JPH06505632A - 熱安定性プルラナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 熱安定性プルラナーゼ レスから得られる新規な熱安定性のプルラナーゼ並びにそれらの酵素の製造方法 に関する。

本発明は又、デンプン変換方法におけるプルラナーゼの使用および糖化プロセス にも関する。

背景技術 熱安定性プルラナーゼは公知であり、例えばバシラスアシドプルリティカスから 単離されており、そして工業的糖化プロセスにおけるそれらの使用は、例えばヨ ーロッパ特許公開公報６３．９０９に記載されている。より熱安定性の酵素に対 する要求に応じるため、調査が継続されており、そして本発明の目的は改善され た熱安定性を有する新規なプルラナーゼを提供することにある。

発明の開示 本発明者らは驚くべき熱安定性を有する新規なプルラナーゼを産生ずる微生物を 単離した。

従って、本発明は、以下の事項を有することを特徴とするプルラナーゼを提供す る ８０〜９０℃の範囲内に最適温度； ５〜７の範囲内に最適ｐＨ値； ｐＨ６，０で２４時間インキュベーション後に少なくとも６０％の残留活性、好 ましくは少な（とも８０％の残留活性；菌株フェルビドバクテリウムＳｐ、Ｖａ ｎ　５　、　０５Ｍ６２０４由来のプルラナーゼの免疫化学的性質と同一もしく は部分的同一の免疫化学的性質。

他の面において、本発明は、プルラナーゼの製造方法を提供し、この方法は、嫌 気性条件のもと、炭素および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養培地中で サーモトガレスのプルラナーゼ生産菌株を培養し、引き続き所望の酵素を回収す ることを含んでなる。

他の面において、本発明は、組換え体プルラナーゼの製造方法を提供するもので あり、この方法は、プルラナーゼをコードするＤＮＡ断片を単離し、ＤＮＡフラ グメントを、適当なプラスミドベクター中の適当な発現シグナルと組合せ、自己 複製型プラスミドとしてプラスミドベクターを適当な宿主に導入するか、又は染 色体に組込み、嫌気性条件のもと適当な栄養培地中で宿主生物を培養しプルラナ ーゼを発現せしめ次いでプルラナーゼを培地から回収することを含んでなる。

更に別の面において、本発明は液化デンプンの糖化のためプルラナーゼの使用に 関し、更に本発明は、デンプンを、グルコースおよび／又はマルトース含有シロ ップに変換する方法を提供し、この方法はプルラナーゼ並びにグルコアミラーゼ 、α−グルコシダーゼ、β−アミラーゼ、又は他の糖化酵素から成る群から選ば れる１種又はそれ以上の酵素の存在下、デンプン加水分解物の糖化を行うことを 含んでなる。

図面の簡単な説明 （％）を示す；最適温度の測定に対しインキュベーションにおいて性（％）を示 す、最適ｐＨの測定に対し全体にわたって１．８Ｕ’／ｄを用いた。

図２は、プルラン（Ｆｉｇ、　２　Ａ　）　、分枝鎖を有するオリゴ糖（Ｆｉｇ 。

２Ｂ）およびアミロース（Ｆｉｇ、　２　Ｃ）のそれぞれの分解中、本発明のプ ルラナーゼの作用によって放出された糖の分析を示す、左側はプルラナーゼなし 、右側は８０℃で８時間インキュベージテン後を示し、０．２５Ｕ／ｍがインキ ュベーション中に用いられた。

図３は、デンプンおよび金属イオン（３Ａ、０〜２４時間；３Ｂ。

０〜１時間）の不存在下、７０°Ｃ（■）、８０℃（◆）、および９０℃（ロ） で、ｐＨ６，０でのプルラナーゼの熱安定性を示す、熱安定性の調査のために用 いたプルラナーゼ溶液の初期活性は６．５Ｕ／ｄであった。

図４は、５ｍＭのＣａＣ１ｚ（◆）、１％のデンプン（■）、５ｍＭの（ａｃｌ ｚおよび１％のデンプン（◇）の存在下、および金属イオン又はデンプン（ロ） なしで（４Ａ、０〜４８時間；４Ｂ、６〜１時間）　、ｐＨ４５および８０°Ｃ でプルラナーゼの熱安定性を示す、熱安定性の調査に用いたプルラナーゼ溶液の 初期活性は６．５Ｕ／ａｔであった。

図５は、ＮＣＩＭＢ漱４０３２０でＥ、コリー菌株５Ｊ９８９における、１９９ ０年９月２６日に寄託されたプラスミドｐＳＪ９３３の制限地図を示す。

図６〜７は、本発明のプルラナーゼ（Ｆｉｇ、　６　）およびバシラスプルラナ ーゼ（Ｐｒｏｍｏｚｙｓ＋ｅ（登録商標）、図７）によるそれぞれのプルランの 加水分解から、１，２，４．６．２４および４８時間のインキュベーション後に 得られたクロマトグラムを示す。

発明の詳細な説明 本発明は、嫌気性微生物サーモトガレス、好ましくはフエルビドバクテリウム属 の菌株、最も好ましくはフェルビドバクテリウムＳｐ、Ｖｅｎ５　（寄託者の識 別記号）から得ることのできる新規なプルリティック（ｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃ） 酵素を提供する。本発明のプルリティック酵素は、菌株フェルビドバクテリウム Ｓｐ、　Ｖｅｎ５がら得ることのできるプルラナーゼの免疫化学的性質と同一も しくは部分的同一の免疫化学的性質を有する。

菌株フェルビドバクテリウムＳｐ、　Ｖｅｎ　５は、特許の目的のためブタヘス ト条約に従い、ドイツチェ　ザンムルク　フォノ　マイクロオルガニスメンに１ ９９０年４月２５日に、寄託番号ＤＳＭ６２０４をもって本発明者らによって寄 託された。

酵素変異体又は突然変異酵素とは、親遺伝子又はその誘導体のＤＮＡヌクレオシ ド配列の変更によって得ることのできる酵素を意味する。酵素変異体又は突然変 異酵素は、酵素をコードするＤＮＡヌクレオシド配列を適当な宿主生物内の適当 なベクター内に挿入する時、発現されそして製造される。宿主生物は、親遺伝子 が発生する生物と必ずしも同一では°ない。酵素変異体又は突然変異酵素は、機 能的に親酵素と等価と理解される。

本発明の酵素は、デンプンを種々の糖に工業的に変換するため、他の酵素と組合 わせてデンプン変換プロセスにおいて使用価値がある０本発明のプルリティック 酵素は、次の特徴を有する。

■屋上！豊血！ プルラナーゼは、４５°Ｃ未満がら１００″Ｃ超まで活性であり、最適温度を７ ５〜９０°Ｃの範囲内に、より好ましくは８０〜９０”Ｃの範囲内、８５°Ｃ付 近に有する（Ｆｉｇ、　Ｉ　Ａ）に示す如し）。

プルラナーゼは、ｐＨ約３．５からｐＨ８超まで活性であり、相当広い最適ＰＲ をｐＨ４，５からｐＨ８超までに有し、より好ましくはｐＨ５〜７の範囲に有す る（Ｆｉｇ、ｌ　Ｂ参照）。

プルラナーゼは、２４時間のインキュベーション後、７０″ＣでかつｐＨ６，０ で６０％以上（相対）、より好ましくは８０％（相対）の残留活性を示す（Ｆｉ ｌ、３　Ａに示す如し）　、　Ｆｉｇ、３　Ｂに示すように、プルラナーゼは８ ０°ＣおよびｐＨ６，０で１時間インキュベージラン後、４０％以上（相対的） 、より好ましくは６０％以上の残留活性を示す。

プルランは、エンドグリコリティカリ−（ｅｎｄｏｇｌｙｃｏｌｙｔｉｃａｌｌ ｙ）に分解されそして本発明のプルラナーゼによって、α−１，６結合でのみ分 解される。プルラナーゼの作用パターンは、ランダムなエンド攻撃が典型的であ る。デンプンおよびアミロースは、プルラナーゼによっては殆ど攻撃されない。

免ＪｕｌＩ壇１！ 本発明のプルラナーゼは、フェルビドバクテリウムＳｐ、Ｖｅｎ５゜０３Ｍ６２ ０４から由来するプルラナーゼの免疫化学的性質と同−又は部分的同一の免疫化 学的性質を有する。

免疫化学的性質は、免疫学的交差反応同一性試験によって測定できる。同一性試 験は、周知のオウタロニー二重免疫拡散手法により、又はアケルセンＮ、Ｈ，に よる縦に並んだ交差免疫電気泳動（Ｈａｎｄｂｏｏｋｏｆ　Ｉａｍｕｎｏｐｒｅ ｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ−ｉｎ−Ｇｅｌ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　；ブラックウェ ル　サイエンティフィック　パブリケーシタン（１９８３）、　５章および１４ 章）により行うことができる０語句「抗原の同一性」およびｒ部分的抗原の同一 性」は同書、５章、１９章および２０章に記載されている。

単一特異性抗血清は、上記の方法に従い、家兎を本発明の精製プルラナーゼで免 疫することによって生じる。免疫源をフロインドアジュバントと混合し次いで２ 週間毎に家兎に皮下注射する。抗血清を合計８週間のイムーニゼーシッン（ｉｍ ａ＋ｕ−ｎｉｚａｔｉｏｎ）後に得、そして免疫グロブリンをアヶルセンＮ、Ｈ ，（上記）によって記載される如くそこから調製する。

ブル−　−ゼの蕾 本発明のプルラナーゼは、炭素および窒素並びに無機塩を含む適当な栄養培地中 、サーモトガレスのプルラナーゼ生産菌株を培養し、引続き当業者に公知の方法 により所望の酵素を回収することにより調製できる。

好ましくは、プルラナーゼはフェルビドバクテリウムのプルラナーゼ生産菌株、 より好ましくは菌株フェルビドバクテリウムＳｐ、Ｖｅｎ５、又はその突然変異 体もしくは変異体を培養することにより調製される。

別の方法として、プルラナーゼは当業者に自体公知の方法により、組換えＤＮＡ 手法により生産できる、すなわちＤＮＡフラグメントを、適当なプラスミドベク ター中の適当な発現シグナルと組合せ、自己複製型プラスミドとしてプラスミド ベクターを適当な宿主（すなわち、エシェリキアコリ、又はバシラス属の員、例 えばＢ、レングス、Ｂ、ズブチリス、Ｂ、リケニホルミスおよびＢ、アミロリヶ ファシエンス、アスペルギルス、又はストレプトマイセス）に導入するか、又は 染色体に組込み、プルラナーゼを発現せしめる条件の下で宿主を培養し、次いで 培地からプルラナーゼを回収する。

プルラナーゼをコードするＤＮＡフラグメントは、フエルビドバクテリウム菌株 、好ましくは菌株フェルビドバクテリウムＳｐ、Ｖｅｎ　５　＋ＤＳ？ｌ６２０ ４　、又はそれらの突Ｐ８変異株又りよ変異株から単離できる。

好ましくは、宿主生物は、エシェリキアコリ、又はバシラス属、アスペルギルス 属又はストレプトマイセス属の構成員である。

より好ましい態様において、プラスミドはｐＳＪ９３３．　ｐＢＲ３２２又はｐ ＡｃＹｃ１７７又はそれらの誘導体であり、宿主生物はＥ、コリである。

他ノ特異的態様ニオイテ、７’　ラスミＩ’　ハＰｔ１Ｂ１１０．　ｐＨ１９５ ，ｐＡＪ９１、又はｐｃ１９４、又はそれらの誘導体であり、宿主生物はバシラ スＳＰ。

好ましくはＢ、ズブチリス、Ｂ、リケニホルミス、Ｂ、アミロリヶファシェンス 又はＢ、レングスである。

−ンプン゛　プロセス 秀れた熱安定性と基質特異性を有する、技切り酵素であるので、本発明のプルラ ナーゼはデンプン変換プロセスに於て使用価値がある。

本発明のプルラナーゼは、液化デンプンをグルコースまたはマルトースに糖化す るための糖化酵素と共に使用できる。

糖化プロセスは、常法により行うことができそして本質的に例えば米国特許３， ９１２，５９０、ヨーロッパ特許公開公報第２５２．７３０および６３．９０９ 、並びに国際特許出［１１０９０／１１３５２　ニ記載されテいる。好ましい酵 素用量は、乾燥物質１ｚ当たり１〜１００μｇのプルラナーゼの範囲内であり、 より好ましくはＩｇの乾燥物質当たり１〜５０ｕｇである。適当な糖化条件は、 ＰＨ４，５〜７および５５〜７０’Ｃである。

本発明を更に次の実施例により説明するが、これは本発明の範囲を制限するもの ではない。

例１ １υ１■ 菌株ＤＳＭ６２０４を、下記の成分（１２当たり）の培地（デンプン複合培地） 中、Ｎ、／ｃｏｗ（８０：　２０）で連続的に通気しながら６０″Ｃで培養した ： に、ｕｐｏａ　１．６　ｇ ＮａＨｘＰＯ，Ｘ２ＨｚＯ１，Ｏｇ （ＮＨａ）　！ＳＯ４０，８ｇ ＮＨ４Ｃ１０，６ｇ トリプトン　１．０　ｇ 酵母抽出液　１．０ｇ ププトン　ｌ・０ｇ Ｍｇ５Ｏｉ　Ｘ　７　ＨｚＯＯ，４ｇ ＣａＣｌｚ　ｘ２１ｈ０　０．２ｇ 微量元素の溶液５ＬＩＩ　１．Ｏ＋ｄ ビタミン溶液”　（１０−ｆｏｌｄ）　２．０ｍ可溶性デンプン”　２．５　ｇ レゲズリン　１．０ｍｇ ＮａｔＳＸ　９ＨｚＯ０，５ｇ ＮａＨＣＯｓ　１．Ｏｇ 水を加えて１０００ｍとする ｐＨ：　６．８−７．０ ＊）ウオウン等（１８６４，Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。

８７、　ｐ９９３−９９８）によるビタミン溶液＊傘）フル力由来の可溶性デン プン 培地をＮ！／Ｃｏ！（８０：　２０）のもと嫌気的に調製した。ＣａＣ１ｚ　’ 　２　ＨｚＯ。

ＮａｔＳ・９Ｈ２０およびＮａＨＣＯｚを窒素雰囲気下別個にオートクレーブ処 理した。培地に添加する前にＮａ、Ｓ−溶液をｐＦ１７．ｏに調節した。

増殖中、アミロ分解およびプル分解活性光学密度、ｐＨおよび残留デンプン濃度 を測定した。２０時間の増殖後、２０　Ｕ　／　ｆのアミラーゼおよび２０Ｕ／ ｆｆｉのプルラナーゼを細胞のない上澄み中に検出した。

プルラナーゼ・　のための　法 プルラナーゼ活性を、８５°ＣでかつｐＨ６，０でプルランとインキュベーシヨ ンする間に遊離した還元糖の量を決定することにより測定した。プルラナーゼＩ Ｕの活性を、標準としてマルトースを用い１分当たり１μ１ｌＯ１の還元糖を遊 離する酵素の量として定義した。酵素反応は、５０■Ｈのナトリウム−ホスフェ ート緩衝液（ｐＨ６，０）中で行い、基質の濃度は０．５％（ｗ／ｖ）であった 。

５０μｌの酵素溶液を２００ａｌｌの基質溶液に添加することにより反応混合物 を調製した。混合物を８５°Ｃで５分間インキュベートし、冷却し次いで２．５ ＋ｄの水で希釈した。インキュベージ９ン中、２５０μ２のジニトロサリチル酸 試剤（すなわち、ジニトロサリチル酸１ｇ、２　Ｎ　ＮａＯＨ２０ｍ、Ｋ−Ｎａ −タートレートｘ４ｎ、０３０ｇおよび希釈水Ｌｏｏｍ）を添加した。

インキユベートされなかった混合物に対し、５４６ｎｍで光学密度を測定した。

種々のインキュベージ９ン中で眉いた酵素溶液の活性は次の通りであった： １）最適温度（Ｆｉｇ、　Ｉ　Ａ）　１．２　Ｕ／ｄ１２）最適ｐＨ（Ｐｉｇ、 　Ｉ　Ｂ　）　１．８　Ｕ／１ｄ３）プルラン、分枝少糖類および アミロースの分野（Ｆｉｇ、　２　）　０．２５　Ｕ　／ａｆ４）熱安定性の調 査のために用いた プルラナーゼの初期活性（Ｆｔｇ、　３〜４）　６．５Ｕ／ｄ５）種々のグルコ ースポリマーに対するルラナーゼの活性　２．５　Ｕ／ｄ ６）プルラナーゼの活性に間する金属イオン、シクロデキストリンおよびグルコ ース ポリマーノ影響（表３）　１．ＯＵ／ｄ阻害剤の濃度は次の如くであった： 金属イオンおよびシクロデキストリン　５ｍＭグルコースポリマー　〇、ＯＳ％ 例２ 例１に従って得られた４０ｊ！の細胞の無い上澄みを２００倍に濃縮し、５０ｍ Ｍのナトリウムホスフェート（２日７．５）に対し透析し次いでＱ−セファロー スを用いイオン交換クロマトグラフィー法により分離した。

プルラナーゼはカラムに結合しなかったが、緩衝液で洗浄中に溶出した。

プル分解（ｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃ）活性を有する分画を集め、濃縮し次いで旧ロ ード１６／６０スーパデックス２００カラムを用いゲル濾過により分離した。こ の手順の後、プルラナーゼはアミラーゼがなくそしてプルラナーゼの非特異的反 応の故に非常に低いアミロ分解活性のみが検出できた。

（Ｎｉ１．）　！５０４−グレージエント（１，５Ｍ〜６Ｍ）を減少させながら 、フェニル−スーパーロースを用い疎水性クロマトグラフィー法により更に精製 を行った。

精製中のプルラナーゼの回収を以下の表１に示す。

のプルー　−ゼの 濃度　１３０　２２６　１．７　１００この手順の後、プルラナーゼの比活性は 約１００Ｕ／ｍｇに達しそして大抵の実験は上記の方法で精製された酵素を用い て行なわれた。

調製用ゲル電気泳動および５Ｏ５−ゲル電気泳動により同質性まで精製された酵 素は、分子量７８．０ＯＯＤを有する唯一の帯を表わした。

この分離中、プルラナーゼの低安定性のため、比活性は８Ｕ／ｓｇに減少した。

例３ 豊引巳む」１■ 例２に従うで得られた精製プルラナーゼは、例１に記載したプルラナーゼ活性の 分析方法を用い特性記述に委ねた。

′　Ｈおよび　。

図ＩＡに示すように、プルラナーゼは４５℃未満から１００℃超までの温度で活 性であり、７５〜９０°Ｃの範囲内に、より好ましくは８０〜９０℃の範囲内、 約８５℃（ｐＨ６，０で）にその最適温度を有する。

図ＩＢに示すように、プルラナーゼは１）Ｆｌ約３．５からｐＨ８超まで活性で あり、ｐＨ４，５からｐ［１８超、より好ましくはｐ［１５〜７（８５℃で）の 範囲内にむしろ幅広い最適ｐＨを有する。

玉！豊ｌ性 プルラナーゼを種々のグルコースポリマー、例えばデンプン、プルラン、分枝オ リゴ糖、アミロースおよびグリコーゲンとインキュベートした０表２に示すよう に、酵素は基質としてプルランに関し最高の活性を示しそしてもしも分枝オリゴ 糖とインキュベートした場合５０％のプル分解活性が検出された。デンプンとア ミロースは殆ど未攻撃のま−残り、わずか５〜１０％のプル分解活性がこれらの 基質について見出された。高分技サツカリドグリコーゲンは分解されなかった。

Ｕ 々のグルコースポリマーに１　るプルー　−ゼゞ基　質　活性（％） プルラン　１００ 分技オリゴ糖　４１ プルラン、分枝オリゴ糖およびアミロースの分解中放出された糖の分析は、プル ランがエンド型でグルコース分解されそしてα−１−１，６−結合（図２に示す 如く）でのみ分解されることを示した。

また、分枝オリゴ糖はそれらの分枝点でのみ攻撃されそして放出された直鎖オリ ゴマーは添加されたα−グルコシダーゼによりグルコースに容易に分解された。

アミロースは殆ど未攻撃のま−で残った。

プル　２　に　る　イオン　シクロ−゛キス　ｉン゛よびグルコースボブマーの ≦ プルラナーゼの活性に関する金属イオン、シクロデキストリンおよび種々のグル コースポリマーの影響を調べるため、精製した酵素を５■Ｈまでの金属イオンの 存在下、０．５％のプルラン溶液（ｐＨ６，０）とインキュベートした。アミロ ース、デンプン、グリコーゲン、プルランおよび分枝オリゴ糖を０．０５％まで の濃度で添加した。

以下の表３に示すように、カルシウム、マグネシウム、モリブデンイオンおよび ＥＤＴＡはプル分解活性に影響を与えなかった。コバルトとニッケルイオン並び にα−シクロデキストリンの添加は、酵素活性をわずかに減少させそして５霞Ｈ の銅、亜鉛およびクロメートイオン又はβ−シクロデキストリンの存在下、プル ラナーゼは完全に阻害された。

驚くべきことに、アミロースおよびデンプンの添加はプルラナーゼに影響を与え ずそしてもしも０．０５％のこのポリマーを添加すると約２０〜３０％の初期活 性が見出された。

Ｊ− プルラナーゼ活性に関する金属イオン、シクロデキストリンおよびグルコースポ リマーのＩ 阻害剤　活性（％） Ｎｏｎｅ　１００ ｕＳＯ４０ ＺｎＳＯａ　８ ＥＤＴＡ　１００ α−シクロデキストリン　５７ 値は、０．０５％グルコースポリマーの５１℃Ｍ金属イオンの存在下、プル分散 活性を示す。

１、ＯＵ／＋ｄのプルラナーゼ活性がインキュベーシツン中に用いられた。

な活性の損失がなく、基質および金属イオンの不存在下、７０℃で２４時間ｐＨ ６，０でインキュベートできた（Ｆｉｇ、　３　Ａ　（■）参照）。

８０℃でインキュベーション中、わずか約１０％の初期活性が同じ期間後に検出 された（Ｆｉｇ、　３　Ａ　（◆）参照）、９０℃で酵素は１５分以内に失活し た（Ｆｉｇ、　３１３　（ロ）参照）。

デンプン糖化プロセスにおいて支配する条件のもと、熱安定性を調べるため、酵 素をまたデンプンとカルシウムイオンの存在下、８０℃でかつ＋）［１４，５で インキュベートした（Ｆｉｇ、　４参照）。

カルシウムイオンとデンプンの双方は、熱安定性を著るしく増加せしめたが、純 粋な酵素の活性は減少した。デンプンと金属イオンの不存在下、酵素は１０分間 のインキュベーション中に完全に失活した。５■阿のカルシウムの存在下、失活 はよりゆるやかであり、３０分後５０％の初期活性が検出された。デンプンの添 加は熱安定性を著るしく増加させたが、最初のプル分解活性はデンプンなしのサ ンプルの２０％までに減少した。

最高の安定性は、カルシウムイオンとデンプンの双方の存在下で観察された。こ れらの条件の下、プルラナーゼは２４時間安定であった。

例４ フエルビドバクーリウム）゛のブルー　−ゼ゛　−のクローニングフエルビドバ クテリウムＳｐ、　Ｖｅｎ５．　（ＤＳＭ）６２０４）染色体ＤＮＡをピッチエ ル等（（１９８９）　；Ｌｅｔｔ、　Ａｐｐｌ、　Ｍｔｃｒｏｂｉｏｌ、、　８ ．１５１−１５６）に従って単離し次いで５ａｕ３Ａで部分的に消化した。１０ ０Ｉ！ｇのフェルビドバクテリウムＤＮＡを２０単位の５ａｕ３Ａで１０分間３ ７℃で消化した。

消化はフェノール：クロロホルム抽出により終了しそしてＤＮＡをエタノール沈 殿せしめた。

連結反応を、染色体ＤＮＡ対ｐｓＪ９３３　（Ｂａ１１８１により消化しそして より大きな５．８ｋｂの断片を単離した）を１対３の割合で用い、４ＮｇのＤＮ Ａ／１０ｕｆｆｉを用いそして２単位のＴ４リガーゼを添加し次いで室温（２５ ℃）で４時間インキュベートすることによって行った。プラスミドｐＳＪ９３３ を、Ｅ、コリー株５Ｊ９８９において、ブダペスト条約に従い１９９０年９月２ ６日にナシッナルコレクション　オブ　インダストリアル　アンド　マリンバク テリアＬｔｄ、（２３ストリート、マーカル　ドライブ、アバディーンＡＨ２１ ＲＹ、スコツトランド、Ｕ）［）に受託番号ＮＧＩＭＢ４０３２０のもとで寄託 した。プラスミドの制限地図を図５に示す。

Ｅ、コリー株ＭＣ１００Ｏを連結したＤＮＡで形質転換し次いでルリアブロスお よび１０ｇｇ／−のクロラムフェニコールを含有する２％寒天上にプレートし、 更に３７℃でインキュベートした。１６時間インキュベーションした後、約１４ ，０００個のクロラムフェニコール耐性コロニーがプレート上で観察された。こ れらのコロニーを、２％寒天、６Ｎｇ／ｍのクロラムフェニコールおよび０．１ ％の染色プルランを含有する新しいセットのルリアブロスプレートにレプリカプ レートし、次いで一夜増殖させた。

（染色したプルラン：５０ｇのプルラン（ハカシバラ　バイオケミカル　ラボラ トリーズ）および５ｇのシバのクロムロットＢ（チバガイギー）を０．５ＭのＮ ａＯＨ５００ｉｄ中に県懸させる）次いで混合物を室温で１６時間定速撹拌しな がらインキュベートする。　ｐＨを４ＮのＨ，ＳＯ４で７．０に調節する。しか る後、染色したプルランを遠心分離により集め、次いでプルランを蒸留水で３回 洗浄し、適当量の蒸留水に県懸させる。） 次いでプレートを６０℃で４時間インキュベートし、コロニーの１個の周囲に輪 が表われ、これは染色したプルランの消化に由来する。

ルリアブロスプレートの第一のセット上の対応するコロニーを単離し次いでプラ スミド含有量に対し分析した。

単離したコロニーＰＬ２１２５を１０−のルリアブロス内で増殖し、プラスミド をモーゼル等（Ｐｌａ＝ａｉｄ　１２　：　１９　（１９８４））に記載の方法 で単離した。プラスミドを制限地図により分析し、そしてフェルビドバクテリウ ムＤＮＡの挿入が約４．５ｋｂを示した。

例５ プルランの　” 例２に従って得られたプルラナーゼに関し、次の実験を行い、そして商業的に入 手できるバシラスブルラナーゼ調製品（プロモザイム（Ｐｒｏｍｏｚｙｍｅ）　 （登録商標）、ノボ　ノルディスクＡ／Ｓ、デンマーク）と比較した。

プルランは、１．６−α結合によって結合されたアルドトリオシル単位から本質 的に成っている直ｔＩＤ−グルコースポリマーである。

エンド−プルラナーゼは、１，６−α結合をラムダムに加水分解し、そして加水 分解された結合の数は修正ソモギーネルソン洗を用い還元炭素化物をして測定さ れる。

１プルラナ一ゼ単位（ＰＵＮ）は、標準条件下（すなわち、４０’Ｃ；ｐＨ５， ０；３０分の反応時間；そして基質として０．２％のプルランに関する）、毎分 １ｔＩＩｌｏｌのグルコースに相当する還元力を有する還元炭水化物を放出して 、プルランを加水分解する酵素の量として定義される。この分析方法を記載する 印刷物ＡＦＬ９％は要求によりノボ　ノルディスクＡＳ（デンマーク国）から入 手可能であり、この印刷物は参考のための本明細書に加えられている。

プルー２の　” ５．０ｇノフルラン（ハヤシハラｐｓｓ２ｏ８１８）を、１００ｉｄ１７１０． ０５ｄの０．０５Ｍ、　ｐＨ５，０のシトレート緩衝液に溶解することにより、 プルランの基質を調製した。

加水分解は、スクリューキャブを備え、５０℃の振とぅ浴に入れた５０ａｄのフ ラスコ中で行った。

酵素は乾燥物１ｉ　（ＤＳ）を基準にして用い、ｌ　ＰＵＮ／　ｇ　ＤＳ、そし てＨＰＬｅ分析から次の結果を得た（ＤＰ、重合の程度）：プロモザイム　１　 ７．０　９３．０ （ＩＰＵＮ／　ｇ　ＤＳ）　２　７．９　９２．１２４　０．３　１７．８　８ ２．０ ４８　０．５　１８．０　８１．５ ２　１２．８　８７．２ プルラナーゼ　６　２１．３　７８．７（ＩＰＵＮ／ｇＤＳ）　２４　０．５　 ５７．４　４２．１４８　０．９　７６．２　２２．９ サンプルをＧＰＣ分析に供した。得られたクロマトグラムを図６〜７に示す。

加水分解の初期の階段で、マルトトリオース並びにヌルトトリオースの一連の１ ．　６−ｃｘ結合オリゴマーが見出された０作用パターンはラムダムなエンド攻 撃の典形である。比例してより多くのマルトトリオースが本発明の酵素により生 じた。

温度 Ｈ Ｆｌｇ、　２Ｃ 時間（ｈ） 時間（ｈ） １時間　２時間　４時間 ６時間　２４時間　４８時間 Ｆｉｇ、　６ １時間　２時間　４時間 ６時間　２４時間　４８時間 Ｆｉｇ、　７ 補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成５年Ｓ月Ｉ日

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. １．以下の（ａ）〜（ｄ）を有することを特徴とするプルラナーゼ： （ａ）８０〜９０℃の範囲内に最適温度；（ｂ）５〜７の範囲内に最適ｐＨ値； （ｃ）ｐＨ６．０で２４時間インキュベーション後に少なくとも６０％の残留活 性、好ましくは少なくとも８０％の残留活性；（ｄ）菌株フェルビドバクテリウ ムＳｐ．Ｖｅｎ５，ＤＳＭ６２０４由来のプルラナーゼの免疫化学的性質と同一 もしくは部分的同一の免疫化学的性質。
2. ２．サーモトガレス菌株から由来する、請求の範囲第１項記載のプルラナーゼ。
3. ３．フェルビドバクテリウム菌株、好ましくは菌株フェルビドバクテリウムＳｐ ．Ｖｅｎ５，ＤＳＭ６２０４から由来する、請求の範囲第２項記載のプルラナー ゼ。
4. ４．請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のプルラナーゼの製造方法であって 、嫌気性条件のもと、炭素および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養培地 中でサーモトガレスのプルラナーゼ生産菌株を培養し、引き続き所望の酵素を回 収することを含んでなる、前記方法。
5. ５．フェルビドバクテリウム、好ましくは菌株フェルビドバクテリウムＳｐ．Ｖ ｅｎ５，ＤＳＭ６２０４、又はそれらの突然変異体もしくは変異体を培養する、 請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．窒素および／又は炭酸ガスを通気しつつ５０〜７０℃で培養する、請求の範 囲第４又は第５項記載の方法。
7. ７．請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のプルラナーゼの製造方法であって 、プルラナーゼをコードするＤＮＡ断片を単離し、ＤＮＡフラグメントを、適当 なプラスミドベクター中の適当な発現シグナルと組合せ、自己複製型プラスミド としてプラスミドベクターを適当な宿主に導入するか、又は染色体に組込み、嫌 気性条件のもと適当な栄養培地中で宿主生物を培養しプルラナーゼを発現せしめ 次いでプルラナーゼを培地から回収することを含んでなる、前記方法。
8. ８．プルラナーゼをコードするＤＮＡフラグメントを、フェルビドバクテリウム 菌株、好ましくは菌株フェルビドバクテリウムＳｐ．Ｖｅｎ５，ＤＳＭ６２０４ 、又は突然変異体もしくはそれらの変異体から単離する、請求の範囲第７項記載 の方法。
9. ９．宿主生物が、エシェリキアコリー、又はバシラス属、アスペルギルフ属、又 はストレプトマイセス属の構成員である、請求の範囲第７又は第８項記載の方法 。
10. １０．プラスミドがｐＳＪ９３３，ｐＢＲ３２２又はｐＡＣＹＣ１７７又はそれ らの誘導体であり、宿主生物がＥ．コリーである、請求の範囲第７〜９項のいず れかに記載の方法。
11. １１．プラスミドがｐＵＢ１１０，ｐＥ１９５，ｐＡＭβ１又はｐＣ１９４、又 はそれらの誘導体であり、宿主生物がバシラスＳＰ．である、請求の範囲第７〜 ９項のいずれかに記載の方法。
12. １２．宿主生物が、Ｂ．ズブチリス、Ｂ．リケニホルミス、Ｂ．アミロリケファ シエンス又はＢ．レンタスである、請求の範囲第１１項記載の方法。
13. １３．液化デンプンの糖化用に対する、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載 のプルラナーゼの使用。
14. １４．デンプンを、グルコールおよび／又はマルトース含有シロップに変換する 方法であって、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のプルラナーゼ並びにグ ルコアミラーゼ、ａ−グルコシダーゼ、β−アミラーゼ、又は他の糖化酵素から 成る群から選ばれる１種又はそれ以上の酵素の存在下、デンプン加水分解物の糖 化を行うことを含んでなる、前記方法。
15. １５．糖化を、ｐＨ４．０〜６．０および６０〜８０℃の温度で行い、プルラナ ーゼ用量が１ｇの乾燥物質当たり１〜１００μｇである、請求の範囲第１４項記 載の方法。