JPH09506435A

JPH09506435A - アレルギー診断法および抗アレルギー性治療剤のスクリーニング法

Info

Publication number: JPH09506435A
Application number: JP7516387A
Authority: JP
Inventors: タイ・ワイ・フェイ、デイビッド; ロウ、ジョン; ジャルデュー、ポーラ
Original assignee: ジェネンテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1993-12-10
Filing date: 1994-12-09
Publication date: 1997-06-24
Anticipated expiration: 2019-03-15
Also published as: ATE157455T1; JP3507852B2; US5714338A; GR3025089T3; CA2176811C; CA2176811A1; DK0733207T3; EP0733207A1; EP0733207B1; WO1995016203A3; DE69405251T2; WO1995016203A2; DE69405251D1; ES2108566T3

Abstract

(57)【要約】患者におけるアレルギー性疾患の診断法を提供する。抗アレルギー性治療剤およびＩｇＥ拮抗剤のスクリーニング法も提供する。

Description

【発明の詳細な説明】アレルギー診断法および抗アレルギー性治療剤のスクリーニング法発明の背景本発明の分野この発明はアレルギー性疾患診断の分野に関し、またアレルギー性疾患処置用治療剤のスクリーニング法に関する。背景および関連技術の記載アレルギー性疾患の診断には主に皮膚反応、ＩｇＥ血清水準検定、およびヒスタミン放出検査の３種の技術が使用されてきた。皮膚反応は１８６５年に導入されて以来、アレルギーの第一次診断用手段を代表してきた。アトピーの古典的な皮膚反応は皮膚に導入した抗原が予め形成されていた伝達物質の放出、血管透過性の亢進、局所浮腫およびカユミを起こすＩ型膨疹および紅斑反応である。このような皮膚反応は臨床的基礎の上に立つ特異的アレルギーの診断用に有用な確証を提供できる。しかしながら、不適正に行なうと、皮膚反応は誤陽性または誤陰性の結果を招来することがある。皮膚反応の主な限界は、非アレルギー性個体の一部がアレルギー性の症候なしに皮膚反応に対して膨疹および紅斑反応を起こす特異的ＩｇＥ抗体を持つために、陽性反応が必ずしもその病気がアレルギー的な性格であることを意味しないことである。皮膚反応で観察されるＩｇＥ媒介誤陽性現象は患者血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥを検定する試験管内法では観察されない（ＨｏｍｂｕｒｇｅｒとＫａｔｚｍａｎｎ、「ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＬａｂｏｒａｔｏｒｙＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＩｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎｏｆＬａｂｏｒａｔｏｒｙＴｅｓｔｓｆｏｒＡｌｌｅｒｇｙ（実験的免疫学方法論：アレルギー用各種実験的検査の原理および解釈）」、Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎなど編、「ＡｌｌｅｒｇｙＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ（アレルギー、原理および実際）」、Ｍｏｓｂｙ出版、４版、第１巻、２１章、５５４〜５７２頁（１９９３年）参照）。典型的には、アレルゲン特異的ＩｇＥ水準は患者血清を抗原被覆吸着剤粒子とともにインキュベーションし、それに続いて標識抗体で抗原に結合した特異的ＩｇＥを検出する放射性アレルゲン吸着法（ＲＡＳＴ）により測定する（たとえば、Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１５巻：１５７７〜１５８３頁（１９７５年）参照）。全血清ＩｇＥ水準もアレルギーの診断に使用する。全ＩｇＥ水準はＨｏｍｂｕｒｇｅｒとＫａｔｚｍａｎｎ、前出、に記載のラジオイムノアッセイまたはイムノメトリー検定法によって測定できる。ＩｇＥ水準はしばしばアレルギー性疾患で上昇し、寄生体侵襲により著しく高める。アトピー性疾患の存在について小人または成人を評価する時、正常な全ＩｇＥ水準はアトピーを排除しないのだが、上昇したＩｇＥ水準は診断の助けになる。臨床的兆候の発現に重要な寄与をする遺伝子的および環境的因子が存在するので、全ＩｇＥの測定のみではアレルギー状態を予測しない。アレルギー診断における血清ＩｇＥ水準の価値には健康個体でのＩｇＥ血清濃度範囲の広さという限界もある。健康成人におけるＩｇＥ濃度の頻度分布は９５％限界が広く、低ＩｇＥ値の数が不相応なので顕著に歪曲される。従って、正常ＩｇＥ水準の９５％限界算出に当って、多くの研究者は算術的方法と比較して正常血清ＩｇＥ上限が非常に高く出る対数変換によってデータを処理している。正常血清ＩｇＥの上限が高いことは臨床的アレルギーについてのスクリーニングによる血清ＩｇＥ検査の診断的価値を低減する。ヒスタミン放出検査は患者血清中の機能的でアレルゲン特異的なＩｇＥの検出方法を提供する。典型的には、ヒスタミン放出検査は患者で起きるようなアレルゲン特異的反応を模倣する（たとえば、ｕｎｄｅｒｖａｎｄｅｒＺｅｅなど、Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８２巻：２７０〜２８１頁（１９８８年）参照）。患者の血液と様々なアレルゲンとを混合することによってこの反応を試験管内で発生させ、その後、後続する各アレルギー反応の間に放出されるヒスタミン量を測定する。試験管内ヒスタミン放出検定法では本来全血からの白血球分離および／または遊離ヒスタミンの様々な抽出法が必要であった。後に、白血球ヒスタミン放出検査法が改良され、自動化されて、血球分離とヒスタミン抽出とが回避された（たとえば、Ｓｉｒａｇａｎｉａｎなど、Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５７巻：５２５〜５４０頁（１９７６年）参照）。現在では、商業的に購入できる白血球ヒスタミン放出検査のキットによれば、２.５ｍＬの全血で１００回までの異なる測定が可能である。しかしながら、血液標本は検定の前２４時間以上保存できない。これに加え、この検査では、アレルゲン抽出物の毒性や他の因子によって起きる非特異的ヒスタミン放出に起因する誤陽性の結果が出る。また、品質管理研究からヒスタミンの測定にはかなりの研究室間変動があるという報告がある（ＧｌｅｉｃｈとＨｕｌｌ、Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６６巻：２９５〜２９８頁（１９８０年））。アレルギー症候、陽性皮膚反応および明瞭に検出可能なＩｇＥ抗体を持つ患者の中の少数では、患者好塩基球とアレルゲンとからの試験管内ヒスタミン放出が観察できない。もし陽性対照が入手できないと、この現象はヒスタミン放出検査結果を解釈不能にし、アレルギー性疾患診断でのこの検査の有用性を限定する。ＬｅｖｙとＯｓｌｅｒ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９９巻：１０６２〜１０６７頁（１９６７年）は、非アレルギー性個体の僅かに２０％から３０％までの白血球だけが試験管内でアレルゲン特異的ＩｇＥでの受動感作とそれに続くアレルゲンチャレンジによるヒスタミン放出を示すことを報告した。Ｉｓｈｉｚａｋａなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１１巻：５００〜５１１頁（１９７３年）は白血球を酸化重水素（Ｄ₂Ｏ）とともにインキュベーションすると、抗ブタクサ血清での白血球の受動感作およびブタクサ抗原によるチャレンジによって誘導されるヒスタミン放出を強化することを証明することによって、この検査の有用性を拡大した。Ｐｒａｈｌなど、Ａｌｌｅｒｇｙ、４３巻：４４２〜４４８頁（１９８８年）は非アレルギー性個体から分離したＩｇＥ欠落白血球で非放出性アレルギー性患者血清での受動感作と、それに続くアレルゲンの誘導によるヒスタミン放出を報告した。しかしながら、Ｐｒａｈｌなどの方法は非アレルギー性提供者全血からの対照白血球分離と、それに続く提供者血球に結合したＩｇＥの移動と、が必要である。これに加えて、Ｌｅｖｙなど、Ｉｓｈｉｚａｋａなど、およびＰｒａｈｌなどの操作は前記他種ヒスタミン放出検査法の有用性を限定するヒスタミン検定変動と同じ変動の対象である。従って、本発明の目的の一つは便利で再現性があり、広範に適用できるアレルギー性疾患診断用試験管内検査法を提供することである。アレルギー性疾患処置用治療剤の生物活性検定用試験管内操作法を提供することがもう一つの目的である。ＩｇＥ拮抗剤スクリーニング用試験管内操作法を提供することが別の目的の一つである。これらおよび他の目的は当業者には自明になるものと思われる。発明の要約従って、本発明は患者におけるアレルギー性疾患診断用試験管内検査法を提供するものであって、ここに、ＩｇＥ拮抗剤の存在下および不在下の双方でアレルゲン特異的ＩｇＥを非アレルギー性提供者からのＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞と相互作用（で感作）させることにより患者血清内のアレルゲン特異的ＩｇＥを検出する。本発明の一側面は放出混合物中での薬理学的伝達物質の放出と遮断放出混合物中での薬理学的伝達物質の放出とを比較することを含む患者におけるアレルギー性疾患の診断法であって、ここに、放出混合物は患者からの血清標本およびナイーブ提供者からの組織標本を含み、およびここに、遮断放出混合物は患者からの血清標本、ナイーブ提供者からの組織標本、およびＩｇＥ拮抗剤を含み、およびここに、放出混合物と遮断放出混合物との双方を目的アレルゲンと混合するものである。本発明はもう一つのアレルギー診断用試験管内検査法をも提供するものであって、ここに、アレルゲン特異的ＩｇＥを、患者ＩｇＥおよびアレルゲンとの接触に際してその宿主細胞の薬理学的伝達物質放出をさせることができるＦｃ_εＲＩ α−サブユニットの表面発現を展示するように遺伝子工学的に処理した好塩基球または肥満細胞宿主と、ＩｇＥ拮抗剤の存在下および不在下の両方で、相互作用させることにより患者血清内のアレルゲン特異的ＩｇＥを検出する。このアレルゲン特異的ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩ相互作用はアレルゲンを添加することおよびヒスタミンまたはその他の薬理学的伝達物質の即時放出を測定することによって検定する。この検定中で使用するには、Ｆｃ_εＲＩ受容体への結合についてＩｇＥと競合するものであるＩｇＥ拮抗剤およびＩｇＥへの結合についてＦｃ_εＲＩ受容体と競合するＩｇＥ拮抗剤を含む、いかなるＩｇＥ拮抗剤も適当である。ＩｇＥ拮抗剤のこの新規な使用は薬理学的伝達物質１種またはそれ以上の非特異的放出に起因する誤陽性結果を削減する。本発明の一側面は患者におけるアレルギー性疾患の診断法であって、（ａ）反応混合物中での薬理学的伝達物質の放出と遮断した反応混合物中での薬理学的伝達物質の放出とを比較すること、ここに、（１）反応混合物および遮断した反応混合物は患者血清ＩｇＥおよびアレルゲンによる誘導に際して薬理学的伝達物質の宿主細胞による放出を媒介できるＦｃ_ε ＲＩ α−サブユニットの表面発現を展示するように遺伝子工学的に処理したいずれかの肥満細胞宿主および患者血清ＩｇＥおよびアレルゲンによる誘導に際して薬理学的伝達物質の宿主による放出を媒介できるＦｃ_εＲＩ α−サブユニットの表面発現を展示するよう遺伝子工学的に処理したいずれかの好塩基球から構成される群から選択した共通親細胞の子孫である細胞を含み、（２）反応混合物および遮断した反応混合物各々はさらにその患者からの単一血清標本の一部であって、血清標本中での目的アレルゲン特異的ＩｇＥの存在または不在が未知であるものを含み、（３）遮断した反応混合物はさらにＩｇＥ拮抗剤を含み、および（４）反応混合物と遮断反応混合物とを両方ともアレルゲンと混合すること、および（ｂ）段階（ａ）での比較に基づいてアレルゲン特異的ＩｇＥの血清標本内での存在または不在を決定することを含む診断法である。本発明は抗アレルギー性治療剤としての薬剤の生物活性用およびＩｇＥ拮抗剤としての薬剤の生物活性用の試験管内検査法も提供するものであって、その薬剤の存在下または不在下に、アレルゲン特異的ＩｇＥをＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞と接触することによってその薬剤がアレルゲン特異的ＩｇＥとＦｃ_εＲＩ受容体との間の相互作用を遮断する性能を検定する。このアレルゲン特異的ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩ相互作用はアレルゲンの添加とヒスタミンその他の薬理学的伝達物質の即時的放出の測定とによって検定する。本発明の一側面は薬剤がＩｇＥ誘導免疫細胞感作を遮断する生物活性検定の方法であって、放出混合物中での薬理学的伝達物質の放出と遮断された放出混合物中での薬理学的伝達物質の放出との比較からなり、ここにその放出混合物はナイーブ提供者からの組織標本および血清標本を含み、またここに、その遮断された放出混合物はナイーブ提供者からの組織標本、血清標本およびその薬剤を含み、およびここに、その放出混合物および遮断された放出混合物を目的アレルゲンと混合するものである。本発明の別の側面は免疫細胞脱顆粒反応を阻止する性能について薬剤をスクリーニングする方法である。この方法では、その薬剤で処置した患者免疫細胞または試験管内でその薬剤とともにプレインキュベーションした提供者免疫細胞を、まずＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下にアレルゲン特異的ＩｇＥと混合し、その混合物をそのアレルゲンでチャレンジする。ヒスタミン放出を減少するＩｇＥ拮抗剤の性能はその薬剤が免疫細胞脱顆粒反応を阻止する性能を示す。図面の簡単な説明図１はｒｈｕＭＡｂＥ２５のヒスタミン放出始動不能性を示すグラフ描写である。ナイーブ提供者１２名からの血液標本を１０％ＲＳＨＰで前感作し、ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡ、ブタクサ０.１μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬのＭＡＥ１、または１０μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５で３７℃で３０分間チャレンジした。様々な反応混合物の上清液に放出されたヒスタミン（ｎＭ）を次の通りに示した：ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡ混合物は白色正方形で表示し、ブタクサ混合物は黒色正方形で表示し、ＭＡＥ１混合物は白色三角形で表示し、ｒｈｕＭＡｂＥ２５混合物は黒色円形で表示した。図２はブタクサ特異的ヒト血漿のスクリーニングを示すグラフ描写である。ナイーブ提供者１名からの全血を１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５の存在（陰影柱）下または不在（黒色柱）下にブタクサにアレルギー性であることが知られた提供者から採取した相異なるヒト血漿（Ａ〜Ｇ）７個で個別に前感作した後に、ブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬでチャレンジした。ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡ単独で前感作した混合物は白色柱で表示した。各柱は測定２回の平均値を表示する。血漿Ｂ（ロット４２−３６５０５４）を次の検定での好塩基球感作のために選択した。各誤差線は測定値２個の範囲を表示する。図３は１０％ＲＳＨＰでの前感作が全血のブタクサ誘導ヒスタミン放出に及ぼす効果を示すグラフ描写である。ヘパリン化血液標本をＰＢＳ／０.１％ＢＳＡ（白色柱）か、または１０％ＲＳＨＰ、ロット４２−３６５０５４（陰影柱）かとともに３７℃で２時間プレインキュベーションした後に、０、１、１０および１００ｎｇ／ｍＬのブタクサアレルゲンでチャレンジした。誘導ヒスタミン放出を定量し、様々な反応上清液中濃度（ｎＭ）の値として表現する。各柱は測定２回の範囲を表示する（白色円形）。図４は様々なナイーブ提供者血液のヒスタミン放出性能を示すグラフ描写である。ナイーブ提供者血液をｒｈｕＭＡｂＥ２５の生物活性検定で使用するために適当なヒスタミン放出性能についてスクリーニングした。提供者血液を１０μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５の存在（陰影柱）下または不在（黒色柱）下に１０％ＲＳＨＰとともに２時間３７℃でインキュベーションして感作した後に、ブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬでチャレンジした。ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡチャレンジに反応してのヒスタミン放出を白色柱で表示する。誘導ヒスタミン放出を細胞中全ヒスタミンに対する百分率として表示する。各柱は測定２回の平均値を表示する。図５はヒスタミン放出機序を示すグラフ描写である。０.５μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５(白色正方形)、１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５(白色三角形) 、またはｒｈｕＭＡｂＥ２５なし（白色円形）の存在下に１０％ＲＳＨＰで前感作したナイーブ提供者血液をブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬでチャレンジし、所定時間インキュベーションした。１０％ＲＳＨＰで前感作し、ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡでチャレンジしたナイーブ提供者血液を（白色円形）陰性対照に用いた。誘導したヒスタミン放出を定量し、様々な反応上清液中の濃度（ｎＭ）として表現した。誤差線は測定値２個の範囲を表示する。図６はインキュベーション培地内におけるＣａ⁺²およびＭｇ²⁺欠落に起因するヒスタミン放出減少を示すグラフ描写である。ナイーブ提供者のヘパリン化全血をハンク緩衝液（白色円形）またはＣａ⁺²およびＭｇ²⁺が欠落したハンク緩衝液（ＨＢＳＳ^--）（黒色円形）で希釈し、様々な濃度のｒｈｕＭＡｂＥ２５と共に２時間インキュベーションした後、３７℃で３０分間ブタクサアレルゲン（０. １μｇ／ｍＬ）でチャレンジした。各点は測定２回の平均値を表示する。図７はインキュベーション培地のＣａ⁺²およびＭｇ2⁺濃度がヒスタミン放出に及ぼす効果を示すグラフ描写である。ナイーブ提供者全血を様々な濃度のＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ(白色円形)、ＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ(黒色円形)、またはＣａＣｌ₂・２Ｈ₂ ＯプラスＭｇＣｌ₂・６Ｈ₂Ｏ（白色正方形）を含有するＨＢＳＳ^--で希釈して１０％ＲＳＨＰによって２時間感作した後に、３７℃で３０分間ブタクサアレルゲン（０.１μｇ／ｍＬ）でチャレンジした。上清液中ヒスタミン放出を定量し、細胞中全ヒスタミンの百分率として表現した。各点は測定２回の平均値を表示する。図８はブタクサ誘導ヒスタミン放出に及ぼすｒｈｕＭＡｂＥ２５濃度の効果を示すグラフ描写である。ナイーブ提供者血液を様々な濃度のｒｈｕＭＡｂＥ２５の存在下に１０％ＲＳＨＰとともに３７℃で２時間インキュベーションして感作した後に、３７℃で３０分間ブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬでチャレンジした。誘導したヒスタミン放出を定量し、様々な反応上清液中での濃度（ｎＭ）として表現する。各点は測定２回の平均値を表示する。図９はチリダニに対してアレルギー性の個体からの血漿が起こすナイーブ提供者好塩基球のヒスタミン放出に及ぼすｒｈｕＭＡｂＥ２５の効果を示すグラフ描写である。ナイーブ提供者１名からのヘパリン化全血をハンクス緩衝液で１：７に希釈し、ｒｈｕＭＡｂＥ２５の存在（１μｇ／ｍＬ）下または不在下にチリダニにアレルギー性である個体から採取した血漿（ＡからＧまで）７個とともに２時間プレインキュベーションし、３７℃で３０分間緩衝液（ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡ）およびチリダニアレルゲン（０.１μｇ／ｍＬ）でチャレンジした。誘導したヒスタミン放出を定量し、様々な反応上清液中での濃度（ｎＭ）として表現する。ｒｈｕＭＡｂＥ２５不在下でのヒスタミン放出は白色柱で表示し、１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５存在下でのヒスタミン放出は陰影柱で表示する。各柱は測定２回の平均値を表示する（円形）。図１０はヒトＩｇＥのＲＢＬ４８細胞への結合に対するｒｈｕＭＡｂＥ２５による阻止を示すグラフ描写である。ＲＢＬ４８細胞を４００００細胞／ウェルで接種し、５％ＣＯ₂培養器中一夜３７℃で培養した後にアルコールで固定した。固定した細胞を次の培地の一つの中で１時間３７℃でインキュベーションした：（１）１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ−グルタミンおよび活性ゲネティシン（ｓＩＭＤＭ）（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１１８１１−０３１）５００μｇ／ｍＬ添加Ｉｓｃｏｖｅ修正ダルベッコ培地、（２）ｓＩＭＤＭ／１０％ＲＨＳＰ、または（３）ｓＩＭＤＭ／１０％ＲＨＳＰ／１０μｇ／ｍＬｒｈｕＭＡｂＥ２５。インキュベーション後に、細胞をＰＢＳ／０.０５％トゥイーン２０で６回洗浄し、次にセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＥ（１／１００００倍希釈）と３７℃で３０分間反応させ、続いてｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質と常温で３０分間インキュベーションした。各柱は測定２回の平均値を表示する。図１１はＲＢＬ４８細胞中でのブタクサ誘導ヒスタミン放出に及ぼす温度およびＣａ⁺²濃度の効果を示すグラフ描写である。ＲＢＬ４８細胞を４００００細胞／ウェルで接種し、５％ＣＯ₂培養器中、一夜３７℃で培養した。細胞を１０％（ｖ／ｖ）ＲＳＨＰを含むｓＩＭＤＭ中、３７℃で２時間プレインキュベーションし、次に室温で５０％Ｄ₂Ｏ(白色円形)、３７℃で５０％Ｄ₂Ｏ(黒色円形)、３７℃でＳＩＭＤＭ(黒色正方形)、または３７℃で５０％Ｄ₂Ｏ／２.５ｍＭ−ＥＤＴＡ（白色正方形）中のブタクサアレルゲン０μｇ／ｍＬ、０.００１μｇ／ｍＬ、０.０１μｇ／ｍＬ、０.１μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、または１０μｇ／ｍＬでチャレンジした。各点は測定２回の平均値を表示する。図１２は５０％Ｄ₂Ｏ存在下、ＲＢＬ４８細胞によるブタクサ誘導ヒスタミン放出の時間的経過を示すグラフ描写である。ＲＢＬ４８細胞を４００００細胞／ウェルで接種し、５％ＣＯ₂培養器中、一夜３７℃で培養した。細胞をｓＩＭＤＭまたはｓＩＭＤＭ／１０μｇ／ｍＬｒｈｕＭＡｂＥ２５とともに１０％（ｖ／ｖ）ＲＳＨＰの存在下に３７℃で２時間プレインキュベーションした。ｓＩＭＤＭで３回洗浄後、細胞を下記混合物の一つでチャレンジした：（１）ヒスタミン放出緩衝液（ＨＲＢ）（５０％Ｄ₂Ｏ、０.８％ＮａＣｌ、１.３ｍＭ−ＣａＣｌ₂ 、ｓＩＭＤＭ）(白色円形)、（２）ＨＲＢおよびブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬ(黒色円形)、（３）ＨＲＢ、ブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬ、および０.５μｇ／ｍＬのrｈｕＭＡｂＥ２５(黒色正方形)、または（４）ＨＲＢ、ブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬ、および１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５（白色正方形）。各点は測定２回の平均値を表示する。図１３はＲＢＬ４８細胞中のブタクサ誘導ヒスタミン放出に対するｒｈｕＭＡｂＥ２５による阻害を示すグラフ描写である。ＲＢＬ４８細胞を４００００細胞／ウェルで接種し、５％ＣＯ₂培養器中、一夜３７℃で培養した。細胞を０.０７８、０.１５６、０.３１３、０.６２５、１.２５、２.５、５、および１０μｇ／ｍＬ濃度でのｒｈｕＭＡｂＥ２５とともに１０％（ｖ／ｖ）ＲＳＨＰ存在下に３７℃で２時間プレインキュベーションした。ｓＩＭＤＭで３回洗浄後、細胞をＨＲＢ、ブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬ、５０％Ｄ₂Ｏにより３７℃で３０分間チャレンジした。各点は測定２回の平均値を表示する。図１４はヒト好塩基球ヒスタミン検定（ＨＢＨＡ）結果とラット肥満細胞ヒスタミン検定（ＲＭＣＨＡ）結果との間の相関関係を示すグラフ描写である。１５標本のｒｈｕＭＡｂＥ２５を各々２用量でＨＢＨＡおよびＲＭＣＨＡの双方でブタクサ誘導ヒスタミン放出阻止性能について検査した。各標本のｒｈｕＭＡｂＥ２５濃度は各検定法のｒｈｕＭＡｂＥ２５標準曲線から決定した。回収したｒｈｕＭＡｂＥ２５濃度（希釈係数に対して補正後）をプロットした。ＳｔａｔＶｉｅｗ４.０プログラムを使用して９５％信頼区間による単純回帰分析を行った。図１５はアレルゲンパネルに対するアレルギー性個体からのヒト血漿標本のＲＭＣＨＡスクリーニングを示すグラフ４個を開示する。ＲＢＬ４８細胞を４００００細胞／ウェルで接種し、５％ＣＯ₂培養器中、一夜３７℃で培養した。細胞を異なるアレルギー性提供者４名から分離した血漿標本（Ｐ₁、Ｐ₂、Ｐ₃、Ｐ₄）で個別に感作し、ＨＲＢ(Ａ)、ＨＲＢおよび標準化したダニ（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ）アレルゲン０.１μｇ／ｍＬ(Ｂ)、ＨＲＢおよびハウスダスト混合アレルゲン０.１μｇ／ｍＬ(Ｃ)、ＨＲＢおよびブタクサ抗原Ｅ−ＢおよびＥ−Ｃ０.１μ ｇ／ｍＬ(Ｄ)、ＨＲＢおよび標準化したネコ毛皮アレルゲン０.１μｇ／ｍＬ(Ｅ )、またはＨＲＢおよびアルテルナリア属真菌（Ａlｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｉｕｓ）のアレルゲン０.１μｇ／ｍＬ（Ｆ）でチャレンジした。アレルゲン誘導ヒスタミン放出は１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５存在（黒色柱）下または不在（白色柱）下に感作した標本に対する細胞中全ヒスタミンの百分率として決定した。各柱は測定２回の平均値を表示する。図１６はＨＢＨＡ検定で測定したブタクサアレルゲンおよびブタクサアレルゲン／３３％Ｄ₂Ｏにより誘導されたヒスタミン放出量の比較を示すグラフ描写である。提供者血液を１０％ＲＳＨＰとともに３７℃で２時間インキュベーションし、次に３３％Ｄ₂Ｏの存在下または不在下に３７℃で３０分間ブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬでチャレンジした。異なるナイーブ提供者全部で２７名を用いた。各点は測定２回の平均値を表示する。図１７はＲＢＬ４８細胞のブタクサ誘導ヒスタミン放出に及ぼすＤ₂Ｏの効果を示すグラフ描写である。ＲＢＬ４８細胞を４００００細胞／ウェルで接種し、５％ＣＯ₂培養器中、一夜３７℃で培養した。細胞をｓＩＭＤＭまたはｓＩＭＤＭ／１０μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５とともに１０％（ｖ／ｖ）ＲＳＨＰ存在下に３７℃で２時間プレインキュベーションした。ｓＩＭＤＭで３回洗浄後、細胞を次の混合物中、様々な濃度（０％、３０％、５０％、７０％、１００％）のＤ₂Ｏで個別にチャレンジした：（１）ＨＲＢ(黒柱)、（２）ＨＲＢおよびブタクサアレルゲン(白色柱)、および（３）ＨＲＢ、ブタクサアレルゲン０.１μ ｇ／ｍＬ、および１０μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５（陰影柱）。各点は測定２回の平均値を表示する。好適な態様の詳細な記載Ａ．定義用語「ＩｇＥ拮抗剤」はここではＩｇＥと免疫細胞上の高親和性受容体Ｆｃ_ε ＲＩまたはアレルゲン剌激に反応して薬理学的伝達物質単数または複数を放出しないよう遺伝子工学的に処理した細胞との間の相互作用を分裂または阻害できる化合物を意味する。好ましくは、このＩｇＥ拮抗剤は免疫細胞または遺伝子工学的に処理した細胞の特定薬理学的伝達物質単数または複数の誘導不能性によっても特徴付けられる。ＩｇＥ拮抗剤は、たとえばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような、いかなる免疫グロブリン型の抗ＩｇＥ抗体およびその断片、可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体およびその断片、抗Ｆｃ_εＲＩ抗体およびその断片、ＩｇＥ変異体およびその断片、ＩｇＥ結合性ペプチド、Ｆｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチド、およびＩｇＥに結合することができるかまたはＦｃ_εＲＩ受容体へのＩｇＥの結合についてＩｇＥと競合することができる非蛋白質性低分子を含む。「抗ＩｇＥ抗体」はここでは結合したＩｇＥがＦｃ_εＲＩ受容体と相互作用する性能を削減または除去するようにＩｇＥに結合することができる抗体のいずれかとして定義する。「抗ＩｇＥ抗体断片」はここでは結合したＩｇＥがＦｃ_εＲＩ受容体と相互作用する性能を削減または除去するようにＩｇＥに結合することのできる抗ＩｇＥ抗体分子のいずれかの部分として定義する。「可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体」はここではＦｃ_εＲＩα鎖の細胞外ドメイン（エキソドメイン）にＩｇＥ結合部位を含み、ここに、結合ＩｇＥがＦｃ_εＲＩ受容体と相互作用する能力を削減または除去するようにその分子がＩｇＥに結合することができる分子のいずれかとして定義する。用語「ＩｇＥ変異体」はここでは、ＩｇＥ分子が免疫細胞を感作する性能を削減するか除去し、ここに、変化したＩｇＥ分子がＦｃ_εＲＩ受容体への結合についてＩｇＥと競合することができる、単数または複数のアミノ酸置換および／または単数または複数のアミノ酸欠失のような変化を持つＩｇＥ分子のいずれかとして定義する。用語「ＩｇＥ変異体断片」と「ＩｇＥ変異体の断片」とはここではＦｃ_εＲＩ受容体への結合についてＩｇＥと競合することのできるＩｇＥ変異体の断片のいずれかとして定義する。用語「ＩｇＥ−結合性ペプチド」はここでは可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体および抗ＩｇＥ抗体およびその断片を含む、ＩｇＥへの結合についてＦｃ_εＲＩ受容体と競合することのできるペプチドのいずれかとして定義する。用語「Ｆｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチド」はここではＩｇＥ変異体およびその他の抗体およびその断片を含み、Ｆｃ_εＲＩ受容体への結合についてＩｇＥと競合することのできるペプチドのいずれかとして定義する。用語「アレルゲン」はここでは、たとえば花粉、ブタクサ、チリダニ、および牛乳抗原のような、ある抗原に対する患者の第２回または後続する接触に際して患者にＩ型過敏反応を発生することのできる抗原のいずれかを示す。用語「薬理学的伝達物質」はここでは、Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞により放出され、たとえばヒスタミン、ロイコトリエン、プロスタグランジンおよび血小板活性化因子のように炎症反応を媒介することのできる化合物のいずれかを意味する。用語「Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞」はここではＦｃ_εＲＩ高親和性受容体を発現する細胞であって、ＩｇＥ誘導感作および目的抗原との接触に際して薬理学的伝達物質単数または複数を放出することのできる、たとえば肥満細胞および好塩基球のような細胞を示すことを意図している。用語「遺伝子工学的に処理した」はここでは外因性または追加的内因性ＤＮＡの導入によって天然の状態から変えられている細胞とこのような変化された細胞の子孫とを示す。遺伝子工学的に処理した肥満細胞の例には、宿主細胞に異種であるＦｃ_εＲＩα鎖をコードする外因性ＤＮＡを発現する肥満細胞、宿主細胞と同族であるＦｃ_εＲＩα鎖をコードする外因性ＤＮＡを発現する肥満細胞、および宿主細胞によるＦｃ_εＲＩα鎖をコードする内因性ＤＮＡの発現を強化する外因性ＤＮＡを含む肥満細胞などを包含する。遺伝子工学的に処理した好塩基球の例には、宿主細胞に異種であるＦｃ_εＲＩα鎖をコードする外因性ＤＮＡを発現する好塩基球、宿主細胞と同族であるＦｃ_εＲＩα鎖をコードする外因性ＤＮＡを発現する好塩基球、宿主細胞によるＦｃ_εＲＩα鎖をコードする内因性ＤＮＡの発現を強化する外因性ＤＮＡを含む好塩基球などを包含する。用語「患者血清」および「患者から採取した血清標本」はここではＩｇＥを含有し、Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を欠落する患者血液の画分のいずれかであるとして定義する。用語「血清標本」および「目的アレルゲンに特異的なＩｇＥを含有する血清」はここでは感作したＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を目的アレルゲンによるチャレンジによって、薬理学的伝達物質単数または複数の放出を誘導するようにＦｃ_εＲＩ⁺ 免疫細胞を感作することができるＩｇＥ含有処理物のいずれかを示す。用語「提供者」、「ナイーブ提供者」、「健常提供者」、および「非アレルギー性提供者」はここでは互換的に使用され、目的アレルゲンに対してアレルギーを持たない個体を示すことを意図している。用語「ナイーブ提供者からの組織標本」と「提供者組織」とはここではナイーブ提供者から採取した、Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を含有する肺臓組織、全血、および血液分画を包含する組織のいずれかとして定義する。用語「ナイーブ提供者からの血液標本」と「提供者血液」とはここではナイーブ提供者から採取し、Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を含有する、全血を包含する血液分画として定義する。用語「放出混合物」、「感作混合物」、「感作免疫細胞」、および「感作提供者血液」はここでは患者血清またはその他の血清標本および提供者組織との混合物を示し、ここでは、患者の血清または血清標本中に存在するアレルゲン特異的なＩｇＥのいずれかを提供者組織に存在するＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞と相互作用させる。用語「遮断放出混合物」および「遮断した感作混合物」はここでは患者血清またはその他の血清標本、提供者組織、およびＩｇＥ拮抗剤であるか、またはＩｇＥ拮抗剤候補であるか、または抗アレルギー性治療剤候補である薬剤との混合物を示す。ＩｇＥ拮抗剤の場合には、その薬剤を好ましくは患者血清または血清標本内に存在するアレルゲン特異的ＩｇＥのいずれかと提供者組織の中に存在するＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞との間の相互作用を減少させるに十分な濃度で存在させる。ＩｇＥ拮抗剤候補または抗アレルギー性治療剤候補の場合には、薬剤は好ましくはＩｇＥとＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞との相互作用を分裂または遮断する該薬剤の性能を検定するに十分な濃度で存在させる。用語「ＩｇＥ誘導免疫細胞感作を遮断する薬剤の生物活性」はここではＩｇＥのＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞への相互作用を分裂または遮断するその薬剤の性能として定義する。この定義にはＦｃ_εＲＩ⁺とＩｇＥへの結合について競合することによってＩｇＥ／免疫細胞相互作用を遮断または分裂する生物活性およびＦｃ_ε ＲＩへの結合についてＩｇＥと競合することによってＩｇＥ／免疫細胞相互作用を遮断または分裂する生物活性を包含する。用語「抗アレルギー性治療剤候補」はここではアレルギー性疾患の処置での使用について評価すべき薬剤のいずれかとして定義する。用語「ＩｇＥ拮抗剤候補」はここではＩｇＥ拮抗剤としての使用について評価すべき薬剤のいずれかとして定義する。用語「Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞とのＩｇＥの相互作用」、「ＩｇＥ誘導免疫細胞感作」、「Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞感作」、「免疫細胞感作」、および「Ｆｃ_εＲＩ受容体とのＩｇＥの相互作用」は、ここではアレルゲン特異的ＩｇＥの免疫細胞Ｆｃ_εＲＩ受容体への結合であって、これに後続するアレルゲンのＦｃ_εＲＩ受容体結合性ＩｇＥへの結合が免疫細胞による薬理学的伝達物質単数または複数の放出を誘導するようなものとして定義する。Ｂ．一般的方法Ｉ．ナイーブＦｃ_εＲＩ⁺細胞によるアレルゲン特異的ＩｇＥの検出一側面では、本発明はアレルギー性疾患の診断法を提供する。一般的に、この方法はＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を使用するアレルギー性患者血清内アレルゲン特異的ＩｇＥの検出を含む。さらに特定的には、アレルギー性患者血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥをＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下に好塩基球および／または肥満細胞上での開放されたＦｃ_εＲＩ受容体とそのアレルゲン特異的ＩｇＥとを、相互作用（感作）させることによって検出する。このアレルゲン特異的ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩ相互作用をアレルゲン添加およびヒスタミンまたはその他の薬理学的伝達物質の即時放出の測定によって検定する。ＩｇＥ拮抗剤はＩｇＥ／Ｆｃ_ε ＲＩ相互作用を遮断するので、ＩｇＥ拮抗剤を含有する反応混合物中でのヒスタミンの低濃度は患者血清中におけるアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を指摘する。ヒスタミンは下記論議の多くでアレルゲンが誘導し、ＩｇＥが媒介する免疫細胞の炎症反応関連化合物の放出を示すために使用できる薬理学的伝達物質の例として役立つけれども、本発明はここに定義し、論議し、請求する方法において、ロイコトリエン、プロスタグランジンおよび血小板活性化因子を包含するかかる薬理学的伝達物質いずれかの使用をも包含することが認識されるであろう。ａ．ナイーブＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞の調製一態様において、本方法は患者血清をナイーブ提供者から採取したＦｃ_εＲＩ⁺ 免疫細胞と接触することを包含する。ＩｇＥ感作およびアレルゲンチャレンジに反応して薬理学的伝達物質単数または複数を放出することのできるＦｃ_εＲＩ⁺ 免疫細胞を包含する、ナイーブ提供者から採取した組織標本のいずれも患者血清中におけるアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を検出するために使用できる。例えば、好塩基球を含む組織標本を使用できる。個体の約１５％は試験管内でヒスタミンを放出しない好塩基球を持っているので、提供者候補を本方法での使用に適する好塩基球のヒスタミン放出性能についてスクリーニングすべきである。好ましくは、アレルゲン特異的ＩｇＥで前感作した提供者好塩基球はアレルゲンチャレンジに際して細胞中全ヒスタミンの７％またはそれ以上、さらに好ましくは１０％またはそれ以上を放出する。いずれのアレルゲンおよび対応するＩｇＥによるヒスタミン放出についても、下記実施例に記載するブタクサ誘導ヒスタミン放出に関する提供者スクリーニング法に従えば、提供者をスクリーニングできる。許容可能な放出性を持つ潜在的な提供者の群は、提供者細胞を酸化重水素（Ｄ₂ Ｏ）存在下に提供者細胞をインキュベーションすることによって増加する。実施例に示すように、インキュベーション培地中のＤ₂Ｏの存在はアレルゲン誘導性ヒスタミン放出を増大する。インキュベーション培地における最終濃度約１０％から５０％、好ましくは約２０％から４０％、最も好ましくは約３３％でＤ₂Ｏを効果的に使用できる。好適な態様では、ナイーブ提供者からの全血標本を使用する。全血使用は好塩基球の検定前処理を有益に減じ、細胞分離操作に起因する細胞機能の破壊を回避する。全血標本は検定で使用する前に抗凝固処理し、緩衝塩溶液で希釈できる。インキュベーション培地内Ｃａ²⁺の存在はヒスタミン放出に実質的な影響を及ぼす（ＭａｃＧｌａｓｈａｎとＢｏｔａｎａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０巻：９８０〜９９１頁（１９９３年））ので、希釈緩衝液はＣａ²⁺を含有するものが好適である。その他に、希釈緩衝液は下記実施例に記載するように、ヒスタミン放出を増加するためにＭｇ²⁺も含有できる。約１：２から１：１０、より好ましくは約１：５から１：７までの比率での１.３ｍＭ−Ｃａ²⁺および０.９ｍＭ−Ｍｇ²⁺を含有するハンク平衡塩緩衝液（ＨＢＳＳ）による血液標本の希釈はヒスタミン放出について良い環境を提供する。その他に、ナイーブ提供者からの分離白血球も使用できる。白血球はＧｉｌｌｅｓｐｉｅなど、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、５１巻：２９４１〜２９４７頁（１９７２年）の方法に従って分離し、調製できる。もう一つの態様では、提供者細胞にある開放Ｆｃ^εＲＩ受容体数を好塩基球の細胞表面からＩｇＥを除去することによって増加できる。この技術は検定用に適当な受容体数を持つ潜在的提供者集団を増加する。Ｐｒａｈｌなど、前出、が記載のように血液を洗浄し、血球を４℃で約５分間燐酸緩衝液（ｐＨ３.６）中に懸濁することにより、またはＰｒｕｚａｎｓｋｙなどがＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３巻：１９４９〜１９５４頁（１９８３年）に記載のような乳酸洗浄により好塩基球細胞表面から結合したＩｇＥを除去できる。さらに別の態様では、肥満細胞からなる提供者組織標本を使用できる。肥満細胞を含む組織標本はナイーブ提供者の肺臓組織から入手できる。肺臓組織はＭａｒｏｎｅなど、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．、９３巻：２４６〜２５２頁（１９８９年）に記載のように細胞懸濁液として採取調製できる。ｂ．患者血清の調製ＩｇＥを含有し、および／またはＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を欠落する患者血液画分はいずれも本発明によるアレルギー診断での使用に適当である。容易に得られるので患者血清標本は分析用に便利な画分である。ｃ．患者血清によるナイーブＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞の感作患者血清をＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下にナイーブ提供者組織標本に添加するとそれぞれ遮断感作混合物または感作混合物を得る。提供者組織が血液標本である時は、混合物中の患者血清と提供者血液との望ましい比率は提供者血液の画分および使用すべき血液の希釈率および検査すべき患者血清の希釈率に従って変化する。提供者全血をＨＢＳＳ／１％ＢＳＡで１：７に希釈し、非希釈患者血清と混合する場合は、提供者血液と患者血清との適当な比率は約２：１から２０：１、好ましくは約４：１から１５：１、さらに好ましくは約９：１である。患者血清／ナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞の混合物少なくとも２個を並行して比較する。一方の混合物では患者血清ＩｇＥがナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺ 免疫細胞に結合するのをＩｇＥ拮抗剤を使用して遮断する。第二の混合物では患者血清をナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞とＩｇＥ拮抗剤の不在下に接触する。好適な態様では、ＩｇＥに結合するＩｇＥ拮抗剤を患者血清／提供者組織混合物中で患者血清中アレルゲン特異的ＩｇＥを力価検定するための濃度範囲で使用する。ＩｇＥ拮抗剤濃度範囲の効果の分析は患者のアレルギー症状の重篤度評価に強力な手段が得られる。要すれば、アレルゲン特異的ＩｇＥを含有することが判明している血清標本もＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下に本発明に従って検査してそれぞれ陰性および陽性対照を提供する。遮断感作混合物のＩｇＥ拮抗剤の望ましい濃度は使用するＩｇＥ拮抗剤の型に従って変化する。ＩｇＥへの結合についてＦｃ_εＲＩ受容体と競合するＩｇＥ拮抗剤の場合には、ＩｇＥ拮抗剤の好適な濃度はＩｇＥ拮抗剤およびＦｃ_εＲＩ受容体のＩｇＥへの相対的親和性に依存する。ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩ受容体相互作用の完全な遮断を所望する時は、遮断感作混合物中に存在するＩｇＥの飽和に十分な濃度のＩｇＥ拮抗剤を使用するのが好ましい。Ｆｃ_εＲＩ受容体への結合についてＩｇＥと競合するＩｇＥ拮抗剤の場合には、ＩｇＥ拮抗剤の好適な濃度はＩｇＥとＩｇＥ拮抗剤とのＦｃ_εＲＩ受容体への相対的親和性に依存する。ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩ受容体相互作用の完全な遮断を所望する時は、遮断感作混合物中に存在するＦｃ_εＲＩ受容体の飽和に十分なＩｇＥ拮抗剤濃度を使用するのが好ましい。抗ＩｇＥモノクローナル抗体をＩｇＥ拮抗剤として使用する時およびナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞の源泉として血液を使用する時は、患者血清／提供者血液混合物中にある抗体の有用な濃度範囲は好ましくは約０.００１から１０ μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは約０.００５から５μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０.０１から２μｇ／ｍＬである。ＩｇＥ拮抗剤は、患者血清を提供者組織混合物に添加する前か、または同時かに提供者組織と混合できる。あるいは、患者血清をＩｇＥ拮抗剤とを前混合し、次に提供者組織と混合できる。提供者組織／患者血清混合物はＩｇＥのＦｃ_εＲＩ受容体への結合に適当な条件下にインキュベーションする。提供者血液／患者血清混合物の場合には、好適な条件は下記実施例に記載するように、加湿５％ＣＯ₂培養器での３７℃で約２時間のインキュベーションから構成される。ｄ．感作Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞のアレルゲンチャレンジインキュベーションに続いて、感作混合物と遮断感作混合物との適量を目的アレルゲンでチャレンジする。好ましくは、感作混合物および遮断感作混合物の適量、約５０から２００μＬ、さらに好ましくは１００から１５０μＬの大きさ、をアレルゲンチャレンジのために使用する。感作混合物および遮断感作混合物の適量をマイクロタイタープレートのウェルに入れて、好都合なアレルゲンとの反応および分析ができる。各ウェルにアレルゲン充分量を添加し、反応混合物をヒスタミン放出に適当な緩衝液で希釈できる。必要なアレルゲン量はＩｇＥ結合性Ｆｃ_εＲＩ受容体の濃度とＩｇＥのアレルゲン特異的結合への親和性とに依存する。反応混合物中で過剰のアレルゲンを使用できるが、アレルゲンの高濃度はヒスタミン放出の非特異的誘導を起こしうる。アレルゲン濃度約０.０１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０.０５μｇ／ｍＬから１５μｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは約０.１μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬは本発明で殆どのアレルゲンと感作免疫細胞との反応に適当である。アレルゲン反応混合物のインキュベーション条件はヒスタミン放出が誘導されるよう選択する。好適な態様では、反応混合物を温度低くとも３２℃で約２０から３０分間、さらに好ましくは低くとも３７±１℃でインキュベーションする。ｅ．ヒスタミン放出の検定アレルゲン反応混合物中のヒスタミン放出は反応容器温度を鋭く低下させる、たとえばマイクロタイタープレートを氷上に置くようないずれの好都合な方法でもよいが、ことにより停止できる。各標本について細胞中全ヒスタミンは細胞を破壊し、細胞破砕物からヒスタミンを分離し、分離したヒスタミンを定量することによって測定できる。細胞は、たとえば超音波処理、Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ圧縮または浸透圧および凍結解凍のような、いかなる好都合な方法によっても破壊でき、ヒスタミンを細胞破砕物から、たとえば濾過または遠心分離によって、容易に分離する。ヒスタミン濃度はＮｏｌｔｅなど、Ａｌｌｅｒｇｙ、４２巻：３６６〜３７３頁（１９８７年）に記載の分光光学的螢光測定法、Ｐｅｙｒｅｔなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、９０巻：３９〜４５頁（１９８６年）に記載のラジオイムノアッセイ、および、たとえばヒスタミンをヒスタミン複合酵素と固体担体に固定した抗体への結合について競合させ、それに続いて発色団基質を持つ結合酵素の検出によって結合競合イムノアッセイを行うような、酵素イムノアッセイを包含する多数の方法で測定できる。下記実施例に記載するように本発明ではＡＭＡＣ社、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥから購入できるヒスタミンのイムノアッセイキットを使用してヒスタミン水準を測定できる。本発明のさらなる態様では、ガラス繊維存在下にヒスタミン放出反応を行い、続いてガラス繊維に結合したヒスタミンを検出することによりヒスタミン濃度を測定できる。マイクロタイタープレートはＮｏｌｔｅなどが記載したようにしてガラスミクロ繊維を層積できる。血球がミクロ繊維に捕捉されるのを回避するため、Ｎｏｌｔｅなどの方法に従ってＰｉｐｅｓ−ＡＭＣをウェルに添加できる。次に、提供者血液および患者血清をＩｇＥ拮抗剤存在下または不在下にウェルに添加し、続いて前記方法におけるようにアレルゲンと反応する。妨害物質はプレートを洗浄することによってミクロ繊維に結合したヒスタミンから分離できる。ヒスタミンを、たとえばＮｏｌｔｅなどが記載したＨＣｌＯ₄／ｏ−フェニレンジアミン混合物のような適当な溶媒の添加によりミクロ繊維から放出し、ヒスタミン含有量は前記方法のいずれかによっても測定できる。最後に、ＩｇＥ拮抗剤に起因するヒスタミン放出の阻害百分率を算出する。ＩｇＥ拮抗剤の特定濃度に起因する阻害百分率はＩｇＥ拮抗剤不在下のヒスタミン放出量からＩｇＥ拮抗剤存在下のヒスタミン放出量を減算し、この差をＩｇＥ拮抗剤不在下のヒスタミン放出量で除算することによって算出できる。ヒスタミン放出を減少するＩｇＥ拮抗剤の性能は、患者血清内にアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を示すので、その特定のアレルゲンに対するアレルギー反応が認定される。ヒスタミン放出を減少するために必要なＩｇＥ拮抗剤の量は、アレルギー症状の臨床的な強度および重篤度の指標である。ＩＩ．ナイーブＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞による患者血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥ検出用キット本発明の検査システムをキットの形で供給でき、その内容はナイーブ提供者のＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を含むバイアル、ＩｇＥ拮抗剤を含むバイアルおよび目的アルレゲンを含むバイアル単数または複数を包含する。ナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞は全血、血液画分、洗浄白血球懸濁液、またはナイーブ提供者に由来する肥満細胞懸濁液の形で提供でき、冷蔵庫中に貯蔵するのが便利である。前記のＩａに記載したように感作放出混合物中の薬理学的伝達物質の放出を促進するに適当な緩衝塩溶液を含むバイアルをキットに包含することもできる。所望ならば、目的アルレルゲンに特異的なＩｇＥを含むバイアル１個またはそれ以上を陽性対照として提供できる。陽性対照アレルゲン特異的ＩｇＥは被検患者と同じ動物種に由来する。陽性対照アレルゲン特異的ＩｇＥは患者血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥの力価測定に有用な標準曲線の構築を促進するために所定濃度で提供できる。態様の一つでは、このキットには提供者のナイーブＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞が放出する薬理学的伝達物質の分析に使用する薬剤を含むバイアルを包含する。別の態様では、このキットには包装ラベルまたは前記Ｉに記載した方法のいずれかによるキットの使用に関する指示を提供する包装挿入物を包含する。ＩＩＩ．遺伝子工学的に処理した細胞による患者血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥの検出本発明はさらに患者血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥと遺伝子工学的に処理した細胞の感作およびアレルゲンとの接触に際して、薬理学的伝達物質単数または複数の宿主細胞による放出を媒介できるＦｃ_εＲＩα鎖の表面発現を示すように遺伝子工学的に処理した肥満細胞または好塩基球に患者血清を接触することによる患者血清標本のアレルゲン特異的ＩｇＥの検出法を包含する。このシステムにおいては、遺伝子工学的に処理した肥満細胞宿主または好塩基球宿主が発現するＦｃ_εＲＩα鎖は患者血清中ＩｇＥのいずれとも結合することができる。これに加え、このＦｃ_εＲＩα鎖は宿主細胞の薬理学的伝達物質放出効果器の機能の中で作用することができる。このＦｃ_εＲＩα鎖は患者ＩｇＥ結合Ｆｃ_εＲＩα鎖のアレルゲン誘導交差結合が伝達物質放出を始動するように機能的ＩｇＥ受容体複合体として、また十分な数で宿主細胞の表面に発現される。アレルギー性患者血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥは、ＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下に、アレルゲン特異的ＩｇＥを遺伝子工学的に処理した肥満細胞または好塩基球宿主上のＦｃ_εＲＩ受容体α鎖と相互作用させることによって検出する。アレルゲン特異的ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩα鎖相互作用はアレルゲンを添加し、即時放出ヒスタミンまたは他の薬理学的伝達物質を測定することで検定する。ＩｇＥ拮抗剤はＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩ相互作用を遮断するので、ＩｇＥ拮抗剤含有反応混合物中のヒスタミン低濃度は患者血清中におけるアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を指摘する。ａ．遺伝子工学的に処理した細胞の構築本発明の方法は遺伝子工学的に処理した肥満細胞または好塩基球宿主のいずれかについて実施できる。典型的には、本方法では所与の動物種由来のＦｃ_εＲＩ α鎖は同じ動物種に由来するＩｇＥと反応するであろうから、患者の動物種にとって本来のＦｃ_εＲＩα鎖を発現するように遺伝子工学的に処理した肥満細胞または好塩基球宿主を使用する。しかしながら、本発明は種間システムの使用も包含し、そこでは、遺伝子工学的に処理した宿主細胞が発現するＦｃ_εＲＩα鎖が患者のものとは異なる動物種に由来するけれども、患者血清中に存在するアレルゲン特異的ＩｇＥと反応することができ、感作宿主細胞のアレルゲン誘導に際して薬理学的伝達物質単数または複数の放出を起こす。本発明はＦｃ_εＲＩα鎖を特定度合の同族性または異種性の発現宿主細胞とともに使用することに限定されていないことは認識されるものと思われる。本発明を実施するのに必要なアレルゲン刺激に際して、薬理学的伝達物質のＩｇＥ媒介放出を起こすことが宿主細胞／Ｆｃ_εＲＩα鎖システムの性能である。本発明で使用するために適当な遺伝子工学的に処理した肥満細胞または好塩基球は動物の適当な組織から肥満細胞または好塩基球を分離し、その肥満細胞または好塩基球を組織培養中でクローニングし、目的Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡを分離または合成し、Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡを適当な発現ベクターにクローニングし、肥満細胞または好塩基球細胞宿主を組換え発現ベクターで形質転換し、細胞表面に組換えＦｃ_εＲＩα鎖を発現し、患者ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩα鎖複合体のアレルゲンへの交差結合に反応して薬理学的伝達物質単数または複数を放出する肥満細胞または好塩基球形質転換体を検出し、採取することによって構築できる。１．肥満細胞および好塩基球の分離本発明は、たとえば齧歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、および霊長類その他のようないかなる動物種から採取した肥満細胞ででも実施できる。肥満細胞宿主候補は種々の型の動物組織から入手できる。肥満細胞は動物から採取した骨髄、腹膜腔液、脾臓、胎児肝臓、リンパ節、または肺臓組織から分離できる。肥満細胞を次に組織標本から抽出し、たとえば、Ｎａｂｅｌなど、Ｎａｔｕｒｅ、２９１巻：３３２〜３３４頁（１９８１年）またはＧａｌｌｉなど、Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、９５巻：４３５頁（１９８２年）の方法など当分野で公知の有力な方法のいずれかによりクローニングする。クローニングした肥満細胞の培養のために適当な培地は公知である。商業的に購入できる培地にはダルベッコの修正イーグル培地(ＤＭＥＭ)、Ｉｓｃｏｖｅの修正ダルベッコの培地（ＩＭＤＭ）およびその他の公知のものを含む。これら製品は、たとえば加熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）など、血清を添加するか血清とともに使用するのが有益であり、他のエネルギー源または栄養および／または感染を予防するために抗生物質または抗ウイルス剤を包含できる。好ましくは、クローニングした肥満細胞を生長／刺激因子の存在下に維持するが、この因子にはＣｏｎＡで刺激した脾臓細胞から、Ｎａｇｅｌなど、前出、に記載のクローニングしたＬｙｌ⁺２^-インデューサーＴリンパ球から、またはＮａｇｅｌなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１２巻：３３３頁（１９８１年）に記載のＷＥＨＩ−３細胞から、採取した上清液などを包含する数種が既に公知である。好適な態様では、肥満細胞系候補はＣａｎｔｏｒなどへの米国特許４５５９３１０号に記載のようにして入手する。他の好適な態様では、不死細胞系、たとえば目的肥満細胞種の新生物同族体など、を、たとえばラット肥満細胞系ＲＢＬ２Ｈ３のような、肥満細胞宿主として使用し、前記培養基中で生育させる。本発明は、たとえば齧歯類、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、および霊長類その他のようないかなる動物種から採取した好塩基球ででも実施できる。好塩基球宿主候補は動物血液から採取できる。白血球は前記Ｉａに記載したナイーブ提供者白血球を分離するために使用した操作のいずれかに従って全血から分離できる。好塩基球は、たとえば白血球調製物をフルオロクローム標識抗Ｆｃ_ε ＲＩ抗体またはフルオロクローム標識ＩｇＥと反応させ、続いて螢光を発する細胞をフロー活性化細胞選別機で検出し、区分するような、当分野の公知操作により残余白血球集団から分離できる。あるいは、好塩基球はＭｕｌなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．、１４９巻：２０７〜２１４頁（１９９２年）の方法に従って目的動物種から分離できる。分離した好塩基球を次に、たとえば、Ｉｓｈｉｚａｋａなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３４巻：５３２〜５４０頁（１９８５年）に記載のような、確立された方法に従って懸濁細胞培養で生長させる。２．Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡの調製目的Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡは当分野で公知の種々の方法のいずれかで調製できる。もしＤＮＡ配列が公知であれば、そのＤＮＡは、たとえばトリエステル法、ホスファイト法、ホスホロアミダイト法、Ｈ−ホスホネート法のようにＥｎｇｅｌｓなど、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、２８巻：７１６〜７３４頁（１９８９年）に記載の方法に従って、化学的に合成できる。Ｓｈｉｍｉｚｕなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻：１９０７〜１９１１頁（１９８８年）はヒトＦｃ_εＲＩα鎖をコードするｃＤＮＡとラットＦｃ_εＲＩα鎖をコードするｃＤＮＡとを開示している。天然配列ＤＮＡに加えて、目的Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードする非天然起源ＤＮＡもここでの使用に適当である。一つの態様では、発現宿主細胞に好適なコドンを使用してＦｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡを設計する。その他に、目的Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡはＦｃ_εＲＩα鎖ｍＲＮＡを含むと信じられる組織、一般的には意図する患者と同じ動物種から採取した肥満細胞または好塩基球、から得たいずれのｃＤＮＡライブラリーからもクローニングできる。Ｆｃ_εＲＩα鎖の遺伝子はゲノムＤＮＡライブラリーからも取得できる。ライブラリーを目的遺伝子またはそれがコードする蛋白質を認定するように設計したプローブでスクリーニングする。ヒトおよびラットのＦｃ_εＲＩα鎖の完全ｃＤＮＡはＳｈｉｍｉｚｕなどに記載がある。他の動物種のＦｃ_εＲＩα 鎖をコードする核酸はＳｈｉｍｉｚｕなどの１９０９頁の図２のＦｃ_εＲＩα鎖遺伝子配列からのオリゴヌクレオチド配列を持つプローブを使用して目的種のゲノムＤＮＡ、肥満細胞ｃＤＮＡまたは好塩基球ｃＤＮＡのライブラリーをストリンジェンシーの低いスクリーニングをすることで容易に取得できる。これらプローブは通常約１００またはそれ以上の塩基を含み、ラットまたはヒトのＦｃ_εＲＩα鎖ｃＤＮＡ全体を構成できる。ハイブリッド化スクリーニングで検出した陽性クローンを次にヒトおよびラットＦｃ_εＲＩα鎖に対する相同性を分析する。一般に、所与動物種からのＦｃ_εＲＩα鎖候補はラットまたはヒトのＦｃ_εＲＩ α鎖との間に約３０％またはそれ以上のアミノ酸相同性を示し、Ｓｈｉｍｉｚｕなどがラットまたはヒトについて記載したようにＦｃ_εＲＩα鎖は免疫グロブリン様構造を持つであろう。目的Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードする全長遺伝子のハイブリド化を確認する検定を行う。Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡ候補を単純に発現ベクターに挿入し、正常ならば意図する患者の目的ＩｇＥとは結合しない宿主細胞に形質転換する。そこで、意図する患者のＩｇＥに結合する性能を獲得した形質転換体は目的とするＦｃ_εＲＩα鎖遺伝子を持つ。例えば、Ｆｃ_εＲＩα鎖をコードするＤＮＡ候補をｐＳＶＬベクターにサブクローニングして形質転換したＣＯＳ−７細胞により発現し、形質転換体をトリニトロフェニル化赤血球および意図する患者の動物種から誘導した抗ジニトロフェニル（ＤＮＰ）モノクローナルＩｇＥと反応させ、続いてＭｉｌｌｅｒなどが、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４巻：３３４〜３３６頁（１９８９年）に一般的に記載したようにロゼット形成を検出する。Ｓｈｉｍｉｚｕなどはラット全長Ｆｃ_εＲＩα鎖ｃＤＮＡを成功裏に使用してヒトＦｃ_εＲＩα鎖ｃＤＮＡクローンをヒト肥満細胞ｃＤＮＡライブラリーから検出し、分離しているので、ラットまたはヒトのｃＤＮＡを使用すれば他の動物種のＦｃ_εＲＩα鎖をコードするゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをライブラリーを求めるスクリーニングに高い成功率をもって使用できることが認識されよう。もう一つの態様は、標的ＤＮＡまたはＲＮＡを増幅する、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋなど、「ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室指針）」、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ社（１９８９年）の１４章に記載のあるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許４６８３１９５号、Ｅｒｌｉｃｈ編、「ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＰＣＲ技術）」、１９８９年）の方策である。この方法は目的とするＦｃ_εＲＩα鎖をコードする核酸にハイブリッド化すると期待されるオリゴヌクレオチドのプライマーの使用が必要とするが、これらはＳｈｉｍｉｚｕなどが開示したラットまたはヒトのＦｃ_εＲＩα鎖をコードするｃＤＮＡから容易に選択される。もう一つの態様では、Ｆｃ_εＲＩα鎖蛋白質を目的動物種の肥満細胞または好塩基球から分離し、α鎖蛋白質を部分的にまたは完全にアミノ酸配列決定し、アミノ酸配列の情報を使用して縮重ＤＮＡプローブを設計し、プローブの集合を合成してゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーの目的Ｆｃ_εＲＩα鎖遺伝子についてのスクリーニングに使用する。この一般的操作はラットＦｃ_εＲＩα鎖をコードするｃＤＮＡのクローニングに関してＳｈｉｍｉｚｕが記載している。３．遺伝子工学的に処理した細胞の作成Ｆｃ_εＲＩα鎖ＤＮＡを得た後、これを選択した肥満細胞または好塩基球細胞宿主内でＦｃ_εＲＩα鎖ＤＮＡを発現することのできるベクターに挿入する。ベクター構築物はＦｃ_εＲＩα鎖をコードする領域の上流（センス一本鎖上のコード領域の５’方向）に肥満細胞または好塩基球細胞宿主にとって内因的なＲＮＡポリメラーゼによりＦｃ_εＲＩα鎖ＤＮＡの転写を開始することができるプロモーター配列を含まねばならない。要すれば、プロモーター配列はＦｃ_εＲＩα鎖ＤＮＡの転写を強力に推進するものである。発現ベクターは転写を促進するためのエンハンサーおよび／または転写終止配列を持つ。好ましくは、宿主細胞をマーカー遺伝子を含む発現ベクターで形質転換するか、または発現ベクターとマーカー遺伝子を含むベクターとで共形質転換して、形質転換体の検出または選択を促進する。好適な態様では、Ｇｉｌｆｉｌｌａｎなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９巻：２４４５〜２４５１頁（１９９２年）に記載のＶＩＳ発現ベクターを使用する。適当な発現ベクターの構築後、肥満細胞または好塩基球細胞宿主を、たとえば燐酸カルシウム法またはＤＥＡＥデキストラン沈殿法、電気穿孔法、ウイルス形質導入法、または微粒子衝突法のような当分野での公知方法いずれかによって、ベクターＤＮＡで形質転換し、形質転換体を選択培地中で生長させて検出し、選別する。形質転換体肥満細胞または好塩基球を次に、たとえば前記Ｍｉｌｌｅｒなどの方法または下記実施例２に記載した方法を使用して、目的Ｆｃ_εＲＩα鎖の表面発現について検査する。目的Ｆｃ_εＲＩα鎖を発現する肥満細胞候補または好塩基球宿主候補はアレルゲン誘導ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩα鎖複合体の交差結合に際して、たとえばヒスタミンのような、薬理学的伝達物質放出能について検定する。この検定は遺伝子工学的に処理した肥満細胞候補または好塩基球候補を前記ＩＩＩ（ａ）（１）に記載した培地中で生長させること、培養した肥満細胞または好塩基球を下記実施例２に記載する意図する患者の動物種から由来する公知のアレルゲン特異的ＩｇＥを含む血清と接触すること、感作した肥満細胞または好塩基球を下記実施例２に記載するアレルゲンと接触すること、および前記Ｉ（ｅ）に記載した方法いずれかにより混合物中のヒスタミン放出を測定することによって行う。好ましくは、意図する患者のアレルゲン特異的ＩｇＥで前感作してある遺伝子工学的に処理した肥満細胞または好塩基球はアレルゲンのチャレンジに際して、細胞中全ヒスタミンの７％より大きい、さらに好ましくは１０％より大きい放出をする。許容できる放出能のある遺伝子工学的に処理した肥満細胞および遺伝子工学的に処理した好塩基球の潜在的な集合は遺伝子工学的に処理した細胞を酸化重水素（Ｄ₂Ｏ）の存在下にインキュベーションをすることによって増加する。下記実施例２に示すように、培地中のＤ₂Ｏの存在はアレルゲン誘導ヒスタミン放出を強化する。Ｄ₂Ｏはインキュベーション培地中の最終濃度約１０％から１００％、好ましくは約３０％から７０％、さらに好ましくは約５０％から７０％で効果的に使用できる。好適な態様の一つでは、Ｇｉｌｆｉｌｌａｎなどが記載したラット肥満細胞系ＲＢＬ４８を本発明の方法で使用する。ｂ．遺伝子工学的に処理した細胞の検定用調製遺伝子工学的に処理した肥満細胞は、たとえばＣａｎｔｏｒなどに付与された米国特許４５５９３１０号に記載の肥満細胞クローニングに使用された組織培養法のような、肥満細胞培養に適当なことが公知の好都合な方法のいずれかによって、本発明の方法で使用するために培養できる。遺伝子工学的に処理した細胞が全面生長した後、これらをトリプシン化し、培養培地中に懸濁し、細胞密度約０ .２×１０⁶から０.６×１０⁶細胞／ｍＬ、好ましくは約０.４×１０⁶細胞／ｍＬに希釈する。次に、細胞をマイクロタイタープレートのウェル中に約２００００から６００００細胞／ウェル、好ましくは約４００００細胞／ウェルで接種し、約１日間培養する。好適な態様の一つでは、培養上清液を、たとえば吸引により、除去し、ウェルに残留する接着細胞を培養培地で１回またはそれ以上洗浄して遺伝子工学的に処理した細胞が自然に放出したいかなるヒスタミンの存在をも削減する。細胞洗浄に続き、培養ウェルに適量の新鮮な培地または、より好ましくは遺伝子工学的に処理した細胞による薬理学的伝達物質の放出を強化するように設計した塩緩衝液を添加する。インキュベーション培地中のＣａ²⁺の存在がヒスタミン放出に実質的効果を及ぼす（ＭａｃＧｌａｓｈａｎとＢｏｔａｎａ、前出）ので、緩衝液がＣａ²⁺を含有するのが好適である。その他に、緩衝液は後記実施例１および実施例２に記載するように、ヒスタミン放出を増加するためにＭｇ²⁺を含有できる。態様の一つでは、緩衝液は希釈したＨＢＳＳであって、最終Ｃａ²⁺濃度約０.１３ｍＭから０.６５ｍＭ、好ましくは約０.１８ｍＭから０.２６ｍＭ、および最終Ｍｇ²⁺濃度約０.０９ｍＭから０.４５ｍＭ、および好ましくは約０.１３ｍＭから０.１８ｍＭを提供する。遺伝子工学的に処理した好塩基球は、たとえばＩｓｈｉｚａｋａなど、前出、の方法のような、好塩基球懸濁細胞培養に適当なことが公知の好都合な方法のいずれかによって、本発明の方法で使用するために培養できる。好ましくは、好塩基球懸濁液培養物を約３００００から９００００細胞／ｍＬ、好ましくは約５００００から７００００細胞／ｍＬの濃度まで希釈する。懸濁培養物の希釈は新鮮な培養培地または、より好ましくは前記のようにヒスタミン放出を強化するように設計した塩緩衝液で実施できる。好適な態様では、自然に放出したヒスタミンを、遺伝子工学的に処理した好塩基球を培養培地から、たとえば遠心分離または濾過などにより、分離し、細胞を新鮮な培養培地で１回またはそれ以上洗浄することによって、削減する。洗浄した細胞を次に新鮮な培養培地中に再懸濁するか、または、より好ましくは、前記のような細胞による薬理学的伝達物質の放出を促進するのに適当な緩衝液塩溶液中に再懸濁する。この細胞懸濁液を前記所期細胞濃度になるよう調整する。これに加え、遺伝子工学的に処理した細胞のヒスタミン放出性能は懸濁緩衝液または培養上清液中に適当な濃度のＤ₂Ｏ（前記ＩＩＩ（ａ）（３））を添加することにより増強できる。好適な態様では、遺伝子工学的に処理した肥満細胞を下記実施例２に記載のように培養する。ｃ．検定用患者血清の調製ＩｇＥが含まれ、および／または、Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞が欠落する患者血液のいかなる画分も本方法に従うアレルギー診断での使用に適当である。容易に採取できるので、患者血清標本は便利な分析用画分である。ｄ．遺伝子工学的に処理した細胞の感作患者血清を遺伝子工学的に処理した細胞標本に、ＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下に添加して、それぞれ遮断した反応混合物または反応混合物を形成する。ＩｇＥ拮抗剤は混合物に患者血清を添加する前または同時に遺伝子工学的に処理した細胞標本と混合できる。あるいは、患者血清はＩｇＥ拮抗剤と予め混合し、次に遺伝子的に処理した細胞標本と混合できる。接着細胞培養物を使用する態様では、反応混合物および遮断反応混合物は患者血清をＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下に培養上清液と混合することによって形成できる。懸濁細胞培養を使用する態様では、反応混合物および遮断反応混合物はＩｇＥ拮抗剤存在下または不在下に患者血清を細胞懸濁液と混合することによって形成できる。好適な態様ではヘパリンを反応混合物中に約１から１０Ｕ／ｍＬ、好ましくは約２から６Ｕ／ｍＬ、さらに好ましくは約３Ｕ／ｍＬの濃度で存在させる。反応混合物中のヘパリン成分は、患者血清をヘパリン緩衝液にいれたものとして入手するか調製するのが有利である。あるいは、ヘパリン成分は反応混合物に使用する細胞培養培地または細胞懸濁緩衝液中に包含できる。患者血清／遺伝子工学的に処理した細胞少なくとも２種を並行して比較する。一方の混合物ではＩｇＥ拮抗剤を使用して患者血清ＩｇＥが遺伝子工学的に処理した細胞に結合するのを遮断する。第二の混合物ではＩｇＥ拮抗剤不在下に患者血清を遺伝子工学的に処理した細胞と接触させる。態様の一つでは、ＩｇＥに結合するＩｇＥ拮抗剤は患者血清中のアレルゲン特異的ＩｇＥを力価検定をするために、患者血清／遺伝子工学的に処理した細胞の混合物中で一定の濃度範囲で使用する。ＩｇＥ拮抗剤濃度範囲の効果の分析は患者のアレルギー症状の重篤度を評価する強力な手段を提供する。要すれば、アレルゲン特異的ＩｇＥを含有することが判明している血清標本も本方法に従ってＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下に検査して、各々陰性および陽性対照を提供する。反応混合物中で使用する患者血清およびＩｇＥ拮抗剤の濃度はＦｃ_εＲＩα鎖の発現水準および使用する特定の遺伝子工学的に処理した細胞の細胞濃度、宿主細胞が発現するＦｃ_εＲＩα鎖に対する患者ＩｇＥの親和性、および患者ＩｇＥおよび／または宿主細胞が発現するＦｃ_εＲＩα鎖に対するＩｇＥ拮抗剤の親和性に依存する。好ましくは、ＩｇＥ拮抗剤は遮断反応混合物中に含有する遺伝子工学的に処理した細胞と患者ＩｇＥとの間の相互作用を減少するに十分な濃度で存在する。ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩα鎖相互作用の完全な遮断が所望される時には、遮断反応混合物中に存在するＩｇＥおよび／またはＦｃ_εＲＩα鎖を飽和するに十分なＩｇＥ拮抗剤濃度で使用するのが望ましい。抗ＩｇＥモノクローナル抗体をＩｇＥ拮抗剤として使用し、遺伝子工学的に処理した細胞の単層を患者血清と最終希釈率約１：１００から約１：２まで、好ましくは約１：１０で接触する時には、患者血清／遺伝子工学的に処理した細胞混合物中の抗ＩｇＥモノクローナル抗体濃度の有用な範囲は約０.５から１００μｇ／ｍＬ、好ましくは約１から１０μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは約２から５μｇ／ｍＬである。反応混合物中の遺伝子工学的に処理した細胞濃度、患者血清希釈率、およびＩｇＥ拮抗剤濃度についての至適パラメーターは本方法のいずれの態様についても常用的実験によって容易に決定できることが認識されると思われる。反応混合物および遮断反応混合物はＩｇＥがＦｃ_εＲＩ受容体に結合するのに適する条件下にインキュベーションする。好適な条件は下記実施例２に記載するように加湿５％ＣＯ₂培養器中、約３７℃でのインキュベーション約２時間である。ｅ．感作した遺伝子工学的に処理した細胞のアレルゲンチャレンジインキュベーションに続き、反応混合物および遮断反応混合物を目的アレルゲンでチャレンジする。もし遺伝子工学的に処理した細胞の接着培養物を使用するなら、前記ＩＩＩ（ｂ）に記載のように、要すれば培養上清液を、たとえば吸引により、除去し、Ｄ₂Ｏ（アレルゲンチャレンジに際してヒスタミン放出を最大にするため）含有または不含の塩緩衝溶液に置換する。アレルゲンチャレンジは反応容積約５０から２００μＬ、好ましくは約１００から１５０μＬ、中で実行するのが有利である。そこで、感作細胞の接着細胞培養の場合は、培養上清液を約５０から２００μＬ、好ましくは約１００から１５０μＬの前記塩緩衝液と置換するのが望ましい。遺伝子工学的に処理した細胞の懸濁液の場合には、約５０から２００μＬ、好ましくは約１００から１５０μＬ量の感作細胞懸濁液を使用してアレルゲンチャレンジ用反応容積を提供するのが望ましい。約０.０１μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬ、より好ましくは約０.０５μｇ／ｍＬから１５μｇ／ｍＬ、さらに好ましくは約０.１μｇ／ｍＬから１μｇ／ｍＬのアレルゲン濃度が本検定における殆どのアルレルゲンと感作した遺伝子工学的に処理した細胞との反応には適当である。このアレルゲン反応混合物用インキュベーション条件はヒスタミン放出を誘導させるように選択する。好適な態様の下では、反応混合物を、低くとも３２℃、さらに好ましくは低くとも３７℃±１℃の温度で、約２０から３０分間インキュベーションする。ｆ．ヒスタミン放出の検定アレルゲン反応混合物中のヒスタミン放出は、たとえばマイクロタイタープレートを氷上に置くような、好都合な方法いずれによっても反応容器内温度を鋭く低下することにより停止できる。アレルゲン誘導ヒスタミン放出測定のために、反応混合物上清液を濾過または遠心分離によって細胞から分離し、上清液中のヒスタミンを前記Ｉ（ｅ）記載のヒスタミン検出検定法のいずれかにより測定できる。細胞中全ヒスタミン測定のためには反応液中の遺伝子工学的に処理した細胞を、たとえば超音波処理、Ｍａｎｔｏｎ−Ｇａｕｌｉｎ圧搾、トリトンＸ−１００のような界面活性剤での処理、または浸透圧および凍結解凍など、便利な方法いずれかによって破壊し、濾過または遠心分離により細胞破砕物からヒスタミンを分離し、ヒスタミンを前記の通りに定量する。最後に、ＩｇＥ拮抗剤に起因するヒスタミン放出阻止百分率を算出する。アレルゲンが誘導するヒスタミン放出はアレルゲン誘導ヒスタミン値を細胞中全ヒスタミン値で除算して細胞中全ヒスタミンの百分率として表現でき、遮断反応混合物および非遮断反応混合物のおのおのについて遮断百分率および非遮断百分率を得る。特定濃度のＩｇＥ拮抗剤で起きる阻止百分率は非遮断百分率から遮断百分率を減算し、この差を非遮断百分率で除算することにより決定できる。あるいは阻止百分率はＩｇＥ拮抗剤存在下のヒスタミン放出量をＩｇＥ拮抗剤不在下のヒスタミン放出量から減算し、この差をＩｇＥ拮抗剤不在下のヒスタミン放出量で除算して算出できる。そのＩｇＥ拮抗剤がヒスタミン放出を削減する性能は患者血清中でのアレルゲン特異的ＩｇＥの存在を示し、それ故特定アレルゲンに対するアレルギー反応を認定する。ヒスタミン放出削減に必要なＩｇＥ拮抗剤の量はアレルギー症状の強度と重篤度の指標である。ＩＶ．遺伝子工学的に処理した細胞による患者血清中アレルゲン特異的ＩｇＥ検出用キット本発明の検査システムはキットの形で供給でき、その内容は遺伝子工学的に処理した肥満細胞または遺伝子工学的に処理した好塩基球を含むバイアル、ＩｇＥ拮抗剤を含むバイアル、および目的アレルゲンを含むバイアル１種またはそれ以上から構成される。遺伝子工学的に処理した肥満細胞または好塩基球は凍結型で好都合に供給できるが、この場合は使用前に適当な公知解凍操作による再生化が必要である。このキットには細胞培養中に遺伝子工学的に処理した肥満細胞または好塩基球の増殖を支えることができる必須栄養素、エネルギー源、増殖因子などを含む培地をいれたバイアルおよび／または前記ＩＩＩ（ｂ）に記載したように反応混合物中で薬理学的伝達物質の放出を促進するのに適切な緩衝塩溶液を含むバイアルも包含することができる。要すれば、目的アレルゲンに特異的なＩｇＥを含むバイアル１種またはそれ以上を陽性対照として提供する。アレルゲン特異的ＩｇＥ陽性対照は、検査すべき患者と同じ動物種から由来する。アレルゲン特異的ＩｇＥ陽性対照は所定濃度で提供され、アレルゲン特異的ＩｇＥを力価測定するために有用な標準曲線の構築を促進する。態様の一つでは、このキットには遺伝子工学的に処理した細胞により放出される薬理学的伝達物質の分析に使用する試薬を含むバイアルも包含する。他の態様では、このキットには包装ラベルまたは前記ＩＩＩに記載した方法いずれかでのキットの使用に関する指示を提供する包装挿入物も包含する。Ｖ．ＩｇＥ拮抗剤のスクリーニング本発明はＩｇＥ誘導免疫細胞の感化を遮断する薬剤の生物活性検定法も提供する。本法はアレルギー疾患処置用治療剤のスクリーニングに使用できる。本法は前記アレルギー診断法またはその他のいずれの目的において使用するためのＩｇＥ拮抗活性をもつ薬剤のスクリーニングにも使用できる。一般に、本法は前記アレルギー疾患診断法におけるＩｇＥ拮抗剤の代わりに被検薬剤を使用することに関連する。アレルゲン特異的ＩｇＥとＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞とをその薬剤の存在または不在下に接触することによってアレルゲン特異的ＩｇＥとＦｃ_εＲＩ受容体との間の相互作用を遮断する性能についてある薬剤を検定する。アレルゲン特異的ＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩの相互作用はアレルゲンを添加し、即時的なヒスタミンまたはその他の薬理学的伝達物質の放出を測定することによって検定する。その薬剤含有混合物中のヒスタミン濃度の低さはその薬剤のＩｇＥ拮抗作用を示す。目的アレルゲンに特異的なＩｇＥを含み、およびＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞を欠落した血清標本はいずれもＩｇＥ誘導免疫細胞感化を遮断する薬剤の活性検定における使用に適当である。適当な血清標本は前記のようにアレルギー性患者から入手できる。この態様では、ある薬剤は特定の患者からのアレルゲン特異的ＩｇＥを遮断する性能について検定でき、その特定患者における種々の薬剤の治療効果を評価するために強力な手段を提供する。たとえば下記実施例で使用するブタクサ特異的ヒト血漿（ＲＳＨＰ）のような商業的に調製した血漿製品も本発明での使用に好適である。ＩｇＥ誘導免疫細胞感化を遮断する薬剤の活性検定において使用するのに適当なナイーブ提供者血液またはその他のナイーブ提供者組織標本の画分は前記アレルギー性疾患診断法について記載したようにして取得し、調製できる。血清標本をその薬剤の存在下または不在下にナイーブ提供者組織標本に添加してそれぞれ遮断感化混合物または感化混合物を形成する。提供者組織として全血または血液画分を使用する時は、血清および提供者血液を前記アレルギー性疾患診断法について記載した割合で混合できる。血清／ナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞の混合物少なくとも２種を並行して比較する。一方の混合物では、血清ＩｇＥのナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞への結合を遮断するためにその薬剤を使用する。第二の混合物では、その薬剤の不在下に血清をナイーブ提供者Ｆｃ_εＲＩ⁺免疫細胞に接触させて陽性対照を提供する。好適な態様では、一連の血清／提供者組織混合物を所定濃度範囲でアレルギー性疾患の処置におけるその薬剤の効果を評価するために使用し、またはその薬剤のＩｇＥ拮抗剤としての活性を測定するために使用する。被検薬剤がモノクローナル抗体である時および使用する提供者組織が全血または血液画分である時、血清／血液提供者混合物中の抗体濃度の有用な範囲は好ましくは約０. ００１から１０μｇ／ｍＬ、より好ましくはくは約０.０１から５μｇ／ｍＬ、さらにより好ましくは約０.０１から２μｇ／ｍＬである。薬剤は、提供者組織混合物に血清を添加する前または同時に提供者組織と混合できる。あるいは、その血清を薬剤とあらかじめ混合し、次に提供者組織混合物に添加できる。提供者組織／血清混合物はアレルギー性疾患診断法について前記した条件下にインキュベーションする。インキュベーションに続いて、感化混合物および遮断感化混合物の適量を目的アレルゲンでチャレンジする。アレルゲン反応混合物の適当な量、アレルゲン量およびインキュベーション条件はアレルギー性疾患診断法について前記した。アレルゲン反応混合物中に放出されたヒスタミンは前記アレルギー性疾患診断法について記載した技術いずれかにより測定できる。最後に、その薬剤に起因するヒスタミン放出の阻止百分率を算出する。特定濃度の薬剤に起因する阻止百分率はその薬剤濃度の存在下に放出されたヒスタミン量をその薬剤不在下に放出されたヒスタミン量から減算し、その差をその薬剤不在下に放出されたヒスタミン量で除算して決定する。その薬剤がヒスタミン放出を減少する性能はアレルギー性疾患の処置でのその薬剤の効果および／またはＩｇＥ拮抗剤としてのその薬剤の活性の指標である。ヒスタミン放出を減少するのに必要なその薬剤の量は抗アレルギー性治療剤および／またはＩｇＥ拮抗剤としてのその薬剤の強さの指標である。これに加えて、本発明は免疫細胞脱顆粒反応を阻止する性能についての薬剤のスクリーニング法を提供する。この方法では薬剤で処置した患者からの免疫細胞または試験管内でその薬剤とともにプレインキュベーションした提供者免疫細胞を、まずＩｇＥ拮抗剤の存在下または不在下にアレルゲン特異的ＩｇＥと混合して、次にその混合物をアレルゲンでチャレンジする。ヒスタミン放出を減少するＩｇＥ拮抗剤の性能は免疫細胞脱顆粒反応を阻止するその薬剤の性能の指標であろう。この方法は肥満細胞および好塩基球の両方における脱顆粒反応を阻止するその薬剤の性能を検査するために使用できる。本発明の使用に適当なＩｇＥ拮抗剤には抗ＩｇＥ抗体およびその断片、可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体、ＩｇＥ変異体およびその断片、Ｆｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチド、ＩｇＥ結合性ペプチド、およびＦｃ_εＲＩ⁺免疫細胞がアレルゲン刺激に応答して薬理学的伝達物質単数または複数を放出しないように、ＩｇＥとＦｃ_ε ＲＩ受容体との間の相互作用を分裂または遮断することのできる非蛋白質性低分子を包含する。ある化合物をＩｇＥ誘導免疫細胞感化を遮断する薬剤の前記生物活性検定法に従ってＩｇＥ拮抗剤としての活性についてスクリーニングできる。拮抗剤候補は免疫細胞ヒスタミン放出誘導不能性についてスクリーニングできる。このような作用はアレルギー性疾患を診断する本発明の方法におけるＩｇＥ拮抗剤の効果を損なう筈である。その上に、ヒスタミン放出を始動する薬剤の性能は患者でのアレルギーを刺激または悪化するものと思われ、それ故、抗アレルギー性治療剤のためには望ましくない特性である。ある薬剤のヒスタミン放出誘導作用は感化免疫細胞をアレルギー性疾患診断法について前記したアレルゲンの代わりにその薬剤と混合することによって検査できる。アレルゲンまたは緩衝液のみと混合した感化免疫細胞はおのおの陽性対照および陰性対照として役立つ。好適な態様では、下記実施例に記載したようにヒスタミン放出の誘導について、その薬剤を検査する。もしその薬剤がヒスタミン放出を誘導しなければ、すなわち、陰性対照の水準よりも実質的に高くなければ、その薬剤は本発明での使用が許容できる。ＶＩ．ＩｇＥ拮抗剤の作成好適な態様の一つでは、抗ＩｇＥ抗体をＩｇＥ拮抗剤として使用する。この抗ＩｇＥ抗体は、たとえばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥのような、ＩｇＥに対して産生されるそのような抗体のポリクローナルおよびモノクローナル型を含むいずれの型の免疫グロブリンであることもできる。ＩｇＥに対するポリクローナル抗体は一般に動物へのＩｇＥおよびアジュバントの多回皮下（ｓｃ）または腹腔（ｉｐ）注射により産生される。ＩｇＥまたはＩｇＥのＦｃ領域からの標的アミノ酸配列を含む断片を、免疫すべき種において免疫原である蛋白質、たとえばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシ甲状腺グルブリンまたは大豆トリプシン阻止剤など、に双官能試薬または誘導化剤、例えば、マレインイミドベンゾイルスルホサクシンイミドエステル(システイン残基経由複合)、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド(リジン残基経由) 、グルタルアルデヒド、コハク酸無水物、ＳＯＣｌ₂、またはＲ¹Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ、ここにＲおよびＲ¹は異なるアルキル基である、など、を使用して複合することは有用であろう。動物は通常は、ＩｇＥ１ｍｇまたは１μｇと完全フロイントアジバントを結合し、この溶液を多数部位に皮内注射することによって、細胞または免疫原複合体または誘導物に対して免疫される。１ケ月後、不完全フロイントアジュバント中で元の量の１／５から１／１０の複合体を動物の多数部位に皮下注射してブースト（ｂｏｏｓｔ）する。７から１４日後、動物から採血し、血清を抗ＩｇＥ力価検定する。力価がプラトーになるまで動物をブーストする。好ましくは、動物を同じＩｇＥの複合体であるが、異なる蛋白質への複合体および／または異なる交差結合剤によるものでブーストする。複合体は組換え細胞培養物中に蛋白質融合体として製造できる。また、たとえば明礬のような、凝集剤を使用して免疫反応を強化する。モノクローナル抗体は免疫した動物から脾臓細胞を採取し、その細胞を、たとえば骨髄腫細胞との融合またはエプスタイン−バール（ＥＢ）ウイルス形質転換と所期抗体を発現するクローンのスクリーニングとによるなど、通常の様式で不死化して調製する。最初にＫｏｅｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎがＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６巻：５１１頁（１９７６年）に、また、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇなどが「ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＴＣｅｌｌＨｙｂｒｉｄｏｍａｓ（モノクローナル抗体およびＴ細胞ハイブリドーマ）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＮＹ中、５６３〜６８１頁（１９８１年）に記載したハイブリドーマ技術は特異的抗原多数に対するモノクローナル抗体を高水準で分泌するハイブリッド細胞系の調製に広範に応用されてきた。ハイブリッド細胞系は試験管内で細胞培養培地内に維持できる。抗体を生産する細胞系はヒポキサンチン−アミノプテリンチミジン（ＨＡＴ）培地内の連続細胞系からなる組成物中で選択し、および／または維持できる。実際、一旦ハイブリドーマ細胞系が樹立されると、種々の栄養的に適当な培地上に維持できる。その上、ハイブリッド細胞系は、液体窒素下の凍結および貯蔵を含む、常法多数のいずれかで貯蔵し、保存できる。凍結した細胞系は再生し、モノクローナル抗体の合成および分泌の再開を伴って無限に培養できる。分泌した抗体は、たとえば沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーのような、常法によって組織培養上清液から回収する。ここに記載する抗体もハイブリドーマ細胞培養物から、これまで血漿集積から免疫グロブリン精製用に使用されてきたＩｇＧまたはＩｇＭの精製用の常法、たとえばエタノールまたはポリエチレングリコール沈降操作など、によって回収する。精製した抗体は無菌濾過する。日常的にはマウスのモノクローナル抗体を使用するが、本発明はこれに限定されるものではない、事実、ヒト抗体も使用できる。このような抗体は、例えば、ヒトハイブリドーマの使用（Ｃｏｔｅなど、「ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓａｎｄＣａｎｃｅｒＴｈｅｒａｐｙ（モノクローナル抗体および癌治療）」、ＡｌａｎＲ．、Ｌｉｓｓ、７７頁（１９８５年））により、入手できる。事実、本発明に従えば、動物の抗原結合性可変ドメインをヒト定常ドメインを結合することによるキメラ抗体生産用に開発された技術（Ｃａｂｉｌｌｙなど、米国特許４８１６５６７号、Ｍｏｒｒｉｓｏｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８１巻：６８５１頁(１９８４年)、Ｂｏｕｌｉａｎｎｅなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻：６４３〜６４６頁(１９８４年)、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１２巻：６０４頁(１９８４年)、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻：２６８〜２７０頁(１９８５年)、Ｔａｋｅｄａなど、Ｎａｔｕｒｅ、３１４巻：４５２頁(１９８５年)、欧州特許１８４１８７、欧州特許１７１４９６、欧州特許１７３４９４、ＰＣＴＷＯ８６／０１５３３、Ｓｈａｗなど、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃ．Ｉｎｓｔ．、８０巻：１５５３〜１５５９頁(１９８８年)、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９巻：１２０２〜１２０７頁(１９８５年)、Ｏｉなど、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、４巻：２１４頁（１９８６年））を利用でき、そのような抗体はこの発明の範囲内である。用語「キメラ」抗体は、ここでは少なくとも抗体分子の抗原結合部位を含み、少なくとももう一つの他の蛋白質の一部に結合している（典型的には免疫グロブリン定常ドメイン）ポリペプチドを記載するために使用する。態様の一つでは、このようなキメラ抗体は齧歯類（またはその他の非ヒト種）配列約三分の一を含み、そこで、ヒトで著明な抗グロブリン反応を起こすことができる。例えば、ネズミ抗ＣＤ３抗体であるＯＫＴ３の場合には、得られる抗グロブリン反応は多くが可変領域に対するもので、定常領域に対するものではない（Ｊａｆｆｅｒｓなど、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、４１巻：５７２〜５７８頁（１９８６年））。ヒト化抗体は、人におけるいずれかの抗グロブリン免疫反応を軽減または除去するために使用する。実際に、ヒト化抗体は典型的にはヒト抗体であって、そこでは、抗原結合部位の形成に直接関与している可変ドメイン中の超可変領域である相補性決定領域（ＣＤＲｓ）からのアミノ酸残基、およびおそらく可変ドメイン内のいくらか保存がなされている配列の領域であるフレームワーク領域（ＦＲｓ）からのアミノ酸、が齧歯類抗体中の類似部位からの残基で置換されている。ヒト化抗体の構築はＲｉｅｃｈｍａｎｎなど、Ｎａｔｕｒｅ、３３２巻：３２３〜３２７頁(１９８８年)、Ｑｕｅｅｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻：１００２９〜１００３３頁(１９８９年)、Ｃｏなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：２８６９〜２８７３頁(１９９１年)、Ｇｏｒｍａｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：４１８１〜４１８５頁(１９９１年)、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙなど、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．、１９巻：２４７１〜２４７６頁(１９９１年)、Ｂｒｏｗｎなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８巻：２６６３〜２６６７頁(１９９１年)、Ｊｕｎｇｈａｎｓなど、ＣａｎｅｒＲｅｓ．、５０巻：１４９５〜１５０２頁(１９９０年)、Ｆｅｎｄｌｙなど、ＣａｎｅｒＲｅｓ．、５０巻：１５５０〜１５５８頁(１９９０年)、およびＰＣＴ出願ＷＯ８９／０６６９２およびＷＯ９２／２２６５３に記載されている。場合によっては、齧歯類抗体からのＣＤＲをヒトのフレームワーク領域にあるヒトＣＤＲに置換することは高い抗原結合親和性の移動に十分（Ｊｏｎｅｓなど、Ｎａｔｕｒｅ、３２１巻：５２２〜５２５頁(１９８６年)、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎなど、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：１５３４〜１５３６頁（１９８８年））であるが、一方では他の場合にはさらに１個（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎなど、前出）または数個（Ｑｕｅｅｎなど、前出）のＦＲ残基を追加的に置換することが必要である。Ｃｏなど、前出、も参照。本発明はトランスジェニック動物の生産でのヒト抗体の使用も包含する。このシステムでは、目的抗体をコードするＤＮＡを分離し、動物宿主の生殖系に安定的に導入する。この抗体はその動物により生産され、その動物の血液または他の体液から収穫する。あるいは、所期抗体を発現する細胞系を動物宿主から分離して、試験管内で抗体を生産するために使用し、その抗体を標準法により細胞培養物から収穫する。本発明の方法での使用に殊に好適なものは、下記実施例に記載するヒト化抗ＩｇＥ抗体Ｅ２５（ｒｈｕＭＡｂＥ２５）である。ｒｈｕＭＡｂＥ２５の構築はＰｒｅｓｔａなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５１巻：２５２３〜２６３２頁（１９９３年）に開示されている。抗ＩｇＥ抗体断片も本発明の方法で使用できる。免疫細胞または遺伝子工学的に処理した細胞とのＩｇＥ相互作用を遮断または分裂することができる抗ＩｇＥ抗体の断片はいずれもここでの使用に適当である。この抗体断片は免疫細胞または遺伝子工学的に処理した細胞中でのヒスタミン放出を始動することができないことが好ましい。適当な抗ＩｇＥ抗体断片は組合せ可変ドメインライブラリーを所期抗体断片を発現することのできるＤＮＡについてスクリーニングして入手できる。抗体分子の抗原結合領域の組換えＤＮＡ版（Ｆ（ａｂ）断片と呼ばれる）を作成するためのこれら技術は、モノクローナル抗体の作成を回避するが、この発明の実施の範囲内に包含する。そこで抗体特異的メッセンジャーＲＮＡ分子を免疫した動物から得た免疫システム細胞から抽出し、これらを相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）中に転写し、そのｃＤＮＡを細菌発現系内にクローニングする。この発明の実施に適当なこのような技術の一例はスクリプス／ストラタジェンの研究者が開発し、所有するバクテリオファージラムダベクター系に導入するものである。このベクター系は発現したＦ（ａｂ）蛋白質の細胞質縁辺空隙（細菌の細胞膜と細胞壁との間）への移動を起こすか、分泌させるリーダー配列を含む。抗原に結合する機能的なＦ（ａｂ）断片を無数に迅速に発生させて、スクリーニングできる。このようなＩｇＥ結合分子（ＩｇＥ蛋白質について特異的なＦ（ａｂ）断片）もここに特定的に定義し、討論し、請求する用語「抗体」の中に包含する。本発明の別の態様では、可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体をＩｇＥ拮抗剤として使用できる。ここで使用するために適当な可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体はＦｃ_εＲＩα鎖の細胞外ドメイン（エキソドメイン）にＩｇＥ結合部位を含む分子を包含する。このＦｃ_εＲＩのα鎖は、Ｂｌａｎｋなど、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６６巻：２６３９〜２６４６頁（１９９１年）またはＱｕなど、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１６７巻：１１９５頁の方法に従って、エキソドメインを可溶性蛋白質として組換え発現システム中に分泌するように遺伝子的に修飾できる。前記したＩｇＥが誘導する免疫細胞の感化遮断薬剤の生物活性検定法に従えば、ＩｇＥ拮抗剤としての活性について可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体候補をスクリーニングできる。あるいは、ＩｇＥと前記遺伝子工学的処理細胞によるアレルギー診断法での遺伝子工学的に処理した細胞との間の相互作用をその可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体候補がブロックするように使用することによって、ＩｇＥ拮抗剤としての活性について可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体候補をスクリーニングできる。本発明は抗ＩｇＥ抗体および可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体に加えて、ＩｇＥ結合性ペプチドの使用も包含する。ＩｇＥとＦｃ_εＲＩ受容体との間の相互作用を分裂または遮断することのできるＩｇＥ結合性ペプチドはいずれもここでの使用に適当である。ＩｇＥ結合性ペプチド候補はＩｇＥ誘導免疫細胞の感化を遮断する薬剤の生物活性を検定する前記方法に従って、ＩｇＥ拮抗剤としての活性についてスクリーニングできる。その他にＩｇＥ結合性ペプチド候補は、前記遺伝子工学的に処理した細胞によるアレルギー診断法のいずれかによって、ＩｇＥと遺伝子工学的に処理した細胞との間の相互作用を遮断するためにそのＩｇＥ結合性ペプチド候補を使用すれば、ＩｇＥ拮抗剤としての活性についてスクリーニングできる。このＩｇＥ結合性ペプチドは免疫細胞または遺伝子工学的に処理した細胞中でヒスタミン放出を誘導できないものが好ましい。ＩｇＥ結合性ペプチド候補は前記アレルギー性疾患診断法のいずれかにおいて、感化免疫細胞（または感化した遺伝子工学的に処理した細胞）と、アレルゲンの代わりにそのペプチドとを混合すれば、検査できる。アレルゲンまたは単なる緩衝液と混合した感化細胞はそれぞれ陽性および陰性対照として役立つ。もしＩｇＥ結合性ペプチド候補がヒスタミン放出を誘導しなければ、すなわち陰性対照の水準よりも実質的に高くなければ、そのペプチドは本発明の方法での使用について許容される。たとえば、前記した抗ＩｇＥ抗体、その断片、可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体、その他の前記ＩｇＥ結合性ペプチドのようなＩｇＥに結合することによってＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩ受容体相互作用を妨害するＩｇＥ拮抗剤に加えて、本発明はＦｃ_εＲＩ受容体への結合についてＩｇＥと競合して、利用可能なＦｃ_εＲＩ受容体を減少させることによってＩｇＥ／Ｆｃ_εＲＩ受容体相互作用を分裂するＩｇＥ拮抗剤の使用を包含する。ＩｇＥ変異体は本発明の方法での使用に適当なＦｃ_εＲＩ受容体結合競合体の一例である。ＩｇＥ変異体は、たとえば単数または複数のアミノ酸置換および／または単数または複数のアミノ酸欠失のような変換を持ち、免疫細胞を感化するこの変換ＩｇＥ分子の性能が低下または除去されるもの、およびこの変換ＩｇＥ分子がＦｃ_εＲＩ受容体への結合についてＩｇＥと競合することができるもの、であるＩｇＥの形態である。ＩｇＥ変異体候補は、前記のＩｇＥ誘導の免疫細胞感化を遮断する薬剤の生物活性の検定法に従えば、ＩｇＥ拮抗剤としての活性についてスクリーニングできる。その他に、ＩｇＥ変異体候補は、前記遺伝子工学的に処理した細胞によるアレルギー診断法のいずれかで遺伝子工学的に処理した細胞とＩｇＥとの間の相互作用を遮断するためにそのＩｇＥ変異体候補を使用することによって、ＩｇＥ拮抗剤としての活性についてスクリーニングできる。ＩｇＥ変異体候補は免疫細胞感化活性または遺伝子工学的に処理した細胞感化活性の不在について、アレルゲンチャレンジに際してのＩｇＥ変異体感化細胞のヒスタミン放出とＩｇＥ感化細胞のヒスタミン放出とを比較すれば検査できる。もし、ＩｇＥ変異体候補を含む混合物中のヒスタミン放出の水準がＩｇＥを含む混合物中のヒスタミン放出の水準よりも実質的に低ければ、その変異体は本発明の方法における使用に適当である。ＩｇＥ変異体の断片も、ここでの使用に適する。Ｆｃ_εＲＩ受容体への結合についてＩｇＥと競合することのできるＩｇＥ変異体の断片は本発明の方法で使用できる。ＩｇＥ変異体断片候補は前記ＩｇＥ変異体候補についての方法に従えば所期の活性について検査できる。本発明はＩｇＥ変異体およびその断片に加えてＦｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチドの使用も包含する。ＩｇＥとＦｃ_εＲＩ受容体との間の相互作用を分裂または遮断することができるＦｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチドは、いずれもここでの使用に適当である。Ｆｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチド候補はＩｇＥ拮抗剤としての活性について、前記したＩｇＥ誘導免疫細胞感化を遮断する薬剤の生物活性検定法に従って、スクリーニングできる。その他に、Ｆｃ_εＲＩ結合性ペプチド候補は前記した遺伝子工学的に処理した細胞によるアレルギー診断法のいずれかにおいて、ＩｇＥと遺伝子工学的に処理した細胞との間の相互作用を遮断するためにＦｃ_εＲＩ結合性ペプチド候補を使用すればＩｇＥ拮抗剤としての活性についてスクリーニングできる。このＦｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチドは免疫細胞または遺伝子工学的に処理した細胞中でヒスタミン誘導できないのが好ましい。Ｆｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチド候補は免疫細胞感化活性（または遺伝子工学的に処理した細胞感化活性）の欠落について、ＩｇＥ変異体の免疫細胞（または遺伝子工学的に処理した細胞）感化活性の検査について前記したものと同じ方法によって、検査できる。本発明の実施はペプチドＩｇＥ拮抗剤の使用に限定されていない。ＩｇＥ拮抗剤として機能できるいかなる化合物も、非蛋白質性の低分子化合物も含めて、本発明の方法における使用について好適である。そのような化合物はＩｇＥ拮抗剤活性について、前記方法でＩｇＥ拮抗剤としてその化合物を使用することによって、検査できる。もしその化合物が感化された免疫細胞（または感化された遺伝子工学的に処理した細胞）中で薬理学的伝達物質単数または複数の放出を始動できなければ、またアレルゲン刺激に感応して薬理学的伝達物質単数または複数を放出せずに、ＩｇＥと免疫細胞（または遺伝子工学的に処理した細胞）上の高親和性受容体Ｆｃ_εＲＩとの間の相互作用を分裂または遮断することができれば、その化合物にはここに定義し、記載し、請求するＩｇＥ拮抗剤の一つとしての資格がある。本発明のさらなる詳細は下記実施例に見出すことができ、本発明の範囲をさらに定義する。ここに引用する文献はその全体について参考のために明示的に引用するものである。実施例実施例１１．材料および方法ａ．材料通常のハイブリドマ技術により製造したモノクローナル抗体をＣａｒｔｅｒなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻：４２８５〜４２８９頁（１９９２年）およびＰｒｅｓｔａなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５１巻：２６２３〜２６３２頁（１９９３年）によって記載のように、ヒト化し、分離した。これらには好塩基球上のＩｇＥに結合してヒスタミン放出を始動する（Ｐｒｅｓｔａなど）ネズミ抗ヒトＩｇＥＭＡｂ(ＭＡＥ１)、ヒト化抗ヒトＩｇＥＭＡｂ(ｒｈｕＭＡｂＥ２５)、ヒト化抗ＨＥＲ２ＭＡｂ（ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２）およびヒト化抗ＣＤ１８ＭＡｂ（ｒｈｕＭＡｂＣＤ１８）を包含する。ヒトＩｇＧＦｃ断片はＯｒｇａｎｏｎＴｅｋｎｉｋａ社、ＷｅｓｔＣｈｅｓｔｅｒ、ＰＡから購入した。ブタクサ抗原Ｅ−ＢおよびＥ−Ｃ（ロット番号Ａ−６０１ −９０３Ａ−１８５）はＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから入手した。チリダニアレルゲン（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅおよびＤ．ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ５０／５０ｍｉｘ、ロット６６９１ＵＭ）はＭｉｌｅｓ社、ＷｅｓｔＨａｖｅｎ、ＣＴからである。ブタクサ特異的ヒト血漿（ＲＳＨＰ）およびチリダニ特異的ヒト血漿（ＤＭＳＨＰ）はＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｍｉａｍｉ、ＦＬから入手した。ハンクの平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、ＩＸ）はＧｉｂｃｏＢＲＬ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄからである。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、第Ｖ画分）はＳｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏから入手した。ＣａＣｌ₂２Ｈ₂ ＯおよびＭｇＣｌ₂６Ｈ₂ＯはＢａｋｅｒＣｈｅｍｉｃａｌ社、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＮＪから入手した分析純級の試薬であった。ｂ．血液提供者検定用ヘパリン化全血は一群の非アレルギー性またはアレルギー性個体から入手した。この群は女子１７名（非妊婦）と男子２６名とから構成され、年齢２２から５１才の範囲で、平均３４±７才であった。ボランティアは全例が治療を受けておらず、事前告知を承認した。ｃ．ブタクサアレルゲン誘導ヒスタミン放出検定あらかじめスクリーニングした提供者からの全血（５ｍＬ）をヘパリン管（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）に採取し、４時間以内に検定に使用した。血液をＨＢＳＳ／１％ＢＳＡで１：７に希釈した。希釈血液９部をＲＳＨＰ１部に添加し、ｒｈｕＭＡｂＥ２５標準（最終濃度０.０１から２μｇ／ｍＬ）の存在下または不在下に加湿５％ＣＯ₂培養器中、３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーションの後、標本１００μＬを緩衝液（酵素免疫検定キットで提供されたＨＢＳＳ／１％ＢＳＡ）５０μＬ、ブタクサアレルゲン（ＰＢＳ／０.０１％ＢＳＡ中、０.３μｇ／ｍＬ）またはＭＡＥ１（ＰＢＳ／０.０１％ＢＳＡ中、３０μｇ／ｍＬ）を含む丸底９６ウェル非組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ３７９７）に移し、さらに３７℃で３０分間インキュベーションした。プレートを氷上に移してインキュベーションを停止した。プレートを９００×ｇで５分間遠心分離し、上清液を収穫してヒスタミンを測定した。各血液標本について、標本５０μＬを蒸留水９５０μＬと混合し、続いて凍結と解凍を１５分サイクルで２回行うことにより、細胞中の全ヒスタミンを測定した。標本を９００×ｇで５分間遠心分離し、上清液を集めた。上清液中のヒスタミン濃度を、製造元の指示書に従ってヒスタミン酵素免疫検定キット（ＡＭＡＣ社、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ）により、測定した。略述すれば、ヒスタミンをアシル化し、マイクロウェル上に被覆した抗体への結合についてヒスタミンアセチルコリンエステラーゼと競合させた。１８時間後、各ウェルを洗浄し、結合した酵素活性を発色団基質（ジチオニトロ安息香酸アセチルコリンエステル）の添加により測定した。４０５ｎｍでの発色強度を使用して標本中のヒスタミン濃度をキットに添付された標準で得た標準曲線によって計算した。算出したヒスタミン濃度を次に細胞中全ヒスタミンに対する百分率に換算した。ブタクサによるヒスタミン放出を分母としてｒｈｕＭＡｂＥ２５によるブタクサ誘導ヒスタミン放出の阻止百分率を計算した。様々なｒｈｕＭＡｂＥ２５製品の生物活性を標準希釈曲線から測定し、そこでブタクサ誘導ヒスタミン放出の阻止百分率を最小自乗非線形４母数適合度プログラムを使用してｒｈｕＭＡｂＥ２５濃度に対してプロットした。ｄ．２価カチオンの研究全血をＣａ²⁺およびＭｇ²⁺を含まないハンクの平衡塩緩衝液（ＨＢＳＳ^--）にＣａＣｌ₂２Ｈ₂Ｏ、ＭｇＣｌ₂６Ｈ₂Ｏ、またはＣａＣｌ₂２Ｈ₂ＯプラスＭｇＣｌ₂ ６Ｈ₂Ｏを最終濃度０、０.３２５、０.６２５、１.２５、２.５、５、および１０ｍＭで添加したもので１：７に希釈する以外は、前記段階ｃに記載したものと同じ方法でヒスタミン放出検定を実行した。１０％ＲＳＨＰで２時間感化した後、希釈血液をブタクサアレルゲン（０.１μｇ／ｍＬ）で３７℃で３０分間チャレンジした。上清液中のヒスタミン放出を測定し、細胞中全ヒスタミンに対する百分率に換算した。ｅ．酸化重水素（Ｄ₂Ｏ）の研究検定用血液提供者のスクリーニングにあたり、酸化重水素の効果を測定した。非アレルギー性提供者１７名からのヘパリン化全血を１０％ＲＳＨＰで前記検定の構成におけるように感化し、次にＰＢＳ／０.０１％ＢＳＡか、または酸化重水素（最終濃度３３.３％）かの中で調製したブタクサアレルゲンでチャレンジした。３０分間インキュベーション後の上清液中のヒスタミン放出を定量し、細胞中全ヒスタミンに対する百分率に換算した。ｆ．チリダニアレルゲン誘導ヒスタミン放出検定非アレルギー性提供者全血をハンクス緩衝液で１：７に希釈し、ｒｈｕＭＡｂＥ２５（１μｇ／ｍＬ）の存在下または不在下に、チリダニにアレルギー性個体から採取した血漿（最終濃度１０％）７個とともに個々に２時間プレインキュベーションし、次に前記段階ｃに記載した操作に従ってチリダニアレルゲンでチャレンジした。上清液中のヒスタミン濃度を定量した。２．結果ａ．ｒｈｕＭＡｂＥ２５のヒスタミン放出始動不能性最初の研究はｒｈｕＭＡｂＥ２５はＲＳＨＰ感化好塩基球に結合せず、抗原刺激不在下にはヒスタミン放出を始動しないことを確認するために実行した。提供者１２名からの全血標本を１０％ＲＳＨＰで前感化し、ブタクサアレルゲン０. １μｇ／ｍＬ、ＭＡＥ１（Ｐｒｅｓｔａなどが記載したように、好塩基球表面上のＩｇＥに結合でき、ヒスタミン放出を始動できるネズミＭＡｂ）１０μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５、またはＨＢＳＳ／１％ＢＳＡでチャレンジした。インキュベーションの後、上清液中のヒスタミン濃度を定量した。ブタクサアレルゲンとＭＡＥ１との両方はヒスタミン放出を起こした。しかしながら、ｒｈｕＭＡｂＥ２５は背景水準以上にはヒスタミン放出を誘導しなかった（図１）。ｂ．ＲＳＨＰによる好塩基球感化好塩基球を最高度に感化するために、ブタクサに対してアレルギー性であることが判明している個体から採取したヒト血漿標本７個をヒスタミン放出誘導性能についてスクリーニングした。ＲＳＨＰロット番号４２−３６５０５４（全ＩｇＥ１.６４μｇ／ｍＬ）はブタクサアレルゲンでチャレンジ後、常に最高のヒスタミン放出を示した（図２）。そこで、ＲＳＨＰ（ロット４２−３６５０５４）をその後の検定全てで好塩基球を感化するために使用した。図３に示すように、全血中の好塩基球のブタクサ特異的ＩｇＥを含む外因性ヒト血漿（ＲＳＨＰ）による前感化は、後続するブタクサアレルゲンによるチャレンジに際しての、ヒスタミン放出のための必要条件の一つであった。ＲＳＨＰ不在下には、背景水準のヒスタミンが検出されたが、一方ＲＳＨＰ存在下には用量依存性のヒスタミン放出が観察された。ｃ．提供者スクリーニング非アレルギー性ボランティアを検定で提供者として使用する前にプレスクリーニングした。スクリーニング実験計画はｒｈｕＭＡｂＥ２５（１０μｇ／ｍＬ）の存在下および不在下に提供者全血を１０％ＲＳＨＰで２時間３７℃で前感化すること、続いてブタクサアレルゲン（０.１μｇ／ｍＬ）でチャレンジすることを包含していた。細胞中全ヒスタミンの１０％以上を放出した好塩基球を持つ提供者を後の研究用に選択した。図４に示すように、ある提供者からの血球はブタクサでのチャレンジに際してヒスタミンを放出せず、逆に、他の提供者からの血球ではアレルゲンでのチャレンジなしにヒスタミンを放出することを見出した。ボランティア４３名中、１２名が本検定のこの態様における日常的使用に適切な「応答者」であった。ｄ．ヒスタミン放出の機序ＲＳＨＰ感化全血からのブタクサ誘導ヒスタミン放出は迅速で、インキュベーション２０〜３０分後にはプラトーに達する（図５）。これらの結果に基づき３７℃で３０分間のインキュベーションを検定の至適条件として確定した。もし、常温でインキュベーションすると、ヒスタミン放出は顕著に減少した。ｅ．特異性ＲＳＨＰ感化全血とｒｈｕＭＡｂＥ２５に対して相補性決定領域（ＣＤＲ）では異なるが全相同性は約９５％を示す他のヒト化モノクローナル抗体とのプレインキュベーションは次の表Ｉに示すようにブタクサアレルゲンにより起こされるヒスタミン放出には阻止効果を及ぼさなかった。これに加えて、ヒトＩｇＧＦｃ断片もブタクサ誘導ヒスタミン放出には阻止効果を示さなかった。ｆ．変動検定間変動を測定するため、提供者１２名からの血液を使用して全部で２３回の検定を行った。これらの検定からの結果を次の表ＩＩに表示する。０.１、０.５および１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５によるブタクサ誘導ヒスタミン放出阻止百分率の平均はそれぞれ２２．５％±７.８％、７８.３％±１３.３％、９３.９％±５.８％であった。０.５μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５によるヒスタミン放出阻止百分率から算出した検定間変動（％ＣＶ）は１７％（ｎ＝２３）であった。８週間の期間にわたる提供者内変動はさらに小さく、平均９.０５％（ｎ＝７）であった。ｇ．２価カチオンヒスタミン放出がインキュベーション培地中のＣａ²⁺によって影響されることはよく確立されている（ＬｉｃｈｅｎｓｔｅｉｎとＯｓｌｅｒ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１２０巻：５０７〜５３０頁(１９６４年)、ＨａｙｄｉｋとＭａ、Ｃｌｉｎ．Ｒｅｖ．Ａｌｌｅｒｇｙ、６巻：１４１〜１６２頁(１９８８年)、ＭａｃＧｌａｓｈａｎとＢｏｔａｎａ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５０巻：９８０〜９９１頁（１９９３年））。従って、前記検定法でのＣａ²⁺およびＭｇ²⁺の効果を測定した。全血をＣａ²⁺とＭｇ²⁺とが欠落したハンク平衡塩緩衝液（ＨＢＳＳ^-- ）で希釈した時、Ｃａ²⁺とＭｇ²⁺とを含有するハンク平衡塩緩衝液での希釈と比べてヒスタミン放出能にかなりの減少があった（図６）。ＣａＣｌ₂２Ｈ₂ＯおよびＭｇＣｌ₂６Ｈ₂Ｏを等濃度でＨＢＳＳ^--に添加すると、ヒスタミン放出が再生した。ＭｇＣｌ₂６Ｈ₂Ｏのみを添加すると放出は部分的に再生したが、ＣａＣｌ₂２Ｈ₂Ｏの添加ではヒスタミン放出能は完全に再生された（図７）。ｈ．遮断抗体とのプレインキュベーションによるヒスタミン放出の阻止ブタクサ特異的血清を０.５または１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５とともにプレインキュベーションすると、後続するブタクサチャレンジによる刺激でのヒスタミン放出をかなり阻止した（図５）。ｒｈｕＭＡｂＥ２５濃度に対してブタクサ誘導ヒスタミン放出阻止百分率をプロットするとｒｈｕＭＡｂＥ２５の阻止効果は最も良く示される。典型的ｒｈｕＭＡｂＥ２５標準曲線を図８に示す。ブタクサ誘導ヒスタミン放出の阻止は用量依存的であり、１μｇ／ｍＬ以上のｒｈｕＭＡｂＥ２５によりしばしば到達される。ｒｈｕＭＡｂＥ２５について至適検定範囲は約０.１から約１μｇ／ｍＬまでで、平均ＩＣ₅₀は０.２５５±０.０７９μｇ／ｍＬ（ｎ＝１５）であった。この検定の構成を修正すれば、容易に他種アレルゲンが起こすヒスタミン放出遮断に及ぼすｒｈｕＭＡｂＥ２５の効果を決定できる。一例を図９に示す。非アレルギー性提供者の全血をｒｈｕＭＡｂＥ２５（１μｇ／ｍＬ）の存在下または不在下にチリダニにアレルギー性の個体からの１０％血漿で２時間３７℃で個別に感化した。次に、血球をチリダニアレルゲン（１００ｎｇ／ｍＬ）を添加してさらに３０分間チャレンジした。上清液中のヒスタミン放出を測定した。患者Ｂ、Ｃ、Ｆ、およびＧではチリダニ誘導ヒスタミン放出は１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５で阻止されることが観察された。患者Ａ、ＤおよびＥではチリダニアレルゲンでのチャレンジ後のヒスタミン放出には背景以上の顕著な上昇はなかった。もし１０％ではなく、５０％のチリダニ特異的ヒト血漿を使用して好塩基球を感化したなら、チリダニ誘導ヒスタミン放出を完全な遮断には高濃度のｒｈｕＭＡｂＥ２５が必要であった。そこで、この検定の構成はあるアレルゲンに対して特異的なＩｇＥの存在ならびに抗ＩｇＥ抗体がアレルゲンが起こす反応を遮断する性能の両方を証明するために有用である。ｉ．酸化重水素の研究酸化重水素が白血球からのヒスタミン放出を強化するとの報告がある（ＧｉｌｌｅｓｐｉｅとＬｉｃｈｔｅｎｓｔｅｉｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、５１巻：２９４１〜２９４７頁（１９７２年））。それ故、ブタクサ誘導ヒスタミン放出における酸化重水素の効果を決定した。Ｄ₂Ｏ単独ではヒスタミン放出を始動しなかった。次の表ＩＩＩに示すように、インキュベーション媒体にＤ₂Ｏを添加（最終濃度３３％）すると、ブタクサ誘導ヒスタミン放出を顕著に強化する。無作為に選択した非アレルギー性提供者１７名の中で、提供者１５名（８８％）はこの検定の構成ではブタクサアレルゲンによるチャレンジに際して血球中全ヒスタミンの２０％より大きいヒスタミン放出を示した。ヒスタミン放出の増加は平均６.３倍ほどであった。実施例２１．材料および方法ａ．材料通常のハイブリドーマ技術により生産したモノクローナル抗体をＣａｒｔｅｒなど、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、８９巻：４２８５〜４２８９頁（１９９２年）およびＰｒｅｓｔａなど、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５巻：２６２３〜２６３２頁（１９９３年）に記載のようにヒト化して、分離した。これらにはヒト化抗ヒトＩｇＥＭＡｂ（ｒｈｕＭＡｂＥ２５）(Ｐｒｅｓｔａなどは「変異体１２」として記載している)、ヒト化抗ＨＥＲ２ＭＡｂ（ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２)、ヒト化抗ＣＤ１８ＭＡｂ(ｒｈｕＭＡｂＣＤ１８)、およびヒト化抗ＩＣＡＭＭＡｂ（ｒｈｕＭＡｂＩＣＡＭ）を包含する。ヤギ抗ヒトＩｇＥ（ε）ＨＲＰ複合体はＫｉｒｋｅｇａａｒｄ＆ＰｅｒｒｙＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤから購入した。組換えヒト神経生長因子 (ｒｈｕＮＧＦ)、腫瘍壊死因子(ｒｈｕＴＮＦ)、およびガンマ−インターフェロン（ｒｈｕＩＦＮ−ガンマ）はＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社（ＳｏｕｔｈＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）が生成し、クローニングし、配列決定をした。ブタクサ抗原Ｅ−ＢおよびＥ−Ｃ（ロットＡ−６０１−９０３Ａ−１８５）はＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＨｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤから入手した。標準化ダニアレルゲン（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ）（カタログ＃６７２０ＵＰ、ロット＃Ｅ５３Ｌ３５３３）およびハウスダスト混合アレルゲン（カタログ＃４７０１ＥＤ、ロット＃Ｃ６３Ｊ８３０８）はＭｉｌｅｓ社、Ｅｌｋｈａｒｔ、ＩＮから購入した。標準化ネコ毛皮アレルゲン（ロット＃３Ｅ００２０２）およびＡｌｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｕｉｓ（ロット＃３Ｊ１７２４２）アルレルゲンはＣｅｎｔｅｒＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ＰｏｒｔＷａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹから入手した。ヒト血漿はＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｍｉａｍｉ、ＦＬから入手した。ハンク平衡塩溶液（ＨＢＳＳ、１Ｘ）およびグルタミンはＧｉｂｃｏＢＲＬ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）から購入した。ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ、第Ｖ画分)、ｏ−フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）基質およびトリトンＸ−１００はＳｉｇｍａ社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから購入した。ウシ胎児血清はＨｙｃｌｏｎｅ社、Ｌｏｇａｎ、ユタから購入した。酸化重水素（Ｄ₂Ｏ、純度９９.９９６％）はＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍ．社、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩから入手した。ｂ．血液提供者ヘパリン化全血を一群の健康な非アレルギー性またはアレルギー性個体から採集し、ヒト好塩基球ヒスタミン検定（ＨＢＨＡ）のために使用する前にプレスクリーニングした。スクリーニングのプロトコールは提供者全血をｒｈｕＭＡｂＥ２５（１０μｇ／ｍＬ）の存在下または不在下に１０％ＲＳＨＰによる３７℃で２時間の前感化とそれに続くブタクサアルレルゲン（０.１μｇ／ｍＬ）によるチャレンジを包含していた。血球中全ヒスタミンの１０％以上を放出した好塩基球を持つ提供者をその後の研究用に選択した。これらボランティアは治療を受けておらず、全例が事前告知を承認した。ｃ．ヒト好塩基球ヒスタミン検定（ＨＢＨＡ）ヘパリン化全血をＨＢＳＳ／１％ＢＳＡで１／７に希釈し、１０％（ｖ／ｖ）アレルゲン感化ヒト血漿（たとえば、ブタクサ特異的ヒト血漿（ＲＳＨＰ））と混合した。混合物をｒｈｕＭＡｂＥ２５（ＰＢＳ／０.０１％ＢＳＡ中で製造）の存在下または不在下に加湿５％ＣＯ₂培養器中、３７℃で２時間インキュベーションした。インキュベーション後、標本を緩衝液（ＨＢＳＳ／１％ＢＳＡまたは５０％Ｄ₂Ｏ／０.８％ＮａＣｌ／１.３ｍＭ−ＣａＣｌ₂）またはアレルゲン（ＰＢＳ／０.０１％ＢＳＡまたは５０％Ｄ₂Ｏ／０.８％ＮａＣｌ／１.３ｍＭ−ＣａＣｌ₂中、０.３μｇ／ｍＬ）を含む９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃３７９７）に移動し、さらに３７℃で３０分間インキュベーションした。プレートを４℃で５分間９００×ｇで遠心分離し、上清液を収穫し、ヒスタミン測定をした。各血液標本について、全血５０μＬを蒸留水９５０μＬと混合し、続いて凍結と解凍を１５分間サイクルで行うことによって、血球中全ヒスタミンを測定した。上清液中のヒスタミン濃度をヒスタミン酵素免疫検定キット（ＡＭＡＣ社、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ、ＭＥ）で測定した。ｄ．細胞培養ＲＢＬ４８ラット肥満細胞系はＧｉｌｆｉｌｌａｎなど、前出、によって記載されたようにして入手した。ＲＢＬ４８細胞系はラット親肥満細胞系ＲＢＬ２Ｈ３をヒト高親和性ＩｇＥ受容体Ｆｃ_εＲＩのα−サブユニットで形質転換して誘導した（Ｇｉｌｆｉｌｌａｎなど）。細胞を加湿５％ＣＯ₂孵卵器中、３７℃でＴ１７５組織培養フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ＃３０２８）に入れたｓＩＭＤＭ（１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ−グルタミン、および活性ゲネチシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１１８１１−０３１）５００μｇ／ｍＬ添加Ｉｓｃｏｖｅ修正ダルベッコ培地）中で増殖させた。細胞をＰＢＳ４ｍＬ／０.０５％トリプシン／０.５３ｍＭ−ＥＤＴＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ＃１５４００−０１３）に３７℃で２分間接触し、その後、遠心分離（４００×ｇ、１０分間）し、新鮮なｓＩＭＤＭ中に再懸濁して収穫した。全面生長が達成された後、細胞を１：５比で至適に分離した。ｅ．ヒト血漿ＩｇＥ結合ＥＬＩＳＡ検定ウェル当り４００００細胞で接種したＲＢＬ４８細胞を加湿培養器中で、一夜３７℃／５％ＣＯ₂で培養した。プレート洗浄器でＰＢＳ／０.０５％トゥイーン２０で３回洗浄後、細胞を常温でウェル当り無水アルコール２００μＬで２分間固定し、続いて残留アルコール除去のため６回洗浄した。ｒｈｕＭＡｂＥ２５（最終濃度１０μｇ／ｍＬ）存在下または不在下に１０％ＲＳＨＰを含むｓＩＭＤＭを細胞と３７℃で１時間インキュベーションした。インキュベーション後、細胞をＰＢＳ／０.０５％トゥイーン２０で６回洗浄した。捕捉したＩｇＥを次にヤギ抗ヒトＩｇＥＨＲＰと３７℃で３０分間反応し、続いて常温で３０分間ＯＰＤ基質とともにインキュベーションした。６Ｎ−Ｈ₂ＳＯ₄１００μＬ／ウェルの添加によって反応を停止した。４９２ｎｍでの吸光度を測定した。ｆ．ラット肥満細胞ヒスタミン検定（ＲＭＣＨＡ）ＲＢＬ４８細胞を全面生長まで増殖させ、次に前記ｄに記載したようにトリプシン処理した。懸濁液中の細胞をヘマサイトメーター（ｈｅｍａｃｙｔｏｍｅｔｅｒ、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ−Ｊｕｎｇ社、Ｂｕｆｆａｌｏ、ＮＹ）で計数し、密度を０.４×１０⁶細胞／ｍＬに調整した。細胞を次に９６ウェルＵ字型プレート（Ｌｉｎｂｒｏ＃７６−０４２−０５）中に１００μＬ／ウェル（ウェル当り４００００細胞）で接種し、加湿５％ＣＯ₂培養器中３７℃で２４時間培養した。ｓＩＭＤＭ２００μＬ／ウェルで１回洗浄後、細胞をヘパリンナトリウム（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ＃３６７６７３）３Ｕ／ｍＬおよび１０％（ｖ／ｖ）アレルゲン特異的ＩｇＥ含有アレルゲン感化ヒト血漿を包含する新鮮ｓＩＭＤＭ１００μＬ／ウェルとともに、ｒｈｕＭＡｂＥ２５標準の存在（最終濃度範囲０ .０７８から１０μｇ／ｍＬ）または不在下に、３７℃で２時間プレインキュベーションした。インキュベーション後、ウェル中の培養培地を吸引して除去し、接着細胞をｓＩＭＤＭで３回洗浄した。細胞を次にヒスタミン放出緩衝液（ＨＲＢ）（５０％Ｄ₂Ｏ／０.８％ＮａＣｌ／１.３ｍＭ−ＣａＣｌ₂／ｓＩＭＤＭ）１００μＬ／ウェル、アレルゲン(ＨＲＢ中、０.１μｇ／ｍＬ)、または０.５％トリトン溶液（全ヒスタミン放出用）とともに３７℃で３０分間インキュベーションした。プレートを４℃で５分間、９００×ｇで遠心分離し、上清液を収穫し、全ヒスタミン放出用にはＰＢＳで１０００倍に希釈し、アレルゲン誘導ヒスタミン放出用には８０倍に希釈した。上清液中のヒスタミン濃度は前記ｃにＨＢＨＡ検定について記載したようにして測定した。ｇ．ＲＭＣＨＡとＨＢＨＡとの相関性研究ｒｈｕＭＡｂＥ２５標本１５個（−７０℃、２〜８℃、２５℃、および４０℃ で１から１８ケ月貯蔵）をＨＢＨＡおよびＲＭＣＨＡの両方でブタクサ誘導ヒスタミン放出阻止能について並行検査した。濃度２段階（ＲＭＣＨＡには０.６２５および１.２５μｇ／ｍＬ、ＨＢＨＡには０.２５および０.５μｇ／ｍＬ）の各標本を前記ｃおよびｆに記載した検定に使用した。標本の蛋白質濃度はｒｈｕＭＡｂＥ２５標準曲線から決定した。標本の回収濃度（希釈率係数で補正後）を算出した。別の研究で、ダニ(Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ)、ハウスダスト混合物、ブタクサ、ネコ毛皮、およびＡｌｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｕｉｓを包含するアレルゲン５種のパネル（５０％グリセリン中で調製）を使用してヒト血漿８種のパネル（ＮｏｒｔｈＡｍｅｒｉｃａｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ社、Ｍｉａｍｉ、ＦＬからのアレルギー性個体の血漿７種およびＧｅｎｅｎｔｅｃｈ社、ＳｏｕｔｈＳ．Ｆ．、ＣＡからの貯蔵血漿標本１種）をＲＭＣＨＡおよびＨＢＨＡの両方でスクリーニングした。ＲＢＬ４８ラット肥満細胞およびナイーブ提供者血液好塩基球を最初にｒｈｕＭＡｂＥ２５（１μｇ／ｍＬ、ＲＭＣＨＡにはｓＩＭＤＭ／ヘパリンナトリウム３Ｕ／ｍＬで、およびＨＢＨＡにはＰＢＳ／０.０１％ＢＳＡ中で調製）の存在下または不在下に１０％（ｖ／ｖ）ヒト血漿で２時間３７℃で感化し、次に緩衝液（ＨＢＨＡ用には３３％Ｄ₂Ｏ／０.８％ＮａＣｌ／１.３ｍＭ−ＣａＣｌ₂、ＲＭＣＨＡには３３％Ｄ₂Ｏ／０.８％ＮａＣｌ／１.３ｍＭ−ＣａＣｌ₂ ／ｓＩＭＤＭ）または３３％Ｄ₂Ｏ含有緩衝液中アレルゲン（３３３.３ＡＵ／ｍＬ＝３３.３３ＢＡＵ／ｍＬ＝１００ＰＮＵ／ｍＬ＝１μｇ／ｍＬと仮定して最終濃度０.１μｇ／ｍＬ）の単回投与でチャレンジした。上清液中のヒスタミン濃度を前記のように測定した。ｈ．データ分析ヒスタミン濃度はヒスタミン標準曲線から「Ｒｅａｄ」コンピュータープログラムを使用して決定した。阻止百分率はＭｉｃｒｏＳｏｆｔＥｘｅｌ４.０プログラムにより算出した。グラフはＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ３.０プログラムを使用して描出した。統計はＳｔａｔＶｉｅｗ４.０プログラムで分析した。２．結果ａ．ＩｇＥのＲＢＬ４８細胞への結合ＩｇＥのＲＢＬ４８細胞への結合はアルコール固定ＲＢＬ４８単層を使用してＲＳＨＰ中のヒトＩｇＥ（全ＩｇＥは１.６４μｇ／ｍＬで測定）がＲＢＬ４８細胞表面に発現したＦｃ_εＲＩ受容体のα−サブユニットに結合できるかどうか決定するためにＩｇＥ結合ＥＬＩＳＡによって評価した。図１０はＲＳＨＰに存在するＩｇＥが実際にＲＢＬ４８細胞のＦｃ_εＲＩ受容体に結合することを証明する。これに加え、遮断抗ＩｇＥモノクローナル抗体、ｒｈｕＭＡｂＥ２５、の添加がこの結合を完全に破壊するので、この結合はＩｇＥに特異的である。ｂ．ＲＭＣＨＡの特異性ＲＭＣＨＡを行って(表ＩＶ)、ｒｈｕＭＡｂＥ２５が、たとえば抗ＨＥＲ２、抗ＣＤ１８、および抗ＩＣＡＭのような、他の組換えヒトモノクローナル抗体および、たとえばＩＦＮ−γ、ＴＮＦ、およびＮＧＦのような、組換えヒトサイトカインと同様に、単独でＲＢＬ４８細胞に適用した時には、肥満細胞に脱顆粒反応を誘導しないことを証明した。ＲＢＬ４８細胞を４００００細胞／ウェルで接種し、５％ＣＯ₂培養器中、３７℃で一夜培養した。細胞をｓＩＭＤＭ／５０％Ｄ₂Ｏ、ｒｈｕＭＡｂＥ２５(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＭＡｂＣＤ１８(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＭＡｂＩＣＡＭ(１０ μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＩＦＮ−γ(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＴＮＦ(１０μｇ／ｍＬ)、またはｒｈｕＮＧＦ（１０μｇ／ｍＬ）とともに１０％（ｖ／ｖ）ＲＳＨＰの存在下に３７℃で２時間プレインキュベーションした。ｓＩＭＤＭで３回洗浄した後、細胞を５０％Ｄ₂Ｏの存在下にブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬで３０分間３７℃でチャレンジした。これに加え、ＲＳＨＰ感化細胞を直接にｒｈｕＭＡｂＥ２５(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＭＡｂＨＥＲ２(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＭＡｂＣＤ１８(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＭＡｂＩＣＡＭ(１０μｇ／ｍＬ) 、ｒｈｕＩＮＦ−γ(１０μｇ／ｍＬ)、ｒｈｕＴＮＦ(１０μｇ／ｍＬ)、またはｒｈｕＮＧＦ（１０μｇ／ｍＬ）単独で３７℃で３０分間チャレンジした。下記表ＩＶに示す値はそれぞれ測定３回の平均を代表する。標本を前記抗体およびサイトカイン１０μｇ／ｍＬとともにプレインキュベーションした時には、ヒスタミン放出は観察されなかった。その上、ブタクサ特異的ヒト血漿を１０μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５とともにプレインキュベーションすると５０％Ｄ₂Ｏ存在下のブタクサ０.１μｇ／ｍＬ誘導ヒスタミン放出を完全に破壊した。ｃ．温度およびカルシウムの効果ＲＭＣＨＡでは、ブタクサにより誘導されるヒスタミン放出はブタクサ濃度、温度およびカルシウムイオンに依存性である（図１１）。ブタクサチャレンジ段階を５０％Ｄ₂Ｏの存在下または不在下に３７℃でインキュベーションした時には、約０.１μｇ／ｍＬで極大放出に達する鐘型用量依存性ヒスタミン放出曲線が観察された。ブタクサによって起きるヒスタミン放出は、もしも２.５ｍＭ− ＥＤＴＡの存在下または常温でインキュベーションすれば、減弱または破壊された。ｄ．ヒスタミン放出の時間的経過図１２に示すデータは３７℃でのブタクサ誘導ヒスタミン放出は時間依存性であって、インキュベーション３０分間で極大に達することを証明する。インキュベーション時間を４５分間または６０分間まで延長すると、上清液中のヒスタミン濃度は細胞中全ヒスタミンの３６％から１６％までに鋭く低下した。これに加えて、ブタクサ特異的血漿を０.５または１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５とともにプレインキュベーションすると、ブタクサアレルゲンによるヒスタミン放出が阻止された。ｒｈｕＭＡｂＥ２５の生物学的活性を定量するための典型的な標準曲線を図１３に示す。ｒｈｕＭＡｂＥ２５によるブタクサ誘導ヒスタミン放出阻止はＩＣ₅₀平均１.１９±０.３１μｇ／ｍＬ（ｎ＝２５）である。ｅ．ＲＭＣＨＡとＨＢＨＡとの相関ｒｈｕＭＡｂＥ２５標本１５個の活性を評価すると、ＲＭＣＨＡとＨＢＨＡとの間には相関係数０.９３（ｎ＝５９、ｐ＜０.０００１）と、良い相関が証明された（図１４）。これに加えて、ｒｈｕＭＡｂＥ２５の存在または不在下のヒト血漿８種おのおのからのＩｇＥで前感化したナイーブ提供者血液好塩基球およびＲＢＬ４８肥満細胞の双方をチャレンジするためにアレルゲン５種のパネルを使用した。ＲＭＣＨＡ用の各血漿標本４種の代表的な棒グラフを図１５に示す。細胞を血漿標本１（Ｐ１）で感化した時、ダニ（Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ）およびブタクサアレルゲンが起こすヒスタミン放出のみが明確にベースライン（３３％Ｄ₂Ｏ／０.８％ＮａＣｌ／１.３ｍＭ−ＣａＣｌ₂／ｓＩＭＤＭ（ＨＲＢ））より高いヒスタミン放出を起こした。しかしながら、ダニ(Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ)、ハウスダスト、ブタクサ、ネコ毛皮、およびＡｌｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｕｉｓアレルゲンで誘導された時には第二の血漿標本（Ｐ２）とのプレインキュベーションは明確なヒスタミン放出を起こした。同様に、第三の血漿標本（Ｐ３）はダニ(Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ)、ハウスダスト、ブタクサ、およびネコ毛皮で誘導した時は、明確なヒスタミン放出を起こした。これと対照的に、細胞を第四の血漿標本（Ｐ４）でプレインキュベーションした時は、これらアレルゲン５種はどれも明確なヒスタミン放出を刺激しなかった。これら全ての場合、このアレルゲン誘導ヒスタミン放出は１μｇ／ｍＬのｒｈｕＭＡｂＥ２５で遮断できた。血漿標本全８種について行った血液および細胞検定から得られたヒスタミン放出データを単純回帰統計学によって分析した。下記表Ｖはハウスダストアレルゲン(ｒ＝０.８４、ｐ＝０.００１３、Ｎ＝１１)、ブタクサアレルゲン(ｒ＝０.８６、ｐ＝０.０１３３、Ｎ＝７)、ネコ毛皮アレルゲン(ｒ＝０.６７、ｐ＝０.０１６５、Ｎ＝１２)、および全アレルゲン（ｒ＝０.６９、ｐ＝０.０００１、Ｎ＝３７）での検定２種の相関を示す。ｆ．酸化重水素（Ｄ₂Ｏ）の効果もしあるなら、ＨＢＨＡシステムにおける３３％Ｄ₂Ｏの効果を研究するために、３３％Ｄ₂Ｏの存在下または不在下のブタクサ誘導ヒスタミン放出の比較研究を行った。無作為に選択した健康な提供者計２７名を研究に採用した。提供者のヘパリン化全血を１０％ＲＳＨＰで２時間３７℃で前感化した後、ブタクサアレルゲン０.１μｇ／ｍＬ（最終濃度）でさらに３０分間３３％Ｄ₂Ｏの存在下または不在下にチャレンジした。上清液に放出されたヒスタミン濃度を細胞中全ヒスタミンに対する百分率に換算した。回帰分析はブタクサ誘導ヒスタミン放出とブタクサ／３３％Ｄ₂Ｏ誘導ヒスタミン放出との間に線形の相関（ｒ＝０.８０、勾配＝１.０４、ｐ＝０.０００１）を示した（図１６）。データは３３％Ｄ₂Ｏ存在下でのヒスタミン放出強化の特性はＤ₂Ｏ不在下のブタクサチャレンジに比例し、同等であることを示す。ＲＭＣＨＡに及ぼすＤ₂Ｏの効果も検討した。Ｄ₂ＯはＲＢＬ４８細胞中のヒスタミン放出を用量依存的な様式で強化し、５０％Ｄ₂Ｏで最大放出に至ることが判明した（図１７）。しかしながら、Ｄ₂Ｏはそれ自体ではヒスタミン放出を刺激せず、また、ＲＢＬ４８細胞によるヒスタミン放出を阻止するｒｈｕＭＡｂＥ２５を妨害することもない。これらの検定で使用する試薬のｐＨに及ぼすＤ₂Ｏの効果を研究して、Ｄ₂Ｏに起因するヒスタミン放出強化がｐＨの変化によるものではないことを決定した。ＨＢＨＡで使用した種々の試薬（ＨＢＳＳ、ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ、ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ＋血液＋１０％ＲＳＨＰ、ＨＢＳＳ＋１％ＢＳＡ＋血液＋１０％ＲＳＨＰ＋３３％Ｄ₂Ｏ、血液、および１００％ＲＳＨＰ）およびＲＭＣＨＡで使用した種々の試薬（ｓＩＭＤＭ、ｓＩＭＤＭ＋ヘパリンナトリウム３Ｕ／ｍＬ、およびｓＩＭＤＭ＋３３％Ｄ₂Ｏ）（２ｍＬ）のｐＨを常温または３７℃で１時間インキュベーション後に分析した。下記表ＶＩに示す各ｐＨ値は測定各３回の平均値を示す。予期通り、試薬のｐＨは常温と比較して３７℃ではｐＨ７.２０± ０.０１から７.３４±０.０１へと僅かに酸性になった。３３％Ｄ₂Ｏは血液試薬（３７℃で）の僅かなアルカリ性化を起こしたが、全血のｐＨ（ｐＨ７.３５± ０.０１）またはＲＭＣＨＡ試薬のｐＨには有意な変化を起こさなかった。３．討論ヒトＦｃ_εＲＩ受容体のαサブユュニットを形質転換したラットの肥満細胞系（ＲＢＬ４８）を使用してアレルゲン誘導ヒスタミン放出およびｒｈｕＭＡｂＥ２５活性を定量する生物検定法を開発した。この検定ではこれら細胞表面に発現したＦｃ_εＲＩ受容体に結合するアレルゲン特異的ＩｇＥを含むヒト血漿でＲＢＬ４８細胞を感化した（図１０）。それに続くブタクサアレルゲンによるチャレンジはヒスタミン放出を起こし（図１１）、これは抗ＩｇＥモノクローナル抗体（ｒｈｕＭＡｂＥ２５）により用量依存的様式で阻止された（図１３）。ｒｈｕＭＡｂＥ２５は、いずれのアレルゲン誘導ヒスタミン放出をも阻止できるので、この検定の構成はアレルゲン全てに適用できる。この検定を修正してアレルゲンのパネルを使用すれば、ヒト血漿をスクリーニングしてＩｇＥ媒介アレルギー性疾患の症状診断ができる（図１５）。ＲＭＣＨＡ開発のために、ヒスタミン放出に及ぼすＤ₂Ｏの効果を注意深く研究した。図１７に示すように、ＲＢＬ４８細胞を高濃度（１００％まで）Ｄ₂Ｏでチャレンジしてもヒスタミン放出は観察されなかった。図１６のデータはブタクサとブタクサ／３３％Ｄ₂Ｏとで誘導されるヒスタミン放出の間に統計学的にかなり有意な相関関係（ｒ＝０.８０、ｎ＝２７、ｐ＝０.０００１）が証明されて、Ｄ₂Ｏが血液の好塩基球中に比例的なヒスタミン放出を促進することが示された。３３％Ｄ₂Ｏの存在はＨＢＨＡ試薬もＲＭＣＨＡ試薬もいずれも生理学的ｐＨには顕著な効果を及ぼさないと思われる（表ＶＩ）。ＲＭＣＨＡの構成はｒｈｕＭＡｂＥ２５またはその他のＩｇＥ拮抗剤が種々のアレルゲンが誘導するヒスタミン放出を阻止する効果を測定するために図１５に示すように容易に修正しうる。ベースライン（ＨＲＢ）より高いヒスタミン放出は血漿中のアレルゲン特異的ＩｇＥの存在の指標である。ここで得られたデータは、アレルゲン２種がベースラインより有意に高いヒスタミン放出を剌激するので、血漿標本１（Ｐ１）はダニ(Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ)、およびブタクサに特異的なＩｇＥを含むことを指摘する。同様に、血漿標本２（Ｐ２）はダニ(Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ)、ハウスダスト混合物、ブタクサ、ネコ毛皮、およびＡｌｔｅｒｎａｒｉａｔｅｎｕｉｓに特異的なＩｇＥを含み、血漿標本３（Ｐ３）はダニ(Ｄ．ｆａｒｉｎａｅ)、ハウスダスト混合物、ブタクサ、およびネコ毛皮に特異的なＩｇＥを含み、血漿標本４（Ｐ４）はこれらアレルゲン５種のいずれにも特異的なＩｇＥを含まないことを示す。同様なヒスタミン放出プロファイルはＨＢＨＡでの血液好塩基球をチャレンジするためにこれらアレルゲンを使用した時にも得られた。ヒト化抗ＩｇＥモノクローナル抗体１５種の生物学的活性を評価するについて(図１４)、および種々のアレルゲンにより誘導されるヒスタミン放出について（表ＶＩ）ＲＭＣＨＡはＨＢＨＡと良く相関するので、これをＩｇＥ媒介アレルギー診断に新しい手段として使用できる。数々の研究がＩｇＥ水準はアレルギー性疾患に相関することを明確に立証しているので(Ｂａｈｎａ、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ、６２巻：４７１〜４７５頁(１９８９年)、Ｍａｓｃｉａなど、Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ、６２巻：３１１〜３１８頁（１９８９年）、Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ、Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．、１４５巻：Ｓ４４〜Ｓ４７頁（１９９２年）)、このＲＭＣＨＡはＩｇＥ媒介経路を研究し、開発するため、ならびにＩｇＥのＦｃ_εＲＩへの結合の遮断を指向する免疫治療法の効果推測を予想するため、に使用できる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ジャルデュー、ポーラアメリカ合衆国カリフォルニア94708、バークレイ、ヒルデイル・アベニュー854番

Claims

【特許請求の範囲】１．患者におけるアレルギー性疾患の診断法であって、（ａ）放出混合物中への薬理学的伝達物質放出を遮断放出混合物中への薬理学的伝達物質放出と比較すること、ただしここに、放出混合物および遮断放出混合物はおのおのナイーブ提供者からの単一組織標本の一部を含み、およびここに、放出混合物および遮断放出混合物はおのおのさらに、血液標本中の目的アレルゲンに特異的なＩｇＥの存在または不在が未知な、患者からの単一血液標本の一部を含み、およびここに、遮断放出混合物はさらにＩｇＥ拮抗剤を含み、およびここに、放出混合物および遮断放出混合物双方をアレルゲンと混合するものとする、（ｂ）段階（ａ）での比較に基づいて、その血清標本中にそのアレルゲンに特異的なＩｇＥの存在または不在を決定することを含む診断法。２．薬理学的伝達物質がヒスタミンである請求項１の方法。３．組織標本が血液標本である請求項１の方法。４．ＩｇＥ拮抗剤が抗ＩｇＥ抗体またはその断片である請求項１の方法。５．抗ＩｇＥ抗体がモノクローナル抗ＩｇＥ抗体である請求項４の方法。６．モノクローナル抗ＩｇＥ抗体がｒｈｕＭＡｂＥ２５である請求項５の方法。７．ＩｇＥ拮抗剤がＩｇＥ変異体またはその断片である請求項１の方法。８．ＩｇＥ拮抗剤が可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体である請求項１の方法。９．ＩｇＥ拮抗剤がＩｇＥ結合性ペプチドまたはＦｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチドである請求項１の方法。１０．遮断放出混合物中の組織標本を最初にＩｇＥ拮抗剤と混合し、次に患者からの血清標本と混合する請求項１の方法。１１．遮断放出混合物中の血清標本を最初にＩｇＥ拮抗剤と混合し、次に組織標本と混合する請求項１の方法。１２．好塩基球のＩｇＥ誘導感化を遮断する薬剤の生物活性検定法であって、（ａ）放出混合物中への薬理学的伝達物質放出を遮断放出混合物中への薬理学的伝達物質放出と比較すること、ただしここに、放出混合物および遮断放出混合物はおのおのナイーブ提供者から得た単一全血標本の一部を含み、およびここに、放出混合物および遮断放出混合物はおのおのさらにアレルゲンに特異的なＩｇＥを含む単一血清標本の一部を含み、およびここに、遮断放出混合物はさらに薬剤を含み、およびここに、放出混合物および遮断放出混合物双方をアレルゲンと混合するものとする、（ｂ）段階（ａ）での比較に基づいて、好塩基球のＩｇＥ誘導感化を遮断する薬剤の生物活性を決定することを含む薬剤の生物活性検定法。１３．薬剤が抗アレルギー性治療剤候補である請求項１２の方法。１４．抗アレルギー性治療剤候補が抗ＩｇＥ抗体またはその断片、ＩｇＥ変異体またはその断片、可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体、ＩｇＥ結合性ペプチドおよびＦｃ_ε ＲＩ受容体結合性ペプチドから構成される群から選択される請求項１３の方法。１５．薬剤がＩｇＥ拮抗剤候補である請求項１２の方法。１６．ＩｇＥ拮抗剤候補が抗ＩｇＥ抗体またはその断片、ＩｇＥ変異体またはその断片、可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体、ＩｇＥ結合性ペプチドおよびＦｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチドから構成される群から選択される請求項１５の方法。１７．遮断放出混合物中の全血標本を最初に薬剤と混合し、次に血清標本と混合する請求項１２の方法。１８．遮断放出混合物中の血清標本を最初に薬剤と混合し、次に全血標本と混合する請求項１２の方法。１９．患者におけるアレルギー性疾患の診断法であって、（ａ）反応混合物中への薬理学的伝達物質放出を遮断反応混合物中への薬理学的伝達物質放出と比較すること、ただしここに、（１）反応混合物および遮断反応混合物は患者血清ＩｇＥおよびアレルゲンによる誘導に際して宿主細胞の薬理学的伝達物質放出を媒介することのできるＦｃ_ε ＲＩαサブユニットの表面発現を示すように遺伝子工学的に処理した肥満細胞宿主のいずれか、および患者血清ＩｇＥおよびアレルゲンによる誘導に際して宿主細胞の薬理学的伝達物質放出を媒介することのできるＦｃ_εＲＩαサブユニットの表面発現を示すように遺伝子工学的に処理した好塩基球細胞宿主のいずれかから構成される群から選択した共通の親細胞の子孫である遺伝子工学的に処理した細胞を含み、（２）反応混合物および遮断反応混合物はおのおのさらに血清標本中の目的アレルゲンに特異的なＩｇＥの存在または不在が未知な、患者からの単一血清標本の一部を含み、（３）遮断反応混合物はさらにＩｇＥ拮抗剤を含み、および（４）放出混合物および遮断放出混合物双方をアレルゲンとを混合するものとする、（ｂ）段階（ａ）での比較に基づいて、その血清標本中にそのアレルゲンに特異的なＩｇＥの存在または不在を決定することを含む診断法。２０．遺伝子工学的に処理した細胞が遺伝子工学的に処理した肥満細胞である請求項１９の方法。２１．遺伝子工学的に処理した肥満細胞が遺伝子工学的に処理した齧歯類肥満細胞である請求項２０の方法。２２．遺伝子工学的に処理した齧歯類肥満細胞が遺伝子工学的に処理したラット肥満細胞である請求項２１の方法。２３．遺伝子工学的に処理したラット肥満細胞がＲＢＬ４８細胞である請求項２２の方法。２４．Ｆｃ_εＲＩαサブユニットが患者の動物種から誘導される請求項１９の方法。２５．患者がヒトである請求項１９の方法。２６．Ｆｃ_εＲＩαサブユニットをヒト起源から誘導する請求項１９の方法。２７．Ｆｃ_εＲＩαサブユニットが遺伝子工学的に処理した細胞に対して外因性である請求項１９の方法。２８．ＩｇＥ拮抗剤が抗ＩｇＥ抗体またはその断片である請求項１９の方法。２９．抗ＩｇＥ抗体がモノクローナル抗ＩｇＥ抗体である請求項２８の方法。３０．抗ＩｇＥ抗体がｒｈｕＭＡｂＥ２５である請求項２９の方法。３１．ＩｇＥ拮抗剤がＩｇＥ変異体またはその断片である請求項１９の方法。３２．ＩｇＥ拮抗剤が可溶性Ｆｃ_εＲＩ受容体である請求項１９の方法。３３．ＩｇＥ拮抗剤がIｇＥ結合性ペプチドまたはＦｃ_εＲＩ受容体結合性ペプチドである請求項１９の方法。３４．遮断反応混合物中の遺伝子工学的に処理した細胞を最初にＩｇＥ拮抗剤と混合し、次に患者からの血清標本と混合する請求項１９の方法。３５．遮断反応混合物中の血清標本を最初にＩｇＥ拮抗剤と混合し、次に遺伝子工学的に処理した細胞と混合する請求項１９の方法。３６．薬理学的伝達物質がヒスタミンである請求項１９の方法。