JPH01502590A - 循環時間の長いリポソーム - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ′　日の　いリポソーム １．１Ｕ引先夏 本発明はリポソーム治療組成物に関し、特に静脈内投与された場合に血流中にお ける循環時間が長いリポソーム配合物に関する。 ２、吏臣文藍 １−　Ａ１１ｅｎ、　Ｔ、Ｍ、　（１９８１）　Ｂｉｏｃｈｅ＋ａ、　Ｂｉｏｐ ｈｙｓ、　Ａｃｔａ　６４０＋３８５３９７゜ ２　、　Ａ１１ｅｎ＋　Ｔ、翫＋およびＥｖｅｒｅｓｔ＋　Ｊ、　（１９８３） 　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。 Ｅｘｐ、丁ｈｅｒａｐ、　ｈｉ、　５３９−５４４゜３、　Ａｌｔｕｒａ、　Ｂ 、Ｍ、　（１９８０）　Ａｄｖ、　Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃ、９．２５２−２９４゜ ４、　Ａｌｖｉｎｇ、　Ｃ，Ｒ，（１９８４）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ、　 Ｔｒａｎｓ、　１２．３４２３４４゜５、Ａｓｈｗｅｌｌ、　ｃ、、およびｌ１ ｏｒｅ１１．、Ａ、Ｇ、　（１９７４）　Ａｄｖ、　Ｅｎｚｙｓｏｌｏｇ３虹、 　９９−１２８゜ ９、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ＋　Ｇ−＋およびＲｙｍａｎ、　Ｂ、Ｅ、　（１９ ７２）　Ｅｕｒ、　Ｊ。 Ｂｉｏｃｂｅｓ＋、２４．４８５−４９１゜１０、　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ＋ 　Ｇ、＋およびＮｅｅｒｕｎｊｕｎ、　Ｄ、　（１９７４）　Ｅｕｒ、　Ｊ。 Ｂｉｏｃｈｅｓ、Ｑ＋　１７９−１８５゜１１、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　Ｇ −＋および５ｅｎｉｏｒ、　Ｊ、　（１９８０）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ。 ■瓜、４３−４６゜ ｉ２．　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、　Ｊ、Ｐ、ら（１９７９）　Ｂｌｏｏｄ　公：９ １６゜１３、Ｈａｋｏｍｏｒｉ、ｓ、（１９８１）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉ ｏｃｈｅｍ、５０．　７３３−７６４゜１４、　Ｈｗａｎｇ＋　Ｋ、Ｊ、ら（１ ９８０）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ３３６−３ ４８゜ １６、　Ｊｕｌｉａｎｏ、　Ｒ，Ｌ、、およびＳｔａｗ＋ｐ、　Ｄ、　（１９７ ５）　Ｂｉｏｃｈｅ＋＊、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。 Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、６３．６５１−６５８゜１７、Ｋａｒｌｓｓｏｎ＋　Ｒ ，Ａ、（１９８２）　Ｉｎ：　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ＋　 ｖｏｌ。 ＣＤ＋Ｃｈａｐｍａｎ　（編）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋　Ｎ、Ｙ、＋ 　ｐＩ）、１−７４゜１８、　Ｋｉｍｅｌｂｅｒｇ、　Ｈ，に、ら（１９７６） 　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　３６．２９４９２９５７゜１９、　Ｌｅｅ、　Ｋ、 Ｃ，ら、　Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　１２５：８６　（１９８０）。 ；２０．　Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ＋　Ｇ、ら（１９８４）　Ｃａｎｃ ｅｒ　Ｒｅｓ、　４ｉ、３７５−３７８゜２１、０ｋａｄａ、　Ｎ、（１９８２ ）　Ｎａｔｕｒｅ　２９９：２６１゜２２、　Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ　？１．Ｊ、 、およびＪｕｌｉａｎｏ、　Ｒ，Ｌ、　（１９８４）　Ｐｈａｒ＋＋ａｃｏｌ。 Ｒｅｖ、　３６．　２７７−３３６゜ ２３、　Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ、　Ｖ、Ｊ、ら（１９７９）　Ｂｒ、　Ｊ、　Ｃ ａｎｃｅｒ　４０．３５４３゜２４、　５ａｂａ、Ｔ、ｔｊ、（１９７０）　Ａ ｒｃｈ、Ｉｎｔｅｒｎ、　ｌ’ｌｅｄ、１２６．　１０３１−１０５２゜２５． ５ｃｈａｖｅｒ、Ｒ，（１９８２）Ａｄｖ、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　Ｃｈｅ ＩＩｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。 並：１３１゜ ２６、５ｃｂｅｒｐｈｏｆ、　Ｔ、ら（１９７Ｂ）　Ｂｉｏｃｈｉｓ＋、　Ｂｉ ｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ　５４２゜２９６−３０７゜ ２７、５ｅｎｉｏｒ＋　Ｊ、ｌ　およびＧｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　Ｇ　（１９ ８２）　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ。 シは、１０９−１１４゜ ２８．５ｅｎｉｏｒ、　Ｊ、ら（１９８５）　Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、　Ａｃｔａ　８３９＋　１−８゜２９、５ｚｏｋａ、　Ｆ、　Ｊｒ、ら（１ ９７Ｂ）　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｌｌ５Ａユニ４１ ９４゜ ３０、５ｚｏｋａ、　Ｆ、、　Ｊｒ、ら（１９８０）　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂ ｉｏｐｈｙｓ、　Ｂｉｏｅｎｇ。 ３・主Ｊ坏１１１ リポソーム供給システムは様々な薬剤に対して提藁されている。血流による薬剤 供給に使用する場合、リポソームは。 該リポソーム内に捕捉された薬剤の１Ｆｉｌｉ５された蓄積物放出を長期間にね たっそ与える可能性、および血流中における遊離薬剤の濃度を制限することによ り薬剤の有毒な副作用を低減する可能性を有する。リポソーム／薬剤組成物は、 薬剤の用量を増大させ、薬剤投与の頻度を減少させることにより、治療の便宜を 増大させ得る。リポソーム薬剤供給システムは。 Ｐｏｚｎａｎｓｋｙらにより、一般的な総説が与えられている。 静脈内におけるリポソームによる薬剤供給に対して、長年にわたって認識されて いる１つの制限は、細網内皮系（ＲＥＳ）とも呼ばれる単核食細胞系（ＭＰＳ） により血液ｖＭ環リポソームが急速に取込まれることである。循環しているマク ロファージと、肝臓（クップファー細胞）、肺臓、肺、および骨髄の固定化マク ロファージとから構成されるこの系は、リポソームを包含する外来の微粒子状物 質を分単位の半減期で血液循環から除去する（Ｓａｂａ）　ｅ最も広範囲に研究 された微粒子状の薬剤担体の１つであるリポソームは、肝臓のクップファー細胞 により循環からまず除去され、そして他のマクロファージ集団によりさらに少な くなるまで除去される。 ＲＥＳがリポソーム取込みを行なう因子に関する様々な研究が報告されている。 初期の実験では、主な脂質成分としてホスファチジルコリン（ＰＣ）およびコレ ステロール（ＣＢ）を含有する多重ラメラリポソーム（ＭＬＶ　）の不均一な調 製物を使用し。 これらのリポソームが、初期の！、速な取込み段階に続き取込みが緩慢となる段 階を有する２段階工程で、肝臓および肺臓へ取込ま、れることにより、循環から ゑ、速に除去されるということが示された（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　１９７ ４；　Ｊｏｎａｈ；　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ。 １９７２；　Ｊｕｌｉａｎｏ）、循環からの−Ｌｖ除去に対する半減期は、静脈 内（ＩＶ）注射後５〜１５分程度であった。負に荷電したリポソームは、中性ま たは正に荷電したリポソームよりもセ、速に循環から除去される。小さな単ラメ ラリポソーム（ＳＵＶ）は、　ＭＬＶに比べて約３〜４倍長い半減期を有するこ とが明らかになった（Ｊｕｌｉａｎｏ；　Ａ１１ｅｎ、　１９８３）、肝臓およ びＷＩｐｍによるリポソームの取込みは、マウス、ラット、サル、およびヒトを 包含するいくつかの種において同様の速度で起こる（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ。 １９７４；　Ｊｏｎａｈ；　Ｋｉｍｅｌｂｅｒｇ、　１９７６；　Ｊｕｌｉａｎ ｏ；　Ｒ５ｃｈａｒｄｓｏｎ；　Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ）。 ＲＥＳを回避し得るリポソームは、２つの重要な利点を有する。第１の利点は、 血液中におけるリポソームの循環時間が増加することである。この利点は、血流 中に薬剤を徐々に放出するという薬物速度論的な利点を増大させると共に、肝臓 。 ＩＩｌ！Ｓ、および肺を含まない組織を標的とする機会を増大させる。第２の利 点は、ＲＥＳのリポソーム負荷を減少させることである。外来粒子を除去する際 におけるＲＥＳの役割に加えて。 ＲＥＳは、いくつかの他の機能を伴う、このような機能には。 病原微生物、寄生虫、および腫瘍細胞に対する宿主防御；内毒素および出血性シ ョックに対する宿主応答；薬剤応答；および免疫複合体の循環に対する応答が含 まれる（Ｓａｂａ、　Ａｌｔｕｒａ）。 従って、血流によるリポソーム投与においては、比較的短期の大量取込みまたは 累積のリポソーム取込みにより、ＲＥＳを著しく傷つけることを避けることが重 要である。 提案されているあるアプローチは、血清中におけるリポソームの安定性を増大せ ることによりリポソームの循環時間を増大させることである。このアプローチは ９本発明者らの一人および他の研究者らによる研究に基づいているが、彼らは血 漿中におけるリポソーム内容物の漏出を減少させる因子が。 ＲＥＳによるリポソームの取込み速度をも減少させるということを示している（ Ａｌｌｅｎ、　１９８３；　Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ、　１９８０；　Ａ１１ｅ ｎ。 １９８１５ｅｎｉｏｒ、　１９８２）、このような効果に寄与する最も重要な因 子は、二重層の硬さのようである。この因子は、血清成分。 特に高密度リポタンパクの不安定化効果に対するより高い抵抗性をリポソームに 付与する（Ａｌ１ｅｎ＋　１９８１；　５ｃｂｅｒｐｈｏｆ）　ａこのように、 リポソームの二重層内にコレステロールを含有させることにより、ＲＥＳによる 取込み速度を低下させ得る（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ＋　１９８０；　Ｉｌｗａ ｎｇ；　Ｐａｔｅｌ、　１９Ｂ３：　５ｅｎｉｏｒ、　１９ＢＳＬそして、ジス テアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）から構成されるリポソーム、ある いは多量のスフィンゴミエリン（ＳＭ）を含有するリポソームのような硬いリポ ソームは、肝臓への取込み速度および取込み量が減少することを示す（Ａｌｉｅ ｎ、　１９８３：Ｅｌｌｅｎｓ；　５ｅｎｉｏｒ＋　１９８２；　Ｈｗａｎｇ） 。 しかしながら、このアプローチは、血流中におけるリポソームの循環時間を増大 させる可能性に限界がある０本発明を支持するために実施された研究、および以 下に示した研究によると、０．１〜０．２ミクロンのリポソームを含有する最適 な膜性化リポソーム配合物は、静脈内リポソーム投与の２時間後は主としてＩ’ ｌＥＳ中に局在している。長い循環時間は、小さな単ラメラ小胞または（約０． ０３ミクロンと０．０８ミクロンとの間のサイズ範囲を有する）ＳｔｌＶにより 達成されるが、ＳＵＶは一般に、薬剤運搬能力が小さく、かなり不安定であるた め、薬剤供給には、あまり有効ではない、ＳＵＶは、リポソームに付随した薬剤 のや、速な放出をもたらし、大きく、不均一なサイズを有するリポソームを生じ るリポソーム融合という現象を引き起こし得る。 本出願人を含め数人の研究者らは、赤血球の表面をまねてリポソーム表面を設計 することにより、リポソームの循環時間を増大させる可能性についても探究した 。＠胞認識現象における細胞表面の糖質の役割は広く認識されている（Ａｓｈｗ ｅｌ　１Ｈａｋｏｍｏｒｉ、　Ｋａｒｌｓｓｏｎ）　＊　シアル酸の化学９代謝 、および生化学機能に関する総説が蝉告されている（Ｓｃｈａｕｅｒ）。ガング リオシド、および糟タンパク（例えば、グリコホリン）により運搬されるシアル 酸は、循環中における赤血球、血小板、およびリンパ球の生存に大きな役割を果 たしている。末端にガラクトース残基が露出しているシアル酸を酵素的に除去す ると、循環から赤血球が２．速ムニ除去され、肝臓のクソブフ７−細胞へ取込ま れる（Ｄｕｒｏｃｈｅｒ）。血小板（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ）およびリンパ球（Ｗ ｏｕｄｒｕｆｆ）からのシアル酸除去は、やはり肝臓によるそれらの急速な除去 をもたらす。 するが、著しい質量作用を起こさせるには血清を添加しなければならない、飲食 作用を仲介する血清成分の本質は不確かであるが、免疫グロブリンおよび補体（ Ｃ３ｂ）が関与すると考えられる。　Ｃｚｏｐら（Ｃｚｏｐ）は９通常ヒトの単 球による貧食作用を受けないヒツジの赤血球が、シアル酸を除去すると、　Ｃ３ ｂに結合し、そして貧食作用を受けるということを示している。 ０ｋａｄａ　ら（Ｏｋａｄａ）は、リポソーム股上のシアリ糖脂質が他の補体経 路の活性化を制限すること、およびこれら糖脂質から末端のシアル酸を除去する と、この制限能力が無効になり。 他の補体経路の活性化を起こすということを示している。従って、シアル酸は１ 部分的にはｃ３ｂの結合を妨げる能力によって、Ｔ１８胞膜上の非認識分子とし て機能し、他の補体経路による貧食作用を妨げることができる。他の免疫因子も リポソーム賞食作用に関与し得る。Ａｌｖｉｎｇは３個々のヒトから得たを仲介 する天然の「抗リポソーム」抗体を含有しているということを報告している。 上記の結果は１例えばガングリオシドまたはグリコホリンの形でリポソーム中へ 取込まれた表面シアル酸および／または他の赤血球表面物質が、リポソームの循 環半減期を増大させ得るということを示唆している。このアプローチは１例えば 米国特許第４．５０１．７２８号のｒ　ＲＥＳ認識からのリポソームのマスキン グ」′に述べられている。しかし、この特許は、リポソームをシアル酸で被覆す ることにより、有意のＲＥＳマスキングが実際に達成されるかどうかについて開 示していない。 実際１本出願を支持するために実施された実験によると。 シアル酸は、ガングリシドの形では、ホスファチジルコリン（卵ＰＣ）　、ある いは卵ＰＣ：コレステロール混合物のような。 従来のリポソーム脂質から主として構成されるリポソームにおけるインビボでの 循環半減期を延長する能力に制限がある。 ＰＣ：コレステロール：ガングリオシドから構成されるリポソーム（０，２ミク ロンまたはそれ以下）のインビボでの取込みに関する研究によると、注射された リポソームは投与の２時間後には主としてＲＥＳに局在している。 要約すると、血流中におけるリポソームの循環時間を増大させるためのいくつか のアプローチが提冥されている。しかしながら、従来、これらのアプローチは、 特に非経口薬剤組成物に対して一般的に最も望ましい０．０７〜０．２ミクロン というサイズ範囲のリポソームの血液循環時間をごくわずかたけ向上させただけ である。 ４、！王立！ｌ 従って、著しく向上された血液循環時間を与える改良されたリポソーム組成物を 提供することが１本発明のある一般的な目的である。 本発明のさらに特定の目的は、リポソーム投与の数時間後に、肝臓および＊ｍよ りもむしろ主として血流中にリポソームが局在するような組成物を提供すること にある。 本発明のさらに他の目的は、約０．０８ミクロンと０．２ミクロンとの間の選択 されたサイズ範囲内にあるリポソームを含有する組成物本提供することである。 腫瘍治療における改良された薬剤供給および／または薬剤標的化のために、血流 中で薬剤を運搬するリポソームの寿命を著しく延長する方法を提供することは１ 本発明のさらに別の目的である。 本発明は、血流中における循環を増強するように設計されたリポソーム組成物を 包含する。この組成物におけるリポソームは以下のように特徴づけられる：（ａ ）リポソームのサイズが約０．０７．ミクロンと０．４　ミクロンとの間の選択 されたサイズ範囲内にある；（ロ）実質的に均一相のリポソーム二重層が少なく とも約５０モル％の膜性化脂質から構成される；および（Ｃ）約５モル％と２０ モル％との間の糖脂質成分が、ガングリオシド叶１．水素化ホスファチジルイノ シトール、およびスルファチド（すなわち、ラクトセレブロシドモノガラクトシ ルの硫酸エステル）からなる群から選択される。ｖＭ脂質の親油性部分は１層分 離を起こすことなく、成分をリポソーム二重層中にとどめるように作用する。 リポソームは増強された組織分布を示す。組織分布は、リポソームの静脈内投与 の２時間後、４時間後、および２４時間後に測定する場合に、肝臓および肺臓に おけるマーカの結合量に対する血液中に存在するりポソームマーカの比により測 定される。好ましくは、血液／ＲＥＳ比は、投与の２時間後に測定した場合、少 なくとも約５０モル％の膜性化脂質を含有するが、糖脂質を含有せず同様に構築 されたリポソーム組成物を用いて得られた一方の場合の血液／ＲＥＳ比と、５モ ル％と２０モル％との間の糖脂質は含有するが、膜性化脂質を含有せず同様に構 築されたリポソーム組成物を用いて得られた他方の場合の血液／ＲＥＳ比との合 計より実質的に大きい。 ある好ましい実施態様では、膜性化脂質は、スフィンゴミエリンと中性リン脂質 （例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ））との組合せである。好ましいモル比 は、約２：１と４；１との間である。別の実施態様では、この脂質は飽和ＰＣで あり。 コレステロールを有するものも、有さないものもある。 （以下余白） 溌ユぶ」Ｉ駐しピ咽 本発明のリポソーム組成物は、栄養添加物、ビタミン、またはキレート化金属な どの薬剤または他の薬品を、血流により被検体に供給するように、がっＲＥＳに よるリポソームの取込みが比較的体々に行われるように設計されており、そのこ とにより薬剤または薬品が数時間またはそれ以上の長期間にわたってリポソーム から血流中に放出される。あるいは、該組成物は、リポソームの表面を適当に改 変することにょ１棲的組織の隣接した領域において薬剤または薬品を濃縮させる ために、血流による非ＲＥＳ標的組織の標的化を行なうように設計されている。 以下の第１節Ａでは、インビボでのＩ’ｌＥＳによるリポソーム取込みを評価す るのに使用される一般的な方法について述べられている。第１節Ｂでは１本発明 のある局面に従って、静脈内注射されたリポソームに対して長い血液循環時間を 与えることが見い出されているリポソーム成分の組合せについて述べられている 。第１節Ｃでは、静脈内投与を行なうように設計された薬剤含有リポソームの調 製方法、サイズ調整方法。 および殺菌方法について述べられている。薬剤供給および薬剤標的化におけるリ ポソーム組成物の有用性は第■節で考察Ａ、インビボでのＲＥＳによるリポソー ム取込みの測定インビボでのリポソーム循環時間を評価するに用いられる方法で は、血流中およびＲＥＳの主要器官における注射後の選択された時刻での静脈内 注射されたリポソームの分布が測定される。使用される標本化モデルでは、肝臓 および肺臓、すなわちＲＥＳの主要器官における全リポソームに対する血流中の 全リポソームの比により、ＲＥＳ取込みが測定される。実際には１年齢および性 別をそろえたマウスに、放射標識されたリポソーム組成物を２尾部の静脈に静脈 内（ニジ）注射し、全血の放射標識カウントと、肝臓および肺臓を合わせた放射 標識カウントとを測定することにより、各時刻におけるポイントを決定する。多 くの研究では、すべての体の部分の完全解剖。 重量測定、および放射活性の測定が行われた。全血のカウントは、全血の容量が 動物の体重の７％を構成すると仮定することにより計算される。実験方法につい ては実施例２で詳細に述べられている。 ＲＥＳによるリポソームの初期取込みのほぼ１００％が肝臓およびＨＨで行われ るため、上述した血液／ＲＥＳ比は、インビボでの血液からＲＥＳへの取込み程 度の良い近似を与える。例えば、約１またはそれ以上の比は、血流中に残留して いる注射されたリポソームが支配的であることを示し、約１を下回る比は、　Ｒ ＥＳ中のリポソームが支配的であることを示す。興味ある脂質組成物の大部分は 、血液／ＲＥＳ比を２時間後、４時間後、および２４４時間後計算した。 モデルの動物系を用いて得られたデータは、ヒトおよび獣医が扱う興味ある動物 についても正しく推定することができる。これは、上述したように、肝臓および 肺臓によるリポソームの取込みが、マウス、ラット、サル、およびヒトを含むい くつかの哺乳動物種では、同様の速度で起こることが見い出されているからであ る（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｔｓ、　１９７４；　Ｊｏｎａｂ：　Ｘｉｍｅｌｂｅｒ ｇ。 １９７６；Ｊｕｌｉａｎｏ；　Ｒ４ｃｈａｒｄｓｏｎ；　Ｌｏｐｅｚ−Ｂｅｒｅ ｓｔｅｉｎ）。この結果は。 ＲＥＳによるリポソーム取込みに最も重要であると思われる生化学的な因子（血 清リポタンパクによる最適化、サイズに依存する取込み効果、および表面部分に よる細胞保護を含む）は、調べた哺乳動物種のすべてムこ共通の特徴である。 Ｂ、ユ１底盆 本発明のリポソームを形成するのに用いられる脂質成分は。 ３つの重要な規準を満足するように選択される。 第１に、脂質の主成分、すなわち５０モル％を上回る成分は。 中性のｌ！ｉ！強化成分であって５比較的強固であり、密に充填された脂質二重 層の構造を生じる非荷電脂質成分を意味する。 典型的には、該脂質は、主として相転移温度（Ｔｃ）が約２５°Ｃ以上、好まし くは約３０℃と５０°Ｃとの間にある飽和脂質である。 好ましい膜性化脂質には、　Ｓｒ１　（Ｔｃが約３０°Ｃ）と、アシル鎖が主と して飽和しているＰＣのような中性リン脂質とが含まれる。 ここで広範囲に研究されている飽和ＰＣは、　丁ｃが約５０のジステアロイルＰ Ｃ（Ｏ５ＰＣ）であ之。 第２に、そして本発明の重要な特徴によれば、脂質成分は。 リポソームの外側表面で部分的に保護されているような、すなわちある種の電荷 −電荷結合相互作用が起こらないような。 単一の負電荷を有する負に荷電した糖脂質を含有しなければならない。現在まで に、リポソーム配合物を用いて達成された高い血液／Ｉ’ｌＥＳ比から示される ように、このような特徴を有する３つの糖脂質が同定されている。これらは、ガ ングリオシドＧ？！、、水素化ホスファチジルイノシトール（ＵＰＩ）、および スルファチド（すなわち、ガラクトセレブロシドの硫酸エステル）である、これ ら３つの化合物は、第１図Ａから第１図Ｃにそれぞれ示されており、ここでＧＭ ＋および硫酸エステル化合物のＲ基は長鎖炭化水素である。この図に示されてい る特定のスルファチドはセレブロン酸テアル。 第３に、上記の脂質成分は、実質的に均一相の二重層構造を生じなければならず 、このことは、臨界膜を強化し、かつ負に荷電した脂質成分が、物理的に分離し た不連続相とは対照的に単一の相に存在することを意味する。明らかに、この要 求は、このリポソームによって得られる血液／ＲＥＳ値を増大させ、さらに血流 中における急速なリポソームの崩壊および漏出を最小限に抑える。 選択された糖脂質の１つと組み合わせた膜性化脂質成分の重要性は、実施例３． ４．８および９で示されている血液／ＲＥＳのデータから評価し得る。実施例３ の表１は、いくつかのリポソーム組成物と、注射の２時間後に測定された対応す る血液／ＲＥＳ値とを示している。表中の組成物３および４を比較すると、卵Ｐ ＣおよびＧ？’ｌ、を含有するリポソームにコレステロールを添加することによ り得られる血液／ＲＥＳ値が大きく上昇することかわかる、コレステロールは、 ＩＣが約Ｏ′Ｃであるような比較的流動性を有する脂質（例えば、卵ＰＣ）に対 する強化効果または「バンキング」効果を有することが知られている。 さらに重要なことに１本発明の目的に対し１組成物３および４と１組成物１２お よび１３とを比較すると、　ＳＭと組み合わせたＧＭ、は、　ＰＣと組み合わせ たガングリオシドよりもはるかに高い血液／ＲＥＳ値を与える。ここでは１組成 物１７および１８に関して、コレステロールがＳＭ：　ｃｈ、の配合物における 血液／ＲＥＳ比を減少させることが注目される。これは、おそらくいくつかの強 化脂質組成物においてよく知られたコレステロールの流動化効果によるものであ る。 表１のいくつかの配合物における卵ＰＣに替えてＤＳＰＣ（すなわち、飽和鎖ｐ ｃ）を用いた場合の効果は実施例４の表２から明らかである。　ＤＳＰＣおよび （Ｊｌは共に、明らかに血液／ＲＥＳ値を効果的に増大させている。この効果は 、該組成物にＳＭを添加することにより、さらに増強され、この比はＳＭ　：　 ＰＣの相対量が最高である場合に最高となる。　ＤＳＰＣの存在下では、血液／ ＲＥＳ比から明らかなように、コレステロールの流動化効果は小さいようである 。 ＨＰＩを用いて得られる血液／ＲＥＳ値に対する飽和脂質の効果は表５および表 ６から明らかである。これらの表では、ＰＣｉＣＨ中にＰＩ（不飽和Ｐ）を含有 する組成物と、不飽和ＰＣ（ＤＯＰＣ）　：ＣＥ中ニ）ＩＰＩを含有する組成物 とが、ＨＰＩ　：　ＤＳＰＣ：　ＣＥを含有する組成物と比較されている。飽和 組成物の血液／ＲＥＳ比は、不飽和組成物（不飽和ＰＩまたは不飽和ｐｃのいず れか）の血液／ＲＥＳ比よりも実質的に大きい。２４時間後の全回収量がより大 きいことから明らかなように、飽和組成物は不飽和Ｐ’ｌまたは不飽和ｐｃを含 有する２つの組成物よりも血流中で安定である。飽和ＰＩ、例えばＨＰＩに対す る要求は１強化脂質の二重層構造におけるＰ】成分の相分離を防止することであ る。 リポソームを含有するスルファチドの血液／ＲＥＳ比に対する飽和脂質の効果は １表６の血液／ＲＥＳのデータを比較することにより評価することができる。こ の表から明らかなように。 ５ＵＬＦを飽和脂質成分と組み合わせて用いた場合、２４時間後の血液／ＲＥＳ 比は約１５倍に増加している。ここで定義されるように、スルファチドはイオス （ｉｏｓ）を包含する。 実施例８は、いくつかのリポソーム組成物について注射の４時間後における血液 ／Ｆ！ＥＳ比を調べたものである。この結果は、注射の２時間後に見られる上記 の結果と一致している二〇ＳＰＣおよびＣＩ（と組み合わせた場合には、　Ｓｌ ’ｌの存在下または非存在下で、Ｇ？Ｉ、を含有するリポソームは、卵ＰＣとＣ Ｂとを含有するリポソームに比べて、はるかに高い血液／ＲＥＳ価を与える。 ここでのデータはまた。飽和リン脂質（ＤＳＰＣ）およびコレステロールの存在 下では、）ｉＰＩも高い血液／ＲＥＳ値を与えることを示している。 実施例９０表６は、注射の２４時間後に測定した数多くのリポソーム組成物に対 する血液／ＲＥＳ値を示している。これらの組成物は、血液／ＲＥＳ値が増加す る順に配列されている。まず。 血液／ＲＥＳ値は４時間と２４時間との間では著しく減少しているが、最良の配 合物では２４時間後でも比較的良好な血液／ＲＥＳ値（例えば、０．３またはそ れ以上）を示すことが明らかである。 これらの配合物には、　ＳＭの存在下または非存在下で、飽和ＰＣ（ＤＳＰＣ） 　ｍよびコレステロールと組み合わせた５ＵＬＦ、　ＵＰｌ、およびＧ？Ｉ、が 含まれる。 ここで、リポソームの糖脂質成分を考慮すると、上で考察したデータ、および特 に表６の比較データは、ＧＭ、、　Ｉ（ＰＩ　。 および５ＵＬＦが、膜性化成分と組み合わせると高い血液／ＲＥＳ比を生じるの にすべて効果的であることを示している０本発明を支持するために実施された研 究においては、これら３つの糖脂質と、それらの血液／ＲＥＳ比への効果とを、 他の様々な関連する糖脂質またはリン脂質と比較している。 実施例７０表３は、様々な異なる糖脂質および負に荷電したリン脂質のうちの１ つを包含するＰＣ：　Ｃ８およびＳＭ　：　ＰＣ組成物に対する血液／ＲＥＳ値 を示す、ＩＩ脂質の省略形および関連する構造的特徴は実施例７で詳細に述べら れている。いくつかの調べた脂質成分のうち、ＧＭ、のみ、あるいはＧＡＬまた はＧＬｔｌと組み合わせたＧＭＩが、ＰＣ：ＣＥリポソームにおいて高い血液／ ＲＥＳ値を与えｉ：、ＳＭ　：　ＰＣリポソームでは、　５ＵＬＦが比較的高い 血液／ＲＥＳ値を与えた。 実施例７で詳細に述べられているように、いくつかの異なるガングリオシドのう ちの１つを含有するＳＭ　：　ＰＣリポソームの血液／ＲＥＳ値もまた調べた０ 表４から明らかなように、Ｇ？Ｉ。 から１個またはそれ以上の末端糖基を除去すること（Ｇｌ’＋２およびＧＭＩ） 、ＧＭ、からシアル酸残基を除去すること（ＡＳＧ？ｌυ、あるいは１個より多 くのシアル酸残基が存在すること（ＧＤ＋−またはＧＴ＋ｂ）は、Ｇ？！、の血 液／ＲＥＳ増強効果を実質的に解消する。 表５では、ＰＣ：ＣＨリポソーム中におけるＧＭ、、　５ＬＩＬＦ、およびＨＰ Ｉは、すべて同程度の血液／ＲＥＳ値（約１）を与えるのに対し１強化脂質酸分 を用いた場合にはＧＭ、およびＨＰＩ　（ＳＵＬＦは試験しなかった）が最も高 い値を与えることがわかる。これら３つの成分は、上述したように、飽和脂質配 合物中で最も高い血液／ＲＥＳ値を与えた。 第２図Ａおよび第２図Ｂは、２つの異なるリポソーム配合物中におけるＧＭＩの モル比の関数として、血液／ＲＥＳ値をプロットしたものである。第２図Ａに示 されている第１の配合物は（最適以下の血液／ＲＥＳ比を与える）　ＰＣ：　Ｃ ）！配合物であり。 第２の配合物はＳＭ　：　ＰＣ配合物である。実施例６で考察されているように 、後者の配合物のみが強い（Ｊ、効果を示す。これから明らかなように、Ｇ？’ ｌ、の最適な濃度は、５モル％と１５モル％との間である。血液／ＲＥＳ比に対 する高い糖脂質濃度の効果は実施例１０で明らかになる。実施例１０では、　Ｄ ＳＰＣ：　ＣＨまたはＰＣ：　ＣＢを含有し、かつＨＰＩのモル濃度が増加する リポソームに対する４時間後および２４時間後の血液／ＲＥＳ比について調べら れている。約２５％を越えるＨＰＩのモル比では、約１６モル％またはそれ以下 の濃度において見られた高い血液／ＲＥＳ値が実質的に解消された。 上で考察した結果は、膜性化成分と組み合わせることにより、血液／ＲＥＳ値を 上昇させるのに最も効果的な糖脂質が２つの特徴を共有していることを示唆して いる。第１の特徴は。 ＧＭ＋　におけるシアル酸、ＦＩＰＩにおけるリン酸極性基、あるいは硫酸エス テルにおける末端ガラクトシル基に関連していると思われる単一の負電荷である 。この荷電した基の考えられる１つの役割は、インビトロまたはインビボのいず れかにおけるリポソームの凝集を低減させることである。　ＣＴＲ’ｌ、　ＤＧ ＤＧ。 ？ＩＧＤＧ、　ＧＡＬ、　ＧＬＯＢ、　ＡＳＧ門、、またはＧＬ［を包含する非 荷電の糖脂質にいずれもが、および２または３個の電荷を有する糖脂質のいずれ もが高い血液／ＲＥＳ比を与えなかった。 第２の必要な特徴は、糖脂質の荷電した基との直接的なタンパク相互作用および ／またはカルシウムイオン相互作用を妨げ得る電荷保護である。Ｇ？ｉ＋の場合 、荷電したシアル基が２つの末端糖基により、保護され得る（第４図Ａを参照） 。 興味深いことに、保護し得る糖残基を１つ有するＧＭ２は血液／ＲＥＳ価を上昇 させず、このことは両方の糖残基が必要であることを示唆している。ＨＰＩでは 、負に荷電したリン酸基が末端のイノシトール残基により保護される。このこと は、荷電したリン酸基が露出していると思われるＰＡ、および荷電したリン酸基 が比較的小さなグリセロール残基により保護されているＰＧとは対照である。こ こで、いくらかの電荷保護がなされているＰＧが）ＩＰＩとＰＡとの中間の血液 ／ＲＥＳ値を与えることは注目される。スルファチド糖脂質の場合、比較的高い 血液／ＲＥＳ値は、ガラクトシル残基（第４図Ｃ）上の負に荷電した硫酸基がリ ポソーム表面に部分的に埋められるか、あるいは保護されていることを示してい る。対照的に、硫酸基が露出していると思われている硫酸コレステロールは低い 血液／ＲＥＳ値を与える。電荷保護が明らかに必要であるということは。 ２個の電荷を有する糖脂質および３個の電荷を有する糖脂質（例えば、　ＧＤ、 、およびＧＴ＋ｂ）が、少なくとも１個の電荷が保護されていないと考えられる ために、比較的小さな血液／ＲＥＳ比しか示さないのはどうしてかということも 説明し得る。 脂質成分が均一相の二重層を形成する必要性は２部分的には、２４時間またはそ れ以上の期間にわたって血流中でリポソームが良好な安定性を示すのを確実にす るのが目的である。 リポソームの不安定性はＲＥＳの取込みを増大させると思われるので、二重層に おける相の均一性は、向上された血液／ＲＥＳ値に寄与するはずである。このこ とは１例えば、どうしてＳＭ二〇も配合物が２４時間後には比較的低い血液／Ｒ ＥＳ比を与えるのに（表６）、２時間後には非常に高い比を与える（表１）のか ということを説明し得る。両方の表のデータは、実施例９で詳細に述べるように 、この配合物が血流中では非常に不安定であること、および／または漏出しやす いということを示しでいる。 相の不均一性は、また、　ＤＳＰＣ：　Ｃ）！混合物と組合わせた場合には、　 ＨＰＩに比べてＰＩＯ方が血液／ＲＥＳ比を増大させるのに効果がないのはどう してかを説明し得る。何故なら、　）ＨＰＩが飽和ＰＣとのより良好な相適合性 を有する（より類似したＴｃを有する）と思われるからである。 リポソーム組成物に必要とされる膜性孔側およびガングリオシドに加えて、リポ ソームのＲＥＳ回避特性を著しく傷つけない他の中性の小胞形成脂質を含むよう にリポソームを配合し得る。明らかな例としては、上述の配合物の多くに使用さ れる。約３０％のモル比のコレステロールがある。 リポソームはまた。リポソームに対する。および／または一リポソーム中に捕捉 されて運搬される薬剤に対する酸化的損傷を最小限に抑えるために、α−トコフ ェロールまたは他の遊離基阻害剤のような保護剤を含有し得る。 Ｃ，リポソーム組成物の調製 リポソームは、５ｚｏｋａら（１９８０）により詳述されているような様々な技 術によって調製され得る。薬剤含有リポソームのある好ましい調製方法は、　５ ｚｏｋａらおよび米国特許第４，２３５，８７１号により述べられている逆相蒸 発法である。この方法では。 リポソーム形成脂質溶液を少量の水性媒体と混合し、この混合液を分散させて油 中水型エマルジョンを形成させる。供給されるべき薬剤または他の製薬剤は、親 油性薬剤の場合には脂質溶液に添加され、水溶性薬剤の場合には水性媒体に添加 される。ここで、すべての脂質および水性成分は、好ましくは無菌であり１発熱 因子を全く含まないべきであることに注意する。蒸発により、脂質溶媒を除去し た後、得られたゲルは、水溶性薬剤に対しては５０％までのカプセル化効率で、 リポソームに変換される。逆相蒸発小胞（ＲＥＶ　）は約２〜４ミクロンの典型 的な平均サイズを有し、そして主としてオリゴラメラである。すなわち１個また は２．３個の脂質二重層殻を含む。この方法は実施例ＩＡで詳細に述べられてい る。 ＲＥＶは、以下に考藁されているように、好ましくは約０．０８〜０．４　ミク ロンの間の最大の選択されたサイズを有するオリゴラメラ小胞を与える押し出し により、容易にサイズ調製することができる０本発明を支持するために実施例さ れた実験によると、この型のサイズ調製されたオリゴラメラ小胞は。 同様にサイズ調製された多重ラメラ小胞（ＭＬＶ）に比べて実質的に高い血液／ ＲＥＳ比を示し１例えば０．１６〜０．１７ミクロンのサイズを有するより小さ なＲＥＶは９例えば０．４　ミクロンのより大きなＲＥＶに比べて高い比を与え る。ＲＥＶの別の利点は、脂質に対するカプセル化薬剤の割合が高いことであり 、このことにより、所定の脂質用量でより多くの薬剤用量を投与し得る。 必要に応じて、　？ＩＬＶは簡単な脂質膜水和技術により形成し得る。この方法 では、適当な溶媒に溶解した。上で詳述した型のリポソーム形成脂質の混合液を 容器中で蒸発させてＦ［を形成し１次いで水性媒体で被覆する。この脂質膜は水 和して、典型的には約０．１〜１０ミクロンの間のサイズを有するＭＬＶを形成 する。これらの小胞は、サイズ調製されていない場合には１表９から明らかなよ うに、押し出さなかった？ｌＬＶ　１Ｍ成物に対する比較的小さな血液／ＲＥＳ 比を示す、典型的には、　？ＩＬＶは、０．５　ミクロンまたはそれ以下の所望 サイズ範囲内に、好ましくは下で詳述するように、押し出しにより、約０．０７ と０．１２ミクロンとの間にサイズ調製される。 ＲＥＶおよび肚Ｖのある効果的なサイズ調製方法は１選択された均一な孔サイズ （典型的には、　０．０５．０．０８．０．１．０．２゜または０．４ミクロン ）を有するポリカーボネート膜を通してリポソームの水性懸濁液を押し出すこと を包含する（Ｓｚｏｋａ）　。 膜の孔サイズは、この膜を通して押し出すことにより作製されるリポソームの最 大サイズにほぼ対応しており、特に調製物は同じ膜を２回またはそれ以上押し出 される。リポソームのサイズを調製するこの方法は、以下の実施例で述べられて ルターを通して押し出すことを包含する。この方法は、米国特許出願第８２９． ７１０号の「リポソーム押出方法Ｊ　（１９８６年２月１３日出ＩＩ）に詳述さ れている。 あるいは、　ＲＥＶまたはＭＬＶ調製物は、　０．０４〜０．０８ミクロンの範 囲のサイズにより特徴づけられる小さな単ラメラ小胞（ＳＵＶ）を作製するよう に処理され得る。しかしながら、上で示したように、ＳＵＶは、水溶性薬剤を供 給するには内容量が比較的小さく、また、融合することにより、不均一に分散し た薬剤の漏出特性と、ＲＥＳ取込み特性とを有するより大きな不均一サイズのリ ポソームを形成する傾向があり、ＲＥＶまたは？ＩＬＶに比べて漏出しやすい、 ＳＵＶは、実施例ＩＣに述べられているように、ＲＥＶまたは肚Ｖを均質化した り、超音波処理することにより、容易に作製することができる。 最終的なサイズ調整の後、リポソームは必要に応じて、フリーの（捕捉されてい ない）薬剤を除去する処理を行い得る。 従来の分離技術（例えば、遠心分離、透析濾過、および分子ふるいクロマトグラ フィー）が好適である。組成物は、一般的に用いられている０、４５ミクロンの 深さのフィルターを通して濾過することにより、滅菌することができる。 （以下余白） 上記のようにして調製し、循環半減期を有意に増大させたリポソームは、治療用 または診断用の２種の一般的なタイプのリポソーム組成物に利用され得る。第１ の組成物は、リポソームを循環させることによって、リポソームと結合させた薬 物の血流中への放出を持続させるよう設計されている。上記から明らかなように ９本発明によって調製されたリポソームは、大部分が２４時間まで血流中に保持 されるので、約１日間あるいはそれ以上まで、生理学的にを効なレベルで薬物の 放出が持続され得る。 血流中での薬物の利用性が増大したことを示すひとつの尺度としては、血液／Ｒ ＥＳリポソームが高い場合に認められる曲線下領域（ＡＵＧ）の増大がある。　 Ａｔ１Ｃの測定は、実施例９に記載したように、血液および肝臓の両方について 、２４時間にわたりリポソームマーカのレベルを測定することにより行われる。 これらのＡＵＧ（ｉの比率により、総リポソーム利用性の度合が肝臓から血流へ 移ったことが示される。実施例τの表７は、高い血液／ＲＥＳ値が、高いＡＵＧ 比率と相関関係のあることを示す。 血流中のリポソームの寿命が延長したので、注射されたリポソームの存意な量が 、ＲＥＳによって血流から除去される前に標的部位に到達できるようになる。特 に、腫瘍患者に静脈投与することにより、腫瘍組織を標的として薬剤治療を行な うことが望ましい。 動物の腫瘍を標的とする本発明のリポソーム組成物の使用は、実施例１１〜１３ に詳細に記載される。結果を要約すると。 血液／ＲＥＳ比が増大したときのリポソームは、遊離の薬物に比べて腫瘍への取 込みが１０〜３０倍増大する。腫瘍中に高濃度の薬物が認められるのは、投与後 ４〜４８時間であるが、腫瘍への取込みは投与後２４時間がピークであった。処 置方法の詳細は実施例に示す。 種々の薬物または他の薬理学的に活性な試薬が、リポソーム組成物による供給に 適している。薬物の一般的なりラスのひとつには、水溶性でリポソーム透過性の 化合物が包含される。このような化合物は、リポソーム懸濁液の水性部分に優先 的に分配され９時間の経過とともに、懸濁液においてリポソームの内部空間と外 側のバルク相の間に平衡化する傾向にあることにより特徴づけられる。このクラ スの代表的な薬物としては、テルブタリン、アルブチロール、硝酸アトロビンメ チル、クロモリンナトリウム、プロプラノロール、フルノイソリド、イブプロフ ィン、ゲンタマイシン、トベルマイシン、ペンタアミジン、ペニシリン、テオフ ィリン、プレオマイシン、エトポシド、キャプトブレル、ｎ−アセチルシスティ ン、ベラパミル、ビタミン類、およびキレート化金属のような放射線不透過性で 粒子放出性の物質が包含される。これらの薬物は、媒体の水性組成物と平衡化す る傾向があるため。 リポソーム組成物は凍結乾燥した状態で貯蔵し、投与直前に再水和するのが好ま しい。あるいは、この組成物を濃縮形態で製造し、投与前に希釈してもよい、後 者の方法は、　１９８６年５月７日出願の米国特許出願第８６０．５２８号「リ ポソーム組成物およびその方法」に詳細に記載されている。 薬物の第２のクラスは、水溶性ではあるが、リポソーム不透過性の薬物である。 大部分は、これらは、ペプチドホルモン、酵素、酵素阻害剤、アポリポタンパク のようなペプチドまたはタンパク分子であり、そして、高分子量の炭水化物はカ プセル化ときに長期間安定であるという特徴を有する。このクラスの代表的な化 合物としては１次の化合物が包含される：カルシトニン、アトリオペブチン、　 ”ａｏ−１−アンチトリプシン（プロテアーゼ回害剤）、インターフニロン、オ キシトシン、バソプレッシン、インスリン、インターロイキン−２，スーパーオ キシドジムスターゼ、組織プラスミノーゲンアクチベータ−（ＴＰＡ）　、血漿 因子８．上皮成長因子、腫瘍壊死因子、肺界面活性タンパク、インターフェロン 、リポコルチン、　′ａ”−インターフェロンおよびエリスロボエチン。 第３のクラスの薬物は、親油性分子であり、この親油性分子は、脂質二重層の相 に分配されやすく、そのため、主として膜に捕捉された形態でリポソームと会合 している。このクラスの薬物は、１よりも大きく、好ましくは約５より大きいオ イル／水分配係数で規定される。この係数はオクタツール／水のような標準オイ ル／水混合物中で測定される。このクラスの代表的な薬物としては９次の化合物 が包含されるニブロスタグランジン類、アンホテリシンＢ、プロゲステロン。 イソソルビドジナイレート、テストステロン、ニトログリセリン、エストラジオ ール、ドキソルビシン、ベクロメタゾンおよびそのエステル類、ビタミンＥ、コ ルチゾン、デキサメタシンおよびそのエステル類、およびベタメタシンバレレー ト。 血流を介して薬物放出を持続させるために、リポソーム組成物は、望まれる分配 時間、典型的には１２〜２４時間にわたり適切な薬物量を与える量で静脈投与さ れる。この注射は、一度に行なうかまたは徐々に静脈点滴で行われ得、リポソー ムが注射部位から徐々に分散される。 選択された非ＲＥＳ！ｍ部位をリポソームの標的とした場合には、リポソームは 、好適には標的部位の分子の表面を認識するように設計される０例えば、固体腫 瘍を標的とする場合には１表面に結合した腫瘍認識分子（例えば、ｌ！瘍特異的 抗原に対する抗体）とともに調製され得る。このタイプの分子を結合させる方法 は、当業者に公知である。このような方法は、ホスファチジルエタノールアミン のような脂質成分をリポソームに組み込む方法を一般に包含し、これらの脂質成 分は活性化されて２表面物質または脂質誘導化プレオマイシンのような誘導され た親油性化合物と結合し得る。 固体ｍ瘍部分を放射線造影するのに有用な特定のリポソーム組成物においては、 リポソームは、カプセル化された放射線不透過性の、または粒子放出性の金属で 、典型的にはキレート化された形で調製され、リポソームが腫瘍部位に優先的に 結合するように１表面に結合したプレオマイシン分子を有する。上記キレート化 された形は、リポソーム二重相を介して金属が透過するのを実質的に阻止する。 次の実施例は、循環時間を長くしたリポソームの調製方法およびインビボおよび インビトロにおける循環時間を近づける方法を示す、実施例は９本発明の特定の リポソーム組成物と方法を例示するのを目的とするが９本発明を限定するもので はない。 セラミド１（ＣＥＲ）　、コレステロール（ＣＨ）、モノガラクトシルステレー ト　スルファチド類（ＳＵＬＦ）　、ガラクトセレプロシド１（ＧＡＬ）　、グ ルコセレブロシド１（ＧＬＵ）　、およびラクトシルセレミド（ＬＡＣ）は、シ グマ社（Ｓｉｇａｎａ；Ｓｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　ＭＯ）から入手した。スフィン ゴミエリン（ＳＭ）、卵ホスファチジルコリン（レシチン）（ＰＣ）　、ホスフ ァチジルイノシトール（ＰＩ）、水素化ホスファチジルイノシトール（Ｉ（Ｐｌ ）　、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルグリセリロール（ＰＧ） 　、ホスファチジンａ　（ＰＡ）　、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ） 　、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）　、ジパルミトイ ルＰＣ（ＤＰＰＣ）、　ジオレイルＰＣＣｌｌ０ＰＣ）およびジステアロイル（ ＤＳＰＣ）は、アバンティ　ポーラ−リビンズ社（Ａｖａｎｔｉ　Ｐｏ１ａｒＬ ｉｐｉｄｓ；ＢｉｒｌｌＩｉｎｇｈａｍ、ＡＬ、）から入手した。グロボシド類 （ＧＬＯＢ）　。 ジガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）　、　モノシアロガングリオシド（Ｇ ＭＩ）、ガングリオシドＧｌ’ｌｚ　（（Ｊｈ）　、ガングリオシドＧｌ’ｈ　 （Ｇｌ’ｌｘ）　。 トリジアロガングリオシド（６丁、１）およびジンアロガングリオシド（ＧＤ、 、　）は、スペルコ社（ＳｕｐｅｌｃｏＨＢｅ１ｌｅｆｏｎｔｅ、　ＰＡ）から 入手した。 （＋２Ｊ）−チラミニルイヌリンは１文献記載の方法で調製した。ｔｈ７ガリウ ムー８−ヒドロキシキノリンは、ＮＥＷネオスカン社（ＮＥＮ　Ｎｅｏｓｃａｎ ；　Ｂｏｓｔｏｎ、　ＭＡ）より得た。ドキソルビシン（アドリアマイシン）は アトリア社（Ａｄｒｉａ　；　Ｃｏ１ｕａ＋ｂｕｓ、　ＯＨ）から、そして、プ レオマイシンはブリストルマイヤーズ社（Ｂｒｉｓｔｏｌ　Ｍｙｅｒｓ　；５ｙ ｒａｃｕｓｅ、ＮＹ　）からそれぞれ得た。 １施■土 ■と一１ヱ」ムは８腸二９匡袈 この実施例では、逆蒸発小胞（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｈａｓｅ　ｅｖａｐｏｒａｔ ｉｏｎｖｅｓｉｃｌｅｓ　；　ＲＥＶ　）多重ラメラ小胞（＋ａｕｌｔｉｌａｍ ｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ　；？ｌＬＶ　）および小車ラメラ小胞（ｓｍａ ｌｌ　ｕｎｉｌａ＋ｌ１ｅｌｌａｒ　ｖｅｓｉｃｌｅｓ　；５ＬｉＶｓ　）の調 製法について述べる。 Ａ、サイズ°、　′れたＲＥＶ 選択した脂質成分の全量５０■（モル比は下記実施例に示す）を、５−のジエチ ルエーテルに溶解させた６　１３１Ｍリン酸塩。 １４０　ｆｆ１Ｍ　ＮａＣ１を含有するｐＦＩ７．４の水性緩衝液を、有機溶媒 に。 最終容量が６．５　ｍとなるように添加した。次いで得られた混合物を、１分間 超音波処理して乳化し、得られた溶液を室温またはそれを下まわる温度に保持し た。リポソームが、カプセル化された（１２Ｓ））チラミニルイヌリンを含有す るように調製される場合には、それは、約４．ｇｃｉ／ａｔｅ緩衝液、の濃度で 上記リン酸塩緩衝液に含有される。 このエーテル溶媒を、減圧下室温で除去し、得られたゲルを、上記緩衝液の１ｄ で取出し激しく振盪した。得られたＲＥＶ懸Ｓ液には、顕微鏡で測定したところ 、約０．１〜２０μ節の粒子が含まれていた。主として比較的大きな（１μ閣よ り大きい）小胞で構成され、これら小胞は、１つもしくはごく少数の二重層ラメ ラを備えていた。 リポソームを、０．４　μｍもしくは０．２　μｍの選択された孔サイズを有す るポリカーボネートフィルター（Ｓｚｏｋａ、１９７Ｂ）を通して押出した。０ ．４　μｍのフィルターを通して押出されたリポソームは、平均０．１７　（０ ，０５）μｍの直径であり、０．２μｍのフィルターによるものは、平均０．１ ６　（０，０５）μｍの直径であった。押出されたリポソームを、セファデック スＧ−５０（ファルマシア社）を通過させて、カプセル化されていない（Ｉｆ％ Ｉ〕チラミニルイヌリンを除去した。 Ｂ、胆 選択した脂質成分の全量１０〜１００■を、クロロホルム：メタノール（２：１ ）に溶解させた。溶解させた脂質溶液を回転エバポレーターで蒸発させて薄いフ ィルムとし９次いでカプセル化されるべき溶質（例えば、デスフェラルまたはプ レオマイシン）を含有する水性生理学的援衝液で水和した。１〜２時間おだやか に振盪して肛Ｖを形成した。カプセル化されなかった溶質をゲル濾過法で除去し た。この？ｌＬＶを調べたところ、約０．１〜２０μｍの不均一なサイズを示し 、大部分が多重層構造であった。この１１ＬＶを９選択された大きさの細孔を有 する二重ポリカーボネート膜を通しで押８してサイズ調整を行なった。膜の細孔 の大きさは、低い相転移点（流体）のリポソーム配合物用のものについては典型 的には０．０５μｍであり、高い相転移点（剛体）のリポソーム配合物用のもの については０．０８μｍであった。いずれの場合についても、リポソームの寸法 は、レーザー光線散乱法で測定すると、主として０．０７〜０．１２μｍの大き さの範囲内であった。高い相転移点の脂質が使用された場合には、再水和および 押出しを５０〜上記のようにして得た大きさのそろっていない？ｌＬＶの懸濁液 約２５絋に、１／２インチのサファイアを結合プローブを用いて超音波を照射し 、最通の出力条件下で、１５分間隔のパルス超音波処理を行なった。この超音波 処理は、窒素気流下でリポソームの容器を氷水中につけて行なった。超音波処理 された小胞は、セファデックスＧ−５０を通過させ、放出された遊離のマーカー を除去した。リポソームのサイズは、主として０．０３〜０．０８μｍの範囲で あった。 １里■呈 ′ＲＥＳ　レベルの′１ 年令と性別とを揃えた。典型的にはその体重が２０〜２５．のマウスの尾の静脈 に、リポソーム懸濁液または生理食塩水を注射した。注射した物質の総量は、総 注射容量０．２　ｊｄ中にリン脂質が０．５■であった。注射後１選択した時間 間隔で、頚部脱臼によって動物を殺し、血液試料を心臓から採取し、肝臓と肺臓 とを取出した。肝臓および肺臓の水分をぬぐい取り。 重量を測定し、直接、ガンマ線のシンチレーシテンカウンターでそれぞれ測定を 行なった。血液が肝臓および膵臓に残留しているのを考慮して補正係数を適用し た。血液試料の一部について同様に、直接、ガンマ線計数を行なった。全血液の カウントを、全血液容量が体重の７％であることに基づいて算出した。血液ＲＥ Ｓ比を、全血液カウント値／肝臓および肺臓の総カウント値として算出し、いく つかの他の組織についてもしばしば血液／ＲＥＳ比を決定した。 時間経過後に測定した血液／１？ＥＳ　（Ｉは、リポソームの放射標識の損失に ついて補正を行なった。この補正は、注射直後に測定したリポソームのカウント 数をもとにして、各時点でインビボに残留している総カウント数のパーセントを 、測定された血液／ＲＥＳ比にかけることにより行なわれた。 １隻皿主 と　゛　ＲＥＳ　との矢　、 ０．１７μ−の大きさにサイズ調整され９表１の左側に示すリポソーム組成とモ ル比とを有するＲＥＶを、実施例１と同様にして調製した０、報された研究に用 いられたＳＭは、ウシ脳スフィンゴミエリンであり、その炭化水素鎖部分には９ 部分的に不飽和鎖が混合して含有する。リポソームを静脈注射し、注射された動 物を注射してから２時間後に殺した０表に、リポソームのサイズ、血液／ＲＥＳ 比（前記のようにして算出）。 および注射して２時間後に回収されたカプセル化されたマーカー（イヌリン）の 総量の全体に対する百分率を示す。 ｌ上 上記血液／ＲＥＳ比のデータは次の事柄を示している：１、　コレステロール（ 組成物４　）　、　ＤＳＰＣ（組成物８）、およびＳ？！（組成物１２．１７） またはこれらの脂質成分の組み合わせ（組成物９および１３）のような膜を強化 する成分を含み。 その内部にガングリオシドＧＭ、を含有するリポソームは、　ＧＭ。 なしで膜を強化する成分を含有するリポソーム（組成物６゜７、１０．１１．１ ４または１５）またはＧＭ、を含有するが、膜を強化する成分を含有しないリポ ソーム（＆ｌｌ初物３に比べて。 はるかに高い血液／ＲＥＳ比を与えた。 ２　リポソーム中の５Ｍ１０代わりにアシラオガングリオシド（ＡＳＧＭＩ　） を用いると（組成物１９対組成物１７）、血液／ＲＥＳ比に対するＧチ、の増強 効果を大きく減少させた。 総画収率（％）のデータは、２種のＳＦ’ｊ配合物（組成物１０および１２）で は体内での接続性に比較的劣ることを示しており。 これは、おそらくリポソームの安定性が低く、ｉｇしたカプセル化マーカーが速 やかに除去されるからであろう。 （以下余白） 亥１ΔＬ ＤＰＳＣの　゛　ＲＥＳ　に・するに 表２の左に示す５種の脂質組成物を有し、サイズ調製されたＲＥＶを上記と同様 にして調製した。これらの組成物は、ジステロイルＰＣ（ＤＳＰＣ）を、比較的 不飽和度の高い卵ＰＣ（ＰＣ）の代わりに用いたこと以外は１表１の組成物のい くつがと類似している。血液／ＲＥＳ比を、実施例３と同様にして静脈注射して から２時間後に測定し、結果を表２の右側に示した。 表１および表２における同様の組成物の血液／ＲＥＳ値を比較すると１次の事柄 がわかった： １、　ＳＭ：ＰＣ：Ｇ！’ｌ、組成物中（７）ＰＣ（７）代わりＣＤ５ＰＣを用 いる（表２の組成物２対表１の組成物１７）と、血液／ＲＥＳ比が有意に増大す る。 ２．３本ＰＣ：ＣＨ：ＧＭ、組成物中のｐｃの代わりにＤＳＰＣを用いる（表２ の組成物５対表１の組成物１８）と、同じく、血液／ＲＥＳ比が増大する。 表２ Ｉ１五１ ２４　日にわたる　；ＲＥＳ　の陪♂　′。 ２種のリポソーム組成物の血液／ＲＥＳ比（１）ＰＣ：ＣＥ：ＧＭ、、２：１： ０．１４　（組成物４）および（２）針：ＰＣ：Ｇ？１１゜４：１：０．３５　 （組成物１７）を含有し、サイズ調整した（０．１７μ＋ｅ）ＲＥＶを有する２ 種のリポソーム組成物の血液／ＲＥＳ比を、注射２．６および２４時間後に測定 した。この２種の配合物の２４時間にわたる挙動を、第１図に示す。第１図にお いて黒丸は組成物４．白丸は組成物１７を示す。 図から明らかなように１組成物１は、注射２時間後に完全に除去される。これに 対して１組成物２は、注射２４時間後においても有意のレベルを保持している。 皇ｌ拠旦 ＲＥＳ　に・するガング１オシド゛　の≦カプセル化されたイヌリンを含有し、 サイズ調整された？１ＬＶ（０，１７μ閤）を、上記と同様にして調製した。リ ポソーム組成物は、　ＰＣ：ＣＨ，２：１を含有しく第２図Ａ）、あるいはＳＭ ：ＰＣ，４：１を含有していた（第２図Ｂ）、前者におけるＧＭｌは、　０．２ ．５゜５．０．７．５および１０モル％であり、後者におけるＧ？１１　は前者 と同様であり、さらに１２および１５モル％のものを包含する。組織に分配され たリポソームの標識を、肝臓（三角印）、肺臓（四角印）および血液（丸印）に ついて、静脈投与２時間後に、前記したのと同様にして測定した。 第２図Ａを参照すると、　ＧＭＩのモル量を増加させると、注射２時間後の血液 中のリポソーム濃度は、５および７．５モル％のガングリオシドを含有するリポ ソームにおいては、総注入カウントの約１０％程度まで増大した。同時に、肝臓 の取込み量は、５および７．５モル％のガングリオシドのときに、最低のレベル であることが観察された。しかし、このレベルは。 総注射カウントの３０％よりも大きかった。 これには対照的に、第２図Ｂを参照すると、　ＧＭ、量を約２．５モル％を超え て増加させると、血液中のカウントのパーセントが増大して５０％を超えた。一 方、全肝臓取込み量は、約１０％未満に減少した。この結果は、膜を強化させる 成分（この場合は５Ｐｌ）が、　ＧＭＩの血液／Ｉ’ｌＥＳ比に対する影響に重 要であることを示す。さらにこの結果は、リポソーム中の最適Ｇｌ’ｌ。 濃度が約７．５〜１５．０モル％であることも示している。 実施孤１ ：ＲＥＳに・する　および　？８　の５表３に示す１８個の異なる組成物の一つ を含有し、サイズを調整されたＲＥＶを調製し９種々の糟および／または負荷電 基の血液／ＲＥＳレベルに対する影響を、リポソームを投与２時間後に測定した 。各組成物には、　ＰＣ：ＣＨ、２：１と、１種以上の糖脂質もしくは負荷電脂 質の０．２モル％を含有させた。使用した種々の荷電物質および／または糖物質 は次のとおりである：モノガラクトシルステアレート、ガラクトース残基に荷電 サルフェート基を有するスルファチド（ＳＵＬＦ　；第５図Ｃ）。 ホスファチジルセリン（ＰＳ）　；ホスファチジン酸（ＦＡ）、）リヘキソシド セラミド類（ＣＴＲＩ）　、３個のヘキソース単位を有する非荷ｉｔｓ脂質；ジ ガラクトシルジグリセリド（ＤＧＤＧ）　。 ２個のガラクトシル残基を有する非荷電糖脂質；モノガラクトシルジグリセリド （？１ＧＤＧ）　、単一のガラクトシル残基を有する非荷電糖脂質；ガラクトセ レブロシド類（ＧＡＬ　）　、単一のガラクトシル残基を有する非荷電複脂質； グロボシド類（ＧＬＯＢ）　、４個の糖残基を有する非荷電糖脂質；アシアロガ ングリオシド（ＡＳＧＬ　）　；　＃よびグリコセレブロシド（ＧＬＵ）。 単一のグルコース残基を有する非荷電糖脂質。 モル組成および注射２時間後に測定した血液／ＲＥＳ比を下記の表３に示す、Ｐ ＣおよびＣ）ｌとを含有する組成物において。 ＧＭＨのみ、またはＧＭ＋　と組合わせてＧＡＬもしくはＧＬＵを含有する組成 物は、　ＰＣ：ＣＨリポソームの場合よりは有意に大きい血液／ＲＥＳ値を示し た。ｐｃおよびＰＡは９両者ともに、血？４．ＺｆｌＥｓ比を低下させ、Ｐｓは 血液／ＲＥＳを著しく低下させた。 針とＰＣとを含有する組成物においては、モノガラクトシルステアレート（ＳＵ ＬＦ）が、　ＰＣ：ＣＨ：ＧＦ’１．配合物に匹敵する値を示した。 （以下余白） 表３ ＰＣ：ＣＨ，４：１で構成され、下記のガングリオシド類もしくは修飾ガングリ オシド類の１種の０．３５モル％を含み、サイズを調整された（０．１７μｍ　 ）　ＲＥＶの注射２時間後に、血液／ＲＥＳ値を測定した。ガングリオシド類も しくは修飾ガングリオシド類には、Ｇ？ｌ、；１個のほとんど荷電していない末 端糖残基を有するＧＭｚ；２個のほとんど荷電していない糖残基を有するｃｈｓ ；ジシアロガングリオシド（ＣＤ１．）　（その４つの糖残基は２個のシアル酸 残基を有する）；そして、トリジアロガングリオシド（ＧＴ＋ｂ）（その４つの 糖残基は２個のシアル酸残基を有する）がある。血液／ＲＥＳ比を下記の表４に 示す。表かられかるように、　ＧＭ、ガングリオシドだけが、高い血ｉ／ＲＥＳ 比を示す 表４ 亥１１１− ５゛　・４　日′のリポソームの ２５ｍＭのデスフェラルを含有する水和緩衝液を用いて実施例１と同様にして、 肚■を調製した。脂質組成物を下記表５の左に示し、その隣りの欄に相対モル量 を示す。これらＭＬＶを実施例１と同様に押出して、サイズ範囲を約０．０７〜 １．１２μ箱とし、遊離のデスフニラルをセファデックスＧ−７５０カラムクロ マトグラフイで除去した。 動物に注射する第１日前に　６”ｌガリウム／８−ヒドロキシキノリンの複合体 （弱親油性のキレート化剤）を、リポソームの！！！濁液に添加した。この複合 体がリポソームを透過するとき、カプセル化されたデスフエラルのｂ’ｒＧａの 移動が起こる。 得られたｔｈ７Ｇａ−デスフエラル複合体は、高い親和力を有するので、トラン スフェリンあるいは他の金属結合タンパクによって置換され得ない、この複合体 は、リポソームから放出されると、数分間の半減期で尿によって速やかに排泄さ れる。 注射する直前に、リポソームを陰イオン交換樹脂（ＡＧ−ＩＸ４アセテート型） を通過させて、カプセル化されていないｈ”ｒＧａ−８−ヒドロキシキノリン複 合体のすべてを完全に除去する。 年令と性別とを一致させたマウス群に、下記表５に示す脂質組成物の１種を含有 するリポソーム調製物を９尾の静脈から注射した。注射４時間後に、血液および 肝臓と肺臓とを含む解剖された身体部分の放射能（カウント７分）を、　１０〜 １００Ｏｋｅνの間での積分カウンティング法を用いるガンマ線カウンティング によって測定した。血液総カウント数を、推定全血液容量に基づいて前記のよう にして測定した。全回収率Ｃ％）は。 全身のガンマ線カウント数によって測定した（全身カウント数×１００／注射さ れたカウント数）。 血Ｐｉ、／ＲＥＳ比は、総血液カウント数を、肝臓および肺臓の総カウント数の 合計で劃ることにより、前記と同様にして算出した。その結果を表５に示す。表 がられがるように、　ＧＭ。 ガングリオシドと水素化ＰＩ　（ＨＰＩ　）とは、飽和ＰＣ，または飽和ＰＣ÷ Ｓ？Ｉを含有するリポソームに比較的高い血液／ＲＥＳ比を与えた。不飽和リポ ソーム配合物中の上記と同様のガングリオシドまたは５ＵＬＦ、または不飽和配 合物中の卵ＰＴは、実質的に低い値を与えた。 （以下余白） 表５ 亥ｌ１１史 ）パ　・′２４誹ｌＰ゛Ｆ時のリポソームの１表６に示す脂質組成物を含有し、 ６？ガリウム／デスフ工ラル複合体をカプセル化している。サイズを調整したＭ ＬＶを実施例８と同様にしてｔｌ！製した。上記の方法により決定した血液／Ｒ ＥＳ比と全身総回収率（％）とを１表の右側に示す。ＧＭＩ。 ＢＰＩおよびＳＬ！ＬＦをＤＳＰＣおよびＳＭのような飽和中性脂質成分と組合 わせると、２４時間経過した時点で最適の血液／ＲＥＳ比が得られるということ をデータは示している。 負に荷電している成分がＰＧもしく：よりＳＰＧの場合には、低い血液／ＲＥＳ 値が得られ、これら成分の負の荷電二ヨ、比較的小さなグリセロール基で保護さ れ、そして、負に荷電している成分がコレステロールサルフェート（ＣＢＳ　） の場合には、その荷電サルフェート基は保護されていない。 表６ また、配合物が異なると２４時間後の全身総回収率が変化すたはＲＥＳ値との関 係、またはそれらの比に明確な関係はないが、脂質成分が広範囲に変化する相転 移温度（Ｔｐ）を有する場合、配合物の多くは比較的低い回収率を示した。した がって９例えば、　ＳＭ　（Ｔｐが約３０℃）およびＤＳＰＣ（Ｔｐが約５０″ Ｃ）を含有するＧ？ｌ、配合物は、注射後４時間経過時点で観察したところ、　 ＳＭを含有しないＧ？！１配合物よりもはるかに低い回収率を示した。更に、　 ＳＭと卵ｐｃ　（Ｔｐが約０°Ｃ）とを含有する。ガングリオシドもしくは非ガ ングリオシド配合物が、コレステロールを含有していてもいなくても低い回収率 を示したのは−Ｎ　７ｉ１　＜べきことであった。 注射後２４時間経過時点で血液、肝臓および肺臓に含有される総放射能レベル（ リポソームのマーカ）を、下記表７の右側に示した数種のリポソーム組成物につ いて測定した。これらのレベルは、２．４および２４時間経過した時点で測定し たレベルについて１曲線下面積（Ａｔ］Ｃ）として決定したものであり、従って 、注射後２４時間経過時点までの期間の組織（血液、肝臓もしくは肺臓）中に存 在するマーカの全レベルに関係している。 表から分かるように、　ＧＭＩ　もしくはＨＰＩを含有する配合物には、高いＡ ＵＧ血液／肝臓比が認められ、一方、　ＰＧもしくはＩ）ＰＰＧを含有する配合 物については、上記の比率がはるかに低く、このことは９表６における血液／Ｒ ＥＳ比の価と一致している。 表７ リポソームの血中レベルとＲＥＶレベルとの間に統計上有意な相関関係があるか 否かを調べるために、最小２乗法を用いて、データの線形回帰分析を行なった。 第３図Ａは、血中レベルとＲＥＳの取込みとの間に逆（負）相関関係があること を示している（　ｒ　＝　−０，８８，ｐ　＝Ｏ，０ＯＯ０２）　、これらの数 値は表６の数値を採用した。 ！ＪＬ［１段 ＩＲＥＳ　に・する尋Ｔのに屯 下記表８に示すように、　ＨＰＩ　またはＰＩと、　ＤＳＰＣもしくはＰＣのい ずれか一方と、コレステロールとを含有し、　ＨＰＩまたはＰｌのモル量が増大 するように変化させ、そして、サイズ調整した肚■を上記の方法により調製し、 注射後２４時間経過時または４時間経過時の血液／ＲＥＳ比および全身総回収率 について調べた。表８から分かるように、　ＨＰＩのモル百分率を約６％から１ ６％に増大しても血液／ＲＥＳ比はほとんど変化しなかったが、１６％から３０ ％に増大させると著しく低下した。血液／ＲＥＳ比の同様の低下は、　ＰＩ配合 物についても、注射後４時間および２４時間経過時点の両時点で観察された。　 Ｐｌもしくは）ＩＰＩの割合（％）は、注射後４時間経過時または２４時間経過 時の全身総回収率には大きな影響を与えなかった。 （以下余白） 表８ ！Ｊ１４■ リポソームのマーカのマウス　−への取゛入動物に、　Ｊ６４５６もしくはＢ１ ６のｍ藻細胞系列を接種した。 Ｊ６４５６系列はＴ細胞由来のリンパ腫（Ｇａｂｉｚｏｎ　）であり、インビト ロでは細胞懸Ｓ：ａ、増殖し、腹腔内注射のち、腹水腫瘍として増殖する。静脈 注射後、これは、主として肝臓および肺臓に転移する。Ｂ１６黒色腫系列は、イ ンビトロでは粘着性腫瘍として増殖する神経外胚葉山来の固体形腫瘍があり、主 として肺に転移する。 腫瘍細胞（１０６のＪ６４５６細胞または５Ｘ１０’のＢ１６細胞）を、同系の （Ｃ５７ＢＬ／６またはＢａ１ｂ／ｃ）の雌のマウスの後足の筋肉内に接種した 。接種後２週間から３Ｉ間経過し、腫瘍が約０．５〜２ｇになった時に、下記の 表９に示すリポソーム組成物の一種をリン脂質が１μｆｆ１ｏ】　となる量を静 脈注射した。 成分のモル比は、同じ脂質成分の配合物と同じである。リポソームは、カプセル 化されたガリウム／デスフニラル複合体で上記の方法により調製され、主として ０．０７〜０．１２μｍの範囲のサイズを有する。サイズ調整されたＭＬＶであ った。 リポソーム投与後２４時間経過時点で、動物を完全に解剖した。表に示した数値 は、６′ガリウムのカウントに基き３組織の血液含有量について補正される。正 常な組織および腫瘍における血液含有量についての補正係数を２年令および性別 を一敗させ、ｕ瘍を有するマウスの＋＋Ｉアーオキシンで標識した赤血球の分布 を調べることにより算定した。比率は、各組織の１ｇにつき注射投与量の割合（ ％）を割算することによって得られた。全身平均とは１体重１ｇ当りの平均リポ ソーム取り込み量を示し、全身（ＩＩ！瘍を含む）で回収された注射投与量の％ 値を動物の体重で割り算することによって算出された。 表９のデータから分かるように、　Ｊ６４５６を注射されたマウスについて９　 インビボで長時間循環するよう選択されたリポソームを用いた場合、腫瘍の取り 込・み量が着実に（２５倍まで）増大することが認められた。注射投与量の約４ 〜６％という数値が、　ＧＭＩガングリオシド含有の配合物または飽和リン脂質 と組合わせた）ＩＰｌについて得られた。これらの値は、上記の方法により、ｍ 藻中の血液容積について補正した後に得たものである。遊離の６７ガリウム一デ スフエラル複合体を注射した際、Ｉ！瘍のマーカ取り込み量は、Ｉｇ当りの注射 投与量の０．１％より少なかった。表中の右側のデータは肝臓対腫瘍比が同時に 減少することを示し、リポソームが全身の組織中で非特異的に増大するのではな く、腫瘍中に選択的に蓄積することを示している。また（Ｊ、または）ＩＰＩ配 合物についても腫蕩対層体比が漸時高くなることが認められた（記載せず）。 表９ 沖射１ｊＬ　の７３ム（〆　Ｇ　（ＳＤ）ＰＧ：ＰＣ：Ｃ１Ｉ　Ｏ，２（０，０ ）　３６．４（６，３）　２．９（０，７）　０．１　１８２．ＯＰＧ：ＰＣ： ＣＨＯ，３２１，４２，３０，１７１，３（押出し処理せず） Ｂ１６を接種した動物の腫瘍の取込み量のデータから９表１０に示すように、同 様な結論が得られたが、リポソーム組成に関連した腫蕩取り込み量の増加は余り 顕著で二まない。 Ｃ以下余白） 表１０ Ｈ，５ｙｓｂ−（７＋１ｌＡ（Ｏｎ”＋　Ｇ　ＳＤ最小２乗法を用いて、データ の線形回帰分析を行い、統計上有意な相関関係がリポソームの血中レベルと腫瘍 取り込み量との間に存在するがどうかを決定した。第３図Ｂは、リポソームの血 中レベルと腫瘍取込み量との間に直接（正の）相関関係が、Ｂ６４５６接種の動 物（黒三角）と８１６接種の動物（黒丸）との両方にあることを示している。　 Ｊ６４５６接種動物についての相関係数はｒ＝０．８９およびＰ　＝０．０００ ５テｉ、　Ｂ１６接種動物についての相関係数はｒ　＝０．９１およびｐ　＝０ ．００４である。 亥１け インジウムで　したプレオマイシンのマウス　への亙込立 ＧＭ、＝ＤＳＰＣ：ＣＨ（１：１０：５）で構成され、カプセル化されたｌ　ｌ 　１１　ｎ−プレオマイシンを含をする。サイズを調整したＭＬＶを上記の方法 により調製した。リポソーム投与の１日前にｌ　Ｉ　ｌ　ｌｎをプレオマイシン リポソームの懸濁液に加えることによって、プレオマイシンを１’Ｉｎで標識し 、リポソーム中にカプセル化された。高親和力の１１１１ｎ−プレオマイシン複 合体を形成した。使用直前にこのリポソームを上記の方法により陰イオン交換樹 脂を通過させ、カプセル化されていないＩ　ｌ　ｌ　１０を除去した。 Ｊ６４５６リンパ腫またはＢ１６紺胞を接種したマウスに、リポソーム（１μｌ １１０１リン脂質／動物）または当量の遊離Ｉ　Ｉ　ｌ　ｌｎ−プレオマイシン を静脈注射した。投与後２４時間経過時の放射標識の組織への分布状態を上記の 方法により測定して、結果を表１１　（Ｊ６４５６を感染させた動物）および表 １２　（Ｂ１６を感染させた動物）に示した。表から分かるように、リポソーム の形に調製した薬物は、遊離の薬物よりも薬物量を１０〜３０倍増加させた。 表１１ 投与量の割合Ｃ”Ａ＞７ｇ組織 表１２ 投与量の割合（Ｘ）／組織 カプセル化されたｌ　ｌ　１１０−プレオマイシンを有する。サイズを調整した ＨＰＩ：ＤＳＰＣ：Ｃ１（１：１０：５）　ノリポソームを上記の方法により調 製し、上記の方法によりＪ６４５６腫瘍細胞を接種したマウスに静脈注射した。 マウスを、４．２４および４８時間経過した時点で殺し、腫瘍、血液および肝臓 の放射能レベルを測定し、結果を下記表１３に示した。標識の血中レベルは、４ 〜４８時間の試験期間に急速に低下した。肝臓と腫瘍については。 ２４時間経過した時点で最適のレベルが観察されたが、４時間および４８時間経 過時におけるレベルは比較的に高かった。 表１３ 投与量の割合（χ）／組織 Ｉ藷且■ Ｊ６５　マ　ス　へのドキソルビシンの　゛入下記表１４に示す三つの脂質組成 物の一つを有する。サイズを調整したＭＬＶを上記の方法により調製した。ドキ ソルビシンを、水和緩衝液に約５　ｇ　／　ｒｎｌの濃度まで添加し、遊離の薬 物をゲル濾過によって、サイズを調整したリポソームから除去した。 Ｊ６４５６リンバｌｌ細胞を接種したマウスに、　ＭＬＶ　（１μｍｏｌリン脂 質／動物）または当量の遊離のドキソルビシンを静脈注射した。注射後２４時間 経過時点での該薬物の組織への分布状態を、蛍光分析法で測定して結果を下記表 １３に示した。表１３から分かるように、腫瘍１ｇ当りの投与量の割合（％）と して示した該薬物の組織中のレベルは、２つのリポソーム組成物（ＰＧ：ＰＣ： ＣＨおよびＧＭ、、：ＰＧ：ＰＣ：ＣＭ　）に対する遊離の薬物に類似している が、これらの組成によって血液／ＲＥＳ比が有意に増大しない。一方、ｌｌ瘍藻 中薬物レベルは、最適の血液ＺＲＥＳ比を示すリポソーム（ＧＭ、：ＤＳＰＣ： Ｃ）！　）によって３〜６倍増大した。 表１４ 本発明のリポソームを調製および使用する特定の方法がここで説明されているが ９種々の異なる脂質組成物、薬物−リポソーム配合物およびリポソームによる治 療法が本発明の範回内で実施されうることは明らがである。 シ虹射　７女　の　時　閏 ＦＩＧ、　１ ；Ｌ＠２　Ｎｒ？−ワ’ｑｉｎＥ主入　リ・丁Ｓ゛たＡ　（４ｍ）月千　月１’ ｉ７’、Ｊし８卑　憐　ヘー　コ　ν入ｊ　ｔｙａ）殖射投キす（ゾ・）／峙″ 偽　（り） ＦＩＧ、　４Ａ Ｈ Ｒ−ＨＣ−Ｏｆ−１ ＵＬＦ 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．薬物を捕捉したリポソームを含有する組成物であって，次の特徴を有する組 成物： （３）リポソームのサイズが主として約０．０５〜０．５μであり，（ｂ）該リ ポソームは実質的に均一相の二重層を有し，該二重層は，主として飽和アシル鎖 を有するスフィンゴミエリンおよび中性リン脂質でなる群から選択される膜強化 性脂質を少なくとも約５０モル％の割合で含有し，そして，（ｃ）該二重層は、 約５〜２０モル％の糖脂質を含有し，該糖脂質は，ガンダリオシドＧＭ１，飽和 ホスファチジルイノシトールおよびガラクトセレプロシド硫酸エステルでなる群 から選択される。 ２．組織分布比により特徴づけられる請求の範囲第１項に記載の組成物であって ， 該組織分布比は，該組成物を被検体に静脈内投与した２時間後に測定したときに 得られる，静脈投与したリポソームの血液内における存在量を，投与されたリポ ソームの肝臓および脾臓における存在量の合計で割った値により示され，該組織 分布比は，同様にして形成された他のリポソーム組成物により得られる組織分布 比の合計よりも大きく，該他のリポソーム組成物のうちのひとつは，糖脂質以外 の膜強化性脂質を少なくとも約５０モル％の割合で含有し，他のものは，膜強化 性脂質ではない糖脂質を５〜２０モル％の割合で含有する。 ３．前記糖脂質がガンダリオシドＧＭ１である請求の範囲第１項に記載の組成物 。 ４．前記糖脂質が水素添加されたホスファチジルイノシトールである請求の範囲 第１項に記載の組成物。 ５．前記リポソームが主として０．０７〜０．０２μのサイズの範囲である請求 の範囲第１項に記載の組成物。 ６．前記膜強化性脂質がスフィンゴミエリンを包含する脳スフィンゴミエリンリ ポソームであり，そして該リポソームは，スフィンゴミエリンおよびホスファチ ジルコリンを２：１から４：１のモル比で含有する，請求の範囲第１項に記載の 組成物。 ７．前記膜強化性脂質が主として飽和アシル鎖を有するホスファチジルコリンで ある，請求の範囲第１項に記載の組成物。 ８．薬物がその内部に捕捉され，そのサイズが主として約０．０５〜０．５μで あるリポソームの懸濁液を静脈注射により投与する，薬物による治療法であって ；次のようなリポソームの調製を包含し，血流中におけるリポソームの寿命が長 い，方法： （３）実質的に均一相の二重層を有し，該二重層は，主として飽和アシル鎖を有 するスフィンゴミエリンおよび中性リン脂質でなる群から選択される膜強化性脂 質を少なくとも約５０モル％の割合で含有し，そして， （ｂ）該二重層は，約５〜２０モル％の糖脂質を含有し，該糖脂質は，ガンダリ オシドＧＭ１，飽和ホスファチジルイノシトールおよびガラクトセレプロシド硫 酸エステルでなる群から選択される。 ９．前記リポソームを静脈注射することにより得られる組織分布比が，同様にし て形成された他のリポソーム組成物により得られる組織分布比の合計よりも実質 的に大きい，請求の範囲第８項に記載の方法であって， 該組織分布比は，該組成物を被検体に静脈内投与した２時間後に測定したときに 得られる，血液中のリポソーム存在量を，投与されたリポソームの肝臓および脾 臓における存在量の合計で割った値により示され， 該同様にして形成された他のリポソーム組成物のうちのひとつは，糖脂質以外の 膜強化性脂質を少なくとも約５０モル％の割合で含有し，他のものは，膜強化性 脂質ではない糖脂質を５〜２０モル％の割合で含有する。 １０．前記糖脂質がガングリオシドＧＭ１である請求の範囲第８項に記載の方法 。 １１．前記糖脂質が水素添加されたホスファチジルイノシトールである請求の範 囲第８項に記載の方法。 １２．前記リポソームがスフィンゴミエリンおよびホスファチジルコリンを２： １から４：１のモル比で含有する，請求の範囲第８項に記載の方法。 １３．前記膜強化性脂質が主として飽和アシル鎖を有するホスファチジルコリン である，請求の範囲第８項に記載の方法。 １４．薬物による腫瘍の治療に用いられる請求の範囲第８項に記載の方法であっ て，腫瘍に供給された薬物量が，薬物の投与２４時間後に薬物／腫瘍重量により 算出すると，遊離型の薬物を投与したときよりも数倍高い，方法。 １５．前記リポソームに捕捉される薬物がブレオマイシンである請求の範囲第１ ４項に記載の方法。 １６．前記リポソームに捕捉される薬物がドキソルビシンである請求の範囲第１ ４項に記載の方法。 １７．リポソーム表面に腫瘍特異的結合分子を付加することによりリポソームを 腫瘍に対して標的化することを包含する，請求の範囲第１４項に記載の方法。