JPH06504675A - 自己抗体の製造方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 自己抗体の製造方法 発明の分野 本発明は自己免疫疾患の特徴的な抗原と反応する自己抗体の製造方法、及び自己 免疫疾患に対する治療的効果を有する物質についてのスクリーニング方法に関す る。

発明の背景 ヒト免疫系を研究する目的のため、様々な動物、特にマウスのモデルが作製され ており、ここで免疫不全マウスには免疫系の一部を構成するヒト細胞又は組織が 移植されている。この目的にとって好まれているマウス種は重症複合免疫不全（ ＳＣＩＤ）マウスであり、これはＴ及び８９２３球を欠いている。従ってかかる マウスはＴ及びＢ細胞により仲介される免疫機能を欠いている（ＳＣＩＤマウス マウス種詳しい説明はＧ、　Ｃ，Ｂｏｓｍａら、Ｎａｔｕｒｅ　３０１．１９８ ３年２月１０日、頁５２７−５３０を参照のこと）。

従って、ＪｏＭｏＭＣＣＵｎｅら、５ｃｉｅｎｃｅ　２４１１１９８８年９月２ ３日、頁１６３２−１６３９　（ＥＰ３２２．２４０も参照のこと）は、幹細胞 のヒトＴ及びＢ細胞への分化が事実上起こるように、ヒト胎児肝細胞（幹細胞の 起源として）、並びに胸腺及びリンパ節へとそれぞれが発育する胸腺及びリンパ 節組織の５ＣｒＤマウスへの移植を述べている。ヒト免疫グロブリンを作るため にバイブリド５ＣＩＤマウスが利用できることが提案されている。

Ｄ、　Ｅ、　Ｍｏ５ｉｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ　３３５　．１９８８年９月１５日 、頁２５６−２５９は、正常／健康ドナーに由来するヒト末梢血液リンパ球白血 球（ＰＢＬ）の５ＣＩＤマウスへの移植による、機能性ヒト免疫系の５ＣＩＤマ ウスへの転移を報告している。この再構成マウスはヒト免疫グロブリンを分泌し 、そしてこのマウスをテタヌストキソイドで免疫すると特異的な抗体応答が誘発 される。この再構成マウスはワクチンに対するヒト免疫応答を研究するため、免 疫調節因子を調べるため、並びに感染症及び新形成における病理機構を研究する ために利用できうる。

Ｍ、　Ａ、　Ｄｕｃｈｏｓａｌら、Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、１７２．１９９０年９ 月、頁９８５−９８８は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者由来のＰＢＬ の５ＣＩＤマウスへの転移を述べている。この再構成マウスＳＬＥドナーの力価 に匹敵するそれにおいて、抗核抗体を含むヒト免疫グロブリンを生産する。

ＳＬＨの進行を調べる及び様々な潜在的な治療法を比較するためにこのマウスの モデルを利用することが提案されている。

発明の概要 本発明は自己免疫疾患の特徴的な抗原に反応する自己抗体を製造する方法に関連 し、この方法は、 （ａ）自己免疫疾患に苦しむドナー個体に由来するリンパ球を免疫不全哺乳動物 に投与し、 （ｂ）前記哺乳動物のうちの少なくとも一匹における免疫細胞の再構成を可能と する十分なる期間の経過後、所望の自己抗体を生産する再構成哺乳動物を選択し 、 （ｃ）この選択した哺乳動物からリンパ球を単離する前又は後で、そのリンパ球 を不死化させ、そして （ｄ）この不死化Ｂ−リンパ球を、所望の自己抗体のその生産を可能とする条件 のもとで培養し、次いで生ずる自己抗体をこの培養物から回収すること、 を含んで成る。

本明細書において、「自己抗体」なる語は、個体の血液又は組織における存在が 自己免疫疾患の進行又は樹立の指標となる抗体と同−又は機能的に相当する抗体 を意味しており、「機能的に相当」とは、この自己抗体が、進行している又は樹 立した自己免疫疾患を有する個体に由来する真性自己抗体のと同一の（複数の） 抗原と反応することを意味すると解釈される。この語は抗体のフラグメント、例 えはＦａｂ’　、　Ｆ（ａｂ’　）ｚ、　Ｆｖ、単鎖ドメイン抗体等を含むこと を意図する。

「免疫不全哺乳動物」なる語は、免疫能力のかなり低下した哺乳動物、特に機能 性Ｂ及び／又はＴ細胞を欠く哺乳動物を意味することを意図している。かかる不 全の一般的な症状は通常重症複合免疫不全（ＳＣｒＤ）と呼ばれている。

「再構成」なる語は、哺乳動物宿主に免疫細胞を投与し、そしてそれらの細胞を この宿主の中で増殖させることによる、哺乳動物の宿主における少なくとも部分 的に機能的な免疫系の樹立を意味するように用いている。「再構成哺乳動物」は このように処置された哺乳動物である。

本発明にかかわる方法はヒト自己抗体を再現よく、且つ、大量に獲得する好適な 手法を提供する。所望の自己抗体を生産する哺乳動物を選択し、次いでその不死 化Ｂ−リンパ球からこの自己抗体を単離することにより、ドナー個体におけるこ の自己抗体の生成を生じせしめる抗原を単離又は特性化せずに、対象の自己抗体 を製造することが可能である。

対象の自己抗体は実質的に純粋な単離状態で製造されつるため、自己免疫疾患を 診断する通常かなりめんどうであるアッセイ手順を大いに簡素化することが可能 でありうる。糖尿病の場合、臨床的に無症候な前糖尿病期における疾患の診断の ための現状利用されている手順は間接免疫蛍光による高細胞（ｉｓｌｅｔ　ｃａ ｌｌ）抗体の検出にあト免疫グロブリンとインキュベートし、そして紫外顕微鏡 のもとで検出する（例えば、Ｇ、　Ｆ、　Ｂｏｔａｚｚｏら、Ｌａｎｃｅｔ　ｉ ｉ、１９７４、頁１２７９−１２８２を参照のこと）。他方、高細胞抗体を検出 するために免疫組織化学手順が利用されている（例えば、Ａ、　Ｔａｋａｈａｓ ｈｉら、利用する手順は時間がかかり、そして実施するために特別な装置を必要 とする。

これに反して、本発明は、自己免疫症状を診断するのに現状利用されているもの よりも簡単、且つ、より信頼性のあるアッセイを実施することを可能とする。例 えば、競合アッセイを組立てることが可能であり、この場合、本発明により製造 した予め決定しておいた量のラベル化自己抗体を、標的抗原（即ち、この自己抗 体と反応する抗原）を含む調製品と、患者血清を伴ってインキュベートする。

血清を全く加えていないコントロールに対する標的抗原に結合したラベル化抗体 の減少量は従って血清中の自己抗体の存在を指標するであろう。かかるアッセイ 手順は、対照標準品としての陽性患者血清の利用よりも血清中の自己抗体の存在 のより正確な決定を可能とする。これはまた患者血清中の自己抗体の量を定量す ることを可能とする。更に、本方法により製造される自己抗体はヒト抗体であり 、従ってそれは例えばマウス抗体よりも、患者血清中の自己抗体の反応性により 匹敵する状況において標的抗原に反応する。

別の観点において、本発明は自己免疫疾患に対する治療的効果を有する物質につ いてのスクリーニング方法に関し、この方法は、特定の自己免疫疾患に対する治 療的効果を有すると予測される物質を、問題の自己免疫疾患に苦しむドナー個体 の機能性リンパ球により再構成された、且つ、標的細胞、組織又は器官を認識す るＴ−細胞の投与された免疫不全哺乳動物に投与し、次いで前記Ｔ−細胞と前記 標的細胞、組織又は器官との反応性に及ぼすこの投与した物質の任意の効果を決 定することを含んで成る。

本明細書において、「標的細胞、組織又は器官」なる語は、細胞、組織又は器官 であってＴ−細胞によるその崩壊又は機能の不活性化標的細胞、組織又は器官を 認識するＴ−細胞（Ｔ−細胞系又はＴ−細胞クローンのいづれか）は自己免疫疾 患に苦しむ患者に由来しうる（例えば、Ｂ、　Ｒｏｅｐら、Ｎａｔｕｒｅ　３４ ５．１９９０、頁６３２−６３４を参照のこと）。

発明の詳細な説明 本発明の方法は、別の哺乳動物におけるヒト自己抗体の製造を可能とする点が特 に重要である。従って、本発明の好ましい態様において、ドナー個体はヒトドナ ーである。免疫不全哺乳動物に投与されるリンパ球は従ってヒト末梢血液から獲 得するのが好ましい。

原則的には、本方法により製造される自己抗体により診断されうる自己疾患に制 限はない。従って、該自己抗体は器官特異的及び全身自己免疫疾患の両方の特徴 である抗原に反応しつる。かかる自己免疫疾患の適当な例はインスリン依存性真 性糖尿病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、甲状腺炎、重症筋無力症及 びリウマチ性関節炎である。特に自己免疫疾患はインスリン依存性真性糖尿病（ ＩＤＤＭ）である。

前記した通り、ヒト組織又は細胞の移植された免疫不全マウスはヒト免疫系の研 究のための好適な動物モデルを担う。本方法において用いた免疫不全哺乳動物は 従ってマウス、特に５ＣＩＤマウスである。

本発明につながる研究の際に、再構成動物における自己反応性細胞により所望の 自己抗体の生産を刺激することが、１又は複数の対応の標的抗原による、単離さ れたその抗原もしくはその機能的相当物の形態においての、又はこの抗原を含む 器官、組織もしくは細胞の形態においての、この哺乳動物のその後の免疫化（即 ち、再構成後の）によって可能であることが見い出された。これに関連して、「 標的抗原Ｊなる語は、自己抗体又はこの抗体を生産する細胞が反応する抗原を意 味することを意図している。哺乳動物に投与すべきリンパ球がＩＤＤＭ患者に由 来するとき、この再構成哺乳動物をランゲルハンス島、島β−細胞又はそれらに 由来する抗原によって適当に刺激してよい。この標的抗原はリンパ球ドナーと同 種に由来する必要がないことに注目すべきである。従って、例えばヒトリンパ球 の投与された再構成哺乳動物におけるヒト自己抗体の生産を刺激するため、哺乳 動物を例えばラットの（複数の）高細胞によって免疫してよい。

本目的の特に着目すべきことは、所望の自己抗体が、再構成哺乳動物において、 リンパ球ドナー個体の血清中に匹敵する、又は好ましくはそれより高い濃度で生 産されうることが見い出されたことにある。これは、再構成哺乳動物の免疫細胞 が対象の自己抗体を優先的に生産し、より多くの数の自己抗体生産性Ｂ−リンパ 球がその後二〇哩乳動物から単離されることが可能となることを示唆している。

再構成哺乳動物により生産される所望の自己抗体の濃度／力価は、リンパ球ドナ ー血清において見い出されるものよりも、適切には少なくとも２倍高い、より好 ましくは少なくとも５倍高い、最も好ましくは少なくとも１０倍高い、例えば約 ２０倍高い（これは例えばＥＬＩＳＡ又はラジオイムノアッセイ技術により測定 ）。

本発明の工程（Ｃ）におけるＢ−リンパ球の不死化は、かかる細胞を不死化せし める任意の好適な手法において行われつる。例えば、不死化は、哺乳動物からＢ −リンパ球を単離する前に、この再構成哺乳動物にニブスティン−バーウィルス を接種する（例えば、この感染性ウィルスを含む培養培地を哺乳動物に注射する ことによる）ことによって行われうる。他方、不死化は、例えばり、　Ｇｏｏｄ ｓｅｎらＪ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　１０１．１９８７、頁１９３− ２００に記載の方法に従い、選別した再構成哺乳動物から単離したＢ−リンパ球 のニブスティン−バーウィルス形質転換によって行われつる。更に、Ｂ−リンパ 球は例えばＣａｒｒｏｌｌら、Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　５１９ ８６、頁６１ｆｆに記載の通りに、再構成哺乳動物からの単離後の適切な不死細 胞系との融合によって不死化されつる。

不死化Ｂ−リンパ球の培養及びこの培養物からのその回収（本発明の方法の工程 （ｄ））は、例えばＣａｒｒｏｌｌら、前掲に記載の常用の手順に従って行われ うる。

自己免疫疾患に対する治療的効果を有する物質についてのスクリーニングの本発 明の方法において、この機能性ドナーリンパ球は好ましくは問題の自己免疫疾患 に対する自己抗体を生産するＢ−リンパ球である。このスクリーニング方法の再 現性の向上を保障するため、このＢ　−ＩＪンバ球は好都合には不死化Ｂ−リン パ球、特に前記した本発明の方法（工程（ａ）−（Ｃ））により調製したリンパ 球でありうる。このリンパ球は好ましくはヒトリンパ球である。本発明の方法が 糖尿病の処置において有用な物質のスクリーニングを意図するとき、このリンパ 球は糖尿病患者に由来するべきである。

ヒト免疫系に匹敵する試験系を確立するため、本発明のスクリーニング方法にお いて用いるＴ−細胞はヒト細胞であることが好ましい。完全な免疫系、特にヒト 免疫系への密接な接近のため、標的細胞、組織又は器官、特にヒト標的細胞、組 織又は器官を免疫不全哺乳動物に移すことを追加することが好都合でありうる。

自己免疫疾患により冒された器官又は複数のそれに対する哺乳動物に投与すべき 物質の効果を決定する好都合な手法を提供するため、かかる器官又は複数のそれ に由来する細胞又は組織を再構成哺乳動物の中に追加的に移植してよい。従って 、ヒト系に及ぼす物質の効果を調べるためには、かかる器官に由来するヒト細胞 又は組織を移植してよい。問題の自己免疫疾患がＩＤＤＭであるとき、かかる細 胞又は組織は好都合には高細胞、又はランゲルハンス島を含んで成る膵臓組織で ありうる。

本発明を以下の実施例で更に例証するが、これらは本発明の請求の範囲を限定す ることを意図しない。

実施例１ ＳＣＩＤマウスにおけるヒト免疫グロブリンの生産生後５〜６週目の１１匹の雄 のＣ，Ｂ−１７５ＣｒＤｖウス（Ｇ、　Ｃ，Ｂｏｓｍａら、前掲を参照のこと） に、臨床上、糖尿病の開始から４ケ月以内の１型糖尿病患者から獲得した２０Ｘ １０’個の末梢血液単核細胞（ＰＢＭＭＣ）を腹腔内注射した。

再構成５ＣＩＤマウスの血清中のヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ及びＩｇＭ）のレ ベルを、５μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ又はＩｇＭ　（Ｚｙｍｅｄより入手） によりコートされたマイクロタイタープレートを用いる抗体捕獲ＥＬＩＳＡアッ セイにより決定した。血清サンプルの希釈系列を室温で２時間インキュベートし た。結合したＩｇをベル才キシダーゼーコンシュゲート化ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ＊ ）ＩｇＧ　ＳＨ＋Ｌ（Ｚｙｍｅｄより入手）により定量し、そしてこのサンプル の免疫グロブリン濃度を計算した。

全ての再構成５ＣＩＤマウスがヒト免疫グロブリンを生産することを示したが、 濃度はかなり異なり（ＩｇＧ　：　１〜２８１６μｇ／ｍｌ　；　ＩｇＭ　：　 Ｏ〜３４４　μｇ／ｍｌ）、ＰＢＭＮＣの注射後８〜１１週間でピークレベルに 達した。

自己反応性Ｂ−細胞を刺激するため、このヒト免疫グロブリンレベルを基礎とし て選択したマウスを、ＰＢＭＮＣによる再構成の６０日後に、フロイント完全ア ジュバント中のラットの島細胞により免疫した。

マウス血清の免疫蛍光分析 これらのマウス及び非免疫マウス由来の血清を次に、未希釈のマウス血清と９０ 分間インキュベートさせたヒト膵臓の凍結切片（厚さ４μｍ１血液型Ｏ、アセト ン固定）における免疫蛍光分析により試験した。ＰＢＳの中で洗った後、この膵 臓切片をＰＢＳで１：２０に希釈したＦｒＴＣ−コンジュゲート化抗ヒトＩｇＧ （Ｄａｋｏ、デンマーク国）と４０分間インキュベートし、洗い、次いでマウン トし、そして蛍光顕微鏡で観察した。ヒトＩｇＧの濃度に関係なく、再構成した 非免疫マウス由来の血清はどれもヒト膵臓切片における島細胞を染めなかった。

一方、ラット島細胞による免疫の１９日後における５ＣＩＤマウスから獲得した 血清サンプルは高細胞細胞質抗体（［ＣＡ）を含んでいた。５ＣＩＤマウス血清 は、１：６４に希釈したドナー患者血清により誘発される強さに匹敵する強さで ヒト膵臓島を染めた。

マウス血清の免疫沈殿分析 ５ＣＩＤマウスを、島細胞と反応するヒト自己抗体の存在を検定するために、ラ ットの島細胞による免疫沈殿分析によっても試験した。

１型糖尿病の発症し始めたばかりの患者由来の血清、並びに前記した通りに新生 ラット島細胞により免疫する前及び後のＰＢＭＮＣ再構成マウスに由来する血清 を、（”Ｓ）メチオニン−ラベル化うット島細胞のトリトンＸＩ＋４清浄相細胞 質画分（Ｓ、　Ｂａｋｋｅｓｋｏｖら、Ｎａｔｕｒｅ　３４７．１９９０年９月 １３日、頁１５１−１５６に記載の通りに調製）を免疫沈殿させるために用いた 。免疫沈殿物をＳ、　Ｂａｋｋｅｓｋｏｖら、前掲に記載の通り、５ＤＳ−ＰＡ ＧＥ、その後のフルオログラフィー分析にかけた。

患者のうちの１人に由来の血清は６４ｋＤの自己抗原に強く結合した。

この患者由来のＰＢＭＮＣにより再構成した５ＣＩＤマウスのうちの１血清は６ ４ｋＤの自己抗原を認識したが、ただし弱かった。ラットの島細胞による免疫は 強めの結合を全く誘発せしめなかった。一方、　ｌＣＡ陽性５ＣＩＤ血清（上記 の通りに獲得）は、たとえマウス血清中のヒトＩｇＧ濃度が、患者血清中の７８ ２３μｇ／ｍｌに比べて５１２μｇ／ｍｌシかないにもかかわらず、この患者に 由来する血清とほぼ同じ強さで６４ｋＤの自己抗原に結合した。ラットの島細胞 により免疫する前に獲得したこの特定のマウスに由来の血清（ヒトＩｇＧ　２２ １μｇ／ｍｌ）はこの６４ｋＤの自己抗原を沈殿させなかった。これらの結果は 、自己反応性Ｂ−細胞が少なくとも２ケ月間残り、そして適当な抗原によるマウ スの免疫によって刺激されうろことを示唆する。

マウス血清のイムノプロティング分析 最後に、新生ラット島細胞の全すゼートのイムノプロッティング分析によって５ ＣＩＤ７ウス血清を試験した。Ａｔａｒら、Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、１４３．１９ ８９、頁５３３に本質的に記載の通りに、このタンパク質をＤＴＴを利用する還 元条件のもとてドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）により変性させ、１０％のポ リアクリルアミドゲルでの電気泳動にかけ、次いでニトロセルロースフィルター 上にエレクトロプロットさせる。免疫染色のため、ニトロセルロースストリップ を、１型糖尿病患者由来の血清（１：５０の希釈率）又は新生ラット島細胞によ る免疫の前又は後の再構成５ＣｒＤマウス由来の血清（１：５の希釈率）と１． ５時間インキュベートシ、その後それらを洗い、アルカリホスファターゼ（Ｚｙ ｍｅｄより入手）にコンジュゲートさせたヤギ抗ヒトＦ（ａｂ）２１ｇＧ　。

Ｈ＋Ｌと１時間インキュベートし、洗い、そして最後に基質とインキュベートさ せる（Ａｔａｒら、前掲を参照のこと）。

いくつかのバンドが、イムノブロッティング分析において患者血清により認識さ れた。５２ｋＤの見かけ上の分子量を有する分子がＩＣＡ及び６４ｋＤの自己抗 原陽性患者血清により認識されたが、　ＩＣＡ陰性患者血清によっては認識され なかった。ラットの島細胞により免疫した後に獲得されたＩＣＡ及び６４ｋＤの 自己抗原陽性５ＣＩＤマウスに由来する血清もイムノブロッティングにおいて５ ２ｋＤの抗原に結合したが、他方、免疫の１日前に獲得した血清サンプルはこの 抗原との反応性を示さなかった。この抗体反応を更に特徴付けするため、免疫後 の血清を、イムノプロッティング分析の前に、ラット島細胞のリゼート（細胞を Ｐｏｔｔｅｒ−Ｅｌｖｅｒｈｊｅ１ｍホモジナイザーの中の低張緩衝液の中でホ モジナイズし、次に遠心によって分離することによって獲得）又はＥＢＶ−形質 転換リンパ球のリゼートのいづれかと室温で６０分間インキュベートすることに よって吸収させた。リンパ球とではなく、ラットの島細胞とのブレインキュベー ションは５２ｋＤの抗原との結合を低め、この５２ｋＤの分子が共通の細胞決定 基でないことを示唆する。

ラットの島細胞による免疫をしたかしないかに関係なく、どの再構成５ＣＩＤマ ウスも、高い血糖値又は損われたグルコース負荷値を示さず、そして免疫化５Ｃ ＩＤマウスに由来する膵臓の検査は免疫の４０日経過後に形態学的変化を全く示 さなかった。これらの結果はマウス中の自己抗体の短期間の存在（４０日以内） により、又はマウス補体がヒト　［ｇＧを固定できないことにより説明されつる 。他方、これらの結果は、島細胞の自己抗体がそれ自体β−細胞病状を誘発する のに十分ではないが、β−細胞に対する自己免疫攻撃に対する二次現象を示しう ることを示唆する。上記の実験は、５ＣＩＤマウスに移すべき自己反応性Ｂ−細 胞クローンの選択的な増殖を刺激とすることが可能であることを実証する。

実施例２ 再構成５ＣＩＤマウスからのヒトモノクローナル自己抗体の生産実施例１に記載 の高細胞自己抗体陽性マウスに由来する膵臓細胞及び胸腺細胞を、組織を慎重に 抜き取り、次いで遠心により全細胞集団を単離することによって単離した。この マウスからの腹腔細胞を、その腹腔をシリンジ及び針によって培養培地で慎重に 洗い、次いで遠心によって分離させることにより単離した。次にこの単離細胞を 感染性ニブスティン−バーウィルスを含む培地中でインキュベートすることによ ってそれらをニブスティン−バーウィルスにより形質転換させた（Ｄ、　Ｇｏｏ ｓｅｎｓら、前掲を参照のこと）。膵臓細胞から樹立したＩｇＧ生産性細胞系が ヒトＢ−細胞より構成されているかをフローサイトメリーによって確認した（ヒ トＢ−リンパ球に特異的なモノクローナル抗体マーカーを用いて）。これらの細 胞により分泌される精製［ｇＧをここで高細胞反応性について試験する。この高 細胞自己抗体陽性マウスより樹立したＢ−細胞系は、近縁分析により、高細胞抗 体を生産することが証明されるであろうことが予測される。

これらの結果は、ヒトＰＢＬにより再構成した５ＣＩＤマウスがヒトモノクロー ナル自己抗体の有用な択一的起源を示しうろことを示唆する。

更に、例えば自己反応性Ｔ−細胞及び／又は標的組織もしくは器官（例えばヒト 島細胞）を再構成５ＣＩＤマウスに移すことによって、自己免疫疾患における自 己抗体の役割が調べられることができ、そして自己免疫性のメカニズムが詳細に 研究されつる。そして、かかるマウスは問題の自己免疫疾患に対する治療的効果 を有する物質についてスクリーンするために利用されつる。

５ＣＩＤマウス及び免疫 内因性免疫グロブリン生産性を有さない（血清中、＜１０ｎｇ／ｍｌのマウスｒ ｇＧ）Ｃ，Ｂ、−１７５ｃｉｄ／５ｃｉｄ（ＳＣＩＤ）マウス（雄；生後５〜６ 週間）に、マウス当り２０Ｘ１０“個のフィコール単離ＰＢＭＣを腹腔内注射し た。

−人は高細胞抗体（ＩＣＡ）及び６４ｋＤａ抗体が陰性であり、そして−人はＩ ＣＡ及び６４ｋＤａ抗体が陽性である。１型糖尿病患者よりＰＢＭＣを獲得した （表１）。５ＣｒＤマウスを２人の健康な個体からのＰＢＭＣによっても再構成 した（表１）。ＰＢＭＣによる再構成の６０日後、マウスを不完全フロインドア ジュバント（ＩＦＡ）中の新生ラット島細胞（１０００の高細胞／マウス）、　 ＩＦＡ単独又はラット脳からのアフィニティー精ＩＪＧＡＤ（５０μｇ／マウス ）のいづれかにより腹腔内免疫した。免疫の１日前及び１９日後に血液サンプル を採血した。

ヒト免疫グロブリンについてのアッセイ血清中のヒト■ｇＧ及び−ｆｇＭの濃度 を抗体捕獲ＥＬＩＳＡアッセイにより決定した。マイクロタイタープレートをヤ ギー抗ヒト　ＩｇＧ又はＩｇＭ（５０ｍＭのＮＡ２Ｃ０＄／ＮａＨＣＯ，−緩衝 液中５　ｕ　ｇ／ｍｌ）　（Ｚｙｍｅｄ、南すンフランシスコ、　ＣＡ）により コードン、洗い（０，１％のツイーン２０を有するＰＢＳで３回）、そして試験 サンプルの希釈系列と２ｈインキユベートする。結合した１ｇをペルオキシダー ゼ−コンジュゲート化ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋　Ｌ　ＸＺｙｍｅｄ）より定量 する（基質：水中の、０．４■／ｍｌの０−フェニルジアミン及び０．０３％の 過酸化水素）。ＩｇＧアッセイの低検出限界値は１０ｎｇ／ｍｌであった。この アッセイにおいてマウスＩｇに対する検出可能な交差反応はなかった。

自己抗体の検出 細胞質高細胞抗体を検出するため、ヒト膵臓の凍結切片（厚さ４μｍ、血液型０ 、アセトン固定）を血清と９０分インキュベートしくマウス血清は希釈しないで 用いた）、そしてＰＢＳ中で洗った。結合した免疫グロブリンをペルオキシダー ゼ−コンジュゲート化プロティンＡ　（Ａｍｅｒｓｈａｍ、英国）及び基質（ジ アミノベンジジン（１■／ｍｌ）　、ＨｚＯｚ（０，０２３％））又はＦＩＴＣ コンジュゲート化ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｚｙｍｅｄ）より識別化させた。免疫沈 殿のため、実施例１に記載の通り、Ｃｓ５）メチオニンラベル化Ｔｘ−ｘ＋＜清 浄粗精製細胞質画分を免疫沈殿させた。簡潔すると、新生ラット島細胞より調製 した細胞質置物を温度誘発Ｔ　ｘ　−１＋　４相分離にかけた。両親和性可溶性 タンパク質を含む清浄相のアリコートを血清と一夜インキユベートして免疫複合 体を形成させた。この免疫複合体をプロティンＡ−セファロースへの吸着によっ て単離した。この免疫沈殿物を還元条件のもとて５Ｏ３−ＰＡＧＥ　（１０％） 、その後のフルオログラフィーによって分析した。イムノブロッティングのため 、新生高細胞を９０ｍＭのトリスＨＣＩ　、　１７％のスクロース、３％のＮａ ＤｏｄＳＯ４及び１０ｍＭのジチオスレイトールの中で３分煮沸することにより 可溶化させた。約ｌＸｌ０’個の島細胞／１０ｃｍのゲルを１０％の５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥにかけ、ニトロセルロースフィルター上にエレクトロプロットし、次いで Ｊ、Ｐ、Ｐａｌｍｅｒ、　５ｃｉｅｎｃｅ２２２　、１９８３、頁１３３７−１ ３３９に記載の通りに免疫染色した。結合したＩｇを、アルカリホスファターゼ （Ｚｙｍｅｄ；にコンジュゲートさせたヤギー抗ヒトＦ（ａｂ２）ＩｇＧ及び発 色基質により識別化させた。

全ての再構成５ＣＩＤマウスはかなり様々な濃度ではあるが（血清ヒ）　ＩｇＧ に２８１６μｇ／ｍＬ　ヒトＩｇＭＯ〜３４４　μｇ／ｍｌ）ヒト免疫グロブリ ンを生産し、ＰＢＭＣの注射後８〜１１週でピークレベルに達した。

β−細胞反応性自己抗体を検出するため、血清を免疫組織化学、免疫沈殿及びイ ムノブロッティング分析によって試験した。高細胞抗体は、　ＩＦＡ中の島細胞 （ｎ＝９）又はＩＦＡ単独（ｎ＝８）によるいづれの免疫後も、２人の健康なコ ントロールに由来のＰＢＭＣにより再構成したどのマウスにおいて検出されなか った。

ＩＦＡ中のラット島細胞（ｎ＝２）又はＩＦＡ単独（ｎ＝３）による免疫にもか かわらず、　ＩＣＡ陰性患者に由来するＰＢＭＣにより再構成したどのマウスも ＩＣＡ又は６４ｋＤａ陽性であると見い出せなかった。

ｆＣＡ陽性患者に由来するＰＢＭＣにより再構成され、そしてＩＦＡ単独を注射 されたマウス（ｎ＝７）もヒトＩｇＧ濃度に関係なく　ＩＣＡ陰性であった。他 方、ラットの島細胞による免疫の１９日後に獲得した、この患者に由来するＰＢ ＭＣにより再構成した１０匹の５ＣｒＤマウスのうちの２匹に由来する血清サン プルが、Ｊ：６４の希釈率におけるドナー患者血清により誘発されるのに匹敵す る強さで島細胞を染めるヒト起源のＩＣＡを含んでいた。驚くべきことに、患者 由来のＰＢＭＣによる再構成の８０日後に獲得した２匹の５ＣｒＤマウス由来の 血清が、抗核抗体（ＡＮＡ）に対して陽性であることが認められた（一方は島細 胞により、そして他方はＩＦＡ単独で免疫）。この患者由来の血清は常にＡＮＡ 陽性であった。

島細胞による免疫の１９日経過に獲得したｒＣＡ陽性５ＣＩＤマウス及びＩＣＡ 陰性マウス由来の血清は６４ｋＤａの島細胞抗原を免疫沈殿させた。

一方、免疫前の同一のマウスより獲得した血清は６４ｋＤａの抗原を沈殿させな かった。この血清は、患者血清中の非常に高いＩｇＧ濃度にもかかわらず（３匹 の５ＣＩＤマウスそれぞれにおける５１２μｇ／ｍｌ、３５５１１ｇ／ｍｌ及び ５１８μｇ／ｍｌに比して、患者において８０６４μｇ／ｍｌ）、ドナー患者由 来の血清とほぼ同じ強さで抗原を沈殿させた。

ＩＣＡ陽性患者由来のＰＢＭＣより再構成させた２匹の５ＣＩＤマウス由来の血 清も、ラット島細胞による免疫前に６４ｋＤａの抗原を沈殿させたが、しかしな がら他の６４ｋＤａ陽性５ＣＩＤマウスよりも有意に弱い強度であ５ＣＩＤマウ ス、再構成していないコントロール５ＣＩＤマウス又はその他の種（雄、年令を 合わせた）に由来するマウスも、６４ｋＤａの島細胞抗原を沈殿させなかった。

ラット島細胞に由来する全すゼートのイムノブロッティング分析において、５２ ｋＤの分子は、高細胞抗体陽性患者血清により認識されたが、しかしながら高細 胞陰性患者血清によっては認識されなかった。ラット島細胞による免疫後のＩＣ Ａ及び６４ｋＤａ陽性５ＣＩＤマウスのした血清はこの抗原に結合しなかった。

この５ＣＩＤマウス由来の免疫後血清において、ヒトリンパ球ではな（ラットの 島細胞とのブレインキュベーションは、５２ｋＤ抗原への結合性を低め、これが 共通の細胞決定基でないことを示唆する。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年７月１３日

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．自己免疫疾患の特徴的な抗原に反応する自己抗体を製造する方法であって、 （ａ）自己免疫疾患に苦しむドナー個体に由来するリンパ球を免疫不全哺乳動物 に投与し、 （ｂ）前記哺乳動物のうちの少なくとも一匹における免疫細胞の再構成を可能と する十分なる期間の経過後、所望の自己抗体を生産する再構成哺乳動物を選択し 、 （ｃ）この選択した哺乳動物からリンパ球を単離する前又は後で、このリンパ球 を不死化させ、そして （ｄ）この不死化Ｂ−リンパ球を、所望の自己抗体のその生産を可能とする条件 のもとで培養し、次いで生ずる自己抗体をこの培養物から回収すること、 を含んで成る方法。
2. ２．前記ドナー個体がヒト個体である、ヒト自己抗体の製造のための請求項１に 記載の方法。
3. ３．前記リンパ球がヒト末梢血液から獲得されるものである、請求項２に記載の 方法。
4. ４．前記自己免疫疾患が、インスリン依存性真性糖尿病、全身性エリテマトーデ ス、多発性硬化症、甲状腺炎、重症筋無力症及びリウマチ性関節炎より成る群か ら選ばれる、請求項１に記載の方法。
5. ５．前記自己免疫疾患がインスリン依存性真性糖尿病である、請求項４に記載の 方法。
6. ６．前記免疫不全哺乳動物がマウスである、請求項１に記載の方法。
7. ７．前記マウスが重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスである、請求項６に記載 の方法。
8. ８．再構成させた免疫不全哺乳動物における自己反応性細胞を、１又は複数の対 応の標的抗原により、その単離された抗原もしくはその機能的相当物の形態にお いて、又は標的器官、組織もしくは細胞の中に存在しているものとして、その後 免疫することによって刺激する、請求項１に記載の方法。
9. ９．哺乳動物に投与する前記リンパ球がＩＤＤＭ患者に由来し、そしてここで前 記の再構成哺乳動物をランゲルハンス島、島β−細胞又はそれらに由来する抗原 による免疫によって刺激する、請求項８に記載の方法。
10. １０．所望する自己抗体が、リンパ球ドナー個体の血清中の濃度と匹敵する又は それより高い濃度で、再構成された哺乳動物において生産される、請求項１に記 載の方法。
11. １１．再構成した哺乳動物により生産される所望の自己抗体の濃度／力価が、リ ンパ球ドナー血清において見い出されるものよりも、少なくとも２倍高い、より 好ましくは少なくとも５倍高い、最も好ましくは少なくとも１０倍高い、請求項 １０に記載の方法。
12. １２．所望する自己抗体の濃度／力価が、リンパ球ドナー血清において見い出さ れるものよりも約２０倍高い、請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記Ｂ−リンパ球を、この哺乳動物からそれを単離する前に、この再構成 哺乳動物にエプステイン−バーウィルスを接種することによって不死化せしめる 、請求項１に記載の方法。
14. １４．前記Ｂ−リンパ球を、選択した再構成哺乳動物から単離したＢ−リンパ球 のエプステイン−バー形質転換によって不死化せしめる、請求項１に記載の方法 。
15. １５．前記Ｂ−リンパ球を、再構成哺乳動物から単離した後に、適当な不死細胞 系と融合させることによって不死化せしめる、請求項１に記載の方法。
16. １６．自己免疫疾患に対する治療的効果を有する物質についてのスクリーニング 方法であって、特定の自己免疫疾患に対する治療的効果を有すると予測される物 質を、問題の自己免疫疾患に苦しむドナー個体の機能性リンパ球により再構成さ れた、且つ、標的細胞、組織又は器官を認識するＴ−細胞の移された免疫不全哺 乳動物に投与し、次いで前記Ｔ−細胞と前記標的細胞、組織又は器官との反応性 に及ぼすこの投与した物質の任意の効果を決定することを含んで成る方法。
17. １７．前記ドナーリンパ球が問題の自己患者に対する自己抗体を生産する、請求 項１６に記載の方法。
18. １８．前記リンパ球が不死化Ｂ−リンパ球である、請求項１６又は１７に記載の 方法。
19. １９．前記リンパ球が請求項１、工程（ａ）−（ｃ）に記載の通りに生産される 、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．前記リンパ球がヒトリンパ球である、請求項１６−１９のいづれか１項に 記載の方法。
21. ２１．前記リンパ球が糖尿病疾患に由来する、請求項２０に記載の方法。
22. ２２．哺乳動物に移すＴ−細胞がヒトＴ−細胞である、請求項１６に記載の方法 。
23. ２３．標的細胞、組織又は器官を哺乳動物に追加的に移す、請求項１６−２２の いづれか１項に記載の方法。
24. ２４．前記標的細胞、組織又は器官がヒトドナーに由来する、請求項２３に記載 の方法。
25. ２５．自己免疫疾患により冒された器官に由来する細胞又は組織を再構成哺乳動 物に追加的に移植する、請求項１６に記載の方法。
26. ２６．前記細胞又は組織がヒト細胞又は組織である、請求項２５に記載の方法。
27. ２７．前記細胞又は組織が、島細胞又はランゲルハンス島を含んで成る膵臓組織 である、請求項２１又は２６に記載の方法。