JPH06502302A - 細胞増殖阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞増殖阻害剤 本発明はβ−ガラクトシド結合蛋白として知られる蛋白ならびに細胞増殖を抑止 し調節しあるいはそれ以外の方法で影響を与えるためのその利用に関するもので ある。

細胞表面上の特異的な糖に結合する能力のある蛋白は多年にわたり知られている 。従来知られている糖結合蛋白は一般名「レクチン」という名で通常称されてい る。レクチンは特定の糖残基に対し特異性のある炭水化物結合蛋白として定義さ れ、結合に関して２価あるいは多価であり、少なくとも単量体の場合には２価で ある（バロンデス、エイチ（Ｂａｒｏｎｄｅｓ、Ｈ）　、サイエンス（Ｓｃｉｅ ｎｃｅ）　２２３゜１２５９−１２６４　（１９８４））。多価性のためにレク チンが赤血球の凝集を引き起こすこと、すなわちそれらが赤血球凝集素であり、 細胞表面の糖に対する親和性のために他の細胞の凝集を引き起こしうることがレ クチンをさらに性格づける特徴となっている。また２価性あるいは多価性に関連 する架橋をするという性質によりレクチンは細胞増殖を阻害しつる。しかしなが らそれらの効果は無差別的で生理学的に不可逆であり、それらは高い毒性を有し ている。

レクチンのとくによく知られた例は植物蛋白コンカナバリンＡおよびフィトヘマ グルチニンである。さらに最近になって、を椎動物および枯菌を含む他の生物に おいて糖結合蛋白が同定されている。この分類におけるを椎動物の蛋白が例えば 以下の文献に記載され特徴づけられている。

−バロンデス、エイチ（Ｂａｒｏｎｄｅｓ、　Ｈ，）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ ｅ）　２２３．　１２５９一オオヤマ、ワイ（Ｏｈｙａｍａ、　Ｙ、　）　、ヒ ラバヤシ、ジェイ（［１ｉｒａｂａｙａｓｈｉ、　Ｊ、　）　、オダ、ワイ（Ｏ ｄａ、　Ｙ。）、オーツ、ニス（Ｏｈｎｏ、　Ｓ、　）　、　カワサキ、エイチ （Ｋａｗａｓａｋｉ。

１（、）、スズキ、ケイ（Ｓｕｚｕｋｉ、　Ｋ、　）およびカサイ、ケイ（Ｋａ ｓａｉ、　Ｋ、　）バイオヶム・バイオフィズ・レス・コム（Ｂｉｏｃｅｍ、　 Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｌｌｌ１１．　）　１３４　、　５１一すザ ン、ン−（Ｓｏｕｔｈａｎ、Ｃ，）　、エイトケン、エイ（Ａｉｔｋｅｎ、＾、 ）、チルズ、アールズ・エイ（Ｃｈｉｌｌｓ、　Ｒ，＾、）、アボット、ダブリ ュ’ｙ　・エム（Ａｂｂｏｔ、　ｆ、　Ｍ、　）−ヒラバヤシ、ジェイ（Ｈｉｒ ａｂａｙａｓｈｉ、　Ｊ、　）　、　カサイ、ケイ（Ｋａｓａｉ、　Ｋ、　）ジ ャーナル・オブ・バイオケミストリー（東京）　（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｏｋｙｏ）　）１す４，１−４　（１９８８） 一クラーク、エル・ビー（Ｃ１ｅｒｃｈ、　Ｌ、　Ｂ、　）　、ポイットニー、 ビー（ｆｈｉｔｎｅｙ、Ｐ）　。

ハース、エム（Ｂａｓｓ、　Ｍ、　）　、　プリュー、ケイ（Ｂｒｅｗ、　Ｋ、 　）　、ミラー、ティー（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｔ、　）　、ウニルナ−、アールＣ ｗｅｒｎｅｒ、　Ｒ，）およびマサ口、ディー−クーラウンド、ビー・オー（Ｃ ｏｕｒａｕｎｄ、　Ｐ、　０．　）　、　カサンチーニーポロス、ディー　（Ｃ ａｓａｎｔｉｎｉ−Ｂｏｒｏｃｚ、Ｄ）　、プリンガム、ティー・ニス（Ｂｒｉ ｎｇｈａａ＋、　Ｔ、　Ｓ、　）　。

グリフイス、ジェイ（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ、Ｊ、）　、　？クグローガン、エム、 （ＭａｃＧｒｏｇａｎ、Ｍ）およびネトウィン、ジー・イー（Ｎｅｄｖｉｎ、　 Ｊ、　Ｅ、　）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎ ａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２旦４．１３１〜 アボット、ダブリユウ・エム（Ａｂｂｏｔ、ｆ、　Ｍ、　）およびフェイジ、テ ィー（Ｆｅｉｚｉ。

Ｔ、）バイオケム・ジャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　）２５９．２９１− ２９４　（１９８β−ガラクトシドが糖であるため、β−ガラクトンド結合蛋白 がレクチンであることの判断基準を満たすことは上記のレクチンの定義から明ら かであろう。そしてすべてのβ−ガラクトンド結合蛋白が実際にはレクチンであ ったということが従来理解されていた。このことが実際にはそうではないという ことが、本発明者らにより本明細書中に記載されている。

植物レクチンはリンパ球の活性化を引き起こすことが知られている。ＥＰ−Ａ− ０３３７２９９もまた、例えば重症筋無力症およびリウマチ様関節炎のような免 疫系の欠損を含む疾病の治療において種々のを椎動物起源のレクチンの利用につ いて記載している。糖尿病および多発性硬化症についての有益な効果もまた示唆 されている。

ＥＰ−Ａ−０２６０４９７においてサルコフ７−ガ・ベレグリナ（Ｓａｒｃｏｐ ｈａｇａｐｅｒｅｇｒｉｎａ）　（内規）の細胞系から単離された「レクチン様 」蛋白が記ｒＬすれており、それは血球凝集素として作用し、ネスミの腫瘍の成 長を抑制する効果を有する。

しかしながら前記出願齋類のクレームは用いられた蛋白のレクチンとしての性質 に基づくものである。本発明者らは、細胞増殖抑制性のある新しくて改良された 試薬を検索するうちに、正常および癌細胞の増殖を阻害あるいは抑止する能力の ある新しい細胞増殖抑制性のある蛋白を単離し精製し性質を調べたが、本蛋白は マウス胚繊維芽細胞により生産されレクチンの性質の判断基準を満たさない。

本蛋白のアミノ酸配列を決定し、文献およびデータベースを用いて単離蛋白の配 列を他の公知蛋白の配列と比較することにより、その阻害剤がβ−ガラクトンド 結合蛋白（ＧＢＰ）であることが確認された。このことはｃＤＮＡクローニング および組換え型の本蛋白の発現により確認された。

本発明者らは、さらに、単量体でかつ糖結合部位に関して１価であるかまたはグ リカン複合体で覆われているため利用可能な糖結合部位を有していないという理 由で、本蛋白は分類上の定義に従えはレクチンとは言えないことを見い出した。

従って本蛋白は血球あるいは他の細胞を凝集させる能力がない。そのうえ本蛋白 はレクチンに関して報告されているよう２価体として存在しないのではなく、む しろ本来的に１価の単量体として存在する。言い換えると本蛋白は４つのβ−ガ ラクトノド結合部位が内部にある４価体を形成でき、それゆえ、グルカン複合体 が当該分子と会合しない場合でさえ、細胞凝集を引き起こすことができな（なる 。そのうえ細胞増殖抑制効果は糖結合部位を通じて作用するのではなく、特異的 細胞表面受容体に高い特異的親和性をもって結合するドメインを通じて作用する 。

本明細書に記載の本発明は上述の発見に基づ（ものであり、またマウス胚繊維芽 細胞からの細胞増殖抑制性であり非凝集性であるＧＢＰがヒトの癌細胞の増殖に 対して抑制効果を有するというさらなる発見に基づ（ものでもある。それゆえ本 発明は、これらの発見の具体化、すなわち、天然の動物由来であれ組換えＤＮＡ 工学により生産されるものであれ、細胞増殖の阻害剤および調節剤ならびに治療 薬として前記特性を有する非凝集性のＧＢＰに指向される。この新しい細胞増殖 阻害蛋白はマウスの組織から単離されたが、同じ性質を有する等価の蛋白が他の 種から嵐離され得ることが期待される。

かくして本発明によりを椎動物細胞の増殖阻害剤として用いられる動物由来の非 凝集性のβ−ガラクトシド結合蛋白（ＧＢＰ）が提供される。

本明細書中、β−ガラクトシド結合蛋白なる語は天然型の蛋白のアミノ酸配列か あるいは目的細胞の特異的な細胞表面受容体に結合する能力のあるドメインまた はドメイン類を有するようにいくらか修飾されたアミノ酸配列を有する物質を意 味することが理解されるべきである。かかる修飾蛋白は付加されまたは除去され たアミノ酸を有するかあるいはその増殖阻害効果に影響しないアミノ酸の置換を 有する蛋白を包含する。

そのうえ、本明細書に用いられる語として、非凝集性なる語は、本来の形態では 糖と結合するため親和性を有するが、その糖結合親和性の直接の結果としての細 胞凝集を引き起こすことのできない蛋白を表す。従っていくつかの他の生化学的 メカニズムにより凝集を引き起こすＧＢＰの能力が除外されることはない。

好ましくは本発明で使用するＧＢＰはを椎動物由来のものとするが、他種由来の ＧＢＰを除（ものではない。

好ましくは細胞は形質転換細胞とし、より好ましくはヒト由来の形質転換細胞と する。「形質転換細胞」なる語はその定義において癌細胞や悪性細胞のすべての 形態と、癌性のみならず前癌性、形質転換前、過形成および不規則な細胞のすべ ての形態ならびに細胞分化の望まない形態の細胞を包含する。特にヒトあるいは 動物由来の組換え型ＧＢＰはヒトの悪性疾病の治療における治療薬として利用さ れつる。好ましくはかかる用途のＧＢＰは、ヒトかマウスのいずれかの起源のＧ ＢＰのアミノ酸配列を有するか含むとするが、他の種由来のアミノ酸配列を除外 するものではない。天然型のマウスおよびヒトのＧＢＰは共に１３４個のアミノ 酸からなり、８９％の相同性を有する。交差種効果が存在すること、すなわちマ ウスのＧＢＰがヒトの癌細胞の増殖を阻害することが本出願人によって明確に示 された。したがってヒトかマウスのいずれかのみならず他種由来のＧＢＰもヒト あるいは他の動物種における治療薬として利用できる。高度なアミノ酸配列の相 同性がヒトの非凝集性β−ガラクトシド結合蛋白と他種のＧＢＰとの間で示され たので、他種由来のＧＢＰもまたヒト細胞の増殖を阻害する効果を有することが 期待されうる。したがって、かかる他のＧＢＰは本発明の範囲内のものである。

これらの蛋白が６０期の細胞を維持し、細胞周期の６２期を通過することを阻止 あるいはその機会を減少させ、このため有糸分裂に入ることを妨げるという効果 を有するということが、本明細書中で組換え型のマウスＧＢＰに関してさらに開 示されている。本蛋白のかかる特殊な性質は、再び増殖することを妨げられてい る６０期の悪性細胞に対する治療の観点から特に有利となり得る。

そのうえ、蛋白が治療的に投与された場合、体液中あるいは組織中細抱の凝集は もちろん望ましくないという理由で、これらのＧＢＰの非凝集性の性質はそれら を治療薬として適したものにしている。

本発明で用いるＧＢＰはβ−ガラクトシド結合部位に関して単量体かつ１価であ ってよいが、好ましくは覆われ修飾されあるいは全て除去された単一の糖の結合 手に対して単量体である。それらは多量体であってもよく、好ましくは４量体で あるが、露出した糖の結合手があってはならない。４量体がなお非凝集性（本明 細書で定義したような）であり、それゆえ本発明の範囲内のものであるというこ とは本明細書に開示された情報から理解されるであろう。単量体および４量体の 双方が糖あるいは好ましくは例えばグリカン複合体のような多糖複合体と会合し つるが、非糖複合体を除外するものではない。

最も好ましい糖複合体は、マクロファージや肝細胞上の炭水化物特異的受容体に よるあるいは他の解除系による循環からの解除から複合体化した会合ＧＢＰを保 護するシアル酸を含むものである。

糖複合体は実施例により本明細書に示された場合のようにして得ることができる 。あるいは天然型であれ遺伝子操作型であれ分子中の糖転移部位から生成しうる 。サイトダイレクト変異の手法により糖結合部位を覆うように糖転移部位が作成 され、あるいは糖結合部位を覆うように糖複合体以外の複合体が用いられあるい は遺伝子操作により作成されることが予想される。糖結合部位が覆われているか かる蛋白はすでに述べた理由およびその安定性と高い増殖阻害活性により治療上 の利点を有する。複合体によりβ−ガラクトシド結合部位が覆われたＧＢＰは以 後、蛋白の「複合体化した」形態と記載する。この語は本明細書記載の場合のよ うにして複合体が得られる場合であってもまたそれが分子中で例えば糖転移部位 から生成する場合であっても用いられる。

本発明によりβ−ガラクトシド結合蛋白は覆われているというよりはむしろ糖結 合部位が全て除去されるというように修飾できることがさらに当然のこととして 予想される。かかる蛋白はやはり本発明の範囲内のものである。

本発明の別の態様において担体あるいは希釈剤をと共に動物由来の非凝集性β− ガラクトシド結合蛋白の有効量からなる医薬組成物が提供される。好ましくは該 組成物は非経口的投与あるいは別経路の投与用に処方し、何等かの希釈剤、アジ ュバント、保存剤あるいは慣用的にかかる組成物中に含まれまた当業者によ（知 られている他の成分を含有させてもよい。該組成物を単位投与形に処方する場合 、患者にはそれぞれの治療用法および目的細胞の感受性に従って用量あたりＬｏ ｎｇないし１０００ｍｇを投与するのが好ましい。

ＧＢＰは別の蛋白あるいは分子キャリヤーに付加あるいは付着させて用いること ができる。

本発明の第３の態様において、本明細書で定義されるような非凝集性のβ−ガラ クトシド結合蛋白の製法が提供され、該方法は少なくとも、（ａ）該蛋白を発現 する単細胞あるいは多細胞いずれかの生物を提供し、（ｂ）該蛋白を発現させ、 （Ｃ）純粋でない形態の該蛋白を該生物から分離し同定し、（ｄ）該蛋白を精製 工程に付して発現生物に由来する汚染が実質的にない生成物を得る工程からなる 。

ＧＢＰを生産する生物は本蛋白を構成的に発現する動物細胞よりなるものであっ てもよく、商業的規模で本蛋白を生産するように培養できる。広い範囲の動物細 胞系をこの方法でＧＢＰを生産するのに用いることができ、昆虫、魚類、ヒトお よび他の哺乳動物由来の細胞も含む。構成的に発現された蛋白は当業者に知られ た標準的な手法により細胞系を増殖させる組織培養培地から容易に回収し、同定 し、精製できる。商業的なＧＢＰの生産には連続した細胞系、特に浮遊培養で増 殖する細胞系が特に好ましい。

本明細書に記載する実施例において、発明者らは２代目のマウス胚繊維芽細胞か らＧＢＰを容易に回収しＭ製した。

別法として、ＧＢＰを生産する生物は組換えＤＮＡ工学により当該蛋白を生産す るように設計されたものでもよい。かかる生物としては改善された収率を与える ように設計された上述のすべての構成的に生産を行う細胞系および本蛋白を通常 発現しないのではなくてその中に誘導されるＧＢＰをコードしているＤＮＡを持 った単細胞および多細胞の広範囲の生物を含む。この点で特に好ましいのは細菌 、酵母およびカビのごとき微生物あるいは植物および動物組織培養細胞であるが 植物および動物のような高等生物の使用もまた予想できる。外来遺伝子を微生物 に導入し、その発現を得るのに必要な遺伝子組換えの手段は当業者によ（知られ ている。

本明細書中に記載の実施例において、発明者らはＣＤＭ８プラスミドを発現ベク ターとして用いており、マウスの組換え型蛋白をＣＯ３−１細胞で発現させた。

ＧＢＰが直接動物組織から単離されうることもまた予想できる。したがって本発 明の第４の態様において、本明細書に定義されるような非凝集性のＧＢＰを生産 する方法が提供され、本方法は少なくとも、（ａ）るために動物由来の組織を処 理し、それから蛋白抽出物を得て、（ｂ）該抽出物から非凝集性のβ−ガラクト シド結合蛋白を分離し同定し、次いで （Ｃ）精製工程に該蛋白を付して、組織由来の汚染が実質的にない生成物を得る 工程からなる。

該蛋白は多（のよく知られた手法のうちのいくつかによって抽出し、分離し、精 製できる。特に、組織から分泌される他の蛋白から該蛋白を分離するためにＧＢ Ｐの糖結合能力を利用することが可能であり実際好ましい。前記方法は容易に利 用できるため、問題としている組織がヒトの組織であり、この点に関してヒトの 胎盤組織が特に適する場合、前記方法は好ましいものである。そのうえ、供給が 豊富でもあるという理由で例えばウシ、ブタなどの大型の哺乳動物の胎盤組織が ＧＢＰの源として利用できる。

別法として、ＧＢＰあるいはそのいかなる部分も合成的に調製されうる。

組換え型のＧＢＰの生産に関してナショナル・コレクション・オブ・タイプ・カ ルチャーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ １ｔｕｒｅｓ）　、５１　）リンディル・アベニュー　（Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ＾ ｖｅｎｕｅ）　、ロンドン　ＮＶ９５八丁に１９８９年４月２６日に以下のもの を寄託した。

ａ）マウスのＧＢＰ配列をコードしている全ｃＤＮＡを含むＣＤＭ８プラスミド の宿主である大腸菌　ＭＣ１０６１／Ｐ３株。受託番号１２２３７゜ｂ）ヒトの ＧＢＰ配列をコードしている全ｃＤＮＡを含むバクテリオファージλｇｔ　１１ ゜受託番号１２２３６゜ Ｃ）ｂ）の宿主としての大ｖＡ菌　Ｙ　１０９０゜受託番号１２２３５゜前記の ものの利用は当業者にとってはｃＤＮＡ挿入部分の単純な置換によって、他起源 の動物ＧＢＰの発現のために構築し、あるい（１他のベクターを用いてマウスあ るいはヒトのＧＢＰを発現するための日常的な作業を意味する。前記のプラスミ ドおよびファージは他のベクターの構築および所望により覆われ改変されあるい は除去された糖結合部位を持つように付加的に設計されうる他のＧＢＰ発現のた めのモデルを提供する。

本発明のＧＢＰは広い範囲の方法で上述のようにして生産されうるが、本発明で 用いる天然型あるいは組換え型のマウスＧＢＰの調製および単離が、まず２代目 のマウス胚繊維芽細胞（ＭＥＦ）を培養しその培養物を回収することにより発明 者らによって行われた。天然型の蛋白はそこからセファデックスゲル濾過につい で逆相ＨＰＬＣにより精製し、マウス胚繊維芽細胞の同調培養物を細胞増殖阻害 活性を検出するためにテスト細胞として用い、細胞の直接計数および細胞蛍光分 析を用いた細胞周期分析により阻害の程度を評価した。

最初に標準的手法により３個のペプチドのアミノ酸配列を得、次いで文献および 蛋白データベースを通じて配列決定された蛋白と相同性を持つ領域を含む蛋白を 検索することにより蛋白を特徴付けた。かくして、新たに単離された蛋白はβ− ガラクトシド結合蛋白であることが立証された。このことはｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクロ ーニングおよびさらなる特徴付けの研究のための組換え型蛋白の利用によって確 認された。

ファージλｇｔｌｏのｃＤＮＡライブラリーは核酸源としてマウス胚繊維芽細胞 のｍＲＮＡを用いて構築された。ペプチドのアミノ酸配列についての知見によリ ライブラリーを検索するために合成されるべきオリゴヌクレオチドのプローブの 提供が可能となった。この工程により、サイズ分画ｃＤＮＡが構築したＣＤＭ８ プラスミドライブラリー用のさらなるプローブとして供される１１０ｂｐのｃＤ ＮＡが得られた。この経路により、１４，７３５ダルトンの翻訳された分子量を 有するアミノ末端メチオニンおよび１３４個のアミノ酸からなる蛋白をコードし ているｃＤＮＡ挿入部分を有しているクローンが同定された。マウスＧＢＰｃＤ ＮＡを有するＣＤＭ８プラスミドをＣＯ５−１細胞をトランフェクトするために 用い、該細胞にて組換え型のマウスＧＢＰ　（ｒＧＢＰ）の発現が達成された。

多くの標準的な精製手法のうちいずれもが使用できるが、該組換え蛋白は発明者 らが作成した抗−マウスＧＢＰ抗体を用いて精製した。マウスＧＢＰは通常のマ ウス細胞、マウスの形質転換細胞および癌細胞ならびにヒト癌細胞に対して有効 な増殖阻害活性を有することが示された。さらに、マウスＧＢＰはウィルス複製 に対しても阻害効果を有することが示され、免疫系の細胞に対して調節効果を有 することが予期された。

以後記載する詳細な手法は本発明で用いる天然型および組換え型双方の動物のＧ ＢＰに対する実験経路についての実施例によるものである。添付図面の説明は以 下を参照のこと。

図ＩＡは逆相ＨＰＬＣでの追跡を示し１、そこには細胞増殖阻害活性のある２つ のピークが蛋白の複合体化した（分子量１８，０００）および複合体化していな い（分子量１５．０００）形態に対応して同定されており、図ＩＢはＳＤＳ勾配 ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）およびバイオラッド銀染色（Ｂｉ ｏｒａｄ　５ｉｌｖｅｒ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）により示されたピークに対応する フラクションからの蛋白バンドを示し、 図ＩＣは図ＩＢに示された先のポリアクリルアミドゲルから溶出されたフラクシ ョンからの１２％ＳＤＳゲル上での蛋白の再単離を示し、図ＩＤａはｃｏｓ−ｉ 細胞で発現された組換え蛋白の還元的および非還元的条件下でのＳＤＳ勾配ポリ アクリルアミドゲル電気泳動で得られた蛋白バンドを示している。

図ＩＤｂは本発明の分子量１８，０００および１５．０００のＧＢＰの染色を糖 付加された蛋白であるトランスフェリンおよび糖付加されていないトランスフェ リンのＮ−末端側断片の糖染色と比較して糖染色することにより得られた蛋白の プロットを示す。

図ＩＥは競争的な糖、ノイラミニダーゼおよび酸素原子を介した糖／蛋白結合を 切断する酵素にて分子量１８．０００のＧＢＰを処理した後ＳＤＳ勾配ポリアク リルアミドゲル電気泳動により得られた蛋白ノくンドを示す。

図２Ａは３ｍのペプチドのアミノ酸配列およびを椎動物由来のβ−ガラクトシド 結合蛋白のアミノ酸配列とのこれらのペプチドとの相同性を示し、相同性のタリ 部分が箱の中に示されており、 図２８ａは下線を付した糖結合部位および推定される２次構造とともにマウスの ＧＢＰのアミノ酸配列を示し、 図２Ｂｂは該蛋白のハイドロパンツク・プロファイルを示しており、糖結合部位 は黒部で示されており、 図３ＡはマウスＧＢＰに関するヌクレオチド配列および推定できるアミノ酸配列 を示し、 図３ＢはヒトＧＢＰに関するヌクレオチド配列および推定できるアミノ酸配列を 示し、 図４Ａは単量体の天然型および組換え型のマウスＧＢＰのマウス胚繊維芽細胞（ ＭＥＦ）の増殖に対する影響ならびに同等投与量における植物レクチンであるコ ンカナバリンＡおよびサタンニルコン力ナバリンＡの効果の欠如を示し、図４Ｂ は接種から４０時間増殖後のマウス胚繊維芽細胞を示し、図４０は接種から４０ 時間増殖後の４００　ｎ　ｇｍ　ｌ−１の単量体のＧＢＰで処理されたマウス胚 繊維芽細胞を示し、 図４Ｄは複製中のＭＥＦに対する単量体のＧＢＰおよび４量体のＧＢＰの５日間 にわたる経過後における効果を示し、 図４Ｅは血清中で刺激された後ＧＢＰで処理されたＭＥＦの細胞周期の異なった 段階における細胞増殖の指標としてのＤＮＡ分配を示し、図５ＡはＭＥＦ細胞周 期の００期の間の構成的な内在性のＧＢＰに対する中和抗体の細胞増殖に対する 添加効果を示し、図５Ｂは細胞周期の０２期に先立って抗体を添加した場合の細 胞増殖に対する効果を示し、 図６Ａハネスミ＋１７）形質転換された細胞系１８−８．　ＰＶ−ＴＴ−８，Ｗ ｅ　ｉ　１３ＢおよびＬ−５７の増殖に対する種々の濃度におけるネズミｒＧＢ Ｐの効果を示し、図６Ｂはヒト癌細胞に５６２．Ｎａ１ｍ６およびＫＧＩの増殖 に対する種々の濃度におけるネズミｒＧＢＰの効果を示し、図７は３７℃での６ ．１２および２４時間のインキュベーション後における複合体化していないＧＢ Ｐの単量体から４量体への変換（左図）および複体化したＧＢＰの単量体から４ 量体への変換（右図）を示し、図８Ａは１００ｍＭの競争的なラクトース不存在 下でのマウス胚繊維芽細胞に対するＧＢＰの受容体親和性結合を示し、図８Ｂは １００ｍＭの競争的なラクトース存在下でのマウス胚繊維芽細胞に対するＧＢＰ の受容体親和性結合を示し、 図８０はＭＥＦ上の細胞受容体に対する４つの形態のＧＢＰ　（単量体および４ 量体）の親和性を比較しており、 図９はマウス胚繊維芽細胞におけるネズミのＧＢＰのＥＭＣウィルスの複製に対 する影響を示す。

実施例１．　天然に存在するマウスのＧＢＰの単離ａ）マウス胚繊維芽細胞（Ｍ ＥＦ）の培養物はＣ５７Ｂ１株のマウスから調製した。

初代細胞を１０％０％トリプトース酸ブロスおよび１０％０％ラン血清（増殖培 地）を含有するイーグル（Ｅａｇｌｅ）のＢＨＫ培地中で、５％二酸化炭素を含 む空気中で接種した。

増殖培地を２％ウシ胎児血清を含有するＢＨＫ培地に変更し、培養物をさらにこ ポリクローナルおよびモノクローナルな抗−ＧＢＰ抗体を用いた免疫アフイニテ イ培養物は空気中５％ＣＯ１と共に空気中で平衡化し、３７℃のウォーターバス 中でインキュベートした。選ばれた時間に増殖阻害活性を試験されるべき標品を 添加した。これらの各標品は無血清培地（ＳＦＭ）に対して既に透析しその後５ ％ウシ胎児血清を添加したものである。対照にはＳＦＭと５％血清を与えた。増 殖阻害は０．１％トリプシンおよび０．２％トリバンブルーを含有する０、　５ ｍ　１０．０２％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を用いて細胞をガラス器 壁から除去することにより測定した。次いでトリプシンを０．５ｍｌの血清で中 和した。

トリパンブルー染色された細胞および染色されなかった細胞をフックスーローゼ ンタール（Ｆｕｃｈｓ−Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）のへマドメーターで計数した。す べての実験において染色された細胞の数すなわち生存していない細胞は２％未満 であった。

ａ）蛋白の逆相ＨＰＬＣは、実施例１に記載のように、６０期のＣ５７／Ｂ　１ 株のマウスの２伏目ＭＥＦから得られた無血清培地での培養物の０７５セフアデ ツクスによる分画で得られたプールについて行った。２５０μｇの蛋白を０．０ ８％トリフルオロ酢酸で平衡化されたＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムに適用し、２０ ％から６０％までのアセトニトリルの濃度勾配を伴い、毎分１．５ｍｌで４５分 間溶出された。０．７５ｍ１ずつのフラクションを集めた。得られたＨＰＬＣの トレース図を図ＩＡに示す。阻害活性のある２つのピークが確認された（矢印で 示す）。阻害活性のピークを含むプールされたフラクションをＳＤＳ勾配ポリア クリルアミドゲルに流した時、１番目のピークを含むフラクシヨンは見掛けの分 子量約１８．０００ダルトンのバンドを示した。２番目のピークを含むフラクシ ョンは見掛けの分子量約１５，０００ダルトンを示しながら泳動する１個の成分 を示した。これらのバンドは明確に図ＩＢのゲル上に示されている。阻害活性の ある２つのピークから単離された蛋白が実際には同一物でありその分子量の相違 は初めのピークの蛋白上の糖の決定要素の存在、特にβ−ガラクトシド結合部位 に結合し効果的にそれを覆うＩｉ？ｊ’一体に起因していることが配列分析およ びモノクローナル抗体の使用により確認された。

ｂ）逆相ＨＰＬＣカラムからの２番目のピーク中に溶出された２００／ｉｌのプ ールされた活性のあるフラクションを凍結乾燥し、５０μｍの試料緩衝液中に添 加し、０．１％ＳＤＳを含む１２％ポリアクリルアミドスラブゲルの単一のレー ンに流した。レーンを２ｍｍずつスライスし、各スライスを３００μｍのイーグ ルのＢＨＫ培地中で溶出させ、４℃で一晩ロータリー７エーカーで振とうした。

各２００μｍの回収された上澄を４℃で１５分間１０．０００　ｇで遠心分離し た。

５０μＪをＳＤＳポリアクリルアミドスラブゲルに流し、バイオラッド銀染色で 染色した。ゲルは図１Ｃに示す。次いで回収された上澄の残り１５０μｍに５％ ウシ胎児血清および１％の脂肪酸を含まないウシ血清アルブミンを含有させ、マ ルチウェルプレート中の４伏目マウス胚繊維芽細胞の二連培養物に添加した。細 胞増殖阻害活性の評価のために、接種から４０時間後に細胞をメタノール中で固 定し、染色した。ランダムな５つの場所の細胞数を接眼レンズのグラティキュー ルを用いて計数した。図ＩＣは増殖阻害活性の鋭いピークと一致した予想分子量 で移動するバンドを明確に示している。

Ｃ）工程ａ）およびｂ）による精製に続いて、構造レベルでの該蛋白の特徴づけ のためにアミノ酸配列分析を用いた。図ＩＡに示したプールされた活性フラクシ ョンを還元し、アルキル化し、１０ｍＭの炭酸水素アンモニウムに対して透析し 、凍結乾燥し、１０ｍＭの炭酸水素アンモニウムに再懸濁した。ＴＰＣＫで処理 したトリプシンを添加した（蛋白、トリプシンが重量比でＺｏｏ　：　１）。こ の混合物を３７℃で１２時間インキュベートし、さらに同じトリプシン溶液を添 加し、さらに１２時間インキュベートを続けた。次いでペプチドを０．０８％ト リフルオロ酢酸で平衡化したＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムに直接適用した。０から ６０％のアセトニトリルの濃度勾配を１ｍ１ｍ１ｒｒ’で７５分間行い、Ｑ、５ ｍｌずつのフラクションを集めた。かくして生成された３個のペプチドの配列決 定をアプライド・バイオシステムズ　４７０Ａ　（＾ｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙ ｓｔｅｍｓ　４７０＾）気相配列決定装置および１２０＾分析装置を用いたオン ラインで作動するＰＴＨアミノ酸分析を用いて行った。定量的なＰＴＨアミノ酸 の回収率をシマズ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）　ＣＲ３Ａ記録積分装置を用いて測定し た。得られた３個のペプチドの配列を図２Ａに示す。

上述のこれらの３個のペプチドの配列と相同性を示す他の蛋白を同定するために 蛋白データベースおよび文献の検索を行った。その検索は、ラット肺β−プラク トシド結合蛋白の配列と絶対的に同一であり、いくつかのヒト組織由来のβ−ガ ラクトシド結合蛋白の配列と１個のアミノ酸を除いて絶対的に同一であり、他の ヒト組織ならびにマウス、ウシおよびニワトリの組織の入手可能な配列と相同性 を有することを明らかにした。このことは図２Ａに示されており、箱の中の配列 は相同性がないことを示している。かくして、ペプチド配列分析およびそれに続 く検索はＭＥＦ阻害効果のある蛋白がβ−ガラクトシド結合蛋白であることを明 確に示した。後記するごとく全長ＧＢＰｃＤＮＡをクローニングし実施例３に記 載されるような他種由来のＧＢＰとマウスＧＢＰのアミノ酸配列を比較すること により、かかる事態を確認した。

ｄ）ＧＢＰの全アミノ酸配列が得られたならば、コンピューター分析を使用して いずれのβ−ガラクトシド結合部位の位置も確認した。図２８ａは示された推定 二次構造および下線を付した単一の糖結合部位に関するアミノ酸配列を示す。

図２Ｂｂは該蛋白のバイトロバシック・プロファイルを示し、この中で当結合部 位のアミノ酸を黒部で示す。天然型および組換え型双方の該蛋白は単量体で示す （実施例６を参照）。上述の分析は該単量体蛋白が単一のβ−ガラクトシド結合 部位のみを有することを明確に示す。この特徴は該蛋白をレクチンと区別するも のであり、該蛋白が細胞凝集を引き起こすことを妨げるものである。

レオチド配列を推定するために、図２Ａに示したペプチドのうちの１つの一部分 のアミノ酸配列（下線を付した配列）を使用した。

ｂ）ポリＡ”ＲＮＡを３代目のマウス胚繊維芽細胞から単離した。二重鎖のｃＤ ＮＡをこのｍＲＮＡから合成し、ファージλｇｔｌＯＤＮＡに連結し、組換え型 のファージを生体外でパッケージした。次いで、上述のペプチド配列に基づく４ 個のオリゴヌクレオチドのプローブの組み合わせを用いた標準的な方法でλｇｔ １０ｃＤＮＡライブラリーを検索した。次いで、オリゴヌクレオチドのプローブ を調製するために用いられるペプチドのアミノ酸配列に関するコード領域を含む １１０ｂｐのｃＤＮＡを単離し、マウス繊維芽細胞のポリＡ″ＲＮＡから調製し たサイズ分画ｃＤＮＡ　（４００ないし１２００ｂｐ）により調製されるＣ０Ｍ ８プラスミドのライブラリーを検索するために使用した。ＸｈｏｌによるｃＤＮ Ａ挿入断片が単離され、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）のジデオキシヌクレオチドタ ーミネーション法による配列決定のためにサイズにより選択した。クローンＭＷ ２は好適な開始位置にＡＴＧ開始コドンを伴う４０５ｂｐのオーブンリーディン グフレームを含む４９５個のヌクレオチドからなることが見いだされている。ク ローンＭＷ２のｃＤＮＡはアミノ末端のメチオニンおよび翻訳分子量が１４，７ ３５ダルトンである１３４個のアミノ酸からなる蛋白をコードしている。そのコ ード領域の横に１９ｂｐの５′末端側の非翻訳配列および４０６番目の位置に停 止コドンを含む７１ｂｐの３′末端側の非翻訳配列ならびにさらに２３ｂｐ下流 のコンセンサスアデニル化／グナルおよび１９個のアデノシンからなる尾部が存 在する。

ＭＥＦＧＢＰに関するヌクレオチド配列を図３Ａに示す。ラット、ヒトおよびニ ワトリのβ−ガラクトシド結合蛋白の既知の配列と比較すると、本明細書記載の それぞれ１３４ｍのアミノ酸からなるＧＢＰがマウス／ラット９６％、マウス／ ヒト８９％、マウス／ニワトリ５０％の相同性をもっことがわかる。それゆえ、 特に哺乳動物のＧＢＰの場合には分子類似性が極めて高い。このことは交差種活 性すなわち実施例５に引例されたマウスＧＢＰのヒト癌細胞に対する効果を説明 する。

実施例４．　ＣＯ３−１細胞におけるＧＢＰの発現および組換え蛋白の精製ａ） ＤＥＡＥ−デキストランおよびＤＭＳＯにより容易にされたＤＮＡの取り込みに 基づいた標準的な方法を用いて、１０６個の細胞層たり１０μｇのＤＮＡという プラスミドと細胞の比率で、上述のクローンＭＷ２を含むＣ０Ｍ８プラスミドに より該蛋白を本来発現しないＣＯ３−１細胞をトラフエクトした。かくして発現 された組換え型のＧＢＰを免疫アフィニティークロマトグラフィーにより精製し た。当業者に知られたいかなる精製法もこの段階で用いることができるが、この 特別な実施例においては、天然型のＭＥＦ　ＧＢＰに対して作成されたモノクロ ーナル抗体（クローンＢ２）のＩｇＧフラクションをアフィニティー試薬として 用いた。ＣＯ３−１細胞が１５．０００ダルトンの蛋白およびグリカンが複合し た１８．０００ダルトンの蛋白（この蛋白は自然な条件下でも発現される一図Ｉ ＡおよびＩＢを参照）を発現するので、抗体により精製されたｒＧＢＰはアシア ロフェツインセファロースクロマトグラフィーに供した。複合体化した蛋白は素 通りのフラクション中に回収されたが、複合体化していない蛋白は競争的な糖に よりカラムから溶出することにより回収された。

ｂ）天然型のＧＢＰに対するモノクロナール抗体の調製のため、８ないし１０週 齢のＢＡＬＢ−Ｃマウスをポリアクリルアミドゲルから電気溶出により精製され たＧＢＰで腹腔内から免疫感作させた。４週間間隔で５０μｇ蛋白をフロイント （Ｆｒｅｕｎｄ）の完全アジュバント中にて注射し、つずいてフロイントの不完 全アジュバント中にて５０μｇ蛋白を２同腹腔内注射した。免疫されたマウスを 、次いで、５０μｇのＧＢＰを腹腔内注射して追加免疫し、３日後に膵臓を摘出 した。融合を誘導するために膵臓細胞をポリエチレングリコールを用いてＮ５− １骨髄幹細胞と融合させ、次いで支持細胞層を形成させるために２０％のウシ胎 児血清を含む選択ＨＡＴ培地に膵臓細胞とともに分配した。クローンが適当な大 きさに成長すると、その上澄をＥＬＩＳＡ分析を用いて試験した。陽性のクロー ンを限界希釈法により２回植え継ぎ、選択しクローンを液体窒素中で凍結した。

クローンＢ２をＭＥＦ　ＧＢＰの免疫アフィニティー精製に使用するために選択 した。

実施例５．　天然型および組換え型ＧＢＰの増殖阻害活性ａ）（上述のようにし てｙ４製した）同調培養されたマウス胚繊維芽細胞に対するＧＢＰの増殖阻害効 果を実施例２記載の方法で評価した。単量体ＧＢＰの濃度を増加させて試験を行 った。比較のため、コンカナバリンＡの濃度も平行して増加させて試験を行った 。図４Ａは天然型（・−・）あるいはｒＧＢＰ　（■−■）の濃度増加（Ｏから ４００ｎｇｍｌ’）に伴う１００％までの増殖阻害の等しい増加を示している。

一方、ＧＢＰおよびその効果が細胞段階に特異的であるインターフェロンのよう な他の生理学的成長因子とは異なり、さらに多くの投与量を必要とし非特異的な 阻害を引き起こす、同一濃度のコンカナバリンＡ（ローロ）あるいはサクシニル コンカナバリンＡ（△−△）による増殖に対する効果は全く示されなかった。図 ４Ｂは対照のマウス胚繊維芽細ｍ（ＭＥＦ）の単層状態を示し、図４Ｃは接種時 から４ないし４０時間の間の４００　ｎ　ｇｍ　Ｉ　”の単量体マウスＧＢＰで 処理したＭＥＦの単層状態を示す。復製が妨げられた場所では細胞は肥大した細 胞質と核領域あるいはいくらかの場合２個の核を持つ傾向があることがこれらの 細胞観察により示された。

ｂ）単量体および４量体ＧＢＰの増殖阻害効果を比較した。糖と複合体化してい るものと複合体化していないものの双方の蛋白の４量体の存在は、まず実施例６ に記載したように１２５■で蛋白を標識することにより示された。複合体化した および複合体化していない形態は２４時間にわたり３７℃でインキュベートし、 次いでセファデックスＧ１００クロマトグラフイーに供し、フラクション中の放 射活性を測定した。その結果を図７に示しく左図が複合体化していない蛋白で右 図が複合体化した蛋白である）、２４時間以上経過すると単量体が４量体を形成 し得ることを示している。しかしながら、図から明らかなごとく複合体は４量体 への変化に耐性がある（図７ｄ、右図）。４量体の場合、還元剤の存在が４量体 の形成を妨げるという理由でこれらの分子はジスルフィド結合の形成により生成 することか示されつる。

単量体と４量体双方の増殖阻害活性は２００ｍｇｍ１−’の濃度にて、複製中の （上述のごと（調製した）マウス胚繊維芽細胞に関して評価した。結果を図４Ｄ に示し、４量体の阻害効果（０−０；−ローロー）は分子量１５．０００の単量 休日−日および実際量も高い増殖阻害活性を有する分子量１８．０００の単量体 一の阻害効果より弱いことが示されている。対照は○−○で表す。なぜ４量体の 阻害活性が弱いのかという理由についての可能な説明は１個の４量体は１個の細 胞受容体に結合できるにすぎないということである。そのうえ、おそらく４量体 への変化に対して抵抗性があるという理由で複合体化した単量体（分子量１８． ０００）は本発明中量も高い能力を有している。

ｄ）種々のネズミおよびヒトの癌細胞系に対するＭＥＦ　ＧＢＰの影響を調べ、 結果を図６Ａおよび図６Ｂに示す。ＧＢＰとともにインキュベートした細胞系の 増殖を３日間続け、無処理の対照に対して増殖速度を比較した。１８．８細胞（ プレＢ細胞系）　、ＰＶ−ＴＴ−８細胞（ポリオーマウィルス誘導性の肉腫細胞 ）、Ｗｅｉ１３Ｂ細胞（骨髄単球性白血病細胞系）およびＬ−５７（自発的に形 質転換したマウス繊維芽細胞）に適用した場合、１００（△−△）および４００ （ローロ）ｎｇｍｌ−ＩのＧＢＰにおいて増殖阻害効果が明確に示される。図６ Ｂはヒト癌細胞系に５６２（慢性骨髄性白血病）　、Ｎａ　１ｍ６（急性リンパ 球白血病）およびＫＧＩ（赤白血痰）の細胞に適用した場合の同様の阻害効果を 示す。図６Ａおよび図６Ｂにおいて対照は記号（Ｘ−Ｘ）で示す。上記に加え、 以下のヒト細胞系である骨髄芽球増血細胞系ＨＬ−６０、リンパＢ細胞系−ｒａ ｊｉ、リンパＴ細胞系−ＭＯＬＴ、およびリンパＴ細胞系−ＪＭについて１００ ないし２５０ｎｇｍＩ−１の投与量でＧＢＰを試験し、Ｓおよび６２期の細胞数 の減少ならびに４０ないし６０％の増殖減少を引き起こすことが示された。した がって、天然型および組換え型双方のマウスＧＢＰがヒト由来の腫瘍細胞に対し て強力な阻害効果を有する。

しているところではバンドの位置が変化したはずである。明らかなごとくこのよ り°はこれら２個の混合物を示している。かくして、マウスＧＢＰは単量体であ 結合に使用しうる糖結合部位がないという理由で該蛋白の複合体および４量体は よって覆われている。複合体化していない形態からの４量体の場合、各構成単量 ンスフエリンならびにトランスフェリンの非糖鎖付加Ｎ−末端断片を対照として ニトロセルロース膜にブロンティングし、エライザ・グリカン・ディテクション ・キット（Ｅｌｉｓａ　Ｇｌｙｃａｎ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ）　（ベー リンガーマンハイムノくイオケミカがはじめて示された。その結果をずつＩＤｂ に示すが、レーン（ａ）は分子量１８．０００のＧＢＰ、レーン（ｂ）は分子量 １５．０００のＧＢＰ、レーン（Ｃ）はトランスフェリン、レーン（ｄ）はトラ ンスフェリンのＮ−末端断片である。

蛋白濃度は左から右へそれぞれ１２０ｎｇ、６０ｎｇおよび３０ｎｇである。

レーンａおよびＣの高度な染色は糖複合体の存在を示している。したがって分子 量１８．０００の蛋白は分子量１５．０００の蛋白には明らかに存在しないかか る複合体を示している。

該蛋白の〇−糖鎖付加が存在するのか否か、あるいはグリカン複合体がある他の 方法でで該蛋白に結合しているのか否かを調べるために、糖複合体の結合の性質 をさらに研究した。

組換え型の複合体蛋白をアシアロフェツインセファロースクロマトクラフィーを 用いて非複合体蛋白から分離し、前述のようにそこに非複合体蛋白を保持させた 。次いで、ラクトースおよび／またはノイラミニダーゼの存在下および非存在下 、〇−説糖鎖酵素で蛋白を処理した後、該複合体蛋白をＳＤＳポリアクリルアミ ドゲル電気泳動に供した。その結果を図ＩＨに示すが、処理は以下の通りであａ 　対照の分子量１８．ＯＯＯのＧＢＰｂ　分子量１８．０００のＧＢＰ＋ラクト ースＣ分子量１８．０００のＣ；ＢＰ＋Ｏ−説１１ｔｊｉ＃素ｄ　分子量１８， ０００のＧＢＰ＋Ｏ−説糖鎖酵素十ラクトースｅ　分子量１８．０００のＧＢＰ ＋Ｏ−税糖鎖酵素十ノイラミニダーゼ＋ラクｆ　分子量１８，０００のＧＢＰ十 〇＝脱糖鎖酵素十ノイラミニダーゼｇ　分子量１８．０００のＧＢＰ十ノイラミ ニダーゼ＋ラクトースｈ　分子量１８．０００のＧＢＰ十ノイラミニダーゼ１　 対照の分子量１５．０００のＧＢＰ図ＩＥの実験は、糖複合体が脱糖鎖酵素によ って除去されないからといってシアル酸残基を含むｔｌＫｍ合体はその分子の〇 −糖鎖付加部位から生成するのではなく、その糖複合体のシアル酸残基がノイラ ミニダーゼによる消化により除去されたらそれがラクトースとの競争により除去 されつるということを示している。

Ｃ）複合体化したＧＢＰにおいてはβ−ガラクトシド結合部位が糖複合体により 覆われていることが上述（ｂ）記載の実験により示されている。該蛋白の４量体 型はアンアロフェツインセファロースカラムｌ：結合できないため、使用可能な 糖結合部位を有していないことも示されている。それにもかかわらず、ＧＢＰの これらの形態は増殖阻害効果が該蛋白の糖結合能力に関連していないことを示す 論証可能な増殖阻害活性を有している。

糖結合部位が覆われていない場合でさえ糖結合部位が増殖阻害効果に関係してい ないことを示すために、マウス胚繊維芽細胞の特異的な表面受容体へのＧＢＰの 結合アフィニティーを競争的な糖の存在下あるいは非存在下で分析した（図８Ａ および図８Ｂ）。結合の分析はまた、マウス胚繊維芽細胞の受容体に対する４つ の形態のＧＢＰ　（複合体および非複合体の単量体ならびに複合体および非複合 体の４量体）のそれぞれに関するアフィニティーを比較するためにも行った（図 ８Ｃ）。

結合分析は１２５Ｉで標識したＧＢＰを用いて行った。該蛋白は、その１量ｇを １００μｍの１００ｍＭＮａＰｉ中、ｐＨ７で、あらかじめ導入されるヨウ素ビ ーズのヨウ素化試薬を用いて５００μＣｉのキャリアーを持たないＮａ”Ｉと混 合することにより放射ヨウ素化された。反応停止後０．１％ＢＳＡを含む３００ μＩの１００ｍＭＮａＰｉを添加し、ヨウ素化蛋白を１００ｍＭＮａＰｉ中に０ ．１％ＢＳＡを含む溶液で平衡化したバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）　Ｄ　Ｇ　 １０カラム上で分離した。比活性は４Ｘ１０’ないし８　Ｘ　１０’ｃ　ｐｍｎ 　ｇ−’の範囲であった。

試料はポリアクリルアミドゲル電気泳動で調べ、結合の分析が行う前に生物学的 活性を試験した。競争的な結合の分析はファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）社の２４ウ エルマルチウエルプレート上の３系並列したマウス胚繊維芽細胞について４℃で 行った。

前もって凍結され、冷結合用緩衝液（Ｃａ”およびＭｇ”を含むＰＢＳに０．１ ％ＢＳＡを添加したもの）で３回洗浄した細胞（ウェル当たり２Ｘ１０５個）に 順次濃度を増加させた濃度の非標識ＧＢＰとあらかじめ混合した０、６２５ｎｇ の１２５　Ｉ標識ＧＢＰを受容させた。平衡結合は３時間で達成され、４時間後 に細胞を冷結合用緩衝液で３回洗浄し、０．１ｍＭＮａＯＨ１２％Ｎ　ａ　２　 ＣＯ３および１％ＳＤＳを含む溶液に可溶化させた。分析はまず、競争的な糖と して１００ｍＭラクトースの存在下および非存在下で行った。競争的なラクトー スを添加したときは、これお、ＧＢＰ溶液とともに室温にて２０分間ブレインキ ュベートした。

この実験結果を図８Ａおよび８Ｂに示すが、図８Ａはラクトース非存在下でのマ ウス胚繊維芽細胞へのＧＢＰの親和的結合を示し、図８Ｂはラクトース存在下で の結合を示す。挿入図はどちらの条件下でも蛋白が高い親和性を持って概算５な いしｌ０ＸＩＯ’個の特異的受容体と結合し、そのため結合は糖に結合するドメ イン以外のドメインで起こるに違いないということを示すスキャッチャード・プ ロットである。ラクトースが細胞への結合を全く妨げておらず、そのためすでに 複合体および４量体に関して明らかとなっているように糖結合部位がその分子の 増殖阻害活性に関係し得ないことがこれらの結合分析の結果から明らかである。

結合分析に関して言えば、糖だけでは何の効果も示さないのであるが、ＧＢＰで 処理された細胞は競争的な糖が存在してもしなくても増殖状態に入ることはない 。

次いで４つの異なる形態のＧＢＰを用いてさらなる受容体結合分析を行った。

結果を図８０に示し、（ａ）は分子量１５．０００のＧＢＰ、（ｂ）ｌ；！分子 量１８．０００のＧＢＰ、（ｃ）は分子量１５．０００のＧＢＰＪ量体であって 、（ｄ）は分子量１８，０００のＧＢＰＪ量体である。＋２５７で標識された蛋 白の結合がすべての場合同種の過剰の標識された蛋白によって同様な様式でもっ て阻害され、細胞当たりの概算の結合部位の数および相対的なＫｄ値が同様の値 となること（挿入されたスキャッチャード・プロット）が結果から明らかになっ ている。

したがって、細胞受容体結合の効率は該蛋白の４つのすべての形態に関して同じ である。

実施例７、　細胞周期に対するＭＥＦ　ＧＢＰの作用様式の研究ａ）細胞増殖阻 害様式を調べるために、静止状態および血清で刺激され４００ｎｇｍヒ１の単量 体ＧＢＰで処理されたマウス胚繊維芽細胞のＤＮＡ含量を細胞蛍光分析により定 量することにより細胞周期を分析した。分析結果を図４に示し、（ａ）は静止状 態の６０期の細胞を示し、（ｂ）は１０％ウシ胎児血清を添加することにより刺 激された細胞を示し、（Ｃ）は血清刺激の４時間前から００期の間に前処理した 後血清刺激された細胞を示し、（ｄ）は０１期の開始から処理された細胞を示し く血清刺激６時間前、（ｅ）は０２期の４時間前から処理された細胞を示す。

処理されていない対照の細胞（４Ｅｂ）が０２期を経過している時、６０期にＧ ＢＰで処理された細胞は００期のままであることが判明した（４　Ｅ　ｃ）。６ ０期に処理された細胞は対照細胞がその周期を１周する時間までには分裂しない 。

さらなる実験（記載されていない）は、５　Ｑ　ｎ　ｇｍ　Ｉ−’未満の濃度の ＧＢＰでも同様の効果が得られることを示した。したがってＧＢＰは００期の細 胞をブロックすることによって細胞分化を阻害しうる。

ＧＢＰを６１期の間に添加した場合（図４Ｅｄ）、細胞周期の５期への移行は抑 制されなかったが、その代わり、Ｓ後期からの移行は影響された。Ｓ後期から６ ２期を経過する移行は細胞が６２期に入る前にＧＢＰが添加された場合にも影響 される（図４Ｅｅ）。細胞は、対照の細胞が複製するまでには分裂しなかった。

さらなる実験（記載せず）により、ｌＱｎｇｍｌ”程度の少量投与により細胞増 殖が数時間遅れることをか再度示された。異なった実験系においてより少量の投 与量であっても効果的であろうことが予想される。

コンカナバリンＡおよびサクシニルコンカナバリンＡも同じ投与量でこれらの細 胞周期実験で試験し、効果がないことが示された。

ｂ）構成的で内在性のＧＢＰの調節作用を、内在性蛋白に与えるマウスＧＢＰに 対する中和モノクローナル抗体の効果を試験することにより調べた。モノクロー ナル抗体をＧＢＰに対して生成させ、これをＨＰＬＣで精製し、スライスしたゲ ルから溶出させた。Ｂａ　Ｉ　ｂ／Ｃ−Ｎ５−１骨髄幹ハイブリツドからのエラ イザ陽性のクローンを２回サブクローンし、クローンＢ２由来のＩｇＧ画分をウ サギ・抗−マウスＩｇＧを用いて精製した。

まず、中和抗体を００期のマウス胚繊維芽細胞に添加した。図５Ａにおいて（ａ ）は静止状態細胞（ＧＯ）を示し、（ｂ）は血清刺激された対照細胞を示し、（ Ｃ）は血清刺激６時間前から処理された細胞を示す。２番目の実験における結果 を図５Ｂに示し、中和抗体は０２期に入る前に添加された。この場合、細胞は（ ａ）静止状態（００期）の細胞、（ｂ）血清刺激された対照細胞、および（Ｃ） ６２期の６時間前から処理された細胞であった。再実験において、添加された中 和抗体の量は０．５μｇｍド１であった。

図５Ａに示した結果から、血清刺激の前に処理された細胞は対照（ｂ）よりも約 ２時間早（Ｓおよび６２期を通過することがわかる。このことはマウス細胞中で 構成的なＧＢＰには定常期における細胞を維持する役割があることを示すもので ある。図５Ｂの結果は０２期に入る前に抗体にさらされた細胞においては、Ｓお よび６２期を経る進行が無処理の細胞（ｂ）よりも早い（Ｃ）ことを示しており 、細胞周期のこの時期における役割を示している。

実施例７の実験は００期およびＧ１期において作用するインターフェロンの場合 のようにＧＢＰは細胞段階特異性をもって細胞分裂を阻害し、それゆえその効果 がサイトカインの効果であるがレクチンの効果ではないことを示している。

実施例８．　ＧＢＰの効果あるいはウィルスの複製に関する研究ネズミのｒＧＢ ＰをＲＮＡウィルスである編心筋炎ウィルス（ＥＭＣ）に対する抗ウィルス活性 について試験した。マウス胚繊維芽細胞を細胞当たり１０プラ一ク形成単位でＥ ＭＣウィルス感染させられ、ウィルス吸着後ＧＢＰを添加した。

宿主細胞のＲＮＡ生成を停止するためにアクチノマイノンＤでＭＥＦを処理した 後、３Ｈ−ウリジンのウィルスＲＮＡへの取り込みによってウィルス複製の程度 を測定した。感染された細胞は２００．２０および２Ｈｇｍヒ１のＧＢＰで処理 し、ウィルス複製のレベルを対照と比較した。結果を図９に示し、２Ｈｇｍｌ′ □１程度の低濃度のＧＢＰでさえウィルス復製の存意な低下を引き起こすことが 明確に示されている。

よって、本明細書で定義されたＧＢＰは抗ウィルス剤としても有効な用途がある 。

実施例９．　ヒトＧＢＰに関するｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ糖結合に関して１価であるヒト 非凝集性β−ガラクトンド結合蛋白（ｈｕｍａｎ　ＧＢＰ）に関するｃＤＮＡも また本発明者によりバクテリオファ−２スーン化された。そのヌクレオチド配列 および推定されるアミノ酸配列（１３４個のアミノ酸、分子量１４．７４４）を 図３Ｂに示すされている。マウスＧＢＰのヒト悪性細胞に対する明確な増殖阻害 効果が示されており、それは先の知見から予想できないものであるため、相当す るヒトの蛋白がヒト悪性細胞に対して一層強力な増殖阻害効果を有すると推定す ることは合理的である。

動物β−ガラクトシド結合蛋白のこの新たに発見されたかかる阻害活性は、それ らの蛋白が悪性疾病の治療薬として多大な可能性を有していることを意味する。

さらに調節効果が免疫系の細胞に関して期待でき、よって自己免疫疾病ｌこおけ る治療上の有゛用性もまた予想できる。

そのうえ、本発明者らにより、この種の蛋白はまたウィルス複製に対しても阻害 効果を有し、それゆえ別の可能性のある治療上の有用性を提供することもさらに 示された。

天然に存在する非凝集性のマウスＧＢＰの単離および精製、組換えＤＮＡ工学に よるその生産ならびにマウスおよびヒトの形質転換された細胞の増殖とウィルス 複製に対する阻害効果が、一般的にはこれらの非凝集性の動物ＧＢＰの可能性の ある利用およびヒト由来ＧＢＰの可能性のある利用を示した実施例によって提供 されている。これらの動物のＧＢＰが強力な増殖阻害効果を持ちつるという知見 が提供されているため、この経路により治療上の有用性のある他のＧＢＰを生産 することは当業者の通常の能力の範囲内である。

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ｎｇｍド１蛋白 ７７６４’１３゜ 時間（日） ／＃　／７　ｉダ　！／　ｌダ ７７６″″／ 競争物質、ｎＭ ７６２゛ｆ乙 補正音の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　５年　４月２８日−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．脊椎動物細胞の増殖阻害剤として使用される動物由来の非凝集性β−ガラク トシド結合蛋白。 ２．該脊椎動物細胞が形質転換細胞である請求項１記載の蛋白。 ３．該形質転換細胞がヒト由来である請求項２記載の蛋白。 ４．該形質転換細胞が癌細胞である請求項２あるいは３記載の蛋白。 ５．悪性疾病の治療における治療薬として使用される動物由来の非凝集注β−ガ ラクトシド結合蛋白。 ６．細胞増殖および複製の規制剤および調節剤として使用される動物由来の非凝 集性β−ガラクトシド結合蛋白。 ７．自己免疫疾病の治療における治療薬としての請求項６記載の非凝集性β−ガ ラクトシド結合蛋白。 ８．抗ウイルス剤として使用される動物由来の非凝集性β−ガラクトシド結合蛋 白。 ９．ヒト由来である前記いずれか１の請求項記載の蛋白。 １０．ネズミ由来である請求項１ないし８のいずれか１に記載の蛋白。 １１．組換えＤＮＡ工学により合成される先のいずれか１の請求項記載の蛋白。 １２．単量体である前記いずれか１の請求項記載の蛋白。 １３．多量体である請求項１ないし１１のいずれか１に記載の蛋白。 １４．４量体である請求項１３記載の蛋白。 １５．β−ガラクトシド結合部位が覆われ、修飾されあるいは除去された前記い ずれか１の請求項記載の蛋白。 １６．該β−ガラクトシド結合部位が糖複合体により覆われた請求項１５記載の 蛋白。 １７．該糖複合体がシアル酸を含む請求項１６記載の蛋白。 １８．別の蛋白あるいは分子キャリアーに付着あるいは付加された前記いずれか １の請求項記載の蛋白。 １９．細胞由来の汚染がない実質的に純粋な非凝集性β−ガラクトシド結合蛋白 。 ２１．組換えＤＮＡ工学により調製された非凝集性β−ガラクトシド結合蛋白。 ２１．合成的に調製された非凝集性β−ガラクトシド結合蛋白またはその一部。 ２２．受託番号１２２３７を持つ細胞増殖阻害効果を有するネズミの非凝集性β −ガラクトシド結合蛋白についての全ｃＤＮＡ暗号配列を含むＮＣＴＣに寄託さ れたプラスミド。 ２３．受託番号１２２３６を持つ細胞増殖阻害効果を有するヒトの非凝集性β− ガラクトシド結合蛋白についての全ｃＤＮＡ暗号配列を含むＮＣＴＣに寄託され たバクテリオファージλｇｔ１１。 ２４．悪性疾病を治療するための医薬品の製造における動物由来の非凝集性β− ガラクトシド結合蛋白の使用。 ２５．ウイルス感染を治療するための医薬品の製造における動物由来の非凝集性 β−ガラクトシド結合蛋白の使用。 ２６．担体または希釈剤と共に請求項１ないし２１いずれか１に記載の蛋白の有 効量からなる医薬組成物。 ２７．単位投与形態において各単位用量が１０ｎｇないし１０００ｍｇの該蛋白 を含有する請求項２６記載の医薬組成物。 ２８．請求項１ないし２０のいずれか１に記載され実質的に本明細書中の実施例 １ないし９に記載のごとく使用される動物由来の非凝集性β−ガラクトシド結合 蛋白。 ２９．少なくとも、 （ａ）蛋白を発現する単細胞または多細胞いずれかの生物を提供し、（ｂ）該蛋 白の発現を行わせ、 （ｃ）該生物から純粋でない形態の該蛋白を分離し、同定し、次いで（ｄ）該蛋 白を精製に付して発現生物由来の汚染が実質的にない生成物を得る工程からなる 請求項１ないし２０のいずれか１に記載の非凝集性β−ガラクトシド結合蛋白の 製法。 ３０．該生物が動物組織由来の細胞系である請求項２９記載の方法。 ３１．該細胞がヒト細胞系である請求項３０記載の方法。 ３２．該細胞系が連続した細胞系である請求項３０または３１記載の方法。 ３３．該生物が構成的に該蛋白を生産する請求項２９ないし３２のいずれか１に 記載の方法。 ３４．該生物が組換えＤＮＡ工学により該蛋白を生産するように遺伝子操作され る請求項２９から３２のいずれか１に記載の方法。 ３５．該微生物が組換えＤＮＡ工学により該蛋白を生産するように作成された細 菌、酵母、またはカピから選択される微生物である請求項２９記載の方法。 ３６．該蛋白を発現する該生物が受託番号１２２３７を持つＮＣＴＣに寄託され たプラスミドに由来するネズミ非凝集性β−ガラクトシド結合蛋白のｃＤＮＡを 含有するように操作された請求項２９、３０、３１、３２、３４または３５のう ち１に記載の方法。 ３７．該蛋白を発現する該生物が受託番号１２２３６を持つＮＣＴＣに寄託され たファージに由来するヒト非凝集性β−ガラクトシド結合蛋白のｃＤＮＡを含有 するように操作された請求項２９、３０、３１、３２、３４または３５のうち１ に記載の方法。 ３８．遺伝子操作された生物が、 （ａ）ｃＤＮＡが動物由来の細胞から回収されたｍＲＮＡに相当するｃＤＮＡラ イブラリーを提供し、 （ｂ）非凝集性β−ガラクトシド結合蛋白をコードしているＤＮＡの少なくとも 一部にハイブリダイズすることを可能ならしめるヌクレオチド配列を有する少な くとも１個の標識されたポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドプローブで ライブラリーをプローブし、 （ｃ）工程（ｂ）において同定された該蛋白をコードするＤＮＡを切断し、（ｄ ）発現ベクターに該ＤＮＡを連結し、次いで（ｅ）該ベクターを生物に導入する 工程により生産される請求項３４または３５記載の方法。 ３９．該蛋白を発現する該生物がＮＣＴＣ受託番号１２２３７の下で寄託された ＣＤＭ８プラスミドで形質転換された大腸菌ＭＣ１０６１／Ｐ３株である請求項 ３５記載の方法。 ４０．該蛋白を発現する該生物がＮＣＴＣ受託番号１２２３６の下で寄託された バクテリオファージλｇｔ１１でトランスフェクトされた大腸菌Ｙ１０９０株で ある請求項３５記載の方法。 ４１．該細胞系がマウス胚繊維芽細胞である請求項２８あるいは３２記載の方法 。 ４２．該マウス胚繊維芽細胞が生体外で培養される請求項４１記載の方法。 ４３．分離工程（ｃ）をカラムクロマトグラフィーにより行い、精製工程（ｄ） を非凝集性β−ガラクトシド結合蛋白に対するポリクローナルまたはモノクロー ナル抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより行う請求項２９ない し４２のいずれか１に記載の方法。 ４４．請求項１ないし１０および１２ないし１９のいずれか１に記載され、少な くとも、 （ａ）動物由来の組織を処理して、蛋白抽出物を得、（ｂ）該抽出物より非凝集 性β−ガラクトシド結合蛋白を分離し、同定し、（ｃ）該蛋白を精製工程に付し て組織由来の汚染が実施的にない生成物を得る工程からなる非凝集性β−ガラク トシド結合蛋白の製法。 ４５．該組織が胎盤組織である請求項４４記載の方法。