JPH06503477A - 真核無細胞抽出物中での転写と翻訳の共役 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 真核無細胞抽出物中ての転写と翻訳の共役発明の背景 本発明は一役に分子生物学に関し、そして更に詳細には真核細胞溶解物または池 の抽出物中で鋳型ＤＮＡからＲＮ　Ａの転写と該ＲＮｚ〜の翻訳を共役させるこ とができる新規方法に関するものである。

細胞中の遺伝子の転写と翻訳（発現）に係わる段階は非常に複雑でありそして未 だ完全には理解されていない。しかし乍ら、タンパク質をＤＮＡから製造するた めには従わなければならない基本的なパターンがある。ＤＮ、Ａは最初にＲＮ　 Ａに転写され、次いてそのＲＮ　Ａが種々の細胞成分の相互作用によってタンパ ク質に翻訳される。原核細胞（細菌）では転写と翻訳は「共役しており（ｃｏｕ ｐｌｅｄ）　Ｊ、これはＲＮＡがＤＮＡから転写されている時間中にＲＮＡがタ ンパク質に翻訳されることを意味する。真核細胞（動物、植物）では、この２つ の作用は別個であり、全体の過程ははるかにより一層複雑化されている。ＤＮＡ は細胞の核内部でＲＮＡに転写されるが、ＲＮＡは更にｍＲＮＡにプロセシング され、そして次いでｍＲＮ、Ａはタンパク質に甜訳される核外の細胞質に輸送さ れる。

分子生物学者が遺伝子を単離しクローン化できそして細胞から特定のｍＲＮＡま たは「メツセージ」を単離できるので、これらの遺伝子またはメツセージを発現 させるために使用し得る系が必要となった。遺伝子の発現は遺伝子の機能と調節 を全体的に理解するために重要である。タンパク質を迅速に発現させる方法が現 在利用でき、これは遺伝子を操作し次いでその機能に与える操作の影響の研究を 可畦にしている。産生ずべきタンパク質の量、遺伝子が原核生物であるのかまた は真核生物であるのか、およびインビトロ系またはインビボ系の相対的な利点は 、発現系を選択するときに研究者が言置するファクターの幾つかである。系の選 択は研究される遺伝子によって影響される。殆どの場合、原核生物遺伝子は原種 生物系で最も良く発現され、モして真核生物遺伝子は真核生物系で一層効率良く 且つ正確に発現される。これは、多くの調節配列およびプロモーターは類似する 系て一層効率良く認識されるためである。遺伝子の発現はインヒポおよびインヒ ドロ系の両方で達成することができる。

原核または真核細胞を使用するインビボ転写系は利用可能であるが、これらの系 は無傷の細胞が使用されるので操作が困難である。他方、インビトロ系はＤＮ、 ＡまたはＲＮＡをタンパク質に翻訳するために必要な成分を全て含有する原核ま たは真核細胞から製造された無細胞抽出物がら製造される。無細胞抽出物は大腸 菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）のような原核細胞並びにウサギ網状赤血球および小麦胚芽 のような真核細胞から調製することができる。無細胞系は、それらの調製に利用 できる標準的なプロトコールが存在しそして多数の供給源から市販で入手できる ので、非常に一般的である。

大腸菌Ｓ３０無細胞抽出物はズベイ（Ｚｕｂａ）’）、　Ｇ、　にょって最初に 記載された（１９７３、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｇｅｎｅｔ、７巻、２６７頁）。

これらの抽出物は発現されるべき遺伝子が適当な原核生物調節配列、例えばプロ モーターやリポソーム結合部位を有するベクター中にクローン化されたときに使 用することができる。原核生物大腸菌無細胞系は、抽出物へのＤＮＡの添加後に 転写と翻訳が同時に生起するので、「共役している」と考えられる。大腸菌抽出 物中で鋳型としてＲＮＡを使用するとタンパク質が生成するが、このような反応 は共役してはいない。ウサギ網状赤血球溶解物と小麦胚芽抽出物は好ましくは、 真核生物遺伝子またはｍＲＮＡの発現に使用される。両系共、真核生物系は既に 述べたように共役していないので、タンパク質翻訳の鋳型としてＲＮＡを使用す ることが必要である。

ウサギ綱状赤血球溶解物はペルハム（Ｐｅｌｈａｍ）、　Ｈ，Ｒ，Ｂ、およびジ ャクラン（Ｊａｃｈｓｏｎ）、　Ｒ，Ｊ、によって記載された（１９７６、Ｅｕ ｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、１３１巻、２８９頁）。

この発現系は多分インビトロ翻訳に最も広範に使用されている無細胞系であり、 モしてｍＲＮＡ種の同定、それらの産生物の特徴決定、転写と翻訳の制御の研究 に使用される。シグナルペプチド開裂およびコアグリコジル化のようなプロセシ ングはイヌのミクロゾーム膜を標準的な翻訳反応に加えることによって試験され る（ｆａｌｔｅｒ、　Ｐ　およびＢｉｏｂｅｌ、　Ｇ、　（１９８３）　３１ｅ ｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、９６．５０）　Ｏウサギ網状赤血球溶解物はまた、 アセチル化、イソプレニル化、タンパク質分解および成る種のリン酸化活性を含 む種々の転写後プロセシング活性も有している（Ｇｌａｓｓ、　Ｃ，Ａ、　Ｐｏ １ｌａｒｄ、　Ｋ、　’４．　（１９９０）　Ｐｒｏｍｅｇａ＼ａｔｕｒｅ、　 ２６）。

小麦胚芽抽出物はロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）、　Ｂ、Ｃおよびパターラン（Ｐ ａｔｅｒｓｏｎ）。

Ｂ、　Ｍ、　ｉ：よって記載された（１９７３、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、７０巻、２３３ｏ頁）、小麦胚芽の無細胞抽出物は 多種のウィルスおよび他の原核生物のＲＮＡ並びに真核生物のｍＲＮＡのインビ トロでの翻訳を支えている。（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、　Ｃ，等（１９８３）　Ｍｅ ｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１．６３５）　、一般に、小麦胚芽抽出物には りボヌクレアーゼ活性が存在しているので、小麦胚芽翻訳系の反応混合物中にリ ボヌクレアーゼインヒビターを含んでいることが必要と見られている。

翻訳研究用のＲＮＡはｍＲＮＡを単離するがまたはＲＮＡポリメラーゼプロモー ターを有するベクターにクローン化されているＤＮＡからインビトロでＲＮＡ転 写物を製造するかのいずれかによって得られる。第１の方法は細胞から直接ｍＲ ＮＡまたは「メツセージ」を単離する。

第２の方法はインビトロ転写によってインビトロ翻訳用のＲＮＡを得る。ファー ジポリメラーゼプロモーターの後にクローン化されたＤＮＡのインビトロ転写は クリー７（Ｋｒｉｅｑ）、　Ｐ、およびメルトン（Ｍｅｌｔｏｎ）、　Ｄ　によ って記載された（１９８４、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、　１２巻、 ７０５７頁）。これはインビトロ翻訳反応に使用するためにクローン化した遺伝 子からＲＮＡを得る標準的な方法となった。この方法は問題のＤＮＡまたは遺伝 子が次のＲＮＡポリメラーゼ、即ちＳＦ３、Ｔ７またはＴ３のうちの１つのプロ モーターを有するベクター中にクローン化されることが必要である。次いで、こ のベクターはクローン化された遺伝子の３′末端で制限酵素を使用して線状化さ れ、次いてインビトロ転写反応によってＲＮＡ転写を行う。ＳＦ３、Ｔ７および Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する多数のベクターは市販で入手可能 でありそしてＤＮＡのクローニングに広範に使用されている。

いずれにしても、ウサギ網状赤血球溶解物または小麦胚芽系に使用されるＲＮＡ 転写物を得るプロセスは翻訳反応の効率に影響を与える要素を導入する。ＲＮ、 へはりホヌクレアーゼで容易に分解されるので、ＲＮＡを用いて操作するときに は常に特別の注意を払わなければならない。ＤＮＡ鋳型ははるかにより安定であ る。

ウサギ網状赤血球溶解物および小麦胚芽抽出物が無細胞翻訳系として開発された 後、転写と翻訳を共役させる試みがなされた。開発された１つの系は［連結され ティる（ｌｉｎｋｅｄ）　Ｊ転写と翻訳系であった（Ｒｏｂｅｒｔｓ、　Ｂ、Ｅ 、等（１９７５）　、ＰｒｏｃＮａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　 ７２巻、１９２２〜１９２６）　。この系は小麦胚芽抽出物を使用することに係 わるものでありそして大腸菌のＲＮＡポリメラーゼを使用する５ｖ４０ウイルス ＤＮＡの転写と翻訳を考慮していた。この系では転写は小麦胚芽抽出物の添加直 前の１５分のインキュベーション段階で生じる。これらの段階は転写に必要な緩 衝液条件と翻訳に必要な緩衝液条件との間の不適合性のため、そして更には両プ ロセスの温度要件が異なるために分離されている。この系には多（の欠点がある 。１つは、多数の異なるタンパク質が同一の５Ｖ４０ＤＮＡ鋳型から同時に合成 されるので、タンパク質産生物の産生が制御されていないことである。この研究 の著者は共役系が開発されたことを示しているが、共役系のデータは示されなか った。

もう１つの系はペルハム、　Ｈ，Ｒ，Ｂ、等によって開発され（１９７ｇ）　、 Ｅｕｒ、　Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、、８２巻、１９９〜２０９、その際転写と翻 訳の共役はワクシニアウィルスコア粒子をウサギ網状赤血球溶解物に導入した後 に生じた。ウィルスＤＮＡからワクシニアタンパク質の産生は多分内因性ワクシ ニアＲＮＡポリメラーゼによる転写とそれに続く溶解物による翻訳によるもので あった。この系は、ワクシニア以外の供給源の外因性ＤＮＡはＲＮＡポリメラー ゼによって認識されないので転写または翻訳が生起せず、ワクシニアタンパク質 だけが産生されるという事実によって制限された。ウィルスコア粒子は単離しな ければならず、そしてこの著者は単一のタンパク質だけを専ら産生させることは できなかった。

タンパク質の大規模産生に重点をおいた「連続的な」無細胞インビトロ翻訳系を 使用する研究も記載されている。連続系はより通常のバッチタイプまたは含まれ ている反応容量中で生じる静置インビトロ翻訳反応とは非常に異なっている。

連続的翻訳は、大規模反応が組み立てられそしてタンパク質が長期間に亘って「 連続的に」翻訳されるバイオリアクター（例えばＡｍ１ｃｏｎ　８ＭＣ限外ろ過 ユニット）に係わるものである。この反応には、反応の進行につれて反応中に緩 衝液を供給する必要があり、そしてまた翻訳の産生物も反応フィルターユニット から取り出さなければならない。このタイプの系はＲＮ　Ａ鋳型を導入するとき 大１１ｊ％［Ｓ　３０抽出物および小麦胚芽抽出物で良好に作用する。スピリン （Ｓｐｉｒｉｎ）等（１９８８，５ｃｉｅｎｃｅ、２４２巻、１１６２〜１１６ ４参昭。このシステムはまたウサギ網状赤血球溶解物てＲＮ　Ａ鋳型を使用して も作用する。リャボバ（Ｒｙａｂｏｖａ）等（１９８９）　、Ｎｕｃｌ、　へＣ １ｄ　Ｒｅｓ、、　１７巻、１１号、４４１２参昭。この系はまた大腸菌Ｓ３０ 抽出物中てＤＮＡ鋳型を使用しても良好に作用することが知られている。バラノ フ（Ｂａｒａｎｏｖ）等（１９８８）　、Ｇｅｎｅ、　８４巻、４６３〜４６６ 参照、、ＰＣＴ公開ＷＯ９１０２０７６は真核生物溶解物を使用するＤＮＡ鋳型 からの連続的な無細胞翻訳を開示している。

連続反応は１０時間から約１００時間まで種々に実施され、そして組み立て且つ 実施するためには時間および供給源のかなりの投資が必要である。「連続」系で の翻訳はまた大量のタンパク質を産生させる方向にも向けられており、そして標 準的な（静置）インビトロ翻訳反応とかなり異なっている。静置反応は少ない反 応容量で、典型的にはマイクロリットルで測定される量で行うことができ、そし てそれはしばしば１乃至２時間で完結される。静置翻訳反応は調製量（ミリグラ ム）のタンパク質を産生ずる方向には向けられていない。静置反応は一般に、研 究的用途、例えばｍ　ＲＮ　Ａ種の同定、特徴決定または転写若しくは翻訳制御 の研究用にタンパク質を産生させるために使用される。インビトロ翻訳で現在知 られているウサギ網状赤血球系または小麦胚芽系はいずれも、静置反応混合物中 で転写と翻訳の共役を提供していない。

発明の要約 それ故、本発明の１つの目的は標準的なインビトロ翻訳反応で真核細胞溶解物を 使用して鋳型１１’ＪＡからタンパク質を製造する簡単な方法を提供することで ある。

本発明の更に特定の目的は、ＤＮＡ鋳型によってコードされる単一のタンパク質 の転写と翻訳を共役させるために使用できる上記方法を提供することである。

もう１つの目的は真核無細胞溶解物を使用する転写と翻訳の共役反応によって、 Ｄ　Ｎ　Ａ鋳型からインビトロでのタンパク質の産生が高い方法を提供すること である。

更にもう１つの目的は、転写と翻訳の共役実験に使用される真核細胞溶解物を製 造する方法を提供することである。

更に尚もう１つの目的は転写と翻訳の共役反応に必要な１つまたはそれ以上の成 分または試薬を有する上記溶解物調製物を製造する方法を提供することである。

もう１つの目的は転写と翻訳の共役実験に使用される上記調製物を提供すること である。

本発明の更にもう１つの目的は調製されたウサギ網状赤血球溶解物または小麦胚 芽抽出物を有しそしてＤＮＡ鋳型から転写と翻訳を共役させる反応混合物を製造 するのに必要な他の成分若しくは試薬を含有するキットを提供することである。

更に特定の目的は少なくとも１つの成分として、転写と翻訳を共役させるのに必 要な１つまたはそれ以上の試薬を有する調製されたウサギ網状赤血球溶解物また は小麦胚芽抽出物調製物を有するキットを提供することである。

上記の目的や他の目的を達成するために、本発明は真核細胞溶解物中で転写と翻 訳を共役させる方法を提供する。本方法は、ＲＮＡがＤＮＡから転写されそして ＲＮＡがタンパク質に翻訳される値にまで溶解物の最終マグネシウム濃度を高め るのに十分な量のマグネシウム化合物を溶解物に添加することからなる。

本発明はまた、溶液中での転写と翻訳の共役によって、特定のポリメラーゼプロ モーター配列を有するＤＮＡ鋳型からタンパク質を製造する方法も提供する。

これは、真核細胞溶解物の標準的な調製物を製造し、転写と翻訳を支えるのに十 分な１度のりボヌクレオチド三リン酸、アミノ酸および鋳型ＤＮＡのプロモータ ー配列に対応しているポリメラーゼで溶解物を修正し、モしてＲＮＡがＤＮＡか ら転写され且つＲＮＡがタンパク質に翻訳される値にまで最終マグネシウム濃度 を高めるのに十分な量のマグネフラム化合物を上記溶液に添加することによって 達成される。ＤＮＡのプロモーター配列に隣接する遺伝子に対応するタンパク質 だけが製造される。

本発明は更に、ＲＮＡがＤＮＡから転写され且つＲＮＡがタンパク質に翻訳され る値にまで最終マグネ／ラム１度を高める方法に従って調製された修正真核細胞 溶解物を提供する。この溶解物は製造中に・ごのように調整されたマグネ／ラム １度を有することができる。本発明はまた、転写と翻訳の共役用の真核細胞調製 溶解物を含有する容器からなるキットも提供する。調整されたマグネシウム濃度 を有することに加えて、この溶解物は転写上翻訳の共役に必要な種々の追加成分 を含有することができる。含有させることができる追加成分の１つはＲＮＡポリ メラーゼである。他のものは種々の緩衝液若しくは塩または転写と翻訳の共役反 応条件を最適にする他の成分若しくは試薬、例えば鎖延長の効率を高めることが 知られているスペルミジンである。

ウサギ網状赤血球または小麦胚芽系での転写と翻訳の共役化は、ＲＮＡ鋳型によ る標準的なインビトロ翻訳と比較するとき、タンパク質産生を顕著に高め、そし 、゛〔共役した転写と翻訳は広範囲の分子量サイズに亘って多様な種々のタンパ ク質に作用することが示されている。

翻訳される遺伝子またはＤＮＡは好ましくは、ＳＰ６、Ｔ７若しくはＴ３プロモ ーターのようなＲＮＡポリメラーゼプロモーター、またはポリメラーゼが利用可 能になる任！のＲＮＡポリメラーゼプロモーターの後でクローン化される。ＤＮ Ａ鋳型は閉環状プラスミドＤＮＡの形態でまたは線状プラスミドＤＮＡとして転 写と翻訳の共役反応に導入される。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列はまた 熱循環増幅方法によって特定のＤ　Ｎ　Ａフラグメントに結合させることができ 、そしてこれらの線状ＤＮＡフラグメントは転写と翻訳の共役反応に使用するこ とができる。

標準的なインビトロ翻訳反応には時間と資源を投資する必要が殆どなく、そして 該反応はタンパク質を定性的に発現させるために良好に確立された方法である。

標準的なインビトロ翻訳反応でウサギ網状赤血球溶解物または小麦胚芽抽出物を 使用して転写と翻訳を共役させることによって、別個のインビトロ転写反応の必 要性がなくなり、そしてタンパク質の産生が顕著に高められる。かくして、ウサ ギ網状赤血球溶解物または小麦胚芽抽出物を使用した転写と翻訳の共役は現行の 標準的なインビトロ翻訳反応に比べて顕著な改良を提供する。予期されなかった 利益は、所望のタンパク質生成物の産生が標準的なインビトロ翻訳反応にＲＮ　 Ａを添加することによって見られる産生に比べて劇的に（数倍）高まることであ る。

更に、共役した転写と翻訳では別個のキャッピング反応の必要がない。

もう１つの利屯は、特定のＲＮＡポリメラーゼプロモーターを含有しクローン化 されるかまたは増幅されたＤＮＡ鋳型からタンパク質を産生てきることである。

二のようにして、プロモーターの下流の単一の遺伝子からＲＮＡを合成するよう に指令することができ、そしてこのＲＮＡから翻訳されるタンパク質だけが産生 される。このＲＮＡが唯一のタンパク質を指令する場合には、該反応によって唯 一のタンパク質が産生される。このように使用されるプラスミドベクターは当該 技術分野で周知であり、そして幾つかの供給源から入手可能てあり、研究者は所 望の任意のクローン化遺伝子からタンパク質を産生させることができる。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および請求の範囲を検討する ことによって当業者に明白となろう。

好ましい実施態様の説明 本発明の目的のためには、任意の真核細胞溶解物を使用することができ、そして それらを製造するためには多数の慣用の技術が存在する。無細胞真核細胞溶解物 は多くの理由により、少なくとも部分的にはそれらが種々の翻訳後プロセシング 活性を保持しているので、好ましい発現系である。イヌのミクロゾーム膜を添加 して、シグナルペプチド開裂およびコアグリコリル化のようなプロセシングを試 験することができる。真核細胞溶解物はまた広範囲のウィルスおよび他の原核生 物ＲＮＡ、並びに真核生物ｍＲＮＡのインビトロでの翻訳を支える。

池の真核生物系も適しているが、ウサギ網状赤血球溶解物および小麦胚芽抽出物 が好ましい。これらの真核生物溶解物は研究者に一般的であり、そして広範に入 手可能である。好ましい実施態様では、ウサギ網状赤血球溶解物はペルハム。

Ｈ８およびンャクラン、ＲＪ、によって記載され（１９７６、Ｅｕｒ、　Ｊ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ、　６７．２４７〜２５６）そして製造プロトコールＬ４１５／ Ｌ４１６、プロメガコーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｃｏｒｐ、　）　、ウ ィスコンシン州マデイラン、に従って修正された方法によって調製される。網状 赤血球溶解物は、フェニルヒドラジンを注射したニューンーランドホワイトラビ ノトから調製され、これによって各ロットで信頼性のある一定した網状赤血球の 産生が確保される。網状赤血球は、最終抽出物の翻訳特性を変化させる夾雑細胞 を除去するために精製される。網状赤血球を溶解させた後、抽出物はミクロコツ カスヌクレアーゼおよびＣａＣｌ２で処理して内因性ｍ　ＲＮ　、Ａ。

を破壊し、そしてその結果バックグランド翻訳を減少させて最小にする。次いで 、ＥＧＴＡを加えてＣａＣｌ２をキレート化させ、それによってヌクレアーゼを 不活性化する。

この溶解物はタンパク質合成に２・要な細胞成分を含有している。これらにはｔ ＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アミノ酸並びに開始、延長および終結因子が含まれる。この 溶解物は更に、予め試験したホスホクレアチンキナーゼおよびホスホクレアチン からなるエネルギー発生系を添加することによってｍＲＮＡ翻訳が最適化される 。

翻訳され得るｍ　ＲＮ　Ａの範囲を拡張するためにｔＲＮＡの混合物や開始阻害 を阻止するためにヘミンも添加される。ヘミンは開始因子ｅＩＦ２αのインヒビ ターのサプレッサーであるので、網状赤血球溶解物に加えられる。ヘミンが存在 しないと、網状赤血球溶解物中のタンパク質合成は短期間のインキュベーンコン 後に停止する（Ｊａｃｋｓｏｎ、　Ｒ，およびＨｕｎｔ、　Ｔ、　、　１９８３ 　Ｍｅｔｈ、　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　９６．５０）。

酢酸カリウムおよび酢酸マグネシウムは大部分のｍＲＮＡ種の翻訳に推奨される 値で添加する。これがインヒドロ翻訳で使用される標準的なウサギ網状赤血球溶 解物である。標準的なウサギ網状赤血球溶解物の最終マグネシウム濃度は典型的 には約４２から５．　ＱｍＭの範囲てあり、該溶解物は転写と翻訳の共役反応で は５０％比率のものが使用される。

ウサギ網状赤血球溶解物（５０％溶解物）の翻訳反応における添加成分の最終１ 度寄与 クレアチンリン酸　７ｍＭ タレアチンホスホキナーゼ　３５μｇ／ｍ１ＤＴＴ　１．４ｍＭ つ／肝＠ｔＲＮＡ　３５μｇ／。■ 酢酸カリウム　５６ｍＭ 酢酸マグネシウム　３５０μ輩 ヘミン　１４３μ輩 もう１つの好ましい実施態様では小麦胚芽抽出物を使用する。これはロバーツ。

Ｂ、　Ｅ、およびバターラン、　Ｂ、Ｍ、によって記載されている方法（１９７ ３、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　７０巻、第８号、２３３０〜２３３４頁）、 アンダーラン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、　Ｃ。

Ｗ　等によって記載されている修正（１９８３、Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、 　１０１巻、６３５頁）に従って、そして製造プロトコールＬ４１ｇ、プロメガ コーポレーション、ウィスコンシン州マディラン、のように修正して製造するこ とができる。一般に、小麦胚芽抽出物は抽出緩衝液中で小麦胚芽を粉砕し、次い で遠心して細胞破片を除去することによって調製される。次いで、クロマトグラ フィーによって翻訳を阻害する内因性のアミノ酸および植物顔料から上清液を分 離する。この抽出物もハックグランド翻訳を減少させて最小にするため更にミク ロコツカスヌクレアーゼで処理して内因性ｍＲＮＡを破壊する。この抽出物はｔ ＲＮＡ、ｒＲＮＡ並びに開始、延長および終結因子のようなタンパク質合成に必 要な細胞成分を含有している。この抽出物は更に、ホスホクレアチンキナーゼお よびホスホクレアチンからなるエネルギー生成系を添加することによって最適化 され、そして酢酸マグネシウムは大部分のｍＲＮ　１種の翻訳に推奨される値で 添加する。標準的な小麦胚芽抽出物の最終マグネシウム１変は典型的には約６． ０ｍ肋１ら７．５ｍＭの範囲である。

小麦胚芽抽出物（５０％抽出物）の翻訳反応における添加成分の最終１度寄与 クレアチンリン酸　１０ｍＭ クレアチンホスホキナーゼ　５０μｇ／ｍｌＤ　Ｔ　Ｔ　５ｍｌ１１ ウン肝＠　ｔ　ＲＮＡ　５０ｕｇ／ｍｌ酢酸マグネシウム　３．０〜３．７５ｍ Ｍ酢酸カリウム　５３ｍＭ 共役した転写と翻訳では、真核細胞溶解物のマグネシウム濃度は添加されるマグ ネシウム化合物、好ましくは塩によって調整しなければならない。好ましい塩に は塩化マグネシウムおよび酢酸マグネシウムがある。緩衝剤を添加する必要はな いが、緩衝剤の添加はｐＨを安定化させるため溶液として使用することができる 。転写と翻訳を共役させるために、ＲＮ　ＡがＤＮＡから転写されそしてＲＮＡ がタンパク質に翻訳される値に最終マグネシウム濃度を高めるのに十分な量の塩 化または酢酸マグネシウムが溶解物に添加される。この値は使用される溶解物に 依存して変化する。

標準的なウサギ網状赤血球溶解物または小麦胚芽抽出物に原核生物のＲＮ　Ａボ リメラーセおよびリボヌクレオチド三リン酸を単に添加しても、インビトロでの ＤＮＡ鋳型からのタンパク′Ｒ産生は可能でない。しかしγら、記載されるよう に二の系で塩濃度を特別に調整すると、Ｄ　Ｎ　ＡからＲＮＡへの転写およびＲ Ｎ　Ａからタンパク質への翻訳の両方を可能にする溶解物内ての条件かつ（られ てタンパク質の産生が可能になる。

マグネシウムは集合させたりホソームの安定性およびそれらの翻訳中の結合機能 を高めるので、翻訳を最適化するのに重要であることが知られている。マグネシ ウムはまたポリメラーゼ結合を促進する役割を果たし、ていると思われる。翻訳 を最適化するにはカリウムも同様に重要であるが、マグネシウムの場合とは違っ て、共役した転写と翻訳ではカリウムイオンの濃度は標準的な翻訳調製物値を超 えて変化させる必要はない。

カリウムとマグネシウムは標準的なウサギ溶解物中に存在している。その値は１ 部は内因性溶解物値によるものであり、そして１部は翻訳用溶解物に添加される ような溶解物の調製中になされた添加によるものである。溶解物は調製中に幾分 希釈され、その結果転写と翻訳の共役反応では調製された溶解物は５０％で使用 されるにすぎない。

マグネシウム１度はかなり狭い最適範囲内に調整すべきであるので、溶解物のマ グネシウム値は、反応でのマグネシウム量が１つの溶解物バッチから次のバッチ まで標準化できるように、追加のマグネシウムを添加する前にマグネシウムアッ セイを使用して直接測定することが好ましい。ランサー（Ｌａｎｃｅｒ）の「マ グネシウムラピッドスタットダイアグノスティックキｙ　ｈ　（Ｍａｇｎｅｓｉ ｕｒａ　Ｒａｐｉｄ　ＳｔａｔＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ　Ｋｉｔ）　Ｊ　（Ｏｘｆ ｏｒｄ　Ｌａｂ　Ｗａｒｅ　Ｄｉｖｉｓｉｏｎ、　Ｓｈｅｒｗｏｏｄ　Ｍｅｄｉ ｃａｌ　Ｃ潤A、ミ ズーリー州セントルイス）は生物学的液体中のマグネシウム値を正確に測定でき るそのような１つのアッセイである。溶解物の所定のバッチのマグネシウム・イ オン濃度が既知であると、溶解物のマグネシウム濃度を最適範囲内にするためま たは反応混合物の半分として使用される修正溶解物調製物の場合には最適範囲の ２倍以内にするため、例えば濃縮されたマグネシウム塩溶液形態の追加的なマグ ネシウムを既知の方法で添加することができる。

かくして、ウサギ網状赤血球溶解物の最終マグネシウム濃度を例えば、塩化また は酢酸マグネシウムの濃縮溶液を’ｌ、　５ｍＭより多いが３．５ｍＭ未満、好 ましくは２．６ｍＭから３．　ＯｍＭの間の濃度まで添加することによって調整 するとき、共役した転写と翻訳が生じることが見い出された。小麦胚芽抽出物を 使用する転写と翻訳の共役化では、約３．　ＯｍＭより多いが約５．２５ｍＭ未 満、好ましくは約４．０ｍＭから４．７５ｍ１ｌに調整された塩化または酢酸マ グネシウムの最終濃度によってタンパク質が産生される。

転写と翻訳の共役反応の条件には、ウサギ網状赤血球溶解物ではりポヌクレオチ ド三リン酸（ＡＴＰ、ＧＴＰＳＣＴＰｌＵＴＰ）およびアミノ酸をそれぞれ各０ ４１および各２０μＭの最終、ａ度で添加することが含まれる。小麦胚芽抽出物 の反応条件は、リボヌクレオチド三１，１ン酸をＣＴＰおよびＵＴＰて０．４ｍ Ｌ　ＧＴＰて０゜５１そして、八ＴＰで１．６０１Ｍの最終１度になるように添 加し、一方アミノ酸を２０〜８０μＭの最終、１度になるように添加することに よって修正される。放射標識したアミノ酸、例えば３５Ｓメチオニンまたは３Ｈ ロインンを共役反応に使用する場合には、対応するアミノ酸はアミノ酸混合物か ら除く。次いで、ＳＦ３、Ｔ７またはＴ３のいずれかのＲ＼Ａポリメラーゼを、 好ましくは５０μｍの反応物当たり約８０〜１６０ユニツトの最終、震度になる ように添加する。翻訳される遺伝子を有するＤＮＡ鋳型は１部ｇの、！１度で添 加し、そして反応容量は水を添加して５０μｍに調整する。次いで、反応物は３ ０℃で１〜２時間時間インキュトート。

好ましい実施態様ではカリウムが反応混合物に添加されるが、マグネシウムとは 対照的に追加的なカリウムはタンパク質産生を余り高めることはなく、適当なマ グネシウム値が既に存在しているとき僅かな改善を提供するだけである。酢酸カ リウムは約５９ｍＭの最適最終濃度になるように添加する。塩化または酢酸カリ ウムを添加できるが、マグネシウムの場合より多い量を添加するので、酢酸カリ ウムが好ましい。約５６ｍＭの濃度の標準的な翻訳溶解物値を使用することがで き、一方スペルミンンは約０．２ｍＭの最終濃度を与えるように添加される。塩 化または酢酸カリウムの最終濃度も標準的な溶解物中の当該成分の量に基づいて 概算されるが、この、震度はマグネシウム濃度と同様内因性成分により僅かに変 化することを認識しなければならない。

転写と翻訳の共役反応の効率または安定性を改善するため所望の追加成分を溶解 物に添加することができる。転写と翻訳の共役反応への１つの通常の添加は鎖延 長の効率を高めるのに十分な量のポリアミンである。絶対にそうでなければなら ないわけてはないが、共役した転写と翻訳では、混合物中て約０．２ｍＭの最終 １度のスペルミジンが最適であり、その際この濃度でタンパク質産生の増加が観 察される。ポリアミンも同様に最適のマグネシウム値に影響を与え、そしてこれ は翻訳反応のマグネシウムの有効１度を幾分低下させることが知られている。ポ リアミンは成る値のマグネシウムに代わることができそしてその結果マグネシウ ム条件の最適化において、多分転写と翻訳の共役の最適マグネシウム値を幾らか 低下させる役割を果たすように思われる。

インビトロ環境での最適マグネシウム４度は池の条件および理由によっても影響 を受ける。例えば、リボヌクレオチド三リン酸濃度が上昇すると、リボヌクレオ チド三リン酸が溶液中のマグネシウムと会合するかまたはキレートを形成する傾 向があるので、最適マグネシウム１度が付随して上昇する。か（して、上記反応 で記載したりポヌクレオチド三リン酸濃度が０．６０１Ｍに上昇するとき、転写 と翻訳の共役反応から得られるタンパク質の産生は大いに低下する。マグネシウ ムの最適濃度はまた細胞溶解物のタイプによって、即ち小麦胚芽抽出物を使用す るのかまたはウサギ網状赤血球を使用するのかによっても変化する。最適値を達 成するために添加される必要なマグネシウム量は、溶解物の濃度が上昇すると溶 解物それ自体からのマグネシウムの寄与も増加するので、反応混合物中で使用さ れる溶解物の濃度により変化する。

溶解物混合物中には多数の成分があるため、最適な塩条件以外のもので悪い影響 を受けるのはＲＮＡからのタンパク質翻訳であるのか、ＤＮＡからＲＮＡの転写 であるのかまたはそれらの両方であるのかを確実に述べることはできない。検出 可能なタンパク質値が反応中に生成しないという観察はいずれの場合でも同じで ある。マグネシウム濃度を、多分ポリアミン濃度によって、少々調整しそしてリ ボヌクレオチド三リン酸濃度値が問題とならないことを観察することによって、 転写と翻訳の共役が観察されるが、これは比較的小さい範囲による場合だけであ る。

ジチオスレイトール（ＤＴＴ）は好ましくは翻訳混合物に添加される。転写と翻 訳の共役反応に加えるとき、ＤＴＴは好ましくは約１．４５ａ＋）ｌの最終濃度 になるように添加される。最適ＤＴＴは小麦胚芽では約５，１ｍＭである。更に 、ＲＮａ５ｉｎのようなりボヌクレアーゼインヒビターは内因性リボヌクレアー ゼを効果的に不活性化させるために溶解物に添加することができる。反応物５０ μｍ当たり４０単位の１度が該反応の延長を助けることが証明されている。ＲＮ ａｓｉｎはウサギ網状赤血球溶解物中での転写とＨＩＲの共役には絶対的な要件 ではないが、小麦胚芽抽出物を使用する転写と翻訳の共役では必要である。後者 からＲＮａｓｉｎを除くと、該溶解物中には活性のりポヌクレアーゼが存在して いるので、タンパク質翻訳は生じない。

ウサギ網状赤血球溶解物での塩化若しくは酢酸カリウム、塩化若しくは酢酸マグ ネシウムおよびスペノ１べ／ンの好ましい共役転写翻訳１変は２５μｍの最適の トリス／酢酸緩衝液（１ｘＴＡ緩衝液＝３３ｍＭのトリス／酢酸ｐＨ７，８，６ ５ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、４ｍＭのスペルミジン、 １ｍＭのＤＴＴ）を添加して達成することができる。標準的な５０μｍのインビ トロ翻訳反応物に上記緩衝液を添加するとき、この緩衝液は溶解物中のマグネシ ウム値を全体でＱ、　５ｍＭ上昇させる。

ウサギ網状赤血球溶解物は製造中に修正することができる。この溶解物は５０％ の濃度（典型的には、５０μｍの反応物当たり２５μｍの溶解物）で使用される ので、好ましい修正は酢酸カリウム濃度を１１８ｍＭに、酢酸マグネシウム濃度 を約５．２ｍＭから約６．０ｍ１ｌに、そしてスペルミジン濃度を０．４ｍ引こ 調整することに係わっている。

このことによって、５０％溶解物を転写と翻訳の共役反応で使用するとき、５９ ｍＭの酢酸カリウム、２．６ｍＭから３．０ｍＭの酢酸マグネシウムおよび０． ２１１１Ｍのスペルミジンの最適最終濃度が与えられる。この溶解物はＲＮ　Ａ ポリメラーゼ（ＳＦ３、Ｔ７またはＴ３）の１つを、好ましくは５０μｌの反応 物当たり８０〜１６０単位の濃度で溶解物に添加することによって更に修正する ことができる。このような溶解物は必要になるまで冷凍保存することができる。

スペルミジンも好ましくは、最適には約０．９ｍＭの最終１度で小麦胚芽抽出物 に添加される。酢酸カリウムは好ましくは約５６．５ｍＭの最終濃度まで添加さ れる。これらの濃度は標準的な小麦胚芽抽出物中のこれら成分の量の概算に基づ いているが、標準的な小麦胚芽抽出物を使用する５０μｍのインビトロ翻訳に５ ．０μｍの１ｘＴＡ緩衝液を添加することによって達成することができ、そして 溶解物自体の内因性成分により僅かに変化させることができる。

小麦胚芽抽出物はまた、溶解物を５０％の濃度で使用するとき、酢酸カリウム、 酢酸マグネシウムおよびスペルミジンの最終濃度が小麦胚芽の上記反応条件で上 記した濃度と同じであるように、製造工程中で修正することもできる。小麦胚芽 抽出物はＲＮ　Ａポリメラーゼの１つを１反応当たり８０〜１６０単位の最終濃 度で添加することによって製造中に更に修正することができる。修正した抽出物 は使用されるまで冷凍保存される。

マグネシウム濃度を標準的溶解物中に存在する値のままにすると、タンパク質の 産生は生じない。反応混合物に１＼ＴＡ緩衝液のマグネシウム以外の他の成分を 全て添加するとタンパク質を産生じない反応が生じる。他方、過剰のマグネシウ ムを添加すると翻訳も一緒に停止する。例えば、ウサギ網状赤血球溶解物を使用 するが約３．５ｍＭの最終マグネシウム濃度を有する同様な反応混合物では、タ ンパク質の翻訳も停止する。この上限は多分、カリウムおよびスペルミジン濃度 のような他のパラメーター、並びにＲＮＡがタンパク質に翻訳されるための最適 マグネシウム濃度を変化させることが知られているリボヌクレオチド三リン酸濃 度に従って僅かに変化する。

修正された小麦胚芽抽出物と修正されたウサギ網状赤血球溶解物は両者共、転写 と翻訳の共役反応の組み立てを促進するキットの部分として含めることができる 。このようなキットは、真核細胞溶解物が調製されそして使用の準備ができてい るので、研究者に対する利便性を改善する。ウサギ網状赤血球溶解物または小麦 胚芽抽出物に加えて上記キットには、ＤＮＡ鋳型を導入して転写と翻訳の共役を 行うのに必要な成分、試薬（酵素を含む）および緩衝液を含めることができる。

溶解物は標準化することができ、または塩濃度の調整が製造中に既に行われてい るか若しくは更には共役した転写と翻訳に必要な１つまたはそれ以上の成分、試 薬または緩衝液も含有されているタイプのものであることができる。

共役したインビトロでの転写と翻訳で産生されたタンパク質の量は種々の態様で 測定することができる。１つの方法は、翻訳されている特別のタンパク質の活性 を測定するアッセイの利用可能性に依存している。タンパク質活性を測定するア ッセイの１例はテクニカルビュレティン（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉ ｎ）　０９７、プロメガコーポレーション、ライスコンシン州マディラン、に記 載されているルシフェラーゼアッセイ系である。これらのアッセイはインビトロ での転写と翻訳の共役反応から産生された機能的に活性のタンパク質の量を測定 する。活性アッセイでは、不適当なタンパク質の折りたたみのためまたはタンパ ク質活性に必要な池の翻訳後修正がないため不活性である全長タンパク質は測定 されない。

インビトロでの転写と翻訳の共役反応で産生されたタンパク質の量を測定するも う１つの方法は既知量の３５８メチオニンまたは３Ｈロイ７ンのような放射標識 アミノ酸を使用しそして続いて、新たに翻訳されたタンパク質に取り込まれた放 射標識アミノ酸の量を測定して反応を行うことである。この方法の記載に関して は、ツインビトロ　トランスレーノヨンテクニカルマニュアル（ｔｈｅ　ｉｎ　 ｖｉｔｒ。

Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｍａｎｕａｌ）　、プロメガコ ーポレーション、ウイスコン７／州マディラン参照。取込みアッセイはインビト ロ翻訳反応で産生された全タンパク質（切断されたタンパク質生成物を含む）中 の放射標識アミノ酸の量を測定する。タンパク質ケル上で放射標識タンパク質を 分離し、そして生成物が適当な大きさであり且つ二次的タンパク質生成物が産生 されていないことをオートラジオグラフィーで確認することが重要である。タン パク質産生の最も正確な測定は、活性測定を取込みの測定と関係付けることであ る。

上記したように、転写と翻訳の共役反応にはＤＮＡ鋳型の導入が必要である。

インビトロでのタンパク質翻訳の更なる増強は多数のクローニング領域の１末端 にボリアへ配列を含有するベクターを使用して達成されている。好ましいベクタ ーはまた多数のクローニング領域の反対側末端にＳＦ３、Ｔ７またはＴ３ＲＮＡ ポリメラーゼプロモーターも含有しているので、ベクター中へのクローニングは ５゛末端にＲＮ　７〜ポリメラーゼプロモーターがモして３°末端にポリＡ配列 が位！している遺伝子を生成させる。クローニングベクターは標準的なインビト ロ転写反応に広く使用されるので、商業的に入手可能な多数のクローニングベク ターは１つまたはそれ以上のプロモーターＳＰ６、Ｔ７またはＴ３を含有してい る。ベクターｐＳＰ６４　（ポリ、＼）はウィスコンノン州マディランのプロメ ガコーポレーションから市販で入手可能である。このベクターはルンフエラーセ 遺伝子をクローン化するために使用され、該遺伝子は続いてウサギ網状赤血球溶 解物を使用する転写と翻訳の共役反応で翻訳された。同じルシフェラーゼ遺伝子 はポリＡを欠く別のベクター中にクローン化させ、そして続いて転写と翻訳の共 役反応で翻訳させた。活性アッセイをこれらの反応から得られた産生物で実施し たとき、活性の顕著な上昇がポリＡ構築物を含有する反応で明白であった。

タンパク質の同時翻訳および初期の駐訳後修正を研究するためには、転写と翻訳 の共役反応はイヌ膵臓ミクロゾーム膜の存在下で実施することができるっ／グナ ルベブチド開裂、摸挿入、トランスロケ−／ヨンおよびコアグリコリル化は研究 できる修正の幾つかである。ミクロゾーム膜の存在下でβ−ラクタマーゼプリカ ーサーのクローンを使用する転写と翻訳の共役反応は予期された形態のタンパク 質を産生じ、シグナルプロセ／ングが生じていたことを示した。同様に、ミクロ ゾーム膜の存在下でサツカロミセス・セレビシエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ）から得られたα因子のプリカーサ−のクローンを使用する転写と翻訳の共役反 応は所期のプロセシングされた形態のタンパク質を産生じ、グリコジル化を示し た。

共役した転写と翻訳はタンパク質のインビトロ翻訳を必要とする任意の方法で使 用することができる。これらの方法には、得られたタンパク質の構造および機能 を研究するための遺伝子のインビトロ突然変異誘発が含まれる。池の方法は反応 残部からタンパク質を単離するかまたは精製する目的での修正タンパク質のイン ビトロ翻訳およびタンパク質の抗体を産生させる目的でのタンパク質のインビト ロ翻訳である。ウサギ網状赤血球溶解物または小麦胚芽抽出物における共役した 転写と翻訳の方法は、これらの系が余り時間を必要とせずそして高い値のタンパ ク質を産生する点で、現行のインビトロ翻訳方法を超える利点を提供する。

このような静置した転写と翻訳の共役反応を使用することにはまた連続または流 動反応を超える多数の利点がある。先ず第１に、２つの系の適用には主要な差異 がある。連続系はタンパク質の大規模な工業的製造用であり、一方装置系反応は 日常の研究者が現在行っているインビトロ翻訳に適する。連続的翻訳は実施がは るかにより高価であり、装置の投資（１つの＾ｍ１ｃｏｎ　ｕｎｉｔには約２． ０００米ドルかかる）並びにかなりの量の試薬を特徴とする特に、連続的な真核 生物反応作業を行うために使用されるＲＮＡポリメラーゼの値は簡単な研究用途 には非常に高価なものである（２０．０００〜３０．０００単位／反応）。連続 的反応は比較的大量で行われるように設計されており、一方装置反応は反応容量 が典型的には５０μｍがまたはそれ未満のオーダーにすぎないので、余分の装置 を必要とせず且つ少量の試薬しか必要でない。

連続的反応に必要な時間は２４から１００時間までのいずれかのかなりのもので あり、一方装置反応には完結まで僅か１乃至２時間しか必要でないっ研究者が現 在実施しているインビトロ翻訳では、静置系はインビトロ翻訳段階を回避するこ とによって大部分の分析または他の研究適用で時間のかなりの節約をもたらす。

連続的反応の組み立ておよび実施の両方に時間が必要であるため、このような系 では転写と翻訳が共役していても典型的な研究者にとって正味時間は節約されな いっ更に、転写と翻訳の静置共役系では、ＲＮＡ鋳型を使用する標準的なインビ トロ翻訳と比較してタンパク質産生の顕著な増加が観察される。ＤＮＡ鋳型が３ ′ポリＡ配列を有しているとき、タンパク質産生の更なる増加が静置系で観察さ れる。

それ故、一般に、費用の有効性および使用の容易さのみならず池の既知の真核生 物系を超える顕著な時間の節約およびタンパク質産生の増加のため、静置系は共 役した転写と翻訳を日常の研究者に対し利用可能にする。

実施例１ 共役した転写と翻訳をルシフェラーゼ遺伝子を有するＤＮＡ構築物で実施した。

反応はルンフエラーゼアノセイ系（プロメガコーポレーション、ウィスコンシン 州マディラン）を使用してルシフェラーゼ酵素の産生をアッセイした。ルシフェ ラーゼ活性はターナ−（Ｔｕｒｎｅｒ）ルミノメータ−を使用してターナ−光単 位で測定される。転写と翻訳の共役は次の反応条件下で達成させた２５．０μｍ 　標準的なウサギ網状赤血球溶解物８．０１１１　ｒＮＴＰ　（ＡＴＰｌＧＴＰ 、ＵＴＰ、ＣＴＰ）各２．５ｍＭ１０μｌ　ＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼ（８０ 単位／μｍ）２．５μｔ　ＩＸＴＡ緩’ａｍ本 １．０μｌ　ＲＮａｓｉｎ（４０単位／μｍ）１、０　ｔｔ　ｌ　ｐＳＰ６４ポ リ、Ａ／１ｕｃＤＮＡ（Ｉμｇ）環状プラスミドＤＮＡ１．０４１　１ｍＭアミ ノ酸（完全） ＊１ｘＴＡ緩衝液は３３ｍＭのトリス／酢酸、ｐＨ７，８，６５−の酢酸カリウ ム、ｌｏｍＭの酢酸マグネシウム、４ｍ１ｌのスペルミノンおよび１ｍＭのＤＴ Ｔからなる。

二の反応物は３０℃で１５時間インキュベートした。１５時間後、上記反応から 得られた２、５μｌの試料は、適所に１００倍の光フィルターを有するルミノメ ータ−中でアッセイした。試料は３０．０００を超えるターナ−光単位を生じさ せｔこ、ＤＮＡ力（反応から除かれているかまたは１ｘＴＡを含有させない対照 実験で（まターナ−光単位は生じなかった。

実施例２ 共役した転写と翻訳を小麦胚芽抽出物を含有する反応で同様に実施した。また、 使用されたＤ　Ｎ　、Ａ構築物もルシフェラーゼ遺伝子を有してＬまた。転写と 翻訳の共役は次の条件下で達成させた ２５．０μｍ　標準的な小麦胚芽抽出物８．０μｌ　ｒＮＴＰ　（ＡＴＰ、ＧＴ Ｐ、ＵＴＰＳＣＴＰ）各２．５ｍＭ５．０μｌ　１ｘＴＡ緩衝液 １、Ｏμｌ　ＲＮａｓｉｎ　（４０単位／μｍ）１．０μＩ　ＳＦ３　ＲＮＡポ リメラーゼ（８０単位／μｌ）１．０μｌ　ｐＳＰ６４ポリＡ／１ｕｃＤＮＡ（ １μｇ）環状プラスミドＤＮＡ１．０μｍ１ｍＭアミノ酸（完全） 反応物は３０℃で１時間インキュベートした。１時間後、この反応力）ら得られ た２゜５μｍの試料は、適所に１００倍の光フィルターを有するルミノメーター 中でアッセイした。試料は５．０００を超えるターナ−光単位を生じさせた。

実施例３ 共役した転写と翻訳はまた成る種の成分または試薬を添加すること１こよって製 造中に修正された溶解物を用いても実施した。ウサギ網状赤血球溶解物の製造中 に、分別物をとり分けそして冷凍する前に溶解物にＳＦ３　ＲＮＡポ１ツメラー ゼを添加した。ＳＦ３は２５μｍの溶解物当た引６０単位のＳＦ３の値（こなる よう（こ添加した。溶解物は素早（冷凍しそして使用するまで一７０℃で貯蔵し た。転写と翻訳の共役反応はＳＦ３を更には添加しないことを除Ｌｓで実施ｇＡ １１の条件ζ二軸って組み立てた。製造中にＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼを添加 されたウサギ網状赤血球溶解物で実施した反応はタンパク質を産生させた。更な る実験で、転写と翻訳の共役に２・要な他の成分（例えば、緩衝液やアミノ酸） は溶解物の製造中に添加できることが示された。添加された成分を有する溶解物 は共役反応てタンノ＜り實を産生させるためにＤＮＡ鋳型を導入して使用するこ とができる。

実施例４ 種々のタンパク質の遺伝子を有するＤ　Ｎ　Ａ構築物は転写と翻訳の共役反応で 試験した。放射標識したアミノ酸（３５Ｓメチオニン）を反応混合物に加えた以 外は実施例１と同一の反応条件を使用した。メチオニンはアミノ酸混合物から除 いた。

反応はＳＦ３またはＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの後でクローン化され たプラスミドＤＮＡ構築物を使用して実施した。ルシフェラーゼをコードするｐ ＧＥ〜ＩＬｕｃプラスミドＤ　Ｎ　Ａを転写と翻訳の共役反応で使用し、そして 放射標識したアミノ酸の１５．３％の取込みをもたらした。これを、転写された ルシフェラーゼクローンのＲＮＡ鋳型を使用する標準的なインビトロ翻訳（これ は０．８％の取込みをもたらした）と比較した。これらの反応から得られた試料 はＳＤＳ／ＰＡＧＥで実施して、タンパク質産生物がルシフェラーゼの適当な大 きさであったことが確認された。更なる実験はＳＰ６プロモーターの後のβ−ラ クタマーセ遺伝子およびＳ　セレビシェのα因子のクローンを使用して実施した 。β−ラクタマーゼのＲＮ　Ａ鋳型を使用する標準的なインビトロ翻訳では標識 されたアミノ酸の３％の取込みをもたらし、一方ＤＮＡ鋳型を使用する転写と翻 訳の共役反応では２６８％の取込みをもたらした。α因子遺伝子のＲＮＡ鋳型を 使用する標準的なインビトロ翻訳反応では０．８％の取込みをもたらしたが、一 方ＤＮＡ鋳型を使用する転写と翻訳の共役反応では１２．４％の取込みをもたら した。更に、反応の試料は産生されたタンパク質の大きさを確認するためＳＤＳ ／ＰＡＧＥゲル上で流した。転写と翻訳の共役反応でＤＮＡ鋳型から得られた池 のタン／＜り質には次のものがある：ＴＦＩＩ［）転写因子、Ｔ７プロモーター の後、５％の取込み：Ｃｊｕｎ転写因子、Ｔ７の後、１３．４％の取込み：β− ガラクトシダーゼ、ＳＰ６プロモーターの後、２８％の取込み：およびポリＡ／ ｌｕｃ、ポリＡベクター中のルシフェラーゼ遺伝子、ＳＦ３の後、２５．９％の 取込み。

実施例５ 共役した転写と翻訳はイヌのミクロゾーム膜の存在下および不存在下でβ−ラク タマーゼブリカーサーのＤＮＡ構築物を使用してウサギ網状赤血球溶解物で実施 してタンパク質の転写後修正を試験した。これらの反応物はオートラジオグラフ ィーで産生物を視覚化するために標識アミノ酸を有していた。反応物から得られ た産生物はＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル上で流した。ミクロゾーム膜を有さない反応か ら得たタンパク質産生物は約３１５キロダルトン（Ｋｄ）で移動し、一方ミクロ シーム膜を有する反応から得たタンパク質産生物は約２８．９Ｋｄで移動し、シ グナル配列がプロセシングされたことを示した。

同様な転写と翻訳の共役実験で、Ｓ、セレビシェのα因子のり、ＮＡＡ構築物イ ヌのミクロゾーム膜の存在下および不存在下の両方で翻訳させた。更に、放射標 識産生物もケル上で流し、そしてその結果は、１８．６Ｋｄのプリカーサ−が３ ２．ＯＫｄで移動するタンパク質にプロセシングされたことを示し、α因子がグ リコジル化されたことを示した。

実施例６ 共役した転写と翻訳は、熱循環増幅方法から得たＤＮＡで実施した。このような り　Ｎ　Ａの唯一の要件は増幅されたフラグメントがＲＮＡポリメラーゼプロモ ーターを有することである。実験はｐＧＥＭＬｕｃプラスミドから増幅されたＤ ＮＡフラグメントを使用して実施した。得られたフラグメントは５Ｐ６ＲＮＡポ １ツメラーゼプロモーターの配列およびルシフェラーゼ遺伝子の配列を有してい た。

このフラグメントを実施例１の条件に類似する条件下で共役反応に導入したとき 、ルシフェラーゼタンパク質が産生された。Ｔ７プロモーターの後のｐＧＥＭＥ Ｘ／遺伝子１０フラグメント、およびＳＰ６プロモーターの後のβ−ガラクトシ ダーゼフラグメントを含む増幅された他のＤＮＡフラグメントを共役反応で翻訳 させた。

本願発明の１つの実施態様を記載したが、本発明の精神または下記請求の範囲か ら離れることなく種々の変更および修正をなすことができることは当業者１こ明 白であろう。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＲＮＡがＤＮＡから転写され且つＲＮＡがタンパク質に翻訳される水準にマ グネシウム濃度を高めるのに十分な量のマグネシウム化合物を真核無細胞抽出物 に加えることからなる上記抽出物中でＤＮＡからの転写と翻訳を共役させる方法 。 ２．上記抽出物がウサギ網状赤血球溶解物である請求項１に記載の方法。 ３．上記最終マグネシウム濃度が約２．５ｍＭから約３．５ｍＭである請求項２ に記載の方法。 ４．上記最終マグネシウム濃度が約２．６ｍＭから約３．０ｍＭである請求項２ に記載の方法。 ５．ポリアミンが上記溶解物に添加される請求項２に記載の方法。 ６．上記ポリアミンがスペルミジンである請求項５に記載の方法。 ７．上記スペルミジンを上記溶解物に加えて約０．２ｍＭから約０．４ｍＭの濃 度にする請求項６に記載の方法。 ８．上記溶解物のカリウム濃度を約４０ｍＭから約１００ｍＭに調整する請求項 ２に記載の方法。 ９．内因性リボヌクレアーゼを効果的に不活性化するのに十分な量のリボヌクレ アーゼインヒビターを上記溶解物に添加することを含む請求項２に記載の方法。 １０．上記リボヌクレアーゼインヒビターがＲＮａｓｉｎである請求項９に記載 の方法。 １１．転写と翻訳の共役に必要な追加成分を上記溶解物に添加することを含む請 求項２に記載の方法。 １２．上記追加成分の１つがＲＮＡポリメラーゼからなる請求項１１に記載の方 法。 １３．上記ポリメラーゼがＳＰ６、Ｔ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼからなる 群から選択される請求項１２に記載の方法。 １４．ＤＮＡ鋳型が上記溶解物に添加される請求項２に記載の方法。 １５．上記ＤＮＡ鋳型か複数のクローニング領域を有する請求項１４に記載の方 法。 １６．ポリメラーゼプロモーター配列が上記複数のクローニング領域の１方の末 端に位置している請求項１５に記載の方法。 １７．上記複数のクローニング領域へのクローニングによってＲＮＡポリメラー ゼプロモーターが５′末端にそしてポリＡ配列が３′末端に位置する遺伝子が生 じるように、上記鋳型が上記複数のクローニング領域の反対側末端にポリＡ配列 を有する請求項１６に記載の方法。 １８．上記プロモーター配列に対応しているポリメラーゼが上記溶解物に添加さ れる請求項１６に記載の方法。 １９．上記ＤＮＡ鋳型が、ポリメラーゼ鎖反応として知られる方法によって製造 された超コイル分子、共有的閉環状分子、線状分子またはＤＮＡ断片からなる群 から選択される形態である請求項１４に記載の方法。 ２０．ＤＮＡからＲＮＡの転写を可能にするのに十分な量のリボヌクレオチド三 リン酸が上記溶解物に添加されることを含む請求項２に記載の方法。 ２１．上記溶解物に上記リボヌクレオチド三リン酸が各々０．４ｍＭ添加される 請求項２０に記載の方法。 ２２．上記抽出物が小麦胚芽抽出物である請求項１に記載の方法。 ２３．上記最終マグネシウム濃度が約３．０ｍＭから約５．２５ｍＭである請求 項２２に記載の方法。 ２４．上記最終マグネシウム濃度が約４．０ｍＭから約４．７５ｍＭである請求 項２２に記載の方法。 ２５．ポリアミンが上記抽出物に添加される請求項２２に記載の方法。 ２６．上記ポリアミンがスペルミジンである請求項２５に記載の方法。 ２７．上記スペルミジンを上記抽出物に添加して約０．２ｍＭから０．９ｍＭの 濃度にする請求項２６に記載の方法。 ２８．上記抽出物のカリウム濃度が約５０ｍＭから約１５０ｍＭに調整される請 求項２２に記載の方法。 ２９．内因性リボヌクレアーゼを効果的に不活性化するのに十分な量のリボヌク レアーゼインヒビターが上記溶解物に添加されることを含む請求項２２に記載の 方法。 ３０．上記リボヌクレアーゼインヒビクーがＲＮａｓｉｎである請求項２９に記 載の方法。 ３１．転写と翻訳の共役に必要な追加成分が上記溶解物に添加されることを含む 請求項２２に記載の方法。 ３２．上記追加成分の１つがＲＮＡポリメラーゼからなる請求項３１に記載の方 法。 ３３．上記ポリメラーゼがＳＰ６、Ｔ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼからなる 群から選択される請求項３２に記載の方法。 ３４．ＤＮＡ鋳型か上記抽出物に添加される請求項２２に記載の方法。 ３５．上記ＤＮＡ鋳型が複数のクローニング領域を有する請求項３４に記載の方 法。 ３６．ポリメラーゼプロモーター配列が上記複数のクローニング領域の１方の末 端に位置している請求項３５に記載の方法。 ３７．上記複数のクローニング領域へのクローニングによってＲＮＡポリメラー ゼプロモーターが５′末端にそしてポリＡ配列か３′末端に位置する遺伝子が生 じるように、上記鋳型が上記複数のクローニング領域の反対側末端にポリＡ配列 を有する請求項３６に記載の方法。 ３８．上記プロモーター配列に対応しているポリメラーゼが上記抽出物に添加さ れる請求項３６に記載の方法。 ３９．上記ＤＮＡ鋳型が、ポリメラーゼ鎖反応として知られる方法によって製造 された超コイル分子、共有的閉環状分子、線状分子またはＤＮＡ断片からなる群 から選択される形態である請求項３４に記載の方法。 ４０．ＤＮＡからＲＮＡの翻訳を可能にするのに十分な量のリボヌクレオチド三 リン酸が上記抽出物に添加されることを含む請求項２２に記載の方法。 ４１．上記リボヌクレオチド三リン酸が０．４ｍＭのＣＴＰ、０．４ｍＭのＵＴ Ｐ、０．５ｍＭのＧＴＰおよび１．６ｍＭのＡＴＰの値で上記抽出物に添加され る請求項４０に記載の方法。 ４２．請求項１に従って調製された、修正された真核無細胞抽出物、４３．請求 項４２に記載の抽出物を含有する容器からなるキット。 ４４．請求項５または請求項２５に従って調製された、修正された真核無細胞抽 出物。 ４５．請求項４４に記載の抽出物を含有する容器からなるキット。 ４６．請求項１２または請求項３２に従って調製された、修正された真核無細胞 抽出物。 ４７．請求項４６に記載の抽出物を含有する容器からなるキット。 ４８．特定のポリメラーゼプロモーター配列を有するＤＮＡ鋳型から溶液中で転 写と翻訳の共役によってタンパク質を製造する方法であって、該方法は真核無細 胞抽出物の標準的な調製物の溶液を調製し、転写と翻訳を支えるのに十分な濃度 のリボヌクレオチド三リン酸、アミノ酸および上記鋳型ＤＮＡの上記プロモータ ーに対応しているポリメラーゼで上記抽出物溶液を修正し、そしてＲＮＡが上記 ＤＮＡ鋳型から転写され且つ該ＲＮＡがタンパク質に翻訳される水準に最終マグ ネシウム濃度を上昇させるのに十分な量のマグネシウム化合物を上記抽出物溶液 に添加することからなる方法。 ４９．上記抽出物溶液混合物中のマグネシウムの最終濃度が約０．５ｍＭ上昇さ せられる請求項４８に記載の方法。 ５０．上記抽出物がウサギ網状赤血球溶解物である請求項４８に記載の方法。 ５１．上記最終マグネシウム濃度が約２．５ｍＭから約３．５ｍＭである請求項 ５０に記載の方法。 ５２．上記最終マグネシウム濃度が約２．６ｍＭから約３．０ｍＭである請求項 ５０に記載の方法。 ５３．ポリアミンが上記溶液に添加される請求項５０に記載の方法。 ５４．上記ポリアミンがスペルミジンである請求項５３に記載の方法。 ５５．上記スペルミジンを上記溶液に添加して約０．２ｍＭから約０．４ｍＭの 濃度にする請求項５４に記載の方法。 ５６．上記溶液のカリウム濃度が約４０ｍＭから約１００ｍＭに調整される請求 項５０に記載の方法。 ５７．内因性リボヌクレアーゼを効果的に不活性化するのに十分な量のリボヌク レアーゼインヒビターが上記溶液に添加されることを含む請求項５０に記載の方 法。 ５８．上記リボヌクレアーゼインヒビターがＲＮａｓｉｎである請求項５７に記 載の方法。 ５９．転写と翻訳の共役に必要な追加成分が上記溶液に添加されることを含む請 求項５０に記載の方法。 ６０．上記追加成分の１つがＲＮＡポリメラーゼを含む請求項５９に記載の方法 。 ６１．上記ポリメラーゼがＳＰ６、Ｔ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼからなる 群から選択される請求項６０に記載の方法。 ６２．上記ＤＮＡ鋳型が、ポリメラーゼ鎖反応として知られる方法によって製造 された超コイル分子、共有的閉環状分子、線状分子またはＤＮＡ断片からなる群 から選択される形態である請求項５０に記載の方法。 ６３．上記ＤＮＡ鋳型が複数のクローニング領域を有する請求項５０に記載の方 法。 ６４．ポリメラーゼプロモーター配列が上記複数のクローニング領域の１方の末 端に位置している請求項６３に記載の方法。 ６５．上記複数のクローニング領域へのクローニングによってＲＮＡポリメラー ゼプロモーターが５′末端にそしてポリＡ配列が３′末端に位置する遺伝子が生 じるように、上記鋳型が上記複数のクローニング領域の反対側末端にポリＡ配列 を有する請求項６４に記載の方法。 ６６．上記溶液に上記リボヌクレオチド三リン酸が各々０．４ｍＭ添加される請 求項５０に記載の方法。 ６７．上記抽出物が小麦胚芽抽出物である請求項４８に記載の方法。 ６８．上記最終マグネシウム濃度が約３．０ｍＭから約５．２５ｍＭである請求 項６７に記載の方法。 ６９．上記最終マグネシウム濃度が約４．０ｍＭから約４．７５ｍＭである請求 項６８に記載の方法。 ７０．ポリアミンが上記溶液に添加される請求項６７に記載の方法。 ７１．上記ポリアミンがスペルミジンである請求項７０に記載の方法。 ７２．上記溶液に上記スペルミジンを添加して約０．２ｍＭから約０．９ｍＭの 濃度にする請求項７１に記載の方法。 ７３．上記溶液のカリウム濃度が約５０ｍＭから約１５０ｍＭに調整される請求 項６７に記載の方法。 ７４．内因性リボヌクレアーゼを効果的に不活性化するのに十分な量のリボヌク レアーゼインヒビターが上記溶液に添加されることを含む請求項６７に記載の方 法。 ７５．上記リボヌクレアーゼインヒビターがＲＮａｓｉｎである請求項７４に記 載の方法。 ７６．転写と翻訳の共役に必要な追加成分が上記溶液に添加されることを含む請 求項６７に記載の方法。 ７７．上記追加成分かＲＮＡポリメラーゼからなる請求項７６に記載の方法。 ７８．上記ポリメラーゼがＳＰ６、Ｔ７およびＴ３ＲＮＡポリメラーゼからなる 群から選択される請求項７７に記載の方法。 ７９．上記ＤＮＡ鋳型が、ポリメラーゼ鎖反応として知られる方法によって製造 された超コイル分子、共有的閉環状分子、線状分子またはＤＮＡ断片からなる群 から選択される形態である請求項６７に記載の方法。 ８０．上記ＤＮＡ鋳型が複数のクローニング領域を有する請求項６７に記載の方 法。 ８１．ポリメラーゼプロモーター配列が上記複数のクローニング領域の１方の末 端に位置している請求項８０に記載の方法。 ８２．上記複数のクローニング領域へのクローニングによってＲＮＡポリメラー ゼプロモーターが５′末端にそしてポリＡ配列が３′末端に位置する遺伝子が生 じるように、上記鋳型が上記複数のクローニング領域の反対側末端にポリＡ配列 を有する請求項８１に記載の方法。 ８３．上記リボヌクレオチド三リン酸が０．４ｍＭのＣＴＰ、０．４ｍＭのＵＴ Ｐ、０．５ｍＭのＧＴＰおよび１．６ｍＭのＡＴＰの値で上記溶液に添加される 請求項６７に記載の方法。