JPH06502726A - 培養細胞による分子のそれらの産生部位におけるインビトロアッセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 培養細胞による分子のそれらの産生部位におけるインビトロアッセイ 本発明は可溶性媒介物質又は感染性粒子の成分のような分子の生細胞による産生 を評価するための方法に関し、その方法において細胞培養及び場合により刺激が 上記産生を誘導するために行われ、産生された分子の量がインビトロで固相免疫 アッセイにより評価される。

臨床生物学は病的状態の医学的評価のすべての面（診断、予後、治療モニタリン グ等）においてかなりの役割を果たす。臨床生物学の有利な分野は血漿中に存在 する循環媒介物質、特にホルモン、例えばすべてのペプチド又はステロイドホル モンのアッセイである。これらパラメーターの分析に関する好ましい操作は免疫 アッセイ法に基づき、その中には当業者に周知である多数の変法：競合又はサン ドイッチ、液相又は固相アッセイ、特にＲＩ　Ａ、Ｉ　ＲＭＡ、　Ｅ　Ｌ　Ｉ　 Ｓ　ＡＳＦＩＡ−ＤＥＬＦＩ＾アッセイがある。

近年、多数の可溶性生物学的媒介物質が検出され、これらは体のバランス又は病 的状態に対応するアンバランスに関して決定的役割を果すが、但しそれらは正常 では血漿中に存在しない。これらの媒介物質は性質上ペプチド（神経ペプチド、 サイトカイン等）であるか又はそれ以外である。これらの媒介物質は測定しつる かなりの量で存在する血漿の正常成分でないため、これら媒介物質の評価による 正常又は病的状態の診査には特に臨床生物学研究所のルーチンワークに適した新 規アプローチ及び特別な実施様式を要する。

これらの概念を更によく説明するため、一般的にリンホカイン、モノカイン、イ ンターフェロン、成長因子、分化因子等を含めたサイトカインを例にとる。サイ トカインは体の様々な細胞により、特にほとんどは血球により産生される。はと んどのサイトカインは本質的にオートクリン（自己分泌）又はバラクリン（傍分 泌）タイプである作用様式を有するが、それらの内分泌活性は制限される。した がって、健常個体の血漿又は血清中で測定されうるサイトカインのレベルは通常 従来の生物学的アッセイ又は免疫アッセイの検出限界以下である。急性病的状況 下においてのみあるサイトカインの循環レベルカ（これらサイトカインの内分泌 作用に対応して血清又１よ血漿中で検出できる。急性期タンノくり質の産生を誘 導する肝臓における又は感染もしくは外傷に際して熱を誘発する脳におけるＩＬ −６の内分泌作用が挙げられる。一般的に言えば、サイトカインの血漿又は血清 レベルｉ！それら内分泌活性の良い鏡であるが、但しそれらオートラ１ノン及び バラクリン活性の悪い鏡である。それにも力１力へわらず、このバラクリン活性 は体の良好な機能にとり重要である。異常刺激（例えばウィルス、細菌又は寄生 虫感染時、外傷又は熱傷時、薬品又は毒物の摂取後あるいは代わりにアレルゲン との接触後等）又は体の病的機能不全（新生物又は変性疾患、炎症又は自己免疫 疾患、遺伝子欠失等）はサイトカイン産生の異常を起こすことがある。こうして サイトカインを産生ずる細胞を研究すること及び産生の過剰又は欠乏を証明する ことが可能である。

サイトカインの産生による所定刺激に応答する産生細胞側の能力から細胞の機能 状態（産生されるサイトカインのタイプ及び量、産生の速度論、刺激に対する感 度、刺激における補因子の必要性又は不必要性等）を評価することができる。こ のため、例えば診断又は予後（例えば、所定状況下で起きる敗血症性ショックの リスク）にとり非常に大きな意義を有する細胞の活性化又は前活性化の状態につ いて明確化することが可能である。“産生能力”のこれら測定の生物医学的意義 は血漿又は血清サイトカインの測定とは異なり、それと相補的である。このため このタイプの試験により得られる情報は簡単な血漿又は血清アッセイによって得 ることができない。

非常に考慮すべき可能性があるこの診査方法は、これら測定の技術的複雑性のた めに、これまでほとんど用いられなかったか又は調査及びリサーチ研究所のみで 用いられてきた。

実際上これまで、単核細胞の産生能力の測定は＝１、研究中にある細胞の単離及 び精製；２、人工培地中におけるこれら細胞の培養；３、従来の生物学的アッセ イ又は免疫アッセイ用培地の一部のサンプリング；及び ４、免疫アッセイキットのような適切な技術フォーマットでアッセイを別々に実 施する； ことからなるマルチステップ操作で実施された。

いくつかの問題がこれらの異なるステップに伴うニー細胞の単離及び精製では血 球の異なる副集団を多少意図的に選択してしまう。精製毎の収率も異なるかもし れない。単離及び精製プロセス自体も細胞の未制御活性化を引き起こすことがあ る。

一人工培地での培養は全血の場合に存在しかつ細胞活性化の調節に関与する細胞 −分子相互作用を細胞から奪い取る。

一マルチステップ操作は単調で退屈であり、容易に自動化されないが、それは細 胞の培養後に上澄は回収されて適宜に細胞成分を除去するため遠心されねばなら ず、その後でそれらが利用可能な生物学的又は免疫学的（酵素又は放射線免疫学 的）方法により（直接に又は凍結形で貯蔵後にいずれかで）アッセイされるから である。

一般的に言えば、これらの困難性はインビトロで免疫アッセイを用いて細胞によ る可溶性媒介物質の産生を評価することが望まれる毎に再現される。

本発明の主題はインビトロで生細胞による可溶性媒介物質又は感染性粒子、特に ウィルス粒子の成分のような分子の産生を免疫技術により評価するための方法で あり、その場合に産生が起きる細胞培養と免疫アッセイの免疫捕捉段階は全く同 一の支持容器複合体で実施される。

換言すれば、培養用の支持体及び免疫アッセイ反応用の支持体は連続段階の正常 評価プロセスで分離される代わりにアッセイされる分子の産生段階時に双方とも 一緒に存在する。

本発明はこの評価方法のためにデザインされかつそれに適した技術フォーマット 、アッセイの成分が特に支持体内部で支持体の固相又はビーズのような固相に結 合された抗体の杉で既に一体化された細胞培養支持体を含むあらゆるフォーマッ トに特に関する。この支持体とは別に、そのフォーマットは実施される適用例に 従い培養と産生部位での現場アッセイに適したすべての培地又は試薬を含むこと ができる。

研究下にある細胞群の刺激と一緒の又はそれなしの培養と産生部位において単一 ステップでアッセイに要される免疫捕捉を一体化した現場アッセイ法とその対応 技術フォーマットは、例えば刺激に要される成分と関心あるアッセイに要される 成分の存在下において微量滴定プレートのウェルで研究される細胞群を培養する ことからなる。ユーザーにより選択された時間に、培養は固相を洗浄することで 遮断され、アッセイは培地の移転なしにプレートで直接視覚化される。

このため更に詳しくは、本発明の主題は可溶性媒介物質又は感染性粒子、特にウ ィルス粒子の成分のような分子の生細胞による産生を評価するための方法であっ て、その方法において細胞培養及び場合により刺激は上記産生を誘導するために 行われ、産生された分子の量はインビトロで固相免疫アッセイにより評価され、 即ち：ａ）細胞培養及び適宜に刺激は、アッセイされる分子に特異的な捕捉成分 が結合されているアッセイの固相を組み込んだ容器において場合によりトレーサ ーの存在下で行われる：及び ｂ）培養期間が経過したとき、固相の洗浄とアッセイに要される様々な他の可能 な試薬、特に固相存在下におけるトレーサー用の基質のインキュベート後に、固 相に結合されたトレーサー又はその上記基質により放射されるシグナルが測定さ れる。

好ましくはステップｂ）において、トレーサー及び固相は培養に用いられた容器 でインキュベートされる。

トレーサーが酵素で標識される場合、アッセイに要される上記試薬にはその酵素 用の基質を実際上含むが、これは固相の上記洗浄後にインキュベートされ、しか る後その基質により更に正確に放射されたシグナルが測定される。

“組み込む１とは本出願においてアッセイ用の固体支持体が培養用の支持体に物 理的に依存しても（例えばウェル又は培養チューブの底）又は物理的に依存しな くてもよい（例えば培養支持体に加えられるビーズ又は球体）ことを意味すると 理解されるが、重要な特徴は培養用及びアッセイ用の支持体の同時存在である。

゛培養容器′とは培養が行われる容器を表すと理解される；それは免疫捕捉が行 われる固相でも又はそうでなくてもよい。

実際に、最も意外なことに、培養に関与する成分及び試薬とアッセイに要される 成分及び試薬はニー一方において、培養条件下において同支持容器で接触及び使 用された場合に安定で十分に適合したが、これは特に同相及びトレーサーに結合 された捕捉成分にあてはまる。及び 一他方において、培養とアッセイされる分子の産生の質を否定的に干渉しない： ことが発見された。

一部のケース、特にサンドイッチタイプアッセイにおいて、トレーサーは固相の 存在下でインキュベートしてもよく、後者の第一洗浄は細胞培養とその免疫捕捉 によりアッセイされる分子の産生後に行う。トレーサーのインキュベートと同相 の第二洗浄後に、放射されたシグナルは適宜にアッセイに要される他の試薬と共 にインキュベート後に測定される。

本発明による方法の全体的にみて有利な変法によれば、固相は、アッセイされる 分子に特異的な捕捉成分が特に吸着又は化学結合により結合された培養容器の内 表面からなる。

もう１つの変法によれば、アッセイの固相は細胞培養容器と物理的に依存しない １以上の成分からなる。例えば、それは特に吸着又は化学結合により上記捕捉成 分で被覆されたビーズを含むことができる。上記固相は培養開始時又は培養中の いずれで上記容器中に加えてもよい。

物理的に依存しない成分としては、把持てきる部分、特に蓋に堅固に付着された 成分も挙げられるべきであり、こうしてその成分は培養ステップ後にもう１つの 容器に移すことができる。

本発明を説明する態様において、場合により活性化剤、即ち産生を刺激する剤を 含有した適切な培地で適宜に希釈された研究される細胞群は、測定される可溶性 媒介物質の産生が起きる培養支持体に定量的に分配されるが、この支持体は支持 体である固相に適切に結合された抗体又は抗原の形で今度のアッセイの必須成分 を最初から含む。選択された時間に、培養は細胞の適切な洗浄により遮断され、 産生された媒介物質のアッセイは培地を更に移すことなく支持体で直接終えられ る。

このため例えば、具体的態様において、新鮮な採取全血は場合によりＰＨＡ、Ｌ ＰＳ等のような活性化剤を含ａした培地で例えば５又は１０倍希釈され、この細 胞懸濁液はアッセイに要される抗体が既に結合された微量滴定プレートに分配さ れる。プレートは標準条件下（温度、湿度、０　及びＣＯ２の分圧等）で選択さ れた期間、例えば１時間〜３日間にわたりインキュベートされる。この期間の終 了時に、プレートは細胞を除去してプレートに結合された抗体と培養中に産生さ れた抗原（例えばサイトカイン）を保存させることができる適切な溶液を用いて 洗浄される。トレーサー抗体、即ち例えば酵素又はアイソトープで標識された抗 体はウェルに加えられるか又は一方このトレーサーは初期培地に最初から存在す ることができる。次いでトレーサー及びひいては測定される媒介物質の視覚化は 従来の方法に従い微量滴定プレートで直接実施される。

トレーサー、即ち例えば酵素又は放射性アイソトープで標識された抗体は培地中 への細胞の初期分配時に（この培地に最初からトレーサーを組み込むことができ る）、培養のいずれか他の後の時期に又は細胞の洗浄後であっでも培養ウェルに 加えてよい。

産生された望ましい分子の量は、放射性トレーサーのケースで放射能の直接測定 により、酵素トレーサーのケースで酵素視覚化剤との反応後に又はいずれか他の 常法により同条件下でインキュベートされた標準サンプルから得られる標準曲線 と比較した外挿推定により決定される。

免疫学的方法によりアッセイでき及びインビトロで細胞により産生されるいかな る分子も本発明に従い分析される。特にサイトカイン、モノカイン、リンホカイ ン、成長因子、分化因子、ホルモン、神経ペプチド、キニン、ヒスタミン、好酸 球のカチオン性タンパク質、主要塩基性タンパク質又は他の脱顆粒マーカー、凝 固因子、可溶性レセプター、付着分子及び細胞外基質と産生が細胞培養により起 こされる感染源、例えばウィルス粒子の分子が挙げられる。

感染性粒子のケースにおいて、アッセイはウィルス、抗原性ウィルス成分及び／ 又は他の細胞内微生物及び／又はそれらの抗原成分に適用できる。

細胞に関して、血液は細胞成分が循環している組織であるという事実のために本 発明による方法に特によく適している。しかしながら、本発明による技術は血球 以外の細胞タイプにも広げてよい。

全起源の細胞がそれらの天然環境又はそれ以外において本発明に従い使用される 。例えば、希釈されたもしくはそうでない全血又は単離及び精製された血球；滑 液、胸膜液、腹膜液、脳を髄液等のような他の生物学的液に由来する細胞；肝臓 、皮膚、腺、腫瘍等の固体組織から単離された細胞：ヒト又は動物細胞系；固体 組織から抽出された細胞、特に肝臓パンチバイオプシーから抽出された肝細胞又 はクツパー細胞、固体組織の断片、特に上皮組織の断片又は腫瘍断片が挙げられ る。

本発明の方法によれば、アッセイされるパラメーターの自発的（即ち未刺激）産 生又はその刺激産生を測定することができる。非常に多数のアクチベーターが研 究下にある細胞及びパラメーターと結果の予想される意義に応して可能である。

例えばニ ー細胞内活性化系で作用する非特異的ポリクローナルアクチベーター、特にホル ボールエステル（ＴＰＡ等）、イオノホア（＾２３１８５、イオノマイシン等） ；−ある細胞群にとり選択的なポリクローナルアクチベーター、例えばレクチン 、ＰＨＡ、ＣｏｎＡ　（コンカナバリン）　、ＰＫＭ、ＬＰＳ　（リボ多糖）、 内毒素；−抗体タイプの特異的アクチベーター、特に抗ＣＤ３、抗１ｇＭ、膜結 合分子に対する抗体又は細胞活性化に関与するレセプターニ ー精製された又はそうでない合成又は天然抗原タイプの特異的アクチベーター、 例えば自己免疫疾患の自己抗原、細閑、ウィルス又は寄生虫源の抗原、アレルゲ ン、超抗原ニ ー薬理研究に向けた細胞レセプターの薬品又はサイトカインさえも含めた天然又 は合成リガンド。

が挙げられる。

本発明の方法においては、サイトカインの検出を増幅させるため阻害剤、例えば サイトカインレセブター又はサイトカイン結合タンパク質を中和する抗体を用い ることもできる。

培地への添加剤として、アッセイされる媒介物質の産生調節に故意に干渉するた め、アッセイされない媒介物質に作用する剤又はこれらの媒介物質自体を用意す ることも可能である。例えば、中和抗体でＩＦＮ−γを中和すればこの阻害拘束 から解放されたＩＬ−４産生を増幅させることができる。外来ＩＬ−４の添加は 測定が望まれるＣＤ２３の産生を刺激できる。

比較及び再現しうる結果を得るため、適用毎に培地及び培養条件は標準化される ことが重要である。下記例の大部分において、ＲＰＭ＋　１６４０が培地又は基 本希釈培地として用いられ、インキュベートが水で飽和された雰囲気下３７＠で １〜７２時間にわたり行われる。非常に多数の変法が特に研究下にある細胞タイ プに依存して培地及び培養条件に関して明らかに可能である。

洗浄は本発明による方法の重要ステップであるが、その理由は培養及びアッセイ 用の共通支持体に適宜付着した細胞が例えば酵素反応又は吸着測定のようなアッ セイの最終ステップに対するいかなる干渉も回避するためアッセイ成分を分解す ることなく十分に除去されるべきだからである。例えば、ウェルの底に付着した 細胞は酵素用の基質を活性化して擬似陽性シグナルを与えることができる。洗浄 では抗原−抗体複合体の劣化なしに細胞を完全に脱離させるべきである。

洗浄培地に加えられることが好ましい細胞“脱離剤。

としては特に −ＥＤＴＡＳＥＧＴＡのようなキレート化剤；−トリプシン、ジスパーゼタイプ 等のようなタンパク質分解酵素； −ツイーン又はトリトンタイプ等の界面活性剤；−多糖タイプ、特にヘパリン又 はペプチドタイプ（例えば、ＲＧＤＳ配列等を含む）の付着阻害剤；−又はこれ ら異なる因子の混合物。

かある。

本発明の好ましい態様において、展開される洗浄溶液はタンパク質分解酵素、例 えばトリプシンを含有する。

使用条件下において、これらのタンパク質分解酵素は固相に結合されたアッセイ 成分（Ａｇ−Ａｂ複合体）を破壊しない。

洗浄条件はマニュアルでも又は好ましくは自動であってもよく、標準的な方法で 繰り返される。

本発明によれば、アッセイは固相免疫アッセイであり、固相は研究されるパラメ ーターの産生時に細胞培養物と共に存在する。

それが固相技術であるかぎり、アッセイは当業者に周知の様々な原理、例えば競 合又はサンドイッチ試験に従うことができる。視覚化の技術は当業者に知られる いずれかの性質、例えば酵素、アイソトープ、発光、ケイ光、比濁回折等に基づ くことができる。

使用できるアッセイ法は特にニ ーペルオキシダーゼで又は勿論ペルオキシダーゼ以外の酵素、リボヌクレアーゼ 、アルカリホスファターゼ、アセチルコリンエステラーゼ等で標識されたトレー サー抗体を用いるＥＬＩＳＡタイプのサンドイッチ法；−捕捉抗体がチューブ／ プレート／抗体被覆ビーズタイプの固相上にあるかぎりにおいて抗原又は適宜に 抗イデイオタイプトレーサー抗体（ＥＬＩＳＡ参照）を用いるＥＩＡタイプの競 合法； 一放射性トレーサー抗体（Ｉ、■、　Ｈ等）を用いるＩ　ＲＭＡタイプのサンド イッチ法；−捕捉抗体がチューブ／プレート／抗体被覆ビーズタイプの固相上に あるかぎりにおいてトレーサー抗原（ＩＲＭＡ参照）を用いるＲＩＡタイプの競 合法；−他タイブのトレーサー（発光、ケイ光等）に基づくサンドイッチ又は競 合タイプのすべての免疫アッセイ法；更に一般的には 一サンドイッチ又は競合以外の原理、特に凝集に基づくすべての他の固相免疫ア ッセイ法； である。

固相に結合される捕捉成分はアッセイされる分子に特異的な抗体、抗原もしくは レセプター又はアッセイされる分子に特異的ないずれか他のリガンド、特に可溶 性レセプターのリガンドである。同様のことは使用されるトレーサーにもあては まる。

使用できる抗体は全体で又は断片の形でモノクローナル、オリゴクローナル（即 ち、同一抗原の異なるエピトープヲ認識するいくつかのモノクローナル抗体が用 いられる）又はポリクローナルである。それらはアッセイの質に応しτ選択され 、更にアッセイされるパラメーターの産生に関するそれらの生物学的性質、その 溶解性、その保存性、その捕捉性、結合分子に関するその非マスク性に応して選 択されるか又はそうされない。

実際上好ましくは、抗体はアッセイにおけるそれらの“静的な質だけでなく、そ れらが媒介物質の（例えば産生フィードバックループに干渉することによる）“ 動的な”産生、（例えば媒介物質の分解を妨げることによる）その安定性、（例 えば細胞による媒介物質の再摂取及び消費を妨げることによるか又はそれを複合 化できる可溶性成分でそれがマスクされるのを妨げることによる）そのアベイラ ビリティ等に与える影響に関して選択及び選別される。

ある特別な適用例の関係において、特に全面の活性化細胞により産生されるサイ トカインのアッセイに関して、アッセイに関与する抗体はアッセイされるサイト カインのバラクリン及びオートクリン活性に干渉しないことが好ましいが、これ は適宜にこれらサイトカインの活性化及び産生のプロセスに影響を与える。事実 、これはそのケースであったが、これらの抗体は刺激時に存在することから、一 部サイトカインの最終産生が変えられたことがある。これはアッセイに用いられ た抗体がアッセイされるサイトカインの生物活性を変えず（中性抗体）、即ちこ れらの抗体が好ましくは基質（細胞レセプター）に対するサイトカインの結合部 位とは異なるエピトープによりサイトカインを認識しなければならないことを意 味する。

この概念は下記２例で説明される： １）ＩＬ−２ ＩＬ−２はＩＬ−２産生Ｔ細胞に存在する特異的レセプターに結合することでそ れ自体の産生に正のオートクリン作用を有する。現場アッセイに関与する抗体の １つがＩＬ−２とそのレセプターとの結合を阻止するならば、ＩＬ−２の最終産 生は減少される。対照的に、ＩＬ−２と固相との単純な結合はその生物活性を壊 さない。

２）ＩＬ−１ 単球により産生されるＩＬ−１はＰＨＡによるＴ細胞の活性化を増強する。逆に Ｔ細胞は単球によるＩＬ−１の産生を阻害するＩＬ−４を産生ずる。ＩＬ−１の 動的アッセイに関与する抗体の１つがＴ細胞に対するその生物活性を阻止するな らば、ＩＬ−４産生は減少され、ＩＬ−１産生に関する負のフィードバック効果 はあまり起きなくなり、ＩＬ−１の産生を増大させる。

特定のサイトカイン又は既定群のサイトカインの産生は本発明に従いニ ー　“マルチ被覆された”　（即ち異なる特異性のいくつかの抗体で被覆された ）微量滴定プレートを用い、適切なトレーサーの選択でアッセイの特異性を与え ることにより：又は 一抗体で又は抗体の組合せで被覆された微量滴定プレートを用いて特異性を与え ることにより（したがって、単一のサイトカインに特異的であるトレーサーだけ でなく、関心ある異なるサイトカインに対する抗体の混合物を含ませることも可 能である）： いずれかで研究される。

更に詳しくはＩＶｊ、様において、本発明の主題はいくつかの上記分子がアッセ イされる方法であり、即ち：ａ）細胞培養はアッセイされる分子が存在する多数 群の容器で同時に行われるが、容器とは微量滴定プレートのようなものである； ｂ）各容器に組み込まれる固相に、各々が上記分子の１つを認識するいくつかの 捕捉抗体群、即ちアッセイされる分子のすべてを認識する異なる特異性の抗体の 混合物が結合される； Ｃ）各分子は各対応分子に特異的な異なるトレーサーと共に各容器内でインキュ ベート後にアッセイされ名。

もう１つの態様において、本発明の主題はいくつかの上記分子がアッセイされる 方法であり、即ち：ａ）細胞培養はアッセイされる分子が存在する微量滴定プレ ートのウェルような多数群の容器で同時に行われる： ｂ）各群の容器に組み込まれる固相に、おそらく異なる分子を各群の容器におい て認識する既定特異性の抗体が結合される；及び Ｃ）各分子は対応分子に特異的なトレーサー又は異なる分子に特異的なトレーサ ーの混合物である共通トレーサーと共に各容器のインキュベート後にアッセイさ れるが、その特異性は捕捉抗体により与えられる。

わかるように、好ましくは、アッセイされる分子用のトレーサー又は捕捉成分と してアッセイに関与する固相に結合された抗体はそれらが上記分子の産生及び／ 又はその生物活性に影響を与えないエピトープによりアッセイされる分子を認識 しうるように選択される。

このため除去できるか又はそうでない１２〜９６ウエルからなる滴定プレートの 例が考えられるならば、このプレートは異なるウェルに対応して異なる培養条件 下で（短又は長時間にわたりアクチベーターと共に又はなしに等）単一バラメー ターの産生をアッセイするように工夫される。そのプレートは異なるパラメータ ーを測定するようにデザインしてもよい（例えばＩＬ〜６用のａウェル、ＴＮＦ 用のｂウェル、ＩＬ−１用のＣウェル等）。

このケースにおいて、前記のように２つのアプローチが可能であるニ ー異なる特異性の抗体（抗ＩＬ−６、抗ＴＮＦ。

抗ＩＬ−１等）が結合された支持体が用いられるが、その場合にアッセイの特異 性はトレーサー抗体（例えば抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦ）により与えられる。オペ レーターにとっての利点は支持体、このケースではプレートで彼の異なる条件を 自由にそろえ、その後で加えられるトレーサーにより研究下にあるパラメーター を選択できることである（“マルチ被覆プレート”）；又は−存在する抗体が単 一の分子特異性（例えば抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦ）のみを有する支持体が用いら れるが、但し異なる特異性（抗ＩＬ−６、抗ＴＮＰ等）の標識抗体の混合物から なるトレーサーも利用できる。このケースにおいて、アッセイの特異性は支持体 により与えられ、このため事前に固定される。オペレーターにとっての利点は彼 が支持体への分配前又はその後であっても培地に添加できる共通トレーサーを有 することである（“マルチパラメータートレーサー″）。

培養期間後に直接測定しつるレベルで産生されるいくつかのサイトカインは長期 培養期間後に免疫アッセイの最大アッセイ能力よりもかなり大きなレベルで産生 されることがある（例えばＩＬ−６及びＩＦＮγ）。従来のアッセイにおいて、 過度に高いサンプルはアッセイできるように十分に希釈される。本発明による現 場アッセイのケースにおいて、サイトカイン産生はアッセイ部位で起きることか ら、このような希釈は不可能である。現場アッセイのこの限界を回避するため、 本発明によれば単一実験中に高感度アッセイ及び減感化アッセイを双方とも実施 することができる。

このケースにおいては、下記成分ニ ー測定することが望まれる分子に特異的な抗体で被覆された微量滴定プレート； 一アクチベーター及び／又は測定することが望まれる分子に特異的なトレーサー 抗体を最初から場合により含有できる培地Ａ； 一アクチベーター及び／又は測定することが望まれる分子に特異的なトレーサー 抗体とアッセイを減感する特定量の寒冷抗体を最初から場合により含有できる培 地Ｂ；−標準サンプルの溶液； 一洗浄溶液； 一酵素トレーサーのケースにおいて酵素視覚化剤及び停止溶液； 一接合が培地に組み込まれないならば、適切なアクチベーター； 一接合が培地Ａに組み込まれないならば、適切なトレーサー抗体の溶液Ａ； −これらの成分が培地Ｂに組み込まれないならば、適切なトレーサー抗体とアッ セイを減感する特定量の寒冷抗体の溶液Ｂ； が用いられる。

試験される細胞サンプル（適宜には全血）は培地Ａ（又はトレーサー溶液Ａの存 在下）及び培地Ｂ（又はトレーサー溶液Ｂの存在下）で同時に培養される。標準 系列の濃度範囲内に属する培地Ａ（トレーサー溶液Ａの存在下）で産生されるサ イトカイン濃度の場合、培地Ａ（トレーサー溶液への存在下）で得られる値は標 準系列で直接読み取られる。最終標準点以上に多く培地Ａ（トレーサー溶液Ａの 存在下）で産生されるサイトカイン濃度の場合、培地Ｂ（）レーサー溶液Ｂの存 在下）で得られる対応値は標準系列で直接読み取られ、既定の補正率で掛は算さ れる。

このような減感化及び補正率規定方法が可能であることを示したことも本発明の 目的である。

本発明の主題は更にアッセイの減感化により区別され、アッセイされる分子に特 異的なトレーサー抗体と同特異性の未標識抗体との混合物により得られる前記方 法であるが、減感化によれば既定の補正率によりアッセイの範囲を高い値まで広 げることができる。

本発明の主題は更に、アッセイを減感化して標準範囲と比べて広い濃度範囲にわ たり読取れるようにするため、アッセイされる細胞サンプルがアッセイされる分 子に特異的なトレーサー抗体を含む第一培地とアッセイされる分子に特異的なト レーサー抗体及び同特異性の未標識抗体を含む第二培地で同時に培養される方法 である。

非網羅的ではあるが、本発明の方法の下記利点が挙げられる： １、培養／アッセイ一体化のプロセスにより、実施及び速度の非常に大きな簡便 性が達成される。

２、その方法は従来の方法にとり必須である細胞及び細胞／上澄分離用の装置（ 例えば遠心機等）を要しない。

３、細胞取扱いはかなり減り、このため細胞の活性化又は意図しない選択と結果 の解釈をゆがめる原因に関して減少させる。

４、結果の非常に大きな再現性が観察される。

５、操作の全部又は一部の自動化の可能性は特に従来のマルチステップ方法によ る上澄回収、貯蔵及び再分配ステップの削除結果としてかなり大きい。

６、簡便化、少ない細胞取扱い量及び自動化の可能性の結果として、（肝炎、エ イズ等による）感染汚染のオペレーターリスクは非常に低い。

７、媒介物質の産生及びアッセイの第一ステップは細胞の天然（又は選択された ）環境下で実施できる；最後に及び最も特殊には ８４臨床生物学研究所に臨床診査、即ち産生能力の研究の新分野への更に容易か つルーチン的なアクセスが与えられる。

本発明の主題は更に本発明の方法を実施する上で用いられる技術フォーマットと 様々なパラメーターの産生を評価するための標準化キットである。

これらのキーメトは本発明によるアッセイの培養及び開始のステップに共通した 支持容器並びに適宜にアッセイの培地、洗浄培地、アクチベーター、視覚化剤及 び標準サンプルと本発明によるアッセイに要される他の試薬からなる。更に詳し くは、これらのキットはニー上記固相に免疫アッセイの捕捉成分が結合され、こ の相が上記容器に組み込まれるか又は組み込むことができる（即ち容器に物理的 に依存しているか又は依存し７ていない）アッセイ容器として役立つ細胞培養用 の上記支持８器−並びに 一トレーサー、標準サンプルと培地、細胞希釈培地、洗浄培地及び測定されるパ ラメーターの産生を刺激又は調節する剤を含めたアッセイのすべての成分；を含 む。

わかるように、固体支持容器は滴定プレートの形に組み立てることができるウェ ルの形又はユーザーの便宜及び標準化装置（例えばワッシャー）との適合化のた めに組み立ててよいチューブの形であることが好ましい。特別な適用向けの他の 支持体（ベトリ皿、区画化されたガラススライド等）又は培養支持体とアッセイ 支持体との物理的分離でさえも、それらがアッセイされるパラメーター、例えば 抗体被覆ビーズの産生中に再組立てされるようにデザインされているかぎり適切 である。

変法によれば、トレーサー及び／又は活性化剤（例えばＰＨＡ、ＬＰＳ％Ｃｏｎ Ａ等）はアッセイに関与する抗体で被覆された上記容器、特にマイクロプレート のウェルに乾燥された（蒸発又は凍結乾燥により乾燥された）形で組み込まれる 。この特殊ケースにおいては、適量の培地存在下で新鮮な採取全血をマイクロウ ェルに加えるだけでよい。

変法によれば、標準サンプルはアッセイに関与する抗体で被覆された上記容器、 特にマイクロプレートのウェルに乾燥された（蒸発又は凍結乾燥により乾燥され た）形で組み込まれる。この特殊ケースにおいては、標準を水て再水和してサン プルの場合と同量の培地を加えるだけでよい。

本発明による方法及び技術フォーマットは複数の適用例を有するが、その一部は 的中で詳細に説明される。下記の異なる適用例が非網羅的ではあるが挙げられる ：１、血球によるサイトカインの産生に関する能力の評価希釈された全血が用い られるが、但し適切であれば事前の細胞分離を実施することができる。自発的サ イトヵイン産生と刺激された産生について研究することができる。産生されるサ イトカインの量、産生の速度論及び異・なる濃度における様々なアクチベーター の刺激力等について分析することができる。このタイプの研究によれば特にニ ー先天的又は後天的不全、インビボで強い刺激の条件下における細胞枯渇、活性 が評価される毒物又は免疫抑制薬品の作用、免疫疾患の関係下における調節不全 、腫瘍状態に関連する細胞分布の破壊等に関連した産生不足；−病的状態、臓器 移植、感染状態、自己免疫疾患、癌等に伴う産生細胞の活性化の異常状態に対応 した過剰産生： について評価することができる。

これらの分析から診断価値（例えば先天的又は後天的免疫不全；臓器拒絶等）； 予後に関する価値〔例えば自己免疫状ｇ（多発性硬化症、糖尿病等）出現の再発 リスク；合併症（敗血症性ショック等）発生のリスク〕のある情報；治療効力（ 例えば免疫抑制治療）に関する情報を得る。このためこれら種類の情報は決定及 び医療操作に影響を与え、したがって臨床生物学の範囲内にもっばら属する。

２、インビトロ誘発試験 アレルゲンに対する感受性は特異的血漿ＩｇＥのアッセイ又はインビトロ誘発試 験により決定される。これら双方の方法は大きな欠点を有し、相対的に非常に信 頼性があるだけである。

本発明によれば、アレルギー患者の細胞（即ち、例えば希釈全血）はアレルギー 媒介物質、例えば好塩基球又は好酸球に由来する媒介物質（例えば好酸球のカチ オン性タンパク質、塩基性主要タンパク質及び他の脱顆粒マーカー、ＥＣＦＡ、 ＮＣＦＡ等）のアッセイに用いられる支持体でインキュベートされる。このケー スにおける刺激剤は攻撃的アレルゲンである。

インビトロでアレルゲンに応答するアレルギー媒介物質の産生の評価は本発明に よる方法及びフォーマットの関係から非専門研究所でも利用しやすくなる″イン ビトロ誘発試験゛に相当する。

３、特異的免疫競合試験 患者の精製された又はそうでない細胞は特異性抗原と接触せしめられ、この抗原 に対する応答能力が本発明によりサイトカイン産生を測定することで評価される 。説明として、２例が挙げられる： ａ、患者の細胞は推定自己抗原、例えば多発性硬化症における“ミニリン塩基性 タンパク質”又はその抗原断片の存在下でインキュベートされる。この自己抗原 に対する異常応答は本発明による技術フォーマットでサイトカイン産生の測定に より評価される。

ｂ、ミックスされたリンパ球培養物が本発明による支持体で直接産生される。反 応性は異なるインキュベート時間でサイトカイン産生を測定することにより評価 される（インビトロ適合性試験）。

４、インビトロ薬理研究 媒介物質の産生に関する患者に投与された又は一方インビトロでインキュベート 培地中に存在する薬品の影響は本発明によるフォーマットを用いて容易に研究さ れる。

これによれば治療モニタリング（例えば免疫抑制の効力）又は応答予測を行える 。

５、一体化バイオアッセイ及び免疫アッセイ生物学的アッセイは所定刺激に対す る細胞応答を記録することに向けられている。生物学的アッセイは時には他のア ッセイ法（例えば免疫アッセイ）以上の利点を一部有し、時には選択肢がない。

細胞応答はいくつかの方法で、例えば増殖応答はチミジンの取込みにより、分化 応答は染色により測定される。物質の産生はバイオアッセイで測定される細胞応 答である。このケースにおいて、試験は３ステツプ、実際のバイオアッセイ、上 澄の回収（及び貯蔵）及び免疫アッセイを用いる上澄のアッセイで行う。本発明 による方法によれば異なるステップを一体化することができる（例参照）。

一般的に言えば、標的細胞（例えば細胞系）は細胞応答を評価するためパラメー ターのアッセイ用成分を既に保持した支持体において刺激剤と接触せしめられる 。インキュベート後に細胞は洗浄され、アッセイの視覚化が更に移動させること なくその支持体で直接実施される。

本発明の他の特徴及び利点は下記例から明らかになるであろう。

一部１〜６は単一サイトカインフォーマットに関する例１の実験の結果について 示す。

一部７〜１２はマルチサイトカインフォーマットに関する例２の実験の結果につ いて示す。

−図１３は例３の安定性実験の結果について示す。

−図１４〜１６は例４の洗浄実験の結果について示す。

−図１７及び１８は例５の現場アッセイ及び従来アッセイによるＩＦＮγのアッ セイの結果について示す。

−測定することが望まれるサイトカインに特異的な抗体で被覆された微量滴定プ レート 一培地＋ＰＨＡ５μｇ／Ｉｌ＋　Ｌ　Ｐ　３２５μｇ／ｗ＋＋　トレーサー抗体 の溶液（溶液Ａ）又はＰＨＡ及びＬＰＳなしく溶液Ａ−）を含有したフラスコ 一アッセイされるサイトカインの標準溶液（標準溶液１〜ｎ）を含有した一組の フラスコ −濃洗浄溶液（溶液Ｂ）のフラスコ −トリプシンを含有した中間洗浄溶液（溶液Ｃ）のフラスコ 一トレーサー抗体がペルオキシダーゼで標識された酵素に関する基質の濃溶液（ 溶液Ｄ）のフラスコ−基質を希釈する緩衝液（溶液Ｅ）のフラスコ−酵素反応を 阻止するＨ２Ｓ０４（溶液Ｆ）のフラスー標準及び試験サンプルのために用いら れるプレートの部分を区画化する。

−すべでのウェルを溶液Ａ又はＡ−２００μｇで充填する。

一標準系列の場合、異なる標準ポイント２５μｇを対応ウェルに加える。

一サンプルの場合、２５μｇ／ウェルの全血を加える。

−水飽和雰囲気下３７℃で異なる時間にわたりインキュベートする。

一下記のようにプレートを洗浄する： ・希釈溶液Ｂで４回吸引／洗浄する。

・溶液Ｃ２００μｇでウェルを充填する。

・希釈溶液Ｂで３回吸引／洗浄する。

−基質溶液（Ｅで希釈された溶液Ｄ）２００μｇ／ウェルを加える。

一室温で攪拌下１５分間インキュベートする。

−阻止溶液（溶液Ｆ）５０μｇを加える。

−スペクトル測定器でプレートを読取り、標準曲線を参照して産生されたサイト カインの濃度を外挿推定する。

３）実験 一８サンプルの全血に関して記載及び実施された単一サイトカイン技術フォーマ ットに従い、記載された方法によるサイトカインＩＬ−ＩＢＳ　ＩＬ−６、ＴＮ Ｆα、ＩＬ−２、ＩＦＮα及びＧＭ−ＣＳＦのアッセイ−各サイトカインに関し て、以下が図１〜６で示されている： ・ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＴＮＦα及びＧＭ−ＣＳＦに関してｐｇ／■ｌ、ＩＬ− ２及びＩＦＮγに関して国際単位で表示された、標準サンプル（Ｓ　Ｔ）とサン プル（ＥＣ１〜８）が局在化されたプレートの図により表される実験プラン ・４時間の培養後に読み取られた光学密度を表すプレートの図 ・２４時間の培養後に読み取られた光学密度を表すプレートの図 ・光学密度は一方が４５０ｎｍ及び他方が４９０ｎ■の２回の読取りの総和を表 す。

・プレートの一部は研究下にあるサイトカインに特異的な抗体で被覆されている 。プレートのこの部分で読み取られる値は産生されるサイトカインの量に比例し た特異的シグナルを表す。

・プレートの一部は非特異性抗体で被覆されている（陰影部分）。プレートのこ の部分で読み取られる値はその方法のバックグラウンドを表す。

・４及び２４時間の培養後における標準曲線を参照して外挿推定された、産生さ れたサントカインの濃度を表すチャート ・各サンプルは特異性抗体に関して四重に及び非特異性抗体に関して四重に測定 する。

４）結論： ａ）フォーマットの条件下において、完全に満足しうる見掛けの標準曲線は４及 び２４時間双方の培養後に得られる。

ｂ）これらの条件下において、ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＴＮＦαの有位産生は４ 時間の培養後に観察される。

これらの産生は２４時間の培養後に著しく増加する。

Ｃ）これらの同条件下において、ＩＬ−２、ＩＦＮγ及びＧ　Ｍ　−ＣＳ　Ｆの ａ意産生は２４時間の培養後に観察される。

ｄ）すべてのケースにおいて、バックグラウンドは十分に低い：光学密度単位＜ ０．２ ｅ）すべてのケースにおいて、４回の再現性はひときわ優れている。

これらは下記の場合を除き例１の場合と同一である二一マルチサイトカイントレ ーサー（例えば抗ＩＬ−１抗体＋抗ＩＬ−６抗体＋抗ＴＮＦα抗体）を含有する 溶液Ａ −ＩＬ−１＋ＩＬ−６＋ＴＮＦαマルチサイトカイン標準溶液 Ｂ）実験ブラン： １）列１及び２：抗ＩＬ−１（又は抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦ）単一特異性抗体＋ ＩＬ−１＋ＩＬ−６＋ＴＮＦマルチサイトカイン標準（０，１００，５００及び ２０００　ｐｇ／ａｌｌ）又はサンプル（ＥＣＩ及びＥＣ２）十抗！Ｌ−１＋抗 ＩＬ−６＋抗ＴＮＦマルチサイトカイントレーサーで被覆されたウェル ２）列３及び４：抗ＩＬ−１（又は抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦ）単一特異性抗体＋ ＩＬ−１単−サイトカイン標準（Ｏｌｌｏｏ、５００及び２０００　ｐｇ／ｍｌ ）又はサンプル（ＥＣＩ及びＥＣ２）十抗ＩＬ−１＋十抗ＩＬ−６＋抗ＴＮＦα マルチサイトカイントレーサーで被覆されたウェル ３）列５及び６：抗ＩＬ−１（又は抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦｌ＄１＝特異性抗体 ＋ＩＬ−６単−サイトカイン標準（０，１００，５００及び２０００　ｐｇ／ｍ ｌ）又はサンプル（ＥＣＩ及びＥＣ２）十抗Ｉ　Ｌ　−１，＋十抗ＩＬ−６＋抗 ＴＮＦαマルチサイトカイントレーサーで被覆されたウェル ４）列７及び８・抗ＩＬ−１（又は抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦ）！ｉｔ−特異性抗 体＋ＴＮＦ単−サイトカイン標準（０，１００，５００及び２０００　ｐｇ／ｍ ｌ）又はサンプル（ＥＣＩ及びＥＣ２）十抗ＩＬ−１＋十抗ＩＬ−６＋抗ＴＮＦ αマルチサイトカイントレーサーで被覆されたウェル ５）列９及び１０：抗ＩＬ−１（又は抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦα）単一特異性抗 体＋単一サイトカイン標準（ＩＬ−］又はＩｔ、−６又はＴＮＦ）又はサンプル （ＥＣＩ及びＥＣ２）十用−サイトカイントレーサー（抗ＩＬ−１又は抗ＩＬ− ６又は抗ＴＮＦα）で被覆されたウェル ６）列１１：非特異性抗体＋サンプル（ＥＣＩ及びＥＣ２）十単−サイトカイン トレーサー（抗ＩＬ−１又は抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦα）で被覆されたウェル７ ）列１２：非特異性抗体＋サンプル（ＥＣＩ及びＥＣ２）十抗ＩＬ−１＋十抗Ｉ Ｌ−６＋抗ＴＮＦαマルチサイトカイントレーサーで被覆されたウェル関心ある 各アッセイはニ ー実験プラン 一４時間の培養後に得られた光学密度 −２４時間の培養後に得られた光学密度を示す実験シートにより表される。

結果は図７〜９で表されている。

下記の場合を除き単一サントカインフォーマット参照ニー異なる特異性の抗体コ 抗ＩＬ−１＋抗ＩＬ−６＋抗ＴＮＦの混合物でマルチ被覆されたプレート−ＩＬ −１＋ＩＬ−６＋ＴＮＦマルチサイトカイン標準溶液 Ｂ）実験プラン： ｌ）列１及び２：多特異性抗体（抗ＩＬ−１＋抗ＩＬ−６＋抗ＴＮＦ）＋ＩＬ− １＋ＩＬ−６＋ＴＮＦマルチサイトカイン標準（０，１００，５００及び２００ ０　ｐｇ／ｌ）又はサンプル（ＥＣＩ及びＥＣ２）十単−サイトカイントレーサ ー（抗ＩＬ−１又は抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦ）で被覆されたウェル ２）列３及び４：多特異性抗体（抗！Ｌ−１＋抗ＩＬ−６＋抗ＴＮＦ）＋ＩＬ− １単−サイトカイン標準（０，１００，５００及び２０００　ｐｇ／ｍｌ）又は サンプル（ＥＣＩ及びＥＣ２）十単−サイトカイントレーサー（抗ＩＬ−１又は 抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦ）で被覆されたウェル ３）列５及び６：多特異性抗体（抗ＩＬ−１＋抗ＩＬ−６＋抗ＴＮＦ）＋ＩＬ− ６単一サイ単一サイ機力イン標準００．５００及び２０００　ｐｇ／ｍｌ）又は サンプル（ＥＣ１及びＥＣ２）十単−サイトカイントレーサー（抗ＩＬ−１又は 抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦ）で被覆されたウェル４）列７及び８：多特異性抗体（ 抗ＩＬ−１＋抗ＩＬ−６＋抗ＴＮＦ）＋ＴＮＦ単一サ単一サイシカイン標準１０ ０．５００及び２０００　ｐｇ／ｍｌ）又はサンプル（ＥＣ１及びＥＣ２）十単 −サイトカイントレーサー（抗ＩＬ−１又は抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦ）で被覆さ れたウェル５）列９及び１０：抗ＩＬ−１（又は抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦ）単一 特異性抗体＋単一サイド力イン標準（ＩＬ−１又はＩＬ−６又はＴＮＦ）又はサ ンプル（ＥＣＩ及びＥＣ２）十単−サイトカイントレーサー（抗ＩＬ〜１又は抗 ＩＬ−６又は抗ＴＮＦ）で被覆されたウェル ６）列１１及び１２：非特異性抗体＋サンプル（ＥＣ１及びＥＣ２）十単−サイ トカイントレーサ−（抗ＩＬ−１又は抗ＩＬ−６又は抗ＴＮＦ）で被覆されたウ ェル関心ある各アッセイはニ ー実験プラン 一４時間の培養後に得られた光学密度 −２４時間の培養後に得られた光学密度を示す実験シートにより表される。

結果は図１０〜１２で表されている。

Ｃ）結果の解釈： １）マルチサイトカイン／マル千トレーサーフォーマットに従い得られた標準曲 線の見掛けは測定された３種のサイトカイン：抗ＩＬ−１、ＩＬ−６及びＴＮＦ αに関して完全に満足できる。

２）単一サイド力インフォーマットと比較して、マルチサイトカイン／マルチト レーサーフォーマットで得られたシグナルはわずかに増幅され（これはＩＬ−６ の場合で特に顕著である）、測定に影響を与えることなくアッセイを高感度化す るが、その理由は効果が標準及びサンプルの双方に関して観察されるからである 。

３）測定されるサイド力インに関して観察されるシグナルの特異性は完全である 。例えば：抗ＩＬ−１＋抗ＩＬ−６＋抗ＴＮＦマルチトレーサーの存在下におい て特異的ＩＬ−１抗体で被覆されたプレートでのＩＬ−１のアッセイにおいて、 ＴＮＦ又はＩＬ−６標準の存在下のみならずＩＬ−１標準又はＩＬ−１＋ＩＬ− ６＋ＴＮＦマルチ標準の存在下でもシグナルはない。

４）マルチサイトカイン／マルチトレーサーフォーマットで４時間及び２４時間 の培養後におけるＴＮＦ。

ＩＬ−１及びＩＬ−６の産生及び現場アッセイは完全に満足でき、単一サイド力 インフォーマットで得られる産生及びアッセイに匹敵する。

５）マルチサイトカイントレーサーで観察されるバックグラウンドは常に十分低 く　（光学密度単位＜０．２）、単一サイトカイントレーサーの場合に匹敵する 。

６）結果の再現性は優れている 結論として、マルチパラメータートレーサー原理及びマルチコーティング原理の 双方によれば、そのフォーマットは全く首尾一貫した再現性ある結果を示す。

１）実験の説明： ＴＮＦα標準（二重）及び４サンプル（四重）を４〜７２時間の培養期間にわた り単一サイトカイン操作に従いインキュベートする。非特異的シグナルのモニタ リングはトレーサー抗体の非存在下又は非特異性抗体で被覆されたウェルのいず れかにおいてサンプルをインキュベートすることにより行う。

２）実験ブランコ 結果シートは以下を示すニ ー４．２４．４８又は７２時間の培養後に得られた標準曲線（光学密度単位） 一対応培養期間中にその場で産生されたＴＮＦαの対応値（ｐｇ／ｍ１） 一光学密度単位でトレーサー抗体又は被覆特異性抗体の非存在下で観察された非 特異的シグナル３）結果：これらは図１３で示されているａ、標準曲線のプロフ ィルは３７℃で７２時間の培養後であっても速度論研究中全般にわたり非常に安 定なままである；異なる標準点に対応するＯＤ値は４時間の培養後に得られたＯ Ｄ値の常に８０％以上である。

ｂ、ＴＮＦの現場産生は培養期間の長さに応じて規則的に増加する。

Ｃ１非特異的シグナルは常に弱い（はとんどＯＤ単位く屹　１）。

結論として、アッセイステップと培養条件との一体化は３日間以上にわたる産生 期であっても本発明による方法において安定性の問題により妨げられない。

例４：洗浄条件 洗浄条件はそれらが抗原−抗体複合体を保存しながら細胞を培養ウェルから完全 に除去できねばならないため重要である。示された実験において、８つの異なる 洗浄条件は単一サイド力インフォーマットに従いＴＮＦαの現場アッセイをモデ ルとして用いて試験した。

実験の記載： 全血のサンプルを単一サイド力インフォーマット（例１参照）に従い２つの抗Ｔ ＮＦ微量滴定プレートに分配する。

一方のプレートは４時間、他方は２４時間インキュベートする。

培養は表で記載された条件に従い洗浄により４又は２４時間後に停止させる。

洗浄の効力はトレーサー及び被覆特異性抗体の存在下で特異的シグナル（最大Ｏ Ｄ値）に悪影響を与えることなくトレーサー抗体の非存在下又は被覆特異性抗体 の非存在下で観察されるＯＤ値（最小ＯＤ値）により決定する。

実験プランニ ー８つの洗浄条件を表す表 一ウエルをそれらが行われる洗浄に従い局在化させたプレートの図 −４又は２４時間の培養後に読み取られたＯＤ値を表すプレートの図 結果：これらは図１４〜１６で表される１）水＋ツイーン２０のような界面活性 剤は細胞を全部除去せず、非特異的シグナルを生じる（ＯＤ＞０．５）。同組成 を有する中間洗浄液は効果を有しない。

２）水＋ツイーンによる２回の洗浄の間に牛アルブミンが加えられた又は加えら れていないリン酸緩衝液は非特異的シグナルを十分に減少させる。

３）同様の結果は我々が用いた濃度で特異的シグナルに悪影響を与えることなく トリプシンの異なる溶液で得られる。

例５：現場アッセイと従来アッセイによる結果の対応性実験中、正常ドナ一群及 び病者群に関する単一サイトカインフォーマット（例１参照）によるＩＦＮγの 現場産生と従来のアッセイによる対応産生、即ち別々の支持体で培養後別々のス テップによるアッセイとを比較した。

正常群は６サンプルからなり、病者群は９サンプルからなっていたが、これには 手術後の異なる段階における肝移植（Ｌ　Ｔ）をうけた患者２例、結腸癌（ＣＣ ）２例及び骨髄移植（ＭＧ）５例を含む。

４又は２４時間の培養後に異なるサンプルで得られた値は双方のタイプの培養に 関して表及びチャートの形で示される。標準からそれたサンプルは＊（値く標準 ）又は零＊（値〉標準）でマークされている。

２タイプの培養間における相関関係も計算した。

結果：これらは図１７及び１８で表される１）従来アッセイで得られたＩＦＮｒ 値は現場アッセイで得られた値より高い。

２）しかしながら、２方法間の相関関係は優れており（ｐ＜０．０００１でｒ− ０，９７）、非常に有意である。

３）病気の患者は双方の方法で同様にして識別される。

４）現場アッセイ法はＩＦＮγの正常産生を異常産生から識別することができる 。

例６：リウマチ様関節炎における適用 リウマチ様関節炎にかかった患者の希釈全血によるサイトカインの産生を正常コ ントロール又は骨関節症にかかった患者の場合と比較した。

こうして測定されたサイトカイン産生のプロフィルは上記病的状態で有意に変わ ることが示された。

特に、リウマチ様関節炎にかかった患者は正常者と比べて著しく増加し及び骨関 節症患者と比較して有意に増加したＩＬ−１、ＴＮＦＳ　ＩＬ−６及び！Ｌ−２ 産生を示す。後者は特にＩＬ−２産生に関して正常より高い値を有し、ＴＮＦ及 びＩＬ−６産生に関して少ない値を有する。

ＩＦＮ−７産生は正常者及び骨関節症患者で同等であるが、但しリウマチ様関節 炎患者で非常に有意に減少することは興味ある。ＧＭ−Ｃ５Ｆ産生は３群全部で 等しい。

これらのデータからこれらの病にかかった患者の生理病理学的評価及び治療モニ タリングを行うことができる。

診断関係において、このアプローチによればリウマチ様関節炎を進行させるリス クをもつある患者の罹患性も特定することができる。この関係において、その疾 患に関与する特異性抗原によるサイトカイン産生の活性化も行える（例えばタイ プ２コラーゲン、熱シヨツクタンパク質、細菌抗原等）。

例７：多発性硬化症（ＭＳ）における適用多発性硬化症にかかった患者は疾患の 潜伏期間しかる後再発及び悪化期を通常示す。これらの期は現在予想できず、疾 患の臨床神経学的発現が明白でたいてい不可逆的になったときに認識される。

ＭＳにかかった患者はインビトロで刺激された彼等の全血によるサイトカインの 産生を測定することにより将来に関してモニターした。

更に神経学的障害（クルツケ（Ｋｕｒｔｚｋｅ）スコアにより測定される）の出 現の数週間前に（通常２〜６週間、時には１２週間以内）、非常に有意な増加が これら患者の刺激面によるＴＮＦの産生で観察された。

このため、疾患の臨床神経学的発現の出現に先立つ免疫系の活性化を測定するこ と、ひいては不可逆的神経障害が出現する前に早期段階で治療（例えばコルチコ イド）を確立することが可能である。

この種類の早期診断はこれら患者の予後を著しく改善することができる。

例８：その技術を用いた薬剤の研究 リウマチ様関節炎にかかった患者の刺激された全血によるサイトカインの産生を 、疾患の活動を変える漸増濃度の薬品、アロクリシン及びメトトレキセートの存 在下で測定する。

ＩＬ−１産生はアロクリシンにより、ＩＦＮ−γの場合はメトトレキセートによ り用量依存的に減少する。

こうして、患者の細胞に関する薬剤の活性はその剤の活性、異なる剤との応答に 関する患者細胞の能力及び活性剤用量について調べるためインビトロで研究して もよい。

異なる分子は標的細胞で発揮されるそれらの生物活性の定量により測定される。

測定される活性は標的細胞の生理学的修正（細胞死−例えばＴＮＦ／Ｌ９２９バ イオアッセイのケース−又は細胞増殖−例えば〔３Ｈ〕チミジンの取込みにより 間接的に測定される標的Ｔ細胞の増殖に基づ＜　ＩＬ−２に関するバイオアッセ イのケース）でも又は標的細胞による特異的タンパク質の産生（例えば、膜結合 ＣＤ２３又は適宜に標的Ｂリンパ球系により発現されるその可溶形の定量による ＩＬ−４の生物活性の測定）であってもよい。

はとんどのケースにおいて、バイオアッセイは長たらしく飽きあきするマルチス テップ操作により実施され、このため免疫アッセイはバイオアッセイよりもます ます好まれている。しかしながら、一部のケース、例えば同分子の生物活性又は 不活性形が同サンプル中に共存する場合において、生物活性の測定は分子の免疫 アッセイにとり補足的な情報を与えることができる。

現場アッセイの原理に基づく技術フォーマットは、簡素化されたワンステップ操 作において、標的細胞系の生物学的活性化を関心ある分子と組合せる生物学的ア ッセイと標的細胞により産生された誘導分子のアッセイの実施に特によく合う。

例９−１＝生物活性ＩＬ−４の測定 測定される生物活性ＩＬ−４を含有したサンプルを可溶性ＣＤ２３のアッセイに 関与するトレーサー抗ＣＤ２３抗体の存在下及び特定数のラモス（Ｒａｓｏｓ） 系細胞の存在下において抗ＣＤ２３抗体で被覆されたウェル中でインキュベート する。生物活性ＩＬ−４の存在下において、ラモス細胞は現場アッセイ原理に従 い測定されるＣＤ２３を産生ずる。このケースにおいて、産生されるＣＤ２３の 量はサンプル中に存在するＩＬ−４の量と正比例する。

例９−２：細胞系によりサイトカインの産生を誘導する分子の癌患者の血清中に おける特徴化 患者の血清を関心あるサイトカインのアッセイに関与するトレーサー抗体の存在 下及び選択された系の細胞の特定数の存在下において抗すイトカイン抗体で被覆 されたウェル中でインキュベートする。次いで産生されたあらゆるサイトカイン を現場アッセイ原理に従い測定するが、それらの産生は新生物状態に伴う分子の これら患者の血清中における存在を反映する。

例１０：免疫適合性試験への適用 免疫適合性試験はドナー及び受容者の単核細胞（ＰＢＭＣ）間で移植前に実施さ れる。実際には、ドナー及び受容者のＰＢＭＣはフィコール（Ｆｌｃｏｌｌ）で 単離する。受容者のＰＢＭＣを〔３Ｈ〕チミジンの存在下においてドナー照射Ｐ ＢＭＣの存在下で培養する。細胞が不適合性（異なる組織適合性抗原）である場 合、ドナーの照射ＰＢＭＣは受容者のＰＢＭＣを活性化してこれらの細胞を増殖 させるが、これは数日間の培養後に〔３Ｈ〕チミジンの取込みにより測定される 。

これらの試験に関する操作は厄介かつ複雑であり、長時間（４〜５日間）を要す る。

さて、受容者の活性化されたＰＢＭＣはこの活性化とひいては細胞不適合性を反 映するサントカインを産生ずることができる。

免疫適合性試験はポテンシャルドナー細胞の存在下で受容者のＰＢＭＣにより産 生されるサントカインの現場アッセイの原理に基づき実施される。

このケースにおいては、受容者のＰＢＭＣ（ａ宜には全血）を抗すイト力イン抗 体で被覆されたウェル中におけるドナー照射ＰＢＭＣの存在下及び関心あるサイ トカインのアッセイに関与する抗すイト力イントレーサー抗体の存在下でインキ ュベートする。サイトカイン産生は現場アッセイ原理に従い測定する。測定され たサイトカイン産生はドナー及び受容者細胞の不適合性の間接的尺感染個体であ っても、循環ウィルス粒子は血清中で免疫アッセイによりそれらの直接的検出を 行うには少なすぎる量でたいてい存在する。１つの可能なアプローチはウィルス に対して受容的な細胞の存在下で血清をインキュベートすることである。これら 細胞の感染はウィルス粒子を豊富に産生ずるが、その産生は上澄中における二次 測定の対象である（又は細胞毒性により評価される）。

本発明によるフォーマットでこの試験を実施すれば、同一支持体で培養及びアッ セイを実施して、それに伴う汚染リスクがある追加取扱いを避けることができる 。

汚染（例えばヘルペスウィルス、レトロウィルス等で汚染された）患者の血球を 培養すること及びこれら細胞を分裂促進因子で活性化してインビトロでウィルス 産生を増幅させることも可能である。その場合には、この産生は本発明によるフ ォーマットで直接測定できる（培養は捕捉抗体及び適切なトレーサーを含有した 支持体の存在下で行う）。その試験は例えば培地への中和抗インターフェロン抗 体の添加で高感度化させることができる。

例１２：減感化 ＩＦＮγの現場アッセイの減感化による例証実験の原理： ４つの標準曲線を４及び２４時間の培養に関して前記された単一サイトカインフ ォーマットに従うインキュベート及び現場アッセイにおいて漸増濃度（１，１０ ，５０及び２５０　ｎｇ／ウェル）の寒冷トレーサー抗体の存在下で作成した。

標準曲線と並行して、標準の場合と同様の濃度に相当する漸増用量（Ｏ〜１００ ０　ｕ　１１）の外来ＩＦＮγで富化された全血の２サンプルを同濃度の寒冷ト レーサー抗体の存在下で同様にしてインキュベート及びアッセイした。

減感された標準曲線（１０，５０又は２５０　ｎｇ／ａｔの寒冷トレーサー抗体 の存在下でインキュベート）は未減感化標準参照曲線（寒冷トレーサー抗体なし ）で読み取った。同様に、全血に関する標準曲線もこの同標準参照曲線で読み取 った。

異なる曲線と参照曲線との間の回帰直線は異なる減感化に伴う補正率（線に関す る方程式におけるＸの係数又は勾配の逆数に等しい）を決定するために計算した 。全血に関する曲線から得られる率は活性化全血においてこれら補正率の有効性 を確立するため標準曲線から得られる対応率と比較した。

実験ブランニ ー漸増濃度の寒冷抗体の存在下で得られる標準曲線は表１で示される。

一計算された異なる回帰線に関するＸの係数（異なる減感化に伴う補正率に相当 する）は表２で示される。

表２＝補正係数 ４時間インキュベート ２４時間インキュベート 注釈： 補正係数は減感化標準曲線又は全血での曲線と未減感化参照曲線との間の回帰線 に関する方程式ＡＸ＋ＢでＡの値に相当する。

結果： １）表はシグナル（光学密度）が４時間のインキュベート及び２４時間の場合の 双方に関してトレーサー中に存在する寒冷抗体の量に比例して減少することを示 している。未減感化曲線は０．５〜５０　ｕ　／ｍｌで機能的であり、しかる後 天井に達する。１０ｎｇでの減感化曲線は１〜１００　ｕ　／ｍｌで機能的であ り、しかる後天井に達する。

５０ｎｇでの減感化曲線は２〜５００　ｕ　／ｍｌで機能的であり、しかる後天 井に達する。２５０ｎｇでの減感化曲線は１０〜１０００　ｕ　／ｍｌで機能的 である。

２）減感化標準曲線と未減感化参照曲線との間の補正係数は１０ｎｇ／ウェルの 寒冷抗体の場合２に、５０　ｎｇ／ウェルの寒冷抗体の場合６に及び２５０　ｎ ｇ／ウェルの寒冷抗体の場合３０に近い。

３）全血での曲線から計算される係数は減感化標準曲線から計算される対応係数 と極めて類似している。

４）結論として、これら実験の結果は多量のＩＦＮγの産生をその場で測定する と同時に規定量の寒冷抗体の存在下でアッセイを行うことができることを示して いる。

このケースにおいて、未減感化標準曲線を参照して外挿推定された値はアッセイ で用いられた寒冷抗体の量に依存する補正率により掛は算されねばならない。示 された例において、２５０　ｎｇ／ウェルの寒冷抗体の存在下でサンプルをアッ セイすることにより、５０　ｕ　／ｓ１以内のみで機能的な標準曲線を用いて１ ５００　ｕ　／ｍｌのＩＦＮγの産生を測定できることがわかる。

−測定することが望まれるサイトカインに特異的な抗体で被覆され、ストッパー のストリップで閉じられるマイクロウェルのストリップからなり、以下のいずれ かを含む微量滴定プレート （蒸発又は凍結乾燥で乾燥された）前検量された乾燥標準−標準ウェル又は （再調製後にＰＨＡ５μｇ及びＬＰＳ２５μｇを有するように）特定量で（蒸発 又は凍結乾燥で乾燥された）乾燥ポリクローナルアクチベーター（ＬＰＳ＋ＰＨ Ａ）事サンプルウェル 一ストッパーのストリップで閉じられ、測定することが望まれるサイトカインに 非特異的な抗体で被覆され、（再調製後にＰＨＡ５μｇ及びＬＰＳ２５μｇを有 するように）特定量で（蒸発又は凍結乾燥で乾燥された）乾燥ポリクローナルア クチベーター（ＬＰＳ＋ＰＨＡ）を含むマイクロウェルのストリップ−コントロ ールウェル−測定されるサイトカインに特異的なトレーサー抗体の１０倍濃縮溶 液を含有するフラスコ −培地（例えばＲＰ１１６４０）の溶液−Ａｇ−Ａｂ複合体除去用の普通洗浄溶 液Ａ〜細胞脱離用の洗浄溶液Ｂ −トレーサー抗体が標識された酵素（ｆＰＪえばペルオキシダーゼ）用の基質の 濃溶液のフラスコ−基質を希釈する緩衝液のフラスコ −酵素反応を阻止するＨ　２　Ｓ　Ｏ４のフラスコ２）操作 一トレーサー抗体を試験実施のため所要量の培地で１０倍希釈する。

一蒸留水２５μｇを標準ウェルに加え、全血２５μｇをサンプル及びコントロー ルウェルに加える。

−培地中トレーサー溶液２００μｇをすべてのウェルに加える。

一ウェルをストッパーで止める。

一インキュベートを３７℃でＸ時間行う。

−ストッパーを外す。

一各ウエルの内容物を洗浄溶液Ａで３回吸引及び洗浄する。　・ 一洗浄溶液Ｂ１００μｇをすべてのウェルに加える。

−各ウェルの内容物を洗浄溶液Ａで３回吸引及び洗浄する。

−（使用直前に濃基質を基質緩衝液で希釈することにより調製された）基質溶液 ２００μｇをすべてのウェルに加える。

一インキュベートを室温で１５分間攪拌（７００ｒｐｍ）しながら行う。

−Ｈ２Ｓｏ４５０μｐをすべてのウェルに加える＝−ストリップをスペクトル測 定器で４５０ｎ−及び６３０　ｎｓにおいて読取る。

３）実験 一特別な単一サイトカインフォーマットに従い前記方法によるサイトカインＴＮ Ｆα、ＩＬ−６及びＩＦＮ−γのアッセイ 各サイトカインに関して標準曲線を作成し、光学密度を４時間（ＴＮＦ及びＩＬ −６）又は２４時間（ＩＦＮ）の培養後に（四重に）サンプル及びコントロール ウェルで得る。

速度論 各サイトカインに関して経時的な産生の速度論を調べる。曲線は４者の平均を表 し、得られる最大及び最少値の間である。

患者における異常サイトカイン産生の検出各すイト力インに関して、正常産生値 を健常ドナー１０例の群で得た。正常群に関する極値を患者１２例に関する個別 的値と比較する。

４）結論 一標準曲線は広域のサイトカイン濃度をカバーする（ＴＮＦの場合１００〜１０ ０００　ｐｇ／■ｌ、ＩＬ−６の場合２００〜２００００　ｐｇ／ｍｌ及びＩＦ Ｎの場合５〜５００　ｕ　／ｍｌ）。これらの条件下で、得られる曲線は再現性 及び感度に関して完全に満足しうる。

−サイトカイン産生は常に非常に低いコントロールと比較して十分に明確化され るシグナルだけでなく非常に大きな再現性（４回の質）も示す。

−標準曲線の範囲内に属するサイトカイン産生はＴＮＦの場合２．４又は２４時 間の培養後、ＩＬ−６の場合４又は２４時間の培養後及びＩＦＮの場合２４又は ４８時間の培養後に測定できる。

−その系によれば患者の全血で異常サイトカイン産生を検出てきる。

実験プラン ４時間培養 ２４時間培養 インターロイキン１ 現場産生 サンプル 実験プラン ４ｊｅ間培！ ２４時間培養 ＩＧ−２Ａ インターロイキン６ 実験プラン 厘瘍壌死因子α 実験プラン インターロイキン２ 実験プラン インターフェロンγ 実験プラン ＧＭ−ＣＳＦ １．００　２．００　３．００　４．００　５．００　６．００　７．００８− ００実験プラン 実験プラン 実験プラン 実験プラン 実験プラン 実験プラン ＴＮＦ／４時間 丁ＮＦ／２４時間 現場７ノセイ 現場アッセイ対従来アッセイ ＩＦＮ　ＩＩＩＦ　ＩＦＮ　ＩＮＦ ＮＩ　Ｏｊ　ｔｏｊａ　Ｏｊ　４０．９４１’Ｊ２　０ｊ　Ｌ３．６　０ｊ　３ ０．３９Ｎ３　０．７３　Ｌ４．４７　０ｊ７　ｕ、８２Ｎ４　０．．５　ＬＯ ，Ｌ３　０Ｊ　３０．３９Ｎ５　０ｊ　Ｌ４ｊ９　０ｊ　３１．７８Ｎ６　０ｊ ８　ＬＯ，＋３３　０．９５　１９．ｎＧＦＬ　Ｏｊ　ＯＪ’　ＯＪ　Ｏｊ” Ｇ己　Ｏｊ　Ｏ，，５’　Ｏｊ　Ｃ１５”ＣＣｌ０ｊ　６．７”　Ｏｊ　１０． ７８”Ｃｏ　Ｌｉ　”　５０　”　６．９８　”　２１１　”ＧＭＩ　Ｏ，ｊ　 ０．６”　Ｏｊ　０．６ｊ”０Ｍ２　２．．０５”　２９．６８１１　（四〇　 １０００Ｍ５　０ｊ　４ｊ９＠ＯＪ　９ｊ８”Ｎ１−Ｎ６＝正営６例 ＬＴＩ及びＬＴ２　＝肝移植２例 ＣＣ１−結腸癌、術後 ＣＣ２＝結腸癌、術前 閘Ｇｌ−ＭＧ５＝骨髄移植５例 Ｎ８　“＝正常以下の値 １′″　；王宮以上の値 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ドラクロワ、ドミニクフランス国ガルシュ、リュ、ド、ビュザ ンバル、１５１．ピラーシュ、ドパ （７２）発明者　フランシモン、ポールベルギー国モダーブ、リュ、デュ、ピラ ーシュ、１７

Claims (29)

【特許請求の範囲】
1. １．可溶性媒介物質又は感染性粒子の成分のような分子の生細胞による産生を評 価するための方法であって、細胞培養及び場合により刺激が上記産生を誘導する ために行われ、産生された分子の量がインビトロで固相免疫アッセイにより評価 される、即ち： ａ）細胞培養及び適宜に刺激が、アッセイされる分子に特異的な捕捉成分が結合 されたアッセイの固相を組み込んだ容器において、場合によりトレーサーの存在 下で行われる；及び ｂ）培養期間が経過したとき、固相の洗浄とアッセイに要される様々な他の可能 な試薬、特に固相存在下におけるトレーサー用基質のインキュベート後に、固相 に結合されたトレーサー又はその上記基質により放射されたシグナルが測定され る； ことを特徴とする方法。
2. ２．ステップｂ）においてトレーサー及び固相が培養に用いられた容器中でイン キュベートされる、請求項１に記載の方法。
3. ３．放射されたシグナルが培養に用いられた容器中で測定される、請求項１又は ２に記載の方法。
4. ４．固相が培養容器の内表面からなり、それにアッセイされる分子に特異的な捕 捉成分が結合されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. ５．固相が細胞培養容器と物理的に依存していない１以上の成分からなる、請求 項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
6. ６．固相が、アッセイされる分子に特異的な捕捉成分で被覆されたビーズ又は把 持できる部分に堅固に付着された成分からなる、請求項５に記載の方法。
7. ７．いくつかの分子がアッセイされる、即ち：ａ）細胞培養がアッセイされる分 子が存在する多数の容器で同時に行われる； ｂ）各容器に組み込まれた固相に、各々が上記分子の１つを特異的に認識するい くつかの抗体群が結合される；及び ｃ）各分子が各対応分子に特異的な異なるトレーサーと共に各容器内でインキュ ベート後にアッセイされる；請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. ８．いくつかの分子がアッセイされる、即ち：３）細胞培養が分子が存在する多 数群の容器で同時に行われる； ｂ）各群の容器に組み込まれた固相に、各群の容器において異なる分子を各々認 識する既定特異性の抗体が結合される；及び ｃ）各分子が、対応分子に特異的なトレーサー又は異なる分子に特異的なトレー サーの混合物である共通トレーサーと共に各容器のインキュベート後にアッセイ される；請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
9. ９．免疫アッセイが固相競合タイプ又はサンドイッチタイプである、請求項１〜 ８のいずれか一項に記載の方法。
10. １０．捕捉成分がモノクローナル又はポリクローナル抗体からなる、請求項１〜 ９のいずれか一項に記載の方法。
11. １１．捕捉成分がアッセイされる分子に特異的な抗原又は可溶性レセプターのリ ガンドを含めたいずれか他のリガンドである、請求項１〜１０のいずれか一項に 記載の方法。
12. １２．アッセイが酵素もしくはアイソトープ法、発光、ケイ光又は比濁回折によ り視覚化される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. １３．アッセイのトレーサー成分が支持体での培養開始時から存在するか又はそ の後に加えられる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. １４．測定される媒介物質がサイトカイン、ホルモン、神経ペプチド、可溶性レ セプター、脱顆粒マーカー、細胞外ペプチド又はインビトロで細胞により産生さ れる生物学的効果のいずれか他の媒介物質である、請求項１〜１３のいずれか一 項に記載の方法。
15. １５．感染粒子の成分がウイルス、その他の細胞内微生物又はそれら抗原成分の １つからなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
16. １６．媒介物質の産生が自発的であるかあるいはレクチン、リポ多糖、抗体、抗 原、アレルゲン、薬剤及び細胞レセプターの天然又は合成リガンドのような特異 的又はそうでない活性化剤で刺激される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載 の方法。
17. １７．アッセイされる分子に関するトレーサー又は捕捉成分としてアッセイに関 与しかつ固相に結合されている抗体が、上記分子の産生及び／又はその生物活性 に影響を与えないエピトープによりアッセイされる分子を認識する、請求項１〜 １６のいずれか一項に記載の方法。
18. １８．培養中にアッセイされる分子の産生を調節する剤が培地に加えられる、請 求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. １９．アッセイの減感化により区別され、アッセイされる分子に特異的なトレー サー抗体と同特異性の未標識抗体との混合物により得られ、減感化により既定の 補正率でアッセイの範囲を高い値まで広げることができる、請求項１〜１８のい ずれか一項に記載の方法。
20. ２０．アッセイされる細胞サンプルが、アッセイされる分子に特異的なトレーサ ー抗体を含む第一培地とアッセイされる分子に特異的なトレーサー抗体及び同特 異性の未標識抗体を含む第二培地で同時に培養される、請求項１〜１９のいずれ か一項に記載の方法。
21. ２１．細胞が場合により希釈された全血、精製された細胞群、組織から抽出され た細胞又は細胞系で代表される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. ２２．シグナルを測定する前における固相洗浄用溶液がタンパク質分解酵素、特 にトリプシンの溶液である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. ２３．請求項１〜２２のいずれか一項に記載された方法に適し、免疫捕捉用の容 器としても役立っ細胞培養用の支持容器を含み、免疫アッセイの捕捉成分が結合 されたその固相が上記容器に組み込まれるか又は組み込むことができる技術フォ ーマット又はキット。
24. ２４．固相が培養支持容器の内表面からなる、請求項２３に記載のフォーマット 。
25. ２５．固相支持容器が、滴定プレートの、場合により除去しうるウェルからなる か、又は免疫アッセイに適したチューブもしくはいずれか他の細胞培養容器から なる、請求項２４に記載の技術フォーマット。
26. ２６．細胞培養及び免疫捕捉用の容器がアッセイの固相に物理的に依存していな い、請求項２３に記載の技術フォーマット。
27. ２７．標準サンプル、トレーサー、適宜にその基質と培地、細胞希釈培地、洗浄 培地及び測定されるパラメーターの産生を刺激又は調節する剤を含めたアッセイ の全成分が供給される、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の技術フォーマ ット。
28. ２８．マイクロプレートのウェル中に乾燥形で存在するトレーサー及び／又は活 性化剤を含む、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載のフォーマット。
29. ２９．容器、特にマイクロプレートのウェル中に乾燥形で存在する標準参照サン プルを含む、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載のフォーマット。