JPH06505385A - グルタミン酸デカルボキシラーゼ自己抗原関連疾患の診断及び処置方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 グルタミン酸デカルボキシラーゼ自己抗原関連疾患の診断及び処置方法本発明は 、酵素、イソ型のグルタミン酸デカルボキシラーゼを暗号化する核酸分子の同定 、クローニング及びシーケシングに関し、そしてさらに、インスリン依存真性糖 尿病及びグルタミン酸デカルボキシラーゼが自己抗原である他の病気の診断並び にこれらの疾病にかかっている患者の処置でのこれらの分子及び／又はそれによ り暗号化されたペプチド及びポリペプチドの使用に関する。

酵素、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（以下、ｒＧＡＤＪと称す）は、Ｌ−グ ルタミン酸から抑制性神経伝達物質γ−アミノ酪酸（以下、ｒＧＡＢＡＪと称す ）への変換を触媒する。ＣＡＤは中枢神経系のＧＡＢＡ分泌ニューロン（１−３ ）、膵臓のβ−細胞中（４，５）及び精子中（６）に発現する。免疫親和性に精 製され、酵素的に活性な脳ＣＡＤの分析によりＭｒ５４−６７．０００を有する 幾つかの同質異性型のＣＡＤを確認した（７．８）。脳ｃＤＮＡ発現ライブラリ ーをスクリーンするために精製脳ＣＡＤに対して作られた抗血清を用い、無削除 のラット（９）及びネコ（１０）ＣＡＤ配列を暗号化しているｃＤＮＡ類を分離 し配列を決定した。ラット及びネコＣＡＤの推定アミノ酸配列の比較により両蛋 白は９５％一致し、従って進化の間に高度に保存されていることを示す。

ＧＡＢＡニューロン中ＣＡＤと反応性の自己抗体は、まれな神経性疾患ステイグ ・マン・シンドａ−ム（以下、ｒＳＭＳＪと称する、１１１２）にかかった患者 からの大部分の血清に存在する。ＣＡＤ自己抗体に陽性の患者は高頻度の条内分 泌自己免疫、特にインスリン依存真性糖尿病（以下、ｒｌＤＤＭＪと称す）を有 する。

ＩＤＤＭの前臨床段階の間、及びご（初期臨床ＩＤＤＭにかかっている患者では 、自己抗体はｒ６４ＫＪと名づけられた膵島細胞Ｍｒ６４．０００蛋白に対して しばしば検出される（１３）。最近の報告では、６４に自己抗原はＣＡＤと同一 であると推定された（１４）。しかしながら、ゲノベス（１５）は、ＣＡＤは別 個の６４に蛋白と共沈殿しており、後者は、ＧＡＤのＭｒ５０，０００生成物と は異なるＭｒ３７、　ＯＯＯ／４０．０００のトリプシン生成物によって区別さ れることを示唆した。

ＣＡＤは、別個の遺伝子により暗号化された少くとも２つのイソ型を含む（１６ ，１７，１８）。既知のイソ型の予報された分子量は約６７．０００と６５．　 ＯＯＯである（それぞれｒ６７ＫＪ及びｒ６５に、Ｊイソ型と称する）。異なる 組織内でのＣＡＤイソ型の分布はまだよ（確定していないが、６５にイソ型は６ ５に自己抗原のＣＡＤ成分であると説明されるようである（１７）。

本発明の糸口になる研究において、本発明者等は、潜在的診断及び／又は治療使 用のためにヒト及び他の種からＣＡＤの６フイソ型をクローンしようとした。

本発明によって、ヒトｌｌ１ｉｉ（ＨＢ）、ヒト膵島（ＨＩ　）及びマウス脳（ ＭＢ）のＣＡＤ（以下、それぞれｒＨＢＧＡＤＪ、ｒＨＩＧＡＤＪ及びｒＭＢＧ ＡＤＪと称する）をクローンし、配列決定した。さらに本発明によって、６７に イソ型に対応する組換えＧＡＤ蛋白並びにそれらの断片及び誘導体を抗体及びＣ ＡＤと反応性のＴ細胞を検出するため抗原として用い、これにより、前臨床及び 臨床ＩＤＤＭ及びＳＭＳを含む型の疾病並びにＣＡＤが自己抗原である他の疾病 についての新しい範囲の診断及び治療の基本を形成した。

従って、本発明の第一の局面は、酵素の６７にイソ型に対応するヒトの又はマウ スのグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＣＡＤ）又はその抗原的に活性な断片又 は誘導体を暗号化する配列を暗号化するか又はこれと相補性であるヌクレオチド 配列を含んでいる核酸分子を提供する。

「６７にイソ型」は、約Ｍｒ６７．０００を有するＣＡＤ及び／又は全テノ断片 、誘導体、同族体及び／又はそれらの免疫類縁体の形を意味し、これらはＣＡＤ のＭｒ６５．　ＯＯＯ型と区別可能であり及び／又はさもなければ異なり、そし て、Ｔ細胞及び／又は、臨床又は前臨床ＩＤＤＭ、ＳＭＳ及び／又は他の同様の 疾病を伴う個体からの自己抗体に選択的に反応する。

好ましくはＧＡＤはヒト膵島ＧＡＤ（ＨＩＧＡＤ）、ヒト脳細胞ＣＡＤ（ＨＢＧ ＡＤ）及び／又はマウス脳細胞ＣＡＤ（ＭＢＧＡＤ）である。好ましくは、核酸 分子は、少くともその一部が図１．３．７及び／又は１１に示される配列に実質 的に対応するヌクレオチド配列、又はその断片、誘導体、同族体又は免疫類縁体 又は１又はそれ以上のそれらに相補性配列を有するＤＮＡである。しかしながら 本発明は、又、図１．３．７及び／又は１１に示される配列の全ての単−又は多 重ヌクレオチド！換体、欠損体、及び／又は付加体に及び、それらは依然として ＣＡＤ或いは必要な抗原プロフィルを有するその断片又は誘導体を暗号化し、自 己抗体又はＴ細胞に反応性である。さらに核酸分子がＲＮＡの場合、リボヌクレ オチド配列は、好ましい実施態様では、図１．３．７及び／又は１１に示される １又はそれ以上の配列、又はそれらの断片、誘導体又は同族体に実質的に相補性 である。

本発明は、又、発現調節配列に上述したように実施可能に結合した組換え核酸（ 例えばＤＮＡ）を提供する。このような組換え分子は、例えば、発現ベクターを 含みつる。本発明はさらに、宿主細胞、例えばそのような組換え分子で形質転換 した細菌、酵母、哺乳動物又は昆虫細胞に及ぶ。好ましい哺乳動物細胞系はチャ イニーズハムスター卵巣（ＣＨＤ）細胞系である。

本発明の他の局面は、自己抗体及び／又はＴ細胞に活性であるＣＡＤのイソ型の 全部又は部分の抗原性を表示している合成（例えば組換え）ペプチド又はポリペ プチドに向けられる。

そのような合成ペプチド又はポリペプチドは、例えば組換え手段、例えば上記し た組換え分子で形質転換された宿主細胞の発現により調製しつる。ペプチド又は ポリペプチドは他のペプチド又はポリペプチドに融合しつる。別法として、それ は、化学合成により、例えば周知のメリフィールド固相合成方法により調製しう る。合成（例えば組換え）ペプチド又はポリペプチドはＣＡＤ酵素活性を維持し てもしなくてもよい。さらに、合成ＣＡＤ又はその断片は、好ましい実施態様を 示すが、本発明は、又、自然発生酵素又はその断片の生物学的に純粋な調製物に 及ぶ。「生物学的に純粋な」は少くとも６０％、好ましくは少（とも７０％、よ り好ましくは少（とも８０％、さらにより好ましくは少くとも９０重量％酵素の 調製品を意味する。

最も好ましい実施態様では、本発明は、ＭＢＧＡＤ、ＨＩＧＡＤ及び／又はＨＢ ＧＡＤに対応する自然発生又は合成のペプチド又はポリペプチドに並びにそれら をコードするヌクレオチド配列及びそれの断片、誘導体、同族体又は免疫類縁体 に及ぶ。例として、そのような断片を図２．４．５．６．８．９、及び１０に示 す。「誘導体」は自然発生配列に、又は図１．３．７及び／又は１１に示される 配列に相対的な単−又は多重アミノ酸置換体、欠損体及び／又は付加体を含むこ とを意味し、炭水化物脂質及び／又は他の蛋白様成分を含むペプチド又はポリペ プチドと結合した全ての他の分子への単−又は多重置換体、欠損体及び／又は付 加体を含む。

本発明は、又、ＩＤＤＭと結合した自己抗体の検出方法を意図し、その方法はＣ ＡＤの全て又は抗原部分に対応するペプチド又はポリペプチドを（ＣＡＤは酵素 の６７にイソ型又はその断片又は誘導体に対応する）試験すべき患者からの生物 学的試料と、ペプチド又はポリペプチドＣＡＤに反応性の抗体との間の複合体を 形成するに十分な時間及び条件下に接触させること、次いで複合体を検出するこ とを含む。好ましくは生物学的試料は血清である。より好ましくはペプチド又は ポリペプチドは、血清との接触前、中又は後に固体支持体上に固定化する。検出 の方法は、よく知られており、比色、蛍光及び放射活性方法を含む。他の検出手 段も用いることができ、例えば凝集反応を含む。本検定は本発明の範囲から逸脱 することなく多くの方法に変更することができる。

本発明は、又、ＣＡＤの６７にイソ型に対応するペプチド又はポリペプチド又は その抗原性断片の、ＩＤＤＭ及びＳＭＳを含んでいる型の疾病の診断試験での抗 原としての、又は、例えばエリザ（ＥＬＩＳＡ）又はＲＬＡ技術或いは抗原被覆 ピース等を用いる凝集検定を用いる患者の血清での抗体のタイターの検出又は測 定による無症候性個体をスクリーニングするための、用途に及ぶ。

本発明のこの局面は、ヒト患者からの生物学的試料（例えば血清）中の自己抗体 のタイターの検出及び／又は測定によって便利に実施し得、該方法は、該試料を 、ＣＡＤの６フイソ型の抗原部分に対応するペプチド又はポリペプチド又はその 断片又は誘導体と、ペプチド又はポリペプチドとＣＡＤに反応性の抗体との間の 複合体を形成するのに十分な時間及び条件下に接触させること、次いで複合体及 び／又は複合体中に結合しているペプチド又はポリペプチドの量を検出すること を含む。好ましくは、ペプチド又はポリペプチドは、試料との接触前、中又は後 に固体支持体上に固定化し、そしてペプチド又はポリペプチドは前記のように定 義される。

別法として、そのような疾病は、ＣＡＤ結合免疫複合体をスクリーニングするこ とにより、検出しつるか、そうでないにせよ、少くとも陰性結果を再確認しろる 。例えば陰性自己抗体結果がＣＡＤとの複合体を形成する自己抗体により生じ、 それにより前述の検定で結合に利用できないこともありうる。ＣＡＤ免疫複合体 を便利に検出するために、血清又は他の生物学的液体を抗ＧＡＤ抗体（例えばモ ノクローナル抗体）と、ＣＡＤ−自己抗体免疫複合体を結合するのに十分な時間 及び条件下に接触させる。好ましくは抗ＧＡＤ抗体をまず固体支持体上に固定化 する。次いで、一般に標式又は他のリポータ−分子を付した抗免疫グロブリン抗 体を用いてＣＡＤ複合体の抗体成分をスクリーンする。当業者は、本明細書で意 図された検定が本発明の範囲から逸脱することなく修飾しうることを直ちに認識 するであろう。これらの検定のそのような全ての修飾及び変形は本発明に含まれ る。

本発明は、又、ペプチド及び／又はポリペプチド、又は断片、又は本発明の誘導 体の、患者の処置での使用に及ぶ。この後の局面では、そのような処置方法は、 患者から自己抗体又は自己反応性細胞を除去するための吸着剤としてのそれらの 使用、自己反応性Ｔ細胞又はＩＤＤＭ自己抗原に対する自己抗体の反応性を排除 し又は減じるために又は治療剤用に又はとして用いるＴ細胞系又はクローンを産 生ずるために脱感作し又はトレランスを誘導する手段として患者への直接投与で のそれらの使用を含む。

本明細書で意図したように、処置方法は、以下の処置の実施例を含むがこれらに 限定されない。処置の最初の実施例は、ＣＡＤのＴ細胞認識を変えそしてＴ細胞 抑圧を誘導するため、有効量のＣＡＤペプチド又はポリペプチド又はその断片を 用いる脱感作又はトレランス誘導である。これは、ある種の紫外線波長、特にＵ Ｖ−Ｂの既知の効果を用いることにより達成し得、皮膚を経る抗原提示を修飾す る（１９参照）。有効量のＣＡＤペプチド又はポリペプチド又はその断片を、Ｃ ＡＤに対する末梢血Ｔ細胞反応性を示している患者の皮膚に、ＵＢ−Ｂ放射への 、皮膚の暴露後、皮肉に（ａｐｉｃｕｔａｎｅｏｗｓｌｙ）適用する。処置はＣ ＡＤに対するＴ細胞反応性が抑制するまで繰り返す。第二の処置は、１又はそれ 以上のサイトカイン、例えばＴＮＦα又はβ、これに限らないが、と共にＣＡＤ を皮膚に適用することを含む。第三の処置はＴ細胞免疫を含み、これによりＴ細 胞系は、標準的方法によりＣＡＤペプチド又はポリペプチド又はその断片を産生 じ、細胞は試薬、例えばグルタルアルデヒド又はバラホルムアルデヒドとの結合 により弱毒化し、無菌条件下で洗浄し、ＣＡＤに対する内因性Ｔ細胞応答の抑制 を起こす時間及び条件下に患者に再注射する。これらの処置の接近は、前臨床Ｉ ＤＤＭを伴う無症候性患者又は最近の初期臨床ＩＤＤＭを伴う患者での臨床ＩＤ ＤＭの防止、並びに膵臓、膵島細胞又はインスリン生成細胞移植を受けた患者で のＩＤＤＭの再発に適用可能である。これらの研究法は、又、ＳＭＳ及びＧＡＤ が自己抗原である他の疾病に適用可能である。本発明によれば、ＣＡＤペプチド 又はポリペプチドの有効量は投与量当り０．１μｇないし１０１１１ｇで、好ま しくは投与量当り１．０μｇないしｌＩ！ｇである。投与量は単−投与又は投与 プロトコールを含みつる。投与は全ての慣用手段、例えば静脈内、皮下、皮肉、 注入、経口、局所的、鼻腔内、座薬、又は腸腔内投与によりつるが、これらに限 らない。ＣＡＤペプチド又はポリペプチドは単独で、又は１又はそれ以上の他の 活性分子と共に投与し得、分子はＣＡＤペプチド又はポリペプチド活性を促進し 、例えばサイトカイン、特にＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−βである。

別の実施態様では、本発明は、ＣＡＤの６７にイソ型に対応するペプチド又はポ リペプチド又はその断片又は誘導体の、ＩＤＤＭ自己抗原に対する患者細胞の反 応性を測定するための用途を意図する。ペプチド又はポリペプチド、又はその断 片又は誘導体は、未分画、分画で又は連続細胞系として誘導された、末梢血液か ら又は組織バイオプシーから誘導された患者からの細胞と共に、溶液中で又は固 体支持体に結合して加えつる。次いで自己抗原に対する反応性は、標準的増殖検 定、例えばトリチウム標識チミジンの取り込み、標準的細胞傷害性検定、例えば 標的細胞からマーカー放射活性の放出、発現した又は分泌した分子、例えばサイ トカインの測定又はこの分野で周知である細胞反応性の他の標準的検定により測 定しつる。

本発明のこの局面の一実施態様では、患者Ｔ細胞を検定するための診断キットが 提供される。エリザ検定で用いられるように、標準的９６ウエルプレートを、Ｔ 細胞サイトカイン、例えばγ−インターフェロン（γ−ＩＦＮ）に対するモノク ローナル抗体（ＭＡｂ）で、抗原と共に又は不存在でプレコートする。別法とし て、抗原を、末梢血液単核細胞又はＴ細胞のアリコートと共に可溶形で加える。

２日またはそれ以上インキュベーションし、細胞を洗浄除去し、ウェルを再び洗 浄し、プレートをサイトカインに対する標識第二ＭＡｂ、例えばアルカリホスフ ァターゼ又は西洋ワサビペルオキシダーゼと接合した抗−ア−ＩＦＮで展開する 。次いで比色反応及び読み取り系統を用いることができる。別法として、単−丁 細胞レベルで生成したサイトカインを表わしているウェルの底に顕微鏡的に個々 のスポットを視覚化し、これにより測定すべき抗原反応性Ｔ細胞の前駆体頻度を 可能にすることもできる。

本発明は、ＣＡＤの６フイソ型に対応する合成ペプチド又はポリペプチド又はそ の断片、誘導体、同族体及び／又は免疫類縁体を含むために適応される容器を含 むキットを含む他の形のキット及び診断検定を含む。キットは試験すべき試料を 含み又は受けるのに適応される第二容器を含みうる。ＣＡＤ抗体複合体を検定す るための試薬を含むために適応される第三容器を存在させつる。別法として、キ ットがＣＡＤ免疫複合体を検定するものである限り、キットはＣＡＤ特異抗体（ 例えばモノクローナル抗体）を含むのに適応される−又はそれ以上の容器（例え ばウェル）を含みつる。さらにキットへの付加的容器は溶液試料及び標識抗体を 受入れるための容器を含みつる。

さらに本発明において、本明細書に記載されるＧＡＤ類又はその断片を暗号化す るｃＤＮＡ挿入体の発現は多くの異なる方法で達成しつる。

例として、融合蛋白としての自己抗原の成功発現は、宿主細胞としてエセリシア ・コリを用い、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ融合蛋白の発現を与えるｐ ＧＥＸベクターを用いて達成できる。発現は、又、例として、宿生細胞としてエ セリシア・コリを再び用い、周知のｐＥＶベクター又はポリヒスチジン発現ベク ター（２３）を用い達成できる。別法として、ＣＡＤは、適当なベクター及び宿 主細胞組合せを用いることにより、非融合ポリペプチドとして発現しつる。本発 明により用いることができる他のベクター及び宿主は、酵母細胞に用いるための 多くの明記された酵母シャトルベクター、又は連続細胞系、（例えばＣＨＯ細胞 ）又は遺伝子導入動物に用いうる真核ベクターを含む。

本発明は、以下の限定されない図面及び実施例を引用してさらに記載する。

図において、 図１は、オリゴヌクレオチドを排除しているヒト脳ＣＡＤ（ＨＢＧＡＤ）及びヒ ト膵島ＧＡＤ（ＨＩＧＡＤ）に対応する５４０ヌクレオチドＤＮＡ配列の比較を 示す。

図２はＨＢＧＡＤ及びＨＩＧＡＤの推定されたアミノ酸配列並びにネコＣＡＤ（ アミノ酸２１８−３９８）における相当部分を伴うそれらの線列を示す。

図３は、無削除のマウス脳ＣＡＤ（ＭＢＧＡＤ）に対応するヌクレオチド配列及 び推定されるアミノ酸配列を示す。

図４は、発表されたネコＣＡＤ配列（１０）のアミノ酸１−２０４を暗号化する 、ＭＢＧＡＤ１２と名付けられた、ＭＢＧＡＤのＮ末端断片に対応するヌクレオ チド配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

図５は発表されたネコＣＡＤ配列のアミノ酸１９８−４０４に対応する、ＭＢＧ ＡＤ３４と名付けられた、ＭＢＧＡＤの中央部分断片に対応するヌクレオチド配 列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

図６は、発表されたネコＣＡＤ配列のアミノ酸３９２−５９３に対応する、ＭＢ ＧＡＤ５６と名付けられた、ＭＢＧＡＤのＣ末端断片に対応するヌクレオチド配 列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

図７は、ヒト脳ＣＡＤ（ＨＢＧＡＤ−ＦＬ）に対応する無削除のヌクレオチド配 列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

図８は、発表されたネコＣＡＤ配列のアミノ酸１−２５０に対応する、ＨＢＧＡ Ｄ１７と名付けられた、ＨＢＧＡＤのＮ末端断片に対応するヌクレオチド配列及 び推定されるアミノ酸配列を示す。

図９は、発表されたネコＣＡＤ配列のアミノ酸２０８−４０４に対応する、ＨＢ ＧＡＤ１４又はＨＩＧＡＤ１４と名付けられた、ＨＢＧＡＤ又はＨＩＧＡＤの中 央部分断片に対応するヌクレオチド配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

図１０は、発表されたネコＣＡＤ配列のアミノ酸３９２−５９４に対応する、Ｈ ＢＧＡＤ６５と名付けられた、ＨＢＧＡＤのＣ末端部分断片に対応するヌクレオ チド配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

図１１は、ヒト膵島ＧＡＤ（ＨＩＧＡＤ−ＦＬ）に対応する無削除のヌクレオチ ド配列及び推定されるアミノ酸配列を示す。

実施例１ 材料及び方法 ヒトＲＮＡ　ＲＮＡはヒト成人脳及び膵島から得た。膵島を導管内コラゲナーゼ 拡張方法によりドナー膵臓から分離した。個々に手で摘出した膵島を、５Ｍグア ニジニウムインチオシナート、ｌ□＋ＭトリスｐＨ７，６，１０＋Ｍ　ＥＤＴＡ 及び５．７ＭＣ５ＣＡ’クツシヨンを経て遠心分離により精製したＲＮＡに溶解 した。

ピオウラル・サイエンス、アリシナから、クロード・パーナートの贈り物であっ た。

ヒトｃＤＮＡライブラリーズ　ヒトｃＤＮＡ発現うイブラリーズに基づく２つの λｇｔ−１１をＧＡＤｃＤＮＡの起源として用いた。脳幹ｃＤＮＡライブラリー はクローンチックから得、膵島細胞ライブラリーはワシントン・スクール・オブ ・メディンン、セント・ルイスからアラン・パーナツトの贈物であった。ｃＤＮ Ａはプレート溶解法（２０）によりファージ系統から調製した。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）　発表されたラット（９）及びネコ（１０）Ｇ ＡＤｃＤＮＡ配列に基づき、オリゴヌクレオチドブライマーを保存部分から設計 した。種々のクローンを分離するのに用いたプライマーは表１に示す。全ＲＮＡ （１μｇ）の第一標準合成は、２ｐモルの相補プライマー、４０ＵのＲＮアミン 及び５ＵのＭｏＭＬＶ逆転写酵素を含む１０ｍＭ、ｈリスｐＨ８，３，５０ｍＭ ＫＣＡ’、１５ｍＭＭｇＣ４２，１００μＭ　ｄＮＴＰｓ（ＰＣＲバッファー） 中、５０μｌ反応容量で３７℃で３０分実施した。２ｇｔ−１１ｃＤＮＡ（１０ ０ＩＩ１ｇ）又は１０μｌの第一標準反応は、２０ｐモルの各プライマー及び２ ．５ＵのＴａｇＩポリメラーゼを含むＰＣＲバッファー中、３０熱サイクル（１ サイクル：９５℃で１．５分、３７−４５℃で２０分、７２℃で２．０分）によ り増幅した。反応を低融点アガロースゲル及びフェノール抽出（２０）により精 製した予想される大きさの生成物上で分析した。

クローニング及びＤＮＡシーケシンリン　ＰＣＲ増幅ＤＮＡ断片をプラスミド発 現ベクターｐＧＥＸ１−３（２１）に、及び、又、ヒスチジン発現ベクターｐＤ Ｓ５６（−１）及び（−２０２３）にクローンした。ヌクレオチド配列は、表１ に記載されるように、Ｍ１３万能プライマー及び内部ＣＡＤ配列から設計された 特異プライマーを用いるジデオキシ鎖終止法（２２）により決定した。

実施例２ ヒトＣＡＤのクローニング ヒトＧＡＤｃＤＮＡをクローンするため、ラット及びネコ配列の間に保存したヌ クレオチド範囲（ｓｔｒｅｃｈｅｓ）を重複しているオリゴヌクレオチド対を合 成しＰＣＲ反応に用いて脳及び膵島λｇｔ−１１発現ライブラリーから抽出した ｃＤＮＡ並びにヒト脳及びヒト膵島から抽出したＲＮＡを増幅した。オリゴヌク レオチドプライマー及びアユ−１ルグの温度の種々の組合せを用いる広範なＰＣ Ｒ反応において、６００ヌクレオチドの生成物を、それぞれＣＡＤ開いた読み枠 の中央部分をあられす、発表されたネコｃＤＮＡ（１０）のヌクレオチド部分７ ３９−７６８及び１３１２−１３３０に対応するオリゴヌクレオチドプライマー ：５°ＡＣＴＧＣＣＡＡＴＡＣＣＡＡＴＡＴＧＴＴＣＡＣＡＴＡＴＧＡ３°及び ５°　ＣＣＧＡＡＴＴＣＴＧＴＡＧＡＧＧＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＡＣ３’（相補 ＥｃｏＲＩを含む）により、脳及び膵島ｃＤＮＡ鋳型から得た。２つの６００ヌ クレオチドＰＣＲ生成物は、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩで切断し、ＥｃｏＲＩ及び Ｓ＋ｎａＩで切断したＧＥＸ−３ＸＤＮと連結し、エセリシア・コリに形質転換 した。被転換体からプラスミドＤＮＡの制限分析は、ヒト脳ＣＡＤクローン（Ｈ ＢＧＡＤ）及び膵島ＧＡＤクローン（ＨＩＧＡＤ）を確認した。

オリゴヌクレオチド配列を除く、ＨＢＧＡＤ及びＨＩＧＡＤを決定する５４０ヌ クレオチドＤＮＡ配列を図１に示す。これら２つの配列はネコＣＡＤ配列と９０ ％類似を示し、従って、ヒトクローンの同一性を確認する。ＨＩＧＡＤ配列１こ よるＨＢＧＡＤ配列の線列は、それらが位置８８（Ｔ−Ａ）、９１（Ｔ−Ｃ）、 １２８（Ｃ−Ｔ）及び３６６（Ｃ−Ｔ）で４つのヌクレオチド変化以外、同一で あることを示した。

図２はＨＢＧＡＤ及びＨＩＧＡＤの推定されるアミノ酸配列及びネコＣＡＤ蛋白 （ａａ２１８−３９３）中対応する部分を伴うそれらの線列を示す。ＨＢＧＡＤ とＨＩＧＡＤの間の４つのヌクレオチドの違いは、結果として残基２４７（ロイ シン−イソロイシン）及び２６０（スレオニン−イソロイシン）及び２４８（フ ェニルアラニン→ロイシン）での３つの保存アミノ酸変化となり、残基３３９（ ロイシン）は、位Ｎ３６６でのヌクレオチド相違が無音であるので残基３３９（ ロイシン）は依然として未変化である。脳及び膵島ＧＡＤ蛋白の中央１／３間の これらのアミノ酸相違は、ヒト組織でのＣＡＤの同質異性形の存在についての証 拠を与える。

単核細胞による膵島の侵入は遂にインスリン生成β細胞及び臨床ＩＤＤＭの破壊 となる（２０）。酵素ＣＡＤは最近、幾つかのＩＤＤＭ血清の６４に膵島細胞蛋 白及びＣＡＤを共沈する能力に基づ＜ＩＤＤＭにおける推定膵島自己抗原として 確認され（１４）、前臨床及び臨床ＩＤＤＭを伴う患者からの末梢血液Ｔ細胞が ６４に自己抗原及びＧＡＤを含む膵島膜調製品により活性化できることを示した （２４．２５）。脳及び膵島ＣＡＤ内の配列差の発見は、膵島の選択的自己免疫 破壊についての遺伝学的側面を提供しつる。

実施例３ 無削除のヒト脳及び膵島ＧＡＤｃＤＮＡの構築天然脳ＲＮＡはＣＡＤ５（５’Ｃ ＣＣＡＴＡＡＡＣＴＣＡＴＧＴＴＣＴＴＧ３’）又はＣＡＤ７（５°ＧＧＡＧＡ ＡＡＡＴＡＴＣＣＣＡＴＣＡＣＣ３’）オリゴヌクレオチドで逆転写した。表１ に示すように、ＣＡＤ特異的オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによる第一のス トランド生成物ＧＡＤ７及びＣＡＤ５の増幅によりａａｌ−２５０ＨＢＧＡＤ１ ７を暗号化するｃＤＮＡ及びａａ２０８−５９４を暗号化する重複ｃＤＮＡを産 生じた。１００ナノグラムの各断片は、ＰＣＲバッファー中、９５℃で変性し、 ハイブリッド分子をハイブリッド形成した分子（表１）の末端でアニールするＲ ＧＡＤＩ及びＣＡＤ５オリゴヌクレオチドを用い伸長し、増幅して５９４ａａＧ ＡＤ開いた読み枠を暗号化し、無削除のＨＢＧＡＤ及びＨＩＧＡＤ（図７及び１ １）を産生ずる無削除のヒトＣＡＤクローンを産生した。

実施例４ マウス脳ＣＡＤのクローニング マウス脳ＣＡＤを、プライマーＲＧＡＤ１及びＲＧＡＤ６（表１）を用いた以外 、ＨＢＧＡＤ及びＨＩＧＡＤについて上記のようにクローンした。

実施例５ 組換え蛋白に対するＴ細胞応答 ６７人の被検者をＨＢＧＡＤ及びＨＩＧＡＤに対するそれらのＴ細胞応答（二つ いて試験した。

被検者背景は以下の通りであった。

１５　最近開始の臨床糖尿病（症状の開始後３ケ月以内）４４　前臨床糖尿病（ ヒト膵臓の凍結切片で膵島の反応する膵島細胞抗体１こ陽性であるＩＤＤＭを伴 う人々の無症候性−次程度類縁）８　対照（正常の偉康な若い成人） 末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）をフイコールノ＼イ／＜り密度勾配遠ノロ・↓二 より分離し、２回洗浄した。次いで細胞を完全培養培地（ヘペスノ（ツファ−２ ０１１１Ｍ、ペニシ１ノン１００単位／ｍｌ、ストレプトマイシン１００μｌ／ ｄ、１０−’Ｍ２−メルカプトエタノール及び５％自己血清を伴うＲＰＭｌ　１ ６４０）ｌこ再び懸濁しく２ｘ１０’／Ｗ）、９６ウ工ル丸底ミクロタイタープ レートに接種した（２００μｌ／ウエル）。表１に記載したように、それぞれヒ ト脳及びヒト膵島ＧＡＤの１９６アミノ酸中央部分を含む組換えＧＡ、Ｄ融合蛋 白ＨＢＧＡＤ及びＨＩＧＡＤｌｔ、共に、そして組換えＣＡＤ抗原が溶解するグ ルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を、１０．１．０及び０．１μ ｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。本発明者ら力（ＧＳＴを含有することを明らか にした超音波処理したブタ胎児膵島（２４）、並び；ニブタ胎児肝臓、甲状腺及 び腎臓も抗原（複数もあり）の起源として用ＧＸた。培養物を湿らせた５％Ｃ○ ２大気中で５日間、最後ビ時間＋ｔ　３　Ｈ−チミジンを添加して（１μＣｉ／ ウエル）、インキュベートした。次し１で細胞をシンチレーション計数のために 収集した。各４回の分当りの中央計数を促進指数、即ち、抗原を伴うｃｐａ＋／ 抗原なしのｃｐ謙を誘導するのに用いた。陽性結果をＧＳＴで得たものより大き い促進指数として定義した（組換えＧＡＤ蛋白又１ま２．０（胎児組織）より大 ）。

表２ ト膵島ＧＡＤに、（２６１５０）５０％がヒト脳ＣＡＤＩ：応答して増殖しうる 循環Ｔ細胞を有することを示す。

実施例６ 組換え蛋白に対する抗体応答 被検者からの血清試料を、組換えネズミ脳ＧＡＤ、ＭＢＧＡＤ１２のＮ末端断片 に、並びに無削除組換えヒト脳ＣＡＤＩ：対する抗体応答につし１て試験した。

抗原として用いた蛋白 組換えマウス脳ＧＡＤ１２をｐＧＥＸ系；こおＬ％てグルタチオン−８−トラン スフェラーゼ（Ｇ　Ｓ　Ｔ）との融合蛋白としてクローンし、発現した。ＭＢＧ ＡＤ１２をトロンポンで切断しＣＡＤ蛋白親和性をグルタチオンアガロースビー ズを用Ｌ％ＧＳＴから精製した。ＭＢＧＡＤ３４、ＭＢＧＡＤ５６、ＨＢＧＡＤ １７及びＨＢＧＡＤ６５を、ポリヒスチジン発現系を用１．）Ｎ末端で６つのヒ スチジン残基との融合蛋白としてクローンし、発現した。

エリザ 全てのエリザ検定で、組換えＣＡＤ蛋白（ま９６ウエルプレートのプラスチ・ツ クウェル上に１μｇ７ｍｌに被覆し、ウェルを遮断）くツフア−にさらし、洗浄 し、試験血清の倍加希釈とインキュベートし、洗浄しジアルカリホスファターゼ 結合二次抗体にさらし、洗浄し、ｎ−ニトロフェノールクロモーゲンで発現し、 ４０５ｎＭで読んだ。ＯＤ＞平均＋対照血清との２９Ｄを陽性と取った。

患者は以下の通りであった。

ＭＢＧＡＤ１２、ＭＢＧＡＤ３４及びＭＢＧＡＤ５６並びにＨＢＧＡＤ１７及び ＨＢＧＡＤ６５を用いるエリザの結果はそれぞれ表３及び４に示す。

表３ 証ＢＧＡＤ１２　ＭＢＧＡＤ３４　１１ＢＧＡＤ５６前臨床ＩＤＤＭ　５／９　 ５／９　４／９最近開始臨床ＩＤＤＭ　２／１３　４／１３　３／１３対照　０ ／２２　０／２０　０／２０ ９中７（７８％）の前臨床ＩＤＤＭ及び１３中６（４６％）の最近開始ＩＤＤＭ 血清が少くとも一つのＭＢＧＡＤペプチドと反応した。９中３（３３％）及び１ ３中１（８％）の前臨床及び最近開始ＩＤＤＭ血清だけが、それぞれ全ての３つ のＭＢＧＡＤ断片と反応した。３つのＣＡＤペプチドはどの血清群によっても優 先的に認識されなかった。これらの知見は、組換えＭＢＧＡＤとの血清反応性の ／（ターンは不均質であり、少（とも３つの王なエピトープがＧＡＤ６フイソ型 で存在することを示す。

表４ 被検者　ＨＢＧＡＤ１７　ＨＢＧＡＤ６５前臨床ＩＤＤＭ　７／９　３／９ 最近開始ＩＤＤＭ　３／７　３／７ 対照　０／１６　０／１６ 工リザ形式での２つのヒト脳ＧＡＤ断片ＨＢＧＡＤ１７及びＨＢＧＡＤ６５を用 いた結果は相当するマウス脳ＣＡＤペプチドＭＢＧＡＤ１２及びＭＢＧＡＤ５６ を用いて得られたものと類似する。

当業者にとって、本明細書に記載された本発明がこれら特に記載されたちの以外 の変形及び修飾に感受性である以外に変形及び修飾に感受性であることは明らか である。本発明はこのような全ての変形及び修飾を含むことを理解すべきである 。本発明は、又、本明細書に引用され、又は示される全ての段階、要点、組成物 及び化合物を個々に又は集合的に、そして全ての２又はそれ以上の該段階又は要 点のいかなる且つ全ての組合せをも含む。

引用文献 １、ロバーツ、イー　、チェイズ、ティ、エフ、、及びタワー、ディー、ビー（ １９７６）クロツ・ファウンディシぢン・ンリーズ、５巻、ＧＡＢＡイン・ナー バス・システム・ファンクション、レイブン・プレス、ニューヨーク。

２、ムガイニ、イー１．及びオマーテル、ダブリュ、エイチ、（１９８５）イン ・ハンドブック・ボブ・ケミカル・ニューロアナトミイ（エイ、ブヨ−クランド 及びティー、ホクヘルト、編集）４巻４３６−６０８頁エリスピア−、ニューヨ ーク。

３、プレッリング、ダブリュ、ダブリュ、（１９９０）ニューロサイエンス３７ ．１７１−１８５゜ ４、オカダ、クイ１．タニグチ、エイチ、、及びシマダ、シー、（１９７６）サ イエンス１９４．６２０−６２２゜ ５、ガリー、ディー、ジエイ、、アップル、エフ。エム０．ガリー、エム、ジー 、。

及びブレンセン。アール、エル（１９８８）ジャーナル・ボブ・ヒストケミスト リイ・アンド・チトケミストリイ３６．５７３−５８０゜６、ハーソン、エイチ 、ベルトーフイッコ、エム０、メチイス、エム９、ソダー、オウ１、ブレーン、 ニス１、スコグ、ニス１、ホクフエルト、ティー３、及びリッツエン、イー、エ ム、（１９８０）モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジイ、１９．４７ ０１−４７１１゜７、ゴツトリーブ、ディー、アイ１、チャンク、ワイーシー１ 、及びシュボブ、ジエイ、イー　９１８６）プロシーディンゲス・ボブ・ナショ ナル・アカデミイ・ボブ・サイエンス、ニーニスエイ、８３．８８０８−８８１ ２゜８、チャンク、ワイージー、及びゴツトリーブ、ディー、エル、（１９８８ ）ジャーナル・ボブ・ニューロサイエンス８．２１２３−２１３０゜９、シュリ ーン、ジエイーエフ６、サマナ、ビー０、及びマレット、ジエイ、（１９９０） ジャーナル・ボブ・ニューロケミストリイ５４．７０３−７０５゜１０、コバヤ シ、ワイ１、カウフマン、ディー、エル１、及びトビン、エイ、エル。

（１９８７）ジャーナル・ボブ・ニューロサイエンス７．２７６８−２７７２゜ １１、ソリメト、エム１、フォリ、エフ１、デニスードニニ、ニス６、コミ、ジ ー。

シー１、ポザ、ジー１、デカミリ、ビー９、及びビクリ、エイ、エム１、（１９ ８８）二ニー・イングランド・ジャーナル・ボブ・メディシン３１８．１０１２ −１０２０゜ １２、ソリメチ、エム０、フォリ、エフ０、アパリシ、アール０、ポザ、ジー１ 、及びデカミリ、ビー、（１９９０）ニュー・イングランド・ジャーナル・ボブ ・メディシン３２２．１５５５−１５６０゜１３、バーケスコブ、ニス９、ニー ルソン、ジェイ、エイチ、マーナー、ビー　、ビルデ、ティー３、ルドビグソン 、ジェイ０、及びラーンマーク、エイ、（１９８２）ネイチャー２９８．１６７ −１６９゜１４、バーケスコブ、ニス１、アーンストート、エイラーンェイ６、 クリストガラ、ニス１、ラーン、エイ８、ソリメチ、ニス９、カスカルホ、エム １、ホリ、エフ８、リヒターーオルソン、エイチ１、及びデカミリ、ビー、（１ ９９０）ネイチャー３４７．１５１−１５６゜ １５、ジェノゲス、ニス４、カシイディ、ディー１、ポニファシオ、イー１、ボ ッタワ、ジー、エフ、及びクリステイー、エム、アール、（１９９１）ディアブ 。

クリン、レス、プラク、１４（補遺１）、Ｓｌｌ。

１６、クラム、ディー、ニス１、パーネット、エル、ディ９、ヨセフ、ジエイ、 エル、及びハリソン、エル、シー、（１９９１）バイオケミカル・アンド・バイ オフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ１７６．１２３９−１２４４゜ １７、カールソン、エイ、イー３、ハゴビアン、ダブリュ、ゼット０、クルビン 、シー、イー５等（１９９１）プロシーディンゲス・ボブ・ナショナル・アカデ ミイ・ボブ・サイエンス、ニーニスエイ、８８．８３３７−８３４１゜１８、イ ーラング−、エム、ジー１、ティラカラトン、エフ、ジエイ、ケイ１、フェルド プラン、ニス１、ペイトル、エフ、及びトビン、ジェイ、エイ　（１９９１）ニ ューロン７．９１−１００゜ １９、ウルリッチェス、イー１、イエ−、シー、ケイ１、クリツク、エム、エル 。

（１９８６）イムノロシイ５８．１５８−１９０゜２０、サムプルツク、ジエイ ３、フリッシュ、イー、エフ、及びマニアナイス、ティ、（１９８９）イン・モ レキュラー・クローニング、ア・ラボラトリイ・マニュアル、１−３巻コールド ・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ・プレス、コールド・スプリング・ハー バ−、ニューヨーク。

２１、スミス、ディ、ビー９、及びジョンソン、ケイ、ニス、（１９８８）シー ン６７．３１−４０゜ ２２、サンガー、エフ１、ニクルン、ニス１、及びコールソン、エイ、アール、 （１９７７）プロシーディンゲス・ボブ・ナシ３ナル・アカデミイ・ボブ・サイ エンス、ニーニスエイ、７４．５４６３−５４６７゜２３、ホチュリ、イー１、 ハムワース、ダブリス１、ボベリ、エイチ１、ゲンッ、アール及びスタバー、デ ィ、（１９８８）バイオチクノロシイ６．１３２１−１３２５゜ ２４、ハリソン、エル　シー１、デ・アイズブルア、エイチ１、ロウドパリス、 ティー、キャムプベル、アイ、エル　、ケポン、ジエイ、ニス９、タイト、ビー ディー１、ニーマン、ピー、ジー、（１９９１）ダイアベーラ４０．１１２８− １１３３゜ ２５、ハリソン、エル、シー１、チュー、エクス、ニス　、デ・アイズブルア、 エイチ、ジエイ６、グラハム、エム１、ホニイマン、エム、シー８、ニーマン、 ピー、ジー　（１９９２）ジャーナル・ボブ・クリニカル・インベスティゲイシ ョン（印刷中）。

、ト に フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｑ　１１０２　６ ８０７−４Ｂ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ 、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＡＵ、 　ＣＡ、ＪＰ、　ＵＳＩ （７２）発明者　クラム、ディピッド オーストラリア連邦３１３０　ビクトリア、ブラックバーン・サウス、ワグナ− ・ストリート　６番 （７２）発明者　デ・エイズパルア、ヘンリーオーストラリア連邦３１３０　ビ クトリア、ブラックバーン、フランクコム・ストリート６番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）の６７Ｋイソ型に対応するヒト 又はマウスグルタミン酸デカルボキシラーゼを暗号化する配列又はその抗原的に 活性な断片又は誘導体を暗号化するか又はこれに相補性であるヌクレオチド配列 を含む核酸分子。 ２．該ＧＡＤがヒト膵島ＧＡＤ（ＨＩＧＡＤ）である、請求項１の核酸分子。 ３．該ＧＡＤがヒト脳ＧＡＤ（ＨＢＧＡＤ）である、請求項１の核酸分子。 ４．該ＧＡＤがマウス脳ＧＡＤ（ＭＢＧＡＤ）である、請求項１の核酸分子。 ５．分子がデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である、請求項１の核酸分子。 ６．分子が相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）である、請求項１の核酸分子。 ７．該分子が図１及び／又は１１のＨＩＧＡＤのヌクレオチド配列又はその断片 又はそれに相補性の１又はそれ以上の配列を有する、請求項２の核酸分子。 ８．図１及び／又は７のＨＢＧＡＤのヌクレオチド配列又はその断片又はそれに 相補性の１又はそれ以上の配列を有する、請求項３の核酸分子。 ９．該分子が図３のＭＢＧＡＤのヌクレオチド配列又はその断片又はそれに相補 性の１又はそれ以上の配列を有する、請求項４の核酸分子。 １０．該分子がさらにベクターを暗号化するヌクレオチド配列を含む、請求項７ 、８又は９の核酸分子。 １１．該ベクターが発現ベクターである、請求項１０の核酸分子。 １２．該ベクターが１又はそれ以上の細菌、酵母、哺乳動物又は昆虫細胞におい て、複製可能であるか及び／又は発現可能である、請求項１０又は１１の核酸分 子。 １３．哺乳動物細胞がチャイニーズハムスター子宮（ＣＨＯ）細胞系である、請 求項１２の核酸分子。 １４．請求項１０ないし１３のいずれか一つの核酸分子で形質転換した細菌、酵 母、哺乳動物又は昆虫細胞。 １５．ＧＡＤの６７Ｋイソ型の全部又は部分又はその断片の抗原性を表示し、自 己抗体及び／又はＴ細胞と反応性の合成ペプチド又はポリペプチド。 １６．図１又は１１に示されるＨＩＧＡＤ、或いは図１又は７に示されるＨＢＧ ＡＤ或いは図３に示されるＭＢＧＡＤの全部又は部分に対応するアミノ酸配列を 有する請求項１５の合成ペプチド又はポリペプチド。 １７．第一アミノ酸配列に近接する第二アミノ酸配列をさらに含む請求項１６の 合成ペプチド又はポリペプチド。 １８．該第二アミノ酸配列がグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ） 又はその部分を含む、請求項１７の合成ペプチド又はポリペプチド。 １９．該第二アミノ酸配列が１又はそれ以上のヒスチジン残基を含む、請求項１ ７の合成ペプチド又はポリペプチド。 ２０．請求項１の核酸分子により暗号化された合成ペプチド又はポリペプチド。 ２１．試料中のＧＡＤに対する抗体の検出方法であって、方法は、ＧＡＤの６７ Ｋイソ型の全部又は抗原部分に対応するペプチド又はポリペプチドを該試料と、 ペプチド又はポリペプチドとＧＡＤに反応性の抗体との間で複合体を形成するの に十分な時間及び条件下で接触させること、次いで複合体を検出することを含む 。 ２２．試料が血清である、請求項２１の方法。 ２３．ペプチド又はポリペプチドを試料との接触前、中、又は後に固体支持体上 に固定する請求項２１の方法。 ２４．複合体を比色分析、蛍光分析、放射活性又は他の報告者手段（ｒｅｐｏｒ ｔｅｒ　ｍｅａｎｓ）により、又は凝集手段により検定する、請求項２１の方法 。 ２５．ペプチド又はポリペプチドが請求項１５ないし２０のいずれか一つで定義 されたものである、請求項２１の方法。 ２６．抗体が自己抗体である、請求項２１の方法。 ２７．無症候性固体からの試料中の自己抗体のタイターの検出及び／又は測定に よりＩＤＤＭ及びＳＭＳを含んでいる型の疾病を検出するか又は無症候性固体を スクリーニングする方法であって、該方法は該試料をＧＡＤの６７Ｋイソ型の全 ての又は抗原部分に対応するペプチド又はポリペプチドと、ペプチド又はポリペ プチドとＧＡＤに活性な抗体との間で複合体を形成するのに十分な時間及び条件 下に接触させること、次いで複合体及び／又は複合体に結合したペプチド又はポ リペプチドの量を検出することを含む。 ２８．生物学的試料が血清である、請求項２７の方法。 ２９．ペプチド又はポリペプチドを試料との接触前、中又は後に固体支持体に固 定する、請求項２７の方法。 ３０，ペプチド又はポリペプチドが請求項１５ないし２０のいずれか一つで定義 されたものである、請求項２７の方法。 ３１．ＧＡＤに対する自己抗体の検定用診断キットであって、該キットは請求項 １５ないし２０のいずれか一つのペプチド又はポリペプチドを含むように適応さ れる第一区画を区画された形で含む。 ３２．自己抗体について試験すべき試料を含むよう適応される第二容器をさらに 含む、請求項３１のキット。 ３３，それを必要とする患者のＧＡＤに対する自己抗体及び／又は自己反応性Ｔ 細胞を減少させる、及び／又は自己抗原に対する自己反応性Ｔ細胞又は自己抗体 の反応性を除去し又は減ずるために脱感作し又はトレランスを誘導する方法であ って、該方法は、該患者に、ＧＡＤの６７Ｋイソ型の全部又は一部に対応する有 効量の抗原ペプチド又はポリペプチドを投与することを含む。 ３４．紫外光による処置により抗原提示をまず修飾すること、次いでＧＡＤに対 するＴ細胞反応性を示す患者にペプチド又はポリペプチドを皮内に投与すること をさらに含む、請求項３３の方法。 ３５．紫外光がＵＶ−Ｂである、請求項３４の方法。 ３６．Ｔ細胞反応性が抑制されるまでその繰返しをさらに含む、請求項３４又は ３５の方法。 ３７．１又はそれ以上のサイトカインの投与と同時に又はそれに続いてＧＡＤを 皮内に投与する、請求項３３の方法。 ３８．サイトカインがＴＮＦ−α及び／又はＴＮＦ−βである請求項３７の方法 。 ３９．ＧＡＤの６７Ｋイソ型の全部又は部分に対応するペプチド又はポリペプチ ドの有効量が投与量当り０．１μｇないし１００ｍｇである、請求項３３ないし ３８のいずれカ一つの方法。 ４０．有効量が投与量当り１μｇないし１ｍｇである、請求項３９の方法。 ４１．それを必要とする患者のＧＡＤに対する自己抗体及び／又は自己反応性Ｔ 細胞を減少させる、及び／又は自己抗原に対する自己反応性Ｔ細胞又は自己抗体 の反応性を除去し又は減ずるために脱感作し又はトレランスを誘導する方法であ って、該方法は、該患者に、ＧＡＤ反応性Ｔ細胞系又はクローン又は細胞膜及び ／又は該ＧＡＤ反応性Ｔ細胞系又はクローンからの抗原についてのレセプターを 、ＧＡＤ自己抗原に対するＴ細胞応答の阻止及び／又は減少を誘導するための免 疫原として作用するのに十分な時間及び条件下に投与することを含む。 ４２．ＧＡＤ反応性Ｔ細胞系又はクローンを無傷で又は化学的架橋試薬による弱 毒化後用いる請求項４１の方法。 ４３．化学的架橋試薬がグルタルアルデヒド又はバラホルムアルデヒド又は他の 類似の有効試薬を含む請求項４２の方法。 ４４．ＩＤＤＭＧＡＤ自己抗原に対する患者の細胞の反応性を測定する方法であ って、該方法はＧＡＤの６７Ｋイソ型に対応するペプチド又はポリペプチド又は その抗原断片又は誘導体を該患者からの細胞試料と、適当な時間及び適当な時間 、接触させること及びペプチド又はポリペプチドに対する該細胞の反応性を測定 することを含む。 ４５．細胞試料を抹消血液から、又は組織バイオプシーから誘導する、請求項４ ４の方法。 ４６．反応性を可溶性因子の発現又は増殖検定により測定する、請求項４４又は ４５の方法。 ４７．可溶性因子がサイトカインを含む、請求項４６の方法。 ４８．ペプチド又はポリペプチドが請求項１５ないし２０のいずれか一つで定義 されるものである、請求項４４の方法。 ４９．細胞がＴ細胞である、請求項４４の方法。