JPH06133780A - 新規なｔ−ＰＡ改変体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 プラスミンによる切断をうける以前には天然
ｔ−ＰＡと比較して活性が低下しているが、血栓付近で
プラスミンによる切断をうけることにより天然ｔ−ＰＡ
と同様又はそれ以上の活性を発揮するような、新規なｔ
−ＰＡ改変体を提供する。 【構成】 ｔ−ＰＡのＣ末端にプラスミンによる認識・
切断をうける配列の付加を持ち、さらにそのＣ末端側に
ペプチドが付加されたｔ−ＰＡ改変体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規な組織プラスミノ
ーゲン活性化因子（以下、ｔ−ＰＡ）の改変体に関す
る。更に詳しくは、ｔ−ＰＡのＣ末端にプラスミンによ
る認識・切断をうける配列を付加し、さらにそのＣ末端
側にペプチドを付加することにより、プラスミンによる
切断をうける以前にはプラスミノーゲン活性化活性が天
然ｔ−ＰＡより低下しているが、血栓付近でプラスミン
による切断をうけることにより天然ｔ−ＰＡと同様又は
それ以上の活性を発揮するような、新規なｔ−ＰＡ改変
体に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ｔ−ＰＡは、血漿中に存在する不活性型
酵素前駆体であるプラスミノーゲンを加水分解すること
によって活性型酵素であるプラスミンに変換する。プラ
スミンは、血管内に種々の原因によって生じたフィブリ
ン塊（血栓）を分解する（文献１）。ウロキナーゼやス
トレプトキナーゼなどの既存の血栓溶解剤がフィブリン
特異性を全く有していないのに対し、ｔ−ＰＡは比較的
高いフィブリン特異性を有している。このためフィブリ
ン、ひいては血栓を特異的に溶解するものとして注目さ
れてきた。しかしながら、実際ｔ−ＰＡを臨床に用いた
場合、閉塞冠動脈の再開通には予想されていたよりはる
かに多量の投与量が必要であることが明らかとなった
（文献２）。この大量投与の結果、ｔ−ＰＡのフィブリ
ン特異性の効果が薄れ、結局全身性の出血傾向という副
作用が生じてしまうことが今もって無視できない問題と
なっている。

【０００３】ｔ−ＰＡは、Ｎ末端から２７５番目のアル
ギニンと２７６番目のイソロイシンの間でプラスミンに
よる分解を受けて２本鎖に変換される。変換されたもの
のＮ末端側をＡ鎖、Ｃ末端側をＢ鎖と言う。ｔ−ＰＡの
活性中心は分子量の小さいＢ鎖に存在し、トリプシンな
どの他のセリン酵素と類似の構造を有する。一般的なセ
リン酵素の場合、１本鎖は前駆体であり酵素活性を持た
ないが、特定のペプチド結合が加水分解され、２本鎖と
なって初めて活性を有するとされている。しかしｔ−Ｐ
Ａの場合は２本鎖のみならず１本鎖のｔ−ＰＡも酵素活
性を有している（文献３、４、５）。よって１本鎖ｔ−
ＰＡを投与した場合、ｔ−ＰＡが血栓（『固相』）に到
達して血栓付近に局在しているプラスミンにより２本鎖
に変換される以前に、１本鎖ｔ−ＰＡが循環血中（『液
相』）の線溶系をも活性化してしまうため、これが全身
性の出血傾向という副作用を引き起こす一因となってい
ると考えられている。

【０００４】このような現状から『液相』では不活性型
で、血栓部位に到達した後に活性型となるような、いわ
ゆるプロドラッグ的なｔ−ＰＡの開発が試みられてい
る。例えば文献６、７では、ｔ−ＰＡは他のセリンプロ
テアーゼと異なり特定のアミノ酸間でｓａｌｔ−ｂｒｉ
ｄｇｉｎｇを起こしているがために１本鎖型でも活性を
持つと推測し、このような１本鎖状態でのｓａｌｔ−ｂ
ｒｉｄｇｉｎｇに関与するアミノ酸を置換することによ
って１本鎖型の活性を妨げるという試みがなされてい
る。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、ｔ−ＰＡの
Ｃ末端にプラスミンによる認識・切断をうける配列を付
加し、さらにそのＣ末端側にペプチドを付加することに
より、プラスミンによる切断を受ける以前、即ち１本鎖
の状態ではプラスミノーゲン活性化活性が天然ｔ−ＰＡ
より低下しているが、プラスミンによる切断を受けた
後、即ち２本鎖の状態では天然ｔ−ＰＡと同様又はそれ
以上の活性を発揮するために、結果として血栓部位にお
いて、言い換えればプラスミンの濃縮した環境（文献
８）下において高い活性を示すような、新規なｔ−ＰＡ
改変体を提供することを目的とする。本発明のｔ−ＰＡ
改変体は、１本鎖の状態でプラスミノーゲン活性化活性
が天然ｔ−ＰＡより低いので、天然ｔ−ＰＡを用いる際
の問題点であった大量投与に伴う副作用、すなわち全身
性の出血傾向を減じることが期待される。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは検討の結
果、ｔ−ＰＡのＣ末端にプラスミンによる認識・切断を
うける配列を付加し、さらにそのＣ末端側にペプチドを
付加することにより、１本鎖状態での活性が天然ｔ−Ｐ
Ａより低い新規なｔ−ＰＡ改変体が得られることを見出
した。さらにこのようなｔ−ＰＡ改変体は、プラスミン
による認識・切断を受けることによって天然のｔ−ＰＡ
と同様またはそれ以上の活性を示すことも見出した。

【０００７】即ち、本発明の要旨は、（１）ｔ−ＰＡの
Ｃ末端に、プラスミンによる認識・切断をうける配列の
付加を持ち、さらにそのＣ末端側にペプチドが付加され
ていることを特徴とするｔ−ＰＡ改変体、（２）前記
（１）記載のｔ−ＰＡ改変体をコードしている塩基配列
を含有するＤＮＡ、（３）形質転換された原核性生物細
胞または真核性生物細胞中において、前記（２）記載の
ＤＮＡを発現させ得る組み換え発現ベクター、（４）前
記（３）記載の組み換え発現ベクターで形質転換された
原核性生物細胞または真核性生物細胞、並びに（５）前
記（１）記載のｔ−ＰＡ改変体を有効成分として含有す
ることを特徴とする血栓治療剤に関する。

【０００８】本発明において「ｔ−ＰＡのＣ末端」とは
天然ｔ−ＰＡの５２７番目のプロリン残基を指す。ま
た、本発明において「プラスミンによる認識・切断をう
ける配列」とは、たとえばＧｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｉ
ｌｅ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号１）というア
ミノ酸の配列が考えられる。本発明において「プラスミ
ンによる認識・切断をうける配列のＣ末端側に付加され
るペプチド」とは、特に制限されない。しかしながらこ
のｔ−ＰＡ改変体は、血栓部位でプラスミンによる切断
を受けることにより付加したペプチドが遊離するため、
遊離したペプチドが何らかの抗凝固作用を有しているこ
とがより好ましいと考えられる。即ち、凝固因子である
トロンビンの活性を阻害するようなペプチド等を付加す
ることが好ましいと考えられる。この様なペプチドは、
遊離した後にトロンビンの活性を抑制することが予想さ
れるため、臨床上問題になっている再閉塞を改善しうる
ことが期待される。このようなペプチドの例としては、
具体的には、トロンボモジュリンのＥ４５６ドメインや
ヒルジンのＣ末端部分的配列またはその類似配列（配列
番号２、３）などが挙げられる。

【０００９】トロンボモジュリンは血管内皮細胞上に存
在する糖蛋白で、血中に生じたトロンビンと非常に高い
親和性で結合し、複合体を形成することでプロテインＣ
を抗凝固酵素に変換する速度を増大する。即ち、トロン
ボモジュリンはトロンビンを凝固酵素から抗凝固酵素へ
と変換させる作用を有する。ヒトのトロンボモジュリン
のｃＤＮＡが報告されており、化学構造図が提供されて
いる（文献９）。またトロンボモジュリンの機能部位の
解析により、システインに富むＥＧＦ様ドメインの６つ
の繰り返し配列のうち４番目から６番目の繰り返し配列
部分（Ｎ末端から３４５〜４６２位のアミノ酸配列部分
−以下Ｅ４５６ドメイン）にトロンビンと結合し、プロ
テインＣの活性化を有意に増大する機能が存在すること
が報告されている（文献１０、１１、１２、１３）。

【００１０】ヒルジンはヒル（Ｈｉｒｕｄｏ ｍｅｄｉ
ｃｉａｎａｌｉｓ）の頭部から精製された６５アミノ酸
からなるポリペプチドで、トロンビンに結合し、トロン
ビンのフィブリノーゲンをフィブリンに変換する活性を
阻害することが知られている（文献１４）。トロンビン
のフィブリノーゲン結合部位とヒルジンのＣ末端側が結
合することによってトロンビンの作用が阻害されるとい
われており、ヒルジンのＣ末端のアナログを複数合成
し、その性質を調べた実験の中で（文献１５、１６）、
配列番号４に示すようなわずか１２アミノ酸からなるＣ
末端ペプチドが有意な抗トロンビン作用を持つというこ
とが指摘されている。さらに、天然のヒルジンは、その
６３番目のアミノ酸であるチロシンがスルホン化されて
いるが、この修飾がないリコンビナントのヒルジンにも
トロンビン阻害活性があることが判っている（文献１
７）。

【００１１】本発明のｔ−ＰＡ改変体の調製は、ｔ−Ｐ
ＡのＣ末端にプラスミンによる認識・切断を受けるアミ
ノ酸配列を付加し、さらにそのＣ末端側に先述の様なペ
プチドを付加することにより行うことができる。具体的
には、例えばこれら付加すべきアミノ酸配列（プラスミ
ン認識配列及びペプチド）を天然ｔ−ＰＡのＣ末端直後
に挿入したような改変Ｃ末端アミノ酸配列をコードする
ｃＤＮＡ、あるいは合成オリゴヌクレオチドを天然ｔ−
ＰＡの相当配列と置き換え、適当な発現ベクターと連結
してこれを宿主内に導入し、本発明の最終目的物質であ
るｔ−ＰＡ改変体を発現・生産させることにより行うこ
とができる。

【００１２】本発明のｔ−ＰＡ改変体の製造には、通常
天然のｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡを用いることがで
きる。天然ｔ−ＰＡをコードするｃＤＮＡは、たとえば
ボーズ・メラノーマ細胞からのクローニングによって、
たとえば文献１８に記載されているようにすでに取得さ
れており、従ってそのｃＤＮＡ配列、アミノ酸配列も知
られている。また、天然ｔ−ＰＡを改変すべく例えば半
減期を長くした改変ｔ−ＰＡ（文献１９、２０等）のｃ
ＤＮＡ配列、アミノ酸配列も知られており、これらも用
いることができる。

【００１３】プラスミド中にクローニングしたｔ−ＰＡ
ｃＤＮＡの特定の配列を置換したり特定の部分に挿入を
行ったりする方法は、すでに自由に行える状況になって
おり、本発明においても常法によりｔ−ＰＡのＣ末端領
域にアミノ酸配列を挿入することができる。挿入の方法
としては、制限酵素のサイトを利用してｃＤＮＡ配列を
挿入する方法が便利である。挿入するｃＤＮＡ配列は挿
入に必要な制限酵素サイトを両端に有する合成ＤＮＡで
もよいし、ｃＤＮＡフラグメントの両端に挿入に必要な
制限酵素サイトを導入し、これを増幅したものでもよ
い。ＤＮＡの合成はホスホアミダイト法（文献２１）の
原理によるアプライドバイオシステムズ社のモデル３８
１ＡＤＮＡシンセサイザーを用いて行えばよい。さらに
精製は、同社のオリゴヌクレオチド精製用ＯＰＣカート
リッジを用いて行えばよい。挿入しようとする配列また
はその類似配列のｃＤＮＡが天然に存在している場合に
は、適当なオリゴヌクレオチドをプライマーに用いて増
幅したｃＤＮＡフラグメントを先述のように挿入に用い
ることも簡便な方法であろう。２種のプライマーで挟ま
れた領域の増幅方法としては、例えばポリメラーゼ・チ
ェイン・リアクション（ＰＣＲ）法が有効に用いられる
（文献２２）。即ち、２種のオリゴヌクレオチドをプラ
イマーに用い、ｃＤＮＡを鋳型にしてＴａｑポリメラー
ゼによるＤＮＡの増幅を行うもので、この操作を行うた
めには市販のＤＮＡ自動増幅装置が有効に用いられる。

【００１４】また、目的とする置換、あるいは挿入され
たＤＮＡ配列を確認するためには、ジデオキシ法（文献
２３）の原理を用い、例えばＰＣＲ法を利用したサイク
ルシークエンスの手法により行うことができる。それに
は、アプライドバイオシステムズ社のモデル３７３ＡＤ
ＮＡシークエンサーが有効に用いられる。その他、実施
例に記載されているような制限酵素によるＤＮＡの切
断、欠失、それらにより生じるＤＮＡ断片のポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動による分離、回収、あるいは連結
等の遺伝子操作は全て公知であり、主として文献２４が
参照される。

【００１５】このようにして得られたｔ−ＰＡ改変体を
コードするｃＤＮＡは、ＣＤＭ８（ｏｒｉ^- ）等、周知
のベクターに連結された後、適当な宿主に導入されるこ
とにより、本発明の最終目的物質であるｔ−ＰＡ改変体
タンパクを発現・生産することができる。宿主としての
大腸菌株や動物細胞株は、特に記載のない限り、既に広
く普及しており入手は容易であり、例えば動物細胞宿主
としては、ＣＯＳ−１，ＣＨＯ細胞が挙げられる。発現
プラスミドを用い適当な宿主を形質転換するには、電気
パルス法（文献２５）を用いればよい。形質転換された
細胞の培養上清は、適当な希釈によりそのまま種々の活
性測定に使用され得る程度のｔ−ＰＡ改変体を含んでい
る。

【００１６】この様にして得られた本発明のｔ−ＰＡ改
変体は、１本鎖の状態でのプラスミノーゲン活性化活性
が天然ｔ−ＰＡより低下しているが２本鎖の状態では天
然のｔ−ＰＡと同等の活性を示すので、天然のｔ−ＰＡ
に比べて全身性の出血傾向の減少した医薬組成物の有効
成分とすることができる。本発明のｔ−ＰＡ改変体は、
常法により容器に必要量分注し、凍結乾燥を行うことに
より製剤として極めて容易に得ることができる。この凍
結乾燥品は、製剤学的に容認されるキャリアー物質、例
えば生理食塩水に溶解し、静脈内または動脈または心臓
内への注射によって投与される。投与方法は、持続静注
あるいは投与予定量の一部を最初に静注し残りを持続静
注する等の方法で行われる。

【００１７】

【実施例】以下に、本発明の一例として実施例を示す
が、本発明はこれに限定されるものではない。

【００１８】１．ｔ−ＰＡのＣ末端領域にプラスミンに
よる認識・切断をうけると考えられる配列を有するプラ
スミドｐＵＣ−Ｄ０１の構築 本構築法の概念図を図１及び図２に示す。まず、文献２
６に記載のプラスミドｐＣＤＭ８−０００（Ｓａｌ⁺ ）
（文献２８記載のｔ−ＰＡ発現プラスミドｐＣＤＭ８−
０００のｔ−ＰＡｃＤＮＡ配列上の翻訳終始コドンの下
流１０塩基目〜１５塩基目にＳａｌＩサイトを導入した
もの）をＳｍａＩおよびＳａｌＩで消化し、５５塩基長
のフラグメントＳＳをポリアクリルアミドゲル電気泳動
にて精製・分離し、これとプラスミドｐＵＣ１１８（宝
酒造株式会社製）をＳｍａＩおよびＳａｌＩで消化しと
ものとをライゲートさせ、大腸菌ＪＭ１０９株（東洋紡
績株式会社製）を形質転換して、プラスミドｐＵＣＳＳ
を得た。次に、このプラスミドをＥｃｏＴ１４Ｉで消化
し、クレノウフラグメントで末端を平滑化した後、セル
フライゲーションを行うことにより、プラスミドｐＵＣ
ＳＳ（ＥＴ^- ）を得た（図１）。

【００１９】一方、６種類のオリゴヌクレオチドＤＣ
（配列番号５）、ＤＣＲ（配列番号６）、Ｄ０（配列番
号７）、Ｄ０Ｒ（配列番号８）、ＩＫＧＧ（配列番号
９）、およびＩＫＧＧＲ（配列番号１０）を合成した。
これらオリゴヌクレオチドの合成にはアプライドバイオ
システムズ社製 381A 型ＤＮＡ合成装置を用い、その精
製は同社のＯＰＣカートリッジを用いて行った。ＤＣと
ＤＣＲ、Ｄ０とＤ０Ｒ、およびＩＫＧＧとＩＫＧＧＲを
等モルずつ混合し、アニーリングさせることによりそれ
ぞれ二本鎖化した。次に、これら３種類の二本鎖ＤＮＡ
をＤＮＡライゲースによりライゲート（連結）し、フラ
グメントＡを得た。その後このフラグメントＡをＤＣお
よびＩＫＧＧＲをプライマーに用いてＰＣＲ反応により
増幅した。この増幅フラグメントＡをＢｓｔＥＩＩおよ
びＳａｌＩで消化し、８２塩基長のフラグメントＢＳを
ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて標準的な方法で精
製・分離した（図２）。このフラグメントＢＳと、先の
プラスミドｐＵＣＳＳ（ＥＴ^- ）をＢｓｔＥＩＩおよび
ＳａｌＩで消化したものとをライゲートさせ、これで大
腸菌ＪＭ１０９株を形質転換してプラスミドｐＵＣ−Ｄ
０Ｉを得た（図２）。

【００２０】２．ヒルジンのＣ末端類似配列をコードす
るＤＮＡフラグメントＨＳおよびＨＬの作製 ヒルジンのＣ末端類似配列をコードし、その両端にＥｃ
ｏＴ１４Ｉとの対合末端を有しているような２種のフラ
グメントＤＮＡ、フラグメントＨＳおよびフラグメント
ＨＬを作製した。フラグメントＨＳは配列番号２に示す
ようなアミノ酸をコードしている。これは全長が６５ア
ミノ酸から成るヒルジンの（Ｎ末端より）５４番目から
６４番目のアミノ酸配列のＮ末側にＬｅｕ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｎの配列が付加したようなペプチドをコードする。ま
た、フラグメントＨＬは配列番号３に示すようなアミノ
酸をコードするが、これはヒルジンの４２番目からＣ末
端（６５番目）までのアミノ酸配列のＮ末側にＬｅｕが
付加したようなペプチドをコードする。具体的にはオリ
ゴヌクレオチドを合成し、それらをアニールさせること
によって上述の２本鎖フラグメントＨＳおよびフラグメ
ントＨＬを作製した。合成したオリゴヌクレオチドはＰ
−ＨＳＭ（配列番号１１）、Ｐ−ＨＳＲ（配列番号１
２）、Ｐ−ＨＬＭ（配列番号１３）、およびＰ−ＨＬＲ
（配列番号１４）である。

【００２１】合成オリゴヌクレオチドＰ−ＨＳＭとＰ−
ＨＳＲ、Ｐ−ＨＬＲとＰ−ＨＬＲの組み合わせでアニー
リングさせ、フラグメントＨＳおよびフラグメントＨＬ
を得た。アニーリングは合成オリゴヌクレオチドをそれ
ぞれ７７．７ｎｇずつ混合し、これを水で７μｌにした
ものを６５℃で３０分処理したのち、約１時間かけて常
温（２５℃）に戻すことにより行った。この混合液にリ
ン酸化緩衝液〔Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．６）０．６
６Ｍ、ＡＴＰ１０ｍＭ、ｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ１０ｍ
Ｍ、ＭｇＣｌ₂ ０．１Ｍ、ＤＴＴ１５０ｍＭ、ｇｅｌａ
ｔｉｎ２ｍｇ／ｍｌ〕を１μｌおよびＴ４ ＤＮＡ ｋ
ｉｎａｓｅを２μｌ（２ｕｎｉｔｅｓ）添加し、３７℃
で１時間反応して末端をリン酸化したものをフラグメン
トＨＳおよびフラグメントＨＬとして以降の実験に使用
した。

【００２２】３．Ｃ末端にペプチドの付加を持つような
ｔ−ＰＡｃＤＮＡの一部分を有するプラスミドｐＵＣ−
ＣＴＭ、ｐＵＣ−ＣＨＳ、およびｐＵＣ−ＣＨＬの構築 ｔ−ＰＡのＣ末端にプラスミンによる認識・切断を受け
ると考えられる配列を持ち、さらにそのＣ末端側にＥ４
５６ドメインのアミノ酸配列または先述のヒルジンＣ末
端領域類似アミノ酸配列が付加されたｔ−ＰＡｃＤＮＡ
の一部分を有するプラスミドの構築を行った。これには
フラグメントＳＥ（文献２７）、先述のフラグメントＨ
ＳおよびフラグメントＨＬを、既述のプラスミドｐＵＣ
−Ｄ０１中に存在するＥｃｏＴ１４Ｉ制限サイトを利用
してｐＵＣ−Ｄ０１中のプラスミン認識・切断推定配列
の下流に挿入することにより行った。フラグメントＳＥ
は、トロンボモジュリンのＥ４５６ドメインのアミノ酸
配列をコードし、その遺伝子上流側末端にＳｐｅＩ、遺
伝子下流側末端にＥｃｏＴ１４Ｉの対合末端を有してい
るような、ＰＣＲ増幅２本鎖ＤＮＡフラグメントのＳｐ
ｅＩとＥｃｏＴ１４Ｉの消化物である。プラスミドｐＵ
Ｃ−ＣＴＭ、ｐＵＣ−ＣＨＳ、およびｐＵＣ−ＣＨＬ構
築の概念図を図３に示す。

【００２３】まず、前記プラスミドｐＵＣ−Ｄ０１をＥ
ｃｏＴ１４Ｉで消化したのちに５’末端を脱リン酸化し
た。フラグメントＳＥ、ＨＳ、およびＨＬはそれぞれ、
ｐＵＣ−Ｄ０１のＥｃｏＴ１４Ｉサイトと対合する末端
を両端に持つ（ＳｐｅＩとＥｃｏＴ１４Ｉの末端は対合
する）ので、プラスミドｐＵＣ−Ｄ０１のＥｃｏＴ１４
Ｉ消化物とフラグメントＳＥ、ＨＳ、およびＨＬとをそ
れぞれライゲートさせ、これで大腸菌ＪＭ１０９株を形
質転換させた。ｔ−ＰＡｃＤＮＡと同様の向きに各フラ
グメントが挿入されたことを確かめ、これらをそれぞれ
プラスミドｐＵＣ−ＣＴＭ（フラグメントＳＥを挿入し
たもの）、ｐＵＣ−ＣＨＳ、およびｐＵＣ−ＣＨＬと名
付けた（図３）。

【００２４】４．改変Ｃ末端領域を含むｔ−ＰＡをコー
ドする発現プラスミドｐＣＤＭ８−ＣＴＭ、ｐＣＤＭ８
−ＣＨＳ、およびｐＣＤＭ８−ＣＨＬの構築 ｔ−ＰＡの翻訳領域をすべて含む発現プラスミドｐＣＤ
Ｍ８−０００（Ｓａｌ⁺ ）は、文献２８に記載のｔ−Ｐ
Ａ発現プラスミドｐＣＤＭ８−０００のｔ−ＰＡｃＤＮ
Ａ配列上の翻訳終止コドン（ＴＧＡ）の下流１０塩基目
〜１５塩基目（ＣＣＣＧＡＣ）にＳａｌＩサイトを導入
したものである（文献２６）。このｐＣＤＭ８−０００
（Ｓａｌ⁺ ）を用いて改変Ｃ末端領域を含むｔ−ＰＡを
コードする発現プラスミドｐＣＤＭ８−ＣＴＭ、ｐＣＤ
Ｍ８−ＣＨＳ、およびｐＣＤＭ８−ＣＨＬの構築を行っ
た。ｐＵＣ−ＣＴＭ、ｐＵＣ−ＣＨＳ、およびｐＵＣ−
ＣＨＬの、Ｃ末端への挿入部分以外の領域は全く同じ構
成であるので、以下の操作はこれらの３種類の構築につ
いて同じように行うことができる。その構築の例として
ｐＣＤＭ８−ＣＴＭの構築法の概念図を図４に示す。

【００２５】まず、プラスミドｐＣＤＭ８−０００（Ｓ
ａｌ⁺ ）をＢｓｔＥＩＩおよびＳａｌＩで消化し、５’
末端を脱リン酸化した。一方、前記プラスミドｐＵＣ−
ＣＴＭ、ｐＵＣ−ＣＨＳ、およびｐＵＣ−ＣＨＬをＢｓ
ｔＥＩＩおよびＳａｌＩで消化したのちにｔ−ＰＡｃＤ
ＮＡの改変Ｃ末端領域を含むＢｓｔＥＩＩ／ＳａｌＩ断
片をポリアクリルアミドゲル電気泳動にて精製・分離し
た。プラスミドｐＣＤＭ８−０００（Ｓａｌ⁺ ）のＢｓ
ｔＥＩＩ／ＳａｌＩ消化物と、ｐＵＣ−ＣＴＭ、ｐＵＣ
−ＣＨＳ、およびｐＵＣ−ＣＨＬのＢｓｔＥＩＩ／Ｓａ
ｌＩ消化断片とをそれぞれライゲートさせ、これで大腸
菌ＭＣ１０６１／ｐ３株（フナコシ薬品株式会社製）を
形質転換させて改変Ｃ末端領域を含むｔ−ＰＡをコード
する発現プラスミドｐＣＤＭ８−ＣＴＭ、ｐＣＤＭ８−
ＣＨＳ、およびｐＣＤＭ８−ＣＨＬを得た（図４）。こ
れら３種のプラスミドは、ｔ−ＰＡ構造遺伝子全領域を
含み、ｔ−ＰＡのＣ末端にそれぞれプラスミンの認識・
切断推定アミノ酸配列Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ
−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙと、さらにその後ろにＥ４５
６ドメインの配列または配列番号２または３に示される
ヒルジン類似アミノ酸配列が付加されている。

【００２６】５．本発明の血栓溶解タンパク質のＣＯＳ
−１細胞内での発現および分泌 コントロールとしての天然ｔ−ＰＡを発現するｐＣＤＭ
８−０００（Ｓａｌ⁺）、およびｐＣＤＭ８−ＣＴＭ、
ｐＣＤＭ８−ＣＨＳ、及びｐＣＤＭ８−ＣＨＬを用いて
既述の電気パルス法によりＣＯＳ−１細胞を形質転換し
た。牛胎児血清１０％およびアプロチニン１０μｇ／ｍ
ｌを含有するＤＭＥＭ培地で２４時間培養後、培地を無
血清かつアプロチニン無含有ＤＭＥＭ培地に交換し、さ
らに９６時間培養を継続した。培養液を遠心後その上清
を回収し、これに１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）含有
ＤＭＥＭ培地を１／９量添加し、凍結保存した。この凍
結保存上清をｔ−ＰＡ試料と称し、以後の評価に用い
た。

【００２７】６．蛋白量の定量 前記の各培養上清中のｔ−ＰＡ試料の蛋白量は、市販の
キット（バイオプール社製）を用いた酵素免疫測定法
（ＥＬＩＳＡ）により測定された。

【００２８】７．測定（アッセイ）法 本発明の血栓溶解タンパク質のプラスミノーゲン活性化
活性は、合成発色基質Ｓ−２２５１を用いたインダイレ
クトクロモゲニックアッセイ（文献２９）に基づきプラ
スミンに特異的なカビ（Ｋａｂｉ）社製の合成トリペプ
チド色素原基質Ｓ−２２５１（Ｈ−Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ−ｐＮＡ・２ＨＣｌ・Ｈ₂ Ｏ）を用いて以下の
方法で定量的に測定した。また、上記実施例５．で得ら
れたｔ−ＰＡ試料は、１本鎖型ｔ−ＰＡとして存在して
いる。２本鎖活性の測定には以下の方法で２本鎖化した
２本鎖型ｔ−ＰＡ試料を使用して行った。すなわち、各
種１本鎖型ｔ−ＰＡ試料（最終５０ｎｇ／ｍｌ）を１０
ｎＭプラスミン存在下で３７℃にて３０分インキュベー
トしたものを２本鎖型ｔ−ＰＡ試料として以下に使用し
た。

【００２９】５０ｎｇ／ｍｌに希釈した、各改変体の１
本鎖型および２本鎖型ｔ−ＰＡ試料２０μｌを２００μ
ｌの反応混合液〔プラスミノーゲン１２５ｎＭ、Ｓ−２
２５１ ３５０μＭ、フィブリンフラグメント０．３ｍ
ｇ／ｍｌ、Ｔｗｅｅｎ８００．１％、Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ
（ｐＨ７．８）０．１５Ｍ、およびゼラチン５ｍｇ／ｍ
ｌ〕と混合し、３７℃でインキュベートし、プレートリ
ーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅ社製）を用
いて経時的に４０５ｎｍにおける吸光を測定した。同社
の解析ソフトウェア、ソフトマックスを用いてデータ処
理を行い、一定蛋白量当たりの活性を決定した。その結
果を表１に示す。

【表１】

【００３０】文献 １）欧州特許出願公開 No.0041766 A2 ２）The TIMI study group: N. Engl. J. Med., 320, 6
18, 1989. ３）D.C. Rijiken et al.: J. Biol. Chem., 256, 703
5, 1981. ４）M. Ranby et al.: Thromb. Res., 27, 175, 1982. ５）L. Haggroth et al.: Thromb. Res., 42, 585, 198
6. ６）P. Wallen et al.: Eur. J. Biochem., 132, 681,
1983 ７）欧州特許出願公開 No.89307194.4 ８）B. Wiman et al.: Nature, 272, 549, 1978. ９）K. Suzuki et al.: EMBO J., 6, 1891, 1987. １０）C.T. Esmon et al.: J. Biol. Chem., 6, 3352,
1989. １１）特開平2-19399 号広報 １２）M. Zushi et al.: J. Biol. Chem., 26, 10351,
1989. １３）特開平2-255699号広報 １４）F. Markwardt: Method Enzymol., 19, 924, 197
0. １５）J.M. Maraganore et al.; J. Biol. Chem., 264,
8682, 1989. １６）J.A. Jakubowski et al.: Blood, 72, 326A, 198
8(abstr). １７）E. Degryse et al.: Protein Eng., 2, 459, 198
9. １８）Pennica et al.: Nature, 301, 214, 1983. １９）特表昭 63-501335号 ２０）S. Yoshitake et al.: Thromb. Haemostasis, 6
2, 542, 1982. ２１）S.L. Beaucage et al.: Tetrahedron Letters-22
(20), 1859, 1981. ２２）H.A. Erlich et al.: PCR Technology, 1990. ２３）F. Sanger et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. US
A, 74, 5463, 1977. ２４）T. Maniatis et al.: Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. 198
2 ２５）高山伸一郎、細胞工学 6, 771, 1987. ２６）特願平4-125595号 ２７）特願平3-29624 号 ２８）特願平2-87005 号 ２９）J.H. Verheijen et al.: Thromb. Haemostasis,
48(3), 266, 1982.

【００３１】

【配列表】

配列番号：1 (プラスミン認識配列） 配列の長さ：7 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Gln Phe Arg Ile Lys Gly Gly

【００３２】 配列番号：2 （フラグメントHSのコードする配列） 配列の長さ：14 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Gly Asn Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu

【００３３】 配列番号：3 （フラグメントHLのコードする配列） 配列の長さ：25 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Leu Gly Glu Gly Thr Pro Lys Pro Gln Ser His Asn Asp Gly Asp Phe Glu Glu Ile Pro Glu Glu Tyr Leu Gln

【００３４】配列番号：4 配列の長さ：12 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列

【化１】

【００３５】配列番号：5 （オリゴヌクレオチドDC） 配列の長さ：15 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：No 配列 AAGGTTACCA ACTAC 15

【００３６】配列番号：6 （オリゴヌクレオチドDCR ） 配列の長さ：21 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：Yes 配列 GTCTAGGTAG TTGGTAACCT T 21

【００３７】配列番号：7 （オリゴヌクレオチドD0) 配列の長さ：39 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：No 配列 CTAGACTGGA TTCGTGACAA CATGCGACCG CAGTTTCGC 39

【００３８】 配列番号：8 （オリゴヌクレオチドD0R ） 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：Yes 配列 CGGTCGCATG TTGTCACGAA TCCA 24

【００３９】 配列番号：9 （オリゴヌクレオチドIKGG） 配列の長さ：38 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：No 配列 ATCAAAGGAG GCCTAGGATG ACCAGGAACA GTCGACTC 38

【００４０】 配列番号：10（オリゴヌクレオチドIKGGR ） 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：Yes 配列 GAGTCGACTG TTCCTGGTCA TCCTAGGCCT CCTTTGATGC GAAACTG 47

【００４１】配列番号：11（プライマーP-HSM ） 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：No 配列 CTA GGC AAC GGC GAT TTC GAA GAA ATT CCA GAA GAA TAT CTA TAG C 46

【００４２】配列番号：12（プライマーP-HSR ） 配列の長さ：46 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：Yes 配列 CTAGG CTA TAG ATA TTC TTC TGG AAT TTC TTC GAA ATC GCC GTT GC 46

【００４３】配列番号：13（プライマーP-HLM ） 配列の長さ：79 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：No 配列 CTA GGA GAA GGA ACA CCA AAA CCA CAA TCA CAC AAC GAT GGA GAT TTC 48 GAA GAA ATT CCA GAA GAA TAT TTA CAA TAG C 79

【００４４】配列番号：14（プライマーP-HLR ） 配列の長さ：79 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA アンチセンス：Yes 配列 CTAGG CTA TTG TAA ATA TTC TTC TGG AAT TTC TTC GAA ATC TCC ATC GTT 50 GTG TGA TTG TGG TTT TGG TGT TCC TTC TC 79

【図面の簡単な説明】

【図１】ｔ−ＰＡのＣ末端領域に、プラスミンによる認
識・切断をうけると考えられる配列を有するプラスミド
ｐＵＣ−Ｄ０１の組立模式図の一部を示す。

【図２】ｔ−ＰＡのＣ末端領域に、プラスミンによる認
識・切断をうけると考えられる配列を有するプラスミド
ｐＵＣ−Ｄ０１の組立模式図の一部を示す。

【図３】ｔ−ＰＡのＣ末端にペプチドの付加を持つよう
なプラスミドｐＵＣ−ＣＴＭ、ｐＵＣ−ＣＨＳ、ｐＵＣ
−ＣＨＬの組立模式図を示す。

【図４】発現プラスミドｐＣＤＭ８−ＣＴＭの組立模式
図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 組織プラスミノーゲン活性化因子のＣ末
   端に、プラスミンによる認識・切断をうける配列の付加
   を持ち、さらにそのＣ末端側にペプチドが付加されてい
   ることを特徴とするｔ−ＰＡ改変体。
2. 【請求項２】 Ｃ末端に付加されるペプチドが１５０ア
   ミノ酸残基以下からなるポリペプチドであるような、請
   求項１記載のｔ−ＰＡ改変体。
3. 【請求項３】 Ｃ末端に付加されるペプチドがトロンビ
   ン活性を抑制することが知られている配列を有している
   ような、請求項２記載のｔ−ＰＡ改変体。
4. 【請求項４】 Ｃ末端に付加されるペプチドがトロンボ
   モジュリンのＥ４５６ドメイン、またはヒルジンのＣ末
   端部分的配列またはその類似配列であるような、請求項
   ３記載のｔ−ＰＡ改変体。
5. 【請求項５】 請求項１〜請求項４のいずれかに記載の
   ｔ−ＰＡ改変体をコードしている塩基配列を含有するＤ
   ＮＡ。
6. 【請求項６】 形質転換された原核性生物細胞または真
   核性生物細胞中において、請求項５記載のＤＮＡを発現
   させ得る組み換え発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の組み換え発現ベクターで
   形質転換された原核性生物細胞または真核性生物細胞。
8. 【請求項８】 請求項１〜請求項４のいずれかに記載の
   ｔ−ＰＡ改変体を有効成分として含有することを特徴と
   する血栓症治療剤。