が、２６８ｔｔｌの無水 エタノール中にジゴキシンが５．３５ｍｇ含まれて成るジゴキシン懸濁液（参照 番号３７１００　フル力、スイス）に加えられる。それにより得られた混合液が 、攪拌される状態をもって、室温のもとて２０分間インキュベートされ、その後 、１００μｌの０．１Ｍグリセリンが加えられることにより反応が停止せしめら れる。活性化されたジゴキシンの最終濃度は、初期重量と最終量とに関連して算 出され、１．２　Ｘｌ０−”　Ｍとされる。
ｂ）活性化されたジゴキシンのアロフィコシアニン（ＡＰＣ）　とｐＨ９，０の 硼酸塩緩衝液中における２ｍｌの精製されたＡＰＣ溶液（シアノチック、米国） に加えられる。それにより得られる混合液が、緩やかに攪拌される状態をもって 、室温のもとて１時間３０分に亙ってインキュベートされ、その後、１．３２ｍ １の硼酸塩緩衝液中におけるＮ　ａ　Ｂ　Ｈ＊の濃度が５ｍｇとされた水酸化硼 素ナトリウム溶液の１００μｌが加えられることにより反応が停止せしめられる 。
ｃ）ＡＰＣ−ジゴキシン・トレーサの精製２ｍｌの反応混合液が、ＨＲ１０／１ ０　Ｇ２５イオン交換樹脂柱（ファーマシア、スウェーデン）に噴射されて、ｐ Ｈ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中で平衡化されるとともに排除体積において 溶離される。過剰試薬は、８ＩＩｌｌの緩衝液によって溶離される。
１．２２　ｍｇ／ｍｌのＡＰＣ（波長を６５０ｎｍとする光に対する吸光度によ る測定による）を含む、およそ４ｍｌのＡＰＣ−ジゴキシン結合生成物の溶液が 回復せしめられる。ジゴキシンの濃度は、ＲＩＡあるいはＤＥＬＦＩＡ　（ファ ーマシア、スウェーデン）によってめられる。算出されたアロフィコシアニン対 ジゴキシンの最終モル比はおよそ０．８である。
Ｂ１人間の血清中におけるジゴキシンの競争均質分析抗体−ユーロピウム・クリ ブチ−）　：　ＥｕＴＢＰジアミン共役溶液が、抗ジゴキサン・マウス・モノク ロナル抗体（参照番号０３１６０４　Ｍ　、アンチルシム、フランス）が用いら れ、実施例１に関連して記述された如くにして用意される。この抗体／クリブテ ート共役溶液は、１５０ｍＭのＮａＦ及び１ｇ／Ｉ！のＨＳＡを含んだｐＨ７， ０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中における濃度が０．５μｇ／ｍＩ！とされて用い られる。
ＡＰＣ−ジゴキサン・トレーサは、１５０ｍＭのＮａＦ及び１ｇ／ｌのＨＳＡを 含んだｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中における濃度が０．２μｇ／ｍｊ ！とされて用いられる。
ジゴキサン標準溶液は、ジゴキサン溶液（フル力、スイス）が、人間の血清中に おいて、５０１５０の配分とされたエタノール−水混合液における濃度がｌｌｌ １ｇ／ｌｌ１１！とされるように希釈されることによって用意される。標準溶液 曲線は、５０μｌの燐酸塩緩衝液、５０μｌの標準溶液、１００μｌのＡＰＣ− ジゴキサン・トレーサ、及び、１００μｌの抗体／クリブテート共役溶液を含ん だ複数種の各２５０μｌのサンプルをもって形成される。
分析対象とされる複数種のサンプルは、５０μｌの標準溶液が５０μｌの個々の 分析されるべき血清に置き換えられることを除いて、同じ組成を有する。
分析は、９６個の測定ウェルが設けられたマイクロプレート（ダイナチック、米 国）において行われる。室温のもとに３０分間インキュベートされた後、結果が 、実施例１に関連して記述された如くのレーザ螢光光度計が用いられて処理され る。このレーザ螢光光度計においては、通過波長域を６５５〜６７５ｎｍとする フィルタが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が５０μｓとされ、測定用タ イムウィンドウが１００μｓとされたもとで行われる。
その測定結果は、Ｂ／Ｂ、比のパーセンテージとしてあられされ、Ｂは、各標準 溶液に関して得られる値であり、また、Ｂｏは、標準溶液０に関して得られる値 である。得られた結果は、表■に示される。
表■ 表■に示される測定結果は、得られた値が、ジゴキサンの濃度の増加に応じてリ ニアーに低減する関係にあることをあられしている。
メタノール中に８．７ｍｇ／ｍ　ｌ　（５０ｍＭ）含まれたＳ−ＡＭＳＡの溶液 （シグマ、米国）の５００μｆが、メタノール中に２０　ｍｇ／ｍＩ！含マした Ｔ４の溶液（カルパイオシエム、フランス）の５００μｌに加えられ、それによ り得られた混合液が、メタノール中に６．９５ｍｇ／ｍｌ　（１００ｍＭ）含ま れたハイトロキシルアミンの溶液の５００μｌが加えられる前に、室温のもとて １５分間インキュベートされる。
その後、９７５μｌの反応混合液が除去され、５２５μｌのＭＩＬＬＩＰＯ−Ｒ Ｅ　ＨＡ　０．４５μｍフィルタによって濾過された二重蒸留水が加えられる。
この溶液は、そのうちの２５０ｔｔｌが、Ｐｅｐ、ＲＰＣＨＲ５１５ＨＰＬＣイ オン交換樹脂柱を通過するものとされ、６５／３５　の配分とされたエタノール −水混合液によって溶離される。
溶離された最初の３個のピークは回復せしめられ、それに続く部分が混合されて 、回転蒸発器において蒸発せしめられる。それにより、およそ３ｍｇの活性化さ れたＴ、（Ｔ、−５Ｈ）が回復せしめられる。
ｂ）ＳＭＣＣによるアロフィコシアニンの活性化１０ｍｇのＡＰＣが、ＡＭＩＣ ＯＮ　ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ　３０コーンが用いられるちとで精製されるとともに 濃縮され、その７００μｌについて１０゜６　ｍｇ／ｒｎｌの濃度を有するもの とされる。ｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中に１０　ｍｇ／ｍｌ含まれた ５ｕｌｆｏ　−Ｓ　Ｍ　ＣＣの溶液（ピアース、米国）の１６０μｌが、ＡＰＣ 溶液に加えられる。それにより得られる反応溶液は、それにより得られる混合液 が、攪拌される状態をもって、室温のもとて１時間インキュベートされ、その後 、活性化されたＡＰＣが、ｐＨ７，０の燐酸塩緩衝液中に置かれたＧ２５　ＨＲ １０／１０イオン交換樹脂柱（ファーマシア、スウェーデン）を用いた排除クロ マトグラフィによって精製される。
Ｔ、−８Ｈのフラスコ内には、２００μｌのメタノールが混入しており、その溶 液の５０ＭμｌがｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝液中における２Ｉ１１の活 性化されたＡＰＣ溶液に加えられる。それにより得られる反応混合液が、攪拌さ れる状態をもって、摂氏４度のもとて１８時間に亙ってインキュベートされ、そ の後、過剰マレイミドの部位が、燐酸塩緩衝液中における１／１０のメルカプト エタノール（シグマ、米国）の５μｌによって遮断される。
ｄ　）ＡＰＣ−Ｔ、トレーサの精製 反応混合液が、ＡＭＩＣＯＮ　ＣＥＮＴＲＩＣＯＮ　３０限外濾過装置が用いら れるちとで、全体で１ｍｌとなるように濃縮され、それに、燐酸塩緩衝液中に１ ｍｇ／ｍ　ｌ含まれたＮ−ＡＡＮＳの溶液の５０μｌが加えられる（Ｎ−ＡＡＮ Ｓの最終濃度は、およそ５０μｇ／ｍｆ）。トレーサは、最終的に、ｐＨ７，０ の１１００ｎ燐酸塩溶離緩衝液中に置かれたＰＨＡＲＭＡＣ［Ａ　Ｇ２５　ＨＲ １０／１０排除クロマトグラフイ・イオン交換樹脂柱が用いられて精製され、０ ．８　ｔｎｇ／＋ｏｌの濃度を有した、およそ２．５ｍｌのトレーサとされる（ 算出された波長６５０ｎｍの光に対するモル吸光係数は、ε＝７３１．０００で ある）。
各ＡＰＣ分子に結合する１４分子の数は、トレーサのＲＩＡ及びＴ、標準溶液曲 線（Ｒ４−ＫＰＲｋｉｔ　、オリス　アンディストリ、フランス）との比較によ ってめられる。計算によれば、精製されたトレーサについてのＡＰＣに対するＴ ４の比は１．４である。
ＡＰＣ−Ｔ、トレーサは、Ｎ−ＡＮＳ　（コダック、米国）から合成されたＮ− ＡＡＮＳの存在のもとに、ヒンズ他により記述された手法（ＣＬＩＮ、　ＣＨＥ Ｍ、、　３２．１６〜２１．１９８６）によって精製される。
Ｂ０人間の血清中におけるチロキシンの競争均質分析抗体−ヨーロピウム・クリ プテート：　ＥｕＴＢＰジアミン共役溶液が、抗Ｔ、Ｒ，，マウス・モノクロナ ル抗体（セ・ア・ニスバイオ　アンテルナシイオナル、フランス）が用いられ、 実施例１に関連して記述された如くにして用意される。この共役溶液は、１２０ ｍＭのＮａＦ及び０．２％のＨ３Ａを含んだｐＨ７，０の１００ｍＭ燐酸塩緩衝 液中における濃度が２μｇノｍｌとされて用いられる。
Ｔ、標準溶液は、イオン交換処理が施されてＴ４が無いものとされた人間の血清 中においてＴ４が希釈されることによって用意される。標準溶液曲線は、５０μ ｌのＮ−ＡＡＮＳ溶液、５０μｌのＴ４を含まない人間の血清、あるいは、５０ μｌのＴ４標準溶液。
１００μｌのＡＰＣ−Ｔ、トレーサ、及び、　１００μｌの抗体／クリブテート 共役溶液を含んだ２５０μｌの複数種のサンプルをもって形成される。
分析対象とされる複数種のサンプルは、５０μｌの標準溶液が５０μｌの個々の 分析されるべき血清に置き換えられることを除いて、同じ組成を有する。
分析は、９６個の測定ウェルが設けられたマイクロプレート（ダイナチック、米 国）において行われる。室温のもとに３０分間インキュベートされた後、結果が 、実施例１に関連して記述された如くのレーザ螢光光度計が用いられて評価され る。このレーザ螢光光度計においては、励起光源として、周波数を１．０００） １ｚとするフラシュ・ランプが用いられるとともに、通過波長域を６５５〜６７ ５ｎｍとするフィルタが備えられ、信号光度の測定が、遅れ時間が５０μｓとさ れ、測定用タイムウィンドウが１００μｓとされたもとで行われる。
その測定結果は、Ｂ／ＢＯ比のパーセンテージとしてあられされ、Ｂは、各標準 溶液に関して得られる値であり、また、Ｂｏは、標準溶液０に関して得られる値 である。分析対象とされる各サンプルの濃度は、標準溶液曲線との比較がなされ て算出される。
得られた結果は、表■に示される。
表■ 表■に示される測定結果は、得られた値が、Ｔ、の濃度の増加に応じてリニアー に低減する関係にあることをあられしている。
国際調査報告 ｌ、１１１．Ａ、、ｋｌｌ、２ＰＣＴＩＦＲ９１１００５６７国際調査報告 Ｔｌｌｌ１１−−ｔｈｌツーー−１−１・伽−７４１＋＋　−ｍ７ｍｚ、Ｔｈｅ 　−帽Ｉｅｍ−ｋｍ　１呻−ａｓｍ　０ＩＦｌａｖ　ＥＤＰ　ｋ　Ｍ　Ｘ６ｍｒ ９＋η―−■−−Ｆ−一（Ｍｒｗｍ−一−ｍｙ　ｄｍ　ｊｗ−一−−−１ｉ−１ 四−ｙｍｍ　ｂｒ　１リ−一曽ｅｌ　ｋｄｗｖｕｋｈフロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。
ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ 、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ，ＳＮ、　ＴＤ、　 ＴＧ）、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ３，ＦＩ、　ＨＵ、ＪＰ 、　ＫＰ。
ＫＲ，ＬＫ、ＭＣ，ＭＧ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＯ，ＰＬ、　ＲＯ，ＳＤ、５Ｕ （７２）発明者　アスプ　ダニエル フランス　３０２９０　ローダン　リュ　アリステイト　ベルジェール　１３３ （７２）発明者　フォエンタン　ムリールフランス　８４０００　アヴイニオン 　リュジオルジェ　トーリエ　１ （７２）発明者　ジオル　エティエンヌ　ジャン−ビニールフランス　３０２０ ０　バニュールーシーーセフランス　８４０００　アヴイニオン　リュドユ　シ ャポー　ルー　２３

Claims (15)

    【特許請求の範囲】
  1. １．螢光アクセプタ化合物が用いられる螢光分析においてドナー化合物として用 いられる螢光化合物を不十分な総合量子収量を有するものとし、ドナー発光準位 の放射性不活性化についての量子収量を上記アクセプタの量子収量より低くして 、上記ドナー化合物として用いられる螢光化合物からの発光信号を増幅する螢光 化合物からの発光信号増幅方法。
  2. ２．螢光アクセプタ化合物が用いられる螢光分析において螢光ドナー化合物とし て用いられる希土類キレートもしくは希土類クリプテートを不十分な総合量子収 量を有するものとし、希土類発光準位の放射性不活性化についての量子収量を上 記アクセプタの量子収量より低くして、上記螢光ドナー化合物として用いられる 希土類キレートもしくは希土類クリプテートからの発光信号を増幅する螢光化合 物からの発光信号増幅方法。
  3. ３．アナライトを含む可能性のある媒質中におけるアナライトの検出及び／又は 測定を、 １）上記媒質に、少なくとも一個の上記アナライトに対するレセプタを含んで成 る第１の試薬を添加するステップ；２）上記媒質に、上記アナライト及び少なく とも一個のレセプタのうちから選択された第２の試薬を添加するステップ；及び 、３）上記第１及び第２の試薬の夫々が添加された媒質を、螢光ドナー化合物に 対する励起波長に相当する波長を有した光によって励起した後、螢光アクセプタ 化合物によって発せられる信号を測定するステップ； をもって、アナライトと少なくとも一つの対応するレセプタとの反応による生成 物を螢光を利用して検知することにより行うにあたり、上記螢光ドナー化合物が 希土類キレートもしくは希土類クリプテートから成り、上記第１及び第２の試薬 のうちの一方が上記螢光ドナー化合物と結合したものとされるとともに他方が螢 光アクセプタ化合物と結合したものとされ、上記第１の試薬を添加するステップ と上記第２の試薬を添加するステップとが順序が可逆のものとされたもとで、上 記螢光ドナー化合物を成す希土類キレートもしくは希土類クリプテートが不十分 な総合量子収量を有すものとされ、希土類発光準位の放射性不活性化についての 量子収量が上記螢光アクセプタ化合物の量子収量より低くされたことを特徴とす るアナライトの検出及び／又は測定を行う均質方法。
  4. ４．アナライトを含む可能性のある媒質中におけるアナライトの検出及び／又は 測定が、 １）上記アナライトを含む媒質に、少なくとも一個のアナライトに対するレセプ タから成り、希土類キレートもしくは希土類クリプテートから成る螢光ドナー化 合物と結合した第１の試薬を添加するステップ； ２）上記媒質に、一個もしくは複数個の他の上記アナライトに対するレセプタか ら成り、螢光アクセプタ化合物と結合した第２の試薬を添加するステップ； ３）上記第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第１及び第 ２の試薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、上記螢光ドナー化合物に対する励起波長に相 当する波長を有した光源からの光によって励起するステップ；及び、 ５）上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ； を含む過剰分析方法により行われることを特徴とする請求の範囲第３項記載の均 質方法。
  5. ５．アナライトを含む可能性のある媒質中におけるアナライトの検出及び／又は 測定が、 １）上記アナライトを含む媒質に、上記アナライトに対するレセプタから成り、 希土類キレートもしくは希土類クリプテートから成る螢光ドナー化合物と結合し た第１の試薬を添加するステップ； ２）上記媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合したアナライトを成す第２の試薬 を添加するステップ； ３）上記第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第１及び第 ２の試薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、上記螢光ドナー化合物に対する励起波長に相 当する波長を有した光によって励起するステップ；及び、 ５）上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ； を含む競争分析方法により行われることを特徴とする請求の範囲第３項記載の均 質方法。
  6. ６．アナライトを含む可能性のある媒質中におけるアナライトの検出及び／又は 測定が、 １）上記アナライトを含む媒質に、螢光アクセプタ化合物と結合した、上記アナ ライトに対するレセプタから成る第１の試薬を添加するステップ； ２）上記媒質に、希土類キレートもしくは希土類クリプテートから成る螢光ドナ ー化合物と結合したアナライトを、第２の試薬として添加するステップ； ３）上記第１及び第２の試薬の夫々が添加された後、あるいは、上記第１及び第 ２の試薬の両者が添加された後、得られた媒質をインキュベートするステップ； ４）インキュベートされた媒質を、上記螢光ドナー化合物に対する励起波長に相 当する波長を有した光によって励起するステップ；及び、 ５）上記螢光アクセプタ化合物によって発せられる信号を測定するステップ； を含む競争分析方法により行われることを特徴とする請求の範囲第３項記載の均 質方法。
  7. ７．第１の試薬及び第２の試薬がアナライトを含んだ媒質に同時に添加されるこ とを特徴とする請求の範囲第３項，第４項，第５項又は第６項記載の均質方法。
  8. ８．アナライトに対する単一のレセプタであって螢光ドナー化合物または螢光ア クセプタ化合物と結合したものが用いられることを特徴とする請求の範囲第３項 又は第４項記載の均質方法。
  9. ９．ドナー化合物が、テルビウム・キレート，テルビウム・クリプテート，ユー ロピウム・キレートトもしくはユーロピウム・クリブテートとされたことを特徴 とする請求の範囲第１項，第２項，第３項，第４項，第５項，第６項，第７項又 は第８項記載の方法。
  10. １０．ドナー化合物が、一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｚは窒素，炭素もしくは燐の如くの３価もしくは４価の原子を示し、Ｒは水素 ，水酸基，アミノ基又は炭化水素基、あるいは、なにも無いことを示し、（Ａ） ，（Ｂ）及び（Ｃ）は２価の基を示す。） によりあらわされる巨大多環式化合物によって錯体化された少なくとも一つの希 土類塩から成る希土類クリプテートとされ、２価の基（Ａ），（Ｂ）及び（Ｃ） の夫々が、一つもしくは複数のヘテロ原子を含有して巨大複素環で断続された炭 化水素環であり、また、上記（Ａ），（Ｂ）及び（Ｃ）のうちの少なくとも一つ が、少なくとも一つの分子単位を含有して成るものか、あるいは、本質的に一つ の分子単位から成るものとされ、その分子単位が錯体化された希土類イオンの発 光準位より大である三重項エネルギを有するものとされることを特徴とする請求 の範囲第９項記載の方法。
  11. １１．希土類クリプテートが、一般式：▲数式、化学式、表等があります▼ によりあらわされる巨大多環式化合物によって錯体化されたものとされ、２価の 基（Ａ），（Ｂ）及び（Ｃ）が、−Ｃ２Ｈ４−Ｘ１−Ｃ６Ｈ４−Ｘ２−Ｃ２Ｈ４ −（Ｘ１及びＸ２は、同一であっても相違してもよく、酸素，窒素もしくは硫黄 を示す）； −Ｃ２Ｈ４−Ｘ１−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−ＣＨ２−Ｘ２−Ｃ２Ｈ４− （Ｘ１及びＸ２は、同一であっても相違してもよく、酸素，窒素もしくは硫黄を 示す）；もしくは、 ▲数式、化学式、表等があります▼；▲数式、化学式、表等があります▼▲数式 、化学式、表等があります▼ （Ｘは酸素もしくは水素である。） であらわされることを特徴とする請求の範囲第９項記載の方法。
  12. １２．ドナー化合物がテルビウム・クリプデート：Ｔｂトリスジピリジンもしく はユーロピウム・クリプテート：Ｅｕトリスジピリジンとされることを特徴とす る請求の範囲第９項又は第１０項記載の方法。
  13. １３．螢光ドナー化合物が、式Ｉ； ▲数式、化学式、表等があります▼ もしくは、式ＩＩ； ▲数式、化学式、表等があります▼ ＩＩ によりあらわされる巨大多環式化合物によって錯体化された少なくとも一つの希 土類塩から成る希土類クリプテートとされ、式： ▲数式、化学式、表等があります▼ であらわされる環が、二つの環： １）３　ｎ＝０又は１ ▲数式、化学式、表等があります▼［Ｎ２Ｏ４］巨大環又は（２２）環［Ｎ２Ｏ ３］巨大環又は（２１）環 ▲数式、化学式、表等があります▼ ２）ビスビピリジン巨大環 のうちの一つであり、 ・Ｙが、一つもしくは複数の二重結合を含んだ、及び／又は、一つもしくは複数 の酸素，窒素，硫黄もしくは燐の如くのヘテロ原子によってＣ５〜Ｃ５シクロア ルキレン基もしくはＣ６〜Ｃ１４アリレン基から分断された線状もしくは分枝状 Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン基から選択された２価の有機基から成る基もしくはスペ ース・アームであり、斯かるアルキレン基，シクロアルキレン基あるいはアリレ ン基は、アルキル基，アリル基あるいはサルフォネート基による置換される状態 あるいは置換されない状態をとるものとされる； ・Ｚが、生体物質と共有結合することができる官能基とされ；・Ｒが、メチル基 あるいは−Ｙ−Ｚ基とされ；・Ｒ′が、水素あるいは−ＣＯＯＲ′′基とされて 、Ｒ′′はＣ１〜Ｃ１０アルキル基及び、好ましくは、メチル基，エチル基ある いはテルトーブチル基であり、さもなくば、Ｒ′は−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ｚ基であ る、 ことを特徴とする請求の範囲第８項記載の均質方法。
  14. １４．螢光ドナー化合物が、ユーロピウム・クリプテートとされるとともに、螢 光アクセプタ化合物がアロフィコシアニン，アロフィコシアニンＢ，フィコシア ニンＣ及びフィコシアニンＲのうちから選択されたものとされることを特徴とす る請求の範囲第１項，第２項，第３項，第４項，第５項，第６項，第７項又は第 ８項記載の方法。
  15. １５．螢光ドナー化合物がテルビウム・クリプテートとされるとともに、螢光ア クセプタ化合物がローダミン，チオニン，フィコシアニンＲ，フィコエリトロシ アニン，フィコエリトリンＣ，フィコエリトリンＢ及びフィコエリトリンＲのう ちから選択されたものとされることを特徴とする請求の範囲第１項，第２項，第 ３項，第４項，第５項，第６項，第７項又は第８項記載の方法。
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