RS58087B1

RS58087B1 - Antitela za lečenje kancera koji eksprimira klaudin 6

Info

Publication number: RS58087B1
Application number: RS20181513A
Authority: RS
Inventors: Ugur Sahin; Özlem Türeci; Michael Koslowski; Korden Walter; Stefan Wöll; Maria Kreuzberg; Bernd Hubner; Michael Erdeljan; Michael Weichel
Original assignee: Ganymed Pharmaceuticals Gmbh; Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date: 2011-05-13
Filing date: 2012-04-20
Publication date: 2019-02-28
Also published as: UA115969C2; LT3026064T; CN107090043B; KR102708094B1; MX341147B; HUE028603T2; IL228738B; CA2832174C; MX2020001224A; JP6276176B2; US9321842B2; WO2012156018A1; SMT201600064B; DK3026064T3; WO2012156018A8; BR112013029212A2; IL228738A0; AU2021277764B2; US20160264677A1; JP6637083B2

Description

Opis

[0001] Antitela se sa uspehom koriste u kliničkoj praksi u terapiji kancera, a tokom poslednje decenije smatraju se i terapeutikom sa najvećom perspektivom u onkologiji. U poređenju sa drugim konvencionalnim lekovima protiv kancera lečenje kancera koje se zasniva na antitelima odlikuje se povećanom specifičnošću prema kancerskim ćelijama i slabijim sporednim efektima. Razlozi za to leže u činjenici da antitela poseduju sposobnost preciznog razlikovanja normalne od neoplastične ćelije, kao i u činjenici da se mehanizam delovanja antitela zasniva na manje toksičnim imunološkim anti-tumorskim mehanizmima, kao što su aktivacija komplementa i regrutovanje citotoksičnih imunskih ćelija.

[0002] Klaudini su integralni membranski proteini smešteni unutar čvrstih međućelijskih veza koje se uspostavljaju između epitelnih ili endotelnih ćelija. Klaudini poseduju četiri transmembranska segmenta sa dve vanćelijske petlje i N i C krajevima smeštenim u citoplazmi. Porodica klaudinskih (CLDN) transmembranskih proteina ima kritičnu ulogu u održavanju epitelnih i endotelnih međućelijskih čvrstih veza, a ovi proteini imaju i važnu ulogu u održavanju citoskeleta i u međućelijskoj signalizaciji. Osim što se eksprimiraju na ćelijskoj membrani, ovi proteini se i različito ekspremiraju na tumorskim i normalnim ćelijama, što ih čini atraktivnim metama u imunološkoj terapiji kancera, zbog čega razvijanje terapeutika zasnovanih na antitelima koja prepoznaju CLDN u terapiji kancera daje visoku terapeutsku specifičnost.

[0003] Postoji, međutim, nekoliko prepreka u kliničkoj primeni terapeutika zasnovanih na delovanju usmerenom protiv CLDN. S obzirom na to da su CLDN proteini svuda prisutni u organizmu, i da imaju važnu ulogu u održavanju čvrstih međućelijskih veza, primena terapeutika usmerenih na CLDN zahteva visoku ciljnu specifičnost, kako bi tretman u najvećoj meri bio usmeren na kancerske ćelije i kako bi se sistemska toksičnost smanjila na najmanju meru.

[0004] WO 2012/003956 se odnosi na lečenje i/ili prevenciju tumorskih bolesti povezanih sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN6, naročito kancera i metastaze kancera upotrebom antitela koja se vezuju za CLDN6. Naročito, WO 2012/003956 pokazuje da je vezivanje antitela za CLDN6 na površini tumorskih ćelija dovoljno za inhibiciju rasta tumora i za produženje preživljavanja i produženje života pacijenata sa tumorom. Pored toga, vezivanje antitela za CLDN6 je efikasno u inhibiciji rasta CLDN6 pozitivnih tumora germinativnih ćelija kao što su teratokarcinomi ili embrionalni karcinomi, naročito tumori germinativnih ćelija testisa.

[0005] WO 2010/094499 se odnosi na identifikaciju sekvenci nukleinskih kiselina i aminokiselina koje su karakteristične za tumorska tkiva kao što su tkiva tumora jajnika tumora pluća i koja predstavljaju ciljna mesta za terapiju ili dijagnozu tumorskih bolesti kod subjekta.

[0006] Patent WO 2009/087979 se odnosi na anti-CLDN6 antitela i njihovu primenu kao antikancerskih agenasa. Naročito, ovim pronalaskom opisana su monoklonska antitela koja nose oznake AB3-1, AE1-16, AE49-11 i AE3-20. Ni jedno od ovih antitela, međutim, nije specifično samo za CLDN6, kao što je prikazano rezultatima FACS analiza u Primeru 5. Antitela AE3-20, unaksno reaguju sa CLDN9, dok antitela AE1-16 i AE49-11 ispoljavaju značajno visoku reaktivnost prema CLDN9, a reaguju takođe i sa CLDN4. Vezivanje antitela AB3-1 za CLDN6 jednako je snažno kao i njegovo vezivanje za CLDN6. U Primeru 7 opisano je antitelo AE49-11, koje kada se primeni u mišjem modelu tumora, pokazuje tendenciju da inhibira rast tumora i da produži preživljavanje životinja. Međutim, imajući u vidu nespecifičnost ovih antitela, ostalo je nejasno da li su opisani efekti uslovljeni vezivanjem antitela za CLDN6.

[0007] Do sada nisu opisana antitiela specifična za CLDN6, koja ispoljavaju osobinu selektivnog vezivanja za membranu ćelije koja eksprimira CLDN6. Međutim, takvo specifično antitelo neophodno je za razvijanje terapije zasnovane antitelu usmerenom protiv CLDN6.

[0008] Poravnanje sekvenci proteina CLDN3, CLDN4, CLDN6 i CLDN9 prikazane na Slici 1, ilustruju postojanje visokog stepena konzerviranosti sekvence između CLDN6 i ostalih članova porodice klaudinskih proteina. Ovako visoka homologija CLDN6 sa ostalim klaudinima, naročito sa CLDN9 i CLDN4, kao i činjenica da WO 2009/087979 nije uspela da obezbedi CLDN6-specifična antitela ukazuju da možda nije moguće proizvesti antitela koje se specifično i selektivno vezuju za CLDN6.

REZIME PRONALASKA

[0009] Eksperimentalni rezultati opisani ovde potvrđuju da se CLDN6 eksprimira u različitim tipovima humanih kancerskih ćelija, dok je ekspresija u normalnim tkivima ograničena samo na posteljicu.

[0010] Predmetni pronalazak dalje opisuje uspešnu proizvodnju CLDN6-specifičnih antitela, sposobnih da se vežu za membranu intaktnih ćelija koje eksprimiraju CLDN6. Rezultati FACS analize na intaktnim ćelijama pokazali su da se anti-CLDN6 antitela specifično vezuju samo za ćelije koje eksprimiraju CLDN6, a ne vezuju se za ćelije koje eksprimiraju druge klaudine, specifično, CLDN3, CLDN4 i CLDN9, ili ćelije koje ne eksprimiraju ni jedan od ovih CLDN proteina. Stoga, predmetni pronalazak neočekivano pokazuje da je moguće proizvesti antitela koje specifično razvijaju reakciju antigen-antitelo sa CLDN6 na membrani ćelija koje eksprimiraju CLDN6, ali ne proizvodi značajnu reakciju antigen-antitelo sa drugim visoko homologim klaudinima.

[0011] Predmetni pronalazak generalno obezbeđuje antitela korisna kao terapeutici za tretiranje i/ili prevenciji bolesti koje su povezane sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN6 i koje se karakterišu ekspresijom CLDN6 na svojoj membrani, uključujući tumorske bolesti, naročito kancer, kao što je kancer jajnika, naročito ovarijalni adenokarcinom i ovarijalni teratokarcinom, kancer pluća, uključujući sitnoćelijski kancer pluća (SCLC) i ne-sitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), naročito karcinom skvamoznih ćelija pluća i adenokarcinom, kancer želuca, kancer dojke, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, naročito, kancer bazalnih ćelija i kancer skvamoznih ćelija, maligni melanom, kancer glave i vrata, naročito, maligni plejomorfni adenom, sarkom, naročito, sinovijalni sarkom i karcinosarkom, kancer kanala žučne kese, kancer mokraćne bešike, naročito, karcinom prelaznih ćelija i papilarni karcinom, kancer bubrega, naročito karcinom bubrežnih ćelija, uključujući svetloćelijski karcinom bubrega i papilarni karcinom bubrega, kancer debelog creva, kancer tankog creva, uključujući kancer ileuma, naročito adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, testikularni embrionalni karcinom, placentalni horiokarcinom, karcinom grlića materice, kancer testisa, naročio testikularni seminom, testikularni teratom i embrionalni testikularni kancer, kancer materice, tumor germinativnih ćelija, kao što su teratokarcinomi ili embrionalni karcinom, naročito, tumor germinativnih ćelija testisa, kao i njihove metastatske tumore.

[0012] U jednom aspektu pronalazak se odnosi na antitelo koje je sposobno da se veže za CLDN6 povezan sa površinom ćelije koja eksprimira CLDN6 i nije sposobno da se detektabilno veže za CLDN9 povezan sa površinom ćelije koja eksprimira CLDN9, pri čemu je vezovanje antitela za CLDN6 i CLDN9 određeno pomoću protočno citometrijske analize kao vezivanje antitela za CLDN6 i CLDN9 eksprimirane na površini intaktinih ćelija, gde antitelo sadrži težak lanac antitela i lak lanac antitela, pri čemu težak lanac antitela sadrži najmanje jednu od CDR sekvenci od sekvenci SEQ ID NO: 36 teškog lanca antitela i laki lanac antitela sadrži najmanje jednu od CDR sekvenci sekvence lakog lanca antitela izabrane od SEQ ID NOs: 35, 54 i 55. Poželjno, antitelo nije sposobno da se detektabilno vezuje za CLDN4 povezan sa površinom ćelije koja eksprimira CLDN4 i/ili nije sposobno da se detektabilno vezuje za CLDN3 povezan sa površinom ćelije koja eksprimira CLDN3, pšri čemu vezivanje antitela za CLDN4 i CLDN3 je određeno pomoću protočno citometrijske analize kao vezivanje antitela za CLDN4 i CLDN3 eksprimiranih na površini intaktnih ćelija. Najpoželjnije, antitelo nije značajno sposobno da se vezuje za CLDN protein osim CLDN6 povezan sa povšinom ćelije koja eksprimira navedeni CLDN protein i sprecifičan je za CLDN6. Poželjno, navedena ćelija koja eksprimira navedeni CLDN protein je intaktna ćelija, naročito ne-permeabilizovana ćelija, i navedeni CLDN protein povezan sa površinom ćelije ima nativnu, tj. ne-denaturisanu, konformaciju. Poželjno, antitelo je sposobno da se vezuje za jedan ili više epitopa CLDN6 u njihovoj nativnoj konformaciji.

Pronalazak se odnosi na antitelo sposobno da se veže za CLDN6, poželjno CLDN6 povezan sa površinom ćelije koja eksprimira CLDN6 i sposobno je da razlikuje CLDN6 na površini ćelije koja eksprimira CLDN6 i CLDN6 mutanta na površini ćelije koja eksprimira pomenuti CLDN6 mutant, gde pomenuti CLDN6 mutant sadrži mutaciju alalnina na položaju 35, 37 ili 39 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 2 ili SEQ ID NO: 8, i gde antitelo sadrži težak lanac antitela koji sadrži CDR3sekvencu teškog lanca antitela izabranu iz grupe koja se sastoji od ARDYGYVLDY identifikovane unutar SEQ ID NO: 34, ARDYGFVLDY identifikovane unutar SEQ ID NO: 36, ARDFGYVLDY identifikovane unutar SEQ ID NO: 38 i ARDYGYVFDY identifikovane unutar SEQ ID NO: 40. Poželjno, antitelo nema sposobnost da se veže za CLDN9 na membrani ćelije koja eksprimira CLDN9. Poželjno, antitelo nema sposobnost da se veže za CLDN4 na membrani ćelije koja eksprimira CLDN4 i/ili nije u značajnoj meri sposobno da se veže za CLDN3 na membrani ćelije koja eksprimira CLDN3. Najpoželjnije, ovo antitelo nema značajnu sposobnost da se veže ni za jedan drugi CLDN protein, osim za CLDN6 na membrani ćelije koja eksprimira CLDN6. Poželjno, pomenuta ćelija koja eksprimira pomenuti CLDN protein je intaktna ćelija, tj., nije permeabilizovana ćelija, i pomenuti CLDN protein ekspimiran na membrani ćelije nalazi se u svojoj nativnoj, tj., nedenaturisanoj konformaciji. Poželjno, antitelo je sposobno da se veže za jedan ili više različitih epitopa na CLDN6 u njihovoj nativnoj konformaciji.

[0013] U jednom primeru izvođenja, antitelo je sposobno da se veže za epitop lociran u ekstracelularnom domenu CLDN6 proteina, naznačeno time da vanćelijski domen CLDN6 poželjno sadrži jednu od nekoliko sledećih aminokiselinskih sekvenci: SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 15, poželjno aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6 ili SEQ ID NO: 7, još poželjnije aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6. Poželjno, antitelo je sposobno da se veže za epitop lociran unutar bilo koje od sledećih sekvenci SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 15, poželjno unutar sekvenci SEQ ID NO: 6 ili SEQ ID NO: 7.

[0014] U jednom primeru izvođenja, antitelo je sposobno da se veže za CLDN6, uspostavljanjem interakcije sa najmanje jednim, poželjno 2, 3, 4 ili 5, poželjno sa svim aminokiselinama izabranim iz grupe koju čine, Thr33, Phe35, Gly37, Ser39, Ile40 i Leu151, poželjno, ostvarivanjem interakcije sa najmanje jednom, a poželjno sa više aminokiselina izabranih iz grupe koju sačinjavaju Thr33, Phe35, Gly37, Ser39 i Ile40, još poželjnije, ostvarivanjem interakcije sa najmanje jednom, a poželjno sa više aminokiselina i najpoželjnije sa svim aminokiselinama izabranim iz grupe Phe35, Gly37, Ser39 i Ile40 ili grupe koju čine Thr33, Phe35, Gly37 i Ser39, i naročito, ostvarivanjem interakcije sa najmanje jednom, a poželjno i više i najpoželjnije sa svim aminokiselinama izabranim iz grupe koju čine Phe35, Gly37 i Ser39. Poželjno, antitelo ne ostvaruje interakcije sa jednom ili više, poželjno ni sa jednom aminokiselinom iz grupe koju sačinjavaju Glu154, Ala155, Arg158 i Gly161, i poželjno ne stupa u interakciju sa jednom ili više, poželjno ni sa jednom aminokiselinom iz grupe koju čine Arg158 i Gly161.

[0015] Interakcija između ovog antitela i CLDN6, posebno u njegovoj nativnoj konformaciji može se analizirati alanin-skenirajućom mutagenezom aminokiselina. Ovim se može proceniti sposobnost mutiranih formi CLDN6 da za sebe vežu specifična monoklonska antitela. Poremećeno vezivanje specifičnog monoklonskog antitela za mutirani CLDN6 ukazuje da je mutirana aminokiselina važna za uspostavljanje kontakta. Vezivanje se može analizirati primenom protočne citometrije.

[0016] U jednom primeru izvođenja, antitelo se može dobiti postupkom koji se sastoji od faze imunizacije životinje peptidom koji ima aminokiselinsku sekvencu bilo koje od SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 15, poželjno, aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 6 ili SEQ ID NO: 7 ili nekog imunološki ekvivalentnog peptida ili nukleinske kiseline ili ćelije domaćina koja eksprimira pomenuti peptid.

[0017] U drugim primerima izvođenja, CLDN6 za koje se vezuje antitelo, poseduje aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2 ili aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8. Naročito je poželjno da je antitelo sposobno da veže CLDN6 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 2 ili za CLDN6 sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 8.

[0018] U jednom primeru izvođenja, antitelo opisano ovde ima težak lanac antitela koje sadrži najmanje jednu, poželjno dve, još poželjnije sve tri CDR sekvence teškog lanca izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 34, 36, 38 i 40, ili njihovih varijanti. CDR sekvence su uokvirene u prethodno pomenutim sekvencama teškog lanca antitela na Slici 25.

[0019] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema opisu sadrži težak lanac koji sadrži CDR3 sekvencu Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, naznačenu time da je Xaa1 bilo koja aminokiselina, poželjno aromatična aminokiselina, još poželjnije Phe ili Tyr, najpoželjnije Tyr, dok je Xaa2 bilo koja aminokiselina, pre svega aromatična aminokiselina, poželjnije Phe ili Tyr, najpoželjnije Tyr, dok je Xaa3 bilo koja aminokiselina, poželjno Leu ili Phe, još poželjnije Leu. U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži težak lanac sa CDR3 sekvencom Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 ili Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, naznačenom time da Xaa1, Xaa2 i Xaa3 imaju značenje koje je ranije opisano. U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži težak lanac sa CDR3 sekvencom Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, naznačenom time što Xaa1, Xaa2 i Xaa3 imaju značenje koje je prethodno opisano. U jednom primeru izvođenja antitelo sadrži težak lanac sa CDR3 sekvencom Ala Arg Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp Tyr, naznačenom time što Xaa1, Xaa2 i Xaa3 imaju značenje kao što je ranije opisano. U jednom primeru izvođenja, antitelo prema otkriću sadrži težak lanac sa CDR1 sekvencom SEQ ID NO: 47 ili njenu varijantu i/ili sadrži CDR2 sekvencu SEQ ID NO: 48 ili njenu varijantu.

[0020] U jednom primeru izvođenja, antitelo saglasno predmetnom pronalasku sadrži težak lanac sa sekvencom izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 34, 36, 38 i 40 ili njihovu varijantu.

[0021] U jednom primeru izvođenja, pronalazak opisuje antitelo koje sadrži laki lanac antitela najmanje jednom, poželjno dve, još poželjnije sa sve tri CDR sekvence lakog lanca antitela, pri čemu su sekvence izabrane iz grupe koju čine SEQ ID NO: 35, 37, 39 i 41 ili njihove varijante. CDR sekvence su uokvirene u prethodno pomenutim sekvencama lakog lanca antitela datim na Slici 26.

[0022] U jednom primeru izvođenja, opis daje antitelo koje sadrži laki lanac antitela sa CDR3 sekvencom Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro, naznačenom time da Xaa1 označava bilo koju aminokiselinu, poželjno Ser ili Asn, najpoželjnije Ser, Xaa2 predstavlja bilo koju aminokiselinu, poželjno Tyr, Ser, Ile, Asn ili Thr, poželjnije Tyr, Ser, ili Asn, najpoželjnije Asn, dok je Xaa3 bilo koja aminokiselina, poželjno, Ser ili Tyr, poželjnije Tyr. U jednom primeru izvođenja, antitelo prema otkriću poseduje laki lanac sa CDR3 sekvencom Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro, naznačenom time da Xaa1, Xaa2 i Xaa3 imaju značenje koje je prethodno opisano. U jednom primeru izvođenja, antitelo prema otkriću sadrži laki lanac sa CDR3 sekvencom Gln Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro Trp Thr, naznačenom time da Xaa1, Xaa2 i Xaa3 imaju značenje kao što je prethodno opisano. U jednom primeru izvođenja, antitelo saglasno gore navedenim primerima izvođenja, sadrži laki lanac antitela sa CDR1 sekvencom saglasno SEQ ID NO: 52 ili njenu varijantu i/ili CDR2 sekvencu saglasno SEQ ID NO: 53 ili njenu varijantu.

[0023] U jednom primeru izvođenja, antitelo saglasno predmetnom pronalasku, sadrži laki lanac sa sekvencom lakog lanaca antitela izabranom iz grupe koju čine SEQ ID NO: 35, 37, 39, 41, 54 i 55 ili njihove varijante.

[0024] U različitim primerima izvođenja, antitelo sadrži teški lanac antitela, kao što je prethodno opisano i laki lanac antitela, kao što je prethodno opisano.

[0025] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži:

(i) težak lanac sa najmanje jednom, poželjno dve, najpoželjnije sve tri CDR sekvence teškog lanca antitela, sekvence SEQ ID NO: x, ili njenu varijantu, i

(ii) laki lanac antitela, sa najmanje jednom, poželjno dve, najpoželjnije sve tri CDR sekvence lakog lanca antitela, SEQ ID NO: x+1, ili njenu varijantu;

naznačeno time što je x izabrano iz grupe koju čine SEQ ID NO: 34, 36, 38 i 40.

CDR sekvence su uokvirene u prethodno pomenutim sekvencama teškog lanca antitela i sekvencama lakog lanca antitela, respektivno, date su na Slikama 25 i 26, respektivno.

[0026] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži:

(i) težak lanac antitela sa CDR3 sekvencom izabranom iz grupe koju čine Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3, Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp, i Ala Arg Asp Xaa1 Gly Xaa2 Val Xaa3 Asp Tyr, naznačeno time što je Xaa1 bilo koja aminokiselina, poželjno aromatična aminokiselina, još poželjnije Phe ili Tyr, najpoželjnije Tyr; Xaa2 je bilo koja aminokiselina, poželjno aromatična aminokiselina, poželjnije Phe ili Tyr, najpoželjnije Tyr, dok je Xaa3 bilo koja aminokiselina, poželjno Leu ili Phe, još poželjnije Leu, i (ii) laki lanac antitela sa CDR3 sekvencom izabranom iz grupe koju čine Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro, Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro, Gln Gln Arg Xaa1 Xaa2 Xaa3 Pro Pro Trp Thr, naznačeno time da je Xaa1 bilo koja aminokiselina, poželjno Ser ili Asn, najpoželjnije Ser; Xaa2 je bilo koja aminokiselina, poželjno Tyr, Ser, Ile, Asn ili Thr, poželjnije Tyr, Ser, ili Asn, najpoželjnije Asn, dok je Xaa3 bilo koja aminokiselina, poželjno Ser ili Tyr, poželjnije Tyr.

[0027] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema prethodnim primerima izvođenja sadrži (i) težak lanac koji sadrži CDR1 sekvencu prema SEQ ID NO: 47 ili njenu varijantu i/ili CDR2 sekvencu prema SEQ ID NO: 48 ili njenu varijantu i/ili (ii) laki lanac koji sadrži CDR1 sekvencu, saglasno SEQ ID NO: 52 ili njenu varijantu i/ili CDR2 prema SEQ ID NO: 53 ili njenu varijantu.

[0028] U jednom primeru izvođenja, antitelo sadrži:

(i) težak lanac antitela koji sadrži sekvencu teškog lanca antitela izabranu od SEQ ID NOs: 34, 36, 38 i 40 ili njenu varijantu, poželjno SEQ ID NO: 36 ili njenu varijantu, i

(ii) laki lanac antitela koji sadrži sekvencu lakog lanca antitela izabranu od SEQ ID NOs: 35, 37, 39, 41, 54 i 55 ili njenu varijantu, poželjno SEQ ID NO: 35 ili njenu vartijantu.

[0029] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku sadrži:

(i) težak lanac antitela koji sadrži sekvencu teškog lanca antitela od SEQ ID NO: 36 ili njenu vartijantu, i

(ii) laki lanac antitela koji sadrži sekvencu lakog lanca antitela izabranu od SEQ ID NOs: 35, 54 i 55

ili njenu vartijantu.

[0030] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku sadrži:

(ii) laki lanac antitela koji sadrži sekvencu lakog lanca antitela izabranu od SEQ ID NOs: 54 i 55 ili njenu varijantu.

[0031] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku sadrži:

(ii) laki lanac antitela koji sadrži sekvencu lakog lanca antitela od SEQ ID NO: 35 ili njenu vartijantu.

[0032] U jednom primeru izvođenja, otkriveno je antitelo, koje sadrži:

(i) težak lanac antitela koji sadrži sekvencu teškog lanca antitela od SEQ ID NO: x ili njenu vartijantu, i

(ii) laki lanac antitela koji sadrži sekvencu lakog lanca antitela od SEQ ID NO: x+1 ili njenu vartijantu;

gde je x izabran od 34, 36, 38 i 40.

[0033] U poželjnim primerima izvođenja, otkriveno je antitelo, koje sadrži težak lanac antitela koji sadrži konstantni region gama-1 teškog lanca, poželjno humani konstantni region gama-1teškog lanca kao što je sekvenca kao što je navedena u SEQ ID NO: 25 i/ili sadrži laki lanac antitela koji sadrži konstantni region kapa lakog lanca, poželjno konstantni region humanog kapa lakog lanca kao što je sekvenca kao što je navedena u SEQ ID NO: 27.

[0034] U poželjnim primerima izvođenja, antitelo ispoljava jednu ili više sledećih aktivnosti: (i) ubija ćelije koje eksprimiraju CLDN6, (ii) inhibira proliferaciju ćelija koje eksprimiraju CLDN6, (iii) inhibira formiranje kolonije ćelija koje eksprimiraju CLDN6, (iv) posreduje u remisiji, na primer, smanjenju veličine, poželjno potpunoj remisiji, odnosno, nestanku uspostavljenih tumora, (v) sprečava formiranje ili ponovno formiranje tumora, i (vi) inhibira metastazu ćelija koje eksprimiraju CLDN6. U skladu sa tim , antitelo se može koristiti u jednoj ili više aktivnosti, pogotovu kada se primenjuje kod pacijenata. Svojstvo ubijanja ćelija i/ili inhibicije jedne ili više aktivnosti ćelija može se iskoristiti kao terapeutsko sredstvo. Naročito, ubijanje ćelija, inhibicija proliferacije ćelija i/ili inhibicija formiranja kolonija ćelija može se primeniti u tretiranju ili prevenciji kancera, uključujući metastaze kancera. Poželjno je antitelo prema pronalasku posreduje u ubijanju ćelija indukcijom lize posredovane citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC), lize posredovane citotoksičnošću zavisnom od antitela (ADCC), apoptoze, homotipske adhezije, i/ili fagocitoze, poželjno indukovanjem CDC posredovane lize ćelija i/ili ADCC posredovane lize. Međutim, predmetni pronalazak takođe obuhvata oblike izvođenja u kojima antitelo ispoljava svoju aktivnost kao što je citotoksična aktivnost i/ili inhibicija jedne ili više aktivnosti ćelija, kao što su na primer, proliferacija ćelija i/ili formiranje kolonija, bez izazivanja lize posredovane citotoksičnošću zavisnom od komplementa (CDC), lize posredovane citotoksičnošću zavisnom od komplementa antitela (ADCC), apoptoze, homotipske adhezije, i/ili fagocitoze. Na primer, antitelo prema pronalasku može da ispolji efekat običnim vezivanjem za CLDN6 na ćelijskoj površini, blokirajući tako proliferaciju tih ćelija. U jednom primeru izvođenja antitelo prema pronalasku ne izaziva CDC-posredovanu lizu ćelija.

[0035] Poželjno je da se ADCC-posredovana liza ćelija odvija u prisustvu efektorskih ćelija, koje su u nekim primerima izvođenja izabrane iz grupe koji čine monocite, mononuklearne ćelije, NK ćelije i PMN, a fagocitozu izvode makrofagi.

[0036] Stepen inhibiranja ili smajenja proliferacije ćelija koje eksprimiraju CLDN6, poželjno, kancerskih ćelija, može se izmeriti in vitro, određivanjem proliferacije kancerskih ćelija koje eksprimiraju CLDN6, u testu sa bromodezoksiuridinom (5-bromo-2-dezoksiuridin, BrdU). BrdU je sintetički analog nukleozida timidina i može se ugraditi u novosintetisanu DNK ćelija koje se dele (tokom S faze ćelijskog ciklusa), ugrađujući se u DNK tokom replikacije, umesto timidina. Detekcija količine ugrađenog BrdU primenom specifičnih antitela na BrdU, ukazuje na ćelije u kojima se odvija replikacija DNK, a to su ćelije koje se dele.

[0037] Stepen inhibicije ili smanjenja sposobnosti formiranja kolonija ćelija koje eksprimiraju CLDN6, poželjno kancerskih ćelija, može se proceniti in vitro, primenom klonogenog testa. Klonogeni test je mikrobiološki test za ispitivanje uticaja specifičnih agenasa na preživljavanje i proliferaciju ćelija. Ovaj test se često koristi u laboratorijama koje se bave istraživanjem kancera, u testovima ispitivanja efekata lekova ili uticaja radijacije na proliferaciju tumorskih ćelija. Eksperiment obuhvata tri osnovna koraka: (i) primena tretmana na uzorku ćelija, poželjno kancerskih ćelija, (ii) zasejavanje ćelija u posude za ćelijsku kulturu i (iii) obezbeđivanje uslova za rast ćelija. Tako dobijene ćelijske kolonije se fiksiraju, boje i broje. Sposobnost formiranja kolonija značajna je za nastanak metastaza, kada pojedinačne tumorske ćelije kolonizuju organe. Inhibitorna aktivnost antitela ukazuje na njihov potencijal da suzbiju formiranje metastaza. Antitela koja ispoljavaju sposobnost da inhibiraju ili umanje formiranje kolonija u klonogenom testu posebno su poželjna u terapiji ili prevenciji metastaza i širenju metastatskih kancerskih ćelija, naročito onih tipova kancera koji su ovde pomenuti.

[0038] U poželjnim primerima izvođenja, antitelo ispoljava jednu ili više imunskih efektorskih funkcija protiv ćelija koje na svojoj membrani eksprimiraju CLDN6 u njegovoj nativnoj konformaciji, pri čemu je jedna ili više efektorskih funkcija poželjno izabrana iz grupe koju čine komplementom izazvana citiotoksična liza (CDC), citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), indukcija apoptoze i inhibicije proliferacije, poželjno su efektorske funkcije ADCC i/ili CDC.

[0039] Poželjno je da jedna ili više pomenutih imunskih efektorskih aktivnosti pomenutog antitela indukovana vezivanjem pomenutog antitela sa CLDN6, poželjno je usmerena na epitop koji se nalazi u vanćelijskom domenu CLDN6, naznačenom time da vanćelijski domen CLDN6 sadrži jednu od narednih aminokiselinskih sekvenci: SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 15, poželjno aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6 ili SEQ ID NO: 7, još poželjnije aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6.

[0040] Prema pronalasku, poželjno je da ćelije koje eksprimiraju CLDN6 eksprimiraju CLDN6 na svojoj membrani. Poželjno je da je ćelija koja eksprimira CLDN6 ili ćelija koja nosi CLDN6 u njegovoj nativnoj konformaciji tumorska ćelija, kao što je kancerska ćelija, poželjno kancerska ćelija izabrana iz grupe koju čine kancer jajnika, naročito adenokarcinom jajnika i teratokarcinom jajnika, kancer pluća, uključujući sitnoćelijski kancer pluća (SCLC) i ne-sitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), naročito, karcinom skvamoznih ćelija i adenokarcinom, karcinom želuca, karcinom dojke, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, naročito, karcinom bazalnih ćelija i karcinom skvamoznih ćelija, maligni melanom, kancer glave i vrata, naročito maligni plejomorfni adenom, sarkom, naročito sinovijalni sarkom i karcinosarkom, kancer kanala žučne kese, kancer mokraćne bešike, naročito karcinom prelaznih ćelija i papilarni karcinom, kancer bubrega, naročito svetloćelijski karcinom bubrega i papilarni karcinom bubrega, kancer debelog creva, kancer tankog creva, uključujući kancer ileuma, naročito adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, testikularni embrionalni karcinom, horiokarcinom posteljice, karcinom grlića materice, kancer testisa, naročito testikularni seminom, testikularni teratom, i embrionalni testikularni kancer, kancer materice, tumor germinativnih ćelija, kao što su teratokarcinomi ili embrionalni karcinom, naročito, tumor germinativnih ćelija testisa, i njihovi metastatski tumori.

[0041] Antitelo saglasno predmetnom pronalasku može se povezati sa jednim ili više terapeutskih efektorskih činilaca, na primer, sa radioobeleživačem, citotoksinom, terapeutskim enzimom, agensom koji indukuje apoptozu, kako bi se, na taj način, obezbedila usmerena citotoksičnost, tj., ubijanje tumorskih ćelija.

[0042] U jednom primeru izvođenja, antitelo prema pronalasku (i) vezuje se za ćelije koje eksprimiraju CLDN6 i koje karakteriše povezanost CLDN6 sa njihovom membranom i (ii) ne vezuje se za ćelije koja ne eksprimiraju CLDN6 i koje ne karakteriše povezanost CLDN6 sa njihovom membranom. Antitelo prema pronalasku poželjno (i) posreduje u ubijanju i/ili inhibiciji proliferacije ćelija koje eksprimiraju CLDN6 na svojoj membrani, ali (ii) ne posreduje u ubijanju i/ili inhibiciji proliferacije ćelija koje ne eksprimiraju CLDN6 i koje nemaju CLDN6 na svojoj membrani.

[0043] U naročito poželjnim primerima izvođenja, antitelo prema pronalasku vezuje se za nativne epitope CLDN6 eksprimiranom na membrani živih ćelija, kao što su epitopi sa sekvencama SEQ ID NO: 6 ili 7. U narednim poželjnim primerima izvođenja, antitelo prema pronalasku specifično se vezuje za kancerske ćelije koje eksprimiraju CLDN6, a ne vezuje se za kancerske ćelije koje ne eksprimiraju CLDN6.

[0044] Antitela saglasno pronalasku mogu se proizvesti u različitim vrstama organizama, uključujući, bez ograničenja, miša, pacova, zeca, zamorca i čoveka. Antitela saglasno predmetnom pronalasku takođe obuhvataju himerne molekule kod kojih se konstantan region antitela dobijen u jednoj vrsti, poželjno kod čoveka, kombinuje sa antigen-vezujućim domenom dobijenim u drugoj vrsti. Štaviše, antitela prema pronalasku obuhvataju humanizovane molekule u kojima se antigen-vezujuće mesto antitela dobijeno u vrsti koja nije čovek, kombinuje sa konstantnim i okvirnim regionima humanog porekla.

[0045] Antitela opisana ovim pronalaskom obuhvataju poliklonska i monoklonska antitela, uključujući IgG2a (na pr. IgG2a, κ, λ), IgG2b (na pr. IgG2b, κ, λ), IgG3 (na pr. IgG3, κ, λ) i IgM antitela. Pronalaskom su obuhvaćeni i drugi izotipovi antitela, uključujući IgG1, IgAl, IgA2, sekretorna IgA, IgD i IgE antitela. Antitela mogu biti celi molekuli ili njihovi antigenvezujući fragmenti, uključujući, na primer, Fab, F(ab’)2, Fv, jednolančane Fv fragmente ili bispecifična antitela. Antigen-vezujući fragmenti obuhvataju vezujuće domene imunoglobilinskih fuzionih proteina, koji sadrže (i) vezujući domen polipeptida (kao što je varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca), spojen sa polipeptidom koji sadrži zglobni region imunoglobulina, (ii) zglobni region CH2 konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa zglobnim regionom (iii) CH3 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa konstantnim CH2 regionom. Ovakvi fuzioni proteini sa vezujućim domenom imunoglobulina opisani su detaljno u US2003/0118592 i US 2003/0133939.

[0046] Antitelo može biti monoklonsko, himerno, humane ili humanizovano antitelo ili fragment antitela. Anititela prema pronalasku mogu biti kompletno humanog porekla. Takva antitela mogu se proizvesti u transgenim životinjama, na primer, u transgenim miševima sposobnim da proizvedu višestruke izotipove humanih monoklonskih antitela specifičnih za CLDN6, posredstvom V-D-J rekombinacije i izotipske izmene. Transgena životinja može biti zec za proizvodnju poliklonskih antitela, kao što je to detalno opisano u US 2003/0017534.

[0047] Poželjno je disocijacija ovde opisanih antitela sa CLDN6 sa ravnotežnom konstantom disocijacije (KD) oko 1 – 100 nM ili manje. Poželjno je da ovde opisana antitela ne reaguju unakrsno sa srodnim membranskim antigenima, pa stoga i ne inhibiraju funkciju tih membranskih antigena.

[0048] U poželjnim primerima izvođenja, antitela prema predmetnom pronalasku poseduju jednu ili više sledećih osobina:

a) specifična su za CLDN6;

b) vezuju se za CLDN6 sa afinitetom od oko 100 nM ili manje, poželjno oko 5-10 nM ili manje, još poželjnije oko 1-3 nM ili manje,

c) sposobna su da indukuju CDC ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i karakterišu se CLDN6 vezanim na svojoj membrani;

d) sposobna su da inhibiraju rast ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i karakterišu se CLDN6 vezanim na svojoj membrani;

e) sposobna su da indukuje apoptozu ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i karakterišu se CLDN6 vezanim na svojoj membrani;

f) sposobna su da indukuju homotipsku adheziju ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i karakterišu se CLDN6 vezanim na svojoj membrani;

g) sposobna su da u prisustvu efektorskih ćelija indukuju ADCC ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i karakterišu se CLDN6 vezanim na svojoj membrani;

h) sposobna su da produže vreme preživljavanja subjekta sa tumorskim ćelijama koje eksprimiraju CLDN6 i karakterišu se CLDN6 vezanim na svojoj membrani;

i) sposobna su da smanje broj ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i karakterišu se CLDN6 vezanim na svojoj membrani;

j) sposobna su da stvaraju agregate CLDN6 na površini živih ćelija.

[0049] Poželjno antitelo opisano ovde je antitelo proizvedeno ili koje se može proizvesti u hibridoma ćelijama deponovanim u DSMZ (Inhoffenstr.7B, 38124 Braunschweig, Germany), sa narednim oznakama i pristupnim brojevima:

1. GT512muMAB 59A, pristupni broj DSM ACC3067, deponavano 21. juna 2010; 2. GT512muMAB 60A, pristupni broj DSM ACC3068, deponavano 21. juna 2010; 3. GT512muMAB 61D, pristupni broj DSM ACC3069, deponavano 21. juna 2010; 4. GT512muMAB 64A, pristupni broj DSM ACC3070, deponavano 21. juna 2010; 5. GT512muMAB 65A, pristupni broj DSM ACC3071, deponavano 21. juna 2010; 6. GT512muMAB 66B, pristupni broj DSM ACC3072, deponavano 21. juna 2010; 7. GT512muMAB 67A, pristupni broj DSM ACC3073. deponavano 21. juna 2010; 8. GT512muMAB 55A, pristupni broj DSM ACC3089, deponavano 31.08.2010; ili 9. GT512muMAB 89A, pristupni broj DSM ACC3090, deponavano 31.08.2010.

[0050] Antitela predmetnog pronalaska nose oznaku antitela i/ili klona u kojem su antitela proizvedena, na primer, muMAB 59A.

[0051] Poželjna antitela su i ona koja poseduju specifičnost antitela proizvedenih ili koja se mogu proizvesti u prethodno opisanim hibridomima, naročito, ona koja obuhvataju antigenvezujući deo ili antigen-vezujuće mesto, naročito varijabilni region, identičan ili homolog istom regionu antitela proizvedenih ili koja se mogu proizvesti u prethodno opisanim hibridomima. Smatra se da su poželjna antitela ona antitela koja poseduju CDR regione, identične ili visoko homologe regionima antitela proizvedenim ili koja se mogu proizvesti u prethodno opisanim hibridomima. Pod “visoko homologim” podrazumeva se da svaki CDR region sadrži 1 do 5, poželjno 1 do 4, na primer, 1 do 3 ili 1 ili 2 supstitucije. Naročito je poželjno da su antitela himerne ili humanizovane forme antitela proizvedenih ili koja se mogu proizvesti u prethodno opisanim hibridomima.

[0052] Shodno tome, antitelo saglasno otkriću mogu se izabrati iz grupe koja se sastoji od sledećih (i) antitelo proizvedeno ili koje se može proizvesti iz klonova sa pristupnim brojevima DSM ACC3067 (GT512muMAB 59A), DSM ACC3068 (GT512muMAB 60A), DSM ACC3069 (GT512muMAB 61D), DSM ACC3070 (GT512muMAB 64A), DSM ACC3071 (GT512muMAB 65A), DSM ACC3072 (GT512muMAB 66B), DSM ACC3073 (GT512muMAB 67A), DSM ACC3089 (GT512muMAB 55A) ili DSM ACC3090 (GT512muMAB 89A), (ii) antitelo koje predstavlja himernu ili humanizovanu formu antitela navedenog pod (i), (iii) antitelo koje ima specifičnost antitela pod (i) i (iv) antitelo koje sadrži antigen-vezujući deo ili antigen-vezujuće mesto antitela pod (i). Antigen vezujući deo ili antigen vezujuće mesto antitela pod (i) može sadržati varijabilni region antitela pod (i).

[0053] Predmetni opis takođe se odnosi na ćeliju kao što je hibridoma ćelija koja proizvodi ovde opisano antitelo.

[0054] Poželjne hibrodoma ćelije su one koje su deponovane u DSMZ (Inhoffenstr. 7B, 38124 Braunschweig, Germany) pod sledećim oznakama i pristupnim brojevima:

1. GT512muMAB 59A, pristupni broj DSM ACC3067, deponavano 21. juna 2010;

2. GT512muMAB 60A, pristupni broj DSM ACC3068, deponavano 21. juna 2010;

3. GT512muMAB 61D, pristupni broj DSM ACC3069, deponavano 21. juna 2010;

4. GT512muMAB 64A, pristupni broj DSM ACC3070, deponavano 21. juna 2010;

5. GT512muMAB 65A, pristupni broj DSM ACC3071, deponavano 21. juna 2010;

6. GT512muMAB 66B, pristupni broj DSM ACC3072, deponavano 21. juna 2010;

7. GT512muMAB 67A, pristupni broj DSM ACC3073. deponavano 21. juna 2010;

8. GT512muMAB 55A, pristupni broj DSM ACC3089, deponavano 31. avgusta 2010; ili 9. GT512muMAB 89A, pristupni broj DSM ACC3090, deponavano 31. avgusta 2010.

[0055] Anti-CLDN6 antitela prema predmetnom opisu mogu se derivatizovati, vezati za ili ko-eksprimirati sa domenima sa drugačijim specifičnim vezivanjem. U naročitom primeru izvođenja, otkriće obezbeđuje bispecifične ili multispecifične molekule koji imaju prvu sposobnost da se specifično vežu za CLDN6 (na primer, neko anti-CLDN6 antitelo ili njegov mimetik), i drugu sposobnost specifičnog vezivanja za efektorsku ćeliju, kao što je specifično vezivanje za Fc receptor (na primer, Fc-γ receptor, kao što je Fc-γ RI ili bilo koji drugi Fc receptor) ili za receptor na T ćeliji, na primer, za CD3 receptor.

[0056] Saglasno tome, predmetne tehnike obuhvataju bispecifične ili multispecifične molekule koji se vezuju kako za CLDN6, tako i za Fc receptor ili za receptor na T ćeliji, na primer, za CD3. Primeri Fc receptora su IgG receptor, Fc-γ receptor (FcγR), kao što je FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) i FcγRIII (CD 16). Ciljne strukture mogu biti i drugi Fc receptori, kao što su IgA receptori (na primer, FcαRI). Poželjno je da se ovaj Fc receptor nalazi na membrani efektorske ćelije, na primer, na membrani monocita, makrofaga ili neke aktivirane mononuklearne ćelije. U poželjnom primeru izvođenja, bispecifični i multispecifični molekuli vezuju se za Fc receptor na mestu drugačijem od vezujućeg mesta Fc imunoglobulina (na primer, IgG ili IgA) na tom receptoru Na taj način vezivanje bispecifičnih ili multispecifičnih molekula nije blokirano fiziološkim nivoima imunoglobulina.

[0057] U sledećem aspektu, anti-CLDN6 antitela predmetnog pronalaska su derivatizovana, vezana ili ko-eksprimiraju sa drugim funkcionalnim molekulom, na primer, sa drugim peptidom ili proteinom (npr., sa Fab’ fragmentom). Na primer, antitelo prema pronalasku može se funkcionalno povezati (npr., hemijskom vezom, genetičkom fuzijom, nekovalentnom vezom ili na drugi način) sa jednim ili više molekulskih entiteta, kao što su na primer, druga antitela (kako bi se dobilo bispecifično ili multispecifično antitelo), citotoksini, ćelijski ligandi ili antigeni (kako bi se dobio imunokonjugat, kao što je imunotoksin). Antitelo prema predmetnom opisu može se povezati sa drugim terapeutskim činiocima, npr., sa radioizotopima, malim molekulima, antikancerskim lekovima, rekombinantnim citokinima ili hemokinima. Saglasno tome, predmetni pronalazak obuhvata veoma raznovrsne konjugate antitela, bispecifične i multispecifične molekule, kao i fuzione proteine, pri čemu svi imaju sposobnost da se vežu za ćelije koje eksprimiraju CLDN6 i/ili za ćelije koje karakteriše CLDN6 asociran sa njihovom ćelijskom membranom, i koji se mogu koristiti kao ciljna mesta meta delovanja drugih molekula.

[0058] Uopšteno govoreći, u značenju koje je ovde primenjeno, termin “antitelo” obuhvata sve derivate antitela, kao što su konjugati antitela, bispecifični i multispecifični molekuli i fuzioni proteini koji su ovde opisani.

[0059] U narednom aspektu, pronalazak takođe predviđa CLDN6-vezujuće proteine dobijene od ne-imunoglobilinskih domena proteina, što se posebno odnosi na jednolančane proteine. Takvi vezujući proteini i postupci njihovog dobijanja opisani su, na primer, u Binz i sar (2005) Nature Biotechnology 23 (10): 1257-1268. Pronalazak obuhvata imunoglobuline i derivate imunoglobulinskih molekula, kao i vezujuće molekule dobijene od neimunoglobulinskih domena. Naročito, vezujući molekuli dobijeni od ne-imunoglobulinskih domena mogu blokirati CDLN6 na ćelijama koje eksprimiraju te molekule i koje karakterišu ti molekuli vezani na ćelijskoj membrani, i tako dovesti do terapeutskog efekta koji je predviđen pronalaskom, naročito može doći do inhibicije jedne ili više aktivnosti tumorskih ćelija, kao što je već pomenuta proliferacija. Iako nije obavezno, ovakvim neimunoglobulinskim vezujućim molekulima moguće je dodeliti efektorske funckije antitela, na primer, fuzijom Fc regiona antitela.

[0060] Predmetno otkriće obuhvata tretman i/ili dijagnostifikovanje bolesti, naročito tumorskih bolesti, usmerenim delovanjem na CLDN6 koji se eksprimira na ćelijama i koji je asociran sa njihovom membranom. Ovi postupci obezbeđuju selektivnu detekciju i/ili eradikaciju ćelija koje eksprimiraju CLDN6, čime se minimalizuju neželjeni uticaji na normalne ćelije koje ne eksprimiraju CLDN6 i koje ne karakteriše CLDN6 vezan na njihovoj membrani. Bolesti koje je ovako moguće tretirati ili dijagnostifikovati su bolesti u kojima ćelije eksprimiraju CLDN6 i odlikuju se asocijacijom CLDN6 sa ćelijskoj membrani, kao što su bolesti koje su prethodno pomenute.

[0061] Jedan aspekt pronalaska obezbeđuje kompozicije, na primer, farmaceutske ili dijagnostičke kompozicije/komplete, koji sadrže antitelo ili kombinaciju antitela predmetnog pronalaska. Farmaceutska smeša predmetnog pronalska može da sadrži prihvatljivi nosač i može izborno da sadrži jedan ili više adjuvanasa, stabilizatora i drugih sastojaka. U naročitom primeru izvođenja, kompozicija obuhvata kombinaciju antitela koja se vezuju za specifične epitope ili koja poseduju specifične funkcionalne karakteristike, kao što je indukcija CDC i/ili ADCC i indukcija apoptoze. U ovom primeru izvođenja pronalaska, antitela se mogu primeniti u kombinaciji, na primer kao farmaceutska kompozicija koja sadrži dva ili više anti-CLDN6 monoklonskih antitela. Na primer, moguće je u okviru jedne terapije kombinovati anti-CLDN6 antitela sa različitim, ali komplementarnim aktivnostima, kako bi se postigao željeni terapeutski efekat. U jednom poželjnom primeru izvođenja, kompozicija obuhvata anti-CLDN6 antitelo koje izaziva CDC, zajedno sa drugim anti-CLDN6 antitelom koje indukuje apoptozu. U narednom primeru izvođenja, kompozicija sadrži jedno anti-CDLN6 antitelo koje efikasno uništava ciljne ćelije u prisustvu efektorskih ćelija, i drugo anti-CLDN6 antitelo koje inhibira rast ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje karakteriše CLDN6 asociran sa njihovom ćelijskom membranom.

[0062] Predmetni pronalazak takođe obuhvata simultanu ili sekvencijalnu primenu dva ili više anti-CLDN6 antitela pronalaska, naznačena time da je najmanje jedno antitelo himerno anti-CLDN6 antitelo, pri čemu se antitela vezuju za isti ili različite epitope na CLDN6 molekulu.

Poželjno, prvo se primenjuje himerno CLDN6 antitelo opisano predmetnim pronalaskom, a nakon toga se primenjuje humane anti-CLDN6 antitelo, naznačeno time da se humane anti-CLDN6 antitelo primenjuje tokom dužeg vremena, na primer kao terapija održavanja.

[0063] Antitela, konjugati, bispecifični/multispecifični molekuli i kompozicije predmetnog pronalaska mogu se primeniti u postupcima sa ciljem da se inhibira rast ćelija koje eksprimiraju CDLN6 i koje karakterišu CDLN6 vezan na njihovoj ćelijskoj membrani i/ili selektivnim ubijanjem ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje karakteriše CLDN6 asociran sa njihovom ćelijskom membranom, delovanjem efektivne količine antitela, konjugata, bispecifičnih/multispecifičnih molekula ili kompozicija na te ćelije, tako da im se inhibira rast i/ili da se ćelije unište. U jednom primeru izvođenja, postupak obuhvata ubijanje ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje karakteriše CLDN6 asociran sa njihovom ćelijskom membranom, izborno u prisustvu efektornih ćelija, na primer, posredstvom CDC, apoptoze, ADCC, fagocitoze ili kombinovanjem dva ili više navedenih mehanizama. Ćelije koje eksprimiraju CLDN6 i koje karakteriše CLDN6 asociran sa njihovom ćelijskom membranom, a koje se mogu inhibirati ili uništiti primenom antitela, obuhvataju ćelije kancera.

[0064] Antitela, konjugati i bispecifični/multispecifični molekuli i kompozicije predmetnog pronalaska mogu se primeniti u terapiji i/ili prevenciji različitih bolesti koje obuhvataju ćelije koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odliku asocijacijom CLDN6 na svojoj ćelijskoj membrani, administriranjem antitela pacijentima koji pate od ovih bolesti. Bolesti koje se mogu tretirati (na primer, ublažiti) ili prevenirati, obuhvataju, bez ograničenja tumorogene bolesti. Primeri tumorogenih bolesti, koje se mogu tretirati i/ili prevenirati obuhvataju kancerske bolesti, kao što su kancer jajnika, naročito ovarijalni adenokarcinom i ovarijalni teratokarcinom, kancer pluća, uključujući sitnoćelijski kancer pluća (SCLC) i ne-sitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), naročito karcinom skvamoznih ćelija pluća i adenokarcinom, kancer želuca, kancer dojke, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, naročito kancer bazalnih ćelija i kancer skvamoznih ćelija, maligni melanom, kancere glave i vrata, naročito, maligni plejomorfni adenom, sarkom, naročito, sinovijalni sarkom i karcinosarkom, kancer izvodnih kanala žučne kese, kancer mokraćne bešike, naročito, karcinom prelaznih ćelija i papilarni karcinom, kancer bubrega, naročito karcinom bubrežnih ćelija, uključujući svetloćelijski karcinom bubrega i papilarni karcinom bubrega, kancer debelog creva, kancer tankog creva, uključujući kancer ileuma, naročito adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, testikularni embrionalni karcinom, placentalni horiokarcinom, karcinom grlića materice, kancer testisa, naročito testikularni seminom testikularni teratom, i embrionalni testikularni kancer, kancer materice, tumor germinativnih ćelija, kao što su teratokarcinomi ili embrionalni karcinom, naročito, tumor germinativnih ćelija testisa, i njihove metastatski tumori.

[0065] U narednom aspektu otkriće se odnosi na postupak tretiranja ili preveniranja bolesti ili poremećaja koji obuhvataju ćelije koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj ćelijskoj membrani, koji se sastoji od administriranja subjektu antitela, konjugata, bispecifičnog/multispecifičnog molekula ili kompozicije saglasno pronalasku. Bolest ili poremećaj koji se tretira jeste tumorska bolest, a u naročitom primeru izvođenja, bolest je izabrana iz grupe koju sačinjavaju kancer jajnika, naročito ovarijalni adenokarcinom i ovarijani teratokarcinom, kancer pluća, uključujući sitnoćelijski kancer pluća (SCLC) i nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), naročito skvamocelularni karcinom i adenokarcinom, kancer želuca, kancer dojke, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, naročito kancer bazalnih ćelija i skvamoznih ćelija, maligni melanom, kancer glave i vrata, naročito maligni plejomorfni adenom, sarkom, naročito sinovijalni sarkom i karcinosarkom, kancer žučnog kanala, kancer mokraćne bešike, naročito karcinom prelaznih ćelija i papilarni karcinom, kancer bubrega, naročito karcinom bubrežnih ćelija, uključujući svetloćelijski karcinom bubrega i papilarni karcinom bubrega, kancer debelog creva, kancer tankog creva, uključujući kancer ileuma, naročito adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, testikularni embrionalni karcinom, horiokarcinom posteljice, karcinom grlića materice, kancer testisa, naročito testikularni seminom, testikularni teratom, i embrionalni testikularni kancer, kancer materice, tumor germinativnih ćelija, kao što su teratokarcinomi ili embrionalni karcinom, naročito, tumor germinativnih ćelija testisa, i njihove metastatski tumori. Poželjno je da se CLDN6 eksprimira na površini ovih ćelija.

[0066] Pronalazak može da obuhvati primenu agenasa i opisanih kompozicija u profilaktičkom i/ili terapeutskom tretmanu tumorskih bolesti, odnosno, u tretiranju pacijenata sa tumorskom bolešću ili osoba kod kojih postoji povećani rizik od razvoja tumora. U jednom aspektu pronalazak obezbeđuje postupke inhibicije rasta tumora, koji se sastoje od primene jednog ili više agenasa i kompozicija koje su ovim pronalaskom obelodanjene.

[0067] Poželjno, ovde opisani agensi i kompozicije se primenjuju na takav način da se terapeutski aktivne supstance ne primenjuju ili da se suštinski ne primenjuju u tkivo ili organ, koji nisu zahvaćeni tumorom koji eksprimira CLDN6 i koje karakteriše CLDN6 asociran sa njihovom ćelijskom membranom, kao što je tkivo placente ili placenta. Ovo se postiže lokalnom primenom opisanih agenasa i kompozicija.

[0068] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje antitelo za primenu u postupcima tretmana. U jednom primeru izvođenja, pronalazak obezbeđuje opisanu farmaceutsku kompoziciju.

[0069] Subjekat na koji se primenjuje antitelo može dodatno biti tretiran hemoterapeutskim agensom, zračenjem ili agensom koji modulira, na primer, pojačava ili inhibira ekspresiju ili aktivnost Fc receptora, na primer, Fcγ receptora, kao što je receptor citokina. Tipični citokini koji se mogu primeniti tokom tretmana antitelom obuhvataju stimulirajući faktor granulocitne kolonije (G-CSF), stimulirajući faktor granulocitno-makrofagne kolonije (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ) i faktor nekroze tumora (TNF). Tipični terapeutski agensi obuhvataju, između ostalog, anti-neoplastične agense, kao što su doksorubicin, cisplatin, taksoter, 5-fluoruracil, metotreksat, gemzitabin i ciklofosfamid.

[0070] U narednom primeru izvođenja, opis se odnosi na strategiju imunizacije životinja, kao što je miš, humanim CLDN6 ili njegovim peptidnim fragmentom, sa ciljem da se dobiju antitela. Poželjni peptidi za imunizaciju su oni izabrani iz grupe koju čine SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 15 i imunološki ekvivalentni peptidi.

[0071] Divlji tip životinje ili transgena životinja može se imunizovati prečišćenim ili obogaćenim preparatom CLDN6 antigena ili njegovim peptidnim fragmentom i/ili nukleinskim kiselinama i/ili ćelijama koje eksprimiraju CLDN6 ili fragment ovog peptida. Poželjno je da je transgena životinja sposobna da proizvede više izotipova humanih monoklonskih antitela na CLDN6 (na primer, IgG, IgA i/ili IgM), postupkom V-D-J rekombinacije i izotipskog prekidača. Izotipski prekidač može se aktivirati na primer, postupkom klasične ili neklasične izotipske izmene.

[0072] Saglasno tome u narednom aspektu, opisane su izolovane B ćelije dobijene od prethodno opisanih ne-humanih životinjskih vrsta. Izolovane B ćelije mogu se imortalizovati fuzijom sa imortalizovanom ćelijom, kako bi se dobio izvor (na primer, hibridom) antitela predmetnog pronalaska. Takvi hibridomi (tj., koji proizvode antitela prema pronalasku) su takođe uključeni unutar obima pronalaska.

[0073] U narednom primeru izvođenja, opisani su postupci dijagnostifikovanja, detekcije i praćenja tumorske bolesti, naznačeni time da se postupci sastoje od detekcije i/ili određivanja količine CLDN6 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje karakteriše CLDN6 asociran sa njihovom ćelijskom membranom, u biološkom uzorku izolovanom od pacijenta, primenom antitela saglasno pronalasku. Biološki uzorak može se dobiti od pacijenta koji ima tumorsku bolest, kod kojeg se sumnja na tumorsku bolest ili koji potencijalno može imati tumorsku bolest.

[0074] U jednom primeru izvođenja postupka dijagnoze, detekcije ili praćenja tumorske bolesti saglasno opisu, biološki uzorak i/ili kontrolni/referentni uzorak je dobijen iz tkiva ili organa koji odgovaraju tkivu ili organu koji treba da bude dijagnostifikovan, ili kod kojeg treba da bude detektovana ili praćena tumorska bolest, na primer, tumorska bolest koja treba da bude dijagnostifikovana, detektovana ili praćena u ovarijalnom kanceru i u biološkom uzorku i/ili kontrolnom/referentnom uzorku ovarijalnog tkiva. Tkiva i organi opisani su u vezi sa različitim tumorskim bolestima i kancerima.

[0075] U jednom primeru izvođenja postupaka za dijagnozu, detekciju ili praćenje tumorske bolesti, biološki uzorak je dobijen iz tkiva ili organa, naznačeno time da tkivo ili organ nemaju tumor, ne eksprimiraju CLDN6 i koje ne karakteriše značajno vezan CLDN6 na njihovoj ćelijskoj membrani. Takva pogodna tkiva su sva tkiva, osim tkiva posteljice.

[0076] Uobičajeni nivo ciljnog molekula u biološkom uzorku poredi se sa referentnom vrednošću, pri čemu odstupanje od naznačenog referentnog nivoa ukazuje na prisustvo i/ili fazu tumorske bolesti kod ispitanika. Referentni nivo može biti nivo određen u kontrolnom uzorku (na primer zdravog tkiva ili ispitanika) ili može biti prosečni nivo koji se detektuje kod zdravih ispitanika. “Odstupanje” od naznačene srednje vrednosti označava bilo koju značajnu promenu, kao što je na primer, povećanje ili smanjenje od 10 %, 20 % ili 30 %, poželjno najmanje 40 % ili 50 % i više. Poželjno je da prisustvo CLDN6 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje karakteriše CLDN6 asociran sa njihovom ćelijskom membranom u naznačenom biološkom uzorku ili povećana količina CLDN6 ili ćelija koje eksprimiraju CLDN6 na svojoj ćelijskoj površini i koje karakteriše CLDN6 asociran sa njihovom ćelijskom membranom, u odnosu na referentni uzorak ukazuje na prisustvo tumorske bolesti.

[0077] Tipično, detekcija i/ili determinacija količine u postupcima predmetnog otkrića obuhvata primenu obeleženih antitela, koja se specifično vezuju za ciljni molekul.

[0078] U jednom naročitom aspektu, predmetni opis obuhvata postupke detekcije, na primer, određivanja pozicije ili mesta tumorske bolesti, na primer, zahvaćenost naročitog tkiva ili organa tumorom, koje podrazumeva primenu antitela predmetnog pronalaska, koje je spregnuto sa odgovarajućim obeleživačem. Obeležavanje tkiva ili organa pacijenta može da ukaže na prisustvo rizika za razvoj tumorske bolesti u tom tkivu ili organu.

[0079] Kao što je ovde ilustrovano, antitela predmetnog pronalaska mogu se direktno proizvesti u hibdridomima koji eksprimiraju antitela ili se mogu klonirati i rekombinantno eksprimirati u ćeliji domaćinu (na primer, CHO ćeliji ili limfocitu). Ćelija domaćin može biti i ćelija mikroorganizma, kao što je bakterija E.coli i gljiva, kao što je kvasac. Alternativno, antitela se mogu proizvesti rekombinantno u transgenim životinjama ili biljkama. Predmetni pronalazak takođe predviđa oblike izvođenja naznačene time da se antitela proizvode imunizacijom ili vakcinacijom primenom imunizacionih strategija, kao što su ovde opisane in situ u pacijentima.

[0080] Predmetno otkriće takođe se odnosi na nukleinske kiseline koje obuhvataju gene ili sekvence koje kodiraju antitela ili njihove delove, na primer lanac antitela, kao što je opisano. Nukleinska kiselina može biti ugrađena u vektor, na primer, plazmid, kozmid, virus, bakteriofag ili u druge vektore koji se koriste u genetičkom inženjerstvu. Vektor može sadržati i druge gene, kao što su marker geni, koji omogućavaju selekciju vektora u pogodnoj ćeliji domaćinu i pod pogodnim uslovima. Dalje, vektor može sadržati element za kontrolu ekspresije, koji dozvoljava adekvatnu ekspresiju kodirajućih regiona u pogodnom domaćinu. Ovakvi kontrolni elementi poznati su u stanju tehnike i mogu uključiti promotor, kasetu za splajsovanje i inicijacioni kodon translacije.

[0081] Poželjno, naznačena nukleinska kiselina je povezana sa sekvencom za kontrolu ekspresije, koja omogućava ekspresiju u eukariotskoj ili prokariotskoj ćeliji. Kontrolni elementi koji osiguravaju ekspresiju u eukariotskim ili prokariotskim poznati su stručnjacima.

[0082] Postupci konstruisanja nukleinskih kiselina, za konstruisanje vektora koji sadrže pomenute nukleinske kiseline, za uvođenje vektora u izabrane ćelije domaćina, za izazivanje ili postizanje ekspresije, dobro su poznati u stanju tehnike.

[0083] Dodatni aspekt predmetnog otkrića odnosi se na ćeliju domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu ili vektor, kao što je ovde opisano.

[0084] Ostale osobine i prednosti ovog pronalaska biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i zahteva.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0085]

Sl.1. Poravnanje sekvenci CLDN3, CLDN4, CLDN6 i CLDN9.

Sl.2. Imunofluorescentna analiza seruma dobijenih od miševa imunizovanih sa ciljem da se proizvedu CLDN6- specifična antitela.

(A) Nefiksirane CHO-K1 ćelije koje su ko-transfektovane nukleiskim kiselina koje kodiraju humani CLDN6, odnosno GFP, inkubirane su sa anti-CLDN6 monoklonskim antitelom (R&D Systems, MAB3656). CLDN6 je lokalizovan na ćelijskoj membrani transfektovanih ćelija i može se obeležiti na živim ćelijama posredstvom specifičnih antitela.

(B) Serum miša na osnovu koga je proizveden hidridom F3-6C3-H8 koja sadrži antitela koja se vezuju za CLDN6 na površini nefiksiranih CHO-K1 ćelija, kotransfektovanih nukleinskim kiselina koje kodiraju humani CLDN6 i GFP.

Sl. 3. Western blot analiza endogene ekspresije klaudinskih proteina u HEK293T ćelijama.

Proteinski lizati HEK293T ćelija transfektovanih nukleinskim kiselinama koje kodiraju CLDN3, CLDN4, CLDN6, i CLDN9, ili negativnom kontrolom, testirane su primenom Western blot analize, primenom komercijalno dostupnih anti-CLDN3(A) (Invitrogen, Cat No.

34-1700), anti-CLDN4(A) (Zymed, 32-9400), anti-CLDN6(A) (ARP, 01-8865) i anti-CLDN9(A) (Santa Cruz, sc-17672) antitela. Antitela su detektovala ekspresiju njihovih odgovarajućih ciljnih proteina samo u odgavarajuće transfektovanim HEK293T ćelijama. Nije detektovana endogena ekspresija ni jednog od navedenih klaudinskih molekula u negativnim kontrolama HEK293T ćelija.

Sl. 4. Protočno-citometrijska analiza specifičnosti komercijalno dostupnih anti-CLDN antitela.

Vezivanje komercijalno dostupnih anti-CLDN antitela za HEK293T ćelije transfektovane nukleinskim kiselina koje kodiraju CLDN3, CLDN4, CLDN6, i CLDN9, ili za netransfektovane ćelije određena je protočnom citometrijom. Samo je komercijalno dostupno anti-CLDN3 antitelo specifično za svoj ciljni protein.

Sl. 5. Protočno-citometrijska analiza specifičnosti anti-CLDN antitela dobijenih na osnovu pronalaska.

Vezivanje antitela iz supernatanata monoklonskih subklonova hibridoma, za HEK293T ćelije ko-transfektovane vektorom koji kodira CLDN6, CLDN3, CLDN4 i CLDN9 ili vektorom koji kodira fluorescentni marker određeno je protočnom citometrijom.

(A) Antitela u supernatantu monoklonskog hidridoma subklona F3-6C3-H8 specifično se vezuju za ćelije transfektovane CLDN6, ali ne i za ćelije transfektovane CLDN3, CLDN4 i CLDN9. Suprotno ovome, antitela iz supernatanata monoklonskog hidridoma subklona F4-4F7-F2 vezuju se za ćelije sa CLDN6 ili CLDN9. Antitela iz supernatanta monoklonskog hibdrodma subklona F3-6C3-H8 takođe se vezuju za ćelije transfektovane (I143V)-SNP varijantom CLDN6 proteina.

(B) Antitela iz supernatanta monoklonskog hibridoma subklona F3-7B3-B4 vezuju se za ćelije transfektovane CLDN6, CLDN3 ili CLDN9. Antitela u supernatantu monoklonskog hibridoma subklona F3-3F7-A5 vezuju se za ćelije transfektovane CLDN6, CLDN4 ili CLDN9.

Sl. 6. Specifičnost vezivanja anti-CLDN6 mišjih monoklonskih antitela muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B i 67A.

Vezivanje anti-CLDN6 antitela za humane proteine CLDN6, 3, 4, 9 i CLDN6 SNP (polimorfizam jednog nukleotida) varijante I143V, analizirano je protočnom citometrijom primenom HEK293T ćelija koje prolazno eksprimiraju odgovarajući humani klaudin. HEK293T ćelije su ko-transfektovane fluorescentnim markerom kako bi se ne-transfektovane ćelije (Q1 i Q3 populacija) razlikovale od transfektovanih (Q2 i Q4) ćelija. Primenjena je koncentracija antitela pri kojoj dolazi do zasićenja vezivanja za CLDN6 (25 mg/ml). Ekspresija humanih CLDN6, 3, 4, 9 i CLDN6-SNP(I143V) potvrđena je primenom komercijalno dostupnih monoklonskih antitela na humani Klaudin-6 (R&D Systems, MAB3656), humani Klaudin-3 (R&D Systems, MAB4620) i humani Klaudin-4 (R&D Systems, MAB 4219).

Sl. 7. Relativni afiniteti anti-CLDN6 mišjih monoklonskih antitela muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B i 67A.

Relativan afinitet vezivanja anti-CLDN6 antitela za humani CLDN6 stabilno eksprimiran na površini HEK293 ćelija određen je protočnom citometrijom. U eksperimentu zasićenja ispitana je jačina FACS signala (srednja vrednost intenziteta fluorescencije) zavisno od koncentracije antitela. Vrednost EC50 (koncentracija antitela pri kojoj se postiže polovina zasićenih vezujućih mesta u ravnoteži) izračunata je nelinearnom regresionom analizom. Anti-CLDN6-specifična antitela, muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B i 67A ispoljila su veoma niske vrednosti EC50 (EC50200-500 ng/ml), dok je zasićenje vezivanja postignuto pri niskim koncentracijama.

Sl. 8. Sposobnost izazivanja citotoksičnosti zavisne od komplementa za anti-CLDN6 mišja monoklonska antitela mu-MAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B i 67A.

CDC aktivnost anti-CLDN6 antitela analizirana je primenom luciferaznog testa za detekciju endogenog ATP u neliziranim ćelijama. CHO-K1 ćelije koje stabilno eksprimiraju humani CLDN6, tretirane su različitim koncentracijama muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B i 67A antitela. MuMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B i 67A ispoljila su dozno-zavisnu CDC aktivnost i izazvala su CDC pri niskim koncentracijama.

Sl. 9. Sposobnost izazivanja citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC) za anti-CLDN6 mišja monoklonska antitela muMAB 65A i 66B kod endogeno CLDN6 eksprimirajućim NEC8 i NEC8 LVTS2 54 (CLDN6 nokdaun) ćelijama.

Anti-CLDN6 antitela muMAB 65A i 66B izazvala su CDC na NEC8 ćelijama na doznozavisan način. Ciljna specifičnost muMAB 65A i 66B dokazana je primenom NEC8 LVTS2 54 ćelija (CLDN6 nokdaun ćelije).

Sl. 10. Terapeutski efekat muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B i 67A u ranom tretmanu ksenograft modela miša sa presađenim NEC8 tumorskim ćelijama.

Primenjen je model endogeno CLDN6 eksprimirajućeg NEC8 ksenografta u atimičnom Nude-Foxn1nu soju miševa. U poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom fiziološkim rastvorom, muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B i 67A pokazala su inhibiciju rasta tumora kod miša sa presađenim NEC8 ćelijama.

Sl. 11. Specifičnost vezivanja himernih anti-CLDN6 monoklonskih antitela chimAB 61D, 64A, 67A i 89A.

Vezivanje anti-CLDN6 antitela za humane CLDN6, 3, 4 i 9, analizirano je protočnom citometrijom na HEK293 ćelijama koje stabilno eksprimiraju humani klaudin. Antitelo je primenjeno u koncentraciji koja dovodi do zasićenja (25 µg/ml). Ekspresija humanih CLDN3, 4, 6 i 9 potvrđena je komercijalno dostupnim monoklonskim antitelima na humani Klaudin-3 (R&D Systems, MAB4620) i humani Klaudin-4 (R&D Systems, MAB 4219), i humani CLDN6/9-reaktivnim mišjim monoklonskim antitelom muMAB 5F2D2. Negativna kontrola je sprovedena pod identičnim uslovima, osim što je izostavljeno primarno antitelo.

Sl. 12. Relativni afiniteti himernih anti-CLDN6 monoklonskih antitela chimAB 61D, 64A, 67A i 89A na HEK293-CLDN6 ćelijama.

Relativni afinitet vezivanja anti-CLDN6 antitela za humani CLDN6 stabilno eksprimiran na površini HEK293 ćelija analiziran je protočnom citometrijom. U saturacionom eksperimentu, ispitan je uticaj koncentracije antitela na jačinu FACS signala (srednji intenzitet fluorescencije). Vrednost EC50 (koncentracija antitela pri kojoj se postiže polovina zasićenih mesta u ravnoteži) izračunata je nelinearnom regresionom analizom. Himerna CLDN6specifična antitela, chimAB 64A i 89A ispoljila su veoma niske vrednosti EC50 (EC50450-600 ng/ml), dok je zasićenje vezivanja postignuto pri niskim koncentracijama. ChimAB 67A i 61D ispoljili su nisku (EC501000 ng/ml), odnosno, srednje visoku (EC502300 ng/ml) EC50 vrednost.

Sl. 13. Relativni afinitet himernih anti-CLDN6 monoklonskih antitela chimAB 61D, 64A, 67A i 89A prema NEC8 ćelijama.

Afinitet vezivanja anti-CLDN6 antitela za tumorske ćelije koje endogeno eksprimiraju humani CLDN6 ispitan je na kancerskoj liniji ćelija testisa, NEC8, primenom protočne citometrije. Himerna CLDN6-specifična antitela chimAB 64A i 89A ispoljila su veoma niske EC50 vrednosti (EC50 600-650 ng/ml) i zasićenje vezivanja je postignuto pri niskim koncentracijama, dok su chimAB 61D i 67A pokazala srednje visoku (EC50 1700 ng/ml), odnosno, visoku (EC506100 ng/ml) EC50 vrednost.

Sl. 14. Relativni afinitet himernih anti-CLDN6 monoklonskih antitela chimAB 61D, 64A, 67A i 89A za OV90 ćelije.

Afinitet vezivanja anti-CLDN6 antitela za tumorske ćelije koje endogeno eksprimiraju humani CLDN6, određen je vezivanjem za tumorsku liniju ćelija ovarijalnog kancera OV90, postupkom protočne citometrije. Himerna CLDN6-specifična antitela chimAB 64A i89A ispoljila su veoma niske EC50 vrednosti (EC50 550-600 ng/ml) i zasićenje je postignuto pri niskim koncentracijama. ChimAB 61D i 67A su ispoljila srednje visoke EC50 vrednosti (EC50 1500 ng/ml, odnosno, EC502300 ng/ml).

Sl. 15. Sposobnost izazivanja citotoksičnosti zavisne od komplementa anti-CLDN6 himernih monoklonskih antitela chimAB 61D, 64A, 67A i 89A kod NEC8 ćelija divljeg tipa i NEC8 nokdaun ćelija.

CDC aktivnost anti-CLDN6 antitela analizirana je primenom luciferaznog testa za detekciju endogenog ATP u neliziranim ćelijama. U te svrhe su NEC8 ćelije divljeg tipa (NEC8 LVTS2 77) koje ektopično ekprimiraju luciferazu, tretirane različitim koncentracijama chimAB 61D, 64A, 67A i 89A antitela. Na NEC-8 ćelijama, chimAB 61D, 64A, 67A i 89A ispoljila su dozno-zavisnu CDC aktivnost, dok na NEC-8 CLDN6 nokdaun ćelijama (NEC8 LVTS254) ni jedno od navedenih antitela nije indukovalo lizu ćelija. Dobijeni rezultati jasno pokazuju specifičnu ciljnu funkciju chimAB 61D, 64A, 67A i 89A antitela.

Sl. 16. Sposobnost indukovanja ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) anti-CLDN6 himernim monoklonskim antitelima chimAB 61D, 64A, 67A i 89A na NEC8 ćelijama divljeg tipa i NEC8 nokdaun ćelijama.

ADCC aktivnost anti-CLDN6 antitela analizirana je primenom luciferaznog testa za detekciju endogenog ATP u ne-liziranim ćelijama. U te svrhe su NEC-8 ćelije divljeg tipa (NEC8 LVTS2 77) tretirane različitim koncentracijama chimAB 61D, 64A, 67A i 89A. Antitela chimAB 61D, 64A, 67A i 89A ispoljila su dozno-zavisnu ADCC aktivnost i indukovala su ADCC, čak i pri niskim koncentracijama. Ciljna specifičnost demonstrirana je primenom NEC8 ćelija sa stabilnim nokdaunom gena za CLDN6 (NEC8 LVTS254).

Sl. 17. Dugotrajni terapeutski efekat mišjih anti-CLDN6 monoklonskih antitela muMAB 61D, 64A i 67A u ranom tretmanu mišjeg ksenografta sa presađenim ćelijama tumorske linije NEC8.

Primenjeni model zasniva se na endogeno eksprimiranom CLDN6 u NEC8 ksenograftu u atimičnom Nude-Foxn1<nu>mišu. Miševi su tokom 46 dana tretirani CLDN6-specifičnim antitelima. Rast tumora je praćen 60 dana nakon završetka tretmana. Čak i nakon prekida imunoterapije, kod miševa tretiranih mišjim monoklonskim antitelima muMAB 61D, 64A i 67A nije uočen rast tumora.

Sl. 18. Terapeutski efekat anti-CLDN6 mišjih monoklonskih antitela muMAB 89A u ranom tretmanu ksenografta na mišu sa presađenim tumorskim ćelijama NEC8 linije.

Model se zasniva na NEC ksenograftima koji endogeno eksprimiraju CLDN6 u atimičnom Nude-Foxn1nu mišu. Pojedinačne tačke predstavljaju zapreminu presađenih tumora u različitim vremenskim tačkama tokom ranog tretmana NEC8 ksenografta u atimičnom Nude-Foxn1nu mišu. U odnosu na kontrolnu grupu tretiranu fiziološkim rastvorom, muMAB 89A je ispoljio inhibitorni uticaj na rast tumora kod miša sa presađenim NEC8 ćelijama (A). Miševi su tretirani tokom 47 dana PBS-om (kontrola) ili CLDN6-specifičnim antitelima. Rast tumora je praćen tokom narednih 51 dana. U poređenju sa PBS grupom nije bilo detektabilnih tumora kod miševa tretiranih muMAB89A antitelom do kraja ove studije (B).

Sl. 19. Terapeutski efekat anti-CLDN6 mišjih monoklonskog antitela muMAB 64A kod tretmana uznapredovalog ksenografta kod miša sa presađenim tumorskim ćelijama NEC8 linije.

Pojedinačne tačke predstavljaju zapremine presađenih tumora u različitim vremenskim tačkama tokom tretmana uznapredovalih NEC8 ksenografta u atimičnom Nude-Foxn1<nu>mišu. Imunoterapija mišjim monoklonskim anti-CLDN6 mu-MAB 64A antitelom pokazala je značajnu inhibiciju rasta tumora solidnih NEC8 ksenografta u poređenju sa kontrolnim antitelom i sa kontrolnom grupom tretiranom fiziološkim rastvorom.

Sl. 20. Dugotrajni terapeutski efekat mišjeg anti-CLDN6 monoklonskog antitela muMAB 64A kod tretmana uznapredovalog ksenografta miša sa presađenom tumorskom ćelijskom linijom NEC8.

Petnaest dana nakon presađivanja u miša, započet je tretman CLDN6-specifičnim antitelom muMAB 64A, koji je trajao sledećih 45 dana. Rast tumora je praćen narednih 49 dana (A). Grafik preživljavanja ukazuje na produženo preživljavanje miševa tretiranih CLDN6 specifičnim antitelom muMAB 64A (B).

Sl. 21. Terapeutski efekat anti-CLDN6 mišjih monoklonskih antitela muMAB 61D, 67A i 89A u tretmanu uznapredovalog ksenografta na mišu sa presađenom tumorskom linijom NEC8.

Tačke predstavljaju zapremine presađenih NEC8 tumora u različitim vremenskim tačkama tokom tretmana NEC8 ksenografta. U poređenju sa grupom tretiranom fiziološkim rastvorom i kontrolnom grupom tretiranom antitelima, inhibicija rasta tumora postignuta je sa mišjim monoklonskim anti-CLDN6 antitelima muMAB 61D, 67A i 89A.

Sl. 22. Dugotrajni terapeutski efekat anti-CLDN6 mišjih monoklonskih antitela muMAB 61D, 67A i 89A u tretmanu uznapredovalog ksenografta kod miša sa presađenim tumorskim ćelijama NEC8 linije.

Sedamnaest dana nakon presađivanja, miševi su tretirani tokom naredna 42 dana CLDN6-specifičnim antitelima muMAB 61D, 67A i 89A. Rast tumora je praćen narednih 49 dana. (A). Grafik preživljavanja pokazuje produženo preživljavanje miševa tretiranih CLDN6-specifičnim antitelima muMAB 61D i 67A (B).

Sl. 23. Terapeutski efekat anti-CLDN6 mišjih monoklonskih antitela muMAB 64A i 89A u tretmanu uznapredovalog ksenografta na mišu sa presađenim NEC8 ćelijama divljeg tipa i NEC8 ćelijama sa stabilnim nokdaunom gena za CLDN6.

Antitela muMAB 64A i 89A pokazuju terapeutski efekat samo kod mišjih graftova sa NEC8 ćelijama divljeg tipa, ali ne i kod miševa sa NEC8 CLDN6 nokdaun ćelijama, što ukazuje na ciljnu specifičnost ovih antitela in vivo.

Sl. 24. Epitopsko mapiranje visoke rezolucije u chimAB 61D, 64A, 67A i 89A.

Mutanti alanina dobili su oznake kao ’divlji tip broj alaninskog ostatka” ili “divlji tip broj glicinskog ostatka” u slučaju alanin-divljeg tipa, tako što je aminokiselina predstavljena jednoslovnim kodom. Aminokiseline F35, G37, S39 i moguće, T33 u prvom vanćelijskom domenu CLDN6 važne su za interakciju sa CLDN6-specifičnim himernim antitelima chimAB 61D, 64A, 67A i 89A. Ostatak I40 ključan je vezivanje chimAB 89A, a doprinosi i vezivanju chimAB 61D i 67A. Uz to, L151 na drugom vanćelijskom domenu CLDN6 doprinosi interakciji sa chimAB 67A. Iako eksperimenti imunofluorescencije potvrđuju ekspresiju CLDN6 mutanata P28A, W30A, G49A, L50A, W51A, C54A i C64A, ne pokazuju membransku lokalizaciju. Usled toga nije moguće isključiti interakciju naših antitela sa ovim aminokiselinama. Ukupno gledano, ovde identifikovani epitop je u skladu sa strategijom imunizacije primenom DNK i peptida EC1 domena CLDN6.

Sl. 25. Poravnanje aminokiselinskih sekvenci varijabilnog regiona teškog lanca CLDN6-specifičnih antitela pronalaska.

Uokvirene su CDR sekvence (HCDR1, HCDR2 i HCDR3).

Sl. 26. Poravnanje aminokiselinskih sekvenci varijabilnog regiona lakog lanca CLDN6-specifičnih antitela pronalaska.

Uokvirene su CDR sekvence (LCDR1, LCDR2 i LCDR3).

Sl. 27. Specifčnost vezivanja himernih anti-CLDN6 monoklonskih antitela chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS.

Specifičnost vezivanja anti-CLDN6 antitela analizirana je protočnom citometrijom na HEK293T ćelijama koje su prolazno transfektovane čovečjim CLDN6, 3, 4 i 9. Da bi se razlikovale tranfektovane i netransfektovane populacije ćelija, ćelije su ko-transfektovane fluorescentnim markerom. Primenjena je koncentracija antitela koja dovodi do zasićenja (100 mg/ml). Ekspresija čovečjih CLDN3, 4, 6 i 9 potvrđena je komercijalno dostupnim monoklonskim antitelima specifičnima za čovečji Klaudin-3 (R&D Systems, MAB4620) i čovečji Klaudin-4 (R&D Systems, MAB4219), kao i CLDN6/9-reaktivnim mišjim monoklonskim antitelom muMAB 5F2D2. Himerna monoklonska antitela chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS su se vezivala za CLDN6 bez interakcije sa CLDN3, 4 i 9.

Sl. 28. Relativni afinitet vezivanja anti-CLDN6 himernih monoklonskih antitela chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS za HEK293-CLDN6 ćelije.

Relativni afiniteti vezivanja anti-CLDN6 antitela za humani CLDN6 stabilno eksprimiran na površini HEK293 ćelija analiziran je protočnom citometrijom. U saturacionom eksperimentu, ispitan je uticaj koncentracije antitela na jačinu FACS signala (srednja vrednost intenziteta fluorescence). Vrednosti EC50 (koncentracija antitela koja dovodi do vezivanja za polovinu svih raspoloživih vezujućih mesta u ravnoteži), izračunata je nelinearnom regresijom. Anti CLDN6-specifična antitela ispoljila su slične niske EC50 vrednosti i zasićenje je postignuto pri niskim koncentracijama.

Sl. 29. Relativni afiniteti vezivanja himernih anti-CLDN6 monklonskih antitela chimAB 64A, mAb206- LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS za NEC8 ćelija.

Afinitet vezivanja anti-CLDN6 antitela za tumroske ćelije koje endogeno eksprimiraju humani CLDN6 koji se vezuje za NEC8 ćelijsku liniju kancera testisa, analiziran je primenom protočne citometrije. U poređenju sa CLDN6-specifičnim antitelima chimAB 64A, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS varijantna kombinacija lakog lanca mAb206-LCC ispoljila je trostruko veći afinitet vezivanja za NEC8 ćelije. U svim slučajevima saturacija je postignuta pri niskim koncentracijama.

Sl. 30. Relativni afinitet vezivanja himernih anti-CLDN6 monoklonskih antitela chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS za OV90 ćelije.

Afinitet vezivanja anti-CLDN6 antitela za ćelijsku liniju humanog ovarijalnog kancera OV90, analiziran je protočnom citometrijom. Anti-CLDN6-specifična antitela ispoljila su slične niske EC50 vrednosti. Varijantna kombinacija lakog lanca mAb206-LCC ispoljila je najsnažnije vezivanje za OV90 ćelije.

Sl. 31a. Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) himernih anti-CLDN6 monoklonskih antitela chimAB 64A, mAb206-LCC i mAb206-SUBG na NEC8 ćelijama divljeg tipa i NEC8 nokdaun ćelijama.

CDC aktivnost anti-CLDN6 antitela analizirana je primenom luciferaznog testa za detekciju endogenog ATP u neliziranim ćelijama. Stoga su NEC8 ćelije divljeg tipa koje ektopično eksprimiraju luciferazu, tretirane različitim koncentracijama chimAB 64A, mAb206-LCC i mAb206-SUBG antitela. Na NEC-8 ćelijama antitela su ispoljila CDC aktivnost na doznozavisan način, dok na NEC-8 CLDN6 nokdaun ćelijama ni jedno od testiranih antitela nije indukovalo lizu ćelija. Ovi rezultati demonstriraju ciljnu specifičnost efektorskih funkcija chimAB 64A, mAb206-LCC i mAb206-SUBG antitela.

Sl. 31b. Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) himernih anti-CLDN6 monoklonskih antitela chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS na NEC8 ćelijama.

Antitela su ispoljila dozno-zavisnu CDC aktivnost. U poređenju sa chimAB 64A, aminokiselinske supstitucione varijante mAb206-SUBG i mAb206-SUBS ispoljile su sličnu CDC aktivnost na NEC8 ćelijama.

Sl. 32a. Citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), himernih anti-CLDN6 monoklonskih antitela chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS na NEC8 i OV90 ćelijama.

ADCC aktivnost anti-CLDN6 antitela analizirana je primenom luciferaznog testa za detekciju endogenog ATP u neliziranim ćelijama. Zato su NEC-8 i OV90 ćelije tretirane različitim koncentracijama himernih antitela na CLDN6. Sva antitela su pokazala dozno-zavisnu ADCC aktivnost i indukovala su ADCC u obe tumorske ćelijske linije, čak i pri niskim koncentracijama antitela.

Sl. 32b. Citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) himernih anti-CLDN6 monoklonskih antitela chimAB 64A, mAb206-LCC i mAb206-SUBG na NEC8 ćelijama divljeg tipa i NEC8 nokdaun ćelijama.

Za ispitivanje ciljne specifičnosti korišćene su NEC8 ćelija sa stabilnim CLDN6 nokdaunom.

Sl. 33. Terapeutski efekat himernih anti-CLDN6 monoklonskih antitela mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS u tretmanu uznapredovalog ksenografta kod miša sa presađenim NEC8 tumorskim ćelijama.

Model se zasniva na NEC8 ksenograftu u atimičnom Nude-Foxn1<nu>mišu. Nakon 17 dana od presađivanja, miševi su tretirani CLDN6- specifičnim antitelima mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS, a zatim je praćen rast tumora. Tačke na grafiku predstavljaju zapremine presađenih tumora u različitim vremenskim tačkama tokom tretmana uznapredovalih NEC8 ksenografta kod miševa. U poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom antitelom, himerna monoklonska anti-CLDN6 antitela mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS ispoljila su inhibiciju rasta tumora.

Sl. 34. Terapeutski efekat anti-CLDN6 himernih monoklonskih antitela mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS u tretmanu uznapredovalog ksenografta kod miša sa presađenim tumorskim ćelijama NEC8 linije.

U poređenju sa Slikom 33, krive rasta detaljnije prikazuju da himerna monoklonska anti-CLDN6 antitela imaju sposobnost da inhibiraju rast tumora (A). Grafik preživljavanja pokazuje produženo vreme preživljavanja miševa tretiranih CLDN6 specifičnih antitela (B).

Sl. 35. Epitopsko mapiranje visoke rezolucije chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS antitela.

Mutanti alanina imenovani su kao ’broj alaninskog ostatka kod divljeg tipa’, naznačeno time da su amino kiseline predstavljene jednoslovnom oznakom. Amino kiseline F35, G37 i S39 i potencijalno, T33 u prvom vanćelijskom domenu CLDN6 važne su za interakciju CLDN6 specifičnih himernih antitela. ChimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS ispoljila su isti obrazac vezivanja.

Sl. 36. Terapeutski efekat anti-CLDN6 mišjih monoklonskih antitela muMAB 64A u modelu metastatskog ksenografta kod miša sa presađenom tumorskom ćelijskom linijom NEC8.

U metastatskom modelu, NEC8 ćelije su injektovane u repnu venu atimičnog miša Nude-Foxn1nu mice. Tri dana nakon presađivanja, miševi su tretirani CLDN6-specifičnim antitelima muMAB 64A. Nakon 8 nedelja preparino je tkivo pluća i rast tumora je analiziran metodom PCR. U poređenju sa PBS kontrolnom grupom, mišje monoklonsko anti-CLDN6 antitelo muMAB 64A jasno je pokazalo inhibiciju rasta tumora.

Sl. 37. Imunocitohemijsko bojenje kancerskog i normalnog tkiva čoveka, primenom monoklonskih antitela muMAB 64A, mAb206-LCC i mAb206-SUBG.

Za razliku od normalnih tkiva, na presecima ovarijanog i testukularnog kancerskog tkiva uočeno je snažno homogeno bojenje. Veoma jaka imunoreakcija uočena je na membranama malignih epitelnih ćelija, dok su susedne stromalne i ne-maligne ćelije ostale neobojene. Rezultati jasno ukazuju da se naše CLDN6-specifično antitelo vezuje za maligne ćelije nastale kod tumorskih bolesnika. (Objašnjenje: broj tkiva obojen antitelom/broj analiziranih tkiva).

DEFINICIJA TERMINA

[0086] Izrazi su definisani kako bi se predmetni pronalazak lakše razumeo. Dodatni opisi značenja navedeni su u delu detaljnog opisa pronalaska.

[0087] U ovoj specifilaciji i zahtevima koji slede, ukoliko sam kontekst ne nalaže drugačije, reč “sadrži” i varijacije “sadrži se” i “sadržati”, shvatiće se u značenju da obuhvataju ili ubrajaju navedene članove, cele brojeve ili grupe članova, brojeva ili faza. (Članovi "a" i "an" i "the" i slično u engleskom originalu, koje se koriste u kontekstu opisa pronalaska (naročito u kontekstu zahteva), treba da se tumače i da obuhvate kako jedninu, tako i množinu, osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili se jasno ne shvata drugačije iz konteksta. Navođenje opsega brojeva ima za cilj da posluži kao skraćeni postupak pojedinačnog referisanja na svaku vrednost koja se nalazi u naznačenom opsegu. Ukoliko nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost unutar opsega obuhvaćena je specifikacijom, kao da je pojedinačno pomenuta. Svi postupci koji su ovde opisani mogu se izvesti bilo kojim pogodnim redosledom, osim ukoliko nije drugačije naznačeno ili se jasno drugačije shvata iz konteksta. Primena bilo kojeg i svih primera, ili primernog jezika (na primer, “kao što je”) ovde je primenjena sa ciljem da bolje ilustruje pronalazak. Ništa u specifilaciji ne treba da se protumači kao da ukazuje na neki element za koji nije tražena zaštita suštinski važan za izvođenje pronalaska.

[0088] Klaudini su porodica proteina, najznačajnijih komponenti čvrstih veza, u kojima ovi proteini uspostavljaju međućelijsku barijeru koja kontroliše protok molekula u međućelijski prostor između ćelija epitela. Klaudini su transmembranski proteini sa 4 transmembranska segmenta i sa N- i C-krajem koji se nalaze sa unutarćelijske strane u citosolu. Prva vanćelijska petlja sadrži u proseku 53 aminokiseline, a druga oko 24 aminokiseline. CLDN6 i CLDN9 su međusobno najsličniji članovi klaudinske porodice.

[0089] Termin "CLDN", u značenju kako je ovde primenjeno, označava klaudin i obuhvata CLDN6, CLDN9, CLDN4 i CLDN3. Poželjno, CLDN je humani protein.

[0090] Termin "CLDN6" pre svega se odnosi na humani CLDN6, i naročito, na (i) nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira amino sekvencu SEQ ID NO: 2 ili koja kodira amino sekvencu SEQ ID NO:8, kao što je nuklenska kiselina koja sadrži nukleinsku sekvencu SEQ ID NO: 1 ili (ii) protein aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 2 ili aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 8. Prva vanćelijska petlja CLDN6 pre svega sadrži sekvencu aminokiseline 28 do 80, poželjno, 28 do 76 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 2 ili aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8, kao što je aminokiselinska sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 7. Druga vanćelijska petlja CLDN6 poželjno sadrži aminokiseline 138 do 160, poželjno aminokiseline 141 do 159, najpoželjnije, aminokiseline 145 do 157 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 2 ili aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 8, kao što je aminokiselinska sekvenca prikazana u SEQ ID NO: 6. Pomenute prva i druga vanćelijska petlja formiraju vanćelijski domen CLDN6.

[0091] Termin "CLDN9" pre svega se odnosi na humani CLDN9, i naročito, na (i) nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira amino sekvencu SEQ ID NO: 9 ili (ii) na protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 9. Prva vanćelijska petlja CLDN9 poželjno sadrži aminokiseline 28 do 76 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 9. Druga vanćelijska petlja CLDN9 poželjno sadrži aminokiseline 141 do 159 aminokiselinske sekvence prikazane u SEQ ID NO: 9. Pomenute prva i druga vanćelijska petlja formiraju vanćelijski deo CLDN9.

[0092] Termin "CLDN4" pre svega se odnosi na humani CLDN4 i, naročito, na (i) nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira amino sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 10 ili (ii) protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 10. Prva vanćelijska petlja CLDN4 poželjno sadrži aminokiseline 28 do 76 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 10. Druga vanćelijska petlja CLDN4 poželjno sadrži aminokiseline 141 do 159 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 10. Pomenute prva i druga vanćelijska petlja poželjno sačinjavaju vanćelijski deo CLDN4.

[0093] Termin "CLDN3" pre svega se odnosi na humani CLDN3 i naročito na (i) nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira amino sekvencu u SEQ ID NO: 11 ili (ii) protein koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 11. Prva vanćelijska petlja CLDN3 poželjno sadrži aminokiseline 27 do 75 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 11. Druga vanćelijska petlja CLDN3 pre svega sadrži aminokiseline 140 do 158 aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 11. Pomenute prva i druga vanćelijska petlja formiraju vanćelijski deo CLDN3.

[0094] Prethodno opisane CLDN sekvence obuhvataju sve varijante naznačene sekvence, naročito, mutante, varijante koje nastaju isecanjem, konformacione varijante, izoforme, alelske varijante, varijante specifične za vrstu i homologe za vrstu, naročito na sve varijante koje su normalno postojeće. Alelska varijanta se odnosi na promenu uobičajene sekvence gena, čiji značaj često nije jasan. Kompletno sekvenciranje gena često ukazuje na brojne alelske varijante datog gena. Homolog vrste je nukleinska kiselina ili aminokiselinska sekvenca koja potiče od različite vrste u odnosu na onu iz koje je nukleinska kiselina ili aminokiselinska sekvenca. Termin "CLDN" obuhvatiće (i) varijante isecanja (ii) posttranslaciono modifikovane varijante CLDN i naročito varijante koje se razlikuju usled glikozilacije, kao što je N-glikozilacioni status, (iii) konformacione varijante CLDN, (iv) varijante CLDN vezane za kancer ili nevezane za kancer. CLDN je pre svega prisutan u svojoj nativnoj konformaciji.

[0095] Utvrđeno je da se CLDN6 eksprimira, primera radi, u kanceru jajnika, kanceru pluća, kanceru želuca, kanceru dojke, kanceru jetre, kanceru pankreasa, kanceru kože, melanomima, kancerima glave i vrata, sarkomima, kanceru kanala žučne kese, kanceru bubrega i kanceru mokraćne bešike. CLDN6 je naročito pogodno ciljno mesto u prevenciji i/ili terapiji kancera jajnika i naročito, ovarijalnog adenokarcinoma i ovarijalnog teratokarcinoma, kancera pluća, uključujući sitnoćelijski kancer pluća (SCLC) i ne-sitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), naročito kancer skvamoznih ćelija pluća i adenokarcinom, kancer želuca, kancer dojke, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, naročito, karcinom bazalnih ćelija i karcinom skvamoznih ćelija, maligni melanom, kancer glave i vrata, naročito maligni plejomorfni adenom, sarkom, naročito, sinovijalni sarko i karcinosarkom, kancer kanala žučne kese, kancer mokraćne bešike, naročito kancer prelaznih ćelija i papilarni karcinom, kancer bubrega, naročito svetloćelijski karcinom bubrega i papilarni karcinom bubrega, kancer debelog creva, kancer tankog creva, uključujući kancer ileuma, naročito adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, testikularni embrionalni karcinom, placentalni horiokarcinom, kancer grlića materice, kancer testisa, naročito testikularni seminom, testikularni teratom i embrionalni testikularni kancer, kancer materice, tumor germinativnih ćelija, kao što je teratokarcinom ili embrionalni karcinom, naročito tumor germinativnih ćelija testisa i njihove metastatske forme. U jednom primeru izvođenja, kancerska bolest povezana sa ekspresijom CLDN6 izabrana je iz grupe koju sačinjavaju kancer jajnika, kancer pluća, metastatski kancer jajnika i metastatski kancer pluća. Kancer jajnika je pre svega karcinom ili adenokarcinom. Kancer pluća je pre svega karcinom ili adenokarcinom i bronhijalni kancer, kao što je bronhijalni karcinom ili bronhijalni adenokarcinom. U jednom primeru izvođenja, tumorska ćelija povezana sa ekspresijom CLDN6 je ćelija takvih kancera.

[0096] Termin “deo” odnosi se na frakciju. U odnosu na konkretnu strukturu, kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein, termin “deo” može da označava kontinualnu ili diskontinualnu frakciju navedene strukture. Pre svega, deo aminokiselinske sekvence obuhvata najmanje 1%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30 %, najmanje 40 %, poželjno, najmanje 50%, najpoželjnije najmanje 60%, još poželjnije, najmanje 70%, poželjnije, najmanje 80% i najpoželjnije najmanje 90% aminokiselinske sekvence naznačene sekvence. Poželjno je, da ukoliko je deo diskontinualna frakcija, da je naznačena diskontinualna frakcija sačinjena od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više delova strukture, od kojih je svaki deo kontinualni element te strukture. Na primer, diskontinualna frakcija neke aminokiselinske sekvence može biti sastavljena od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više, poželjno ne manje od 4 dela naznačene aminokiselinske sekvence, pri čemu svaki deo sadrži najmanje 5 susednih aminokiselina, najmanje 10 susednih aminokiselina, poželjno, najmanje 20 susednih aminokiselinsa, poželjno, najmanje 30 susednih aminokiselina naznačene aminokiselinske sekvence.

[0097] Termini "deo" i "fragment" se koriste kao sinonimi i odnose se na kontinualni element. Na primer, deo neke strukture, kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein, odnosi se na kontinualni element naznačene strukture. Deo ili fragment strukture poželjno sadrži jedno ili više funkcionalnih svojstava naznačene strukture. Na primer, deo ili fragment nekog epitopa ili peptida poželjno je u imunološkom smislu ekvivalentan epitopu ili peptidu od kojeg je fragment nastao. Termin "vanćelijski deo CLDN" u kontekstu predmetnog pronalaska odnosi se na deo CLDN koji je okrenut prema vanćelijskom prostoru i koji je poželjno dostupan sa spoljašnje strane te ćelije, na primer, dostupan antitelima sa spoljašnje strane ćelije. Termin se pre svega odnosi na jednu ili više vanćelijskih petlji ili njihovih delova ili na neki vanćelijski deo CLDN koji je specifičan za naznačeni CLDN protein. Poželjno naznačeni deo sadrži najmanje 5, najmanje 8, najmanje 10, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30 ili najmanje 50 aminokiselina.

[0098] Izraz "CLDN asociran sa ćelijskom membranom” odnosi se na nativni CLDN, to jest, na CLDN u njegovoj ne-denaturisanoj, poželjno, adekvatno upakovanoj formi. Termin "CLDN asociran sa ćelijskom membranom" poželjno označava da je CLDN asociran sa i nalazi se na ćelijskoj membrani naznačene ćelije, pri čemu je najmanje deo CLDN, poželjno njegov vanćelijski deo, okrenut prema vanćelijskom prostoru i dostupan je sa spoljašnje strane naznačene ćelije, na primer, dostupan je antitelima sa spoljašnje strane ćelije. Asocijacija može biti direktna ili posredna. Na primer, asocijacija može biti posredovana sa jednim ili više transmembranskih domena, jednog ili više lipidnih sidara, i/ili posredstvom interakcije sa jednim ili više proteina, lipida, saharida ili drugih struktura koje se mogu naći u spoljašnjem listu ćelijske membrane. Na primer, CLDN asociran sa površinom ćelije može biti transmembranski protein, na primer, integralni membranski protein, koji poseduje vanćelijski deo ili može biti protein asociran sa površinom ćelije, posredstvom interakcije sa drugim transmembranskim proteinom.

[0099] CLDN6 je asociran sa površinom ćelije, ukoliko je lokalizovan na naznačenoj ćeliji i ukoliko je dostupan da se za njega veže CLDN6-specifično antitelo kojim se ćelija tretira. U poželjnim primerima izvođenja, ćelija koju karakteriše CLDN6 vezan na njenoj površini je ćelija koja eksprimira CLDN6. Treba tumačiti da je u slučaju kada je CLDN6 eksprimiran na ćeliji, CLDN6 asociran sa površinom naznačene ćelije može biti deo eksprimiranog CLDN6.

[0100] Izraz "ćelija koja nosi CLDN" pre svega označava da naznačena ćelija nosi CLDN6 na svojoj membrani, to jest da je CLDN asociran sa površinom te ćelije.

[0101] "Ćelijska membrana" ili "površina ćelije" koriste se ravnopravno, saglasno značenju u stanju tehnike, i obuhvataju ćelijsku membranu koja je dostupna za vezivanje proteina i drugih molekula.

[0102] Izraz "CLDN eksprimiran na ćelijskoj membrani" označava da je CLDN eksprimiran od strane ćelije i da se nalazi na površini te ćelije.

[0103] Saglasno pronalasku, CLDN6 nije značajno eksprimiran u ćeliji i nije značajno asociran sa površinom te ćelije ukoliko je nivo ekspresije i asocijacije niži od nivoa ekspresije i asocijacije koji su ustanovljeni u ćelijama placente i tkivu placente. Poželjno, nivo ekspresije i asocijacije je manje od 10%, poželjno manje od 5%, 3%, 2%, 1%, 0.5%. 0.1% ili 0.05% od ekspresije i asocijacije u ćelijama placente i tkivu placente. Poželjno, CLDN5 se ne eksprimira u značajnoj meri u ćelijama i nije u asocijaciji sa ćelijskom membranom, ukoliko nivo ekspresije i asocijacije prevazilaze nivo ekspresije i asocijacije u ne-tumorskim, nekancerskim tkivima, osim tkiva placente, za ne više od 2 puta, poželjno 1.5 put, i još poželjnije da ne prevazilazi nivo ekspresije i asocijacije u naznačenom ne-tumorskom i nekancerskom tkivu. Poželjno, CLDN6 nije suštinski eksprimiran u ćelijama i nije suštinski asociran sa njihovom membranom, ukoliko su nivo ekspresije i nivo asocijacije ispod limita detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije ili asocijacije suviše nizak da dozvoli vezivanje CLDN6-specifičnih antitela kojim se tretiraju ćelije.

[0104] Saglasno pronalasku, CLDN6 se eksprimira u ćeliji i asociran je sa njenom membranom, ukoliko nivo ekspresije i asocijacije prevazilaze nivo ekspersije i asocijacije u ne-tumorskim, ne-kancerskim tkivima, izuzev u tkivu placente, poželjno više od 2 puta, poželjno 10 puta, 100 puta, 1000 puta ili 10 000 puta i više. CLDN6 se poželjno eksprimira u ćeliji i povezan je sa ćelijskom membranom ukoliko su nivo ekspresije i asocijacije iznad limita detekcije i/ili ukoliko su nivo ekspresije i asocijacije dovoljno visoki da omoguće vezivanje CLDN6-specifičnih antitela kojima se ćelija tretira. Poželjno je da je CLDN6 koji je eksprimiran u ćeliji, izložen na ćelijskoj membrani naznačene ćelije.

[0105] Termin "splav" se odnosi na mikrodomene membrane bogate sfingolipidima i holesterolom i lokalizovane u spoljašnjem listu ćelijske membrane. Sposobnost nekih proteina da se asociraju sa ovakvim domenima i njihova sposobnost da formiraju “agregate” ili “fokalne agregate”, može da utiče na funkciju proteina. Na primer, translokacija CLDN6 molekula u ovakve strukture, nakon što se za njega vezalo antitelo predmetnog pronalaska, kreira visoku gustinu CLDN6 antigen-antitelo vezujučih kompleksa u ćelijskoj membrani. Visoka gustina CLDN6 antigen-antitelo kompleksa omogućava efikasnu aktivaciju sistema komplementna tokom CDC.

[0106] Saglasno pronalasku, termin "bolest" odnosi se na bilo koje patološko stanje, uključujući kancer, naročito one forme kancera koje su ovde opisane.

[0107] "Bolest koja uključuje ćelije koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani" saglasno pronalasku, označava da su ekspresija i asocijacija ćelija bolesnog tkiva ili organa povećane u poređenju sa zdravim stanjem tog tkiva ili organa. Povećanje se odnosi na povećanje od najmanje 10%, naročito najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10 000% ili više od toga. U jednom primeru izvođenja, ekspresija i asocijacija sa površinom ćelija pronađena je isključivo u obolelom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu bila potpuno isključena. Saglasno pronalasku, bolesti povezane sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojom membrani obuhvataju tumorske bolesti, kao što je kancer. Takođe, saglasno pronalasku, tumorske bolesti, kao što su kancerske bolesti poželjno su one kod kojih tumorske ćelije ili kancerske ćelije eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj ćelijskoj površini.

[0108] Kao što je ovde korišćeno, termini "tumorska bolest", "tumoru srodna bolest" ili "tumorogena bolest" odnose se na bolesti koje se odlikuju nepravilnom regulacijom rasta ćelija, ćelijske proliferacije, diferencijacije, adhezije i/ili migracije, koje mogu dovesti do produkcije ili tendencije da nastane tumor i/ili tumorske metastaze. Pod “tumorskom ćelijom” podrazumeva se abnormalna ćelija koja raste brzom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste nakon što je stimulus koji je izazvao njen rast, prestao da deluje.

[0109] Pod "tumorom" se podrazumeva abnormalna grupa ćelija ili tkivo koje raste ubrzanom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste nakon što je stimulus koji je to izazvao novi rast prestao da deluje. Tumori ispoljavaju delimičan ili potpuni nedostatak strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim zdravim tkivom, i najčešče formiraju specifičnu tkivnu masu, koja može biti benigna, pre-maligna ili maligna.

[0110] "Tumorska bolest", "tumoru srodna bolest" ili "tumorogena bolest", saglasno pronalasku, predstavljaju neku kancersku bolesti, to jest, malignu bolest, dok je tumorska ćelija, kancerska ćelija. Poželjno je da se “tumorska bolest”, “tumoru srodna bolest” i “tumorogena bolest” odlikuju ćelijama koje eksprimiraju CLDN6 i odlikuju se asocijacijom CLDN6 na svojoj površini, pri čemu tumorska ćelija eksprimira CLDN6 i odlikuje se asocijacijom CLDN6 na svojoj ćelijskoj membrani.

[0111] Ćelija koja eksprimira CLDN6 i koja se odlikuje asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani poželjno predstavlja tumorsku ćeliju ili kancersku ćeliju, poželjno tumorsku ili kancersku ćeliju koje su ovde opisane. Poželjno je da takva ćelija nije ćelija placente.

[0112] Kancerske bolesti saglasno pronalasku, izabrane su iz grupe koju čine kancer jajnika, naročito adenokarcinom jajnika i teratokarcinom jajnika, kancer pluća, uključujući sitnoćelijski kancer pluća (SCLC) i ne-sitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), naročito karcinom skvamoznih ćelija pluća i adenokarcinom, kancer želuca, kancer dojke, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, naročito kancer bazalnih ćelija i kancer skvamoznih ćelija, maligni melanom, kancer glave i vrata, naročito, maligni plejomorfni adenom, sarkom, naročito, sinovijalni sarkom i karcinosarkom, kancer izvodnih kanala žučne kese, kancer mokraćne bešike, naročito, karcinom prelaznih ćelija i papilarni karcinom, kancer bubrega, naročito karcinom bubrežnih ćelija, uključujući svetloćelijski karcinom bubrega i papilarni karcinom bubrega, kancer debelog creva, kancer tankog creva, uključujući kancer ileuma, naročito adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, testikularni embrionalni karcinom, horiokarcinom placente, karcinom grlića materice, kancer testisa, naročito testikularni seminom, testikularni teratom i embrionalni testikularni kancer, kancer materice, tumor germinativnih ćelija, kao što su teratokarcinomi ili embrionalni karcinom, naročito, tumor germinativnih ćelija testisa, i njihovi metastatski tumori.

[0113] Osnovni tipovi kancera pluća su sitnoćelijski karcinom pluća (SCLC) i ne-sitnoćelijski karcinom pluća (NSCLC). Postoje tri osnovna tipa ne-sitnoćelijskog karcinoma pluća: karcinom skvamoznih ćelija pluća, adenokarcinom i karcinom krupnih ćelija pluća. Adenokarcinomi čine oko 10% plućnih kancera. Ovaj kancer se obično nalazi na periferiji pluća, suprotno sitnoćelijskom kanceru pluća i kanceru skvamoznih ćelija, koji je češće centralno lokalizovan.

[0114] Kancer kože predstavlja maligni rast kože. Najčešći oblik kancera kože je kancer bazalnih ćelija, kancer skvamoznih ćelija i melanom. Maligni melanom je opasan tip kancera kože. Uzrokovan je nekontrolisanim rastom pigmentnih ćelija, koje se nazivaju melanocite.

[0115] Saglasno pronalasku, “karcinom" je kancer koji nastaje u površinskom sloju (epitelne ćelije) organa.

[0116] "Bronhijalni karcinom" je karcinom pluća, nastao od epitela terminalnih bronhiola u kojima se neoplastično tkivo pruža duž alveolarnih zidova i raste u malu masu unutar alveola. U nekim od ovih ćelija može se dokazati prisutvo mucina, kao i u materijalu alveola, koji takođe obuhvata ogoljene ćelije.

[0117] "Adenokarcinom" je kancer koji potiče iz žlezdanog tkiva. I ovo tkivo je deo šire tkivne kategorije koja obuhvata epitelna tkiva. Epitelna tkiva obuhvataju kožu, žlezde i raznovrsna druga tkiva koja oblažu šupljine i organe tela. U embrionalnom smislu, epitel može poticati od ektoderma, endoderma i mezoderma. Da bi se klasifikovao kao adenokarcinom, nije neophodno da ćelije budu deo žlezde, sve dok zadržavaju svoja sekretorna svojstva. Ovaj oblik karcinoma može se javiti kod nekih viših sisara, uključujući i čoveka. Dobro diferencirani adenokarcinomi imaju tendenciju da liče na žlezdano tkivo od kojeg potiču, dok slabije diferencirani adenokarcinomi ne moraju biti slični. Bojenjem ćelija dobijenih biopsijom, patolog određuje da li je tumor adenokarcinom ili neki drugi tip kancera. Adenokarcinomi mogu nastati u mnogim tkivima usled sveprisutnosti žlezda unutar organizma. Iako sve žlezde ne luče iste supstance, sve dok ćelija poseduje egzokrinu funkciju, ona se smatra žlezdanom ćelijom, a njena maligna forma se naziva adenokarcinom. Maligni adenokarcinomi vrše invaziju drugih tkiva i često metastaziraju ako im se da dovoljno vremena. Ovarijalni adenokarcinom je najčešći tip ovarijalnog karcinoma. On obuhvata serozne i mucinozne adenokarcinome, svetloćelijski adenokarcinom i endometrijalni adenokarcinom.

[0118] "Cistadenokarcinom" je maligna forma površinskog epitelno-stromalnog tumora, tipa kancera jajnika.

[0119] Površinski epitelno-stromalni tumori čine klasu ovarijalnih neoplazmi, za koje se smatra da nastaju od površinskog epitela jajnika (modifikovani peritoneum) ili od ektopičnog endometrijalnog tkiva ili tkiva jajovoda. Ova grupa tumora čini najveći procenat tumora jajnika.

[0120] Teratokarcinomi se odnose na tumore germinativnih ćelija, koji su mešavina teratoma sa embrionalnim karcinomom ili sa horiokarcinomom ili sa oba. Horiokarcinom je maligni, trofoblastni i agresivni kancer, najčešće kancer placente. On se odlikuje ranim hematogenim širenjem u pluća.

[0121] Sarkom je kancer vezivnog tkiva (kost, hrskavičavo tkivo, masno tkivo) koji je uslovljen proliferacijom mezoderma. To je razlika u odnosu na karcinome koji su epitelnog porekla. Sinovijalni sarkom je retka forma kancera koja se obično javlja u blizini zglobova ruku i nogu. To je jedan od tipova sarkoma mekih tkiva.

[0122] Karcinom bubrežnih ćelija, poznat i pod nazivom kancer bubrežnih ćelija ili adenokarcinom bubrežnih ćelija je kancer bubrega, koji potiče od površinskog sloja proksimalnih uvijenih kanalića, veoma malih kanala u bubregu, kroz koje se filtrira krv i iz nje oslabađaju nepotrebni proizvodi metabolizma. Karcinom bubrežnih ćelija je daleko najčešći tip kancera bubrega kod odraslih, i istovremeno najletalniji urogenitalni tumor. Specifični tipovi karcinoma bubrežnih ćelija su svetloćelijski karcinom bubrega i papilarni karcinom bubrega. Svetloćelijski karcinom bubrega je najčešći vid karcinoma bubrežnih ćelija. Kada se posmatraju pod mikroskopom, ćelije koje formiraju svetloćelijski karcinom izgledaju veoma svetlo ili gotovo bistro. Papilarni karcinom bubrežnih ćelija je drugi po učestalosti podtip karcinoma. Ovi kanceri formiraju male prstolike projekcije (nazvane papile) kod većine ovih tipova tumora.

[0123] Tumor germinativnih ćelija je neoplazma koja nastaje od germinativnih ćelija. Tumori germinativnih ćelija mogu biti kancerozni ili nekancerozni tumori. Germinativne ćelije se normalno nalaze u polnim žlezdama (jajnicima i testisima). Tumori germinativnih ćelija koji potiču izvan gonada (na primer, u glavi, unutar usta, vrata, pelvisa; u fetusima, kod beba i male dece, najčešće se nalaze duž središnje linije tela, naročito na vrhu repne kosti) mogu biti urođeni defekti koji su nastali usled grešaka tokom embrionalnog razvića embriona.

[0124] Dve osnovne klase tumora germinativnih ćelija su seminomi i ne-seminomi, naznačeno time da ne-semitomi obuhvataju: teratokarcinom, embrionalni karcinom, tumor žumancetne kesice, horiokarcinom i različite teratome. Većina ćelijskih linija iz ne-seminoma ekvivalentne su embrionalnim karcinomima, odnosno, sačinjene su gotovo isključivo od matičnih ćelija koje se ne diferenciraju pod bazalnim uslovima, iako neke reaguju na induktore diferencijacije, kao što je retinoinska kiselina.

[0125] Pod "metastazom" se podrazumeva širenje kancerskih ćelija sa početnog mesta na druga mesta u organizmu. Formiranje metastaza je veoma složeni proces, koji zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije u vanćelijski matriks, prodiranja u endotelnu bazalnu membranu kako bi stigao u telesne šupljine i sudove i zatim, nakon transportovanja putem krvi, infiltracija u ciljne organe. Konačno, rast tumora na novom mestu zavisi od angiogeneze. Tumorske metastaze najčešće se javljaju nakon uklanjanja primarnih tumora, jer tumorske ćelije ili komponente mogu ostati na tom mestu i razviti metastatski potencijal. U jednom primeru izvođenja, termin “metastaza” saglasno pronalasku, odnosi se na “udaljene metastaze”, koje se odnose na metastaze koje su prostorno udaljene od primarnog tumora i lokalnog limfnog čvora.

[0126] Ćelije sekundarnog ili metastatskog tumora slične su onima u originalnom tumoru. To znači, na primer, da kada kancer jajnika metastazira u jetru, sekundarni tumor je sačinjen od izmenjenih ćelija jajanika, a ne od izmenjenih ćelija jetre. Tumor u jetri se često naziva metastatički kancer jajnika, a ne kancer jetre.

[0127] Pod "tretiranjem" se podrazumeva primena jedinjenja ili kompozicije koji su ovde opisani, kod subjekta sa ciljem da se spreči ili eliminiše bolest, kao i da se smanji veličina tumora ili broj tumora kod subjekta; prekidanje ili usporavanje bolesti kod subjekta; inhibicija ili usporavanje razvoja nove bolesti kod subjekta; smanjenje frekvencije ili ozbiljnosti simptoma i/ili ponovnog vraćanja simptoma kod subjekta koji ima ili je prethodno imao bolest; i/ili produžavanje, odnosno, povećanje očekivanog preživljavanja subjekta.

[0128] Termin "tretman bolesti" obuhvata lečenje, skraćenje trajanja, ublažavanje, sprečavanje, usporavanje ili inhibicuju napredovanja ili pogoršanja ili sprečavanja ili odlaganja početka bolesti ili njenih simptoma.

[0129] Pod terminom "biti u riziku" podrazmeva se subjekt, odnosno, pacijent kod kojeg je utvrđena veća verovatnoća razvoja bolesti naročito kancera, od normalne verovatnoće koja važi za ukupnu populaciju. Takođe, subjekt koji je bio bolestan ili je još uvek bolestan od kancera, smatra se osobom sa povećanim rizikom razvoja bolesti, i takav subjekt može nastaviti da razvija bolest. Subjekti koji su trenutno bolesni ili su imali kancer takođe su u povećanom riziku od nastanka metastaza.

[0130] Termin "imunoterapija" označava tretman koji obuhvata specifične imunske reakcije. U kontekstu predmetnog pronalaska, termini kao što su “zaštititi”, “sprečiti”, “profilaktički”, “preventivno” ili “zaštitino” odnose se na prevenciju ili tretman ili oba, pojave i/ili napredovanja tumora kod pojedinca. Termin “imunoterapija” u kontekstu predmetnog pronalaska pre svega se odnosi na aktivnu imunizaciju tumora ili vakcinaciju protiv tumora. Prolifaktička primena imunoterapije, na primer, profilaktička primena kompozicije predmetnog pronalaska, poželjno štiti primaoca od razvoja tumora. Terapeutska administracija imunoterapije, na primer, terapeutska administracija kompozicije predmetnog pronalaska, može dovesti do inhibicije napredovanja/rasta tumora. To uključuje usporavanja napredovanja/rasta tumora, naročito prekid napredovanja tumora, što poželjno treba da dovede do eliminacije tumora. Terapeutska primena imunoterapije može da zaštiti pojedinca, na primer, od širenja ili metastaziranja postojećih tumora.

[0131] Termini "imunizacija" ili "vakcinacija" opisuju proces primene antigena na subjekta, sa ciljem da se indukuje imunski odgovor u terapeutske ili profilaktičke svrhe.

[0132] Termin “subjekt”, “osoba”, “organizam” ili “pacijent”, koriste se međusobno ravnopravno i odnose se na kičmenjake, posebno na sisare. Na primer, sisari, u kontekstu predmetnog pronalaska jesu ljudi, druge vrste primata, domaće životinje, kao što su psi, mačke, ovce; goveda, koze, svinje, konji itd., laboratorijske životinje, kao što su miševi, pacovi, zečevi, zamorci, itd, kao i životinje u zatočeništvu, kao što su životinje u zoološkim vrtovima. Termin “životinja” u značenju koje je ovde primenjeno, takođe obuhvata i čoveka. Termin “subjekt” može da obuhvati i pacijenta, odnosno, životinju, pre svega čoveka koji je bolestan, poželjno od bolesti koja je povezana sa ekspresijom CLDN6, poželjno tumorogene bolesti, kao što je kancer.

[0133] Termin "adjuvans" odnosi se na jedinjenje koje produžava ili pojačava ili ubrzava imunski odgovor. Kompozicije predmetnog pronalaska poželjno ispoljavaju svoj efekat bez dodavanja adjuvansa. Ipak, kompozicije predmetne prijave mogu sadržati neki od poznatih adjuvanasa. Adjuvansi pripadaju heterogenoj grupi jedinjenja, kao što su uljanje emulzije (na primer Freundov adjuvans), mineralna jedinjenja (kao što je aluminijum), bakterijske proizvode (kao što je Bordetella pertussis toxin), lipozome i imunostimulirajuće komplekse. Primeri adjivanasa su monofosforil-lipid-A (MPL SmithKline Beecham). Saponini, kao što je QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33739), QS7, QS17, QS18, i QS-L1 (So i sar., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), nekompletni Freundov adjuvans, kompletni Freundov adjuvans, vitamin E, montanid, aluminijum, CpG oligonukleotidi (Krieg et al., 1995, Nature 374: 546-549), i različite emulzije voda-u-ulju, koje se pripremaju od biološki degradabilnih ulja, kao što je skvalen ili tokoferol.

[0134] Saglasno predmetnom otkriću, uzorak može biti bilo koji uzorak u skladu sa predmetnim pronalaskom, naročito, biološki uzorak kao što je uzorak tkiva, uključujući telesne tečnosti i/ili ćelijski uzorak i može se dobiti na uobičajeni način, kao što je biopsija tkiva, uključujući isecanje ili uzimanje krvi, bronhijalnog aspirata, pljuvačke, urina, fecesa ili drugih telesnih tečnosti. Saglasno pronalasku, termin “biološki uzorak” takođe obuhvata frakcije bioloških uzoraka.

[0135] Termin "antitelo" odnosi se na glikoprotein koji se sastoji od najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, međusobno povezana disulfidnim vezama, i obuhvata molekule koji sadrže antigen-vezujući domen. Termin “antitelo” obuhvata monoklonska antitela i njihove fragmente i derivate, uključujući bez ograničenja, monoklonska antitela humanog porekla, humanizovana monoklonska antitela, himerna monoklonska antitela, jednolančana antitela, na primer, scFv’s i antigen-vezujući fragment antitela, kao što su Fab i Fab’ fragmenti, a takođe obuhvata sve rekombinantne forme antitela, na primer, antitela eksprimirana u prokariotima, neglikozilovana antitela i svaki antigen-vezujući fragment i njihove derivate. Svaki od dva teška lanca sadrži varijabilni region teškog lanca (skraćena oznaka VH) i konstantni region. Svaki od dva laka lanca sadrži varijabilni region lakog lanca (skraćeno VL) i konstantni region lakog lanca. VH i VL regioni mogu se dalje podeliti u subregione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost (CDR), koji su smešteni između regiona nešto veće konzerviranosti, koji nose oznaku okvirni regioni (FR). Svaki VH i VL sadrži tri CDR i četiri FR sekvence, poređane, počev od amino terminusa ka karboksi terminusu sledećim redosledom: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujuće domene koji stupaju u interakciju sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu učestvovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući i za različite ćelije imunskog sistema (na primer, efektorske ćelije) i za prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.

[0136] Kao što je ovde korišćen, izraz "najmanje jedna od CDR sekvenci" pre svega znači najmanje CDR3 sekvenca. Izraz "CDR sekvence lanca antitela" pre svega se odnosi na CDR1, CDR2 i CDR3 teškog lanca ili lakog lanca antitela.

[0137] Kao što je ovde korišćen, pozivanje na lanac antitela koji sadrži određenu CDR sekvencu, kao što je konkretna CDR3 sekvenca znači da konkretna CDR sekvenca formira CDR region, kao što je CDR3 region naznačenog lanca antitela, odnosno, CDR region se sastoji od naznačene CDR sekvence, ili da formira deo CDR regiona, kao što je CDR3 region naznačenog lanca antitela, tj., CDR region sadrži specifičnu CDR sekvencu.

[0138] Ukoliko se u skladu sa pronalaskom pominje lanac antitela koje sadrži specifični teški lanac antitela i/ili specifični laki lanac antitela, kao što je lanac koji sadrži određene CDR sekvence, poželjno je da su i teški lanac i/ili laki lanac ili oba lanca sačinjena od određenog teškog lanca antitela i određenog lakog lanca antitela.

[0139] Termin "humanizovano antitelo" odnosi se na molekul koji poseduje antigen vezujuće mesto, koje suštinski potiče od imunoglobulina neke vrste koja nije čovek, naznačeno time da se ostatak strukture imunoglobulinskog molekula zasniva na strukturi ili sekvenci humanog imunoglobulina. Antigen-vezujuće mesto može sadržati kompletne varijabilne domene fuzionisane u konstantne domene ili može sadržati samo regione koji određuju komplementarnost (CDR) umetnute između odgovarajućih okvirnih regiona varijabilnih domena. Antigen-vezujuća mesta mogu biti kao kod divljeg tipa ili modifikovana sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija, na primer, modifikovana tako da više liče na humane imunoglobuline. Neke vrste humanizovanih antitela zadržavaju sve CDR sekvence (na primer, humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDR sekvenci mišjeg antitela). Drugi oblici humanizovanih antitela mogu imati jednu ili više CDR sekvenci, koje su izmenjene u odnosu na originalno antitelo.

[0140] Termin "himerno antitelo" odnosi se na antitela, naznačena time da je deo aminokiselinske sekvence teškog i lakog lanca homolog odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim od određene vrste ili određene klase antitela, dok je preostali segment lanca homolog odgovarajućoj sekvenci iz druge vrste. Tipično, varijabilni regioni lakog i teškog lanca imitiraju varijabilne regione antitela jedne vrste sisara, dok su konstantni delovi homologi sekvencama antitela iz druge vrste. Značajna prednost ovakvih himernih formi je da se varijabilni region može jednostavno dobiti iz poznatog izvora primenom dostupnih B-ćelija ili hibridoma u organizmima domaćina ne-humanih vrsta u kombinaciji sa konstantnim regionima koji se dobijaju iz ćelijskih preparata humanog porekla. Na ovaj način lako se dobija varijabilni region antitela, na čiju specifičnost ne utiče poreklo, a imajući u vidu činjenicu da je konstantni region humanog porekla, manja je verovatnoća izazivanja imunskog odgovora, u odnosu na antitelo kod kojeg su i konstantni i varijabilni regioni nehumanog porekla. Međutim, definicija nije ograničena na ovaj određeni primer.

[0141] Termin "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "vezujući deo"), u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost da se specifično vežu za antigen. Pokazano je da antigen-vezujuću funkciju antitela može da obavlja i fragment pune dužine antitela. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih terminom “antigen-vezujući deo” antitela obuhvataju (i) Fab fragmente, monovalentne fragmente koji sadrže VL, VH, CL i CH domene; (ii) F(ab’)2 fragmente, bivalentne fragmente, koji sadrže dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom na zglobnom regionu; (iii) Fd fragmente, koji sadrže VH i CH domene; (iv) Fv fragmente, koji sadrže VL i VH domene jednog kraka antitela; (v) dAb fragmente (Ward i sar. (1989) Nature 341: 544-546), koji sadrže VH domen; (vi) izolovane regione koji određuju komplementarnost (CDR), i (vii) kombinaciju dve ili više izolovane CDR sekvence, koje izborno mogu biti spojene nekim sintetičkim linkerom. Dalje, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirana različitim genima, mogu se spojiti primenom rekombinantnih postupaka, posredstvom sintetičkog linkera, koji im omogućava da formirju jedan proteinski lanac, u kojem su VL i VH regioni spojeni, tako da formiraju monovalentni molekul (poznat pod imenom jednolančani Fv (scFv); videti, na primer, Bird i sar. (1988) Science 242:423-426; i Huston i sar. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883). Ovakva jednolančana antitela mogu se obuhvatiti pod terminom “antigen-vezujući deo” antitela. Ostali primeri fuzija koje obuhvataju vezujući domen imunoglobulina obuhvataju (i) vezujući domen polipeptida koji je fuzionisan sa zglobnim regionom imunoglobulinskog polipeptida, (ii) CH2 konstatni region teškog lanca imunoglobulina, fuzionisan sa spojnim regionom, i (iii) CH3 konstantni region teškog lanca, fuzionisan sa konstantnim CH2 regionom. Polipeptid sa vezujućim domenom može biti varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. Fuzioni vezujući polipeptidi opisani su u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela dobijeni su primenom poznatih konvencionalnih postupaka, a sposobnost i funkcionalne odlike fragmenata testiraju se na isti način kao i karakteristike celih antitela.

[0142] Termin "epitop" označava antigenu determinantu molekula, odnosno, deo molekula koji je prepoznat od strane imunskog sistema, na primer, onaj deo koji prepoznaje antitelo. Epitopi su diskretna, trodimenzionalna mesta na antigenu, koja prepoznaje imunski sistem. U kontekstu predmetnog pronalaska, epitop je poželjno deo CLDN proteina. Epitopi najčešće sadrže hemijski aktivne grupe molekula, kao što su aminokiseline i lanci ugljenih hidrata i uobičajeno poseduju specifične trodimenzionalne karakteristike, kao i specifino naeletrisanje. Konformacioni i ne-konformacioni epitopi razlikuju se u smislu da se vezivanje prvog, ali ne i drugog, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Epitop proteina kao što je CLDN poželjno sadrži kontinualni ili diskontinualni deo naznačenog proteina i poželjno je dužine između 5 i 100, poželjno 5 i 50, još poželjnije 8 i 30, najpoželjnije 10 do 25 aminokiselina, na primer, epitop može biti sastavljen od 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 aminokiselina.

[0143] Termin "diskontinualni epitop", u značenju koje je ovde primenjeno, označava konformacioni epitop na proteinu antigena, koji se sastoji od najmanje dva odvojena regiona primarne sekvence proteina.

[0144] Termin "bispecifični molekul" označava neki agens, na primer, protein, peptid, ili proteinski ili peptidni kompleks, koji poseduje dve različite vezujuće specifičnosti. Na primer, molekul se može vezati ili stupiti u interakciju sa (a) površinskim ćelijskim antigenom, i (b) Fc receptorom na membrani efektorske ćelije. Termin “multispecifičan molekul” ili “heterospecifičan molekul” treba da označi neki agens, na primer, protein, peptid, ili proteinski ili peptidni kompleks, koji poseduje dve ili više različitih vezujućih specifičnosti. Na primer, molekul se može vezati ili stupati u interakciju sa (a) antigenom na ćelijskoj membrani, (b) sa Fc receptorom na membrani efektorske ćelije, i sa (c) najmanje još jednom komponentom. Stoga, pronalazak obuhvata, bez ograničenja, bispecifične, trispecifične, tetraspecifične i druge multispecifične molekule usmerene protiv CLDN6 i drugih ciljnih molekula, kao što su Fc receptori na efektorskim ćelijama. Izraz “bispecifično antitelo” takođe obuhvata dijatela. Dijatela su bivalentna, bispecifična antitela, u kojima su VH i VL domeni eksprimirani na jednom polipeptidonom lancu, pomoću linkera koji je dovoljno kratak da onemogući sparivanje između dva domena istog lanca, zbog čega se domeni sparuju sa komplementarnim domenima drugog lanca i tako kreiraju dva antigen-vezujuća mesta (videti, na primer, Holliger, P., i sar. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., i sar. (1994) Structure 2: 1121-1123).

[0145] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "heteroantitela" odnosi se na dva ili više antitela, na njihove derivate ili antigen-vezujuće regione spojene ujedno; od kojih najmanje dva poseduju različite specifičnosti vezivanja. Ove različite specifičnosti obuhvataju vezivne specifičnosti za Fc receptor na efektorskoj ćeliji i vezujuću specifičnost za antigen ili epitop na ciljnoj ćeliji, na primer, na tumorskoj ćeliji.

[0146] Antitela opisana ovde mogu biti antitela humanog porekla. Termin “antitela humanog porekla”, u značenju koje je ovde primenjeno, obuhvata antitela sa varijabilnim i konstatnim regionima koja su dobijena primenom imunoglobulinske sekvence karakteristične za ljudsku vrstu. Antitela preklom od čoveka opisana ovde mogu da obuhvate aminokiselinske sekvence koje nisu kodirane imunoglobulinskom sekvencom specifičnom za čoveka (na primer, mutacije uvedene nasumičnom ili usmerenom mutagenezom in vitro ili somatskim mutacijama in vivo).

[0147] Izraz “monoklonsko antitelo” u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na dobijanje molekula antitela jedinstvene molekulske kompozicije. Monoklonsko antitelo ispoljava jednu vezujuću specifičnost i afinitet prema jednom epitopu. U jednom primeru izvođenja, monoklonska antitela se dobijena u hibridomu, koji obuhvata B ćeliju iz vrste koja nije čovek, na primer, miš, koja je fuzionisana sa nekom imortalizovanom ćelijom.

[0148] Termin “rekombinantno antitelo”, u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na sva antitela koja su dobijena, eksprimirana, kreirana ili izolovana rekombinantnim tehnikama, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (na primer, miša), koji je transgen ili transhromozomalan u pogledu imunoglobulinskih gena ili hibridoma koji su od njih dobijeni; (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina koja je transformisana tako da eksprimira antitela, na primer iz transfektoma; (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke antitela, i (d) antitela dobijena, eksprimirana, kreirana ili izolovana na bilo koji drugi način, koji obuhvata isecanje sekvence gena za imunoglobuline od ostatka DNK.

[0149] Termin "transfektom", u značenju koje je ovde primenjeno, obuhvata rekombinantnu eukariotsku ćeliju domaćina koja eksprimira antitelo, kao što su CHO ćelije, NS/O ćelije, HEK239T ćelije, biljne ćelije, ili gljive, uključujući i kvasce.

[0150] U značenju koje je ovde primenjeno, "heterologno antitelo" se definiše u vezi sa transgenim organizmom koji proizvodi ovo antitelo. Termin se odnosi na antitelo koje poseduje aminko-kiselinsku sekvencu ili kodirajuću nukleotidnu sekvencu koja odgovara odgovarajućoj sekvenci tog organizma koje ne sadrži transgeni organizam, i koji načelno nastaje od vrste koja nije transgeni organizam.

[0151] U značenju koje je ovde primenjeno, "heterohibridno antitelo" odnosi se na antitelo koje poseduje lake i teške lance poreklom iz različitih organizama. Na primer, antitelo sastavljeno od teških lanaca poreklom iz čoveka, i lakih lanaca poreklom iz miša, predstavlja heterohibridno antitelo.

[0152] Opis uključuje sva antitela i njihove derivate, kao što je opisano, a koja su za potrebe ove specifikacije obuhvaćena terminom “antitelo”. Termin “derivati antitela” odnosi se na svaku modifikovanu formu antitela, na primer, konjugat antitela ili drugi agens ili antitelo ili fragment antitela.

[0153] Poželjno je da su antitela opisana predmetnim pronalaskom izolovana. “Izolovano antitelo” u značenju koje je ovde primenjeno, označava antitelo koje je suštinski slobodno od drugih antitela koja ispoljavaju različitu antigenu specifičnost (na primer, izolovano antitelo koje specifično vezuje CLDN6 je suštinski slobodno od antitela koja specifično vezuju antigene koji su različiti od CLDN6). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu humanog CLDN6 može, međutim, unakrsno reagovati sa drugim sličnim antigenima, na primer, iz druge vrste (na primer, CLDN6 homolog). Štaviše, izolovano antitelo može biti suštinski slobodno od drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. U jednom primeru izvođenja pronalaska, kombinacija “izolovanih” monoklonskih antitela odnosi se na antitela koja imaju različite specifičnosti i koja se kombinuju u definisanu kompoziciju.

[0154] Saglasno predmetnom otkriću, antitelo je sposobno da se veže za unapred određeni ciljni antigen, ukoliko ima značajan afinitet prema tom unapred određenom antigenu i vezuje za naznačeni antigen u standardnom testu kao što su ovde opisani testovi. Poželjno, antitelo je sposobno da se veže za ciljni antigen ukoliko se merljivo vezuje za naznačeni ciljni antigen u testu protočne citometrije (FACS analiza), naznačeno time da određuje vezivanje antitela za ciljni antigen eksprimiran na membrani intaktnih ćelija. Poželjno, antitelo se merljivo vezuje za ciljni antigen ukoliko je prisutno u koncentraciji od 10 µg/ml ili nižoj, 5 µg/ml ili nižoj i 2 µg/ml ili nižoj. Poželjno, antitelo se merljivo vezuje za ciljni antigen kada je prisutan u koncentraciji od 50 nM ili niže, 30 nM ili niže ili 15 nM ili niže. “Afinitet” ili “značajan afinitet” izražava se ravnotežnom konstantom disocijacije (KD). Termin “značajan afinitet” odnosi se na vezivanje za predeterminisani ciljni antigen sa konstantom disocijacije (KD) of 10-5 M ili niže, 10<-6>M ili niže, 10<-7>M ili niže, 10<-8>M ili niže, 10<-9>M ili niže, 10<-10>M ili niže, 10-11 M ili niže i 10<-12>M ili niže. Antitela prema predmetnom pronalasku poželjno imaju EC50 vrednosti za vezivanje CLDN6 od 6500 ng/ml ili niže, 3000 ng/ml ili niže, 2500 ng/ml ili niže, 2000 ng/ml ili niže, 1500 ng/ml ili niže, 1000 ng/ml ili niže, 500 ng/ml ili niže, 400 ng/ml ili niže, 300 ng/ml ili niže, 200 ng/ml ili niže ili 100 ng/ml ili niže.

[0155] Antitelo nije (suštinski) sposobno da se veže za ciljni antigen ukoliko nema značajan afinitet prema naznačenom ciljnom mestu i kada se ne vezuje značajno za to ciljno mesto u standardnom testu. Poželjno, antitelo nije (suštinski) sposobno da se veže za ciljni antigen ukoliko se merljivo ne veže za naznačenu metu u testu protočne analize (FACS analiza), kada se određuje afinitet vezivanja antitela za pomenuti ciljni antigen eksprimiran na membrani ciljne ćelije. Poželjno, antitelo se ne vezuje u detektabilnoj meri za naznačeni ciljni antigen ukoliko je prisutno u koncentraciji do 2 µg/ml, poželjno do 5 µg/ml, poželjno do 10 µg/ml, poželjno do 20 µg/ml, još poželjnije do 50 µg/ml, i naročito do 100 µg/ml ili do 150 µg/ml ili do 200 µg/ml ili i više. Poželjno, antitelo se ne vezuje u detektabilnom smislu za ciljni antigen kada je prisutan u koncentraciji do 15 nM, poželjno do 30 nM, poželjno do 50 nM, poželjno do 100 nM, poželjnije do 150 nM, ili do 170 nM, do 300 nM, do 600 nM, do 1000 nM do 1300 nM i više. Poželjno, antitelo se ne vezuje detektabilno za naznačeni ciljni antigen ukoliko je prisutno u koncentraciji koja zasićuje vezivanje za ciljno mesto za koju se antitelo vezuje, odnosno, za CLDN6. Poželjno, antitelo nema značajan afinitet za ciljni antigen ukoliko se vezuje za naznačenu metu sa KDkoja je najmanje 10 puta, 100 puta, 103 puta, 104 puta, 105 puta ili 106 puta veća od KDza vezivanje antitela za predeterminisani ciljni antigen za koji je antitelo sposobno da se veže. Na primer, ukoliko KDza vezivanje ciljne sekvence prema kojoj antitelo ima značajan afinitet iznosi 10<-7>M, onda će KDza vezivanje za ciljnu sekvencu za koju antitelo nema značajan afinitet biti najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10-2 ili 10-1 M.

[0156] Antitelo je specifično za predodređeno ciljno mesto vezivanja ukoliko je sposobno da se veže za naznačenu predodređeno ciljno mesto, a nije sposobno da se veže za druge ciljne sekvence, odnosno, nema značajan afinitet za druge ciljne sekvence u standardnom testu. Prema ovom otkriću, antitelo je specifično za CLDN6, ukoliko je sposobno da se veže za CLDN6, a nije sposobno da se veže za druge ciljne sekvence, naročito za klaudinske proteine, izuzev CLDN6, kao što su CLDN9, CLDN4, CLDN3 i CLDN1. Poželjno, antitelo je specifično za CLDN6, ukoliko afinitet za vezivanje za klaudinske proteine, izuzev za CLDN6, kao što su CLDN9, CLDN4, CLDN3 i CLDN1, ne prevazilazi značajno afinitet za vezivanje za klaudinu nesrodne proteine, kao što je na primer, goveđi serum albumin (BSA), kazein, humani serum albumin (HAS) ili ne-klaudinske transmembranske proteine, kao što su MHC molekuli ili transferinski receptor ili za bilo koji drugi specifični polipeptid. Poželjno, antitelo je specifično za predodređeni ciljni molekul ukoliko se vezuje za naznačeni ciljni molekul sa KDkoja je najmanje 10 puta, 100 puta, 103 puta, 104 puta, 105 puta ili 106 puta niža od KDza vezivanje za ciljnu sekvencu za koju antitelo nije specifično. Na primer, ukoliko KDza vezivanje antitela za ciljnu sekvencu za koju je antitelo specifično iznosi 10<-7>M, onda KDza vezivanje za ciljnu sekvencu za koju antitelo nije specifično treba da bude najmanje 10<-6>M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M, 10-2 M ili 10-1 M.

[0157] Vezivanje antitela za ciljnu sekvencu može se odrediti eksperimentalno, primenom pogodnih postupaka; videti na primer, Berzofsky i sar. "Antibody-Antigen Interactions" u Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman i Company New York, N Y (1992), i postupke koju su u njima opisani. Afinitet se može lako odrediti primenom konvencionalnih postupaka, kao što je ravnotežna dijaliza; primenom BIAcore 2000 instrumenta, primenom opštih postupaka opisanih kod proizvođača; primenom radioimunoeseja uz upotrebu radio-obeleženih ciljnih antigena; ili drugim postupcima poznatim u stanju tehnike. Podaci o afinitetu mogu se analizirati, na primer, postupkom Scatchard i sar., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). Izmereni afinitet određene interakcije antigen-antitelo, može se razlikovati ukoliko se meri pod različitim uslovima, na primer, koncentracije soli, pH. Dakle, merenje afinitet i drugih antigen-antitelo parametara, na primer, KD, IC50 poželjno se sprovode u standardizovanim rastvorima antitela i antigena i u standardizovanim puferima.

[0158] Jedinstvena osobina antitela predmetnog pronalaska jeste sposobnost da se veže za membranski klaudin 6.

[0159] Vezivanje monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju klaudine može se testirati primenom protočne citometrije. Ukratko, ćelijske linije koje eksprimiraju membranski asocirane klaudine (rast pod standardnim uslovima), mešaju se u prisustvu različitih koncentracija antitela u PBS, koji sadrži 2% toplotno inaktivirani FCS i 0.1% NaN3na 4°C tokom 30 min. Nakon ispiranja, ćelije reaguju sa fluorescentno obeleženim sekundarnima antitelom pod istim uslovima, kao i kod vezivanja primarnog antitela. Uzorci se mogu analizirati FACS analizom, uz svetlo raspršeno pod pravim uglom na pojedinačne ćelije, čime se određuje vezivanje obeleženog antitela.

[0160] Termin "vezivanje", saglasno predmetnom pronalasku, pre svega se odnosi na specifično vezivanje, kao što je opisano.

[0161] U značenju koje je ovde primenjeno, “izotip” se odnosi na klasu antitela (na primer, IgM ili IgG1) koje je kodirano genima za konstantne regione teškog lanca.

[0162] U značenju koje je ovde primenjeno, “izotipska izmena” odnosi se na fenomen promene klase ili izotipa antitela od jedne Ig klase u drugu Ig klasu.

[0163] Termin “prirodno postojeći” u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmima (uključujući viruse), koja se može izolovati iz prirodnog izvora i koja nije namerno izmenjena od strane ljudi u laboratoriji, prirodno je postojeća sekvenca.

[0164] Izraz “rearanžiran” u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na konfiguraciju teškog lanca ili lakog lanca imunoglobulinskog lokusa, takvu da je V segment pozicioniran neposredno pored D-J ili je J segment u konformaciji koja suštinski kodira kompletni VH, odnosno, VL domen. Rearanžirani lokus gena za imunoglobulin (antitelo) može se identifikovati upoređivanjem DNK germinativne linije; rearanžirani lokus će imati najmanje jedan rekombinovani heptamer/nonamer homologi element.

[0165] Termin “preuređeni” ili "konfiguracija germinativne linije”, u značenju koje je ovde primenjeno u odnosu na V segment, odnosi se na konfiguraciju u kojoj V segment nije rekombinovan, pa se stoga nalazi neposredno uz D ili J segment.

[0166] Termin “molekul nukleinske kiseline” u značenju koje je ovde primenjeno, obuhvata molekule DNK i molekule RNK. Molekul nukleinske kiseline može biti jednolančani ili dvolančani, ali je poželjno dvolančani DNK molekul. Molekul nukleinske kiseline može se primeniti za uvođenje u, na primer, transfekciju ćelija, na primer, u formi RNK koja se priprema in vitro transkripcijom od DNK matrice. RNK se može modifikovati pre aplikacije, stabilizacijom sekvence, modifikacijom tipa “capping” i poliadenilacijom.

[0167] Nukleinske kiseline opisane predmetnim pronalaskom poželjno su izolovane. Termin “izolovana nukleinska kiselina” označava da je nukleinska kiselina, saglasno pronalasku, (i) umnožena in vitro, na primer postupkom lančane reakcije polimeraze (PCR), (ii) rekombinantno proizvedena kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer, razdvajanjem i gelelektroforetskim frakcionisanjem ili (iv) sintetisana, na primer, hemijskom sintezom. Izolovana nukleinska kiselina je nukleinska kiselina koja je dostupna za manipulaciju rekombinantnim DNK tehnikama.

[0168] Nukleinska kiselina može biti prisutna sama ili u kombinaciji sa drugim nukleinskim kiselinama, koje mogu biti homologe ili heterologe. U poželjnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je funkcionalno povezana za ekspresionu kontrolnu sekvencu, koja može biti homologa ili heterologa u odnosu na naznačenu nukleinsku kiselinu, naznačeno time da termin “homologna” označava nukleinsku kiselinu koja je prirodno vezana za ekspresionu kontrolnu sekvencu, dok “heterologna” znači da nukleinska kiselina nije prirodno funkcionalno povezana za ekspresionu kontrolnu sekvencu.

[0169] Nukleinska kiselina, na primer, nukleinska kiselina koja eksprimira iRNK i/ili protein ili peptid i neka ekspresiona kontrolna sekvenca, “funkcionalno” su povezane jedna sa drugom, ukoliko su međusobno kovalentno vezane tako da su ekspresija ili transkripcija te nukleinske kiseline pod kontrolom ili pod uticajem naznačene kontrolne sekvence. Ukoliko se nukleinska kiselina translatira u funkcionalni protein, i ako je ekspresiona kontrolna sekvenca funkcionalno povezana sa kodirajućom sekvencom, onda indukcija naznačene ekspresione kontrolne sekvence dovodi do transkripcije naznačene nukleinske kiseline, bez promene okvira čitanja u kodirajućoj sekvenci ili mogućnosti da kodirajuća sekvenca nije sposobna da se translatira u željeni protein ili peptid.

[0170] U značenju koje je ovde primenjeno, termin "ekspresiona kontrolna sekvenca" obuhvata promotore, ribozome, vezujuća mesta, pojačivače i druge kontrolne elemente koji regulišu transkripciju gena ili translaciju iRNK. U naročitom primeru izvođenja, ekspresiona kontrolna sekvenca može biti regulisana. Tačna struktura ekspresione kontrolne sekvence može varirati kod različitih vrsta ili tipova ćelija, ali ona generalno sadrži 5ˈ-netranskribovane i 5ˈ- i 3ˈ-ne-translatirane sekvence koje su uključene u inicijaciju transkripcije i translacije, kao što su na primer, TATA blok, capping sekvence i CAAT sekvence. Specifičnije, 5ˈ-ne-transkribujuće ekspresione kontrolne sekvence obuhvataju promotorski region koji obuhvata promotorsku sekvencu za kontrolu transkripcije i funkcionalno povezanu nukleinsku kiselinu. Ekspresiona kontrolna sekvenca može sadržati pojačivačku sekvencu ili uzvodnu aktivatorsku sekvencu.

[0171] U značenju koje je ovde primenjeno, “promotor” ili “promotorski region” odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja se nalazi uzvodno (5ˈ) od sekvence nukleinske kiseline koja se eksprimira i koja kontroliše ekspresiju te sekvence, obezbeđujući prepoznavanje i mesto vezivanja za RNK-polimerazu. “Promotorski region” može da obuhvati dodatna mesta prepoznavanja i vezivanja za druge faktore koji su uključeni u regulaciju transkripcije gena. Promotor može da kontroliše transkripciju prokariotskog ili eukariotskog gena. Takođe, promotor može biti “inducibilan” i može inicirati transkripciju usled delovanja indukcionog agensa ili može biti “konstitutivan”, ako transkripcija nije pod kontrolom indukujućeg agensa. Gen koji je pod kontrolom inducibilnog promotora ne eksprimira ili se eksprimira u maloj meri kada je indukcioni agens odsutan. U prisustvu indukcionog agensa, gen se uključuje, odnosno, nivo transkripcije se uvećava. Ova promena uslovljena je vezivanjem specifičnog transkripcionog faktora.

[0172] Poželjni promotori obuhvataju promotore za SP6, T3 i T7 polimerazu, humani U6 RNA promotor, CMV promotor, kao i njihove veštačke hibridne promotore (na pr. CMV), gde su deo ili delovi fuzionisani sa delom ili delovima promotora gena drugih ćelijskih proteina, kao što je na primer humani GAPDH (gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza), i uključujući ili ne uključujući dodatne introne.

[0173] Saglasno predmetnom otkriću, termin "ekspresija" koristi se u svom najopštijem značenju i označava produkciju RNK ili RNK i proteina/peptida. Termin takođe obuhvata delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Dalje, ekspresija može biti prolazna ili stabilna. Saglasno otkriću, termin ekspresija takođe podrazumeva “aberantnu ekspresiju” ili “abnormalnu ekspresiju”.

[0174] "Aberantna ekspresija" ili "abnormalna ekspresija" označava, saglasno predmetnom pronalasku, izmenjenu ekspresiju, pre svega povećanu ekspresiju u poređenju sa referentnom vrednošću, a pre svega u poređenju sa stanjem ne-tumorogene, normalne ćelije ili zdravog organizma. Povećanje ekspresije predstavlja povećanje od najmanje 10%, a poželjno, najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%. U jednom primeru izvođenja, ekspresija postoji samo u bolesnom tkivu, dok je u zdravom tkivu ekspresija potpuno sprečena.

[0174] U poželjnom primeru izvođenja, molekul nukleinske kiseline, saglasno predmetnom pronalasku, predstavlja vektor koji kontroliše ekspresiju nukleinske kiseline. Termin “vektor” ovde se koristi u svom najopštijem značenju, i označava prelazni nosač nukleinske kiseline, koji omogućava naznačenoj nukleinskoj kiselini da se uvede u prokariotsku i/ili eukariotsku ćeliju, i, kada je potrebno, da se integriše u genom ćelije domaćina. Poželjno je da se ovakav vektor replicira i/ili eksprimira u ćeliji. Vektori obuhvataju plazmide, fagemide, bakteriofage i virusni genom. Termin “plazmid” u značenju koje je ovde primenjeno, označava konstrukt ekstrahromozomskog genetičkog materijala, obično cirkularni dvolančani DNK molekul, koji se može replicirati nezavisno od hromozomske DNK.

[0175] Kao vektor za ekspresiju antitela može se koristiti ili tip vektora u kojem se teški i laki lanac antitela nalaze u različitim vektorima ili tip vektora u kojem su teški i laki lanac prisutni u istom vektoru.

[0176] U vezi sa specifičnim sekvencama nukleinskih kiselina i aminokiselina predmetnog pronalaska, kao što su, na primer, one date u listama sekvenci, sekvence se odnose na modifikacije, odnosno, varijante naznačenih specifičnih sekvenci, što uslovljava sekvence koje su funkcionalno ekvivalentne naznačenim specifičnim sekvencama, na primer, aminokiselinska sekvenca koja ispoljava svojstva identična ili slična onima koje ima specifična sekvenca aminokiselina kodirana specifičnom nukleotidinom sekvencom. Jedno od važnih svojstava jeste vezivanje antitela za ciljni epitop ili održavanje efektorske funkcije antitela, kao što su CDC i/ili ADCC aktivnost. Poželjno, sekvenca modifikovana u odnosu na specifičnu sekvencu, kada se zameni specifičnu sekvencu u antitelu, zadržava vezivnu specifičnost tog antitela za ciljnu protein i poželjno, zadržava funkcije tog antitela, koje su ovde opisane.

[0177] Takođe, deo opisa koji se odnosi na specifična antitela ili hibridome za proizvodnju antitela treba tumačiti tako da se odnose na antitela okarakterisana sekvencom aminokiselina i/ili nukleotidnom sekvencom koja je modifikovana u odnosu na aminokiselinsku sekvencu i/ili sekvencu nukleinske kiseline specifičnog antitela, ali je u funkcionalnom smislu ekvivalentna. Jedno važno svojstvo je zadržavanje sposobnosti vezivanja antitela za ciljni epitop ili zadržavanje efektorskih funkcija antitela. Poželjno, kada je sekvenca modifikovana u odnosu na specifičnu sekvencu, zamenjuje tu specifičnu specifičnu sekvencu u molekulu, ona zadržava vezujuću specifičnost naznačenog antitela prema ciljnom epitopu i poželjno, zadržava funkcije naznačenog antitela, na primer, CDC-posredovanu lizu ili ADCC-posredovanu lizu.

[0178] Stručnjaci znaju da se određene sekvence CDR, hipervarijabilnog ili varijabilnog regiona mogu modifikovati bez gubitka sposobnosti vezivanja za ciljni epitop. Na primer, CDR regioni će biti ili identični ili visoko homologi regionima antitela koja su ovde specifikovana. Pod “visoko homologim” se podrazumeva od 1 do 5, poželjno 1 do 4, na primer, 1 do 3 ili 1 ili 2 supstitucije unutar CDR regiona. Takođe, hipervarijabilni regioni mogu se modifikovati tako da ispolje značajnu homologiju sa regionima antitela koja su ovde opisana.

[0179] Smatraće se da opisane specifične aminokiseline takođe obuhvataju aminokiseline modifikovane zbog optimizacije upotrebe kodona u naročitom domaćinu. Razlike u upotrebi kodona među organizmima mogu dovesti do različitih problema vezanih za ekspresiju heterolognih gena. Optimizacija upotrebe kodona, promenom jednog ili više nukleotida u originalnoj sekvenci može poboljšati ekspresiju te nukleotidne sekvence, naročito može poboljšati translacionu efikasnost u homologim i heterologim domaćinima, u kojima se naznačena sekvenca eksprimira.

[0180] Saglasno predmetnom pronalasku, varijanta, derivat, modifikovana forma ili fragment sekvence nukleinske kiseline, aminokiselinske sekvence ili peptida poželjno zadržava ista funkcionalna svojstva kao i sekvenca nukleinske kiseline, aminokiselinska sekvenca ili peptid, od kojeg je nastala. Pod funkcionalnim svojstvima se podrazumevaju interakcije sa drugim molekulima, odnosno vezivanje za druge molekule. U jednom primeru izvođenja, varijanta, derivat, modifikovana forma ili fragment nukleinske kiseline, aminokiselinske sekvence ili peptida imunološki je ekvivalentan sekvenci nukleinske kiseline, aminokiselinskoj sekvenci ili peptidu od kojeg je nastao.

[0181] Stepen sličnosti specifične sekvence nukleinske kiseline i modifikovane sekvence nukleinske kiseline ili varijante naznačene sekvence, biće poželjno najmanje 70%, poželjno najmanje 75%, poželjnije najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90% i veoma poželjno, najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99 %. U vezi sa varijantama nukleinskih kiselina koje kodiraju CLDN6, nivo identičnosti je najmanje 300, najmanje oko 400, najmanje oko 450, najmanje oko 500, najmanje oko 550, najmanje oko 600 ili najmanje oko 630 nukleotida. U poželjnim primerima izvođenja, stepen identičnosti dat je za punu dužinu referentne sekvence nukleinske kiseline, kao što su sekvence date u listingu sekvenci. Poželjno, dve sekvence su sposobne da hibridizuju i formiraju stabilan dvolančani molekul, pri čemu se hibridizacija poželjno sprovodi pod uslovima koji dozvoljavaju specifičnu hibridizaciju između polinukleotida (pod strogim uslovima). Strogi uslovi opisani su, na primer, u Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook i sar., Editors, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989 ili Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel i sar., Editors, John Wiley & Sons, Inc., New York i odnose se na primer, na hibridizaciju na 65°C u puferu za hibridizaciju (3.5 × SSC, 0.02% Ficoll, 0.02% polivinilpirolidon, 0.02% goveđi serum albumin, 2.5 mM NaH2PO4(pH 7), 0.5% SDS, 2 mM EDTA). SSC je 0.15 M NaCl/0.15 M Na-citrat, pH 7. Nakon hibridizacije, membrane sa transferiranom DNK ispiraju se u 2 × SSC na sobnoj temperaturi, a zatim u 0.1-0.5 × SSC/0.1 ×SDS na temperaturi do 68°C.

[0182] Termin "varijanta", saglasno predmetnom pronalasku, takođe obuhvata mutante, varijante nastale različitim isecanjem, konformacione varijante, izoforme, alelske varijante, varijante specifične za vrstu, homologe specifične za vrstu i naročito prirodno postojeće varijante. Alelska varijanta se odnosi na promenu normalne sekvence gena, čiji značaj ne mora uvek biti očigledan. Sekvenciranje kompletne genske sekvence obično otkrije brojne alelske varijante datog gena. Homolog za vrstu je sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiselinska sekvenca koja potiče iz drugačije vrste od one iz koje potiče data nukleinska kiselina ili aminokiselina.

[0183] Za potrebe predmetnog pronalaska, “varijanta” aminokiselinske sekvence obuhvata insercione varijante, adicione varijante, delecione varijante i/ili supstitucione varijante. Aminokiselinske delecione varijante obuhvataju delecije na N-kraju i/ili C-kraju proteina, a označene su imenom N-terminalne i/ili C-terminalne skraćene varijante.

[0184] Aminokiselinske insercione varijante obuhvataju varijante sa insercijom jedne ili dve ili više aminokiselina u određenu aminokiselinsku sekvencu. U slučaju da aminokiselinska sekvenca ima inserciju, jedna ili više aminokiselina ugrađuju se na tačno određeno mesto te sekvence, mada su moguće i nasumične insercije sa naknadnim utvrđivanjem mesta ugrađivanja.

[0185] Aminokiselinske adicione varijante obuhvataju fuzije jedne ili više aminokiselina na amino- i/ili karboksi-terminusu, na primer, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više aminokiselina.

[0186] Aminokiselinske delecione varijante odliku se uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, na primer, uklanjanjem 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više aminokiselina. Delecije se mogu izvršiti na bilo kom mestu u proteinu.

[0187] Aminokiselinske supstitucione varijante odlikuju se uklanjanjem najmanje jednog aminokiselinskog ostatka u sekvenci i njegovom zamenom drugom aminokiselinom na istoj poziciji. Poželjno je da se modifikacije uvede na mestu u sekvenci koje nije konzervirano kod homologih proteina ili peptida i/ili da se izvrši zamena jedne aminokiseline drugom aminokiselinom sa sličnim svojstvima. Poželjno je da je zamena aminokiseline u proteinu konzervativna, što znači da je aminokiselina supstituisana aminokiselinom sa sličnim naelektrisanjem ili nenaelektrisanom aminokiselinom. Konzervativne aminokiselinske zamene obuhvataju supstitucije aminokiseline drugom aminokiselinom iz grupe koja ima sličan bočni lanac. Prirodno postojeće aminokiseline se načelno dele u četiri grupe: kisele (aspartat, glutamat), bazne (lizin, arginin, histidin), nepolarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenil-alanin, metionin, triptofan) i nenaelektrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin). Fenil-alanin, triptofan i tirozin se nekada svrstavaju u aromatične aminokiseline.

[0188] U vezi sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 37 termin varijanta se odnosi naročito na sekvencu gde je cistein na položaju 46 zamenjen drugom aminokiselinom osim cisteina kao što je aminokiselina kao što je navedeno u prethodnom tekstu, poželjno glicin, alanin, serin, treonin, valin ili leucin.

[0189] Poželjno, stepen istovetnosti, stepen sličnosti, poželjno identičnosti između aminokiselinske sekvence i modifikovane aminokiselinske sekvence ili aminokiselinske sekvence koja predstavlja varijantu naznačene specifične aminokiselinske sekvence, predstavlja suštinsku homologiju, od najmanje 70%, poželjno najmanje 80%, još poželjnije najmanje 90% i najpoželjnije 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti. Stepen sličnosti ili identičnosti odnosi se na region aminokiselinske sekvence koji čini najmanje 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90% ili 100% ukupne dužine referentne aminokiselinske sekvence. Na primer, ukoliko se referentna aminokiselinska sekvenca sastoji od 200 aminokiselina, stepen sličnosti ili identičnosti poželjno postoji za ne manje od 20, najmanje oko 40, najmanje oko 60, najmanje oko 80, najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko, ili oko 200 aminokiselina, poželjno u kontinuiranom nizu aminokiselina. Kada je reč o varijantama CLDN polipeptida, stepen sličnosti ili identičnosti obično je najmanje 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180, najmanje oko 200, najmanje oko 210 aminokiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stepen sličnosti ili identičnosti odnosi se na celokupnu dužinu referentne aminokiselinske sekvence, kao što je aminokiselinska sekvenca predstavljena u listingu sekvenci. Poravnanje za određivanje sličnosti aminokiselinske sekvence, poželjno identičnosti, može se obaviti poznatim postupcima, poželjno korišćenjem najboljeg poravnanja sekvenci, na primer, korišćenjem Align, uz standardna podešavanja, poželjno, EMBOSS::needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10.0, Gap Extend 0.5.

[0190] "Sličnost sekvence" odnosi se na procenat aminokiselina koje su ili identične ili predstavljaju konzervativne aminokiselinske supstitucije. “Identičnost sekvence” dva polipeptida ili nukleinske kiseline ukazuje na procenat aminokiselina ili nukleotida koji su identični kod obe sekvence.

[0191] “Procenat identičnosti” se dobija nakon najboljeg poravnanja, i to je čisto statistički parametar, a razlike između dve sekvence se nasumice distribuiraju ravnomerno celom dužinom sekvence. Upoređivanje dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence sprovodi se konvencionalno upoređivanjem ovih sekvenci nakon optimalnog ravnanja, pri čemu se poređenje odvija po segmentima ili po “okvirima komparacije”, kako bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sličnosti. Optimalno ravnanje sekvenci koje se upoređuju može se dobiti manuelno, kao i primenom algoritama homologije Smith i Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, posredtsvom lokalnih algoritama homologije Neddleman i Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, posredstvom metoda određivanja sličnosti Pearson i Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću kompjuterskih programa koji koriste ovakve algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA i Wisconsin Genetics Software paketu, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).

[0192] Procenat identičnosti se izračunava na osnovu određivanja broja identičnih pozicija kod dve sekvence, a zatim deljenjem tog broja ukupnim brojem pozicija koje se porede i množenjem dobijene vrednosti sa 100, kako bi se dobio procenat identičnosti dve sekvence.

[0193] "Konzervativne supstitucije," mogu se uvesti, na primer, na bazi sličnosti u polarnosti, naelektrisanju, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti, i/ili amfipatične prirode aminokiselinskog ostatka. Na primer: (a) nepolarne (hidrofobne) aminokiseline obuhvataju alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan, i metionin; (b) polarne neutralne aminokiseline obuhvataju glicin, serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin; (c) pozitivno naelektrisane (bazne) aminokiseline obuhvataju arginin, lizin i histidin; i (d) negativno naelektrisane (kisele) aminokiseline obuhvataju aspartat i glutamat. Supstitucije se obično uvode unutar grupa (a)-(d). Takođe, glicin i prolin se mogu međusobno supstitiuisati zbog svoje sposobnosti da poremete α-zavojnicu. Neke poželjne supstitucije mogu se uvesti između sledećih grupa: (i) S i T; (ii) P i G; and (iii) A, V, L i I. Imajući u vidu genetički kod, postupke rekombinantne i sintetičke DNK, iskusan naučnik lako može konstruisati DNK koja kodira konzervativnu aminokiselinsku varijantu.

[0194] Predmetni opis obuhvata antitela u kojima su izmene učinjene u Fc regionu, kako bi se promenila funkcionalna ili farmakokinetička svojstva ovih antitela. Ove promene mogu dovesti do smanjenja ili povećanja C1q vezivanja i CDC ili FcγR vezivanja i ADCC. Mogu se napraviti supstitucije jednog ili više aminokiselinskih ostataka konstantnog regiona teškog lanca, što dovodi do promena efektorne funkcije uz očuvanje sposobnosti da se veže antigen, u poređenju sa modifikovanim antitelom, cf. US 5,624,821 i US 5,648,260.

[0195] Polu-život antitela in vivo može se povećati modifikacijom epitopa receptora za rekuperaciju Ig konstantnog domena ili Ig-sličnog konstantnog domena, tako da molekul ne sadrži intaktni CH2 domen ili intaktni Fc region, cf. US 6,121,022 i US 6,194,551. Polu-život in vivo se može dodatno produžiti uvođenjem mutacija u Fc regione, na primer, supstituisanjem treonina na poziciji 252 uvođenjem leucina, supstitucijom treonina na poziciji 254 uvođenjem serina ili supstitucijom treonina na poziciji 256 uvođenjem fenilalanina, cf. US 6,277,375.

[0196] Dalje, moguće je izmeniti tip glikozilacije antitela, kako bi se promenila efektorna funkcija antitela. Na primer, antitela, se mogu eksprimirati u transfektomu koji normalno ne dodaje fukozu na aminokiselinu Asn na poziciji 297 u Fc regionu, čime se pojačava afinitet Fc regiona prema Fc-receptorima, što posledično dovodi do povećanja ADCC aktivnosti antitela u prisustsvu NK ćelija, cf. Shield i sar. (2002) JBC, 277: 26733. Takođe, moguće je uvesti modifikaciju načina galaktozilacije, kako bi se promenila aktivnost CDC.

[0197] Alternativno, u narednom primeru izvođenja, moguće je uvesti nasumične mutacije celom dužinom ili u delu kodirajuće sekvence anti-CLDN6 antitela, na primer, saturacionom mutagenezom, a rezultujuća modifikovana anti-CLDN6 antitela, mogu se ispitati vezano za njihovu vezujuću aktivnost.

Saglasno pronalasku, termin “ćelija” ili “ćelija domaćin” pre svega se odnosi na intaktnu ćeliju, na primer, na ćeliju sa intaktnom ćelijskom membranom, koja ne oslobađa unutarćelijske komponente, kao što su enzimi, organele ili genetički materijal. Intaktna ćelija je poželjno živa ćelija, to jest živa ćelija sposobna da sprovodi normalne metaboličke funkcije. Pomenuti termin se odnosi na svaku ćeliju koja se može transformisati ili transfektovati egzogenom nukleinskom kiselinom. Termin “ćelija”, saglasno pronalasku, obuhvata prokariotske ćelije (na primer, E. coli) ili eukariotske ćelije (na primer, dendritične ćelije, B ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, K562 ćelije, HEK293 ćelije, HeLa ćelije, kvasce i ćelije insekata). Egzogena nukleinska kiselina može se naći unutar ćelije (i) slobodno rasuta, (ii) ugrađena u rekombinantni vektor ili (iii) integrisana u genom ćelije domaćina ili u mitohondrijsku DNK. Naročito su poželjne sisarske ćelije, na primer, ćelije čoveka, miša, hrčka, svinje, koze i primata. Ćelije se mogu dobiti iz velikog broja tkiva i obuhvataju primarne ćelije i ćelijske linije. Specifični primeri obuhvataju keratinocite, leukocite periferne krvi, matične ćelije kostne srži i embionalne matične ćelije. U narednim primerima izvođenja, ćelija je antigen-prezentujuća ćelija, naročito, dendritična ćelija, monocit ili makrofag. Termin “ćelija domaćin”, u značenju koje je ovde primenjeno, poželjno se odnosi na ćeliju u koju je uveden rekombinantni ekspresioni vektor.

[0198] Ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline poželjno eksprimira peptid ili protein koji je kodiran tom nukleinskom kiselinom.

[0199] Termin "transgena životinja" odnosi se na životinju čiji genom sadrži jedan ili više transgena, poželjno transgena koji kodiraju teški i/ili laki lanac ili sadrži transhromozome (bilo integrisane ili ne-integrisane u prirodnu genomsku DNK), koji su sposobni da eksprimiraju transgene. Na primer, transgeni miš može posedovati transgen poreklom od čoveka koji kodira laki lanac antitela, ili teški lanac antitela ili može imati transhromozon čoveka sa teškim lancem, tako da takav miš proizvodi čovečja anti-CLDN6 antitela, kada se imunizuje CLDN6 antigenom i/ili ćelijama koje ga eksprimiraju. Transgen sa humanim teškim lancem može se integrisati u hromozomsku DNK miša, kao što je to slučaj sa transgenim mišom, na primer HuMAb miš, kao što je HCo7 ili HCol2 miš, ili se transgen sa humanim teškim lancem može održavati ekstrahromozomski, kao što je to kod transhromozomskog (na pr., KM) miša, koji je opisan u WO 02/43478. Ovi transgeni i transhromozomski miševi mogu biti sposobni da proizvedu više izotipova humanih monoklonskih antitela na CLDN6 (na pr. IgG, IgA i/ili IgE), ako se podvrgnu V-D-J rekombinaciji i izotipskoj izmeni.

[0200] "Redukovati" ili "inhibirati", u značenju koje je ovde primenjeno, označava sposobnost da se izazove ukupno smanjenje, poželjno od 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije 50% ili više i najpoželjnije od 75% i više, u pogledu nivoa, na primer, nivoa proliferacije ćelija. Termin "inhibirati" ili slični izrazi mogu da obuhvate potpunu ili skoro potpunu inhibiciju, odnosno, smanjenje do nule ili suštinski do nule.

[0201] Termini kao što su "povećanje" ili "pojačavanje" poželjno se odnose na povećanje ili pojačavanje od najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, još poželjnije najmanje 50%, i još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 100%. Ovi izrazi mogu da se odnose na okolnosti, naznačene time da u nultom vremenu nema merljivog signala za određeno jedinjenje ili uslov, odnosno, da se u nekom kasnijem vremenskom trenutku detektuje signal za određeno jedinjenje ili uslov.

[0202] Termin "imunološki ekvivalent" označava da imunološki ekvivalentan molekul, kao što je imunološki ekvivalentna aminokiselinska sekvenca ispoljava ista i suštinski ista imunološka svojstva i/ili ispoljava iste imunološke efekte, na primer, vezano za tip imunološkog efekta, kao što je indukcija humoralnog i/ili ćelijskog imunskog odgovora, jačinu i/ili trajanje indukovane imunske reakcije ili specifičnost indukovane imunske reakcije. U kontekstu predmetnog pronalaska, termin “imunološki ekvivalentan” pre svega se koristi u odnosu na imunološke efekte ili svojstva peptida ili peptidne varijante koja se koristi u imunizaciji. Posebno imunološko svojstvo je sposobnost da se veže za antitela, i kada je potrebno, da se generiše imunski odgovor, poželjno, stimulacijom produkcije antitela. Na primer, neka aminokiselinska sekvenca je imunološki ekvivalentna referentnoj aminokiselinskoj sekvenci, ukoliko naznačena aminokiselinska sekvenca, indukuje imunsku reakciju kada se izloži imunskom sistemu subjekta, poželjno indukuje produkciju antitela koja poseduju specifičnost reakcije u odnosu na referentnu aminokiselinsku sekvencu, kao što je referentna aminokiselinska sekvenca koja formira deo CLDN6.

Termin “imunske efektorne funkcije" u kontekstu predmetnog pronalaska, obuhavataju funkcije posredovane komponentama imunskog sistema koje dovode do inhibicije rasta tumora i/ili inhibicije razvoja tumora, kao i inhibiciju širenja tumora i metastaze. Poželjno, imunske efektorne funkcije dovode do ubijanja tumorskih ćelija. Poželjno, imunske efektorske fukcije u kontekstu predmetnog pronalaska jesu efektorske funkcije posredovane antitelom. Ove funkcije obuhvataju citotoksičnost posredovanu komplementom (CDC), citotoksičnost posredovanu antitelima (ADCC), indukciju apoptoze kod ćelija koje nose tumor-asocirane antigene, na primer, vezivanjem antitela za površinski antigen, i/ili inhibicija proliferacije ćelija koje nose tumor-asociran antigen, poželjno ADCC i/ili CDC. Dakle, antitela koja su sposobna da posreduju u jednoj ili više imunskih efektorskih funkcija sposobna su da posreduju u ubijanju ćelija indukovanjem CDC-posredovane lize, ADCC-posredovane lize, apoptoze, homotipske adhezije i/ili fagocitoze, poželjno indukovanjem CDC-posredovane lize i/ili ADCC-posredovane lize. Antitela takođe mogu ispoljiti svoj efekat jednostavnim vezivanjem za tumor-asocirani antigen na membrani tumorske ćelije. Na primer, antitela mogu blokirati funkciju tumor-asociranog antigena ili mogu indukovati apoptozu, jednostavnim vezivanjem za tumor-asocirani antigen na površini tumorske ćelije.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Mehanizam delovanja mAb

[0203] Naredni tekst razmatra mehanizan terapeutskog delovanja antitela predmetnog pronalaska, i ni na koji način ne uvodi ograničenja.

[0204] Antitela opisana predmetnim pronalaskom mogu da stupe u interakciju sa komponentama imunskog sistema, poželjno posredstvom ADCC ili CDC. Antitela predmetnog pronalaska mogu se primeniti za umanjenje sporednih efekata lečenja (na primer, radioizotopa, lekova ili toksina), za direktno uništavanje tumorskih ćelija ili u sinergističkom delovanju sa tradicionalnim hemoterapeutskim agensima, posredstvom komplementarnih mehanizama delovanja, koji obuhvataju anti-tumorski imunski odgovor, koji može biti ugrožen usled citotoksičnog delovanja hemoterapije na T limfocite. Antitela saglasno pronalasku mogu da ispolje efekat jednostavnim vezivanjem za CLDN6 na ćelijskoj membrani, blokirajući na primer, proliferaciju tih ćelija.

Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela

[0205] ADCC je citotoksična sposobnost efektorskih ćelija, naročito limfocita, koja zahteva da ciljna ćelija bude obeležena antitelom.

[0206] ADCC se odvija tek kada se antitela vežu za antigene na tumorskim ćelijama i kada Fc domen angažuje Fc receptor (FcR) na membrani imunskih efektorskih ćelija. Postoji nekoliko porodica Fc receptora koji su selektivno eksprimirani na specifičnim populacijama ćelija. ADCC je proces kojim se direktno izaziva destrukcija tumora različitog stepena, što će dovesti do prezentacije antigena i do indukcije tumor-usmerenog T-ćelijskog odgovora. Poželjno, ADCC in vivo izaziva tumor-specifičan odgovor T ćelija i humoralni odgovor ćelije domaćina.

Citotoksičnost zavisna od komplementa

[0207] CDC predstavlja drugi način ubijanja ćelija koji je posredovan antitelima. Najefikasniji izotip antitela za aktivaciju komplementa je IgM. U usmeravanju CDC-posredovane lize ćelija preko klasičnog puta aktivacije komplementa jednako su efikasni i IgG1 i IgG3 izotipovi. U ovoj kaskadi formiranje kompleksa antigen-antitelo dovodi do otkrivanja višestrukih C1q-vezujućih mesta u blizini CH2 domena molekula antitela, kao što su IgG molekuli (C1q je jedan od tri subkomponente komplementa C1). Ova otkrivena C1q vezujuća mesta pretvaraju prethodno nisko-afinitetne interakcije C1q-IgG u visoko-afinitetne interakcije, koje će inicirati kaskadu događaja koja obuhvata i druge komplementne proteine i dovodi do proteolitičkog oslobađanja hemotaksičkih agenasa efektorskih ćelija C3a i C5a. Kaskada komplementa završava se formiranjem kompleksa za napad membrane, koji uslovljava nastanak pore u ćelijskoj membrani i olakšava slobodan prolaz vode i rastvora u i van ćelije.

Proizvodnja antitela

[0208] Antitela saglasno pronalasku mogu se proizvesti različitim postupcima, uključujući konvencionalne postupke za dobijanje antitela, na primer, standardne tehnike somatske hibiridizacije po Kohler i Milstein, Nature 256: 495 (1975). Iako su poželjni oni postupci hibridizacije koji uključuju somatske ćelije, u principu je moguće primeniti druge postupke dobijanja monoklonskih antitela, na primer, virusnu ili onkogenu transformaciju B limfocita ili faga ili fagne tehnike korišćenjem biblioteka gena antitela.

[0209] Poželjna životinjska vrsta za dobijanje hibridoma koji oslobađa antitela je miš. Dobijanje mišjih hibridoma je dobro poznato u stanju tehnike. Poznati su i dobro opisani protokoli imunizacije i postupci izolacije imunizovanih splenocita za fuziju. Dobro su poznati i fuzioni partneri (na primer, mišje mijeloma ćelije), kao i postupci fuzije.

[0210] Ostale poželjne životinjske vrste za dobijanje hibridoma za proizvodnju monoklonskih antitela su pacov i zec (opisano u Spieker-Polet i sar. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), videti, takođe Rossi i sar. Am. J. Clin. Pathol.124: 295 (2005)).

[0211] U jednom poželjnom primeru izvođenja, humana monklonska antitela specifična za CLDN6 dobijaju se primenom transgenih i transhromozomskih miševa koji nose delove humanog imunskog sistema, umesto mišjeg. Ovi transgeni i transhromozomski miševi, koji obuhvataju HuMAb miš i KM sojeve miševa, zajedno se nazivaju "transgeni miševi." Dobijanje humanih antitela u transgenim životinjama može se izvesti primenom postupka opisanog za CD20 u WO2004035607.

[0212] Naredna strategija proizvodnje monoklonskih antitela podrazumeva direktno izolovanje gena koji kodiraju antitela iz limfocita koji proizvode specifična antitela, videti na primer, Babcock i sar., 1996; “A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy”. Za detalje rekombinantnog inženjerstva videti Welschof i Kraus, “Recombinant antibodes for cancer therapy”, ISBN-0-89603-918-8 i Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.

Imunizacija

[0213] U cilju dobijanja antitela na CLDN6, miševi se imunizuju peptidima dobijenim od CLDN6, koji su konjugovani sa odgovarajućim nosačima, obogaćenim preparatima rekombinantno eksprimiranog CLDN6 antigena ili njegovim fragmentima i/ili ćelijama koje eksprimiraju CLDN6 ili njegove fragmente. Alternativno, miševe je moguće imunizovati DNK sekvencom koja kodira punu dužinu humanog CLDN6 peptida ili njegov fragment. U slučaju da imunizacija prečišćenim ili obogaćenim preparatima CLDN6 antigena ne dovede do nastanka antitela, miševi se takođe mogu imunizovati ćelijama koje eksprimiraju CLDN6, na primer, ćelijskom linijom, kako bi se podstakao imunski odgovor.

[0214] Imunski odgovor se može nadgledati tokom protokola imunizacije, uzimanjem uzoraka plazme i seruma iz repne vene ili retroorbitalnim iskrvavljenjem. Miševi sa dovoljnim titrom anti-CLDN6 imunoglobulina odabiraju se za fuziju. Brzina oslobađanja antitela iz hibridoma može se podstaći intraperitonealnom ili intravenskom injekcijom ćelija koje eksprimiraju CLDN6, 3 do 5 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine.

Dobijanje hibridoma za proizvodnju monoklonskih antitela

[0215] Za dobijanje hibridoma za proizvodnju monoklonskih antitela na CLDN6, iz limfnih čvorova ili slezine imunizovanih miševa izoluju se ćelije, koje se zatim fuzionišu sa odgovarajućom imortalizovanom ćelijskom linijom, kao što je ćelijska linija mišjeg mijeloma.

Kod tako dobijenih hibridoma pretražuju se oni koji proizvode antigen-specifičnih antitela. Ispitivanje pojedinačnih hibridoma koji proizvode antitela izvodi se primenom ELISA testa. Anti-CLDN6 antitela identifikuju se imunofluorescencijom i FACS analizom ćelija koje eksprimiraju CLDN6. Hibridomi koji oslobađaju antitela ponovo se zasejavaju, ispituje se oslobađanje antitela i, ako su i dalje pozitivni na anti-CLDN6 monoklonska antitela, subkloniraju se ograničenim razblaženjem. Stabilni subklonovi se kultivišu in vitro, kako bi se dobila antitela u medijumu tkivne kulture, koja se dalje mogu isptivati.

Dobijanje transfektoma za proizvodnju antitela

[0216] Antitela predmetnog pronalaska mogu se proizvesti u transfektovanoj ćeliji domaćinu, na primer, kombinovanjem postupaka rekombinantne DNK i genske transfekcije, koji su dobro poznati u stanju tehnike (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

[0217] Na primer, u jednom primeru izvođenja, gen(i) od interesa, na primer, gen koji kodira antitela, može se ugraditi u ekspresioni vektor, kao što je eukariotski ekspresioni plazmid, sličan onome koji je korišćen za GS gensku ekspresiju u WO 87/04462, WO 89/01036 i EP 338 841 ili se može ugraditi u neki drugi ekspresioni sistem poznat u stanju tehnike. Prečišćeni plazmid sa kloniranim genima za antitela može se uvesti u eukariotsku ćeliju domaćina, kao što je na primer, CHO, NS/0, HEK293T ili HEK293 ćelijska linija, ili u neku drugu eukariotsku ćeliju, kao što su ćelije dobijene od biljaka, gljiva ili kvasca. Za uvođenje gena koriste se postupci opisani u stanju tehnike, kao što su elektroporacija, lipofektin, lepofektamin i drugi. Nakon uvođenja gena u ćeliju domaćina, ćelije koje eksprimiraju antitela identifikuju se i selektuju. Ove ćelije predstavljaju transfektome koji se mogu umnožiti u pogledu nivoa ekspresije i uvećati kako bi se dobila antitela. Rekombinantna antitela mogu se izolovati i prečistiti iz ćelijskih supernatanata i/ili ćelija.

[0218] Alternativno, klonirani geni za antitela mogu se eksprimirati u drugim ekspresionim sistemima, uključujući prokariotske ćelije, kao što su mikroorganizimi, na primer, E.coli. Dalje, antitela se mogu proizvesti u transgenim životinjama, na primer, u ovčijem i zečjem mleku ili u kokošijim jajima ili u transgenim biljkama; videti, na primer, Verma, R., i sar. (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, i sar. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; i Fischer, R., i sar. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.

Primena parcijalnog sekvencioniranja u cilju eksprimiranja intaktnih antitela (odnosno, humanizacija i himerizacija)

a) Himerizacija

[0219] Mišja monoklonska antitela mogu se primeniti kao terapeutska antitela kod ljudi, ukoliko su obeležena toksinom ili radioaktivnim izotopom. Neobeležena mišja antitela su visoko-imunogena kod ljudi, a posle višestruke primene smanjuje se njihov terapeutski efekat. Bazična imunogenost uslovljena je konstantnim regionima teškog lanca. Imunogenost mišjih antitela kod ljudi može se smanjiti ili kompletno ukloniti ukoliko se antitela himerizuju ili humanizuju. Himerna antitela su antitela, čiji su delovi poreklom iz različitih vrsta, kao što su na primer, antitela čiji je varijabilni region mišjeg, a konstantni region humanog porekla. Himerizacija antitela se postiže spajanjem varijabilnih regiona mišjeg teškog i lakog lanca sa konstantnim regionom humanog teškog i lakog lanca (na primer, kao što je opisano u Kraus i sar., u Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). U poželjnim primerima izvođenja, himerna antitela se dobijaju spajanjem konstantnog regiona humanog κ-lakog lanca i varijabilnog regiona mišjeg lakog lanca. U narednom poželjnom primeru izvođenja, himerna antitela mogu se dobiti spajanjem konstantnog regiona λ-lakog lanca i varijabilnog regiona mišjeg lakog lanca. Poželjni konstantni regioni teškog lanca za dobijanje himernih antitela su IgG1, IgG3 igG4. Drugi poželjni konstantni regioni teškog lanca za dobijanje himernih antitela su IgG2, IgA, IgD i IgM.

b) Humanizacija

[0220] Antitela ostvaruju interakciju sa ciljnim antigenima, pre svega preko aminokiselinskih ostataka koji su lokalizovani u šest regiona lakog i teškog lanca koji određuju komplementarnost (CDR). Usled toga, aminokiselinske sekvence unutar CDR regiona daleko se više razlikuju među antitelima od sekvenci van CDR. S obzirom na to da su CDR sekvence odgovorne za većinu interakcija između antigena i antitela, moguće je eksprimirati rekombinovana antitela koja imitiraju svojstva specifičnih prirodnih antitela, konstruisanjem ekspresionih vektora koji sadrže CDR sekvence iz različitih prirodnih antitela, ugrađene u okvirne sekvence drugih antitela sa drugačijim svojstvima (videti, na pr, Riechmann, L. i sar. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321: 522-525; i Queen, C. i sar. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 86: 10029-10033). Pomenute okvirne sekvence mogu se dobiti iz dostupnih DNK baza koje obuhvataju sekvence gena za antitela germinativne linije. Ove germinativne sekvence razlikovaće se u odnosu na zrele genske sekvence za antitela, jer ne sadrže kompletno povezane varijabilne gene, koji se formiraju V (D) J povezivanjem tokom sazrevanja B ćelija. Germinativne genske sekvence takođe se razlikuju od sekvenci antitela sa visoko afinititnim repertoarom duž celog varijabilnog regiona. Na primer, somatske mutacije relativno su retke u amino-terminalnom delu okvirnog regiona 1 i u karboksi-terminalnom delu okvirnog regiona 4. Takođe, mnoge somatske mutacije ne menjaju značajno vezujuća svojstva antitela. Usled toga, nije neophodno poznavati celokupnu DNK sekvencu određenog antitela, kako bi se dobilo intaktno rekombinantno antitelo čija su vezujuća svojstva slična onima koje ima originalno antitelo (videti, WO 99/45962). Parcijalne sekvence lakog i teškog lanca koje obuhvataju CDR regione najčešće su dovoljne za ove svrhe. Parcijalna sekvenca se koristi za određivanje koji su geni germinativne linije i zglobni geni doprineli nastanku rekombinovanog gena varijabilnog dela antitela. Germinativna sekvenca se zatim koristi da popuni nedostajuće delove varijabilnih regiona. Liderske sekvence teškog i lakog lanca se isecaju tokom maturacije proteina i ne utiču na konačno svojstva dobijenog antitela. Za dodavanje nedostajuće sekvence, klonirane cDNK sekvence se kombinuju sa sintetičkim oligonukleotidima ligacijom ili PCR amplifikacijom. Alternativno, celokupan varijabilni region može se sintetisati kao niz kratkih, preklapajućih oligonukleotida i kombinovati PCR amplifikacijom, kako bi se dobio ceo klon sa celokupnim sintetičkim varijabilnim regionom. Ovaj proces ima svoje prednosti, kao što je eliminisanje ili uključivanje određenih restrikcionih mesta ili optimizacija upotrebe kodona.

[0221] Transkripti nukleotidne sekvence teškog i lakog lanca hibridoma koriste se za dizajniranje preklapajućeg seta sintetičkih oligonukleotida, za dobijanje sintetičkih V sekvenci sa identičnim aminokiselinskim kodirajućim kapacitetom kao što ga ima prirodna sekvenca. Sintetička sekvenca teškog i κ-lanca može se razlikovati od prirodne sekvence na tri načina: nizovi ponovljenih nukleotidnih baza se prekidaju kako bi se olakšala sinteza oligonukleotida i amplifikacija PCR-om; optimalna inicijaciona mesta translacije se ugrađuju u sekvencu, saglasno Kozakovim pravilima (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 26.6: 19867-19870); i HindIII mesta se ugrađuju uzvodno od mesta inicijacije translacije.

[0222] Kod varijabilnih regiona teškog i lakog lanca, optimizovane kodirajuće i odgovarajuće nekodirajuće sekvence se seku u nizove od 30-50 nukleotida, negde na sredini odgovarajućeg ne-kodirajućeg oligonukleotida. Dakle, za svaki lanac, oligonukleotidi se mogu povezati u preklapajuće dvolančane setove koji zahvataju segmente od po 150-400 nukleotida. Oni se zatim koriste kao matrice za dobijanje proizvoda PCR amplifikacije od 140-400 nukleotida. Tipično, jedan oligonukleotidni set varijabilnog regiona razlaže se u dve grupe, koje se umnožavaju posebno, kako bi se dobili preklapajući PCR proizvodi. Ovi preklapajući proizvodi se zatim kombinuju PCR amplifikacijom, kako bi se dobio kompletan varijabilni region. Kada je potrebno, moguće je PCR amplifikacijom obuhvatiti preklapajuće fragmente konstantnog regiona teškog ili lakog lanca, kako bi se dobili fragmenti koji se mogu klonirati u ekspresioni vektor.

[0223] Rekonstruisani himerni ili humanizovani varijabilni regioni teškog i lakog lanca se zatim kombinuju sa drugim regulatornim sekvencama, kao što su klonirani promotor, vodeća sekvenca, inicijator translacije, kontantni region, 3ˈ-netranslatirani region, sekvenca za poliadenilaciju i završetak transkripcije, kako bi se konstruisao ekspresioni vektor. Konstrukcije teškog i lakog lanca mogu se kombinovati u jedan vektor, ko-transfektovati, serijski transfektovati ili posebno transfektovati u ćeliju-domaćina, a zatim se fuzionisati kako bi se dobila ćelija koja eksprimira oba lanca. Opisani su plazmidi za konstrukciju ekspresionih vektora za IgGκ humanog porekla. Ovi plazmidi se mogu konstruisati, tako da se PCR-om umnožene cDNK sekvence V teškog i V κ lakog lanca mogu iskoristiti za dobijanje kompletnih minigena teškog i lakog lanca. Takvi plazmidi se mogu koristiti za ekspresiju kompletnih humanih ili himernih IgG1, κ ili IgG4, κ antitela. Slični plazmidi se mogu konstruisati za potrebe ekspresije drugih izotipova teškog lanca ili za ekspresiju antitela koja sadrže λ- lake lance.

[0224] U narednom aspektu predmetnog pronalaska iskorišćene su strukturne odlike anti-CLDN6 antitela kako bi se kreirala strukturno slična humanizovana anti-CLDN6 antitela koja zadržavaju najmanje jedno funkcionalno svojstvo antitela predmetnog pronalaska, kao što je vezivanje za CLDN6. Naročito, jedan ili više CDR regiona mišjeg monoklonskog antitela se rekombinantno kombinuje sa specifičnim humanim okvirnim sekvencama i CDR regionima, kako bi se dobila rekombinantna, humanizovana anti-CLDN6 antitela prema pronalasku.

Vezivanje za ćelije koje eksprimiraju antigen

[0225] Sposobnost antitela da se veže za CLDN6 može se odrediti primenom standardnih testova vezivanja, kao što su testovi opisani u primerima (na pr. ELISA, Western Blot, imunofluorescencija i protočna citometrija).

Izolacija i karakterizacija antitela

[0226] Za izolovanje anti-CLDN6 antitela, antitela se prečišćavaju iz medijum selekcionisanih hibridoma, gajenih u bocama sa centralnom teflonskom drškom. Alternativno, anti-CLDN6 antitela mogu se proizvesti dijalizom u bioreaktorima. Supernatant se filtrira i ako je potrebno, koncentruje pre nego što se podvrgne afinitetnoj hromatografiji na protein-G sefarozi ili protein A sefarozi. Prečišćenost eluiranih IgG testira se gel eletroforezom i tečnom hromatografijom visokih performansi. Puferski rastvor se zamenjuje PBS-om, a koncentracija se određuje merenjem optičke gustine na OD280, uz primenu ekstincionog koeficijenta od 1.43. Prečišćena monoklonska antitela se alikvotiraju i skladište na -80°C.

[0227] Vezivanje ovako selekcionisanih anti-CLDN6 monoklonskih antitela za jedinstvene epitope ispituje se usmerenom ili nasumičnom mutagenezom.

Određivanje izotipa

[0228] Izotip izolovanih antitela se određuje ELISA testom, uz primenu različitih komercijalnih kompleta (na pr. Zymed, Roche Diagnostics). Bunarčići mikrotitar ploče se oblažu anti-mišjim IgG antitelima. Nakon blokiranja, ploče se izlažu delovanju monoklonskih antitela ili prečišćenoj izotipskoj kontroli, na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. U bunarčiće se zatim dodaju mišja IgG1, IgG2a, IgG2b ili IgG3, IgA ili mišja IgM-specifična, sa peroksidazom konjugovana antitela. Nakon ispiranja, ploče se razvijaju dodavanjem ABST, kao supstrata (1 mg/ml) i analiziraju merenje optičke gustine (OD) na 405-650 nm. Alternativno se primenjuje komercijalni komplet, IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit (Roche, Cat. No.1493027), prema protokolu proizvođača.

Protočna citometrija

[0229] Dokazivanje prisustva anti-CLDN6 u serumima imunizovanih miševa ili vezivanje monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju CLDN6, obavlja se primenom protočne citometrije. Ćelijske linije koje prirodno eksprimiraju CLDN6 ili su transfektovane CLDN6, kao i negativne kontrole koje ne eksprimiraju CLDN6 (rastu pod standardnim uslovima) mogu se tretirati različitim koncentracijama monoklonskih antitela u supernatantima hibridoma ili u PBS, koji sadrži 1% FBS, a zatim se inkubiraju 4°C tokom 30 min. Nakon ispiranja, anti IgG antitela obeležena APC-om ili Alexa647 fluorescetnom bojom, vezuju se za monoklonska antitela specifična za CLDN6, pod istim uslovima kao kod vezivanja primarnih antitela. Uzorci se zatim analiziraju protočnom citometrijom na FACS aparatu, uz primenu svetla i raspršivanja pod pravim uglom kako bi se usmerile pojedinačne žive ćelije. Za razlikovanje specifične reakcije anti-CLDN6 monoklonskih antitela od nespecifičnog vezivanja u jednom koraku, moguće je primeniti ko-transfekciju. Ćelije koje prolazno eksprimiraju plazmid koji kodira CLDN6 i fluorescentni marker mogu se obojiti kao što je opisano. Transfektovane ćelije mogu se detektovati na različitim fluorescentnim kanalima od ćelija koje su obojene antitelima. S obzirom na to da većina transfektovanih ćelija eksprimira oba transgena, CLDN6-specifična monoklonska antitela se preferncijalno vezuju za ćelije koje eksprimiraju fluorescentni marker, dok se ne-specifično vezana antitela u sličnoj meri vezuju i za ne-transfektovane ćelije. Umesto protočne citometrije moguće je primeniti i alternativni test fluorescentne mikroskopije. Ćelije se mogu obojiti onako kako je opisano i ispitati fluorescentnom mikroskopijom.

Imunofluorescentna mikroskopija

[0230] Prisustvo anti-CLDN6 antitela u serumima imunizovanih miševa ili vezivanje monoklonskih antitela za žive ćelije koje eksprimiraju CLDN6 demonstrirano je imunofluorescentnom mikroskopijom. Na primer, ćelijske linije koje eksprimiraju CLDN6, bilo spontano ili nakon transfekcije CLDN6 i negativne kontrole koje ne eksprimiraju CLDN6, gajene su u komorici pod standardnim uslovima u DMEM/F12 medijumu, obogaćenom 10% serumom govečeta (FCS), 2 mM L-glutaminom, 100 IU/ml penicilinom i 100 mg/ml streptomicinom. Ćelije su zatim fiksirane metanolom ili parformaldehidom ili su ostavljene bez tretmana. Ćeliju su inkubirane sa monoklonskim antitelom na CLDN6 tokom 30 min na 25°C. Nakon ispiranja, ćelije su inkubirane u prisustvu Alexa-555-obeleženih antimišjih IgG sekundarnih antitela (Molecular Probes), pod istim uslovima, a zatim su analizirane pod fluorescentnim mikroskopom.

[0231] Ukupni nivo CLDN6 u ćelijama može se ustanoviti nakon što se ćelije fiksiraju u metanolu ili paraformaldehidu i permeabilizuju u rastvoru Triton X-100. U živim ćelijama i ne-permeabilizovanim, u paraformaldehidu fiksiranim ćelijama moguće je ispitati površinsku lokalizaciju CLDN6. Dodatno, ciljanje CLDN6 u čvrstim vezama može se ispitati, ukoliko su ćelije dvojno obojene antitelima na CLDN6 i proteinskim markerom čvrstih veza, kao što je ZO-1. Takođe, moguće je ispitati efekte vezivanja antitela i lokalizaciju CLDN6 na ćelijskoj membrani.

Western Blot

[0232] Anti-CLDN6 IgG mogu se dalje testirati u vezi sa reaktivnošću na CLDN6 antigen, primenom Western blota. Ukratko, ekstrakti ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i odgovarajuće negativne kontrole pripremaju se na odgovarajući način, a zatim se proteini razdvajaju SDS– poliakrilamid gel elektroforezom (SDS-PAGE). Nakon elektroforeze, razdvojeni antigeni se prenose na nitroceluloznu membranu, blokiraju se i i inkubiraju sa monoklonskim antitelima koja se testiraju. Vezivanje IgG detektuje se primenom anti-mišjih IgG konjugovanih sa peroksidazom, a reakcija se vizuelizuje ECL supstratom.

Imunohistohemija

[0233] Reaktivnost anti-CLDN6 mišjih IgG antitela na CLDN6 može se dalje testirati imunohistohemijski, na primer, primenom standardnih postupaka na kriopresecima fiksiranim u paraformaldehidu ili acetonu ili na parafinskim presecima ne-kancerskih i kancerskih uzoraka tkiva koja su fiksirana u paraformaldehidu, a koja su dobijena od pacijenata tokom uobičajenih hirurških postupaka ili iz miša koji nosi ksenograftaske tumore inokulirane sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN6 spontano ili nakon transfekcije. Za imunološko bojenje, preseci se inkubiraju sa antitelima na CLDN6, a zatim se inkubiraju sa anti-mišjim antitelima poreklom iz koze, koja su konjugovana sa peroksidazom rena ili anti-zečjim antitelima poreklom iz koze (DAKO), saglasno uputstvima proizvođača.

Fagocitna i citotoksična aktivnost antitela in vitro

[0234] Osim vezujuće specifičnosti za CLDN6, anti-CLDN6 antitela mogu se testirati i u vezi svoje sposobnosti da posreduju u fagocitozi ili ubijanju ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na njihovoj ćelijskoj membrani. Testiranje monoklonskih antitela in vitro obezbeđuje dodatnu proveru pre testiranja u in vivo modelima.

Citotoksičnost posredovana antitelima (ADCC):

[0235] Ukratko, polimorfonuklearne ćelije (PMN), NK ćelije, monocite, mononuklearne ćelije i druge efektorske ćelije iz zdravih donora prečišćavaju se centrifugiranjem u Ficoll Hypaque gradijentu, a eritrociti koji kontaminiraju uzorak se liziraju. Čelije se ispiraju i suspenduju u RPMI medijumu, obogaćenom 10% toplotno-inaktiviranim FCS ili alternativno, 5% toplotno-inaktiviranim humanim serumom i mešaju se sa<51>Cr-obeležnim ciljnim ćelijama koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani, pri različitim odnosima efektorskih prema ciljnim ćelijama. Alternativno, ciljne ćelije se mogu obeležiti fluorescentnim pojačavajućim ligandom (BATDA). Nivo fluorescentnog helata europijuma sa pojačavajućim ligandom, koji se oslobađa samo iz mrtvih ćelija meri se fluorometrom. Još jedan alternativni postupak zasniva se na transfekciji ciljnih ćelija luciferazom. Supstrat, lucifer-žuta oksiduje samo u živim ćelijama. Prečišćena anti-CLDN6 IgG antitela dodaju se u različitim koncentracijama. Kao negativna kontrola koriste se nespecifična humana IgG antitela. Test se izvodi 4 do 20 sati na 37°C, zavisno od korišćene efektorske ćelije. Uzorci se testiraju na citolizu merenjem nivoa oslobođenog<51>Cr ili merenjem prisustva EuTDA helatora u medijumu ćelijske kulture. Alternativno, može se meriti intenzitet luminescencije koja nastaje oksidacijom lucifer žutog samo u živim ćelijama.

[0236] Anti-CLDN6 monoklonska antitela mogu se testirati u različitim kombinacijama, kako bi se odredilo da li je citoliza pojačana u prisustvu više različitih monoklonskih antitela.

Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC):

[0237] CDC aktivnost monokolonskih anti-CLDN6 antitela može se testirati primenom različitih poznatih postupaka. Na primer, serum za komplement može se dobiti iz krvi, primenom poznatih postupaka. CDC aktivnost mAbs moguće je odrediti na različite načine. Na primer, CDC aktivnost mAbs moguće je odrediti na osnovu oslobađanja<51>Cr ili povećanja permeabilnosti membrane, primenom testa zasnovanog na izbacivanju propidijum jodida (PI). Ukratko, ciljne ćelije, 5×10<5>/ml, ispiraju se i inkubiraju u prisustvu različitih koncentracija mAb tokom 10-30 min na sobnoj temperaturi ili na 37°C. Zatim se dodaju serum ili plazma u koncentraciji od 20% (v/v) i ćelije se ponovo inkubiraju na 37°C tokom 20-30 min. U svaki uzorak se dodaje rastvor PI u tubice za FACS. Smeša se analizira protočnom citometrijom, primenom FACS analize.

[0238] Alternativno, indukcija CDC aktivnosti može se odrediti na adherentnim ćelijama. U jednom primeru izvođenja ovog testa, ćelije se seju 24 č pre testa u gustini od 3×10<4>/po bunarčiću, na mikrotitar pločama sa ravnim dnom. Sledećeg dana se uklanja medijum i ćelije se inkubiraju sa antitelima, u triplikatu. Kontrolne ćelije se inkubiraju u normalnom medijumu ili medijumu koji sadrži i 0.2% saponina za određivanje bazalne lize i maksimalne lize ćelija. Nakon inkubacije od 20 min na sobnoj temperaturi, supernatant se uklanja i dodaje se 20% (v/v) humane plazme ili seruma rastvorenog u DMEM (ugrejan na 37°C), a ćelije se zatim inkubiraju narednih 20 min na 37°C. U sve uzorke se dodaje rastvor propidijum jodida (10 mg/ml). Supernatanti se zatim zamenjuju PBS-om koji sadrži i 2.5 µg/ml etidijum bromida, a emisija fluorescencije nakon ekscitacije na 520 nm meri se na 600 nm na aparatu Tecan Safire. Procenat specifične lize izračunava se prema formuli: % specifične lize = (fluorescencija uzorka-fluorescencija pozadine) /(fluorescencija maksimalne lize – fluorescencija pozadine) ×100.

Inhibicija proliferacije ćelija primenom monoklonskih antitela:

[0239] Testiranje sposobnosti monoklonskih anti-CLDN6 antitela da iniciraju apoptozu može se obaviti inkubiranjem CLDN6-pozitivnih tumorskih ćelija ili CLDN6-transfektovanih tumorskih ćelija na 37°C tokom 20 sati. Ćelije se prikupljaju, ispiraju u Aneksin-V vezujućem puferu (BD biosciences) i inkubiraju u prisustvu Aneksina V, koji konjugovan sa FITC-om ili APC-om (BD biosciences), 15 min u mraku. U sve uzorke dodaje se rastvor PI (10 mg/ml u PBS) u tubicama za FACS, a zatim se uzorci analiziraju protočnom citometrijom (kao što je opisano). Alternativno, opšta inhibicija proliferacije ćelija u prisustvu monoklonskih antitela može se utvrditi primenom komercijalno dostupnih kompleta za detekciju. Komplet DELFIA Cell Proliferation Kit (Perkin-Elmer, Cat. No. AD0200) je ne-izotopksi imuni test, koji se zasniva na merenju ugrađivanja 5-bromo-2ˈ-dezoksiuridina (BrdU) tokom sinteze DNK u ćelijama koje proliferišu. Ugrađeni BrdU se detektuje primenom monoklonskih antitela obeleženih europijumom. Detekcija antitela izvršena je nakon što su ćelije fiksirane i DNK denaturisana primenom Fix rastvora. Nevezano antitelo je isprano i dodat je induktor DELFIA, kako bi se europijumovi joni disocirali od obeleženih molekula antitela u rastvor, gde ovi joni formiraju intenzivno fluorescentne helate sa komponentama DELFIA induktora. Nivo fluorescencije - izmeren primenom fluorimetrije u vremenu – proporcionalan je nivou DNK sinteze u ćelijama u pojedinačnim bunaričćima.

Prekliničke studije

[0240] Monoklonska antitela koja se vezuju za CLDN6 mogu se takođe testirati u nekom in vivo modelu (na pr. u imunodeficijentnom mišu koji nosi ksenograft tumora inokuliran sa ćelijskom linijom koja eksprimira CLDN6, poželjno nakon transfekcije), kako bi se odredila efikasnost u kontroli rasta ćelija koje eksprimiraju CLDN6.

[0241] Moguće je sprovesti in vivo istraživanje primenom antitela iz predmetnog pronalaska, na imunokompromitovanom mišu ili nekoj drugoj vrsti životinja, nakon ugradnje ksenografta sa tumorskim ćelijama koje eksprimiraju CLDN6. Antitela se primenjuju kod jedinki bez tumora, nakon čega se tumorske ćelije injeciraju, a zatim se izučava sposobnost antitela da spreči formiranje tumora i da se razviju simptomi vezani za tumor. Antitela se primenjuju na miševima sa tumorom, kako bi se odredio terapeutski efekat antitela u smanjenju rasta tumora, sprečavanju ili smanjenju metastaza ili ublažavanju simptoma vezanih za tumor. Antitela se mogu kombinovati sa primenom drugih supstanci ili citostatika, faktora inhibicije rasta, blokatora ćelijskog ciklusa, inhibitora angiogeneze, ili drugih antitela, čime je moguće odrediti sinergističko delovanje ili potencijalnu citotoksičnost primenjene kombinacije. Sporedni toksični efekti primenjenih antitela saglasno pronalasku mogu se analizirati nakon inokulacije sa antitelima ili kontrolnim reagensima i istraživanja simptoma koji mogu biti u vezi sa terapijom CLDN6 antitelima. Mogući sporedni efekti in vivo aplikacije CLDN6 antitela obuhvataju toksičnost na tkivima koja eksprimiraju CLDN6, kao što je posteljica. Antitela koja prepoznaju CLDN6 kod ljudi i drugih vrsta, na primer, miša, posebno su pogodna za predviđanje potencijalnih sporednih efekata primene monoklonskih CLDN6 antitela kod ljudi.

Mapiranje epitopa

[0242] Mapiranje specifičnih epitopa antitela saglasno pronalsku može se izvesti kao što je detaljno opisano u publikacijama "Epitope Mapping Protocols (Methods in Molecular Biology)” autora Glenn E. Morris ISBN-089603-375-9 i u "Epitope Mapping: A Practical Approach" Practical Approach Series, 248, autora Olwyn M. R. Westwood, Frank C. Hay.

I. Bispecifični/multispecifični molekuli koji vezuju CLDN6

[0243] U narednom primeru izvođenja, antitela na CLDN6 mogu se izmeniti ili vezati za druge funkcionalne molekule, na primer za neki protein ili peptid (na primer, Fab’ fragment), kako bi se dobili bispecifični ili multispecifični molekuli, koji se vezuju za više drugih mesta ili ciljnih epitopa. Na primer, antitelo predmetnog pronalaska može se funkcionalno povezati (na primer, hemijskom vezom, genetičkom fuzijom, nekovalentnom asocijacijom, ili na drugi način) sa jednim ili više drugih vezujućih molekula, kao što su druga antitela, peptidi ili mimetici.

[0244] Saglasno tome, predmetno otkriće obuhvata bisepcifične i multispecifične molekule koje ispoljavaju najmanje jedno mesto vezivanja za CLDN6 i drugo mesto vezivanja za neki drugi ciljni epitop. Naročito, drugi ciljni epitop je Fc receptor, na primer, humani Fc-γRI (CD64) ili humani Fc-α receptor (CD89) ili receptor na T ćelijama, na primer, CD3. Stoga, pronalazak obuhvata bispecifične i multispecifične molekule sposobne da se vežu za ćelije koje eksprimiraju Fc-γ, Fc-α ili Fc-εR (na primer, za monocite, makrofage ili polimorfonuklearne ćelije (PMN) i za ciljne ćelije koje eksprimiraju CLDN6 i koje karakteriše asocijacija CLDN6 na njihovoj membrani). Ovi bispecifični i multispecifični molekuli mogu biti usmereni prema ćelijama koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani sa efektorskim ćelijama i mogu aktivirati Fcreceptorom posredovanu ćelijsku aktivnost, kao što je fagocitoza ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani, citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), oslobađanje citokina ili nastanak superoksid anjona.

[0245] Bispecifični i multispecifični molekuli dalje obuhvataju molekule koji ispoljavaju i treću sposobnost vezivanja, uz anti-Fc vezujuću specifičnost i anti-CLDN6 vezujuću specifičnost. U jednom primeru izvođenja pronalaska, treća vezujuća specifičnost je deo sa anti-pojačivačkim faktorom (EF), na primer, molekul koji se vezuje za površinu proteina koji su uključeni u citotoksičnu aktivnost i tako povećavaju imunski odgovor usmeren protiv ciljnih ćelija. “Deo sa anti-pojačivačkim faktorom” može biti antitelo, fragment funkcionalnog antitela ili ligand koji se vezuje za dati molekul, na primer, antigen ili receptor i tako dovesti do pojačavanja efekta vezivanja determinanti za Fc receptor ili ciljni ćelijski antigen. “Deo sa anti-pojačivačkim faktorom” može se vezati za Fc receptor ili za ciljni ćelijski antigen. Alternativno, deo sa anti-pojačivačkim faktorom može se vezati za neki entitet koji je različit od entiteta za koji se vezuju prva i druga vezujuća specifičnost. Na primer, deo sa anti-enhanserskim faktorom može se vezati za citotoksične T ćelije (na primer, preko CD2, CD3, CD8, CD28, CD40, ICAM-1 ili za druge imunske ćelije što dovodi do povećanja imunskog odgovora usmerenog protiv drugih ćelija).

[0246] U jednom primeru izvođenja, bispecifični i multispecifični molekuli sadrže, kao svoju vezujuću specifičnost, najmanje jedno antitelo, uključujući na primer, Fab,Fab’, F(ab’)2, Fv ili neki jednolančani Fv. Antitelo može biti dimer lakih ili teških lanaca ili njihov minimalni fragment, kao što je Fv ili jednolančani konstrukt, kao što je opisano kod Ladner i sar. US 4,946,778. Antitelo može biti vezujući domen imunoglubulin-fuzionog proteina, kao što je opisano u US2003/0118592 i US 2003/0133939.

[0247] U jednom primeru izvođenja, bispecifični i multispecifični molekuli specifično se vezuju za Fc-γR ili Fc-αR prisutne na površini efektorske ćelije, a imaju i sposobnost specifičnog vezivanja za ciljni ćelijski antigen, na primer, za CLDN6.

[0248] U jednom primeru izvođenja, specifično vezivanje za Fc receptor omogućeno je monoklonskim antitelom, čije vezivanje nije blokirano humanim imunoglobulinom G (IgG). U značenju koje je ovde primenjeno, termin “IgG receptor” odnosi se na bilo koji od osam gena za γ-lanac, koji se nalaze na hromozomu 1. Ovi geni kodiraju ukupno dvanaest transmembranskih i solubilnih izoformi receptora, u tri klase Fc-γ receptora; Fc-γRI (CD64), Fc-γRII (CD32) i Fc-γRIII (CD16). U poželjnom primeru izvođenja, Fc-γ receptor je visokoafinitetni Fc-γRI receptor humanog porekla.

[0249] U narednim poželjnim primerima izvođenja, specifičnost vezivanja za Fc receptor je obezbeđena antitelom koje se vezuje za humani IgA receptor, na primer, za Fc-α receptor (FcαRI (CD89)), pri čemu ovo vezivanje poželjno nije blokirano humanim imunoglobulinom A (IgA). Izraz "IgA receptor" obuhvata genski proizvod jednog α-gena (Fc-alphaRI) koji se nalazi na hromozomu 19. Ovaj gen kodira nekoliko alternativno isečenih varijanti transmembranske izoforme, molekulske težine 55 do 110 kDa. Fc-αRI (CD89) se konstitutivno eksprimira na monocitama/makrofagima, eozinofilima i neutrofilnim granulocitama, ali ne i na ne-efektorskim ćelijama. Fc-αRI ima osrednji afinitet za IgA1 i IgA2, a afinitet se povećava nakon izlaganja antitela citokinima, kao što su G-CSF ili GM-CSF (Morton, H. C. i sar. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). Do sada su poznata i opisana četiri Fc-αRI-specifična monoklonska antitela, A3, A59, A62 i A77, koja se vezuju za Fc-αRI, izvan IgA-ligand vezujućeg mesta (Monteiro, R. C. i sar. (1992) J.Immunol. 148: 1764).

[0250] U narednom primeru izvođenja, bispecifični molekul se sastoji od dva monoklonska antitela saglasno pronalasku, pri čemu dva antitela poseduju komplementarne aktivnosti, tako što jedno antitelo pre svega ispoljava CDC aktivnost, dok drugo antitelo pre svega indukuje apoptozu.

[0251] “Antitelo specifično za efektorsku ćeliju”, u značenju koje je ovde primenjeno, odnosi se na antitelo ili na funkcionalni fragment antitela koji se vezuje za Fc receptor na efektorskim ćelijama. Poželjna antitela za primenu kod subjekata, vezuju se za Fc receptor na efektorskim ćelijama za vezujuće mesto na kojem nije vezan endogeni imunoglobulin.

[0252] U značenju koje je ovde primenjeno, termin “efektorska ćelija" odnosi se na imunsku ćeliju koja je uključena u efektorsku fazu imunskog odgovora, suprotno stečenim i aktivacionim fazama imunskog odgovora. Primeri ovakvih imunskih ćelija obuhvataju ćelije mijeloidnog i limfoidnog porekla, na primer, limfocite (na primer, B ćelije i T ćelije, uključujući citolitičke T ćelije (CTL), ćelije-ubice, prirodne ćelije-ubice, makrofage, monocite, eozinofile, neutrofile, polimorfonuklearne ćelije, granulocite, mastocite i bazofile. Neke efektorske ćelije eksprimiraju specifične Fc receptore i obavljaju specifične imunske funkcije. U poželjnim primerima izvođenja, efektorska ćelija je sposobna da indukuje citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC), na primer, neutrofil je sposoban da indukuje ADCC. Dalje, monociti, makrofagi koji eksprimiraju FcR uključeni su u selektivno ubijanje ciljnih ćelija i prezentovanje antigena ostalim komponentana imunskog sistema ili vezivanje za ćelije koje prezentuju antigen. U drugim primerima izvođenja, efektorska ćelija može da fagocitira ciljni antigen, ciljnu ćeliju ili mikroorganizam. Ekspresija određenog FcR na efektorskoj ćeliji može biti regulisana humoralnim faktorima, kao što su citokini. Na primer, interferon gama (IFN-γ) povećava ekspresiju Fc-γRI. Pojačana ekspresija Fc-γRI povećava citotoksičnu aktivnost ćelija na kojima se nalazi ovaj receptor prema ciljnim mestima. Efektorska ćelija može fagocitirati ili lizirati ciljni antigen ili ciljnu ćeliju.

[0253] "Ciljna ćelija" označava bilo koju neželjenu ćeliju kod subjekta (na primer, čovečju ili životinjsku), prema kojoj se može usmeriti delovanje antitela prema pronalasku. U poželjnom primeru izvođenja, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira ili pojačano eksprimira CLDN6 i koja se odlikuje asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani. Ćelije koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom sa CLDN6 na svojoj membrani, najčešće su tumorske ćelije.

II. Imunokonjugati

[0254] U narednom primeru izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CLDN6 antitelo konjugovano sa terapeutskim agensom, kao što je neki citotoksin, lek (na primer, imunosupresant) ili radioizotop. Ovakvi konjugati antitela i terapeutskog agensa nazivaju se “imunokonjugati”. Imunokonjugati, koji obuhvataju jedan ili više citotoksina, nazivaju se “imunotoksini”. Citotoksin ili citotoksični agens je svaki agens koji je poguban za ćelije ili ih ubija. Takvi su, na primer, taksol, citohalazin B, gramicidin D, etidijum bromid, emetin, mitomicin, etopozid, tenopozid, vinkristin, vinblastin, kolhicin, doksorubicin, daunorubicin, dihidroksiantracin-dion, mitoksantron, mitramicin, aktinomicin D, 1-dehridotestosteron, glukokortikoidi, prokain, tetrakain, lidokain, propranol i puromicin, kao i njihovi analozi i homolozi.

[0255] Pogodni terapeutski agensi za formiranje imunokonjugata saglasno pronalasku, obuhvataju, bez ograničenja, antimetabolite (na primer, metotreksat, 6-tioguanin, citarabin, fludarabin, 5-fluorouracil dekarbazin), alkilujuće agense (na primer, mehloretamin, tioepa, hlorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) i lomustin (CCNU), ciklofosfamid, busalfan, dibromomanitol, streptozocin, mitomicin C, i cis-dihlorodiamin platinu (II) (DDP) cisplatin), antraciline (na primer, daunorubicin (prethodno daunomicin) i doksorubicin), antibiotike (na primer, daktinomicin (ranije aktinomicin), bleomicin, mitramicin, i antramicin (AMC), i antimitotičke agense (na primer, vinkristin i vinblastin). U poželjnom primeru izvođenja, terapeutski agens je citotoksični agens ili radiotoksični agens. U narednom primeru izvođenja, terapeutski agens je imunosupresant. U još jednom primeru izvođenja, terapeutski agens je GM-CSF. U poželjnom primeru izvođenja, terapeutski agens je doksorubicin, cisplatin, bleomicin, sulfat, karmustin, hlormabucil, ciklofosfamid ili ricin A.

[0256] Antitela saglasno pronalasku mogu se konjugovati za radioizotop, na primer, jod-131, itrijum-90 ili indijum-III, kako bi se dobili citotoksični radiofarmaceutici za tretiranje poremećaja povezanih sa CLDN6, kao što je kancer. Konjugati antitela saglasno pronalasku mogu se koristiti sa ciljem da se modifikuje biološki odgovor, a podrazumeva se da deo konjugata koji je farmaceutik ne mora biti ograničen na klasične hemijske terapeutske agense. Na primer, deo leka može biti protein ili polipeptid koji poseduje željenu biološku aktivnost. Ovi proteini obuhvataju, na primer, enzimski aktivne toksine ili njihove aktivne fragmente, kao što su abrin, ricin A, endotoksin pseudomonasa ili toksin difterije; protein, kao što je faktor nekroze tumora ili interferon-γ; ili modifikatore biološkog odgovora, kao što su na primer, limfokini, interleukin-1 (IL-1), interleukin-2 (IL-2), interleukin-6 (IL-6), faktor stimulacije granulocitno-makrofagnih kolonija (GM-CSF), faktor stimulacije granulocitnih kolonija (G-CSF) ili druge faktori rasta.

[0257] Postupci konjugovanja ovih terapeutskih delova antitela dobro su poznati u stanju nauke, videti na primer, Arnon i sar., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", u publikaciji Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld i sar. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom i sar.., "Antibodies For Drug Delivery", u publikaciji Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson i sar. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", u publikaciji Monoclonal Antibodies ’84: Biological And Clinical Applications, Pincheraet al. (urednici), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", u publikaciji Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin i sar. (urednici), pp. 303-16 (Academic Press 1985), i Thorpe i sar., "The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982).

[0258] U narednom primeru izvođenja, antitela saglasno pronalasku se privezana za linkerhelator, na primer, tiuksetan, koji omogućava da se antitelo konjuguje sa radioizotopom.

III. Farmaceutske kompozicije

[0259] U narednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje kompoziciju, na primer, farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži jedno ili kombinaciju više antitela predmetnog pronalaska. Farmaceutske kompozicije mogu se formulisati zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačima ili razblaživačima, kao i sa drugim adjuvansima i eksipijensima, koje predviđaju konvencionalni pristupi, kao što su oni opisani u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995. U jednom primeru izvođenja, kompozicije obuhvataju veći broj (na primer, dva ili više) izolovanih antitela predmetnog pronalaska, koja ispoljavaju različite mehanizme delovanja, tako da jedno antitelo, na primer, pretežno izaziva CDC, dok drugo antitelo pretežno izaziva apoptozu.

[0260] Farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska takođe se mogu primeniti u kombinovanoj terapiji, odnosno, u terapiji sa drugim agensima. Na primer, kombinovana terapija obuhvata kompoziciju predmetnog pronalaska sa najmanje jednim anti-inflamatornim agensom ili najmanje jednim imunosupresivnim agensom. U jednom primeru izvođenja, ovi terapeutski agensi obuhvataju jedan ili više anti-inflamatornih agenasa, kao što su steroidni lekovi ili NSAID (nesteroidni anti-inflamatorni lekovi). Poželjni agensi su, na primer, aspirin i drugi salicilati, inhibitori Cox-2, kao što su rofekoksib (Vioxx) i celekoksib (Celebrex), NSAID, kao što je ibuprofen (Motrin, Advil), fenoprofen (Nalfon), naproksen (Naprosyn), sulindak (Clinoril), diklofenak (Voltaren), piroksikam (Feldene), ketoprofen (Orudis), diflusinal (Dolobid), nabumeton (Relafan), etodolak (Lodine), oksaprozin (Daypro) i indometacin (Indocin).

[0261] U narednom primeru izvođenja, ovi terapeutski agensi obuhvataju agense koji dovode do prekida ili funkcionalne inaktivacije regulatornih T ćelija, kao što je ciklofosfamid u niskoj dozi, anti-CTLA4 antitela, anti-IL2 ili anti-IL2-receptor antitela.

[0262] U još jednom primeru izvođenja, ovi terapeutski agensi obuhvataju jedan ili više hemoterapeutika, kao što su derivati Taksola, taksoter, gemcitabin, 5-fluorouracil, doksorubicin (Adriamycin), cisplatin (Platinol), ciklofosfamid (Cytotaxan, Procytox, Neosar). U narednom primeru izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu se primenjivati u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensima, koji poželjno ispoljavaju terapeutsku efikasnost kod pacijenata koji boluju od kancera, na primer, tipova kancera koji su prethodno opisani.

[0263] U narednom primeru izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu se primeniti zajedno sa radioterapijom i/ili autolognom transplantacijom perifernih matičnih ćelija ili matičnih ćelija kostne srži.

[0264] U značenju koje je ovde primenjeno, “farmaceutski prihvatljivi nosač”, označava bilo koji i sve rastvarače, disperzione medije, obloge, antibakterijske i antifugalne agense, izotonične agense i agense koji usporavaju adsorbciju, a koji su fiziološki kompatibilni. Poželjno, nosač je pogodan za intravensku, intramuskularnu, potkožnu, parenteralnu, spinalnu ili epidermalnu primenu (na primer, injektovanjem ili infuzijom). Zavisno od puta primene, aktivno jedinjenje, na primer, antitelo, bispecifični i multispecifični molekul, može biti obložen materijalom, koji štiti jedinjenje od delovanja kiselina ili od drugih fizioloških uslova koji mogu oštetiti jedinjenje.

[0265] “Farmaceutski prihvatljiva so” odnosi se na so koja zadržava željenu biološku aktivnost matičnog jedinjenja i ne izaziva toksične efekte (videti, na primer, Berge, S. M., i sar. (1977) J. Pharm. Sci.66: 1-19).

[0266] Soli koje se mogu koristiti prema pronalasku, obuhvataju soli nastale delovanjem kiselina i soli nastale delovanjem baza. Soli nastale delovanjem kiselina obuhvataju one koje nastaju od netoksičnih neorganskih kiselina, kao što su hlorovodonična, azotna, fosforna, sumporna, bromovodonična, jodovodonična, fosforasta, kao i netoksične organske soli, kao što su soli alifatičnih, mono- i dikarboksilnih kiselina, fenil-supstituisane alkanske kiseline, hidroksi alkanska kiselina, aromatične kiseline, alifatične i aromatične sumporne kiseline. Soli nastale dodavanjem baze obuhvataju soli nastale od zemnoalkalnih metala, kao što su natrijum, kalijum, magnezijum, kalcijum, kao i netoksičnih organskih amina, kao što su N,N’-dibenziletilendiamin, N-metilglukamin, hloroprokain, holin, dietanolamin, etilenediamin i prokain.

[0267] Kompozicija saglasno pronalsku može se primeniti postupcima poznatim u nauci. Stručnjaku je poznato da izbor puta i/ili načina primene zavise od željenih rezultata. Aktivna jedinjenja mogu se pripremiti sa nosačima koji štite jedinjenje od brzog oslobađanja, kao što su formulacije za kontrolisano oslobađanje, na primer, implanti, transdermalni flasteri i mikrokapsulirani sistemi za isporuku. Moguće je primeniti biodegradabilne i biokompatibilne polimere, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polimlečna kiselina. Postupci pripreme ovih formulacija su načelno poznati stručnjacima. Videti, na primer, publikaciju Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ur., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[0268] Za neke vidove administracije jedinjenja predmetnog predonalaska neophodno je da se jedinjenje obloži zaštitnim materijalom ili da se primeni zajedno sa materijalom koji sprečava inaktivaciju. Na primer, jedinjenje se može primeniti zajedno sa odgovarajućim nosačem, na primer, sa lipozomima ili razblaživačem. Farmaceutski prihvatljivi razblaživači su fiziološki rastvor i vodeni rastvori pufera. Lipozomi obuhvataju CGF emulzije tipa voda- ulje-voda, kao i konvencionalne lipozome (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).

[0269] Farmaceutski prihvatljivi nosači su sterilni vodeni rastvori ili disperzije i sterilni praškovi za neposrednu pripremu sterilnih injektabilnih rastvora i disperzija. Primena ovih rastvora ili agenasa kao farmaceutski aktivnih supstanci opisana je u tehnici. Osim ovoga što je do sada navedeno, moguća je primena svih konvencionalnih medijuma ili agensa koji su kompatibilni sa pronalaskom. U sastav kompozicija mogu se uključiti i pomoćna aktivna jedinjenja.

[0270] Terapeutske kompozicije treba da budu sterile i stabilne pod uslovima koji vladaju tokom proizvodnje i skladištenja. Kompozicije se mogu formulisati u vidu rastvora, mikroemulzija, lipozoma ili u vidu drugih organizovanih struktura pogodnih za održavanje visoke koncentracije leka. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol, i tečni polietilen glikol) i njihove pogodne smeše. Odgovarajuću fluidnost kompozicije moguće je održati primenom obloga kao što je lecitin, održavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzija ili primenom površinski aktivnih supstanci. U mnogim slučajevima, biće poželjno uključivanje izotoničnih agenasa u kompozicije, kao što su na primer, šećeri, polialkoholi, na primer, manitol, sorbitol ili natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može se postići uključivanjem u kompoziciju agensa koji odlaže apsorpciju, na primer, soli monostearata i želatina.

[0271] Sterilni rastvori za injektovanje mogu se dobiti rastvaranjem željene količine aktivnog jedinjenja u odgovarajućem rastvaraču, sa jednim ili više sastojaka koji su već pobrojani, prema potrebi i naknadnim sterilnim mikrofiltriranjem.

[0272] Uopšteno, disperzije se pripremaju rastvaranjem aktivne supstance u sterilnom nosaču koji sadrži bazni disperzioni medijum i druge potrebne sastojke koji su već pomenuti. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injekcionih rastvora, poželjni postupci pripreme su vakuumsko sušenje i liofilizacija (sušenje smrzavanjem), čime nastaje prašak sa aktivnim sastojcima plus neki dodatni poželjni sastojci iz prethodno sterilno-filtriranih rastvora.

[0273] Dozni režim se podešava saglasno željenom efektu (na primer, terapeutskom odgovoru). Moguće je, na primer, primeniti jednokratnu dozu, nekoliko doza tokom vremena ili se doza može proporcionalno smanjivati ili povećavati, ukoliko to zahteva terapeutska situacija. Zbog lakoće primene i uniformnosti doza naročito su pogodne parenteralne kompozicije koje obuhvataju jediničnu dozu. Dozne jedinice u značenju koje je ovde primenjeno, odnose se na fizički diskretne jedinice podešene za pojedinačnu primenu kod subjekta koji se tretira; svaka jedinica sadrži prethodno određenu količinu aktivnog jedinjenja preračunatu da se proizvede željeni teraputski efekat, zajedno sa željenim farmaceutskim nosačem.

[0274] Primeri farmaceutski poželjnih antioksidanata obuhvataju: (1) vodorastvorne antioksidante, kao što je askorbinska kiselina, cistein-hlorovodonik, natrijum bisulfat, natrijum metabisulfat i natrijum-sulfit; (2) u ulju rastvorne antioksidante, kao što su askorbil palmitat, butilovani hidroksianizol (BHA), butilovani hidroksitoluen (BHT), lecitim propil galat i alfa-tokoferol; i (3) metal helirajuće agense, kao što je limunska kiselina, etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA), sorbitol, vinska kiselina i fosforna kiselina.

[0275] Za terapeutske kompozicije, formulacije predmetnog pronalaska obuhvataju one koje su pogodne za oralnu, nazalnu, površinsku (uključujući bukalnu i podjezičnu primenu), rektalnu, vaginalnu i/ili parenteralnu primenu. Formulacije se mogu pripremiti u jediničnoj dozi i mogu se dobiti postupcima poznatim u stanju farmacije. Količina aktivnog sastojka koji se kombinuje sa nosačem da bi se dobila jedinična doza, varira zavisno od subjekta koji se tretira i načina primene. Količina aktivnog sastojka, koji se kombinuje sa nosačem kako bi se dobila pojedinačna doza, načelno je ona količina koja proizvodi terapeutski efekat. Formulacije predmetnog pronalaska koje su pogodne za vaginalnu primenu obuhvataju vagitorije, tampone, kremove, gelove, paste, pene ili formulacije u vidu spreja, koje sadrže nosače poznate u stanju tehnike. Dozne forme za površinsku ili transdermalnu primenu formulacija iz predmetnog pronalaska obuhvataju praškove, sprejeve, meleme, paste, kremove, losione, gelove, rastvore, flastere i inhalante. Aktivno jedinjenje se može pomešati u sterilnim uslovima sa farmaceutski prihvatljivim nosačem i bilo kojim konzervansom, puferima ili propelantima koji su neophodni.

[0276] Izrazi "parenteralna primena" "primenjeno parenteralno", označavaju primenu koja nije intestinalna ili površinska, a najčešće se odnose na primenu putem injekcija, i obuhvataju bez ograničenja, intravensku, intramuskularnu, intraarterijalnu, intratekalnu, intrakapsularnu, intraorbitalnu, intrakardijalnu, intradermalnu, intraperitonealnu, transtrahealnu, subkutanu, subkutikularnu, intraartikularnu, subkapsularnu, subarahnoidnu, intraspinalnu, epiduralnu i intrasternalnu injekciju i infuziju.

[0277] Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača, koji se mogu koristiti u farmaceutskim kompozicijama saglasno pronalasku, obuhvataju vodu, etanol, poliole (ka što su glicerol, propilen glikol i polietilen glikol) i njihove pogodne smeše, biljna ulja, kao što je maslinovo ulje, i injektabilne organske estre, kao što je etil oleat. Odgovarajuća fluidnost može se održati, na primer, primenom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem odgovarajuće veličine čestica u slučaju disperzija i primenom površinski aktivnih supstanci.

[0278] Te kompozicije mogu sadržati adjuvanse, kao što su konzervansi, ovlaživači, emulzifikatori, i agensi za dispergovanje. Pojava mikororganizama može se sprečiti sterilizacijom i uključivanjem različitih antibakterijskih i antifugalnih agenasa, na primer, parabena, hlorobutanola i fenol-sorbinske kiseline. Može biti poželjno da se u kompozicije uključe i neki izotonični agensi, kao što su šećeri i natrijum hlorid. Takođe, produžena apsorpcija injektabilnih farmaceutskih formi može se postići uključivanjem agenasa koji odlažu apsorpciju, kao što su aluminijum monostearat i želatin.

[0279] Nezavisno od izabranog načina primene, jedinjenja predmetnog pronalaska, koja se mogu primeniti u hidratisanoj formi, i/ili se farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska mogu formulisati u farmaceutski prihvatljive dozne forme primenom konvencionalnih postupaka poznatih stručnjaku.

[0280] Dozni sadržaj aktivnih sastojaka u farmaceutskim kompozicijama predmetnog pronalaska može varirati, tako da se postigne količina aktivnog sastojka dovoljna da izazove terapeutski odgovor kod naročitog pacijenta, a to se postiže izborom kompozicije i načinom primene i bez izazivanja toksičnih efekata. Izabrana doza zavisi od različitih farmakokinetičkih faktora, uključujući aktivnost konkretne kompozicije predmetnog pronalaska, načina primene, vreme primene, brzinu izlučivanja naročitog jedinjenja, trajanja tretmana, primene drugih lekova, jedinjenja i/ili materijala koji se koriste u kombinaciji sa naročitom kompozicijom, zatim od starosti, pola, težine, kondicije i opšteg stanja zdravlja, kao i prethodne medicinske istorije subjekta koji se tretira i sličnih faktora poznatih u medicini.

[0281] Lekar ili veterinar sa potrebnim iskustvom, može lako odrediti i prepisati efektivnu količinu farmaceutske kompozicije. Na primer, tretman može započeti dozom jedinjenja predmetnog pronalaska u farmaceutskoj kompoziciji koja je niža od potrebne da se postigne željeni terapeutski efekat, pa se doza može postepeno povećavati sve dok se ne postigne željeni terapeutski efekat. Načelno, pogodne dnevne doze kompozicije saglasno pronalasku su one količine jedinjenja čija najniža doza efikasno ostvaruje terapeutski efekat. Ovakve efektivne doze načelno zavise od prethodno opisanih faktora. Poželjno je da je primena intravenska, intramuskularna, intraperitonealna ili subkutana, poželjno je da se medikament primenjuje proksimalno od ciljnog mesta. Kada je potrebno, efektivna dnevna doza terapeutske kompozicije može se primeniti u vidu dve, tri, četiri, pet, šest ili više podeljenih doza, u odgavarajućim vremenskim intervalima tokom dana, ili po potrebi, u vidu pojedinačne dozne forme. Iako je moguća samostalna primena jedinjenja predmetnog pronalaska, poželjna je primena jedinjenja u vidu farmaceutske formulacije (kompozicije).

[0282] U jednom primeru izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu se primeniti putem infuzije, poželjno putem spore kontinualne infuzije tokom dugog perioda, kao što je na primer, period od više od 24 sata, kako bi se smanjili sporedni toksični efekti. Primena se može ostvariti putem kontinualne infuzije tokom perioda od 2 do 24 sata, na primer, od 2 do 12 sati. Ovakav režim može se ponoviti jednom ili više puta ako je potrebno, na primer, nakon 6 meseci ili 12 meseci. Doze se mogu odrediti ili podesiti merenjem količine cirkulišućeg monoklonskog anti-CLDN6 antitela u biološkom uzorku nakon terapijske primene, postupkom koji se zasniva na primeni anti-idiotipskih antitela koja specifično ciljaju na anti-CLDN6 antitela.

[0283] U narednom primeru izvođenja, antitela se primenjuju u terapiji održavanja, kao što je na primer, jednom nedeljeno tokom perioda od 6 meseci ili duže.

[0284] U narednom primeru izvođenja, antitela saglasno pronalasku mogu se primeniti u režimu koji uključuje jednu infuziju antitela specifičnih za CLDN6, nakon čega sledi infuzija antitela specifičnih za CLDN6 i konjugovanih sa nekim radioizotopom. Ovaj režim se može ponoviti, na primer, 7 do 9 dana kasnije.

[0285] U jednom primeru izvođenja, terapeutska jedinjenja predmetnog pronalaska se formulišu sa lipozomima. U još poželjnijem primeru izvođenja, lipozomi sadrže usmeravajući deo. U najpoželjnijem primeru izvođenja, terapeutska jedinjenja u lipozomima se isporučuju pojedinačnom injekcijom u mesto koje je proksimalno od željene oblasti, na primer, od mesta gde se nalazi tumor. Kompozicija mora biti u formi fluida, u meri koja dozvoljava primenu putem injekcije. Kompozicija treba da bude stabilna pod uslovima koji vladaju tokom proizvodnje i skladištenja i mora se održati protiv zagađenja sa mikroorganizmima, na primer, bakterijama ili gljivama.

[0286] U narednom primeru izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu se formulisati kako bi se sprečio ili onemogućio transport kroz placentu. Ovo se može postići pozantim postupcima, na primer, PEG-ilacijom antitela ili primenom F(ab)2’ fragmenata. Za dodatne reference videti “Cunningham-Rundles C, Zhuo Z, Griffith B, Keenan J. (1992) Biological activities of polyethylene-glycol immunoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J. Immunol. Methods, 152: 177-190; i "Landor M. (1995) Maternal-fetal transfer of immunoglobulins, Ann. Allergy Asthma Immunol.74: 279-283.

[0287] “Terapeutski efikasna doza” za tumorsku terapiju može se odrediti objektivnim odgovorom tumora, koji može biti kompletan ili delimičan. Kompletan odgovor (CR) definiše se odsustvom kliničkih, radioloških i drugih znakova bolesti. Delimičan odgovor (PR) nastaje kada se veličina tumora smanji za više od 50%. Srednje vreme progresije predstavlja meru koja karakteriše trajnost odgovora na tumor.

[0288] "Terapeutski efikasna doza" za tumorsku terapiju može se takođe odrediti na osnovu sposobnosti da se stabilizuje napredovanje bolesti. Sposobnost jedinjenja da inhibira kancer može se proceniti u životinjskom model sistemu za predviđanje efikasnosti u tumorima ljudi. Ova osobina kompozicija saglasno pronalasku može se takođe proceniti ispitivanjem sposobnosti jedinjenja da inhibira rast ćelija ili da izazove apoptozu, primenom in vitro testova koji su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Terapeutski efikasna količina jedinjenja može smanjiti veličinu tumora ili može na drugi način ublažiti simptome. Stručnjak je sposoban da odredi terapeutski efikasnu količinu na osnovu faktora kao što su veličina subjekta, težina simptoma bolesti i konkretan izbor kompozicije i načina primene.

[0289] Kompozicija mora biti sterilna i u tečnom obliku, u meri koja omogućava da se primena obavi injektovanjem. Osim vode, nosač može biti neki izotonični puferski rastvor, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol ili tečni polietilen glikol), kao i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost može se održati, na primer, primenom materijala za oblaganje, kao što je lecitin, održavanjem pogodne veličine čestica u slučaju disperzija ili primenom površinski aktivnih supstanci. U mnogim slučajevima poželjno je u sastav uključiti izotonične agense, kao što su na primer, šećeri, polialkoholi, na primer, manitol i sorbitol i natrijum hlorid. Dugotrajna apsorpcija injektabilnih kompozicija može se postići uključivanjem u sastav agenasa koji odlažu apsorpciju, kao što su na primer, aluminijum monostearat ili želatin.

[0290] Kada je aktivno jedinjenje zaštićeno na odgovarajući način, na način koji je opisan, jedinjenje se može primeniti oralno, na primer, zajedno sa inertnim razblaživačem ili nekim jestivim nosačem.

IV. Primena i postupci pronalaska

[0291] Antitela (uključujući imunokonjugate, bispecifične/monospecifičn molekule, kompozicije i njihove druge opisane derivate) predmetnog pronalska imaju terapeutsku primenu u različitim situacijama koje obuhvataju tretman poremećaja vezanih za ćelije koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani. Na primer, antitela se mogu primeniti na ćelije u kulturi, na primer, in vitro ili ex vivo, ili kod ljudi, na primer, in vivo, kako bi se tretirali ili sprečili različiti poremećaji koji su povezani sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN6 i odlikuju se asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani. Poželjni subjekti tretiranja su osobe koje boluju od poremećaja koji se mogu izlečiti ili ublažiti uništavanjem bolesnih ćelija, naročito onih ćelija koje se odlikuju izmenjenim obrascem ekspresije CLDN6 i/ili izmenjenom asocijacijom CLDN6 na ćelijskoj površini u poređenju sa normalnim ćelijama.

[0292] U jednom primeru izvođenja antitela predmetnog pronalaska mogu se primeniti u terapiji subjekta sa tumorogenim poremećajem, na primer, sa poremećajem koji se odlikuje prisustvom tumorskih ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odliku asocijacijom CLDN6 na svojoj ćelijskoj površini. Primeri takvih tumorogenih bolesti, koje se mogu tretirati i/ili sprečiti, obuhvataju sve kancere koji eksprimiraju CLDN6 i druge tipove tumora, koji su ovde već pomenuti.

[0293] Farmaceutske kompozicije i tretmani koji su opisani saglasno pronalasku, mogu se primeniti i za imunizaciju ili vakcinaciju, sa ciljem da spreče bolesti koje su prethodno opisane.

[0294] U narednom primeru izvođenja, antitela predmetnog pronalaska mogu se primeniti sa ciljem da se detektuje nivo ekspresije CLDN6 ili specifične forme CLDN6, ili broj ćelija koje ispoljavaju CLDN6 na svojoj membrani, pri čemu se tako određeni nivo može povezati sa određenim bolestima ili simptomima bolesti koje su već opisane. Antitela se mogu primeniti i sa ciljem da se spreči ili omogući interakcija sa ćelijama koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani, što ukazuje da su ove ćelije važni medijatori bolesti. To se postiže interakcijom uzorka i kontrolnog uzorka sa anti-CLDN6 antitelima pod uslovima koji dozvoljavaju formiranje kompleksa između antitela i CLDN6. Nivo kompleksa formiranog između antitela i CLDN6 detektuje se i upoređuje sa kontrolnim uzorkom, odnosno, sa referentnim uzorkom.

[0295] Vezujuće sposobnosti i specifičnosti antitela predmetnog pronalaska mogu se testirati in vitro u vezi sa terapeutskom i dijagnostičkom primenom. Na primer, antitela se mogu testirati testom protočne citometrije, kao što je ovde prethodno opisano.

[0296] Antitela predmetnog pronalaska mogu se primeniti sa ciljem da izazovu jednu od sledećih bioloških aktivnosti in vivo ili in vitro: da inhibiraju rast i/ili diferencijaciju ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani; da ubiju ćelije koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani; da posreduju u fagocitozi ili ADCC ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani; da posreduju u izazivanju CDC ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani; da posreduju u apoptozi ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani; da indukuju homotipičnu adheziju; i/ili da indukuju trakslokaciju u lipidne splavove nakon vezivanja za CLDN6.

[0297] U naročitom primeru izvođenja, antitela se primenjuju in vivo ili in vitro, u terapiji ili dijagnozi različitih bolesti povezanih sa CLDN6. Primeri bolesti povezanih sa CLDN6 obuhvataju, između ostalih, kancere, kao što su oni prethodno pomenuti.

[0298] Kao što je prethodno opisano, anti-CLDN6 antitela saglasno pronalasku mogu se primeniti u kombinaciji sa jednim ili više drugih terapeutskih agenasa, na primer, sa nekim citotoksičnim agensom, radiotoksičnim agensom ili sa imunosupresivnim agensom, kako bi se smanjila indukcija imunskog odgovora usmerenog prema antitelu predmetnog pronalaska. Antitela se mogu povezati sa nekim agensom (na primer, imunokompleksom) ili se mogu primeniti odvojeno od tog agensa. U slučaju odvojene primene, antitelo se može primeniti pre, nakon ili zajedno sa agensom ili se može ko-primeniti sa drugim poznatim terapijama, na primer, sa antikancerskom terapijom, na primer, sa zračenjem. Ovi terapeutski agenski obuhvataju, između ostalih, anti-neoplastične agense, kao što su oni prethodno pomenuti. Zajednička primena anti-CLDN6 antitela saglasno pronalasku i hemoterapeutskog agensa obezbeđuje dva anti-kancerska agensa koja ostvaruju citotoksični efekat na tumorskim ćelijama posredstvom različitih mehanizama. Ovakva kombinovana primena može sprečiti nastanak i razvoj rezistencije na lekove ili promene antigenosti tumorskih ćelija, usled čega tumor postaje neosetljiv na antitela.

[0299] Kompozicije (na primer antitela, multispecifični i bispecifični molekuli i imunokonjugati) predmetnog pronalaska koje imaju vezujuća mesta za komplement, kao što su delovi IgG1, -2 ili -3, ili IgM, koji vezuju komplement, mogu se koristiti u prisustvu komplementa. U jednom primeru izvođenja, ex vivo tretman populacije ćelija koje sadrže ciljne ćelije, vezujućim agensom predmetnog pronalaska i odgovarajućim efektorskim ćelijama, može se dopuniti dodavanjem komplementa ili seruma koji sadrži komplement. Fagocitoza ciljnih ćelija obloženih vezujućim agensom može se poboljšati dodavanjem proteina komplementa. U jednom primeru izvođenja, ciljne ćelije obložene kompozicijama saglasno pronalasku mogu se lizirati komplementom. U još jednom primeru izvođenja, kompozicije ne aktiviraju komplement.

[0300] Kompozicije predmetnog pronalaska mogu se administrirati zajedno sa komplementom. Saglasno tome, u domen predmetnog pronalaska spadaju i kompozicije koje sadrže antitela, multispecifične i bispecifične molekule i serum ili komplement. Ove kompozicije su naročito poželjne, jer se komplement nalazi u blizini antitela, multispecifičnih i bispecifičnih molekula.

[0301] Alternativno, antitela, multispecifični ili bispecifični molekuli predmetnog pronalaska i komplement ili serum, mogu se primeniti odvojeno. Vezivanje kompozicije saglasno pronalasku za ciljne ćelije može izazvati translokaciju kompleksa CLDN6 antigen-antitelo u lipidne splavove ćelijske membrane. Ova translokacija uslovljava visoku gustinu (prisustvo) antigen-antitelo kompleksa, koji tako efikasno aktiviraju i/ili pojačavaju CDC.

[0302] Domen pronalaska obuhvata komplete koji sadrže kompozicije antitela, saglasno pronalasku (na primer, antitela i imunokonjugate), kao i uputstvo za upotrebu. Komplet može sadržati i jedan ili više dodatnih reagenasa, kao što su imunosupresivni reagens, citotokični agens ili radiotoksični agens ili jedno ili više dodatnih antitela predmetnog pronalaska (na primer, antitela koja ispoljavaju komplementarnu aktivnost).

[0303] Saglasno tome, pacijentima koji se tretiraju kompozicijom antitela, saglasno pronalasku, može se simultano davati (pre, u isto vreme ili nakon davanja antitela predmetnog pronalaska) i neki drugi terapeutski agens, kao što su citotoksični ili radiotoksični agens, koji pojačava ili uvećava terapeutske efekte predmetnog antitela.

[0304] U drugim primerima izvođenja, subjekt se može dodatno tretirati nekim agensom koji moduliše, na primer pojačava ili inhibira, ekspresiju ili aktivnost Fc-γ ili Fc-α receptora, tretiranjem subjekta nekim citokinom. Poželjni citokini su stimulator granulocitnih kolonija (G-CSF), stimulator granulocitno-makrofagnih kolonija (GM-CSF), interferon-γ (IFN-γ), faktor nekroze tumora (TNF). Ostali agensi koji mogu pojačati terapeutsku efikasnost antitela i farmaceutskih kompozicija koje su ovde opisane, su β-glukani, koji predstavljaju razgranate homopolisaharidne polimere glukoze i koji se proizvode u različitim biljkama i mikroorganizmima, na primer, u bakterijama, algama, gljivama, kvascima i zrnevlju. Moguće je koristiti i fragmente β-glikana koji se prirodno proizvode u navedenim organizmima. Poželjno, β-glikan je polimer β(1,3) glukoze, naznačeno time da osnove makar nekih glukoznih subjedinica, na primer, 3-6 %, sadrže ogranke, kao što su β(1,6) ogranci.

[0305] U jednom primeru izvođenja, otkriće obuhvata postupke za detekciju prisustva CLDN6 antigena u uzorku, ili merenje količine CLDN6 antigena, koji se sastoji od reakcije uzorka i kontrolnog uzorka sa antitelom koje specifično vezuje CLDN6, pod uslovima koji omogućavaju formiranje kompleksa između antigena i antitela ili njegovog dela sa CLDN6. Postupkom se detektuje formiranje kompleksa, pri čemu razlika u količini formiranog kompleksa između uzorka i kontrolnog uzorka ukazuje na prisustvo CLDN6 antigena u uzorku.

U još jednom primeru izvođenja, otkriće obuhvata postupak detekcije prisustva ili kvantifikaciju količine ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani in vivo ili in vitro. Postupak obuhvata (i) davanje kompozicije predmetnog pronalaska subjektu, pri čemu je kompozicija konjugovana sa markerom koji se može detektovati; (ii) izlaganje subjekta sredstvima detekcije naznačenog markera, kako bi se identifikovale zone ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani.

[0306] Opisani postupci su korisni za dijagnostikovanje bolesti povezanih sa ekspresijom CLDN6, kao što su kancerske bolesti. Naročito, kada je količina CLDN6 u uzorku veća od količine CLDN6 u kontrolnom uzorku, takav nalaz ukazuje na prisustvo bolesti povezane sa CLDN6 kod tog subjekta, naročito, kod osobe od koje je uzorak uzet.

[0307] Kada se koristi u postupcima koji su prethodno opisani, antitelo je markirano specifičnom oznakom čija je funkcija da: (i) obezbedi detektabilni signal; (ii) ostvari interakciju sa drugom oznakom, kako bi modifikovao detektabilni signal koji emituje prva oznaka, na primer, FRET (fluorescentno-rezonantni transfer energije); (iii) utiče na mobilnost, na primer, elektroforetsku mobilnost, svojim naelektrisanjem hidrofobnošću, oblikom ili drugim fizičkim parametrima, ili (iv) da obezbedi deo za vezivanje, na primer, afinitet, antitelo/antigen ili jonski kompleks. Pogodni obeležavači su strukture, kao što su fluorescentne oznake, hromofore, radioizotopi, izotipsko obeležavanje, izobarsko obeležavanje, enzimsko obeležavanje, čestično obeležavanje, naročito, obeležavanje metalnim česticama, obeležavanje magnetnim česticama, obeležavanje polimernim česticama, zatim malim organskim molekulima, kao što je biotin, ligandima receptora ili vezujućim molekulima, kao što su ćelijski adhezioni proteini ili lektini, sekvence za obeležavanje koje sadrže nukleinske kiseline i/ili aminokiseline koje se mogu detektovati primenom vezujućih agenasa, itd. Obeleživači obuhvataju, bez ograničenja, barijum sulfat, jocetaminsku kiselinu, jopanoinsku kiselinu, kalcijum jopodat, natrijum diatrizoat, meglumin diatrizoat, metrizamid, natrijum tiropajonat i radiodijagnostike, uključujući emitere pozitrona, kao što su fluor-18 i ugljenik-11, gama-emitere, kao što je jod-123, tehnecijum-99, jod-131, i indijum-111, nuklide za nuklearno magnetnu rezonancu, kao što je fluor i gadolinijum.

[0308] U narednom primeru izvođenja, imunokonjugati se mogu primeniti da omoguće usmeravanje nekih jedinjenja (na primer, terapeutskih agenasa, obeleživača, citotoksina, radiotoksina, imunosupresanata itd.) ka ćelijama koje eksprimiraju CLDN6 na svojoj membrani, tako što će omogućiti vezivanje ovih jedinjenja za antitela. Stoga pronalazak obezbeđuje postupke za lokalizaciju ex vivo ili in vitro onih ćelija koje eksprimiraju CLDN6 i koje se odlikuju asocijacijom CLDN6 na svojoj membrani, kao što su na primer, tumorske ćelije u cirkulaciji.

[0309] Predmetni pronalazak je ilustrovan narednim primerima.

PRIMERI

[0310] Primenjene tehnike i postupci su ovde opisani ili sprovedeni na način koji je poznat po sebi i koji je opisan, u publikaciji, kao što su Sambrook i sar., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Svi postupci, uključujući i upotrebu kompleta i reagenasa sprovode se saglasno uputstvima proizvođača, ukoliko nije drugačije naznačeno.

Primer 1: Kvantifikacija ekspresije CLDN6 u normalnim tkivima, kancerskim tkivima i ćelijskim linijama, primenom RT-PCR u realnom vremenu

[0311] Ukupna ćelijska RNK izolovana iz zamrznutih uzoraka tkiva i kancerskih ćelijskih linija, primenom RNeasy Mini Kit (Qiagen), inkubirana je sa dT18 oligonukleotidima, a zatim je reverzno-transkribovana pomoću Superscript II (GIBCO/Lifetech), prema protokolu proizvođača. Celovitost dobijenih cDNK testirana je amplifikacijom p53 transkripata u 30 ciklusa PCR. Nakon normalizacije nivoa proizvoda u odnosu na ekspresiju mesindžera za HPRT, nivo ekspresije CLDN6 kvantifikovan je primenom postupka ΔΔCT kalkulacije.

[0312] U testiranju su korišćeni uzorci zdravih tkiva uzeti od tri ispitanika. U tim uzorcima zdravih tkiva detektovan je veoma nizak nivo transkripata za CLDN6, u RT-PCR reakciji nakon 40 ciklusa amplifikacije. Jedino zdravo tkivo koje se odlikuje nešto većom ekspresijom, iznad praga detekcije, bilo je tkivo placente.

[0313] Suprotno situaciji utvrđenoj kod zdravih tkiva, detektovana je visoka ekspresija transkripta za CLDN6 u uzorcima kancera jajnika (adenokarcinomi), kancera pluća (NSCLC, sa najvećom frekvencijom i nivoom ekspresije u adenokarcinomima), kancera želuca, kancera dojke, kancera jetre, kancera pankreasa, kancera kože (karcinom bazalnih ćelije i karcinom skvamoznih ćelija), malignog melanoma, kancera glave i vrata (malignog plejomorfnog adenoma), sarkoma (sinovijalnog sarkoma i karcinosarkoma), kancera kanala žučne kese, kancera bubrežnih ćelija (svetloćelijskog karcinoma i papilarnog karcinoma), kancera materice i kancerskih ćelijskih linija A2780 (kancer jajnika), NIH-OVCAR3 (kancer jajnika), HCT-116 (kancer debelog creva), EFO-27 (kancer jajnika), CPC-N (SCLC), NCI-H552 (NSCLC), SNU-1 (kancer želuca), KATOIII (kancer želuca), YAPC (kancer pankreasa), AGS (kancer želuca), FU97 (kancer želuca), MKN7 (kancer želuca).

Primer 2: Kvantifikacija ekspresije CLDN6 u normalnim tkivima i ćelijskim linijama primenom Western blot analize

[0314] Za Western blot analizu, korišćeno je 20 µg ukupnih proteina izolovanih iz ćelija liziranih Lemlijevim puferom za lizu (Laemmli-lysis buffer). Ekstrakti su razblaženi u redukujućem puferu za uzorke (Roth) i podvrgnuti su SDS-PAGE elektroforezi i elektrotransferu na PVDF membranu (Pall). Imunoobeležavanje je sprovedeno primenom poliklonskih antitela specifičnih na CLDN6 (ARP) i beta-aktin (Abcam), nakon čega su primarna antitela obeležena sekundarnim antitelima, kozjim anti-mišjim antitelima konjugovanim sa peroksidazom rena (Dako).

[0315] Tkivni lizati dobijeni od pet davalaca testirani su za sve normalne tipove tkiva. Ni u jednom analiziranom zdravom tkivu nije utvrđena proteinska ekspresija CLDN6. Suprotno tome, visoka ekspresija CLDN6 proteina detektovana je u uzorcima kancera jajnika i kancera pluća. Ekspresija CLDN6 detektovana je u sledećim ćelijskim linijama: NIH-OVCAR3 (kancer jajnika), MKN7 (kancer želuca), AGS (kancer želuca), CPC-N (SCLC), HCT-116 (kancer debelog creva), FU97 (kancer želuca), NEC8 (testikularni embrionalni karcinom), JAR (placentalni horiokarcinom), JEG3 (placentalni horiokarcinom), BEWO (placentalni horiokarcinom) i PA-1 (teratokarcinom jajnika).

Primer 3: Imunohistohemijska (IHC) analiza ekspresije CLDN6 u normalnim tkivima i kancerskim tkivima

[0316] Parafinski tkivni preseci (4 µm) inkubirani su 1 sat na 58°C na ugrejanoj ploči (HI 1220, Leica). Parafin je uklonjen sa preseka, inkubiranjem pločica u rastvoru Roticlear (Roth) tokom 2 ×10 min na RT. Nakon toga preseci su rehidratisani u seriji alkohola (99%, 2 × 96%, 80% i 70%, u svakom po 5 min). Izvedena je procedura povraćaja antigena, kuvanjem pločica na 120°C (15 psi), tokom 15 min u 10 mM citratnom puferu (pH 6.0) 0.05% Tween-20. Neposredno nakon kuvanja, pločice su inkubirane u PBS tokom 5 min. Endogene peroksidaze su blokirane u 0.3% vodonik-peroksidu u MeOH tokom 15 min na RT. Da bi se izbeglo nespecifično vezivanje, preseci su blokirani u 10% kozjem serumu u PBS tokom 30 min na RT. Nakon toga, pločice su inkubirane u prisustvu CLDN6-specifičnog poliklonskog antitela (1 µg/ml) (ARP), tokom noći na 4°C. Sledećeg dana su pločice isprane u PBS na RT (3×5 min) i inkubirane u 100 µl sekundarnih antitela (PowerVision poly HRP-Anti-Rabbit IgG ready-touse (ImmunoLogic)), tokom jednog sata na RT. Pločice su zatim isprane u PBS na RT (3 × 5 min). Finalno bojenje je izvedeno primenom komercijalnog kompleta VECTOR NovaRED Substrate Kit SK-4800, koji je nabavljen od Vector Laboratories (Burlingame). Preseci su dodatno obojeni hematoksilinom tokom 90 sek na RT. Nakon dehidracije u seriji alkohola rastuće koncentracije (70%, 80%, 2× 96% i 99%, svaki po 5 min) i 10 min inkubacije u ksilolu, pločice su fiksirane u X-tra Kit (Medite Histotechnic).

[0317] Ekspresija CLDN6 proteina nije detektovana u normalnim, zdravim tkivima pluća, jajnika, želuca, debelog creva, pankreasa, jetre, dvanaestopalačnog creva i bubrega. Suprotno tome, jako ili značajno bojenje uočeno je na tkivnim presecima dobijenim iz uzoraka ovarijalnog kancera, kancera pluća, kancera kože, kancera pankreasa, kancera želuca, kancera dojke, kancera mokraćne bešike (kancer prelaznih ćelija), kancer grlića materice, kancer testisa (seminom) i kancera materice. Bojenje je naročito naglašeno na ćelijskoj membrani malignih epitelnih ćelija, dok su susedne stromalne i ne-maligne ćelije ostale neobojene. Ovi rezultati ukazuju da je CLDN6 protein lokalizovan na ćelijskoj membrani malignih ćelija.

Primer 4: Dobijanje mišjih antitela specifičnih na CLDN6

a. Dobijanje ekspresionih vektora koji kodiraju CLDN6 pune dužine ili CLDN6 fragmente

[0318] Ne-prirodna, kodon-optimizovana sekvenca DNK (SEQ ID NO: 3), koja kodira punu dužinu CLDN6 proteina (NCBI pristupni broj NP_067018.2, SEQ ID NO: 2) dobijena je hemijskom sintezom (GENEART AG, Germany) i klonirana je u pcDNA3.1/myc-His vektor (Invitrogen, USA), čime je nastao vektor p3953. Insercija stop kodona omogućila je ekspresiju CLDN6 proteina, bez fuzionisanja u vektor kodiran myc-His tagom. Ekspresija CLDN6 ispitana je Western blotom, protočnom citometrijom i imunofluorescencijom, primenom komercijalno dostupnih anti-CLDN6 antitela (ARP, 01-8865; R&D Systems, MAB3656).

[0319] Takođe, sintetisana je fuziona sekvenca sastavljena od kodon-optimizovane DNK sekvence (SEQ ID NO: 4) koja kodira pretpostavljeni vanćelijski domen 2 (EC2) fragmenta CLDN6 (SEQ ID NO: 6), N-terminalne Ig-κ vodeće sekvence, nastale od signalnog peptida i od 4 naredne aminokiseline, kako bi se osigurao odgovarajući signal za mesto delovanja peptidaze (SEQ ID NO: 5) i ta sekvenca je klonirana u pcDNA3.1/myc-His vektor, čime je nastao vektor p3974. Pre imunizacije, ekspresija EC2 fragmenta je potrvđena imunofluorescentnom mikroskopijom na prolazno transfektovanim i u paraformalldehidu fiksiranim (PFA)-fixed CHO-K1 ćelijama, primenom komercijalno dostupnih anti-myc antitela (Cell Signaling, MAB 2276).

b. Dobijanje ćelijskih linija koje stabilno eksprimiraju CLDN6

[0320] HEK293 i P3X63Ag8U.1 ćelijske linije koje stabilno eksprimiraju CLDN6 dobijene su standardnim postupcima pomoću p3953 vektora.

c. Imunizacije

[0321] Balb/c miševi su imunizovani primenom 25 µg p3974 plazmidne DNK, zajedno sa 4 µl PEI-manoze (PEI-Man; in vivo-jetPEI™-Man iz PolyPlus Transfection) (150 mM PEI-Man u H2O sa 5 % glukozom), intraperitonealnom injektovanjem ovog rastvora u sledećim danima: 0, 16 i 36. Nakon 48 i 62 dana, miševi su imunizovani intraperitonealnom injekcijom P3X63Ag8U.1 mijeloma ćelija, transfektovanih p3953 vektorom, tako da stabilno eksprimiraju CLDN6. Ćelije koje su tretirane 62. dana, dodatno su i ozračene intenzitetom zračenja od 3000 rad pre injekcije. Prisustvo antitela specifičnih prema CLDN6 u serumima miševa utvrđeno je imunofluorescentnom mikroskopijom između 20. i 70. dana, pomoću CHO-K1 ćelija koje su transfektovane nukleinskim kiselinama koje kodiraju CLDN6 i GFP. Ovo je postignuto tako što su 24 č nakon transfekcije, ćelije fiksirane u PFA-fiksirane i nefiksirane ćelije inkubirane sa serumom imunizovanih miševa (razblaženje 1:100), tokom 45 min na sobnoj temperaturi (RT). Ćelije su inkubirane sa Alexa555-obeleženim anti-mišjim IgG antitelima (Molecular Probes) i nakon toga analizirane pod fluorescentnim mikroskopom.

[0322] Anti-CLDN6 antitela detekotvana su u uzorcima seruma imunozovanih miševa, zavisno od toga koji je hibridoma F3-6C3-H8 proizveden; videti Sl.2.

[0323] Za dobijanje monoklonskih antitela, imunski odgovor miševa sa merljivim nivoom anti-CLDN6 antitela dodatno su podstaknuti četiri dana pre izolovanja slezine, intraperitonealnom injekcijom 2×107 HEK239 ćelija koje su stabilno transfektovane p3953 vektorom.

d. Dobijanje hibridoma koji proizvode mišja monoklonska antitela usmerena na CLDN6

[0324] 6 × 107 splenocita dobijenih od imunizovanih miševa fuzionisano je sa 3 × 10<7>ćelija mišjeg mijeloma P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL 1580), primenom PEG 1500 (Roche, CRL 10783641001). Ćelije su zasejane u gustini od 5 × 10<4>ćelija po bunarčiću na mikrotitarskim pločama sa ravnim dnom, a zatim su gajene oko dve nedelje u RPMI selektivnom medijumu koji je sadržao 10% toplotno-inaktivirani fetalni goveđi serum, 1% fuzije hibridoma i klonirajućeg suplementa (HFCS, Roche, CRL 11363735), 10 mM HEPES, 1 mM natrijum piruvat, 4.5% glukoza, 0.1 mM 2-merkaptoetanol, 1× penicilin/streptomicin i 1 × HAT suplement (Invitrogen, CRL 21060). Nakon 10 do 14 dana, pojedinačni bunarčići su ispitani protočnom citometrijom na anti-CLDN6 monoklonska antitela. Antitela koja oslobađaju hibridome subklonirana su ograničenim razblaživanjem, a zatim su ponovo testirana na prisustvo anti-CLDN6 monoklonskih antitela. Stabilni subklonovi su kultivisani tako da se dobiju male količine antitela u medijumu kulture za potrebe karakterizacije. Iz svakog hibridoma izabran je najmanje jedan klon koji je zadržao reaktivnost matične ćelije (testirano protočnom citometrijom). Za svaki klon formirano je devet vijalica ćelijske banke koje su uskladištene u tečnom azotu.

Primer 5: Vezujuće karakteristike supernatanta hibridoma i monoklonskih antitela

a. Kontrola kvaliteta prolazno transfektovanih HEK293T ćelija (i) Western blotom i (ii) protočnom citometrijom

[0325]

(i) HEK293T ćelije su transfektovane nukleinskim kiselinama koje kodiraju CLDN3, CLDN4, CLDN6 i CLDN9, ili su lažno-transfektovane. Ekspresija CLDN3, CLDN4, CLDN6 ili CLDN9 u HEK293T ćelijama utvrđena je Western blotom. Da bi se to postiglo, ćelije su prikupljene 24 h nakon transfekcije i lizirane su. Lizati su podvrgnuti SDS-PAGE elektroforezi, preneti na nitroceluloznu membranu i obojeni su anti-CLDN3(A) (Invitrogen, 34-1700), anti-CLDN4(A) (Zymed, 32-9400), anti-CDLN6(A) (ARP, 01-8865) ili anti-CLDN9(A) (Santa Cruz, sc-17672) antitelima koja specifično vezuju C-terminus odgovarajućeg klaudina pod denaturišućim uslovima. Nakon inkubacije sa antitelom obeleženim peroksidazom i razvijanja signala pomoću ECL reagensa, za vizuelizaciju je korišćen LAS-3000 imidžer (Fuji). Trake na odgovarajućim molekulskim težinama za CLDN3, CLDN4, CLDN6 i CLDN9, uočene su samo u transfektovanim ćelijama, ali ne i u kontrolnim uzorcima (Sl. 3), što pokazuje da HEK293T ćelije ne eksprimiraju endogeno ni jedan od testiranih klaudina, pa su tako pogodan model za određivanje unakrsne reaktivnosti CLDN6 antitela.

(ii) HEK293T ćelije iz (i) su dalje analizirane protočnom citometrijom primenom anti-CLDN antitela koja prepoznaju nativne epitope (mišje anti-CLDN3 IgG2a (R&D, MAB4620), mišje anti-CLDN4 IgG2a (R&D, MAB4219), mišje anti-CLDN6 IgG2b (R&D, MAB3656)) antitelo. Za izotipsku kontrolu korišćena su antitela nabavljena od kompanije Sigme, pod kataloškim brojevima M9144 i M8894. Specifičnost ovih anti-CLDN antitela analizirana je na HEK293T ćelijama koje su prolazno transfektovane nukleinskim kiselinama koje kodiraju CLDN3, CLDN4, CLDN6 i CLDN9. Anti-CLDN6 antitela pokazuju unakrsnu reaktivnost sa CLDN3, CLDN4 i CLDN9. Anti-CLDN4 antitela pokazuju unakrsnu reaktivnost sa CLDN3, CLDN6 i CLDN9. Anti-CLDN3 antitela vezuju se specifično za CLDN3 (Sl.4).

b. Određivanje specifičnosti monoklonskih antitela proizvedenih saglasno pronalasku primenom protočne citometrije

[0326] HEK293T ćelije su ko-transfektovane vektorom koji kodira različite CLDN proteine i vektorom koji kodira fluorescentni marker. 24 č posle transfekcije ćelije su prikupljene pomoću 0.05% rastvora tripsin/EDTA i isprane su FACS puferom (PBS uz dodatak 2% FCS i 0.1% natrijum azid). Ćelije su transfektovane na mikrotitar ploče sa U-dnom, u gustini od 2 × 105 ćelija po bunarčiću i inkubirane su 60 min na 4°C sa supernatantom hibridoma. Nakon ispiranja tri puta u FACS puferu, ćelije su inkubirane sa alofikocijaninom (APC)-konjugovanim anti-mišjim IgG 1+2a+2b+3 specifičnim sekundarnim antitelima (Dianova, 115-135-164). Ćelije su zatim isprane dva puta i vezivanje je procenjeno protočnom citometrijom, pomoću BD FACSArray (Sl. 5). Ispitana je funkcija vezivanja antitela zavisno od ekspresije fluorescentnog markera. Komercijalno dostupna mišja anti-CLDN6 IgG2b antitela (R&D, MAB3656) poslužila su kao pozitivna kontrola, dok su antitela nabavljena od Sigme pod brojem M8894, poslužila kao izotipska kontrola.

[0327] Antitela u supernatantnima monoklonskih subklonova hibridoma F3-6C3-H2, F3-6C3-H8, F3-6C3-H9, F3-6C3-D8 i F3-6C3-G4, sva dobijena od F3-6C3, specifična su za CLDN6 i ne vezuju se za CLDN9, CLDN3 i CLDN4. Sl. 5A pokazuje rezultate za monoklonske subklonove hibridoma F3-6C3-H8. Antitela u supernatantima monoklonskih hibridoma subklonova F3-6C3-H8 takođe se vezuju za ćelije transfektovane sa (I143V)-SNP variantom CLDN6 proteina. Antitela iz supernatanta monoklonskog hibridoma subklona F4-4F7-F2 vezuju se za CLDN6 i CLDN9 (Sl. 5A). Antitela iz supernatanta monoklonskog hibridoma subklona F3-7B3-B4 vezuju se za CLDN6, CLDN3 i CLDN9 (Fig. 5B). Antitela iz supernatanta monoklonskog hibridoma subklona F3-3F7-A5 vezuju se za CLDN6, CLDN4 i CLDN9 (Sl.5B).

Primer 6: Dobijanje i testiranje monoklonski antitela usmerenih prema CLDN6

a. Dobijanje ekspresionih vektora koji kodiraju vanćelijski domen 1 CLDN6 proteina

[0328] Sintetisana je fuzionisana sekvenca sačinjena od kodon-optimizovane sekvence DNK (SEQ ID NO: 12), koja kodira pretpostavljeni vanćelijski domen 1 (EC1) fragmenta CLDN6 (SEQ ID NO: 7), vodeće sekvence N-terminusa Ig-κ i naredne 4 aminokiseline kako bi se osigurala ispravna signalna sekvenca za mesto isecanja koje prepoznaje peptidaza (SEQ ID NO: 13), a zatim je ta sekvenca klonirana u pcDNA3.1/myc-His vektor, čime je nastao vektor p3973. Pre imunizacije, ekspresija EC1 fragmenta potvrđena je na CHO-K1 ćelijama koje su prolazno transfektovane CLDN6 i fiksirane u paraformaldehidu, postupkom imunofluorescentne mikroskopije primenom komercijalno dostupnog anti-myc antitela (Cell Signaling, MAB 2276).

b. Imunizacija

[0329] Balb/c miševi su imunizovani sa 25 µg p3973 plazmidne DNK, zajedno sa 4 µl PEI-manoze (PEI-Man; in vivo-jetPEI™-Man iz PolyPlus Transfection) (150 mM PEI-Man u H2O sa 5% glukozom), intraperitonealnom injekcijom nultog i 14. dana. Miševi su subkutano imunizovani 28. i 44. dana, ubrizgavanjem KLH-konjugovanih peptida SEQ ID NO: 14 i SEQ ID NO: 15 (100 µg svaki u PBS, JPT Peptide Technologies GmbH, Germany), zajedno sa PTO-CpG-ODN (25 µg u PBS; 5’-TCCATGACGTTCCTGACGTT; Eurofins MWG Operon, Germany) koja je prečišćena HPLC hromatografijom. Miševi su imunizovani 64 77. i 97. dana, intraperitonealnom injekcijom 2×107 P3X63Ag8U.1 mijeloma ćelija transfektovanih p3953 vektorom koji stabilno eksprimira CLDN6. Pre primene ćelije su tretirane mitomicin-C (2,5 µg/ml, Sigma-Aldrich, M4287). U dane 64 i 97, ćelije su tretirane zajedno sa HPLC-prečišćenim PTO-CpG-ODN (50 µg u PBS), a 77. dana zajedno sa nekompletnim Freundovim adjuvansom.

[0330] Četiri dana pre splenoktomije miševima sa merljivim anti-CLDN6 imunskim odgovorom, intraperitonealno je injektovano 2 × 107 HEK293 ćelija koje su stabilno transfektova p3953 vektorom, kako bi se dodatno podstakla produkcija monoklonskih antitela.

c. Testiranje monoklonskih antitela usmerenih na CLDN6

Protočna citometrija

[0331] Za potrebe testiranja vezivanja monoklonskih antitela za CLDN6 i njegov homolog, HEK293T ćelije su prolazno transfektovane odgovarajućim klaudin-kodirajućim plazmidom, a ekspresija klaudina je nakon toga analizirana protočnom citometrijom. Da bi se transfektovane ćelije razlikovale od ne-transfektovanih, HEK293T ćelije su ko-transfektovane i sa fluorescentnim markerom, kao reporterom. Dvadesetčetiri časa nakon transfekcije, ćelije su prikupljene sa 0.05% tripsin/EDTA, isprane su u puferu za FACS analizu (PBS sa dodatim 2% FCS i 0.1% natrijum azidom) i resuspendovane su u puferu za FACS pri gustini od 2 × 106 ćelija/ml. Zapremina od 100 µl ove ćelijske suspenzije inkubirana je sa odgovarajućim antitelom u naznačenoj koncentraciji tokom 30 min na 4°C. Unakrsno reaktivno antitelo je korišćeno za detekciju ekspresije CLDN6 i CLDN9. Komercijalno dostupna mišja antitela specifična na klaudin, naročito anti-CLDN3 (R&D, MAB4620) i anti-CLDN4 (R&D, MAB4219), poslužila su kao pozitivna kontrola, dok su mišja antitela IgG2a (Sigma, M9144) i IgG2b (Sigma, M8894), poslužila kao izotipske kontrole. Ćelije su tri puta isprane u puferu za FACS i inkubirane su sa APC-konjugovanim anti-mišjim IgG 1+2a+2b+3a specifičnim sekundarnim antitelom (Dianova, 115-135-164), 30 min na 4°C. Ćelije su dva puta isprane i resuspendovane su u puferu za FACS. Vezivanje je analizirano protočnom citometrijom, pomoću BD FACSArray. Ekspresija fluorescentnog markera predstavljena je na horizontalnoj osi, a ispitana funkcija vezivanja antitela predstavljena je na vertikalnoj osi.

CDC

[0332] Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) određena je merenjem sadržaja unutarćelijskog ATP u ne-liziranim ćelijama, nakon dodavanja humanog komplementa ciljnim ćelijama koje su inkubirane u prisustvu anti-CLDN6 antitela. Za veoma osetljivu detekciju ATP primenjena je luminescentna reakcija luciferaze.

CHO-K1 ćelije stabilno transfektovane CLDN6 (CHO-K1-CLDN6) prikupljene su u 0.05% rastvoru tripsin/EDTA, isprane su dva puta u medijumu X-Vivo 15 (Lonza, BE04-418Q) i suspendovane su pri koncentraciji od 1×107 ćelija/ml u istom Xvivo 15 medijumu. Zapremina od 250 µl ćelijske suspenzije preneta je u kivete za elektroporaciju od 0.4 cm i pomešana sa 7 µg in vitro transkribovane informacione RNK za luciferazu (luciferazna IVT RNA). Ćelije su elektroporisane na 200 V i 300 µF, primenom Gene Pulser Xcell (Bio Rad). Nakon elektroporacije, ćelije su suspendovane u 2.4 ml ugrejanog DMEM/F12 (1:1) sa GlutaMax-I medijumom (Invitrogen, 31331-093) kome je dodato 10% (v/v) FCS, 1% (v/v) penicilin/streptomicina i 1.5 mg/ml G418. Zapremina od 50 µl ćelijske suspenzije po bunarčiću zasejana je u bele PP ploče sa 96 bunarčića i inkubirana na 37°C i 7.5% CO2. Dvadesetčetiri časa nakon elektroporacije, ćelijama je dodato po 50 µl mišjeg monoklonskog anti-CLDN6 antitela u 60% RPMI (containing 20 mM HEPES) i 40 % humanom serumu (serumski pul je dobijen od šest zdravih donora) u naznačenoj koncentraciji. U bunarčiće kontrole ukupne lize dodato je po 10 µl 8% (v/v) Triton X-100 rastvorenog u PBS po bunarčiću, dok je u kontrole max viabilne ćelije, kao i u testirane uzorke dodato po 10 µl PBS / bunarčiću. Nakon inkubacije 80 min na 37°C i pri 7.5% CO2, u svaki bunarčić je dodato po 50 µl mešavine luciferina (3.84 mg/ml D-luciferina, 0.64 U/ml ATPaze i 160 mM HEPES u ddH2O). Ploča je inkubirana u mraku, 45 min na RT. Luminescencija je izmerena pomoću luminometra (Infinite M200, TECAN). Rezultati su predstavljeni kao integrisane relativne vrednosti svetlosnih jedinica (RLU).

[0333] NEC8 ćelije su elektroporisane na 200 V i 400 µF i gajene su u RPMI 1640 medijumu sa dodatkom GlutaMAX-I medijuma (Invitrogen, 61870) kome je dodato 10% (v/v) FCS. Specifična liza izračunata je na sledeći način:

max vijabilne ćelije: 10 µl PBS, bez antitela

ukupna liza: 10 µl 8% (v/v) Triton X-100 u PBS, bez antitela

Rani tretman

[0334] Za rani tretman antitelima, u bok atimičnog Nude-Foxn1<nu>miša subkutano je inokulirano 2 × 107 NEC8 ćelija u in 200 µl PBS. Svaka od eksperimentalnih grupa sastojala se od po deset ženki miševa starih 6-8 nedelja. Tri dana nakon inokulacije, tokom narednih 46 dana dva puta nedeljno je administrirano po 200 µg prečišćenih mišjih monoklonskih antitela muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B i 67A, putem naizmeničnih intravenskih i intraperitonealnih injekcija. Eksperimentalne jedinke tretirane PBS poslužile su kao negativne kontrole. Zapremina tumora (TV = (dužina×širina<2>)/2) određivana je jednom u dve sedmice. Vrednost TV je izražena u mm<3>, na osnovu čega su konstruisane krive rasta tumora tokom vremena. Kada je tumor dostigao zapreminu veću od 1500 mm<3>životnja je žrtvovana.

d. Rezultati

[0335] Mišja monoklonska antitela muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B i 67A ispoljila su snažno vezivanje za humani CLDN6 i za CLDN6 SNP (polimorfizam pojedinačnog nukleotida) varijantu I143V, a antitela se nisu vezivala za CLDN3, 4, i 9 (Sl.6).

[0336] MuMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B i 67A ispoljila su niske EC50 vrednosti (EC50 200-500 ng/ml), dok je zasićenje vezivanja postignuto pri niskim koncentracijama (Sl.

7).

[0337] MuMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B i 67A izazavala su CDC aktivnost na doznozavisan naičin i indukovala su CDC pri niskim koncentracijama (Sl.8). Anti-CLDN6 antitela muMAB 65A i 66B indukovala su CDC na NEC8 ćelijama na dozno-zavisan način (Sl. 9). Ciljna specifičnost muMAB 65A i 66B dokazana je na NEC8 LVTS254 ćelijama (nokdauni za CLDN6).

[0338] Antitela muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B i 67A izazvala su inhibiciju rasta kod miševa sa presađenim NEC8 ćelijama (Sl.10).

Primer 7: Dobijanje i testiranje himernih monoklonskih antitela usmerenih prema CLDN6

a. Dobijanje mišjih/humanih himernih monoklonskih antitela

[0339] Za dobijanje himernih antitela, varijabilni regioni mišjeg teškog i lakog lanca, zajedno sa vodećim sekvencama amplifikovani su PCR postupkom, primenom prajmera predstavljenih u narednoj tabeli. Mišji teški lanci fuzionisani su, posredstvom ApaI restrikcionog mesta (5’-GGGCCC-3’), za N- terminalni deo humanog Fc-γ1 lanca, koji je kodiran sa ekspresionog vektora. Varijabilni domeni mišjeg κ-lanca klonirani su zajedno sa vodećim sekvencama, ispred konstantnog regiona, posredstvom BsiWI restrikcionog mesta. Pravilna orijentacija konstantnog regiona u vektoru potvrđena je sekvencioniranjem. Zbog pozicije ApaI restrikcionog mesta, amplifikacija varijabilnog regiona zajedno sa vodećom sekvencom za ove svrhe mora da obuhvati prvih 11 nukleotida sekvence humanog γ-1 konstantnog regiona uz sekvencu ApaI mesta. Nukleotidna sekvenca humanog γ-1 teškog lanca predstavljena je kao SEQ ID NO: 24, dok je aminokiselinska sekvenca tako eksprimiranog humanog γ-1 konstantnog regiona predstavljena u SEQ ID NO: 25. Nukleotidna sekvenca koja kodira konstantni deo κ-lakog lanca predstavljena je u SEQ ID NO: 26, dok je odgovarajuća aminokiselinska sekvenca predstavljena u SEQ ID NO: 27.

Tabela 1. Mišje hibridoma ćelijske linije korišćene za dobijanje antitela

[0340] Himerna monoklonska antitela imenovana su dodavanjem prefiksa “chim” na naziv odgovarajućeg mišjeg antitela, na primer, chimAB 64A.

[0341] Amplifikacija mišjih varijabilnih regiona lakog i teškog lanca zajedno sa vodećom sekvencom sprovedena je saglasno “step-out” PCR postupku, koji su opisali Matz i sar. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 6). Za ove svrhe, izolovana je ukupna RNK iz monoklonskih ćelijskih linija hibridoma (vidi Tabelu 1, primenom standardnog postupka poznatog u tehnici, na primer, primenom kompleta RNeasy Mini Kit (Qiagen). Jednolančana cDNK pripremljena je saglasno “template-switch” postupku (koji je takođe opisan kod Matz i sar. (Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, No. 6, 1558). Osim (dT)30 oligomera (SEQ ID NO: 28), dodat je i DNK/RNK hibridni oligomer (SEQ ID NO: 29), koji je poslužio kao 5ˈ adapter za promenu matrice tokom polimerizacije cDNK lanca. U ovom adapterskom oligomeru, najmanje tri poslednja nukleotida bila su ribonukleotidi, umesto dezoksiribonukleotida. Sledeća faza "step-out PCR" koristila je antisens oligomer sa konstantnim regionom mišjeg κ-lanca ili konstantnim regionom podklase 2a γ-lanca (SEQ ID NO: 30 i 31). IgG podklasa mišjih monoklonskih antitela koja je dobijena u ćelijskim linijama hibridoma prethodno je imunološki analizirana primenom IsoStrip (Roche), a na osnovu toga je izabran antisens oligomer (vidi Tabela 1). Mešavina prajmera koja je poslužila kao sens oligomer u "step-out PCR", sadržala je dva oligomera čije su sekvence navedene u SEQ ID NO: 32 i 33.

[0342] Identifikovani mišji varijabilni regioni, uključujući i vodeće sekvence, zatim su amplifikovani primenom PCR, uz izostavljanje 5ˈ UTR i 3ˈ mišjeg konstantnog regiona, i uz dodavanje restrikcionih mesta na krajeve, koji omogućavaju subkloniranje u pripremljene ekspresione vektore koji nose konstantne regione humane sekvence. Uz to, sens-oligomeri su obezbedili konsenzusnu Kozakovu sekvencu (5’-GCCGCCACC-3’), dok su antisens oligomeri za varijabilne regione teškog lanca obuhvatili prvih 11 nukleotida humanog gama 1 konstantnog regiona, uz ApaI restrikciono mesto (videti Tabelu 1, SEQ ID NO: 17 do 23). Varijabilni regioni κ-lakog lanca, zajedno sa vodećim sekvencama klonirani su pomoću HindIII i BsiWI restrikcionih mesta, a varijabilni regioni γ-teškog lanca zahtevali su HindIII i ApaI restrikcione enzime.

[0343] Amplifikovani su i drugi mišji varijabilni regioni lakog i teškog lanca zajedno sa vodećim sekvencam, a himerna monoklonska antitela specifična prema CLDN6 dobijena su prema protokolima koji se ovde opisani.

b. Dobijanje himernih monoklonskih anti-CLDN6 antitela

[0344] Himerna monoklonska antitela su prolazno eksprimirana u HEK293T ćelijama (ATCC CRL-11268) koje su transfektovane plazmidnom DNK koja kodira laki i teški lanac odgovarajućeg antitela. Dvadesetčetiri časa pre transfekcije, 8 × 10<7>ćelija zasejano je na 145-mm posude za ćelijsku kulturu, a ćelije su gajene u 25 ml HEK293T-medijuma (DMEM/F12 GlutaMAX-I, 10% FCS, 1% penicilin/streptomicin). U svakom sudu za ćelijsku kutluru, 20 µg plazmidne DNK rastvoreno je u 5 ml HEK293T-medijuma bez ostalih suplemenata. Nakon dodavanja 75 µl linearnog polietlenimina (PEI) (1 mg/ml) (Polyscience, 23966), smeša (DNA:PEI) je inkubirana 15 min na RT. Ćelijama je nakon toga, kap po kap, dodata mešavina za transfekciju. Nakon 24 h, HEK293T-medijum je zamenjen Pro293a-medijumom (Lonza, BE12-764Q) sa dodatkom 1% penicilin/streptomicina. Da bi se obezbedila optimalna ekspresija, transfektovane ćelije su gajene na 37°C i u atmosferi ugljen-dioksida od 7.5% CO2, tokom sledećih 96 do 120 sati. Supernatant je prikupljen, a himerna antitela su iz njega prečišćena pomoću FPLC hromatografije na protein-A koloni. Određena je koncentracija i antitela su kvalitativno testirana primenom SDS-PAGE elektroforeze.

c. Testiranje himernih monoklonskih antitela specifičnih prema CLDN6

Protočna citometrija

[0345] Specifičnost i afinitet vezivanja CLDN6-specifičnih himernih monoklonskih antitela prema HEK293 ćelijama stabilno transfektovanim sa CLDN3, 4, 6 ili 9, kao i prema tumorskim ćelijskim linijama koje endogeno eksprimiraju CLDN6, analizirani su protočnom citometrijom. Ćelije su prikupljene u 0.05% Tripsin/EDTA, isprane su u puferu za FACS analizu (PBS sa dodatkom 2% FCS i 0.1 % natrijum azida) i resuspendovane su u puferu za FACS, u koncentraciji od 2×106 ćelija/ml. Zapremina od 100 µl ove ćelijske suspenzije inkubirana je sa odgovarajućim antitelom u naznačenoj koncentraciji, tokom 60 min na 4°C. Himerna, unakrsno reaktivna antitela (chimAB 5F2D2) korišćena su da detektuju ekspresiju CLDN6 i CLDN9. Komercijalno dostupna mišja anti-klaudin anti-CLDN3 (R&D, MAB4620) i anti-CLDN4 antitela (R&D, MAB4219) služila su kao pozitivna kontrola, dok je humano IgG1-κ (Sigma, I5154) poslužilo kao negativna kontrola. Ćelije su isprane tri puta u puferu za FACS i inkubirane su 30 min na 4 °C, u prisustvu APC-konjugovanih kozjih anti-humanih IgG Fc-γ (Dianova, 109-136-170) ili APC-konjugovanih anti-mišjih IgG 1+2a+2b+3a (Dianova, 115-135-164) specifičnih sekundarnih antitela. Ćelije su dva puta isprane i resuspendovane u puferu za FACS. Vezivanje je analizirano protočnom citometrijom, pomoću BD FACSArray.

CDC

[0346] Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) određena je merenjem unutarćelijske koncentracije ATP u neliziranim ćelijama nakon dodavanja humanog komplementa ciljnim ćelijama koje su inkubirane u prisustvu anti-CLDN6 antitela. Kao veoma senzitivan analitički postupak za merenje ATP primenjena je bioluminescentna reakcija luciferaze.

U ovom testu, korišćene su NEC8 ćelije divljeg tipa (CLDN6 pozitivne) i NEC8 ćelije nokdauni za CLDN6 (CLDN6 negativne), pri čemu su obe linije stabilno transdukovane ekspresionim vektorom za luciferazu. Ćelije su prikupljene u 0.05% Tripsin/EDTA rastvoru i podešena im je koncentracija na 2×10<5>ćelija/ml u RPMI sa GlutaMax-I medijumom (Invitrogen, 61870-010) koji je obogaćen 10% (v/v) FCS. Ćelije 1 × 10<4>su zasejane na bele PP-ploče sa 96 bunarčića i inkubirane su tokom 24 h na 37°C i u atmosferi sa 5% CO2. Nakon inkubacije, ćelijama je dodato po 50 µl monoklonskih himernih anti-CLDN6 antitela rastvorenih u 60% RPMI medijumu (u 20 mM HEPES) u naznačenoj koncentraciji i 40% humanom serumu (serumski pul je dobijen od šest zdravih donora). Zatim je u svaki bunarčić za kontrole ukupne lize dodato po 10 µl 8% (v/v) Triton X-100 u PBS, dok je u bunarčiće za max vijabilne kontrole i uzorke dodato po 10 µl PBS. Nakon inkubacije od 80 min na 37 °C i u atmosferi 5% CO2, u svaki bunarčić je dodato 50 µl mešavine za luciferin (3.84 mg/ml D-luciferin, 0.64 U/ml ATPaza i 160 mM HEPES u ddH2O). Ploča je inkubirana u mraku na RT tokom 45 min. Bioluminescencija je izmerena luminometrom (Infinite M200, TECAN). Rezultati se predstavljeni kao integrisani brojevi relativnih svetlosnih jedinica (RLU).

[0347] Specifična liza se izračunava sledećom formulom:

max vijabilne ćelije: 10 µl PBS, bez antitela

ukupna liza: 10 µl 8% (v/v) Triton X-100 u PBS, bez antitela

ADCC

[0348] Citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) određena je merenjem sadržaja unutarćelijskog ATP u ne-liziranim ćelijama nakon dodavanja humanog PBMC ciljnim ćelijama koje su inkubirane u prisustvu anti-CLDN6 antitela. Kao veoma senzitivan analitički postupak za merenje ATP primenjena je bioluminescentna reakcija luciferaze.

[0349] U ovom testu, korišćene su NEC-8 ćelije divljeg tipa (CLDN6 pozitivne) i NEC-8 ćelije koje su nokdauni za CLDN6 (CLDN6 negativne), a obe ćelijske linije stabilno su transdukovane ekspresionim konstruktom za luciferazu. Ćelije su prikupljene u 0.05% Trisin/EDTA i koncentracija im je podešena na 2×10<5>ćelija/ml u RPMI, sa dodatkom GlutaMax-I medijuma (Invitrogen, 61870-010) obogaćenog 10% (v/v) FCS i 20 mM Hepes rastvorom. Ćelije 1 × 10<4>su zasejane na bele PP-ploče sa 96 bunarčića i inkubirane su 4 č na 37 °C i u atmosferi 5% CO2. PBMC je izolovan iz krvi donora, centrifugiranjem u gradijentu gustine Ficoll Hypaque (GE Healthcare, 17144003). Izolovana je međufaza koja je sadržala PMBC i ćelije su dva puta isprane rastvorom PBS/EDTA (2 mM). PBMC ćelije, 1 × 10<8>, zasejane su sa 50 ml X-Vivo 15 medijuma (Lonza, BE04-418Q), obogaćenog 5% toplotnoinaktiviranim serumom (Lonza, US14-402E) i inkubirane su 2 č na 37 °C i u atmosferi 5% CO2.

[0350] Četiri sata nakon zasejavanja ciljnih ćelija (NEC-8), ćelijama je dodato 25 µl himernih monoklonski anti-CLDN6 antitela, rastvorenih u PBS u naznačenoj koncentraciji. Neadherirane PBMC, koje su se odvojile tokom prva 2 sata inkubacije od adheriranih monocita, prikupljene su i podešene na koncentraciju od 8 × 10<6>ćelija/ml u X-vivo 15 medijumu. Zapremina of 25 µl ove ćelijske suspenzije dodata je ciljnim ćelijama i monoklonskim himernim anti-CLDN6 antitelima. Ploče su inkubirane 24 h na 37 °C i u atmosferi 5% CO2.

Nakon inkubacije od 24 h, u svaki bunarčić za kontrole totalne lize dodato je po 10 µl 8% (v/v) Triton X-100 u PBS, dok je u bunarčiće sa kontrolom max vijabilne ćelije i uzorke, dodato po 10 µl PBS. U svaki bunarčić je zatim dodato po 50 µl mešavine za luciferin (3.84 mg/ml D-luciferin, 0.64 U/ml ATPaze i 160 mM HEPES u ddH2O). Ploče su inkubirane u mraku na RT, 30 min. Bioluminescencija je izmerena luminometrom (Infinite M200, TECAN). Rezultati su predstavljeni kao integrisani brojevi relativnih svetlosnih jedinica (RLU).

[0351] Specifična liza je izračunata na sledeći način:

max vijabilne ćelije: 10 µl PBS, bez antitela

ukupna liza: 10 µl 8% (v/v) Triton X-100 u PBS, bez antitela

d. Rezultati

[0352] Anti-CLDN6 himerna monoklonska antitela, chimAB 61D, 64A, 67A i 89A ispoljila su sposobnost snažnog vezivanja za humani CLDN6, ali ne i za CLDN3, 4, i 9 (Sl.11).

[0353] U vezi sa vezivanjem za humani CLDN6 stabilno eksprimiran na površini HEK293 ćelije, anti-CLDN6 himerna monoklonska antitela chimAB 64A i 89A ispoljavaju veoma niske EC50 vrednosti (EC50 450-600 ng/ml), a saturacija vezivanja se postiže pri niskim koncentracijam. ChimAB 67A i 61D ispoljavaju nisku (EC50 = 1000 ng/ml) i umerenu (EC50 2300 ng/ml) EC50 vrednost (Sl.12).

[0354] U vezi sa vezivanjem za CLDN6 endogeno eksprimiran na NEC8 ćelijama, anti-CLDN6 himerna monoklonska antitela, chimAB 64A i 89A ispoljavaju veoma niske EC50 vrednosti (EC50600-650 ng/ml), a saturacija vezivanja se postiže pri niskim koncentracijama, dok chimAB 61D i 67A ispoljavaju umerenu (EC501700 ng/ml) i visoku (EC50 6100 ng/ml) EC50 vrednost (Sl.13).

[0355] U vezi sa vezivanjem za CLDN6 endogeno eksprimiran na OV90 ćelijama, anti-CLDN6 himerna monoklonska antitela, chimAB 64A i 89A, ispoljavaju veoma niske EC50 vrednosti (EC50550-600 ng/ml), a saturacija vezivanja se postiže pri niskim koncentracijama. ChimAB 61D i 67A ispoljavaju umerene EC50 vrednosti (EC50 1500 ng/ml, odnosno, EC50 2300 ng/ml) (Sl.14).

[0356] Anti-CLDN6 himerna monoklonska antitela chimAB 61D, 64A, 67A i 89A, ispoljavaju CDC aktivnost na dozno-zavisan način na NEC-8 ćelijama (Sl.15).

[0357] Anti-CLDN6 himerna monoklonska antitela, chimAB 61D, 64A, 67A i 89A ispoljavaju dozno-zavisnu ADCC aktivnost na NEC-8 ćelijama i indukuju ADCC, čak i pri niskim koncentracijama antitela (Sl.16).

[0358] Ovi rezultati jasno pokazuju specifičnost himernih antitela za CLDN6.

Primer 8: Tretman pomoću monoklonskih antitela usmerenih protiv CLDN6

Rani tretman

[0359] Za rane tretmane antitelima, 2×107 NEC8 ćelija u 200 µl RPMI medijuma (Gibco), inokulirano je subkutano u bok atimičnih Nude-Foxn1<nu>miševa. Svaka eksperimentalna grupa sastojala se od deset ženki, starosti 6-8 nedelja. Tri dana nakon inokulacije tumora, početa je primena po 200 µg prečišćenih mišjih monoklonskih antitela muMAB 89A, tokom sedam nedelja, naizmeničnom intravenskom i intraperitonealnom injekcijom dva puta nedeljno. Eksperimentalna grupa tretirana PBS poslužila je kao negativna kontrola. Zapremina tumora (TV = (dužina × širina<2>)/2) određena je na svake dve nedelje. Vrednosti TV predstavljene u mm<3>, omogućavaju konstrukciju krive rasta tumora tokom vremena. Kada su tumori prevazišli zapreminu od 1500 mm<3>, miševi su žrtvovani.

Tretman uznapredovalog tumora

[0360] Za tretman uznapredovalih ksenograftskih tumora antitelima, 2 × 107 NEC8 ćelija u 200 µl RPMI medijuma (Gibco) je subkutano inokulirano u bok 6-8 nedelja starih ženki atimičnog Nude-Foxn1<nu>miša. Zapremina tumora (TV = (dužina × širina<2>)/2) merena je dvonedeljno. Rezultati TV se izražavaju u mm<3>, što omogućava konstrukciju krive rasta tumora tokom vremena. Petnaest do sedamnaest dana nakon inokulacije tumorskih ćelija, miševi su podeljeni u dve grupe, svaka sa po 8 životinja i sa homogenom veličinom tumora od preko 80 mm<3>. Prečišćena mišja monoklonska antitela muMAB 61D, 64A, 67A i 89A primenjena su u količini od 200 tokom pet nedelja, alternativnim intravenskim i intraperitonealnim injektovanjem dva puta nedeljno. Eksperimentalna grupa tretirana PBS i nespecifičnim antitelom je služila kao negativna kontrola. Kada su tumori dostigli zapreminu veću od 1500 mm<3>, miševi su žrtvovani.

[0361] U ranom tretmanu ksenografta na miševima sa presađenom tumorskom linijom NEC8, kod miševa tretiranih mišjim monoklonskim antitelima muMAB 61D, 64A i 67A nije uočen rast tumora, čak ni nakon prekida imunoterapije (Sl.17).

[0362] U ranom tretmanu ksenografta na miševima sa presađenom tumorskom ćelijskom linijom NEC8, antitela muMAB 89A izazvala su inhibiciju rasta tumora, a tumori nisu detektovani ni kod miševa tretiranih muMAB89A antitelima sve do kraja studije (Sl.18).

[0363] U modelu tretmana uznapredovalog ksenografta kod miša sa presađenom tumorskom ćelijskom linijom NEC8, antitela muMAB 64A su inhibirala rast tumora (Sl.19).

[0364] U uznapredovalom tretmanu ksenografta na miševima sa presađenom tumorskom linijom NEC8, miševi tretirani muMAB 64A su ispoljili produženo preživljavanje (Sl.20).

[0365] U tretmanu uznapredovalog ksenografta na miševima sa presađenom tumorskom linijom NEC8, inhibicija rasta tumora postignuta je mišjim monoklonskim anti-CLDN6 antitelom muMAB 61D, 67A i 89A (Sl.21).

[0366] U tretmanu uznapredovalog ksenografta na miševima sa presađenom tumorskom linijom NEC8, miševi tretirani CLDN6-specifičnim antitelima, muMAB 61D ili 67A, duže su preživljavali u odnosu na kontrolne jedinke (Sl.22).

[0367] U tretmanu uznapredovalog ksenografta na mišu sa presađenom tumorskom linijom NEC8 divljeg tipa i NEC8 ćelija sa stabilnim CLDN6 nokdaunom, muMAB 64A i 89A antitela pokazala su teraputski efekat samo kod miševa sa presađenim NEC8 divljim tipom, ali ne i kod miševa sa NEC8 CLDN6 nokdaunom, što pokazuje CLDN6-specifičnost ovih antitela in vivo (Sl.23).

Primer 9: Mapiranje epitopa visoke rezolucije u monoklonskim antitelima specifičnim za CLDN6

[0368] CLDN6-specifična monoklonska antitela pokazala su veoma slabo vezivanje ili odustvo vezivanja za linearne peptide u ELISA epitop-mapirajućim analizama, što ukazuje da je njihov epitop konformacione prirode. Da bi se analizirala interakcija između opisanih antitela i CLDN6 u njegovoj nativnoj konformaciji, za epitopsko mapiranje primenjen je postupak usmerene mutageneze u sisarskoj ćelijskoj kulturi. Urađena je alanin-skenirajuća mutageneza aminokiselina u domenu od 27-81 i 137-161 unutar prvog i drugog vanćelijskog domena. Nakon prolazne ekspresija u HEK293T ćelijama, procenjena je sposobnost CLDN6 mutanata da se za njih specifično vežu monoklonska antitela saglasno pronalasku. Otežano vezivanje specifičnih monoklonskih antitela za CLDN6 mutante ukazuje da je mutirana aminokiselina važna za kontakt i/ili funkcionalnu konformaciju. Vezivanje antitela je analizirano protočnom citometrijom. Da bi se omogućilo razlikovanje netransfektovanih ćelija od transfektovanih, ćelije su ko-transfektovane fluorescentnim markerom.

Aminokiselinski ostaci CLDN6 važni za interakciju sa CLDN6-specifičnim himernim antitelima sistematski su identifikovani alaninskim skeniranjem. Mutacije alanina i glicina su izazvane usmerenom mutagenezom (GENEART AG, Germany). Da bi se testiralo vezivanje monoklonskih himernih antitela za divlji tip CLDN6 i njegove mutante, HEK293T ćelije su prolazno transfektovane odgovarajućim klaudin-kodirajućim plazmidom i ekspresija je analizirana protočnom citometrijom. Transfektovane ćelije su razlikovane od netransfektovanih ćelija tako što su HEK293T ćelije ko-transfektovane fluorescentnim markerom, koji je služio kao reporter. Dvadesetčetiri časa nakon transfekcije, ćelije su prikupljene u 0.05% Tripsin/EDTA, isprane su u puferu za FACS (PBS sa dodatim 2% FCS i 0.1% natrijum azidom) i resuspendovane su u puferu za FACS, pri koncentraciji od 2×106 ćelija/ml. Ova ćelijska suspenzija u zapremini od 100 µl inkubirana je sa 10 µg/ml antitela, 45 min na 4 °C. Komercijalno dostupna mišja anti-CLDN6 antitela (R&D, MAB3656) primenjena su kao kontrola za detekciju površinske ekspresije CLDN6 mutanata. Ćelije su isprane tri puta u puferu za FACS i inkubirane su u prisustvu APC-konjugovanih kozjih antihumanih IgG Fc-γ antitela (Dianova, 109-136-170) ili u prisustvu APC-konjugovanih antimišjih IgG 1+2a+2b+3a specifičnih sekundarnih antitela (Dianova, 115-135-164), tokom 30 min na 4 °C. Ćelije su dva puta isprane i resuspendovane u puferu za FACS. Vezivanje unutar transfektovane populacije ćelija analizirano je protočnom citometrijom, pomoću BD FACSArray. Ekspresija fluorescentnog markera je predstavljena na horizontalnoj osi, nasuprot vezivanju antitela koje je naneto na vertikalnu osu. Prosečan intenzitet fluorescentnog signala monoklonskog himernog CLDN6 specifičnog antitela vezanog za mutante CLDN6 iskazano je kao procenat vezivanja u odnosu na divlji tip. Aminokiseline na pozicijama koje su presudne za vezivanje antitela nisu bile vezane kod mutanata, dok su aminokiselinske pozicije koje podržavaju vezivanje pokazale redukovano vezivanje u poređenju sa divljim tipom.

[0369] Epitopsko mapiranje visoke rezolucije pokazalo je da su aminokiseline F35, G37, S39 i moguće, T33 unutar prvog vanćelijskog domena CLDN6 proteina važne za interakciju sa CLDN6-specifičnim himernim antitelima, chimAB 61D, 64A, 67A i 89A. Pozicija I40 je presudna za vezivanje chimAB 89A i ona doprinosi vezivanju chimAB 61D i 67A. Osim toga, L151 u drugom vanćelijskom domenu CLDN6 važan je za interakciju sa chimAB 67A (Sl. 24).

Primer 10: Dobijanje i testiranje poboljšanih monoklonskih antitela speicifčnih prema CLDN6

[0370] Pokazalo se da antitelo 64A, iako izvanredno u pogledu svojstva vezivanje za CLDN6 i efikasnosti u pogledu tretmana tumora, ima slobodan cisteinski ostatak na poziciji 46 lakog lanca, što potencijalno ugrožava njegova svojstva vezana za solubilnost, stabilnost i formiranje agregata. Slobodan cisteinski ostatak je nepoželjan i iz drugih razloga koji se tiču regulacije aktivnosti. Stoga smo pokušali da napravimo antitelo na bazi 64A, koje bi zadržalo željena svojstva, a ne bi imalo slobodan cisteinski ostatak na poziciji 46.

[0371] Himerno monoklonsko antitelo mAb206-LCC generisano je kombinovanjem teškog lanca chimAB 64A sa lakim lancem chimAB 61D. MAb206-SUBG i mAb206-SUBS su konstruisani amino-kiselinskom supstitucijom. Da bi se ovo postiglo, cistein na poziciji 46 u lakom lancu chimAB 64A supstituisan je glicinom ili serinom.

Dobijanje himernih monoklonskih anti-CLDN6 antitela u HEK293T ćelijama

[0372] Humerna monoklonska antitela se prolazno eksprimiraju u HEK293T ćelijama (ATCC CRL-11268), transfektovanim plazmidnom DNK koja kodira laki i težki lanac odgovarajućih antitela, kao što je opisano u odeljku b, Primera 7.

Dobijanje himernih monoklonski anti-CLDN6 antitela u suspenziji adaptiranih CHO-ćelija

[0373] Suspenzija adaptiranih CHO-ćelija je pod-kultivisana u medijumu bez seruma u CO2šejkeru sa ovlaživačem. Jedan dan pre transfekcije, ćelije su zasejane u u medijumu bez seruma u šejker flaskove. Na dan transfekcije ćelije su prvo centrifugirane (5 min at 200 × g), a zatim su resuspendovane u svežem DMEM-medijumu (Invitrogen, 41965-039) u flaskovima za šejker. Reagensi za DNK i RNK transfekciju dodati su ćelijama i sve je pažjivo promešano. Nakon statičke inkubacije u CO2inkubatoru, ćelije su razblažene medijumom bez seruma i dalje kultivisane za ekspresiju u inkubacionom šejkeru. Nultog, 2, 4 i 6. dana ćelijama dodat CHO CD EfficientFeed™ A i B (Invitrogen, A1023401 and A1024001). Himerna antitela su prikupljena nakon što je vijabilnost ćelija pala ispod 90%. Antitela su prečišćena pomoću FPLC hromatografije, na protein-A koloni. Koncentracija antitela određena je merenjem apsorbance na 280 nm, a prečišćenost je analizirana SDS-PAGE elektroforezom.

Protočna citometrija

[0374] Vezivanje CLDN6-specifičnih himernih monoklonskih antitela za ćelije koje eksprimiraju ciljni protein, analizirana je protočnim citometrijom. Ćelije su prikupljene u 0.05% Tripsin/EDTA, isprane su u puferu za FACS (PBS dopunjen 2% FCS i 0.1% natrijum azidom) i resuspendovane su u puferu za FACS u koncentraciji od 2×106 ćelija/ml. Zapremina od 100 µl ove ćelijske suspenzije inkubirana je sa odgovarajućim antitelom u naznačenoj koncentraciji, 30 min na 4 °C. Primenjeno je chimAB 5F2D2 antitelo kako bi se detektovala ekspresija CLDN6 i CLDN9. Komercijalno dostupna mišja anti-klaudin antitela, anti-CLDN3 (R&D, MAB4620) i anti-CLDN4 (R&D, MAB4219), poslužila su kao pozitivna kontrola, dok su čovečja IgG1-κ antitela (Sigma, I5154) poslužila kao negativna kontrola. Ćelije su isprane tri puta u puferu za FACS i inkubirane 30 min na 4 °C, u prisustvu APC-konjugovanih kozjih anti-čovečjih IgG Fc-γ (Dianova, 109-136-170) ili APC-konjugovanih anti-mišjih IgG 1+2a+2b+3a (Dianova, 115-135-164) specifičnih sekundarnih antitela. Ćelije su isprane dva puta i resuspendovane u puferu za FACS. Vezivanje je analizirano protočnom citometrijom, pomoću BD FACSArray.

CDC

[0375] Citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC) određena je merenjem unutarćelijskog sadržaja ATP u ne-liziranim ćelijama nakon dodavanja čovečjeg komplementa ciljnim ćelijama inkubiranim sa anti-CLDN6 antitelima, kao što je opisano u odeljku c u Primeru 7. ADCC

[0376] Citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC) određena je merenjem unutarćelijskog sadržaja ATP u ne-liziranim ćelijama, nakon dodavanja čovečjeg PBMC ciljnim ćelijama inkubiranim sa anti-CLDN6 antitelima. Kao analitički osetljiv postupak merenja ATP primenjena je bioluminescentna reakcija luciferaze.

U ovom testu korišćene su NEC-8 ćelije divljeg tipa (CLDN6 pozitivne) i NEC-8 ćelije nokdauni za CLDN6 (CLDN6 negativne), a obe su linije stabilno transdukovane luciferaznom RNK, dok su OV90 ćelije prolazno transfektovane IVT-RNK koja kodira luciferazu. Ćelije su prikupljene u 0.05% Tripsin/EDTA i podešena im je koncentracija na 2×10<5>ćelija/ml (NEC-8 ćelije divljeg tipa i CLDN6 nokdaun ćelije) ili na 1×10<6>ćelija/ml (OV90), u odgovarajućim medijumima, obogaćenim 20 mM Hepes. Ćelije, 1×10<4>ili 5×10<4>, zasejane su na bele PP-ploče sa 96 bunarića i inkubirane su na 37 °C, u atmposferi 5% CO2.

PBMC su izolovane iz krvnih uzoraka donora, na gradijentu gustine fikola (Ficoll Hypaque, GE Healthcare, 17144003). PMBC ćelije izolovane u međufazi su isprane dva puta u PBS/EDTA (2 mM). PBMC ćelije, 1×10<8>, zasejane su u 50 ml X-Vivo 15 medijuma (Lonza, BE04-418Q), dopunjenog 5% čovečjim serumom (serumski pul je dobijen od šest zdravih davalaca) i inkubirane su 2 h na 37 °C i u 5% CO2.

Četiri sata nakon zasejavanja ciljnih ćelija, dodato je 25 µl monoklonskih himernih anti-CLDN6 antitela u PBS u naznačenoj koncentraciji. Neadherirane PBMC, koje su se odvojile u prva 2 sata inkubacije od adheriraniih monocita, prikupljene su i podešena im je koncentracija od 1.6×107 ćelija /ml (za eksperiment sa NEC-8 divljim tipom ili CLDN6 nokdaun) ili na 4×107 ćelija/ml (za eksperiment sa OV90 ćelijama) u X-vivo 15 medijumu.

[0377] Zapremina od 25 µl ove ćelijske suspenzije dodata je ciljnim ćelijama i monoklonskim himernim anti-CLDN6 antitelima. Ploče su inkubirane 24 h na 37 °C i u 5% CO2.

Nakon inkubacije od 24 h u svaki bunarić kontrole ukupne lize dodato je po 10 µl 8% (v/v) Triton X-100 u PBS, dok je u bunariće sa kontrolama max vijabilne ćelije i uzorke dodato 10 µl PBS. U svaki bunarić dodato je po 50 µl smeše za luciferin (3.84 mg/ml D-luciferin, 0,64 U/ml ATPaze i 160 mM HEPES u ddH2O). Ploče su inkubirane u mraku na RT tokom 30 min. Bioluminescencija je izmerena luminometrom (Infinite M200, TECAN). Rezultati su predstavljeni u integrisanim digitalnim relativnim svetlosnim jedinicima (RLU).

[0378] Specifična liza se izručunava na sledeći način:

max vijabilne ćelije: 10 µl PBS, bez antitela

ukupna liza: 10 µl 8% (v/v) Triton X-100 u PBS, bez antitela

Tretmani uznapredovalih tumora

[0379] Za tretman uznapredovalih tumorskih ksenografta antitelima, 2×107 NEC8 ćelija u 200 µl PMI medijuma (Gibco), subukutano je inokulirano u bok ženki atimičnog Nude-Foxn1<nu>miša, starosti 6- 8 nedelja. Zapremina tumora (TV = (dužina × širina<2>)/2) merena je dvonedeljno. TV je izražen u mm<3>, što je omogućilo konstrukciju krive rasta tumora tokom vremena. Sedamnaest dana nakon inokulacije tumorskih ćelija, miševi su podeljeni u dve terapijske grupe od po osam životinja u svakoj, vodeći računa o homogenoj veličini tumora od oko 80 mm<3>. Sledećih pet nedelja životinje su tretirane sa po 200 µg prečišćenih himernih monoklonskih antitela, naizmeničnom intravenskom i intraperitonealnom injekcijom dva puta nedeljno. Eksperimentalne grupe tretirane nespecifičnim antitelima poslužile su kao negativna kontrola. Miševi su žrtvovani kada je zapremina tumora prevazišla 1500 mm<3>.

Test metastaze

[0380] Za test metastaze, NEC8 ćelije su prikupljene i filtrirane kroz 70-µm sita, kako bi se eliminisali veliki ćelijski agregati. NEC8 ćelije, 4×10<6>, injektovane su kroz repnu venu ženki Nude-Foxn1nu miša starih 6 nedelja. Tri dana nakon injkecije, primenjeno je 200 µg prečišćenih mišjih monoklonskih antitela muMAB 64A u PBS ili je primenjen PBS bez antitela dva puta nedeljno, naizmeničnom intravenskom i intraperitonealnom injekcijom. Nakon 8 nedelja miševi su žrtvovani, pluća su preparirana i trenutno smrznuta u tečnom azotu.

[0381] Genomska DNK je izolovana iz zamrznutog tkiva, prateći instrukcije proizvođača "Blood & Cell Culture DNA Midi Kit" (Qiagen, 13343). Tkivo pluća je homogenizovano pomoću Ultra Torax T8.10 (IKA-Werke). Da bi se izbegla kontaminacija genomskom DNK čoveka, kvantitativni PRC genomske plućne DNK obavljen je pod sterilnim ulsovima. Udeo tumora čovečje NEC8 ćelijske linije u tkivu pluća miša određen je na osnovu generisane standardne krive, konstruisane na osnovu definisanih količina čovečje NEC8 genomske DNK i mišje plućne genomske DNK. Za to su korišćene sledeće serije razblaženja (NEC8 DNK / mišja plućna DNK): 200/0, 40/160, 8/192, 1,6/198,4, 0,32/199,68, 0,064/199,94, 0,013/200 i 0/200 ng. Za potrebe qPCR,analizirano je 200 ng genomske DNK, 2×SYBR Green (Qiagen, 204145), 16 nmol sens prajmera (GGGATAATTTCAGCTGACTAAACAG, Eurofins) i 16 nmol antisens prajmera (TTCCGTTTAGTTAGGTGCAGTTATC, Eurofins), u ukupnoj zapremini od 50 µl, na aparatu 7300 Real Time PCR-System, nabavljenom od Applied Biosystems. Kao negativna kontrola prepiremljen je uzorak u koji je umesto DNK dodata ista zapremina vode. Analiza qPCR je obavljena pod sledećim uslovima: 15 min at 95°C (1 ponavljanje), 30 sec na 95°C / 30 sec na 62°C / 30 sec na 72°C (40 ciklusa), 15 sec na 95°C / 30 sec na 60°C / 15 sec na 95°C (1 ciklus). Sve qPCR reakcije su ponovljene u triplikatu.

Tumorski udep u tkivnim uzorcima pluća kvantifikovan je u korelaciji sa standardnom krivom, pomoću 7300 System programskog paketa (Applied Biosystems).

Mapiranje epitopa visoke rezolucije

[0382] Analiza interakcije naših antitela i CLDN6 u njegovoj nativnoj konformaciji obavljena je primenom usmerene (za mesto specifične) mutageneze u sisarskim ćelijskim kulturama. S tim ciljem obavljena je alanin-skanirajuća mutageneza amino kiselina na pozicijama 27-81 i 137-161, unutar prvog i drugog vanćelijskog domena CLDN6. Alaninske mutacije generisane su usmerenom mutagenezom (GENEART AG, Germany). Nakon prolazne ekspresije u HEK293T ćelijama, procenjena je sposobnost CLDN6 mutanata da se za njih vežu specifična monoklonska antitela. Smanjeno vezivanje specifičnih antitela za CLDN6 mutant ukazuje da je mutirana amino kiselina važna za uspostavljanje kontanta i/ili uspostavljanje funkcionalne konformacije. Vezivanje je analizirano protočnom citometrijom. Za razlikovanje transfektovanih od netransfektovanih ćelija, ćelijske populacije su kotransfektovane fluorescentnim markerom koji je služio kao reporter.

Dvadesetčetiri sata nakon transfekcije, ćelije su prikupljene u 0.05% Tripsin/EDTA, isprane su puferom za FACS (PBS obogaćen 2% FCS i 0.1% natrijum azidom) i resuspendovane su u istom puferu, u koncentraciji 2×106 ćelija/ml. Zapremina od 100 µl ove ćelijske suspenzije je inkubirana sa 10 µg/ml antitela, tokom 30 min na 4 °C. Komercijalno dostupna mišja anti-Cldn6 (R&D, MAB3656) antitela su primenjena kao kontrola detekcije membranske ekspresije CLDN6 mutanata. Ćelije su isprane tri puta u puferu za FACS i inkubirane su sa APC-konjugovanim kozjim anti-čovečjim IgG Fc-γ (Dianova, 109-136-170) ili APC-konjugovanim anti-mišjim IgG 1+2a+2b+3a specifičnim sekundarnim antitelima (Dianova, 115-135-164), tokom 30 min na 4 °C. Ćelije su dva puta isprane i resuspendovane u puferu za FACS. Vezivanje u populaciji transfektovanih ćelija analizirano je protočnom citometrijom, pomoću BD FACSArray. Ekspresija fluorescentnog markera je predstavljena na horizontalnoj osi, dok je vezivanje antigena predstavljeno na vertikalnoj osi. Prosečna vrednost intenziteta signala monoklonskog himernog CLDN6 specifičnog antitela za mutirani CLDN6 predstavljena je procenat vezivanja u odnosu na divlji tip. Amino-kiselinske pozicije koje su presudne za vezivanje pokazale su odsustvo vezivanja nakon što su amino kiseline na tim pozicijama mutirane, dok su amino kiselinske pozicije koje podupiru vezivanje ispoljile smanjeno vezivanje u odnosu na divlji tip, nakon što su te pozicije mutirane.

Imunocitohemija

[0383] Krio-preseci tkiva (4 µm) fiksirani su neposredno nakon sečenja u acetonu tokom 10 min na -20°C. Preseci su zatim osušeni 10 min na RT i ostavljeni na - 80°C. Pre upotrebe preseci su odmrznuti (10 min na RT) i rehidratisani u PBS tokom 5 min. Aktivnost endogene peroksidaze je blokirana rastvorom 0.3% vodonik-peroksida u PBS, tokom 15 min na RT. Nespecifično vezivanje je umanjeno blokiranjem preseka u 10% kozjem serumu rastvorenom u PBS, tokom 30 min na RT. Nakon toga pločice su inkubirane sa CLDN6-specifičnim mišjim monoklonskim antitelom muMAB 64A (0.2 µg/ml razblaženo u 10% kozjem serumu/PBS), tokom noći na 4 °C. Sledećeg dana pločice su isprane u PBS na RT (3×5 min) i inkubirane sa 100 µl sekundarnih antitela (PowerVision poly HRP-anti-mišja IgG spremna za upotrebu antitela (Immuno-Logic)) tokom jednog sata na RT. Pločice su isprane u PBS na RT (3×5 min). Preseci su obojeni tokom 1.5 min, pomoću VECTOR NovaRED Substrate Kit SK-4800, nabavljenog od Vector Laboratories (Burlingame). Pločice su dvojno obojene hematokslinom tokom 90 sec na RT. Nakon dehidracije u seriji alkohola (70%, 80%, 2×96% i 99%, 5 min svaki) i 10 min inkubacije u Ksilolu, preseci su postavljeni na pločice pomoću X-tra Kit (Medite Histotechnic).

Himerna monoklonska antitela mAb206-LCC i mAb206-SUBG su obeležena FITC-om (Squarix GmbH, Germany), sa ciljem da se koriste za humana tkiva. Krio-preseci su pripremljeni i tretirani kao što je opisano, u vezi sa fiksacijom, blokiranjem endogene peroksidaze i blokiranja nespecifičnog vezivanja. Nakon toga, preseci su inkubirani sa antitelima mAb206-LCC-FITC i mAb206-SUBG-FITC (1 µg/ml u 10% kozjem serumu/PBS) tokom 1 h na RT u mračnoj komori. Preseci su nakon toga isprani u PBS na RT (3 × 5 min) i inkubirani su sa 200 µl zečjeg anti-FITC-HRP antitela(AbD Serotec, razblaženo 1:300 u 10% zečjeg seruma/PBS) tokom 30 min na RT. Nakon ispiranja u PBS na RT (3×5 min), reakcija sa supstratom je obavljena tokom 2.5 min pomoću VECTOR NovaRED Substrate Kit SK-4800 nabavljenog kod Vector Laboratories (Burlingame). Duplo bojenje, dehidracija i lepljenje za pločice obavljeno je kao što je prethodno opisano.

[0384] Analiza vezujuće specifičnosti anti-CLDN6 himernih monoklonskih antitela, izvršena protočnom citometrijom na HEK293T ćelijama koje su prolazno transfektovane humanim CLDN6, 3, 4 i 9, pokazala je da himerna monoklonska antitela, chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS, ispoljavaju vezivanje za CLDN6, a da se ne vezuju za CLDN3, 4 i 9 (Sl.27).

[0355] Kada je reč o vezivanju za čovečji CLDN6 stabilno eksprimiran na membrani HEK293 ćelija, anti-CLDN6 himerna monoklonska antitela, chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS, ispoljavaju slične, niske EC50 vrednosti, dok se zasićenje vezivanja postiže pri niskim koncentracijama (Sl.28).

[0386] Afinitet vezivanja anti-CLDN6 himernih monoklonskih antitela, chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS, za tumorske ćelije koje endogeno eksprimiraju čovečji CLDN6 procenjen je analizom vezivanja za ćelijsku liniju kancerskih ćelija NEC8, primenom protočne citometrije. U poređenju sa CLDN6-specifičnim antitelima chimAB 64A, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS, kombinaciona varijanta lakog lanca mAb206-LCC ispoljava tri puta jače vezivanje i veći afinitet za NEC8 ćelije. U svim slučajevima, zasićenje vezivanja postiže se pri niskim koncentracijama (Sl.29).

[0387] Analiza afiniteta vezivanja anti-CLDN6 himernih monoklonskih antitela chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS za ćelijsku kancersku liniju ovarijalnog kancera OV90, izvršena protočnom citometrijom, pokazala je da CLDN6-specifična antitela ispoljavaju slične niske vrednosti EC50. Kombinaciona varijanta lakog lanca mAb206-LCC ispoljila je najjači afinitet vezivanja za OV90 ćelije (Sl.30).

[0388] Anti-CLDN6 himerna monoklonska antitela chimAB 64A, mAb206-LCC i mAb206-SUBG ispoljila su CDC aktivnost na NEC8 ćelijama, na dozno-zavisan način, dok na NEC-8 CLDN6 nokdaun ćelijama, ni jedno od ovih antitela nije izazvalo nespecifičnu lizu ćelija. Ovaj rezultat ukazuje na ciljnu efektorsku specifičnost chimAB 64A, mAb206-LCC i mAb206-SUBG (Sl.31a).

[0389] Antitela chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS ispoljila su dozno-zavisnu CDC aktivnost na NEC8 ćelijama. U poređenju sa chimAB 64A, aminokiselinske supstitucione varijante mAb206-SUBG i mAb206-SUBS, ispoljile su slične CDC aktivnosti na NEC8 ćelijama (Sl.31b).

[0390] Anti-CLDN6 himerna monoklonska antitela chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS ispoljila su dozno-zavisnu ADCC aktivnost i indukovala su ADCC, čak i pri niskim koncentracijama antitela na NEC8 i OV90 tumorskim ćelijskim linijama (Sl.

32a).

[0391] Sl. 32b pokazuje da citotoksična aktivnost zavisna od antitela (ADCC) himernih monoklonskih antitela chimAB 64A, mAb206-LCC i mAb206-SUBG na NEC8 ćelijama divljeg tipa i NEC8 nokdaun ćelijama. Ciljna specifičnost je demonstrirana na NEC8 ćelija sa stabilnim CLDN6 nokdaunom.

[0392] Tretman uznapredovalih ksenografta na mišu sa presađenim tumorskim ćelijama NEC8 pokazao je da se u poređenju sa kontrolnom grupom, kod grupa tretirane CLDN6-specifičnim antitelima mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS uočava inhibicija rasta tumora (Sl.33).

[0393] Krive rasta na Sl. 34a pokazuju da su anti-CLDN6 himerna monoklonska antitela mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS sposobna da inhibiraju rast tumora. Kriva preživljavanja na Sl.34b pokazuje produženo preživljavanje miševa tretiranih CLDN6-specifičnim antitelima.

[0394] Mapiranje epitopa visoke rezolucije chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS, pokazalo je da su amino kiseline F35, G37 i S39 i potencijalno T33 u prvom vanćelijskom domenu CLDN6, važne za uspostavljanje interakcije sa CLDN6-specifičnim himernim antitelima. Antitela chimAB 64A, mAb206-LCC, mAb206-SUBG i mAb206-SUBS ispoljavaju identičan obrazac vezivanja (Sl.35).

[0395] Terapeutski efekat anti-CLDN6 mišjeg monoklonskog antitela muMAB 64A testiran je u metastatskom modelu ksenografta, u kojem se NEC8 ćelije injektiraju u repnu venu atimičnog Nude-Foxn1<nu>miša. Tri dana nakon presađivanja, miševi su tretirani CLDN6-specifičnim antitelom muMAB 64A. Nakon 8 nedelja preparirana su pluća i udeo tumora analiziran je postupkom PCR. U poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom PBS, kod grupe tretirane mišjim monoklonskim anti-CLDN6 antitelom muMAB 64A uočena je jasna inhibicija rasta tumora (Sl.36).

[0396] Imunohistohemijsko bojenje kancerskog tkiva i normalnih tkiva čoveka, primenom monoklonskih antitela muMAB 64A, mAb206-LCC i mAb206-SUBG, pokazalo je da suprotno normalnim tkivima, tkivni preseci ovarijalnog i testikularnog kancera ispoljavaju snažno i homogeno bojenje. Detektovano je veoma jako membransko bojenje malignih epitelnih ćelija, dok su susedne stromalne i ne-maligne epitelne ćelije ostale neobojene (Sl.

37). Rezultati jasno ukazuju da se naša CLDN6-specifična antitela specifično vezuju za maligne ćelije koje su izolovane iz pacijenata sa kancerom. (Objašnjenje: broj tkiva koji je obojen antitelom/ broj analiziranih tkiva).

Claims

Patentni zahtevi

1. Antitelo koje je sposobno da se veže za CLDN6 (CLDN) povezan sa površinom ćelije koja eksprimira CLDN6 i koje nije sposobno da se detektabilno veže za klaudin 9 (CLDN9) povezan sa povšinom ćelije koja eksprimira CLDN9, pri čemu vezivanje antitela za CLDN6 i CLDN9 je određeno pomoću protočno citometrijske analize kao vezivanje antitela za CLDN6 i CLDN9 eksprimiranih na površini intaktnih ćelija, pri čemu antitelo sadrži težak lanac antitela i laki lanac antitela, pri čemu težak lanac antitela sadrži najmanje jednu od CDR sekvenci od sekvence SEQ ID NO: 36 teškog lanca antitela i laki lanac antitela sadrži najmanje jednu od CDR sekvenci sekvence lakog lanca antitela izabrane od SEQ ID NOs: 35, 54 i 55.

2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, koje nije sposobno da se detektabilno vezuje za CLDN4 povezan sa površinom ćelije koja eksprimira CLDN4 i/ili nije sposobno da se detektabilno veže za CLDN3 povezan sa površinom ćelije koja eksprimira CLDN3, pri čemu je vezivanje antitela za CLDN4 i CLDN3 određeno pomoću protočno citometrijske analize kao vezivanje antitela za CLDN4 i CLDN3 eksprimiranih na površini intaktnih ćelija.

3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, koje je specifično za CLDN6.

4. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-3, koje ima jednu ili više od sledećih aktivnosti:

(i) ubijanje ćelije koja eksprimira CLDN6,

(ii) inhibiciju proliferacije ćelije koja eksprimira CLDN6,

(iii) inhibiciju formiranja kolonije ćelije koja eksprimira CLDN6,

(iv) posredovanje u remisiji ustanovljenih tumora,

(v) sprečavanje formiranja ili ponovnog formiranja tumora i

(vi) inhibiciju metastaze ćelije koja eksprimira CLDN6.

5. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-4, koje ispoljava jednu ili više imunih efektorskih funkcija protiv ćelije koja nosi CLDN6 u svojoj nativnoj konformaciji, pri čemu su jedna ili više imunih efektorskih funkcija poželjno izabrane iz grupe koja se sastoji od citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC), ćelijski-posredovane citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC), indukcije apoptoze i inhibicije proliferacije, poželjno efektorne funkcije su ADCC i/ili CDC.

6. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, koje je monoklonsko, himerno ili humanizovano antitelo, ili antigen-vezujući fragment antitela.

7. Konjugat koji sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 spojen sa terapeutskim sredstvom, poželjno toksinom, radioizotopom, lekom ili citotoksičnim sredstvom.

8. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i/ili konjugat prema patentnom zahtevu 7 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

9. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i/ili konjugat prema patentnom zahtevu 7 za upotrebu u postupku (i) inhibicije rasta ćelije kancera koja eksprimira CLDN6 i koja je naznačena vezom CLDN6 sa njenom ćelijskom površinom, (ii) ubijanja ćelije kancera koja eksprimira CLDN6 i koja je naznačena vezom CLDN6 sa njenom ćelijskom površinom ili (iii) inhibicije metastatskog širenja ćelije kancera koja eksprimira CLDN6 i koja je naznačena vezom CLDN6 sa njenom ćelijskom površinom.

10. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-6, konjugat prema patentnom zahtevu 7 ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 8 za upotrebu u postupku za lečenje ili prevenciju bolesti kancera ili poremećaja koji obuhvata ćeliju koja eksprimira CLDN6 i koja je naznačena vezom CLDN6 sa njenom ćelijskom površinom kod subjekta.

11. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 9 ili 10, pri čemu je kancer izabran iz grupe koja se sastoji od kancera jajnika, naročito adenokarcinoma jajnika i teratokarcinoma jajnika, kancera pluća, uključujući sitnoćelijski kancer pluća (SCLC) i nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), naročito karcinom i adenokarcinom skvamoznih ćelija pluća, kancer želudca, kancer dojke, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, naročito karcinom bazalnih ćelija i karcinom skvamoznih ćelija, maligni melanom, kancer glave i vrata, naročito maligni pleomorfni adenom, sarkom, naročito sinovijalni sarkom i karcinosarkom, kancer žučnog kanala, kancer bešike, naročito karcinom prelaznih ćelija i papilarni karcinom, kancer bubrega, naročito karcinom bubrežnih ćelija uključujući svetloćelijski kancer bubrežnih ćelija i papilarni karcinom bubrežnih ćelija, kancer debelog creva, kancer tankog creva, uključujući kancer ileuma, naročito adenokarcinom tankog creva i adenokarcinom ileuma, testikularni embrionalni karcinom, placentalni horiokarcinom, cervikalni kancer, testikularni kancer, naročito testikularni seminom, testikularni teratom i embrionalni testikularni kancer, kancer materice, tumor germinativnih ćelija kao što je teratokarcinom ili embrionalni karcinom, naročito tumor germinativnih ćelija testisa i njihovi metastatski oblici.

12. Nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira težak lanac antitela i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira laki lanac antitela kao što je definisan u bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, pri čemu je nukleinska kiselina poželjno sadržana u vektoru.

13. Ćelija domaćin koja eksprimira težak lanac antitela i/ili laki lanac antitela, pri čemu navedena ćelija domaćin sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 12.

14. Ćelija domaćin prema patentnom zahtevu 13, pri čemu je navedena ćelija eukariotska ćelija domaćin, poželjno izabrana od CHO ćelije, NS/0 ćelije, HEK293 ćelije, HEK293T ćelije, biljne ćelije ili gljive, poželjno kvasca.

15. Antitelo dobijeno iz ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 13 ili 14.