JPH06501152A - 動物およびヒトにおける感染の治療および予防用の新規な抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 動物およびヒトにおける感染の治療および予防用の新規な抗体発明の背景 動物およびヒトにおける感染の予防および治療に対する有効な薬剤が古くから要 求されてきた。典型的な方法は、微生物の増殖を抑制し、感染因子を撲滅させる 免疫系を付与する化学薬剤を投与することからなる。天然および合成の化学物質 は細菌感染に対する治療剤として特に効果的であるが、耐性株の出現が幾つも証 明されており、問題となっている。ウィルス感染の場合、化学薬剤は効果が限定 されており、疾患の重度は、通常、免疫系状態と相関している。

長年の間、免疫固体からの血清の感染症の予防および治療に対する有効性が知ら れている。しかし、効果的な治療に関与するヒト免疫血清中の抗体、すなわち、 中和抗体成分は、血清抗体全体の非常に小さなフラクションにすぎない。さらに は、免疫血清の使用は、中和抗体レベルが低いことにより、免疫ドナーの不足に より、治療コストにより、最近ではドナー血清中の微生物を介する疾患の二次的 な広がりの危険性により制限されている。

モノクローナル抗体技法の発達は、病原性微生物の全くない細胞株から多量の純 粋なマウスモノクローナル抗体を発達させ、かつ生産する手段を提供した。この 技法を用いて、病原性微生物と相互に影響しあうモノクローナル抗体を得ること が可能であり、そのモノクローナル抗体のうち幾つかは、感染マウスにおける標 的微生物の増殖を防御することができた。残念ながら、イン・ビトロにおける研 究から、どのような抗体がイン・ビボで微生物を不活性化するのに最も効果的で あるかを予想することは不可能である。イン・ビトロの設定条件でその標的に対 して高結合親和性を有する多くのモノクローナル抗体がイン・ビボでは効果的で はない。事実、抗体が、実験室条件下、微生物の増殖を防御するに効果的である い（つかのケースにおいて、イン・ビボ条件下ではそれらの抗体が効果的でない ことが証明されている。

感染疾患の処理についてのマウスモノクローナル抗体の衝撃および限定が、呼吸 器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）感染のケースにより説明されている。ＲＳＶは幼児 の下部呼吸器管感染の主たる原因であり、若ウソにおける呼吸器疾患の有意な原 因である。ヒトの場合、Ｒ８Ｖ感染に対して免疫処置しようする多くの試みが失 敗しており、リバヴイリン（ｒｉｂａｖｉｒｉｎ）のような化学薬剤を用いるＲ ３Ｖ感染の治療が部分的に有効であるにすぎない。ＲＳＶに特異的なマウスモノ クローナル抗体が、マウスにおけるＲＳＶの予防および治療に効果的であること が示されている。しかし、非−マウス種におけるＲＳＶの治療および予防のため のマウスモノクローナル抗体の使用は、「外因性」マウス抗体に対するこれらの 種の免疫応答により潜在的に制限されており、すなわち、マウス抗体に対するヒ トの免疫応答が免疫グロブリンの定常および可変領域（ヒト抗−マウス抗体）の 両方に示された。かくして、Ｒ５Ｖ感染の効果的な予防および治療のためには、 免疫グロブリン定常および可変領域がＲ５Ｖ感染受容者によって「自己（ｓｅｌ ｆ）　Ｊとして認識されるアミノ酸配列を含むモノクローナル抗体の非−免疫原 性変異体が必要である。

組換え型ＤＮＡ技法は、一つの種からの特異的免疫グロブリン（Ｉｇ）領域を別 の種からの領域と置換するために、抗体を改変する能力を特徴する特許協力条約 特許出願番号ＰＣＴ／ＧＢ８５１００３９２　にューベルガー（Ｎｅｕｂｅｒｇ ｅｒ）ら、およびセルチック・リミテッド（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ　Ｌｉａｉｔｅｄ ）　）は、−の方法であって、−の種からの１２分子の相補的型および軽鎖可変 ドメインを別の種の相補的型および軽鎖１ｇ定常ドメインと組み合わせることが できると記載している。この方法を用い、例えば、特定のヒト疾患に向けられた マウスモノクローナルを改変することができる。このような改変は、マウス抗体 定常領域ドメインをヒト１ピＧ定常領域ドメインで置換することによりなされ、 このようなヒト疾患の処理に潜在的に用いられる「キメラ」抗体を創造する。し かし、このようなキメラ抗体は、マウス（すなわち、「外因性」）可変領域に対 するヒトにおける免疫応答をなお潜在的に誘発するであろう。

英国特許出願公開番号ＧＢ２１８８６３８Ａ　（ウィンター（ｆｉｎｔｅｒ）　 ）は、−の方法であって、−の種からのその相補性決定領域（ＣＤＲ）を別の種 からの相補性決定領域で置換することによって抗体を改変する方法を記載してい る。この方法を用い、例えば、ヒト重および軽鎖１ｇ可変領域ドメインからのＣ ＤＲをマウス可変領域ドメインからの別のＣＤＲで置換することができる。これ らの改変Ｉｇ可変領域は、その後、ヒト１ｇ定常領域と組み合わされ、置換され たマウスＣＤＲを除き、構成が全体的にヒトについてである抗体を創造する。こ のようなマウスＣＤＲ置換抗体はほとんどマウス成分を含有していないため、ヒ トにおいてキメラ抗体と比較してかなり減少した免疫応答を誘発しそうである。

しかし、英国特許出願公開番号ＧＢ２１８８６３８Ａにて記載されているように 、単に１またはそれ以上のＣＤＲを所望の疾患に特異的である別の種からの相補 性ＣＤＲと置換することによって、必ずしも相補性ＣＤＨのその抗原結合能を保 持する改変抗体（ａｌｔｅｒｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）が得られるとは限らない 。その英国特許出願は、「慣用的実験操作により、または試行錯誤により」、抗 原結合能を有する機能的改変抗体が得られるかもしれないと提案している。しか し、所望の抗体を得るに要する慣用的実験操作または試行錯誤方法の特性に関す る記載は何ら提供されておらず、種々の源からのＣＤＲの連続的置換を試みるべ きであるとの示唆がなされている。

いくつかのＩｇＧの立体構造の試験により、重および軽鎖の１ｇ可変領域の各々 が、可変領域フレームワークと称されるシート様構造上に支持された３つのルー プ構造（ＣＤＲを含む）からなるという結論に達した。ＣＤＲを構成するものお よびフレームワークを構成するものの生な定義は多数のＩｇのアミノ酸配列に基 づいている。

三次元配置において、マウスとヒト抗体の間で前記のロープ構造およびＣＤＲは かなり重複しているが、正確には一致していない。かくして、ある場合には、Ｃ ＤＨの置換による抗原結合特異性のトランスファーは、その特定のＣＤＲに隣接 する残基のさらなる置換を必要とするようである。例えば、ある場合には、可変 領域のフレームワークアミノ酸残基が、ＣＤＲとの直接的相互作用を介する抗原 結合において重要であるかもしれないという仮説が設けられている（アミット（ Ａｍｉｔ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３３　（１９８６）、７４７ 〜７５３頁。

クイーン（Ｑｕｅｅｎ）ら、プロシーディング・オフ・ナショナル・アカデミ− ・オフ・サイエンシス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　）　、旦 ６　（１９８９）１００２９〜１００３３頁：およびプロティン・デザイン・ラ プス（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｄｅｓｉｇｎ　Ｌａｂｓ）　。

１９９０年７月２６日に公表された特許協力条約の特許出願公開番号ＷＯ９００ ７８６１参照）。クイーン（Ｑｕｅｅｎ）らの引用文献において、かれらはその 置換用に用いたＣＤＲを含有するマウス可変領域に対して最大の相関関係を有す ることを基礎としてマウスＣＤＲ−１換用のヒト可変領域を選択した。加えて、 コンピューター・モデリングを基礎として、クイーンらは、マウスＣＤＲと相互 に作用すると考えられる幾つかのマウスフレームワークアミノ酸を含む、ＣＤＲ 置換用のヒトフレームワークを用いた。得られた改変抗体は、抗原結合能を保持 しているが、さらなるマウスフレームワークアミノ酸を含有した。このような付 加的マウスフレームワークアミノ酸が、ヒトにおける改変抗体に対する免疫応答 の強化に寄与しているかもしれない。

加えて、以前の研究（例えば、リーチマン（Ｒｉｅｃｂｍａｎｎ）ら、ネイチャ ー（Ｎａｔｕｒｅ）、３３２　（１９８８）、３２３〜３２７頁参照）は、新形 態（ｒｅｓｈａｐ−ｉｎｇ）を用いてイン・ビトロでの高親和結合性をマウスか らヒト抗体に移行させるのに用いることができることを証明しているが、イン・ ビボにおけるヒト呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）の増殖を効果的に防御するこ とを保つのに必要な特性の組み合わせを得ることが可能であることは以前には示 されていない。

かくして、感染疾患を予防および治療するための最小免疫原性を有する改変抗体 についての要求がある。加えて、可変領域フレームワークのラジカルな改変およ び免疫原性におけるその付随効果を伴うことなく、このような改変抗体を生産す る限定方法についての要求がある。本発明は、感染疾患の予防および治療用の改 変抗体および重要な可変領域フレームワークの修飾だけを導入することによりそ れらを生産する方法を提供するものである。

バラミクソウィルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ　ｆａｍｉｌｙ）　、 ニューモウイルス属（ｇｅｎｕｓ　Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）に属するＲＳＶが 、若い子供での下部呼吸気管感染の主原因である。−次感染は不完全な免疫性を 付与し、子供の間で再感染が頻繁に観察される。ヒト疾患の免疫機構の役割は明 らかにされていない。弱毒化または死滅Ｒ３Ｖを用いて有効なワクチンを発達さ せる以前の試みは失敗に終わった、すなわち、子供達は防御されないだけでなく 、その後のＲＳＶでの感染が、時々、非免疫処置の対照よりもさらに激しい疾患 をもたらした。Ｒ３Ｖｇ染はまた、若ウシにおける呼吸気感染の主原因である。

最近、ＲＳＶタンパク質の抗原および機能特性に関する、ある種の免疫学的およ び分子情報が得られた。ＲＳＶ融合タンパク質（Ｆ）およびＲ３Ｖ付着タンパク 質（Ｇ）が主たるウィルス抗原として同定されており、その遺伝子がクローン化 されかつ配列されている。ＡおよびＢと称せられる、２種類の抗原的に異なるサ ブグループのヒトＲＳＶが記載されている。サブグループＡおよびＢの間の抗原 的な差異は、主としてＲＳＶ　Ｇタンパク質上にある。対照的に、ＲＳＶ　Ｆタ ンパク質は該２つのサブグループ、およびこれらのサブグループ内にある種々の 菌株の間で高度の遺伝子的および抗原的相同性を有する。

ＲＳＶの両方のエンベロープ糖タンパク質（ＦおよびＧ）に向けられたモノクロ ーナル抗体（ｍＡｂｓ）が該ウィルスを中和することが証明された（ワルシュ＆ フルスカ（Ｗａｌｓｈ＆Ｈｒｕｓｋａ）ジャーナル・オフ・バイ０ロジー（Ｊ、 　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　。

旦、１７１〜１７７　（１，９８３）；およびワルンユら（ｌｆａｌｓｈ）ら、 ジャーナル・オフ・ジェネラル・バイ０ロジー（Ｊ、Ｇｅｎｖｉｒｏｌｏｇｙ） 　、　６５．　７６１〜７６７　（１９８４）参照）。しかし、Ｆタンパク質発 現のｍＡｂｓまたはワクシニアウィルス組換え体でのイン・ビトロおよびイン・ ビボにおける研究は、このタンパク質が交差防御免疫を誘発するのに最も重要な 抗原であることを示唆している（ンョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、ジャーナル ・オフ・パイロロシー（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　。

シーディング・オフ・ナショナル・アカデミ−・オフ・サイエンス・オフ・ザ・ ユナイティッド・ステープ・オフ・アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、＾ｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ）、７４６２〜７４６６　（１９８６）　１ウエルツ（ Ｗｅｒｔｚ）ら、ジャーナル・オフ・パイロロジー（Ｊ、ｌ’ｉｒｏｌｏｇｙ） 　、６１．　２９３〜３１０　（１９８７）　；およびワルノユ（Ｖａｌｓｈ） ら、インフェクンヨン・アンド・イムニティー（Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄＩ ｍｍｕｎｉｔｙ）、４３．　７５６−７５８　（１９８４）参照）。数人ノ著者 ハ、Ｆタンパク質において異なる抗原部位を同定し、少なくとも３つの抗原部位 が中和に関与していることが示されている。２つまたは３つ中和エピトープが別 の方法でＦタンパク質上に位置することが確認された。逸脱（ｅｓｃａｐｅ）変 異体ウィルスを用い、ロペス（Ｌｏｐｅｚ）らは、ジャーナル・オフ・パイロロ ジー（ＪＪｉｒｏｌｏｇＹ）　。

６４．９２７〜９３０　（１９９０）において、Ｆタンパク質のＦ、サブユニッ トの２つのアミノ酸残基（すなわち、２６２−Ａｓｎおよび２６８−Ａｓｎ）が 個々の中和エピトープの統合性に不可欠であることを示している。別の高度に保 存されている中和エピトープが、トルデル（Ｔｒｕｄｅｌ）らのジャーナル・オ フ・ジェネラル・パイロｏジー（Ｊ、Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）　、 旦８．２２７３−２２８０　（１９８７）によって、合成ペプチドでＦタンパク 質のＦ１サブユニットの残基２２１−ｉｌｅないし２３２−Ｇｌｕにマンプされ た。最後に、ベブスカン（Ｐｅｐｓｃａｎ）操作による最近の分析は、Ｆタンパ ク質のＦ１サブユニットの４８３−Ｐｈｅないし４８８　Ｐｈｅ位てエピトープ を同定しており、そのエピトープは別の中和エピトープに一致させることができ た（スコープス（Ｓｃｏｐｅｓ）ら、ジャーナル・ジェネラル・パイロｏンー（ Ｊ、Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）、　７１．５３〜５９　（１９９０） 参昭）。

Ｒ３Ｖ感染の治療および予防について新規な療法を発達させことに対する要求が ある。Ｒ３Ｖウィルス抗原の中和および保護エピトープがＲＳＶ感染の予防およ び／または治療に有用なモノクローナル抗体を生産するのに有用であることが２ 明された。本発明はイン・ビボにて中和および保護抗体によって認識されるＲ５ ＶＦタンパク質上のかかる新規なエピトープを提供するものである。

図１はＲ３Ｖ１９重鎮可変領域（ＶＨ）のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配 列を示す。そのＣＤＲ配列を四角で囲む。下線を引いた、最初の８個および最後 の１１個のアミノ酸が使用のオリゴヌクレオチドブライマーの配列に相当する。

図２はＲＳＶ１９軽鎖可変領域（ＶＫ）のＤＮＡ配列および対応するアミノ酸配 列を示す。そのＣＤＲ配列を四角で囲む。下線を引いた、最初の８個および最後 の６個のアミノ酸が使用のオリゴヌクレオチドブライマーの配列に相当する。

図３はヒト１ｇ重鎖可変領域フレームワークとマウスＲ３Ｖ１９由来のＣＤＲと からなる塩基性プラスミドｐＨｕＲ５Ｖ１９ＶＨを示す。

図４はヒト１ｇ軽鎖可変領域フレームワークとマウスＲ３Ｖ１９由来のＣＤＲと からなる塩基性プラスミドｐＨｕＲｓＶ１９ＶＫを示す。

図５はＲＳＶ１９ＶＨＳＲ３Ｖ１９ＶＫ、ｐＨｕＲ５ＶＶＨおよびｐＨｕＲ８Ｖ １９ＶＫならびにｐＨｕＲ５Ｖ１９ＶＨの誘導体によりコードされた誘導ｒｇ可 変領域アミノ酸配列を示す。

図６はＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨ／ＶＫ抗体およびその誘導体、ＨｕＲ５Ｖ１９ＶＨＦ ＮＳ／ＶＫのＲ３Ｖ抗原への結合のＥＬＩＳＡ分析を示す。

図６ＡはＲ３Ｖ１９およびＨｕＲ５Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲＳＶ１９ＶＫ抗体 の無傷の非−変性ＲＳウィルスに対する結合能の間にたとえ差異があるとしても それはほとんどないことを示す。

図７はｍＡｂＲ３Ｖ１９が、各々、Ｆタンパク質のアミノ酸残基４１７〜４３２ と４２２〜４３８からなる２つの合成ペプチドに結合することを示す。

発明の要約 本発明は、アクセプター・モノクローナル抗体の軽および／または重可変ドメイ ン中の相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくともある部分が、１またはそれ以上の ドナー・モノクローナル抗体からのＣＤＲの類似部分によって置換されており、 ドナー・モノクローナル抗体の結合特異性を保持するために、アクセプター・モ ノクローナル抗体の軽および／または重可変ドメインフレームワーク領域が最小 改変されていてもまたはされていなくてもよく、このようなドナー抗体が微生物 に特異性、特に呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳＶ）に特異性を有する改変抗体（ａ ｌｔｅｒｅｄ　ａｎｔｉｂｏｄｙ）に関する。本発明はまた、このような改変抗 体の製法、治療的に、非毒性量のかかる抗体と医薬上許容される担体または希釈 剤とからなる医薬組成物：および有効量のかかる改変抗体を予防的または治療的 に微生物誘発の疾患症状を処理する必要があるヒトまたは動物に投与することか らなる、そのようなヒトまたは動物における該疾患症状を予防的にまたは治療的 に処理する方法に関する。好ましくは、本発明の改変抗体は組換え型ＤＮＡ技法 によって生産する。本発明の改変抗体は、（全長型および軽鎖を有する）完全抗 体分子またはＦａｂまたは（Ｆ　ａ　ｂ’：ｈフラグメントのようなそのいずれ がのフラグメント、軽鎖または重鎮ダイマーまたはＦｖまたは５ＣＡ（単鎖抗体 ）のようなそのいずれかの最小組換えフラグメントまたは本発明の改変抗体と同 じ特異性を有するいずれか他の分子からなっていてもよい。また、本発明の改変 抗体は、それにエフェクターまたはレポーター分子を付着させていてもよい。例 えば、本発明の改変抗体は、共有架橋構造によってそれに付着する、重金属原子 またはりシンのようなトキシンをキレートするための巨大環を有していてもよい 。別法として、組換え型ＤＮＡ技法の操作を用い、完全抗体分子のＦｃフラグメ ントまたはＣＨ３ドメインが酵素またはトキシン分子により置換されている本発 明の改変抗体を生産してもよい。該改変抗体のリマインダーは、いずれか適当な ヒト免疫グロブリンから誘導してもよい。しかし、ヒト免疫グロブリンのタンパ ク質配列だけからなっている必要はない。例えば、ヒト免疫グロブリン鎖の部分 をコードするＤＮＡ配列をポリペプチド・エフェクターまたはレポーター分子の アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列に融合させる遺伝子を構築することができ る。

本発明の別の態様は、Ｒ３Ｖｌ：！Ｉ！％染したマウスを保護しかつ治療するモ ノクローナル抗体の標的であることが示されているＲＳＶのＦ（融合）タンパク 質の特異的エピトープの知見にある。加えて、このようなモノクローナル抗体の Ｆ　ａ、　ｂフラグメントが、イン・ビボにおける感染からマウスを保護するこ ともまた示されている。か（して、本発明はまた、ＲＳＶのＦタンパク質のこの ような特異的エピトープ；かかるエピトープに向けられたモノクローナル抗体； およびかかるモノクローナル抗体のＦａｂフラグメントに関する。加えて、本発 明は、治療的に、非毒性量のこのようなモノクローナル抗体またはＦａｂフラグ メントと、医薬上許容される担体または希釈剤とからなる医薬組成物；および有 効量のこのようなモノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントを、Ｒ３Ｖ感染 を予防的または治療的に処理する必要のあるヒトまたは動物に投与することから なる、がかるヒトまたは動物におけるＲ３Ｖ感染を予防的または治療的に処理す る方法に関する。

本発明は微生物に特異性を有する改変抗体、およびこのような抗体をコードする ＤＮＡを提供するものである。これらの抗体は、ｌの源がらの１ｇ定常領域およ び可変領域と、異なる源からの１またはそれ以上のＣＤＲとからなる。

加えて、可変領域フレームワークにおけるアミノ酸置換は、抗原結合親和性のた めに重要であると記載されている。本発明はまた哺乳動物の細胞宿主にて改変抗 体を生産するベクターを提供するものである。

本発明は、特に、動物およびヒトにおける感染の予防および治療に必要な特性を 組み合わせた改変抗体を提供するのに適用される。例えば、微生物に特異性を有 する非−ヒト抗体を改変させ、ヒトにおいて最小免疫応答を誘発する［人化（ｈ ｕｍａｎｉｓｅｄ）　Ｊ抗体を生産することができる。特に、本発明は、ヒトの ＲＳＶ感染に関する動物実験で効果的であり、多様なヒトのＲＳＶの臨床的単離 物を認識することがわかっている、ＲＳＶに特異性を有する「人化」抗体を提供 するものである。

本発明はまた、異なる源からのＣＤＲの抗原結合能を保持するために、可変領域 フレームワークのアミノ酸に最小修飾を施す方法を提供する。該方法は抗原結合 親和性のために潜在的に重要な可変領域フレームワークにおける段階的改変およ び個々のアミノ酸を含む。該方法は、ＣＤＲと同じ源からのフレームワークアミ ノ酸の主要な導入を回避する。

本明細書にて用いる場合、「人化抗体」なる語は、非−ヒト種からの免疫グロブ リン由来のその相補性決定領域（および、おそらく、その軽および／または重可 変ドメインフレームワーク領域の最小部）を有する分子をいい、該分子の残りの 免疫グロブリン誘導部分はヒト免疫グロブリンに由来する。

本発明は、アクセプター・モノクローナル抗体の軽および／または重可変ドメイ ンにおける相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくともある部分が、１またはそれ以 上のドナー・モノクローナル抗体からのＣＤＨの類似する部分によって置換され ており、ドナー・モノクローナル抗体の結合特異性を保持するために、アクセプ ター・モノクローナル抗体の軽および／または重可変ドメインフレームワーク領 域が最小改変されていてもよくまたはされていなくてもよい改変抗体であって、 このようなドナー抗体が微生物に特異性、特に呼吸器合胞体ウィルス（ＲＳ　Ｖ ）に特異性を有する改変抗体に関する。本発明はまた、このような改変抗体の製 法；治療的に、非毒性量のかかる改変抗体と医薬上許容される担体または希釈剤 とからなる医薬組成物：および有効量のかかる改変抗体を微生物誘発疾患症状の ヒトまたは動物に投与することからなる、そのようなヒトまたは動物における該 疾患症状を予防的にまたは治療的に処理する方法に関する。

本発明の改変抗体は以下の方法により生産することができる（ａ）慣用的技法に より、発現ベクター中、抗体の重または軽鎖をコードするＤＮＡ配列を有するオ ペロンを生産し、ここで、少なくとも可変ドメインのＣＤＲ（および、ドナー・ モノクローナル抗体の結合特異性を保持するために要求されるアクセプター・モ ノクローナル抗体の軽および／または重可変ドメインフレームワーク領域のそれ らの最小部）は、Ｒ５Ｖ１９により生産されるように、非−ヒト免疫グロブリン から誘導され、その抗体鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分はヒト免疫グロブリ ンから誘導され、それにより本発明のベクターを生産し：（ｂ）慣用的技法によ り、発現ベクター中、相補性抗体の軽または重鎮をコードするＤ　Ｎ　Ａ配列を 有するオペロンを生産し、ここで、少なくとも可変ドメインのＣＤＲ（および、 ドナー・モノクローナル抗体の結合特異性を保持するために要求されるアクセプ ター・モノクローナル抗体の軽および／または重可変ドメインのそれらの最小部 ）は、ＲＳＶ１９によって産生されるように、非−ヒト免疫グロブリンから誘導 され、その抗体鎖の残りの免疫グロブリン誘導部分はヒト免疫グロブリンから誘 導され、それにより本発明の別のベクターを生産し；（Ｃ）慣用的技法により宿 主細胞をそのまたは各ベクターでトランスフェクトし、本発明のトランスフェク ションされた宿主細胞を創造し；（ｄ）慣用的技法によりトランスフェクション された細胞を培養し、本発明の改変抗体を生産する。

宿生細胞は、２種類のベクターでトランスフェクトすることができ、ここで、第 １のベクターは軽鎖誘導のポリペプチドをコードするオペロンを含有し、第２の ベクターは重鎮誘導のポリペプチドをコードするオペロンを含有する。できる限 り、各ポリペプチド鎖を等しく発現させるように、コード配列および選択可能な マーカーが関連する範囲以外、ベクターは同じであることが好ましい。別法とし て、本発明の単一のベクターを用いてもよく、該ベクターは軽鎖および重鎮誘導 ポリペプチドを共にコードする配列を包含する。軽および重鎖用のコード配列中 のＤＮＡはｃＤＮＡあるいはゲノムＤＮＡまたは両方からなっていてもよい。

本発明の改変抗体を発現するのに使用する宿主細胞は、好ましくは真核細胞、最 も好ましくは哺乳動物細胞、例疼ばＣＨＯ細胞または骨髄細胞である。

本発明のベクターを構築してもよい一般的な方法、本発明の宿生細胞を生産する のに要するトランスフェクション方法、かかる宿主細胞から本発明の改変抗体を 生産するのに必要な培養方法は、すべて通常の技術である。同様に、生産後、硫 安沈澱、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動など を包含する当該分野における標準的な手法により、本発明の改変抗体を精製して もよい。

本発明の改変抗体の一例は、実施例に記載するＨｕＲＳＶ１９ＶＨ／ＶＫおよび ＨｕＲ８Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ８Ｖ１９ＶＫのようなマウスモノクローナル 抗体Ｒ３Ｖ１９由来の大化抗体である。かかる抗体は、治療的または予防的に、 ヒトＲＳＶ感染に対するヒトの治療に有用である。したがって、本発明はまた、 有効量（ヒトＲＳＶ感染治療用量）のかかる改変抗体をヒトに投与することを特 徴とする、ヒトＲ５Ｖ感染の治療を要するヒトにおけるヒトＲ５Ｖ感染を治療的 または予防的に治療する方法に関する。

また、本発明の改変抗体は、他の抗体、特に、本発明の改変抗体が向けられてい る疾患と関連する他のマーカー（エピトープ）と反応性のヒトモノクローナル抗 体と組み合わせて使用してもよい。

また、本発明の改変抗体は、化学療法剤または免疫抑制剤と組み合わせて投与す る分離投与組成物として使用してもよい。用いる剤の適当な組合せは、当業者で あれば通常の技術を用いて容易に決定することができる。かかる組み合わせの一 例としては、ヒトにおけるＲ３Ｖ感染の治療を促進するために、ＨｕＲ８Ｖ１９ ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＫとして知られている本発明の改変抗体を、抗ウ イルス剤リバビリンと組み合わせて投与しそもよい。

本発明の一つの医薬組成物は、イムノトキシン（すなわち、二成分により特徴づ けられ、インビトロまたはインビボで選択細胞を殺すのに特に有用な分子）にお ける本発明の抗体の使用よりなる。一つの成分は、付着または吸収された場合に 細胞に通常致命的である細胞障害剤である。第二の成分は、デリバリ−・ビヒク ル（ｄｅｌｉｖｅｒｙ　ｖｅｈｉｃｌｅ）として知られており、例えばガン腫よ りなる細胞のような個々の細胞型に毒性剤を輸送するための手段を提供する。こ の二成分は普通、種々のよく知られた化学的手法のいずれかにより化学的に結合 している。例えば、細胞障害剤がタンパク質であり第二の成分が無傷の免疫グロ ブリンである場合、該結合はへテロニ官能架橋剤、例えばカルボジイミド、グル タルアルデヒドなどによるものであってもよい。種々のイムノトキシンが当該分 野でよ（知られてい種々の細胞障害剤が、イムノトキシンにおける使用に適し、 とりわけ、放射性核種、例えばメトトレキセートのような化学療法薬、例えばリ ポソーム阻害タンパク質（例、リンノ）のような細胞障害タンパク質を包含して もよい。

該イムノトキシンのデリバリ−成分は、本発明のヒト様免疫グロブリンを包含ト 　する。無傷の免疫グロブリンまたはそれらの結合フラグメント、例えばＦａｂ が１　好ましく使用される。典型的には、該イムノトキシンにおける抗体は、ヒ トＩｇＭまたはｒｇＧイソタイプのものであるが、所望により、他の哺乳動物の 定常領域を使用してもよい。

本発明の改変抗体および医薬組成物は、例えば皮下、筋肉内または静脈内のよう な非経口投与に特に有用である。非経口投与のための組成物は、普通、許容しう る担体、好ましくは水性担体に溶解された本発明の改変抗体の溶液またはその反 応混液よりなる。例えば水、緩衝水、０．４％食塩水、０．３％グリシンのよう な種々の水性担体を使用してもよい。これらの溶液は無菌であり、一般に顆粒物 を含まない。これらの溶液は、通常のよ（知られた滅菌技術により滅菌してもよ い。該組成物は、例えばｐＨ調整剤およびＷ！衝剤などのような生理学的条件に 近づけるのに要する医薬上許容しつる補助物質を含有してもよい。かかる医薬製 剤中の本発明の改変抗体の濃度は、約０．５％未満から、通常的１％または少な くとも約１％から、１５または２０重量％まで広く変化してもよく、選択する個 々、の投与方法により、生として液体容量、粘度などに基づき選択される。

したがって、筋肉的注射のための本発明の医薬組成物は、１ｍＬの滅菌緩衝水お よび５０ｍｇの本発明の改変抗体を含有させて調製することができる。同様に、 静脈内注入のための本発明の医薬組成物は、２５０ｍ１の滅菌リンガ−溶液およ び１５０ｍ］の本発明の改変抗体を含有させて作ることができる。非経口投与可 能組成物を調製する実際的な方法はよく知られており、当業者に明らかであり、 例えばレミントシンズ・ファーマシューティカル・サイエンス（Ｒｅｍｉｎｇｔ ｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ）　、１５版、マッ ク・パブリッシング・カンパニー（１！ａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｍｐ ａｎｙ）　、イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）　、ペンシルベニアにより詳細に記載 されている。

本発明の改変抗体は、凍結乾燥して貯蔵し、使用前に適当な担体中で復元させる ことができる。この技術は、通常の免疫グロブリンで有効であることが示されて おり、当該分野で公知の凍結乾燥および復元技術を使用することができる。

意図する結果に応じ、本発明の医薬組成物を予防的および／または治療的処理の ために投与することができる。治療的適用においては、ある疾患に既に罹患して いる患者に、該疾患およびその合併症を治し、または少なくとも部分的に進行を 抑えるのに十分な量の組成物を投与する。予防的適用においては、本発明の抗体 またはその反応混液を含有する組成物を、未だ疾患状態にない患者に投与して患 者の抵抗性を増強させる。

治療医師が選択する用量レベルおよび様式により、該医薬組成物の単一または複 数投与を行うことができる。いずれの場合においても、本発明の医薬組成物によ り、効果的に患者を治療するのに十分な量の本発明の改変抗体が与えられるべき である。

また、本発明の改変抗体は、抗体と同様の療法で有用なペプチド性または非ペプ チド性化合物（模倣物）のいずれかの設計および合成のために使用してもよいこ とを注記すべきである（例えばサラゴビ（Ｓａｒａｇｏｖｉ）ら、サイエンス（ Ｓｃｉｅｎｃｅ）　、２５３．７９２−７９５　（１９９１）参照）。

本発明のもう一つの態様は、Ｒ３Ｖに感染したマウスを保護しかつ治療するモノ クローナル抗体の標的であることが示されているＲ５ＶのＦ（融合）タンパク質 の特異的エピトープの知見にある。さらにまた、かかるモノクローナル抗体のＦ ａｂフラグメントがインビボ感染からマウスを保護することが示される。したが って本発明はまた、Ｒ３ＶのＦタンパク質のかかる特異的エピトープ：かかるエ ピトープに向けられているモノクローナル抗体：およびかかるモノクローナル抗 体のＦａｂフラグメントに関する。さらに本発明は、治療的、非毒性量のかかる モノクローナル抗体またはＦａｂフラグメントおよび医薬上許容しうる担体また は希釈剤よりなる医薬組成物、および有効量のかかるモノクローナル抗体または Ｆａｂフラグメントをヒトまたは動物に投与することを特徴とする、Ｒ３Ｖｇ染 の治療を要するヒトまたは動物におけるＲ８Ｖ感染を予防的または治療的に始末 発明は、微生物に特異性を有する改変抗体、およびかかる抗体をコードするＤＮ Ａを提供する。これらの抗体は、一つの源からのＩｇ定常領域および可変領域、 および異なる源からの−またはそれ以上のＣＤＲよりなる。

さらに、抗原結合親和性のために重要な可変領域フレームワークにおけるアミノ 酸置換を記載する。また本発明は、哺乳動物細胞宿主において改変抗体を生産す るベクターを提供する。本発明は、動物およびヒトにおける感染の予防および治 療に要する性質を組み合わせた改変抗体の提供に特ｌこ適する。例えば、微生物 に特異性を有する非ヒト抗体を改変して、ヒトにおいて最小免疫反応を誘導する 口火化」抗体を生産してもよい。特に本発明は、ヒトにおけるＲ３Ｖ感染に対す る動物モデルにおいて有効であり、非常に多様なヒトのＲ３Ｖの臨床的単離物を 認識することが示されている、Ｒ３Ｖに特異性を有する「人化」抗体を提供する 。

また本発明は、異なる源からのＣＤＲの抗原結合能を保持するために可変領域フ レームワークのアミノ酸に最小修飾を施す方法を提供する。該方法は、抗原結合 親和性のために潜在的に重要な可変領域フレームワークにおける段階的改変およ び個々のアミノ酸の試験を含む。該方法は、ＣＤＲと同様の源からのフレームワ ークアミノ酸の主要な導入をさける。

以下、実施例により本発明を例示するが、本発明を限定するものではない。

実施例 以下の実施例において、全ての必要な制限酵素、プラスミド、ならびに他の試薬 および物質は特記しない限り商業的な供給源から入手された。

以下の実施例において、特記しない限り、全ての普遍的クローニング、連結およ び池の組換えＤＮＡ法は、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ−のコ ールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって発行されている［モレキュラー・クロ ーニング、ア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ、Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｎｕａｌ）Ｊ（１９８２）ティ・マニア ティス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編（以下、「マニアティスら」と記す）の 記載に従って行った。

以下の実施例において、以下の略語を使用してもよい・ｄＣＴＰ　デオキシンチ ジン三リン酸 ｄＡＴＰ　デオキシアデノシン三リン酸ｄＧＴＰ　デオキシグアノシン三リン酸 ｄＴＴＰ　デオキシチンオシンミリン酸（ｄｅｏｘｙｔｈｙｓｉｏｄｉｎｅ　ｔ ｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）ＤＴＴ　ジチオトレイトール ＤＭＥＭ　ダルベツコ修飾イーグル培地ＰＢＳＴ　トゥイーン（Ｔｖｅｅｎ）２ ０（ｐＨ７，５）含有リン酸塩緩衝化生理食塩水 改変抗体 実施例１〜３は本発明の改変抗体のＦｌ製を記載する。

実施例１−　ＲＳＶに対して特異的な改変抗体の製造これらの改変抗体を製造す るのに使用されるドナーＣＤＲの供給源はＲＳＶの融合（Ｆ）蛋白に対して特異 的なネズミ・モノクローナル抗体Ｒ５Ｖ１９であった。

Ｒ３Ｖ１９ハイブリドーマ細胞株は、イギリス、アールジー１６・０エヌエヌ、 バーゲス、ニア・ニューバリー、コンプトンのインスティチュート・フォー・ア ニマル・ヘルス、コンプトン・ラボラトリ−（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ａ ｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ。

Ｃｏｍｐｔｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、シエラルディン°ティラー（Ｇｅｒ ａｌｄｉｎｅ　Ｔａｙｌｏｒ）博士から入手した。ＲＳＶに対して特異的なモノ クローナル抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株の単離方法は、ティラー（Ｔａ ｙｌｏｒ）ら、イムノロジー（Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、５２　（１９８４） 第１３７〜１４２頁によって開示されている。

細胞質ＲＮＡは、ファムｏ　口（Ｆ　ａｖａｌｏｒｏ）ら、（１９８０）、メソ ッズ・イン・エンサイモｏ　ノー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇ ｙ）、第６５巻、第７１８〜７４９頁の方法によってＲ９Ｖ１９ハイブリドーマ 細胞株から調製され、ｃＤＮＡは以下のとおり、Ｉｇ可変領域プライマーを使用 して合成した：■ｇ重鎖可変（ＶＨ）領域に関しテハ、プライマーＶＨＩＦＯＲ （５’ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＧＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡ Ｇ３″）を使用し、１ｇ軽鎖可変（ＶＫ）領域に関しテハ、プ５イｖ−ＶＫＩＦ ＯＲ（５°ＧＴＴＡＧＡＴＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＣＣＣ３°）を使用した。

ＣＤＮＡ合成反応は、全ｊＬ　５０　富１（Ｄ、ＲＮＡ　２０ｍ９．０，４ｍＭ 　ＶＨＩＦＯＲまたはＶＫＩＦＯＲ，各々２５０ｍＭのｄＡＴＰＳｄＣＴＰ、ｄ ＧＴＰおよびｄＴＴＰ、５０ｍＭ　トリス（Ｔｒｉｓ）−ＨＣＩ　ｐＨ７，５， ７５１Ｍ　ＫＣＩ、１０ｚＭＤＴＴ。

３ｍＭ　ＭｇＣ１ｚおよびＲＮａｓｅ阻害薬（連合王国、ミルトン・ケインズの ファルマシア（Ｐ　ｈａｒｍａｃｉａ））　２７ユニツトからなった。試料を７ ０℃で１０分間加熱し、３０分間かけて４２℃にゆっくりと冷却した。次いで、 １００ｍＭＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（連合王国、ペイズリ−のライ フ・テクノロジズ（ＬｉｆｅＴ　ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加し、４２℃で １時間インキュベーションを続けた。

次いで、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３９、（ １９８８）、第４８７〜４９１頁に記載の複製連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、 ＶＨおよびＶＫｃＤＮＡを増幅した。このようなＰＣＲに関して、使用したプラ イマーは以下のＶＨＩＢＡＣＫ（５’ＡＧＧＴＳＭＡＲＣＴＧＣＡＧＳＡＧＴＣ ＷＧＧ３°）、および ＶＫＩＢＡＣＫ（５°ＧＡＣＡＴＴＣＡＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡ３’ ）（ここで、Ｍ＝ＣまたはＡ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｗ＝ＡまたはＴである）。

プライマーＶＨＩＦＯＲ，ＶＫＩＦＯＲ，ＶＨＩＢＡＣＫおよびＶＫＩＢＡＣＫ ｌならびにマウスＩｇＤＮＡのＰＣＲ増幅に関するそれらの使用け、オーランデ ィ（○ｒｌａｎｄｉ）ら、プロン−ディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ− ・オフ・サイエンシズ−、：Ｌ　−−！スーｚイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ　Ｓ　Ａ）、８６．３８３３−３９３７（１９８９）によ って開示されている。

Ｖ　Ｈ（７）　Ｐ　ＣＲ［Ｉ：関しテハ、ＤＮＡ／プライマー混合物は、ＲＮＡ ／ｃＤＮＡハイプリント５冨！および領５冨Ｍ　ＶＨＩＦＯＲおよびＶＨＩＢＡ ＣＫプライマーからなっていた。ＶＫのＰＣＲ増幅に関しては、ＤＮＡ／プライ マー混合物は、ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド５ｘｌおよび領５１Ｍ　ＶＨＩＦ ＯＲおよびＶＫＩＢＡＣＫプライマーからなっていた。これらの混合物に、各々 ２０ＣｈＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、ＩＯＩＭ　トリス （Ｔｒｉｓ）−ＨＣ／（ｐＨ８゜３）、５ＱｚＭＫＣ１、ｌ、ＤＩＭ　ＭｇＣｌ ２．０．０１％（ｗ／ｖ）ゼラチン、０．０１％（ｖ／ｖ）トゥイーン（Ｔｖｅ ｅｎ）　２０．　０．０１％（ｖ／ｖ）ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ２Ｏお よびＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（アメリカ合衆国、オハイオ州クリーブランド のユナイテッド・ステイク・バイオケミカルズ（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｒｅｓ Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））　２ユニツトを添加した。試料を９４℃、１分 、６０℃、１分。

７２℃、２分のＰＣＲの２５熱サイクルに付し、最後に７２℃で５分間付した。

クローニングおよび配列決定について、増幅したＶＨＤＮＡを低融点アガロース ゲル上でおよびＥ　１ｕｔｉｐ−ｄカラムクロマトグラフィー（ドイツ、デュソ セルのンユライヒャー・アンド・ンユール（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ ｃｈｕｅｌｌ））によって精製し、ファージＮ１１３（連合王国、ミルトン・ケ インズのファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））にクローン化した。普遍的クロ ーニングおよび連結法は、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバ−のコ ールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって発行されている「モレキュラー・クロ ーニング、ア・ラボラトリー−マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎ ｇ、　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｎｕａｌ）Ｊ（１９８２）ティ・マニア ナイス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）らＷ（以下、「マニアナイスら」と紀す）の 記載に従った。ＶＨＤＮＡは、Ｍｌ　３　ｍｐｌ　８／　１９（連結王国、ミル トン・ケインズのファルマンア）のＳｍａｒ部位に直接連結されるか、またはＰ ｓｔＴによる消化の後にＭ１３ｔｇ１３１（連合王国、リトル・チャルフォント のアマーノヤム・インターチン−１ナル（Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｉ　ｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ））のＰｓｔ１部位に連結された。増幅したＶＫを同様にゲル精製 し、以下の別法によってクローン化した・ Ｍ１３ｍｐ１９（Ｓｍａ１部位）へのＰｖｕｌｌ消化Ｍ１３ｍｐ１８／１９（Ｓ ａ＋ａＩ　−ＢａｍＨ１部位）へのＰｖｕｌＩおよびＢｇｌＩ［消化Ｍ１３ｔｇ １３１（ＥｃｏＲＶ　−Ｂｇｌｎ部位）へのｐｖｕｌＩおよびＢｇｌＩ［消化Ｍ １３ｔｇ１３１（Ｓｍａｌ　−ＢｇＬＩＩ部位）へのＢｇｌＩＩ消化。

得られた重複クローンの収集物を、シークエナーゼ（アメリカ合衆国、オハイオ 州クリーブランドのユナイテッド・ステイク・バイオケミカルズ（Ｕｎｉｔｅｄ Ｓ　ｔａｔｅｓ　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用してジデオキシ法（サン ガー（Ｓ　ｎｇｅｒ）ら、プロシーディンゲス・オフ・ナショナル・アカデミ− ・オフ・サイエンシズ・ニーニスエイ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ）、７４（１９７７）第５４６３−５４６７頁）によって配列決 定した。

各々、第１図および第２図に示すような、ＲＳＶ１９ＶＨおよびＶＫの配列から 、ＣＤＲ配列は、他のＶＨおよびＶＫ配列によるコンピューター補助配列を使用 して、シーケンンズ・オフ・プロテインズ・オフ・イムノロジカル・インクリス ト（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉ　ｍｍｕｎｏｌｏ ｇｉｃａｌ　Ｉ　ｎｔｅｒｅｓｔ）（ニー　−ｘス・デプト・オフ・ヘルス・ア ンド・ヒユーマン・サービシズ、ニー・ニス・ガバーンメント・プリンティング ・オフィス（ＵＳ　Ｄｅｐｔ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　ａｎｃｔ　ＨｕｍａｎＳｅ ｒｖｉｃｅｓ、　ＵＳ　Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ　Ｐｒｉｎｔｉｎｇ　０ｆｆｉｃ ｅＸ１９８７））におけるカバソト（Ｋａｂａｔ）らの方法に従って明らかにし た。

ネズミＲＳＶ１９　ＣＤＲのヒトフレームワークへの移入は部位特異的突然変異 誘発によって達成された。使用したプライマーは以下のものであった。

ＶＨＣＤＲＩ　５’ＣＴＧＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＧＣＡＴＡＴＡＧＴＡＧＴＣ ＧＣＴＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡＣＧＧＴ３’ＶＨＣＤＲ２５°ＣＡ ＴＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＡＣＴＴＣＧＧＧＧＣＡＴＡＴＧＧＡＡ ＣＡＴＣＡＴＣＡＴＴＣＴＣＡＧＧＡＴＣＡＡＴＣＣＡ３’ ＶＨＣＤＲ３５’ＣＣＣＴＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＧＴＣＡＣＴＣ ＣＣＣＣＡＴＣＴＴＧＣＡＣＡＡＴＡ３゜ＶＫＣＤＲＩ　５’ＣＴＧＣＴＧＧＴ ＡＣＣＡＴＴＣＴＡＡＡＴＡＧＧＴＧＴＴＴＣＣＡＴＣＡＧＴＡＴＧＴＡＣＡＡ ＧＧＧＴＣＴＧＡＣＴＡＧＡＴＣＴＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＧＴＣＡ３’ＶＫＣＤ Ｒ２５’ＧＣＴＴＧＧＣＡＣＡＣＣＡＧＡＡＡＡＴＣＧＧＴＴＧＧＡＡＡＣＴＣ ＴＧＴＡＧＡＴＣＡＧＣＡＧ３’ＶＫＣＤＲ３５’ＣＣＣＴＴＧＧＣＣＧＡＡＣ ＧＴＣＣＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＧＡＡＡＧＣＡＧＴＡＧＴＡＧ ＧＴ３’突然変異誘発に関するＤＮＡ鋳型は、ＶＨおよびＶＫドメインに関して 、各々、セリンからフェニルアラニンのアミノ酸２７の置換（リーヒマン（Ｒｉ ｅｃｈｍａｎｎ）ら、前記引用文献を参照）によって結晶学的に解明された蛋白 、ＮＥＷ（ソウル（Ｓａｕｌ）ら、ジャーナル・オフ・バイオロジカル・ケミス トリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、５３（１９７８）、第５８５〜５９７頁 に開示された）、および、ＲＥＩＣニップ（Ｅ　ｐｐ）ら、ヨーロピアン・ジャ ーナル・オフ・バイオケミストリー（Ｅｕｒ、Ｊ。

Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ、　）、４５（１９７４，）、第５１３〜５２４頁に開示され た）から誘導されたヒトフレームワーク領域からなっていた。ＣＤＲと無関係な ヒトフレームワークからなっているＭ１３ベース鋳型はリーヒマンら、ネイチャ ー（Ｎａｔｕｒｅ）、３３２　（１９８８）による記載に従って製造された。

ヒトＶＨおよびＶＫ遺伝子のオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発はナカ マイエ（Ｎ　ａｋａｍａｙｅ）ら、ヌークリイック・アソソズ・オフ・リサーチ （Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）１４（１９８６）第９６７９〜９６９８頁の方法に基づ いた。

Ｍ１３におけるＶＨまたはＶＫ−末鎖１）ＮＡ　５ａｓ＋に３個のマウスＣＤＲ （相補性決定領域）配列をコードする３個のＶＨまたはＶＫリン酸化オリゴヌク レオチドの各々の２倍モル過剰量を添加した。７０℃への加熱によってプライマ ーを鋳型にアニールし、３７°Ｃにゆっ（りと冷却した。アニール化ＤＮＡに、 反応容量５Ｑｍｌのフレノウ断片（連合王国、ペイズリ−のライフ・テクノロン ズ）６ｕ：Ｔ４　ＣＮＡリガーゼ（連合王国、ペイズリ−のライフ・テクノロジ ズ）６ｕ、各々、０．５重Ｍの以下のヌクレオシド三リン酸ＣｄＡＴＰ、ｄＧＴ Ｐ、ｄＴＴＰおよび２゛−チオキシシチジン５’−０−（１−チオトリホスフェ ート）（チオｄＣＴＰ）＋　６０露ＭトリスーＨＣ１（ｐＨ８，０）：　６ｇＭ 　ＭｇＣＩｘ：　５ｍＭ　ＤＴＴ（連合王国、プールのシグマ（Ｓ　ｉｇｍａ） ）　：および１０ｍＭＡＴＰを添加した。この混合物を１６℃で１５時間インキ ュベートした。次いで、ＤＮＡをエタノール沈澱し、親鎖を切断するが無傷のチ オｄＣＴＰを含有する新しく合成した鎖を残すＮｃｉ　Ｉ　（連合王国、ペイズ リ−のライフ・テクノロジズ）５ユニツトで消化した。次いで、５Ｑｘｌの６０ 翼ＭトリスーＨＣＩ（ｐＨ８，０）、０．６６冨Ｍ　ＭｇＣｌ２、および１１Ｍ 　ＤＴＴ中のエキソヌクレアーゼ■（連合王国、ミルトン・ケインズのファルマ シア）１００ユニツトで３０分間消化することによって親鎖を除去した。次いで 、５Ｑｘｌの６（０冨Ｍトリス〜ＨＣＩ！（ｐＨ８，０）、６露Ｍ　Ｍｇ（Ｊ’ 、、５諺Ｍ　ＤＴＴ、１０１１Ｍ　ＡＴＰおよび各々０５鳳ＭのｄＡＴＰ、ｄＣ ＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ中のＤＮＡポリメラーゼＩ（連合王国、ペイズリ −のライフ・テクノロジズ）３ユニツト、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２ユニットの添加 を介して修復した。該ＤＮＡをマニアナイスらの方法によってコンピテント・イ ー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＴＧ　１細胞（連合王国、リトル・シャルフォント、 アマ−ジャム・インターナショナル）に形質転換した。

メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）の方法［（１９８３）、メソッズ・イン・エンザ イモロンーＣＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１０１、第２０ 〜７８頁］によって、個々のプラークから一本鎖ＤＮＡを調製し、配列決定した 。単一または２倍突然変異体が得られると、３倍ＣＤＲ突然変異体が得られるま で、これらを、適邑なオリゴヌクレオチドを使用することによって突然変異誘発 の循環に付した。

発現ベクトルにおいてＣＤＲ置換ＶＦおよびＶＫ遺伝子をクローン化して（マニ アナイスらの方法による）、各々、第３図および第４図に示すプラスミドを得た 。当該ブラフ、ミＦをｐＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨおよびｐＨｕＲ５Ｖ１９ＶＫ　と称 した。

ｐＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨに関して、Ｉｇ重鎖プロモーター（第３図および第４図） 、適当なスプライス部位およびシグナルペプチド配列（第３図および第４図）と −緒のＣＤＲ置換ＶＨ遺伝子を、ＨｉｎｄＤＩおよびＢａｍＨＩによる消化によ ってＭ１３から切除し、ネズミ１ｇ重鎮エンハンサ−（第３図および第４図）、 ＳＶ４０プロモーター（第３図および第４図）、哺乳動物細胞における選択のた めのｇｐｔ遺伝子（第３図および第４図）およびイー・コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）に おける複製および選択に関する遺伝子（第３図および第４図）を含有する発現ベ クターにクローン化した。次いで、ＢａｍＨＩ断片としてヒ）ＩｇＧ１定常領域 を付加した（第３図および第４図）。

ｐＨｕＲ３Ｖ１９ＶＫプラスミドの構築は、ｇｐｔ遺伝子がハイグロマイシン耐 性遺伝子によって置換されており（第３図および第４図）、ヒト・カッパ鎖定常 領域を付加した（第３図および第４図）以外は実質的に同一であった。

慣用方法を使用して、ｐＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨ１０ｍ９およびｐＨｕＲ５Ｖ１９Ｖ Ｋ２０籾をｐｖｕｌで消化した。ＤＮＡを一緒に混合し、エタノール沈澱し、水 ２５ｄに溶解した。約１０’（ＩｌｌのＹＢ２１０細胞（アメリカ合衆国、メリ ーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍ ｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ））を半集密に 増殖させ、遠心によって収穫し、キュベツト中で消化したＤＮＡと一緒にＤＭＥ Ｍ（連合王国、ペイズリ−のギブコ（Ｇｉｂｃｏ））Ｑ、５ｍｌに再懸濁した。

水上で５分後、該細胞に９６０ｕＦで１７０Ｖの単一パルスを与え（アメリカ合 衆国、カリフォルニア州すッチモンドのパイオーラッド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、シ ーン−パルサー（Ｇｅｎｅ　−Ｐｕ１ｓｅｒ））、さらに２０分間水中に放置し た。次いで、該細胞をＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ÷１０％つ／拍児血清２０友１中に入れ、 ４８時間再生した。その後、細胞を２４ウエル・プレートに分布し、選択培地を 塗布した（ＤＭＥＭ、１０％ウシ胎児皿清、０．８画ｇ／冨ｌミコフェノール酸 および２５０ｍｑ／ｍｎキサンチン）。３〜４日後、培地および死亡細胞を除去 し、新しい選択培地と交換した。トランスフェクトされたクローンは１０〜１２ 日後に肉眼で見ることができた。

慣用のＥＬＩＳＡ法によってトランスフェクトされた細胞を含有するウェルの培 地におけるヒト抗体の存在を測定した。微量滴定プレートをウェル当たりＩＩ＋ ９のヤギ抗ヒト１．ｇＧ（ガンマ鎖特異的）抗体（連合王国、クローリイ・ダウ ンのセーラーラブーリミテッド（Ｓｅｒａ−Ｌａｂ−Ｌｔｄ、））で４℃で一晩 被覆した。ＰＢＳＴ（０，０２％ヒトイーン（Ｔｖｅｅｎ）　２０　ｘ　（ｐＨ ７，５）含有リン酸塩緩衝化生理食塩水）で洗浄した後、トランスフェクトント を含有するウェルからの培養培地１０Ｑｍｌを各微量滴定ウェルに３７℃で１時 間添加した。次いで、該ウェルを空にし、ＰＢＳＴで洗浄し、ベルオキシダーゼ ・コンジュゲート・ヤギ抗ヒトＩｇＧまたはペルオキシダーゼ・コンジュゲート ・ヤギ抗ヒト・カッパ定常領域抗体（共に、連合王国、クローリイ・ダウン、セ ーラーラブーリミテッドから入手した）をウェル当たり１１００ｎで添加した。

次いで、プレートを３７℃で１時間インキユベートシた。次いで、該ウェルを空 にし、ＰＢＳＴで洗浄した。５ＱｍＭクエン酸ナトリウム、５（ｂＭリン酸ナト リウム（ｐＨ５，０）および０．００３％（ｖ／ｖ）Ｈ２０２中３４０−ｑ／冨 ！のＯ−フェニレンジアミンをウェル当たり２００ｉＩｌで添加した。ウェル当 たり５０＠ｉで１２．５％硫酸を添加することによって１〜５分後に反応が停止 された。次いで、４９２ｒ＋ｍでの吸光度を分光光度的に測定した。

ｐＨｕＲ８ＶＶＨおよびｐＨｕＲｓＶＶＫでコトランスフェクトされたトランス フェクト細胞株から分泌されたヒト化（ｈｕｍａｎｉｓｅｄ）抗体ＨｕＲ５Ｖ１ ９ＶＨ／ＶＫを蛋白Ａアガロースカラム（連合王国、ルウニスのベーリンガー・ マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ））上で精製し、ＥＬＩ 　ＳＡアッセイでＲ８Ｖウィルスへの結合について試験した。ウソ腎臓（ＣＫ） 細胞からなる抗原をＲＳＶ（オーストラリアの子供から入手したＲＳＶのＡ２菌 株、ルイス（ＬｅＷｉｓ）ら、Ｍｅｄ、　Ｊ　。

Ａｕ５ｔｒａｌｉａ、　４８．９３２−９３３（１９６１）に開示された）で感 染させ、０．５％（ｖ／ｖ）ＮＰ４０洗浄剤で処理して細胞溶解物を得た。同様 に、非感染ＣＫ細胞を使用して対照細胞溶解物を調製した。微量滴定プレートウ ェルを感染細胞溶解物または対照細胞溶解物のいずれかで被覆した。抗原被覆プ レートを、３７℃で１時間、ＰＢＳＴでブロックし、ＰＢＳＴで洗浄し、その後 、ヒト化抗体を適用した（すなわち、ＨｕＲ５Ｖ１９ＶＨ／ＶＫ）。３７℃で１ 時間後、ウェルを空にし、ＰＢＳＴで洗浄し、ウェル当たりヤギ抗ヒトＩｇＧ抗 体（連合王国、クローリイ・ダウン、セーラ・ラブーリミテンド）２０Ｏｎ９を 添加した。３７℃で１時間後、該ウェルを空にし、ＰＢＳＴで洗浄し、ホースラ ディツシュ・ペルオキシダーゼ、コンジュゲート・ウサギ抗ヤギＩｇＧ抗体（連 合王国、プールのノグマ）の１　：　１０００希釈液２００１ｊ’を添加した。

３７℃で１時間後、該ウェルを空にし、ＰＢＳＴで洗浄した。各ウェルに基質緩 衝液（５０菖Ｍクエン酸ナトリウム、５０１Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ５，０） および１００３％（Ｖ／Ｖ）Ｈ２０２中３４０ｍｇ／ｍｌの０−フェニレンジア ミン）２０（ｂｆｆｌを添加した。１２．５％硫酸５ＯＮｌの添加によって反応 を停止した。次いで、４９２ｎｌｌでの吸光度を測定した。抗体ＨｕＲ，５ＶＶ Ｈ／ＶＫはネズミＲ３■１９抗体よりも低い親和性であるがＲＳＶに結合した。

実施例２−高親和性結合を生じる最小可変領域フレームワーク修飾を達成するべ （設計された方法によるＲＳＶに対して特異的な高親和性抗体の製造 本発明の方法は以下の順番の改変および試験の工程を含む：１、ＣＤＲとの相互 作用について臨界であることが知られている個々のフレームワークアミノ酸残基 を一次抗体および改変ＣＤＲ置換抗体において比較する。

例えば、重鎮アミノ酸残基９４（カバット番号、カバッｈ（Ｋａｂａｔ）ら、前 記引用文献を参照）を−次体（ドナー）および改変抗体において比較する。この 位置のアルギニン残基は、１０１位の不変重鎮ＣＤＲアスパラギン酸残基と相互 作用すると考えられる。

アミノ酸９４が改変抗体のフレームワークではなく一次抗体のフレームワークの アルギニンからなる場合、改変抗体のアルギニン９４からなる副重鎖遺伝子が製 造される。逆の場合、すなわち、−次抗体ではなく改変抗体フレームワークが９ ４位のアルギニン残基からなる場合では、９４位の初期アミノ酸からなる副重鎮 遺伝子が製造される。さらなる分析の前に、これに基づいて製造された副プラス ミドを高親和性改変抗体の製造について試験する。

２　カハット（カバットら、前記文献を参照）に従って定義されたＣＤＲの４個 の残基内のフレームワークアミノ酸を一次抗体において比較する。差異がある場 合、各領域（例えば、ＶＨＣＤＲＩの上流）について、該領域の特定のアミノ酸 を改変抗体の対応する領域のものと置換して少数の改変遺伝子を得る。これに基 づいて製造された副プラスミドを高親和性抗体の製造について試験する。

３、−次および改変ＣＤＲ置換抗体におけるフレームワーク残基を比較し、電荷 、サイズまたは疎水性において大きな差異を有する残基を目だたさせる。これに 基づいて、−次抗体の対応するアミノ酸によって代表される個々のハイライト・ アミノ酸で副プラスミドが製造され、副プラスミドを高親和性抗体の製造につい て試験する。

当該方法は、ＲＳＶに対して特異的なＨｕＲ３ＶＶＨ／ＶＫ（実施例１を参照） から誘導された高親和性改変抗体の製造によって例示される。ＲＳＶ１９ＶＨお よびｐＨｕＲｓＶ１９ＶＨ間のＶＨ遺伝子配列の比較（第５図を参照）は、４個 のアミノ酸差異のうち３個がアミノ酸２７〜３０問およびアミノ酸９１〜９４間 で生じることを示す。か（シテ、ｐＨｕＲ８Ｖ１９ＶＨＮＩＫおよびｐＨｕＲ８ Ｖ１９ＶＨＦＮＳは、前者においては、−次Ｒ３Ｖ１９ＶＨで表されたフレーム ワークアミノ酸２７〜３０および９１〜９４および後者においてはアミノ酸９１ および９４で製造された。実施例１に記載したオリゴヌクレオチド部位特異的突 然変異誘発を使用して、Ｍ１３のＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨ遺伝子の突然変異誘発のた めに以下のオリゴヌクレオチドを使用した・ ｐＨｕＲ５Ｖ１９ＶＨＮＩＫ　−５’ＡＴＡＴＡＧＴＡＧＴＣＴＴＴＡＡＴＧＴ ＴＧＡＡＧＣＣＡＧＡＣＡ３’ ｐＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮｓ　−５’ＣＴＣＣＣＣＣＡＴＧＡＡＴＴＡＣＡＧＡ ＡＡＴＡＧＡＣＣＧ３’。

実施例１で詳述したようなＥＬＩＳＡアッセイで、洗浄剤抽出されたウィルス感 染細胞から調製されたＲ５Ｖ抗原への結合に関する分析についてヒト化ＨｕＲ３ Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＫ抗体を試験した。第６図は、ＨｕＲ５Ｖ １９ＶＨ／ｖＫにおける■Ｈ残基９１〜９４の、マウスＲ８Ｖ１９ＶＨ由来のＶ Ｈ残基との置換が抗原結合レベルを部分的に回復したことを示す。抗原として無 傷Ａ型ＲＳウィルス（長い菌株）を使用したＥＬＩＳＡアツセイを使用してＨｕ ＦＮＳ結合特性のさらなる分析を行った。このようなさらなる分析力Ｘらのデー タ（第６図に示した）は、Ｒ３Ｍ１９およびＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ ３Ｖ１９ＶＫ抗体の無傷非変性ＲＳウィルスに結合する能力間のし）ずれの差異 も／ＪＸさ０こトラ示ス。コノサラする分析は、Ｒ２Ｍ１７また１ｔＨｕＲ３Ｖ １９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＫで見られたよりも非常に低しλが、ＨｕＲ ８Ｖ１９ＶＨ／ＶＫの無傷ウィルスへの検出可能な結合も示した。かくして、こ のさら１こなる分析力１ら（７）チー９ハ、天然抗原ニ対する親和性がＨｕＲＳ Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＫｍＡｂにおいて回復したことを示唆する 。ＲＳＶ　Ｆ蛋白Ｉこ対するＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲＳＶ１９ＶＫの 特異性は、ＣＨ○細胞（二おＬ＼て発現されたトランケートされた可溶性Ｆ蛋白 構築物を使用する慣用のウェスタン・プロ・ソト分析によって示された。

実施例３−　ＲＳＶに対して特異的な改変抗体の特異性および生物学的活性Ｒ， Ｓ　Ｖに対して特異的なヒト化抗体の有効な臨床学的有用性を評価するために、 、２４ＲＳＶ臨床学的単離体への結合の免疫蛍光分析を行った。該単離体（′１ ブ］ノストール・パブリック・ヘルス・ラボラトリ−（Ｂｒｉｓｔｏｌ　Ｐｕｂ ｌｉｃ　ＨｅａｌｔｈＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｙ）　（イギリス、ブリストール） Ｉこよって１９８３−８４年の冬の間（二子供から採取したものであり、ＲＳＶ の主要な両すブグループを表した。１３個の単離体をサブグループＡとして、１ １個の単離体をサブグループＢとして血清型を分けた。Ｒ３Ｖ里離体で感染され たＨｅＬａまたはＭＡ１０４細胞を組織培養物中で増殖させた。細胞が細胞変性 効果の証拠を示した場合、ＰＢＳ中０．０２％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ（エチレンン アミン四酢酸）ニナト１ノウム２０１ＩｌおよびＰＢＳ中０．２５％（ｗ／ｖ） トリプシン３ｘｌｌを添加し、細胞懸濁液をＰＴＦＥ被覆スライド（ポリテトラ フルオロエチレン被覆スライド）（連合王国、エセ・ソクスのヘンドリイ（Ｈｅ ｎｄｌｅｙ））のウェル中にスポットした。３７℃で３時間の後、該スライドを 乾燥し、８０％アセトン中に固定した。細胞を、室温て１時間、モノクローナル 抗体（すなわち、ヒト化抗体ＨｕＲ５Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ８〜′１９〜′ に１またはネズミ抗体Ｒ３Ｖ１９）で塗布した。広範囲にわたって洗浄した後、 フルオレセイン・コンジュゲート・ウサギ抗マウスＩｇＧ（オランダ、チルブル グのノルディック・ラボラトリーズ（Ｎｏｒｄｉｃ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ））またはフルオレセイン・コンジュゲート・ヤギ抗ヒトＩｇＧ１（アメリカ合 衆国、アラバマ州バーミンガムのサザン・バイオテクノロジー（Ｓｏｕｔｈｅｒ ｎ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））のいずれかを添加し、インキュベーション を繰り返した。さらに洗浄した後、細胞をグリセロール中に１き、ＵＶ先光下試 験した。

第１表は、ヒト化抗体ＨｕＲＳＶ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＫおＪ：び ネズミ抗体Ｒ５Ｖ１９に関する比較免疫蛍光の結果を示す。このデータは、臨床 学的単離体の１００％がヒト化抗体および不ズミ抗体の両方によって認識される ことを示す。このようなデータは、ヒト化抗体が主要なＲ３Ｖサブグループの両 方からなるほとんどの臨床学的単離体の認識に関する有効性を有することを示す 。

！１嚢 ヒト化抗Ｒ３Ｖの臨床学的単離体への結合０宰　十、十＋、＋十＋および＋＋十 ＋は、観察された蛍光化細胞の相対的な数を表し、感染した細胞の割合を表す。

次に、融合抑制アッセイでイン・ビトロにおける生物学的活性について、ヒト化 抗体ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ８Ｖ１９ＶＫを試験した。ＭＡ１０４細 胞の懸濁液を、細胞当たり０．０ＩＰＦＵ（プラーク形成ユニット）のｒａ、　 ｏ、　ｉ、　（感染の多重性）で、Ｒ３Ｖで感染した。３７℃で１時間後、１０ ’／ｍｊ！で細胞２１１１をチューブ中のガラスカバースリップに分布した。３ ７℃でさらに２４時間後、培養培！’ｌ）化抗体ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／Ｈ ｕＲ３Ｖ１９ＶＫの希釈物を含有する培地に代えた。２４時間後、カバースリッ プ培養物をメタノール中に１０分間固定し、メイ・グランワルド（Ｍａｙ　Ｇｒ ｕｎｖａｌｄ）染料（連合王国、プールのビーディエイチ・ケミカルズ・リミテ ッド（ＢＤＨＣｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｌｔｄ、））で染色した。第２表ハ、巨細胞 １７１ＭＩｆの抑制＋１：おけるＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ３Ｖ１９Ｖ Ｋの増加する濃度の効果を示す。下記第２表に示したデータは、Ａ型ＲＳＶ誘発 細胞融合ノ抑制ニオケルヒト化抗体ＨｕＲ８Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲＳＶ１９ ＶＫの生物学的活性ｔ−示ｔ。ＲＳＶＩ９対ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ ８Ｖ１９ＶＫに関する融合抑制力価が比較可能であり、天然ウィルス抗原に対す る親和性がＨｕＲＳＶ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲＳＶ１９ＶＫにおいて充分に回復 したというさらなる証拠を提供することをさらなる研究が示したことは注意すべ きである。

ヒト化抗体ＨｕＲ８Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＫは、（Ａ型ＲＳＶ誘 発細胞融合の抑制を示すために前記で使用したものと同様にの方法を使用して） Ｂ型Ｒ３Ｖ（菌株８／６０）誘発巨大細胞融合の用量依存性抑制を示すことも判 明した。

夷ヱム ８２５Ｘ対物顕微鏡レンズで２０＠で２以上の核を有する細胞の数を数えた。

次に、ヒト化抗体ＨｕＲ５Ｖユ９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＫをＲ８Ｖマ’ ）ス感染モデルにおけるイン・ビボての産物学的活性について試験した。ＢＡＬ Ｂ／Ｃマウス（チャールズ・リバーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒｓ）がら入 手した　特異的病原を持たないカテゴリー４標準）を、ヒトＲＳＶのＡ２菌株（ ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、イン７　エクンヨン・アンド・イムニティ（Ｉ　 ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉ　ｍｍｕｎｉｔｙ）、４３（１９８４）、第６４ ９〜６５５頁＋：記載すｔｔｒ　イル）　１０　’　Ｐ　Ｆ　Ｕテ鼻腔内テ攻撃 した。ウィルス感染の１日前または感染の４日後に、マウスのグループ吐ト化抗 体２５翼９を投与した。

抗体の投与は、鼻腔内（ｉ、　ｎ、　）または腹腔内（ｉ、ｐ、）経路によるも のであった。Ｒ８Ｖ感染の５日後、マウスを殺し、Ｒ５Ｖ　ＰＦＵについて肺を アッセイした（ティラーら、インフエクション・アンド・イムニティ、４３（１ ９８４）第６４９〜６５５頁を参照）。下記第３表のデータは、マウス当たり２ ５８９の単回投与量でＨｕＲＳＶ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ５Ｖ１９ＶＫがＲ３Ｖ 感染の予防および治療に非常に有効であることを示す。

Ｋ−１はＲ３Ｖ３Ｖ感染前のＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ５Ｖ１９ＶＫ抗 体の投与を表し、＋４は感染の４日後の抗体の投与を表す。

’ｉ、ｐ、−腹腔内、１．ｎ、−鼻腔内。

−ウィルスＰＦＵは、肺１ｇ当たりのＰＦＵに調節した１０％（Ｗ／Ｖ）肺ホモ ジネート（ティラーら、前記文献を参照）の希釈液からのウィルス力価として表 す。

１ｇ当たりの＜１．７１ｏｇ＋ｏＰＦＵは、肺ホモジネート１０％の出発希釈液 においてウィルスが検出されなかったことを意味する。

ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲＳＶ１９ＶＫは、前記と同様な方法を使用し て、Ｂ型Ｒ３Ｖ（菌株８／６０）で攻撃されたマウスに予防的に投与した場合の イン・ビボにおいて活性であることを示した。さらに、ヒト化抗体ＨｕＲＳＶ１ ９ＶＨＦＮＳ／ＶＫは、前記方法と同様の方法を使用して、Ｂ型ＲＳＶ（菌株８ ７６０）で攻撃されたマウスに予防的に投与した場合のイン・ビポにおいて活性 であることも示した。

本発明は、Ｒ３Ｖ１９またはＲ３Ｖ２Ｏがドナー・モノクローナル抗体である本 発明の改変抗体の有効なヒトＲ９Ｖ感染抑制投与量を必要なヒトに投与すること からなる、必要なヒトのヒトＲＳＶ感染を予防する方法にも関する。

本発明は、ＲＳＶ１９またはＲ５Ｖ２Ｏがドナー・モノクローナル抗体である本 発明の改変抗体の有効なヒトＲｓＶ感染抑制投与量を必要なヒトに投与すること からなる、必要なヒトのヒトＲ５Ｖ感染を治療学的に治療学的に治療する方法に も関する。

ヒトにおいてＲ５Ｖ感染を有効に予防するために、Ｒ３Ｖ１９またはＲ８Ｖ２Ｏ がＨｕＲＳＶ１９ＶＨ／ＶＫまたはＨｕＲＳＶ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ３Ｖ１９ ＶＫのようなドナー・モノクローナル抗体である本発明の改変抗体約１１９／ｈ ９〜２０ｘｏ／ｋｑの１回投与が非経口的に、好ましくは、ｉ、　ｖ、　（静脈 内）またはｉ、ｍ、（筋肉内）で投与されるべきであるか、またはこのような抗 体的２００μ９／に９〜約２１１９／ｋｇの一回投与がｉ、　ｎ、　（鼻腔内） で投与されるべきである。好ましくは、このような投与量は、Ｒ８Ｖンーズンの 始め（１０月〜１１月）で開始してＲ３Ｖシーズン（３月〜４月）の終わりまで ６週間ごとに繰り返されるべきである。別法とじては、Ｒ３Ｖシーズンの始めに 、ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨ／ＶＫまたはＨｕＲ５Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ５Ｖ１９ ＶＫのようなＲ３Ｖ１９またはＲ５Ｖ２Ｏがドナー・モノクローナル抗体である 本発明の改変抗体約５ｗｑｌ＆９〜約１００ｕ／ｋｑの１回投与がｉ、　ｖ、ま たはｉ、　ｒｎ、で投与されるべきであるか；またはこのような抗体的０゜５１ ９／ｋｇ〜１０ｕ／ｂｇの１回投与がｉ、　ｎ、で投与されるべきである。ヒト におけるＲ５Ｖ感染を有効に治療学的に治療するために、ＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨ／ ＶＫまた１；ＬＨｕＲ３Ｖ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲ８Ｖ１９ＶＫ（７１ようなＲ ８Ｖ１９またはＲ２０がドナー・モノクローナル抗体である本発明の改変抗体約 ２−ｇ／ｋｇ〜約２０璽９の１回投与で非経口的に、好ましくはｉ、　Ｖ、また はｉ４．で投与されるべきであるか：またはこのような抗体約２００μｇ／ｋｇ 〜約２冨９／ｂｙがｉ、　ｎ、で投与されるべきである。このような投与は、所 望により、Ｒ３Ｖ感染が全滅されるまで適当な時間間隔で繰り返され得る。

本発明の改変抗体は、吸入によっても投与され得る。「吸入」は、鼻腔内および 経口吸入投与を意味する。エアロゾル製剤または目盛り付投与吸入器のような、 このような投与に適当な投与形態は、慣用技術によって調製され得る。例えば、 許容量１５〜２０ｍＡ’のエアロゾル容器に関する吸入による投与のための組成 物を調製するために、ポリソルベート８５またはオレイン酸のような滑沢剤０． ２−０．２％と本発明の改変抗体１０財とを混合し、該混合物をフレオンのよう なプロペラント中に、好ましくは（１，２−ジクロロテトラフルオロエタン）お よびジフルオロクロロメタンの配合物中で分散させ、鼻腔内または経口吸入投与 に適している適当なエアロゾル容器に入れる。さらなる例としては、許容量１５ 〜２０ｍ１を有するエアロゾル容器に関する、吸入による投与のための組成物に 関して、エタノール（６〜８＊ｌ）に本発明の改変抗体１０１１ｇを溶解し、ポ リソルベート８５またはオレイン酸のような滑沢剤０．１−０．２％を添加し、 フレオンのようなプロペラント中に、好ましくは（１，２−ジクロロテトラフル オロエタン）およびジフルオロクロロメタンの配合物中で分散させ、鼻腔内また は経口吸入投与に適している適当なエアロゾル容器に入れる。

好ましい、吸入によって投与されるべき必要なヒトのＲ８Ｖ感染を予防的または 治療学的に治療するための本発明の改変抗体の使用されるべき日用量は１日当た り約０．１１９〜約１０＋ｇｔｉｌｈ９である。

天然のＲ，Ｓ　Ｖ感染は、ウソ、ヤギ、ヒツジおよびチンパンジーにおいて報告 された。かくして、例えば、前記方法を使用して、適当なマウス抗体は「ウシ化 （ｂｏｖｉｎｉｚｅｄ）Ｊされ、適当なフレームワーク領域残基改変が行われ、 所望により特異的結合親和性を回復することができる。適当なマウス抗体が生じ た場合、当業者は、慣用の投与量決定技術を使用して、ウシＲ３Ｖ感染を予防学 的にまたは治療学的に有効な治療するために必要な適当な投与量および計画を容 易に決定することができる。

実施例１〜３は、感染の予防および治療のための改変抗体が改変抗体のレシピエ ンドによって「自己」として有効に認識される可変領域フレームワークを用いて 製造され得る。可変領域フレームワークへの小さい修飾は、レシピエンドに関す る感知できる程に免疫原性を増加せずに結合する抗原の大きい増加のために行わ れ得る。このような改変抗体は感染を有効に予防および全滅させ得る。

かくして、本発明は、重鎮または軽鎖可変ドメインにおける相補性決定部位（Ｃ ＤＲ）が動物またはヒトにおける感染疾患の有効な予防および治療に必要な性質 の組み合わせを有する抗体を生じる異なる供給源由来のＣＤＲの類似部分と置換 される改変抗体を提供するものである。好適には、ＣＤＲ全体を置換した。好ま しくは、重および軽鎖における可変ドメインがＣＤＲ置換によって改変された。

典型的には、マウス抗体由来のＣＤＲはヒト抗体のフレームワーク領域に移植さ れる。改変抗体は、好ましくは、天然抗体またはそのフレームワークの構造を有 する。

好まし、い抗体は、呼吸性多核性ウィルス（ＲＳ　Ｖ）に対して指向されるもの であり、好ましくは、Ｒ５Ｖの融合（Ｆ）蛋白に対して特異的なものである。こ の種の特に好ましい抗体は、その重および軽鎖において以下のＸ末端可変ドメイ ンアミノ酸配列（下記アミノ酸速記表を参照）を有する。

重’　ＱＶＱＬＱＥＳＧＰＧＬＶＲＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦ？ＴＡＶＹＣ ΔＢ（＊　たｔｔ　ＢＪぷシＷＧＳＤＦＴ）ＨＶ／ＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳアミノ 酸速記表 アミノ酸　３文字略語　１文字記号 アラニン　Ａｌａ　Ａ アルギニン　Ａｒｇ　Ｒ アスパラギン　Ａｓｎ　Ｎ アスパラギン酸　Ａｓｐ　Ｄ システィン　Ｃｙｓ　Ｃ グルタミン　Ｇｉｎ　Ｑ グルタミン酸　Ｇｌｕ　Ｅ グリシン　ｃｔｙ　Ｇ ヒスチジン　Ｈｉｓ　Ｈ メチオニン　Ｍｅｔ　Ｍ フェニルアラニン　Ｐｈｅ　Ｆ プロリン　Ｐｒｏ　Ｐ セリン　Ｓｅｒ　Ｓ トレオニン　Ｔｈｒ　Ｔ Ｒ３Ｖの融合（Ｆ）タンパクに対する抗体の特異性に必ずしも影響を与えること なく、可変領域のアミノ酸を変化させることによって、このような改変抗体を更 に改変しうることは、当業者に理解されるところであり、重鎮および軽鎖のアミ ノ酸の２５％程度をも、可変領域フレームワークまたはＣＤＲのいずれか、ある いはその両方における他のアミノ酸に置換しうることは予想される。このような 改変抗体は、動物およびヒトにおけるＲＳウィルス（ＲＳ　Ｖ）感染の防御およ び処置に有効であり得る。

また、本発明は、本発明の改変抗体のコード配列を含む組換えプラスミドと、こ の改変抗体のコード配列を含む組換えプラスミドでトランスフェクトされた哺乳 類細胞系とを包含する。このようなベクターは、従来の技術によって調製され、 可変領域フレームワークおよび異種起源由来のＣＤＲを含む免疫グロブリン領域 をコードするＤＮＡ配列と、改変抗体をコードするＤＮＡ配列に作動可能なよう に連結した適切なプロモータとを適切に含む。このようなベクターは、従来の技 術によって、トランスフェクトされた哺乳類細胞にトランスフェクトされる。

さらに、本発明は、以下の工程からなる、増大した結合親和性を有する改変抗体 を生産するのに必要な改変であって、改変抗体の可変領域フレームワーク内にお ける最小限の改変を行う方法を包含する：（ａ）ＣＤＲとの相互作用に重要であ ることが知られているフレームワークアミノ酸の分析、ならびに、単一フレーム ワークアミノ酸がＣＤＲと同じ起源由来の対応アミノ酸によって置換されている 改変抗体の生産および試験；（ｂ）ＣＤＲに隣接するフレームワークアミノ酸の 分析、ならびに、ＣＤＲの４残基内における１またはそれ以上のアミノ酸がＣＤ Ｒと同じ起源由来の対応アミノ酸によって置換されている改変抗体の生産および 試験：（Ｃ）改変抗体内におけるフレームワーク残基の分析、ならびに、単一ア ミノ酸が、生として電荷、大きさまたは疎水性が異なる、ＣＤＲと同じ起源由来 の対応アミノ酸によって置換されている改変抗体の生産および試験。

以下の実施例は、本発明の新規なＲＳＶ　Ｆタンパクエピトープに関する。

特異的なＲＳＶ　Ｆタンパクエピトープ以下の実施例は、ＲＳＶによるインビボ 感染からマウスを防御し、治療する２つのモノクローナル抗体が、ＲＳＶのＦタ ンパク内の直鎖エピトープ（この直鎖エピトープは配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉ ｏｎａｌ）エピトープの一部でもよい）であって、４２９位に必須のアルギニン 残基を有する含むＦタンパク・コード配列のアミノ酸残基４１７〜４３８、また はその免疫防御部分、例えば、Ｆタンパク・コード配列のアミノ酸残基４１７〜 ４３２やＦタンパク・コード配列のアミノ酸残基４２２〜４３８など（これらに 限定されない）を含む直鎖エピトープを認識することを示す。この新規なエピト ープ（ここでは、「エピトープ４１７〜４３８」と呼ぶ場合がある）は、他の中 和エピトープのスクリーニング、ＲＳＶに対する防御薬および治療薬、そして特 に、このエピトープに対するモノクローナル抗体へ向けての適切な標的である。

このエピトープに関する知識によって、当業者は、ＲＳＶに対するワクチンとし て適当な合成ペプチドを規定することができる。また、エピトープ４１７〜４３ ８は、ヒトにおけるヒトＲＳＶ感染の処置、治療および／または予防にも有用で ある。

本発明は、このような新規なエピトープに向けられたモノクローナル抗体由来の Ｆａｂ断片の、ウィルスによるインビボ感染に対する防御薬および治療薬として の使用にも適用され、特に、ＲＳＶに対する防御に関する。

本発明は、エピトープ４１７〜４３８に対して生成したモノクローナル抗体のコ ード配列を含む組換えプラスミドと、このようなコード配列を含む組換えプラス ミドでトランスフェクトされた哺乳類細胞系とを包含する。このようなベクター は、従来の技術によって調製され、可変領域フレームワークおよびＣＤＲを含む 免疫グロブリン領域をコードするＤＮＡ配列と、抗体をコードするＤＮＡ配列に 作動可能なように連結した適切なプロモータとを適切に含む。このようなベクタ ーは、従来の技術によって、トランスフェクトされた哺乳類細胞にトランスフェ クトされる。

実施例４ 本実施例は、ＲＳＶのＦタンパクに対するネズミ・モノクローナル抗体であって 、マウスを感染から防御し、かつ治療するモノクローナル抗体の生産を示す。

ネズミ・モノクローナル抗体（ｍＡｂ）１９および２０は以下のように生産した 。

ＢＡＬＢ／Ｃ７ウス（チャールズ・リバーズ（Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒｓ） から入手した特定病原体に非感染のもの）に、ヒト（Ｈ）ＲＳ　ＶのＡ２株（ル イスら［１９６１，メディカル・ジャーナル・オフ・オーストラリア（Ｍｅｄ、 　Ｊ、　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ）、　移、　９３２−９３３］によって報告）のｌ Ｘ１０’ＰＦＵを、３週間あけて、２回、鼻腔内（ｉ、　ｎ、　）接種した。４ か月おいて、これらのマウスに、ウシ（Ｂ）ＲＳＶの１２７株（インスティチュ ート−７ｔ７　・アニマル・ヘルス（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ａｎｉｍａ ｌ　Ｈｅａｌｔｈ）　［コンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ）、　−’−ア・ニューバ リー（Ｎｅａｒ　Ｎｅｗｂｕｒｙ）、バークス（Ｂｅｒｋｓ）、英国］で単離） の２Ｘ１０’ＰＦＵを、腹腔内（ｉ、ｐ、）接種した。接種の３日後、免疫牌細 胞をＮ５−１骨髄腫細胞（ウィリアムス（ＷｉｌｌｉａＩｌｓ）ら、　１９７７ 、セル（Ｃｅｌｌ）。

１２、６６３を参照）と融合させた。得られたハイブリドーマを、以前に報告さ れた放射免疫アッセイおよび免疫蛍光法（ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、　１９ ８４．イムノロジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、　５２．１３７−１４２）によ って、ＲＳＶに対する抗体についてスクリーニングし、（コーラ−（Ｋｏｈｌｅ ｒ）ら［「イムノロジック・メソッズ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄ ｓ）Ｊ、　ｐｐ３９７−４０２．アイ・レフコビッッ・アンド・ビー・ベリス（ １，Ｌｅｆｋｏｖｉｔｚ＆　Ｂ、　Ｐｅｒｒｉｓ）！、アカデミツク・プレス（ Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）コによって報告されたように）軟寒天上で２回 クローン化し、得られたクローン化細胞を、ＢＡＬＢ／Ｃマウスに接種して、以 前に報告されたように（ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、　１９８４．　イムノロ ジー（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、煕、　１３７−１４２を参照）、腹水を生産し た。

ウィルス・ポリペプチドに対するｍＡｂの特異性は、以前に報告されたように（ ケネディー（Ｋｅｎｎｅｄｙ）ら、　１９１１１８．　ジャーナル・オフ・ジェ ネラル・バイロロ／−（Ｊ、　Ｇｅｎ　Ｖｉｒｏｌ、）、　６９．３０２３−２ ０３２を参照）、＜ＳＳＳ＞−メチオニンまたは（３Ｈ）−グルコサミンで標識 されたＲＳＶ感染細胞溶解物の放射免疫沈降法および免疫プロッティング法（タ ケダ（Ｔａｋｅｄａ）ら、　１９８５．エレクトロフォレシス（Ｅｌｅｃｔｒｏ ｐｈｏｒｅｓｉｓ）。

β、　４９２−４９７を参照）によって決定した。免疫プロッティング法に用い た抗原は、ＨＲ３ＶのＡ２株に感染させたＨｅｐ−２細胞（アメリカン・タイプ ・カルチャー０コレクシヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　 Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、　Ｏツクビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）。

メリーランド、ＵＳＡ）またはＢＲ５Ｖの１２７株に感染させた一次つシ腎（Ｃ Ｋ）細胞（インスティチュート・フォア・アニマル・ヘルス（工ｎ５ｔｉｔｕｔ ｅ　ｆｏｒ　Ａｎｉｍａｌｌｌｌｅａｌｔｈ）［コンプトン（Ｃｏｍｐｔｏｎ） コで生Ｎ）のいずれがであった。非感染のＨｅｐ−２細胞またはＣＫ細胞を対照 抗原として用いた。

ｍＡｂの免疫グロブリン・アイソタイプは、放射免疫拡散キット（セロチック（ Ｓｅｒ□ｔｅｃ）、キッドリントン（Ｋｉｄｌｉｎｇｔｏｎ）、オックスフォー ドンヤイア（Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ）、　ＵＫ）を用いた免疫拡散法によって 決定した。

ｍＡｂ１９および２０の性質を以下の表Ａに示す。

’ＥＬＩＳＡｉ：おケル抗原トシテ、ＨＲＳＶ　Ａ２株（サブタイプＡ）、ＨＲ ３Ｖ８／６０株（サブタイプＢ）およびＢＲＳＶ　１２７株を用い、ｌｏｇ＋ｏ 力価として表された抗体力価。

”５ＦＡ＝表面蛍光を示すＨＲＳＶ　Ａ２株感染細胞の百分率。

３ｍＡｂの１／１００希釈液およびウサギ補体によるウィルス感染細胞（持続的 にＢＲＳＶに感染させたウシ鼻粘膜細胞）からの比クロム放出率（％）。

’　ｌ　Ｏｇ＋ｏとして表された５０％プラーク減少力伍０ゝ鼻腔内感染の前日 に１００μｌのｍＡｂを腹腔内投与されたマウスの肺におけるＲＳＶ　Ａ２株の ピーク力価の減少。

放射標識Ｒ３Ｖの免疫沈降（ブルンダ（Ｂｒｕｎｄａ）ら［（１９７７）ジャー ナル・オフ・イム１０ジー（Ｊ、　ｒｍｍｕｎｏｌ、）、　１１９．１９３−１ ９８）コの方法による）は、ｍＡｂ１９および２０が融合（Ｆ）グリコプロティ ンを認識することを示した。このことは、ＲＳＶに感染した細胞の非還元および 還元溶解物のウェスタンプロットによって確認された。プロットは、ＨＲＰ接合 ヤギ抗マウマウ　ｇＧ　（Ｋｐ　１．ガイザースバーグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕ ｒｇ）、メリーランド、ＵＳＡ）でプローブした。ｍＡｂ１９および２０は、天 然のＦタンパク抗原中に存在する１４０ｋ　Ｆタンパク二量体および７０に単量 体、ならびに、２＝メルカプトエタノール中で煮沸することによって変性させた 抗原中に存在する４６Ｋ　Ｆｌ断片を認識した。ｍＡｂ１９および２０は、いず れもＩ　ｇＧ２ａと同定され、ＨＲＳＶのＡ２株および８７６０株に対するその ＥＬＩＳＡ力個は、ＢＲＳＶの１２７株に対するそのＥＬＩＳＡ力価と同様であ った。このことは、これらのｍＡｂによって認識されるエピトープがヒトＲ５Ｖ とウソＲＳＶの株間で保存されていることを示している。ｍＡＢ１９および２０ は、いずれもＲ５Ｖ感染力を中和し、ＲＳＶに感染したＭＡ１０４細胞における 多核巨細胞の形成を示した。ｍＡｂ１９とは対照的に、ｍＡｂ２０は、ウサギ補 体の存在下でＲＳＶ感染細胞を溶解させた。ｍＡｂ１９がＲ３Ｖ感染細胞を溶解 しないことは、ｍＡｂ１９がかかる細胞の８８％を染色したので、ウィルス感染 細胞の表面に結合できないからではない。ｍＡｂ１９および補体がウィルス感染 細胞を溶解できないことは、抗体および補体が媒介する溶解がこの抗体によって 媒介されるインビボでの防御には重要でないことを示している。ｍＡｂ１９およ び２０がＲ５Ｖ感染を防御する能力は、ｍＡｂ１９および２０のｉ、　ｐ、接種 の２４時間後に、Ｒ８Ｖ２４の約１０’ＰＦＵでマウスを１６ｎ感染させること によって評価した。感染の５日後に殺した未処理マウスの肺は、組織１ｇあたり ５．５１ｏｇ＋ｏＰＦＩＪのＲＳＶを含んでいた。ここで、ｍＡｂ１９または２ ０のいずれかを与えたマウスの肺には、ウィルスは検出されなかった。

実施例５ 本実施例は、実施例４で生成したｍＡｂ１９および２０による阻害に耐性を示す Ｒ３Ｖ変異体を単離する方法について説明する。

ｍＡｂ１９および２０による中和に耐性を示す変異体ＲＳウィルスは、ＨＲＳＶ のＡ２株によるプラーク減少法を用いて、以下のように生産した。組織培養フラ スコ中に入れた融合性単層のＣＫ細胞を、ＭＯＩｏ、１で、ＨＲＳＶのＡ２株に 感染させた。感染の２４時間後から開始し、３〜５日間続けて、培地を、１０％ ｍＡｂを含有する新鮮な培地と毎日交換した。細胞変異効果が認められたところ で、ウィルスを採取した。このように調製したウィルスを、等量の非希釈ｍＡｂ １９または２０、あるいは培地だけのいずれかと、室温で１時間混合し、３５ｍ ｍのマルチウェルプレート（タンク（Ｎｕｎｃ）、　カムストラップ（Ｋａｍｓ ｔｒｕｐ）、リスキルデ（Ｒｉｓｋｉｌｄｅ）、デンマーク）のＣＫ単層上に接 種した。３７℃で１時間インキュベートした後、これらプレートに、０．２５％ アガロースおよび１０％ｍＡｂを含む培地、あるいは培地だけを重層した。これ ら培養物を、空気中に５％ＣＯｘ、３７℃で、７日間インキュベートした後、ウ ィルスプラークを可視化するために、０．１５ＭＮａＣｌ中における生体染色色 素の０．３％３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテ トラゾリウムプロミドを重層に添加した。

単一のプラークを含むプレートから推定の変異体ウィルスを寒天プラグに取り出 し、培地中に希釈し、以前のように、等量のｍＡｂ１９または２０と混合し、３ ５ｍｍのマルチウェルプレートのＣＫ単層上に接種した。推定の変異体ウィルス を、プラーク状で再び取り出し、仔ウシ精巣細胞のカバー片を有するチューブに 接種した。４〜６日間インキュベートした後、カバー片を取り除いて、ｍＡｂ１ ９および２０ならびにＦＩＴＣ標識ウサギ抗マウスＩｇ（ノルディック・ラポズ （Ｎｏｒｃｌｉｃ　Ｌａｂｓ）、ティルブルグ（Ｔｉｌｂｕｒｇ）、オランダ） で染色した。陽性対照として、カバー片を、ＲＳＶに対するポリクローナル・ウ ソ抗血清（インスティテユート・フォア・ヘルス−コンプトン（Ｉｎｓｔｉｔｕ ｔｅ　ｆｏｒ　Ａｎｉｍａｌ　Ｈｅａｌｔｈ−Ｃｏｍｐｔｏｎ）にて、ＲＳＶで 高度免疫されたノドパイオートの仔ウシから製造）、およびＦＩＴＣＩ！１識ウ サギ抗ウシつｇ（ノつディック・イムノロジー（Ｎｏｒｄｉｃ　Ｉｍｍｕｎｏｌ ｏｇｙ）、ティルブルグ（Ｔｉｌｂｕｒｇ）、オランダから入手）で染色した。

免疫蛍光法によってｍＡｂ１９または２０に反応しなかったＲＳウィルスを変異 体ウィルスとして分類し、これらを用いてＨｅｐ−２細胞の単層を感染させ、Ｅ ＬＩ　ＳＡ用の抗原を作成した。こうして、Ｒ３Ｖ感染の３〜４日後に、細胞を 培地にこすり付け、４００ｇで５分間遠心し、蒸留水に再度懸濁し、０．５％（ ｖ／ｖ）ＮＰ４０界面活性剤で処理して、細胞溶解物を得た。対照の細胞溶解物 は、非感染のＨｅｐ−２細胞を用いて、同様に作成した。変異体ウィルスに対す るＲＳＶのＦタンパクへのｍＡｂＳパネルの結合を、ＥＬＩＳＡによって調べた 。マイクロタイタープレートのウェルを、感染または対照の細胞溶解物のいずれ か５０μｍで、３７℃にて、−晩コードン、ＰＢＳおよび０，０５％Ｔｗｅｅｎ 　２０中の５％正常ブタ血清からなる遮断緩衝液と共に、室温にて１時間インキ ュベートし、ＰＢＳ／ＴＷＥＥＮで５回洗浄した。ｍＡｂの段階希釈液（３段） をウェルに添加し、プレートを１時間インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ で５回洗浄した後、１：２０００に希釈したＨＲＰ接合ヤギ抗マウマウ　ｇＧ　 （Ｋｐ　１．ガイザースブルグ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）。

メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ）、Ｕ　Ｓ　Ａ　）を各ウェルに添加した。最 終的に洗浄した後、基質３．３°、　５．５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭ Ｂ）（ＩＣＮイムノバイオロジカルズ（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ） 、イリノイ）を用いて、結合した接合体を検出した。

ｍＡｂ１９に対する耐性で選択された変異体ウィルスは、ＥＬＩＳＡにおいて、 ｍＡｂ１９および２０のいずれとも反応しなかった。同様に、ｍＡ　ｂ　２０に 対する耐性で選択された変異体ウィルスはｍＡｂ１９および２０と反応しなかっ た。

試験した他のすべてのｍＡｂは、親であるＨＰＳＶのＡ２株に対するのと同じ程 度で、変異体と反応した。これらの結果を以下の表Ｂに示す。

表Ｂ 表Ｂ　ＲＳＶの抗体回避変異体への抗ＦｍＡｂの結合実施例６ 本実施例は、防御モノクローナル抗体に結合するＦタンパク内のアミノ酸配列の 同定について説明し、このアミノ酸配列に防御ｍａｂが結合するためには、アル ギニン４２９が必須であることを示す。

ＨＲ３ＶのＡ２株または実施例５に記載の変異体の各々のいずれかに感染させた 細胞から単離されたポリ（Ａ）”ＲＮＡを用いて、ＦタンパクｍＲＮＡの配列を 決定した。これらの配列は、以前に報告されたＲＳＶの長鎖のＦタンパク配列（ ロペス（Ｌｏｐｅｚ）ら、　１９１１１ｇ、　ウィルス・リサーチ（Ｖｉｒｕｓ 　Ｒｅｓ、）、　１０．２４９−２６２を参照）に従って合成され、次いで末端 デオキシヌクレオチド転移酵素を用いた追跡（デ・ボーデ（ＤｅＢｏｒｄｅ）ら 、１９８６．アナリティカル・バイオケミストリー（＾ｎａｌＢｊｏｃｈｅｍ） 、　１５７．２７５−２８２を参照）によって得られた５’−３２ｐ標識オリゴ ヌクレオチドプライマーを用いたジデオキシ法（前出）によって決定した。ｍＡ ｂ１９を用いて、３つの変異体を選択し、また、ｍＡｂ２０を用いて、３つを選 択した。

このような変異体はすべて、親のＡ２株と比較すると、ヌクレオチド１２９８で 単一の塩基転換（ＣからＧ）を示した。このヌクレオチド置換は、Ｆタンパクの ４２９位におけるアミノ酸残基をアルギニンからセリンに変化させる。ｍＡｂ１ ９はウェスタン・プロットにおいてＦ、サブユニットと反応したので、抗体結合 部位は、Ｆ、サブユニットの残基４２９が本質的な役割を果す隣接アミノ酸の一 次配列によって決定されると考えられる。Ｆタンパクのアミノ酸残基４１７〜４ ３２．４２２〜４３８．４１７〜４３８および４２１〜４５０に対応する合成ペ プチドを、ＥＬＩＳＡにおいてｍＡｂ１９および２０と反応する能力について調 べた。ｍＡｂ１９および２０は、ペプチド４１７〜４３２　（Ｆ４１７）、４１ ７〜４３８および４２２〜４３８　（Ｆ４２２）と反応したが、ペプチド４３１ 〜４５０とは反応しなかった。マイクロタイタープレートのウェル上に３７℃で 一晩（「乾式」）コートするか、あるいはウェル上に室温で１時間（「湿式」） コートしたペプチド４１７〜４３２および４２２〜４３８（２μｇ／ウェル）へ のｍＡｂ１９の結合を、図７に示す。ｍＡｂ２０が本質的に同じ結果を与えたこ とに留意すべきである。

実施例７ 本実施例は、ｍＡｂ１９および２０由来のＦａｂ断片がＲＳＶに感染したマウス を防御し、かつ治療することができることを示す。

ｍＡｂ１９および２０は、プロティンＡセファロース（ファーマシア（Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）、ミルトン・ケインズ（Ｍｉｌｔｏｎ　Ｋｅｙｎｅｓ）、　ユナイ テッド・キングダム（Ｕｎｉｔｅｄ　Ｋｉｎｇｄｏｍ））を用いて、腹水から精 製した。約１０ｍｇの精製ｍＡｂ１９および２０を、Ｏ、Ｄ　ｍ　１の固定化パ パイン（ピアース−アウト−ペイジャーランド（Ｐｉｅｒｃｅ−Ｏｕｄ−Ｂｅｉ 　ｊｅｒｌａｎｄ）、オランダ）と共に、３７℃で、絶えず撹拌しながら、それ ぞれ５時間および一晩インキユベートした。得られたＦａｂ断片を固定化プロテ ィンＡカラム（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））で回収した。精製１ｇＧおよびパパ イン切断の断片を、還元条件下の５ＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。精製１ｇ Ｇは、Ｉ　ｇ　ＣＤＮＭ４オヨヒ１１Ｍ１：ｊｔ応シテ、５３．０００　ｄおよ び２３．０００　ｄノバンドを示した。Ｆａｂ断片を含有するプロティンＡ画分 は、約２５．０ＯＯｄのバンドを示し、Ｆｃ断片を含有する画分は、非切断Ｉｇ Ｇの重鎖および軽鎖ならびにＦｃ断片に対応して、約２８．０ＯＯｄの３つの異 なるバンドを示した。

精製ＩｇＧ、およびパパイン切断の断片を、ＨＲ５ＶのＡ２株に感染したＨｅｐ −２細胞および感染していないＨｅｐ−２細胞を抗原とし、さらにＨＲＰ−ヤギ 抗マウスＦａｂ　（ジグ７−ケミカル・カンパ＝−（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌ　Ｃｏ、　）、セントルイス、ミシシッピー、ＵＳＡ）および）（ＲＰ−ヤ ギ抗マウスＦＣ（ＩＣＮイムノバイオロジカルズ（ＩｍｍｕｎｏＢｉｏｌｏｇｉ ｃａｌｓ）、イリノイ）を用いたＥＬＴ　ＳＡによって、抗Ｒ３Ｖ活性にライて 調べた。ＥＬＩＳＡは、ｍＡｂ１９および２０のＦａｂ断片が非切断１ｇで汚染 されていないことを示した。これらのデータを以下の表Ｃに示す。

表ＣマウスにおけるＲ５Ｖ感染に対するＦａｂ断片の予防的および治療的効果抗 体力価はＲ８Ｖ／Ａ２および抗原を用いたＥＬＩＳＡによって測定した。

非切断ｍＡｂ１９および２０における抗体の濃度は、Ｆａｂ断片と同様のＥＬＩ ＡＳ力価を与えるように調節し、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶ感染を防御 する能力について調べた。５尾のマウスからなるグループに、非切断の精製ｍＡ ｂ１９またはｍＡｂ２０あるいはＦａｂ断片（ｍＡｂ１９またはｍＡｂ２０に由 来）を、約１０’ＰＦＵのＨＲ８ＶのＡ２株をｉ、　ｎ、接種するＩＳ前＊たｌ ｌＢ後にｉ、　ｎ、接種した。対照のマウスには、ＨＲ３Ｖだけを接種した。ウ ィルス感染の５日後、マウスを殺して、それらの肺を、以前に報告されたように （ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、　１９８４．インフエクション・アンド・イム ニティ（Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ、　）、　４３゜６４９−６５５）、二次Ｃ Ｋ細胞に対するＲ３Ｖ　ＰＦＵについてアッセイした。ｍＡｂ１９および２０の Ｆａｂ断片は、ＲＳＶ感染を防御したり、既定の感染を消滅させるのに極めて効 果的であった。

本発明は、エピトープ４１７〜４３８に関する。また、本発明は、エピトープ４ １７〜４３８に対して生成したモノクローナル抗体にも関する。このようなモノ クローナル抗体は、従来の技術によって生産され、例えば、ネズミのモノクロー ナル抗体、ヒトのモノクローナル抗体、およびウシのモノクローナル抗体を含む が、これらに限定されない。このようなモノクローナル抗体は、完全な抗体分子 （全長の重鎮および軽鎖を有する）またはその断片、例えばＦａｂや（Ｆ　ａ　 ｂ’）ｚ断片、軽鎖や重鎖の二量体またはその最小組換え断片、例えばＦｖや５ ＣＡ（単鎖抗体）、あるいはモノクローナル抗体と同じ特異性を有する他の分子 からなる。

また、本発明は、エピトープ４１７〜４３８に対して生成したモノクローナル抗 体と、薬学的に許容される担体または希釈剤とからなる薬剤組成物にも関する。

また、本発明は、エピトープ４１７〜４３８に対して生成したモノクローナル抗 体を、ヒトＲ３Ｖ感染を阻害するのに有効な用量で、ヒトＲ３Ｖ感染の防御を必 要とするヒトに投与することからなる、このようなヒトのヒトＲ３Ｖ感染を防御 する方法にも関する。

また、本発明は、エピトープ４１７〜４３８に対して生成したモノクローナル抗 体を、ヒトＲ３Ｖ感染を治療するのに有効な用量で、ヒトＲ８Ｖ感染の治療を必 要とするヒトに投与することからなる、このようなヒトのヒトＲＳＶｇ染を治療 的に処置する方法にも関する。

ヒトのＲ５Ｖ感染を効果的に防御するには、エピトープ４１７〜４３８に対して 生成したモノクローナル抗体を、−回あたり約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋ　 ｇの用量で、非経口的に、好ましくはｉ、ｖ、（静脈内）または】１ｍ、（筋肉 内）投与するか、あるいは、このような抗体を、１回あたり約２００μｇ／ｋｇ 〜約２ｍｇ／ｋｇの用量で、ｉ、ｎ、（鼻腔内）投与しなければならない。好ま しくは、このような用量は、Ｒ５Ｖンーズン（１０月〜１１月）の始めから開始 して、ＲＳＶシーズン（３月〜４月）の終わりまで、六（６）週間毎に繰り返さ なければならない。

あるいは、Ｒ５Ｖシーズンの始めには、４１７〜４３８エピトープに対して生成 したモノクローナル抗体を、１回あたり約５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの 用量で、１．■、またはｉ、　ｍ、投与するか、あるいは、このような抗体を、 １回あたり０゜５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇを１．ｎ、投与しなければなら ない。

ヒトのＲ３Ｖ感染を効果的に治療するには、エピトープ４１７〜４３８に対して 生成したモノクローナル抗体を、−回あたり約２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇ の用量で、非経口的に、好ましくはｉ、　Ｖ、または１１ｍ、投与するか、ある いは、このような抗体を、１回あたり約２００μｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの用 量で、１ｎ投与しなければならない。このような用量は、必要であれば、Ｒ５Ｖ 感染が撲滅されるまで、適当な時間間隔で繰り返せばよい。

また、エピトープ４１７〜４３８に対して生成したモノクローナル抗体は、吸入 によって投与してもよい。「吸入」とは、鼻腔内および経口的な吸入投与を意味 する。このような投与に対して適当な投与形態、例えば、エアロゾル処方物また は用量計量型の吸入器は、従来の技術によって調製すればよい。例えば、容量１ ５〜２０ｍ１のエアロゾル容器について吸入投与用の組成物を調製するには、エ ピトープ４１７〜４３８に対して生成したモノクローナル抗体１０ｍｇを、０２ 〜０．２％の滑剤、例えば、ポリソルベート８５またはオレイン酸と混合し、こ のような混合物を噴射剤、例えば、フレオン、好ましくは（１，２ンクロロテト ラフルオコエタン）とジフルオロクロロメタンとの組合せに分散させ、鼻腔内ま たは経口的な吸入投与のいずれか向きの適当なエアロゾル容器に詰める。吸入投 与用の組成物の更なる例としては、容量１５〜２０ｍ１のエアロゾル容器につい て、エピトープ４１７〜４３８に対して生成したモノクローナル抗体１０ｍｇを エタノール（６〜８ｍ］）に溶解し、０．１〜０．２％の滑剤、例えば、ポリソ ルベート８５またはオレイン酸と混合し、このような混合物を噴射剤、例えば、 フレオン、好ましくは（１，２ジクロロテトラフルオロエタン）とジフルオロク ロロメタンとの組合せに分散させ、鼻腔内または経口的な吸入投与のいずれか向 きの適当なエアロゾル容器に詰める。

Ｒ５Ｖ感染を予防的または治療的に処置することを必要とするヒトにおいて、こ のような処置を行うために吸入投与される４１７〜４３８エピトープに対して生 成したモノクローナル抗体について採用すべき好ましい毎日の投与量は、１日あ たり約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇである。

「ヒト」 ＦＩＧ、　３ １ヒト−）　ヒトに定を領域 ＦＩＧ、　４ １．４− □ ０．０００＋００　０．０１００００　＋、００００００　＋００．０００００ ０抗体濃度 （ｕ９／ｍ１） ＦＩＧ、６Ａ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年３月ｚｌ料

Claims (52)

【特許請求の範囲】
1. １．アクセプター・モノクローナル抗体の軽および／または重可変ドメイン中の 相補性決定領域（ＣＤＲ）の少なくともある部分が、１またはそれ以上のドナー ・モノクローナル抗体からのＣＤＲの類似する部分によって置換されており、ド ナー・モノクローナル抗体の結合特異性を保持するために、アクセプター・モノ クローナル抗体の軽および／または重可変ドメインフレームワーク領域が最小改 変されていてもまたはされていなくてもよく、このようなドナー抗体が個々の微 生物に特異性を有することを特徴とする改変抗体。
2. ２．微生物がヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）である請求項１記載の抗体。
3. ３．ドナー抗体がＲＳＶの融合（Ｆ）タンパク質に向けられている請求項２記載 の抗体。
4. ４．ドナー抗体がエピトープ４１７−４３８に向けられている請求項２記載の抗 体。
5. ５．重および軽鎖中に以下のＮ−末端可変ドメインアミノ酸配列を有する請求項 ２記載の抗体。 重鎖：【配列があります】 軽鎖：【配列があります】
6. ６．ドナー・モノクローナル抗体がＲＳＶ１９である請求項２記載の抗体。
7. ７．ドナー・モノクローナル抗体がＲＳＶ２０である請求項２記載の抗体。
8. ８．ＨｕＲＳＶ１９ＶＨ／ＶＫである請求項６記載の抗体。
9. ９．ＨｕＲＳＶ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲＳＶ１９ＶＫである請求項６記載の抗体 。
10. １０．Ｆａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ′）２フラグメントである請求項１記 載の抗体。
11. １１．請求項１に記載の改変抗体と医薬上許容される担体または希釈剤とからな る医薬組成物。
12. １２．微生物がヒトＲＳＶである請求項１１記載の組成物。
13. １３．ドナー抗体がＲＳＶの融合（Ｆ）タンパク質に向けられている請求項１１ 記載の組成物。
14. １４．ドナー抗体がエピトープ４１７−４３８に向けられている請求項１１記載 の組成物。
15. １５．改変抗体が、その重および軽鎖中に以下のＮ−末端可変ドメインアミノ酸 配列を有する請求項１１記載の組成物。 重鎖：【配列があります】 軽鎖：【配列があります】
16. １６．ドナー・モノクローナル抗体がＲＳＶ１９である請求項１１記載の組成物 。
17. １７．ドナー・モノクローナル抗体がＲＳＶ２０である請求項１１記載の組成物 。
18. １８．改変抗体がＨｕＲＳＶ１９ＶＨ／ＶＫである請求項１６記載の組成物。
19. １９．改変抗体がＨｕＲＳＶ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲＳＶ１９ＶＫである請求項 １６記載の組成物。
20. ２０．改変抗体がＦａｂフラグメントまたは（Ｆａｂ′）２フラグメントである 請求項１０記載の組成物。
21. ２１．有効な、ヒトＲＳＶ感染抑制用量の請求項４、５、６、７、８および９の いずれかの改変抗体を、ヒトＲＳＶ感染の予防を必要とするヒトに投与すること からなる、かかるヒトにおけるヒトＲＳＶ感染の予防性。
22. ２２．−用量の改変抗体約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇを非経口内に、好ま しくは静脈内にまたは筋肉内に投与する請求項２１記載の方法。
23. ２３．−用量の改変抗体約２００μｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇを鼻腔内に投与す る請求項２１記載の方法。
24. ２４．投与をＲＳＶ流行期の始め（１０月−１１月）から開始し、ＲＳＶ流行期 の終わり（３月−４月）まで６週間毎に繰り返す請求項２２記載の方法。
25. ２５．投与をＲＳＶ流行期の始め（１０月−１１月）から開始し、ＲＳＶ流行期 の終わり（３月−４月）まで６週間毎に繰り返す請求項２３記載の方法。
26. ２６．ＲＳＶの流行期の始めで、−用量の改変抗体約５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍ ｇ／ｋｇを静脈内または筋肉内投与するか、または−用量のこのような抗体約０ ．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇを鼻腔内投与する請求項２１記載の方法。
27. ２７．改変抗体がＨｕＲＳＶ１９ＶＨＦＮＳ／ＨｕＲＳＶ１９ＶＫである請求項 ２１記載の方法。
28. ２８．改変抗体がＨｕＲＳＶ１９ＶＨ／ＶＫである請求項２１記載の方法。
29. ２９．有効な、ヒトＲＳＶ感染治療用量の請求項４、５、６、７、８および９の いずれかの改変抗体を、そのような感染を治療的に処理する必要があるヒトに投 与することからなる、かかるヒトにおけるヒトＲＳＶ感染を治療的に処理する方 法。
30. ３０．−用量の改変抗体約２ｍｇ／ｋｇ〜約２０もｇ／ｋｇを非経口内に、好ま しくは静脈内にまたは筋肉内に投与する請求項２９記載の方法。
31. ３１．約２００μｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの改変抗体を鼻腔内投与する請求項 ２９記載の方法。
32. ３２．エピトープ４１７−４３８に拮抗して生じるモノクローナル抗体。
33. ３３．請求項３２のモノクローナル抗体と医薬上許容される担体または希釈剤と からなる医薬組成物。
34. ３４．有効な、ヒトＲＳＶ感染抑制用量の請求項３２のモノクローナル抗体を、 そのような感染を予防する必要があるヒトに投与することからなる、かかるヒト におけるヒトＲＳＶ感染の予防方法。
35. ３５．−用量のモノクローナル抗体約１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇを非経口 内に、好ましくは静脈内にまたは筋肉内に投与する請求項３４記載の方法。
36. ３６．−用量のモノクローナル抗体約２００μｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇを鼻腔 内に投与する請求項３４記載の方法。
37. ３７．投与をＲＳＶ流行期の始め（１０月−１１月）から開始し、ＲＳＶ流行期 の終わり（３月−４月）まで６週間毎に繰り返す請求項３５記載の方法。
38. ３８．投与をＲＳＶ流行期の始め（１０月−１１月）から開始し、ＲＳＶ流行期 の終わり（３月−４月）まで６週間毎に繰り返す請求項３６記載の方法。
39. ３９．ＲＳＶの流行期の始めで、−用量のモノクローナル抗体約５ｍｇ／ｋｇ〜 約１００ｍｇ／ｋｇを静脈内または筋肉内投与するか、または−用量のこのよう な抗体約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇを鼻腔内投与する請求項３４記載 の方法。
40. ４０．有効な、ヒトＲＳＶ感染治療用量の請求項３２のモノクローナル抗体を、 そのような感染を治療する必要があるヒトに投与することからなる、かかるヒト におけるヒトＲＳＶ感染を治療的に処理する方法。
41. ４１．−用量のモノクローナル抗体約２ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇを非経口 内に、好ましくは静脈内にまたは筋肉内に投与する請求項４０記載の方法。
42. ４２．約２００μｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの抗体を鼻腔内投与する請求項４０ 記載の方法。
43. ４３．Ｆａｂフラグメントである請求項３２記載のモノクローナル抗体。
44. ４４．モノクローナル抗体を吸入により投与する請求項３４記載の方法。
45. ４５．モノクローナル抗体を吸入により投与する請求項４０記載の方法。
46. ４６．改変抗体を吸入により投与する請求項２１記載の方法。
47. ４７．改変抗体を吸入により投与する請求項２９記載の方法。
48. ４８．結合親和性の増加した改変抗体を生産するのに必要な改変抗体の可変領域 フレームワークの範囲内で最小修飾を施す方法であって、以下の工程：（ａ）Ｃ ＤＲとの相互作用のために重要であることが知られているフレームワークアミノ 酸を分析し、単一のフレームワークアミノ酸かＣＤＲと同じ源からの対応するア ミノ酸により置換されている改変抗体圧生産して試験し；（ｂ）ＣＤＲに隣接す るフレームワークアミノ酸を分析し、ＣＤＲの４残基内の１またはそれ以上のア ミノ酸がＣＤＲの同じ源からの対応するアミノ酸により置換されている改変抗体 を生産して試験し；（ｃ）改変抗体内のフレームワーク残基を分析し、単一のア ミノ酸がＣＤＲの同一の源からの電荷、大きさまたは疎水性にて主たる差異を有 する対応するアミノ酸により置換されている改変抗体圧生産して試験することか らなる最小修飾方法。
49. ４９．請求項１の改変抗体のコード配列を含有する組換え型プラスミド。
50. ５０．請求項４９の組換え型プラスミドでトランスフェクトされた哺乳動物の細 胞株。
51. ５１．請求項３２のモノクローナル抗体のコード配列を含有する組換え型プラス ミド。
52. ５２．請求項５１の組換え型プラスミドでトランスフェクトされた哺乳動物の細 胞株。