JPH06506108A - ヘムタンパク質を製造するための方法 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 明細書 ヘムタンパク質を製造するための方法 発明の分野 本発明は糸状菌類において異種ヘムタンパク質を製造するための方法に関する。

発明の背景 細菌における様々なヘムタンパク質のクローニング及び発現は既に述べられてい る。即ち、Ｓ、Ａ、０ｒｔｌｅｐｐ　ら、Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎ、　１１．１９ ８９、頁３５３−３６４にはＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）における西洋ワサビペル オキシダーゼの発現及び特性化が述べられている。この酵素は不溶性凝集物とし て細胞内で発現され、従ってこれは溶解せしめた細胞から精製しなくてはならな い、更に、この酵素は活性状態において発現されず、従って機能性となるために ヘム及びＣａ”の存在下において別々に折りたたまれねばならない、同様に、Ａ 、Ｔ、５ｓｉｔｈ　ら、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋＊。

■（２２）、１９９０、頁１３３３５−１３３４３に、Ｅ、コリにおける西洋ワ サビペルオキシダーゼの発現が述べられている。この組換酵素は天然の西洋ワサ ビペルオキシダーゼＣよりも弱い活性を有し、そして２〜３％の収率（精製され た活性酵素）で製造されている。Ｓ、Ｌｏｐｒａｓｅｒｔら、Ｊ、Ｂと匹、１７ １（９）　、１９８９、頁４８７１−４８７５には、バチルス　五±アロサーモ フィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｗｏ　ｈｉｌｕｓ）由来の ペルオキシダーゼＡのＥ、コリにおけるクローニング及び発現が報告されている 。　Ｓ、Ｊ、Ｈｏｆｆ５ａｎ　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｌ ＩＳＡ　８７、頁８５２１−８５２５には、［、，１１Ｊにおける機能性ヒトヘ モグロビンの発現が述べられている。　ｌＪｔａｎｇら、Ｊ、Ｂｉｏｔｅｃｈ、 １３，１９９０、頁１３１−１４４には、五トレプトマイシス　−リ］Ｊ午二」 ？ニー≧’Ｘ　（Ｓｔｒｅ　ｔｏｗ　ｃｅｓ　ｌ１ｖｉｄａｎｓ）におけ肛■） 由来のりゲニンペルオキシダーゼのクローニング及び発現が述べられている。

酵母（ｌ三１≧４’ｉＸ　セレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｗ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅ ｖｉ−紅憇］）におけるヒトヘモグロビンの発現はＭＪａｇｅｎｂａｃｈら、Ｂ ｉｏ／Ｔｅｃｈ匹圏■　エ、１９９１、頁５７−６１に述べられている。酵母に おいて、ヘモグロビンは完全に集成したヘム含有四量体として発現される。

しかしながら、このタンパク質は酵母細胞から分泌されず、細胞質空間の中に残 り、従ってそれより精製されねばならない。

従って、ヘムタンパク質を生産することができるだけでなく、それらも活性状態 において細胞膜を通過輸送せしめて精製手順を簡単にする宿主生物、例えば糸状 菌類を選ぶことが有利であろう。

近年、アスペルギルス　ニガー（ハ匹■１ｌｌｕｓ　紅［旦及びアスペルギルス 　ニドウランス（Ａｓ　ｅｒ　１ｌｌｕｓ　ｎ１ｄｕｌａｎｓ）を含む糸状菌類 の形質転換についての手順が開発されている。米国第４，８８５．２４９号（Ａ ｌｌｅｌｉｘ）には、ム　ニガーの形質転換についての一般的手法が述べられて おり、選別マーカーをコードする遺伝子を保有するプラスミドの導入によって例 示されている。ＥＰ　２１５．５９４号（Ｇｅｎｅｎｃｏｒ）には、分泌を担う 種々のアスペルギルスタンパク質のシグナル配列を用いる紅　ニドウランスにお ける様々なタンパク質の発現及び分泌が述べられている。

これらの文献のいづれも糸状菌類におけるヘムタンパク質の製造の可能性を示唆 していない、一方、Ｍ、Ｓａｌｏｈｅｉｍｏら、Ｇｅｎｅ　８５．１９８９、頁 ３４３−３５１には、上Ｊ≦蔓にヱ　リーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅ ｓｅｉ）におけるフレビア　立乏ヱ９　（Ｐｈｌｅｂｉａ　ｒａｄｉａｔａ）由 来のりゲニンペルオキシダーゼのクローニング及び発現が述べられている、この 著者は、リグニンペルオキシダーゼの■ＲＮＡがＬ　リーセイの中で発現される にもかかわらず、タンパク質が検出できなかったと報告している。彼らはこのこ とが、ヘムの非存在下におけるタンパク質の不適切な折りたたみに基づくプロテ アーゼによる細胞内分解、又は翻訳をはばむＲＮＡの異なる構造に原因するので はないがと推測している。

発明の概要 ヘムタンパク質は糸状ＭＲにおいて、酵母における同じタンパク質に関して獲得 できる収率をはるかに超えた収率で製造されうることを驚くべきことに発見した 。

従って、本発明は糸状菌類における異種ヘムタンパク質の細胞外製造についての 方法に関連し、この方法は（ａ）異種ヘムタンパク質をコードするＤＮＡ配列及 び発現されたヘムタンパク質の分泌を可能とするプレ領域をコードするＤＮＡ配 列を含んで成る組換ＤＮ八へクターによって適当な糸状ｗｉを形質転換せしめ、 次いで、 （ｂ）このヘムタンパク質の製造を誘発せしめる条件のもとて適当な培養培地中 でこの形質転換糸状菌類を培養すること、を含んで成る。

本明細書において、「細胞外製造Ｊなる語は、細菌又は酵母においてヘムタンパ ク質を製造する既知の方法に反して、ヘムタンパク質が宿主細胞から培養培地へ と分泌され、従ってそれより容易に回収できることを意味すると理解される。明 らかに、この組換タンパク質はｗ類宿主のヘム合成経路によって作られたヘムを 一体化せしめることができるものであり、従って完全に集成したヘム含有タンパ ク質として宿主細胞によって分泌されうる。「異種」なる語は、問題の宿主生物 によって天然では製造されないタンパク質を表わすことを意味する。［ヘムタン パク質」なる語は、補欠分子族としてヘム（例えばプロトポルフィリンＩＸ）を 含むタンパク質の群の任意の構成員を含むことを意図している。「糸状菌類」な る語は藻菌類（Ｐｈｙｃｏｓｙｃｅｔｅｓ）、接合Ｉｌｌ　（Ｚｙｇｏｓｙｃｅ ｔｅｓ）　、子嚢菌１［（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅｓ）、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉ ｏｍｙｃｅｔｅｓ）の群に属するｉ＊ｉ、又はヒホミケス類（Ｈｙｐｏｍｙｃｅ 　ｔｅｓ）を含む不完全菌類、例えばアスペルギルス、ΣＬ１発明の詳細な説明 該ベクターは好都合には遺伝子の発現を促進せしめる機能、典型的にはプロモー ター、転写開始部位、並びに転写停止及びポリアデニル化機能をコードするＤＮ Ａ配列を含んで成る。

上流に、当業界に知られている通りの活性化配列及びエンハンサ−配列が先行し うるプロモーターは、糸状菌類において強い転写活性を示す任意のＤＮＡ配列で あることができ、そして細胞外又は細胞内タンパク質、例えばアミラーゼ、グル コアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ又は解糖酵素をコードする 遺伝子に由来しうる。

適切なプロモーターの例は、Ａ、土１工（、Ｑエ　虹ｕ憇）ＴＡにＡアミラーゼ 、リゾムコール　ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｗｉｅｈｅｉ）アスパラギ ン酸プロテイナーゼ、！３．三互二中性α−アミラーゼ、紅　玉九二酸安定性α −アミラーゼ、Ａ、王ｙ−グルコアミラーゼ、丈ｊムユニ土　ミーへイリパーゼ 、Ａ、ｌアルカリホスファターゼ又はＡ、ｔ’）ｉトリオースリン酸イソメラー ゼをコードする遺伝子に由来するものである。

糸状Ｗｉ類宿主生物は好適には組換タンパク質を製造するための宿主として従来 利用されているもの、例えばアスペルギルス種の株、例えばｈエ　ニガー、Ａ、 三、トｌ」ＬＺ２２又はＬ　オリザでありうる。

組換タンパク質の製造におけるＡ、ｌの利用は例えばＥＰ　２３８，０２３号に かなり説明されている。

特に宿主生物がｈよ　ｔユニのとき、本発明の方法における利用に好ましいプロ モーターはＡ、オニ］づａｏアミラーゼプロモーターであり、なぜならこれはｔ ＋、ｔ＋ｔｑの中で強い転写活性を示すからである。　ＴＡＫＡアミラーゼプロ モーターの配列はＥＰ　２３８．０２３号より明らかにされている。

停止及びポリアデニル化配列はプロモーターと同一の起源に由来することが適切 でありうる。

菌類宿主細胞を形質転換するのに用いられる技術は、例えばＹｅｌ　ｔｏｎら、 Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ｌｌ５Ａ　影り、　１９８４、頁１４ ７０−１４７４　もしくはＵＰ２１５．５９４号に記述の紅三上ユ立ｌスを形質 転換せしめる方法、又は例えばＢｕｘｔｏｎら、Ｇｅｎｅ　３７．１９８５、頁 ２０７−２１５もしくは米国第４．８８５，２４９号に記述の紅　三り二を形質 転換せしめる方法、又はＥＰ２３８．０２３号に記述の紅主ユヱを形質転換せし める方法から適当に適応されうる０本発明の方法においては、宿主細胞を、形質 転換に基づいて宿主生物のゲノムの中に一体化されることのできるが、しかしな がら形質転換前はその宿主によって発現されない、又は選別条件のもとでは増殖 を可能とするには十分でない量で発現される選別マーカーについてコードするＤ ＮＡ配列を含んで成るベクター系で形質転換せしめてよい、従って形質転換体は 、一体化した選別マーカーに基づいて非形質転換体から選別及び単離されうる。

適切な選別マーカーは、Ａ、ｇＪＪヨ＞ｙｘもしくはＬ　ニカーノ肛■遺伝子、 紅　三」］ヨＬ乙ムの厘遺伝子、！３−　壬」ｊ！し乙五のａｗｄｓ遺伝子、＝ ｘ−ＯＸ弘−Ｌ立ユニ（ｈ肛匹匹ｎｃｒａｓｓａ）　（７）ｍもしくは■■遺伝 子、又はＡ、三り二もしくは紅　オリザの皿遺伝子に由来しうる。

本発明における利用にとって好ましい選別マーカーは紅玉ヱユ立ｌ困又は紅　ニ ガーの」競又は肛ｉ遺伝子に由来する。野生型紅±に１株は通常ＡｒｇＢ”であ る（これは、肛硅遺伝子がＡ、Ｌ！Ｌｉにおいて発現されることを意味する）、 従って、選別マーカーとして肛ｕを選ぶと、宿主生物としてはＡ、主ユヱの紅旺 突然変異株（紅１遺伝子を発現しないもの）を利用しなくてはならない、他方、 ａｍｄｓ遺伝子を、選別条件のもとて増殖を可能とするのに十分な量においてこ の遺伝子を発現しない野生型Ａ、１株における選別マーカーとして利用してよい 。

宿主細胞の分泌経路への発現生成物の効率的な誘導を確実とするためにベクター 上に施されたプレ領域は、細胞からのこのタンパク質の分泌を担う天然のシグナ ルもしくはリーダーペプチド又はその機能部分、あるいは合成配列でありうる。

従って、このプレ領域は任意の起源に由来する分泌型タンパク質についてコード する遺伝子に由来しうる。

特に、このプレ領域はアスペルギルス種のアミラーゼもしくはグルコアミラーゼ をコードする遺伝子、ユズムユニ土　ミーヘイのリパーゼもしくはプロテアーゼ をコードする遺伝子、又はコプリヌス（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）種のペルオキシダー ゼをコードする遺伝子に由来しうる。

このプレ領域は好ましくは紅　主ｐＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ、三立二中性α−ア ミラーゼ、Ａ、三光二酸安定性α−アミラーゼ、紅玉互二グルコアミラーゼ、又 は２１−しＬ入　ヱｊ」口り瓦ム（並肛紐旦ｍａｃｒｏｒｈｉｚｕｓ）もしくは シネレウス（ｃｉｎｅｒｅｕｓ）のペルオキシダーゼをコードする遺伝子に由来 する。

宿主細胞への導入のため、ヘムタンパク質、プレ領域、プロモーター及びターミ ネータ−についてコードするＤＮＡ配列を、選別マーカーを含むベクターの中に 挿入するか、又は別のベクターの中に挿入してよい、ベクター又は複数のベクタ ーは線形又は閉環分子でありうる０本発明の方法の一態様において、一方が選別 マーカーについてコードするＤＮＡ配列を保有し、そして他方がヘムタンパク質 、プレ領域及び遺伝子発現を促進せしめる機能をコードするＤＮＡ配列を保有す る２つのベクターを宿主細胞の中に導入してよい。

本発明の方法により製造されるヘムタンパク質は好ましくはオキシドリダクター ゼ（酸化還元酵素）、特にペルオキシダーゼ、例えばリグニンペルオキシダーゼ もしくはＭｎ−ペルオキシダーゼ、又はハロペルオキシダーゼである。現状好ま しいｎ様において、ペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列はユズ１ム１種、 特にユ１ユ盈困１３−三］−に２２又はシネレウスに由来する。

別の観点において、本発明はコプリヌス種ペルオキシダーゼをコードする図ＩＡ −ＩＢにおいて示すＤＮＡ配列、又はその適当な改質体を含んで成るＤＮＡ構築 体に関する。

ＤＮＡ配列の適切な改質の例は、ペルオキシダーゼの別のアミノ酸配列をもたら さず、しかしながらこのＤＮＡ構築体を導入する宿主生物のコドン用法に対応す るヌクレオチド置換、又は異なるアミノ酸配列をもたらし、従って可能として、 天然酵素とは異なる性質を有するペルオキシダーゼ突然変異体をもたらしうる異 なるタンパク質構造をもたらすヌクレオチド置換である。可能な改質のその他の 例は、配列への１もしくは複数のヌクレオチドの挿入、配列のいづれかの末端へ の１もしくは複数のヌクレオチドの付加、又は配列のいづれかの末端もしくは配 列内での１もしくは複数のヌクレオチドの欠点である。

ペルオキシダーゼをコードする本発明のＤＮＡ構築体は、確立されている標準方 法、例えばＳ、Ｌ、ＢｅａｕｃａｇｅとＭ、Ｈ，ＣａｒｕｔｈｅｒｓのＴｅｔｒ ａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｅｒｓ　２２．１９８１、頁１８５９−１８６９に記載 のホスホラミジット法、又はＭａｔｔｈｅｓ　らのＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ　３ ．１９８４、頁８０１−８０５に記載の方法によって合成的に製造されうる。ホ スホラミジット法に従うと、オリゴヌクレオチドは例えば自動［ＩＮＡ合成装置 で合成され、精製され、アニールされ、リゲートされ、そして適当なベクターの 中にクローンされる。

本発明のＤＮＡ構築体はゲノム又はｃＤＮＡ起源であることもでき、例えばゲノ ム又はｃＤＮ＾ライブラリーを作り、次いで標準的な方法（Ｓａ−ｓｂｒｏｏｋ ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　Ｍａｎｕ ａｌ第２版、ＣｏｌｄＳｐｒｔｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、１９８９を参照のこと）に 従う合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションによりペ ルオキシダーゼの全体又は一部についてコードするＤＮＡ配列をスクリーニング することによって獲得される。この場合、ペルオキシダーゼをコードするゲノム 又はｃＤＮＡ配列は、例えばよく知られている手順に従う相同性組換のための所 望のアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを用いる部位特異的突然 変異誘発により、アミノ酸置換を導入することを所望する（複数の）箇所に相当 する部位にて改質されうる。

最後に、このＤＮＡ構築体は、標準的な技術に従って、ＤＮＡ構築体全体の様々 な部分に相当するフラグメントである、合成、ゲノム又はｃＤＮＡ起源（適宜に ）のフラグメントをリゲートせしめることによって製造される、複合した合成と ゲノム、複合した合成とｃＤＮＡ、又は複合したゲノムとｃＤＮＡの起源であっ てよい、ＤＮＡ構築体は例えば米国第４，６８３，２０２号又はＲ，に、５ａｉ ｋｉ　ら５ｃｉｅｎｃｅ　２３９．１９８９、頁４８７−４９１に記載の通り、 特異的なプライマーを利用するポリメラーゼ連鎖反応によっても製造できうる。

本発明は更に、本発明のＤＮＡ構築体を挿入した組換発現ベクターに関する。こ れは組換ＤＮ八へ順を好適に付することのできうる任意のベクターであってよく 、そしてベクターの選択はそれを導入すべき宿主細胞に通常依存するであろう、 従って、このベクターは自己複製型ベクター、即ち、染色体外因子として存在し 、その複製が染色体の複製と独立しているベクター、例えばプラスミドでありう る。

他方、このベクターは宿主細胞の中に導入したときに宿主細胞のゲノムに組込ま れ、そしてそれが組込まれた（複数の）染色体と一緒に複製するものでありうる 。

該ベクターにおいて、ペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列は適当なプロモ ーター及びターミネータ−配列に作動連結されているべきである。このプロモー ターは選んだ宿主細胞において転写活性を示す任意のＤＮＡ配列であってよく、 そして宿主細胞に対して同族又は異種のいづれのタンパク質をコードする遺伝子 に由来しうる。

適切なプロモーターの例は前記した通りである。ペルオキシダーゼ、プロモータ ー及びターミネータ−のそれぞれをコードするＤＮＡ配列をリゲートする、そし てそれらを適当なベクターの中に挿入するのに利用される手順は当業者によく知 られている（例えばＳａ■ｂｒｏｏｋ、前掲を参照のこと）。

本発明は、本発明の発現ベクターによって形質転換された宿主細胞にも関する。

この宿主細胞は糸状菌類であり、そして好ましくは前記した通すアスベルギルス 種の細胞である。

形質転換宿主細胞を培養するのに用いる培地は糸状菌類を増殖させるのに適当な 任意の常用の培地でありうる。形質転換体は通常安定であり、従って淘汰圧なし で培養されうる。しかしながら、もしこの形質転換体が不安定であると認められ たら、細胞の中に導入した選別マーカーが選別のために利用できる。もしヘミン 又はヘム−含有物質（例えばヘモグロビン又は赤血球細胞）をこの培地に加える と、ヘムタンパク質の収率が顕著に高められることが驚くべきことに見い出され た（下記の実施例３〜６を参照のこと）。

宿主細胞から分泌する成熟ヘムタンパク質はよく知られた手順によって培養培地 から好適に回収することができ、それには遠心又は濾過によってこの培地から細 胞を分け、次いで塩、例えば硫酸アンモニウムによってこの培地のタンパク質成 分を沈殿させ、続いてクロマトグラフィー手順、例えばイオン交換クロマトグラ フィー、アフィニティークロマトグラフィーにかけることが含まれる。

図面の簡単な説明 本発明を添付した図面を参考にして下記の実施例で説明するが、ここで １ｆｆｌｌＡ〜ＩＢはコブリヌス　シネレウス　ペルオキシダーゼをコードする ｃＤＮＡ配列を示し、そして 図２はベクターｐＨ０４１４の地図である。

本発明を下記の実施例で更に例証するが、それらは請求の範囲に記載の本発明の 範囲を何ら限定することを意図していない。

実施例Ｉ ＰＣＲによるプローブの構築 コブリヌス　ヱえ！±囚ム　ペルオキシダーゼのアミノ酸配列を基礎として構築 した特異的なオリゴヌクレオチドブライマー（Ｒ，Ｋ。

−ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってペルオキシダーゼｃＤＮＡフラグメントを作っ た。

ＰＣＲはＧｅｎｅ　Ａｍｐキット及び装置（Ｐｅｒｋｉｎ　［ｉｌｍｅｒ　Ｃｅ ｔｕｓ＋Ｎｏｒｗａｌｋ’＋Ｃｔ＋ＵＳＡより人手可）を用いてその製造業者の 仕様に従って実施したが、ただし第１鎖ｃＤＮ＾（ユニ１困囚　セネレウス　Ｉ ＦＯ８３７１より獲得したｍＲＮＡより調製）に対するより良いハイブリダイゼ ーションのために最初の３周期については２８°Ｃで行い、そしてその後のＰＣ Ｒの３０周期については６５℃で行った。

ＰＣＲのために下記の特異的プライマーを用いた：１、５　’−ＧＣＧＣＧＡＡ ＴＴＣＧＴＮＧＧＮＡＴＮＡＡＣＣＡＣＧＧ−１’３、　５’−ＧＣｃＡＡＴＴ ＣＡＣＮＣｃＮＣＡＧＧＴＮＴＴＣＧＡＣＡｃ−コ’「Ｎ」は４種のヌクレオチ ド全ての混合物を示す。

プライマーを下記の通りに組合せた：１と２．３と４．５と７．６と７、ｌと４ ．１と７及び３と７．従ってＰｃｔ？フラグメントは５′末端でのＥｃｏＲ１部 位及び３′末端でのＢｏｅｌ　１部位で伸長させである。

ＰＣＲ反応は１％のアガロースゲルで分析した。予測サイズのバンドが全ての反 応において認められた。このバンドがペルオキシダーゼ特異性配列に相当するこ とを確認するため、このゲルをサザンブロッティングに付し、そしてＰ、ＣＲプ ライマー３と４との間に位置する下記の配列 を有するオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。このプローブは 約１３０ｂｐ、４２０ｂｐ　、５４０ｂｐ及び２４０ｂＰのバンドとハイブリダ イズすることが認められ、従って観察されたバンドはペルオキシダーゼ配列に相 当する。

様々なＰＣＲ反応に由来するＤＮＡをＥｃｏＲＩ及びＢａｓ＋旧により消化し、 そしてプラスミドＰＵＣ１９（Ｃ，Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、Ｇｅｎｅ 　３３．１９８５、頁１０３−１１９）の中にクローンせしめた。正しいＰＣＲ フラグメントを含むコロニーを前記に挙げたオリゴヌクレオチドプローブを用い るハイブリダイゼーションにより同定した。陽性コロニー由来のＤＮＡを制限酵 素地図化及びＳａｎｇｅｒらＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＩＪＳＡ 　７４．１９７７、頁５４６３−５４６７に記載の部分ＤＩＩＡ配列分析によっ て分析した。プライマー１及び４を用いて獲得したクローンのうちの一つに由来 する４３０　ｂｐのフラグメントを下記に記載の通りにコブリヌス　シネレウＸ 　ｃＤＮＡライブラリーをスクリーンするために用いた。

Ｅ、ｌにおけるコブリヌス　シネレウスｃＤＮＡライブラリーの構築全ＲＮＡを 、Ｂｏｅｌら（ＥＭＢＯＪ、、３　：　１０９７−１１０２．１９８４）及びＣ ｈｉｒｇｗｉｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（ｆｌａｓｈ）１８　：　５２ ９４−５２９９．１９７９）に述べられている方法により、ペルオキシダーゼの 最大活性時にて集めたホモナイズ化コブリヌス　シネレウス（ＩＦＯ８３７１） より抽出せしめた。ポリ（Ａ）−含有ＲＮ＾はＡｒ１ｒとＬｅｄｅｒ（ＰＮＡＳ 、ｔｌｓＡ　６９　：　１４０８−１４１２　、１９７２）に記載のオリゴ（ｄ Ｔ）−セルロースでの２サイクルのアフィニティークロマトグラフィーにより獲 得した。　ｃＤＮＡをＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎに由来するｃＤＮＡ合成キットによ り、その製造業者の仕様に従って合成した。ユエユＭＸ　シネレウスｃＤＮＡラ イブラリー由来の約５０，０００のＬ　且ユ組換体をワットマン５４０ペーパー フイルターに移した。これらのコロニーを溶解させ、そしてＧｅｒｇｅｎら（Ｎ ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、７．２１１５−２１３５．１９７９）によ り述べられている通りに固定化せしめた。これらのフィルターを０．２ＸのＳＳ Ｃ，０，１％のＳＯ５において５ｉｐ−ラベルされた４３０ｂρのペルオキシダ ーゼ特異性プローブとハイブリダイズさせた。フィルターのハイブリダイゼーシ ョン及び洗浄を６５°Ｃで行い、続いて増強フィルターを伴ってオートラジオグ ラフィーを２４時間行った。オートラジオグラフィーの後、これらのフィルター を高めの温度で洗い、続いて増強フィルターを伴ってオートラジオグラフィーを ２４時間行った。これにより、５０個以上の陽性クローンが同定された。ミニプ レプブラスミドＤＮＡを標準手順（Ｂｉｒｎｂｏｉ閣とＤｏｌｙのＮｕｅｌｅｉ ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　７．１５１３−１５２３．１９７９）　によりハイ ブリダイズコロニーから単離し、そしてｃＤＮＡインサートのＤＮＡ配列ヲＳａ ｎｇｅｒのジデオキシ手順（Ｓａｎｇｅｒ　ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ 、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４．１９７７、頁５４６３−５４６７）により決定した。

ペルオキシダーゼｃＤＮＡフラグメントを旧ｎｄｍ／Ｘｈｏｌによる切断により ベクターから切り出し、次いでアガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶離 させて、リゲーション反応のために用意したＩ　ＣＤＮＡフラグメントを旧ｎｄ ｌ［［／Ｘｈｏ　Ｉ消化ｐＨ０４１４とリゲートさせてｐＣｉｐを作り上げ、そ の中ではｃＤＮＡはヱスペルギルｘｔ＋ｔｑ由来の丁ＡＫＡプロモーター及びア スペルギルス土立二由来のＡＭＧターミネータ−の転写コントロール下にある。

アスペルギルス発現ベクターｐ）１０４１４の構築ベクターｐＨ０４１４はプラ スミドｐ７７５（ＥＰ　２３８，０２３号に記載）の誘導体である。ｐ７７５に 反して、ｐＨ０４１４はプロモーターとターミネータ−との間に固有の制限部位 の鎖を存している。

ターミネータ−の３′末端での約２００　ｂｐの長さのフラグメント（望ましく ない制限部位を含む）の除去、及びプロモーターの５′末端での約２５０　ｂｐ の長さのフラグメント（これも望ましくない制限部位を含む）のその後の除去に よってプラスミドを構築した。２００ｂｐの領域は、Ｎａｒｌ　（ｐＵｃベクタ ーの中に位置する）及びＸｂａｌ　（ターミネータ−のすぐ３′に位置する）で の切断、それに続く作り上げた末端のフレノウＤＮＡポリメラーゼ＋ｄＮＴＰに よる補完、ゲルでのベクターフラグメントの精製、及びベクターフラグメントの 再すゲーションによって除去した。このＤＮＡを前記した通りＥ、ユＪ７１Ｃ１ ０６１に形質転換させた。　１０個のコロニー（ｐＨ０４１３−１〜−１０）を 選び、そして制限酵素分析によって分析した。制限酵素分析において予測のバン ドパターンを示すクローンのうちの１つをｐＨ０４１４の構築において用いた。

ｐＨＤ　４１３を５ｔｕｌ　（プロモーターの５′末端に位置する）及びＰｒｕ ｌｌ（ｐＵｃベクターに位１する）で切り、そしてゲルで分画した。このベクタ ーフラグメントを精製し、再すゲートし、そしてＥ、］　ＩＪ　ＭＣ１０６１に 形質転換させた。１２個のコロニーを選び、そして制限酵素分析によって分析し た。１２のクローン全てが予測のバンドパターンを示した。プラスミドｐＨ０４ １４は図２に示す。

アスペルギルス　土ユニ又はアスペルギルス　三互二の形質転換（一般手順） １０抛ｌのＹＰＤ培地（Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｙｅａｓｔ 　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ、１９８１）　にＡ、ｔ’）’ｊ”又はＡ、Ｊ／−の胞子を接種し、次いで 振盪しながら３７℃で２日間インキュベートした。ミラクロスを介す濾過によっ て菌糸体を集め、そして０．６　ＭのＭｇＭｇ３０４２Ｏ０で洗った。この菌糸 体を１．２ＭのＭｇ５Ｏａ；ｌｏｓＭのＮａＨ，ＰＯ，、ｐｆｌ−５，８１５ｍ １に懸濁させた。この懸濁物を氷上で冷却し、そして１２０ｍｇのＮｏｖｏｘｙ −（商標）２３４、バッチ１６７８を含む緩衝液１ｍｌを加えた。

５分後、１：２ｇｇ／ｓｌのＢＳ＾（Ｓｉｇｍａタイプ１２５）　１　ｍｌを加 え、そしてゆっくり撹拌しながらインキエベーシッンを、顕微鏡で見てサンプル 中に大量のプロトプラストが見えるようになるまで３７℃で１．５〜２．５時間 続けた。

この懸濁物をミラクロスで濾過し、その濾液を滅菌チューブに移し、そして０． ６Ｍのソルビトール、１００ｍＭのトリス−１１ｃＩ、ＰＨ−７，０５−１をそ の上に載せた。遠心を１００　ｇで１５分間行い、そしてプロトプラストをＭｇ ５Ｏｉクツシヨンの上から集めた。このプロトプラスト懸濁物に２容量の５ＴＣ （１，２Ｍのソルビトール、１抛属のトリス−ＨＣｌ。

ｐＨ＝１．５．１０ｍＭのＣａＣＩｇ）を加え、次いでこの混合物を１０００　 ｇで５分間遠心した。このプロトプラストペレットを３−１のＳＴＣに再懸濁さ せ、そして再ペレット化した。この手順を繰り返した。最後に、このプロトプラ ストを０．２〜１■ｌのＳＴＣに再懸濁させた。

１００μ■のプロトプラスト懸濁物を１０ｕｌのＳＴＣ中の適当なりＮＡ５〜２ ５μｇと混ぜ合わせた。ａｒｇＢ株に由来するプロトプラストをｐｓａ１４３　 ＤＮＡ　（Ａ、ニドゥランスａｒｇＢ遺伝子を保有するプラスミド）と混ぜ、そ してａｒｇＢ’株に由来するプロトプラストを９３ＳＲ２（、Ｑよ　三エユｉｌ スａｍｄｓ遺伝子を保有するプラスミド）と混ぜ合わせた。

この混合物を室温で２５分間放置した。６０％のＰ［ｉＧ　４０００（ＢＤｌｌ 　２９５７６）、１０−ＭのＣａＣ１１及び１０５Ｍのトリス−ＨＣｌ、　ｐＨ −７，５０，２ｍ’ｌを加え、そして慎重に混合しく２回）、そして最後に０． ８５■ｌの同一の溶液を加え、次いで慎重に混合した。この混合物を室温で２５ 分間放置し、２，５００プレートの上にまいた。ｐｓａｌ　４３で形質転換させ たａｒｇＢ株由来のプロトプラストをグルコース及び尿素を炭素及び窒素起源と してそれぞれ賓し、そして浸透圧の安定化のために１．２　Ｍのソルビトールを 含む最少プレート（Ｃｏｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　１ １３　（１９６６）５１−５６）上にまいた。　ｐ３ｓＲ２で形質転換させたａ ｒｇＢ−株由来のプロトプラストを、　１．０　Ｍのスクロース、ｐＨ−７，０ 、窒素源としての１０ｍＭのアセトアミド及びバックグランド増殖を阻止するた めの２０−一のＣｓＣ１を含む最少プレート（Ｃｏｖｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉ ｏｈｙｓ、Ａｃｔａ　１１３　（１９６６）５１−５６）の上にまいた。３７℃ で４〜７日間のインキエベーシッンの後、胞子を拾い、滅菌水に懸濁し、そして 単一コロニーについてまいた。この手順を繰り返し、そして第２の再単離後の単 一コロニーを規定の形質転換体として保存した。

Ａ、±ＩＪｆ株における組換コプリヌス　シネレウスペルオキシダーゼの製造 ｐＣｉｐを紅　オリザＡ１５６０　（ＩＦＯ４１７７）の中に、前述した紅　三 エユ立ヱ五由来のａｓｄｓ遺伝子を含むｐ３ＳＲ２と、等量のｐＣｉｐ及びｐ３ ＳＲ２の混合物（それぞれ約５μｇ）との同時形質転換によって、形質転換させ た。唯一の窒素源としてアセトアミドを利用することのできる形質転換体を二回 再単離した。　ＹＰＤ培地（Ｓｈｅｒｓ＋ａｎら、１９８１）上での３日間の増 殖後、培養上漬物をＡＢＴＳを利用するペルオキシダーゼ活性アッセイ（下記を 参照のこと）により分析した。最良の形質転換体を更なる研究のために選んだ。

多エ　セレビシェにおけるペルオキシダーゼの製造ペルオキシダーゼ遺伝子をｐ ｃｉｐより単離し、そしてｃＤＮＡがＧａｌ　１−１０プロモーター及びα−因 子ターミネータ−の転写コントロール下にある酵母発現ベクターｐＹＩＩ０５の 中に導入せしめた。　ＵＲＡ３突然変異酵母株をＬｉＡｃ手順（Ｙｅａｓ上Ａヱ ｒａｃｔｉｃａｌ　Ａ　ｒｏａｃｈ、　１．Ｃａｍｐｂｓｌｌと０．８．Ｄｕｆ ｆｕｓ　（ｗｌ）　、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１９８Ｂ、頁１１５）により、酵母 発現プラスミドで形質転換させた。形質転換体をウラシルを含まない最少アガー プレート上で選別し、そしてその後、ウラシルは有さないがガラクトースの添加 された（プロモーターを誘発するために）最少アガープレート上でレプリカプレ ートし、次いでウェスタンブロッティング及び酵素活性の測定によりペルオキシ ダーゼの発現について試験した。

実施例２ 野生型コブリヌス　シネレウスの発酵に由来するコブリヌス　２主ｕ６Ｘペルオ キシダーゼと、形質転換された５エ　セレビシア及び紅、ｔ　ＩＪ　ｆの発酵に 由来する組換コプリヌス　シネワウスペルオキシダー４ゼ（ｒＣｉｐ）との収率 の比較 この実験において用いた各株は、振盪フラスコ培養のための最適条件のもとで、 及び最適培地の中で増殖させた。

コブ１ヌス　シネレウス（ＩＦＯ８３７１）　：培地：３ｇ／ｌの酵母抽出物１ ０ｇ／ｌのペプトン、　０．２ｇ／ｌのＦｅ１ｏ４・７Ｎｔｏ、１　ｇ／　１の ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０，２０ｇ／ｌのグルコース、ｐＨ＝７．０ 増殖条件：３０℃、１ＢＯｒｐｍ　、７日間Ｓ、セレビシェ（ｒｃｉｐ）　：培 地：１０ｇ／Ｉの酵母抽出物、２０ｇ／Ｉのペプトン、１０ｇ／ｌのグルコース 、１０ｇ／ｌのガラクトース、０．１ｇ／ｌのＦｅ５Ｏ１・７！（ｚＯ１ｐＨ＝ ５．０ 増殖条件＝３０℃、２５０　ｒｐｍ　、４日間Ａ、オリザ（ｒＣｉｐ）　：　培 地：５ｇ／Ｉの酵母抽出物、２ｇ／ｌのＫｃｔ、、Ｉｇ／ＩのＮａＨｚＰＱａ　 ’　ｌ０ＨＪ　、２　ｇ／ｌのＮａ、ＳＯ，、Ｉｇ／ｌのＭｇＣ１ｇ　’６Ｈｉ Ｏ１２ｇ／ｌの尿素、２ｇ／ｌのクエン酸、０．２ｇ／ｌのＦｅ５Ｏｎ　・７Ｈ ｔＯ１２０ｇ／ｌのマルトース、ｐＨ＝６．０ 増殖条件＝３７℃、３００　ｒｐｍ　、４日間ペルオキシダーゼ活性は、４１８ ｎ−でモニターする、ｐｎ＝７．５での、ＡＢＴＳ（２，２’−アジ）−ビス（ ３−エチルベンズチアゾリン−６−スルホン酸；　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａ ｎｎｈｅｉｓ＋よりニアンモニウム塩として供給）の過酸化水素酸化を包括する 技術（Ｒ，Ｅ、Ｃｈｉｌｄｓと−、Ｇ、Ｂａｒｄｓｌｅｙ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｊ、１４５．１９７５、頁９３−１０３）によって濾過培養サ ンプルに基づいて測定した。過酸化水素の濃度は１ｍＭとした。

株　細胞外ペルオキシダーゼの収率 コブリヌス　シネレウス　１００％ −−ｎ頁Ｖ３７７ コブリヌス　シネレウスペルオキシダーゼを製造するために紅主ユニを利用する 利点は、供給バッチ発酵において更により強調され、ここで比奴率は、コブリヌ ス　セレビシェより獲得されるそれに比して、２０００％以上であった。

実施例３ ヘミンを含む発酵培地中でのＡ、１株における組換コプリヌスシネレウスペルオ キシダーゼの製造 ｐＣ４ｐを紅　オリザＡ１５６０（ＩＦＯ４１７７）の中に、前記した紅　玉エ ユ立ｌ五由来のＢｍｄＳ遺伝子を含むｐ３ｓ１２２と、等量のｐＣｉｐ及びｐ３ ｓｌ？２　（それぞれ約５μｇ）の混合物との同時形質転換により、形質転換さ せた。唯一の窒素源としてアセトアミドを利用することのできる形質転換体を２ 回再単離した。

フラスコでよって下記の組成 酵母抽出物　１ｇ／ｌ コハク酸　１０ｇ／ｌ −ｇｃ＋、・６ＨｚＯＯ，８２ｇ　／　ＩＫ（：１　１．８３　ｇ　／　Ｉ ＮａＨｔＰＯａ　・２ＨｚＯ１，０１ｇ　／　ＩＨａＳＯａ　１．８　ｇ／　１ 尿素　２ｇ／ｌ クエン酸　２ｇ／ｌ 微量金属溶液　０．５■ｌ／１ プルロニツタ　０．１　ｍｌ／　１ 水　１０１００Ｏに至る （ｐＨはＮａＯＨで６．００に調整） を存する＾５ＰＯ３培地５０■ｌを含み８１２１℃で６０分間オートクレーブに かけられ；続いて０．Ｏｌ−のＮａＯＲの中に溶かし、アルカリｐＨ（１２）に て０．２μｍの膜を介してこのフラスコの中に滅菌濾過する２０ｇ／ｌのマルト デキストリン及び様々な量のヘミン（Ｓｉｇｓ＋ａ　Ｈ−２５５０）の添加され た３００　ｍｌのプロピレン製振盪フラスコに、ｈエ　ｌ形質転換体の胞子懸濁 物（約１０’胞子／ｍｌ）　１ｍｌを接種し、次いで３４℃で７２時間、３００ 　ｒｐ−でインキュベートした。

その結果を下記の表に示す、ペルオキシダーゼ活性はＰＯＤＵ／−１において測 定した。　（Ｉ　ＰＯＤＵ（ペルオキシダーゼ単位）は、１ｍＭのＨｔＣｈの存 在下において、ｐＨ７，０，２５°Ｃの温度で、２．２′−アジノビス〔３−エ チルベンゾチアゾリン−６−スルホネート〕が酸化される系において、１分間当 り１μ■ｏｌのＨ，ｏ□の変換を触媒せしめる酵素の量として定義する。） 培地中のヘミン濃度　７２時間後のペルオキシダーゼ活性Ｏｍｇ／　１　３００ 　ＰＯＤＵ／　ｓ＋１表から明らかな通り、増殖培地へのヘミンの添加はペルオ キシダーゼの収量を有意に高める。

実施例４ ヘミン及び界面活性剤を含む発酵培地中でのＡ、主見二株における組換ｑ　シネ レウスペルオキシダーゼの製造前記の通りに獲得したｔ＋、−ｒ＋ｔｑ形質転換 体を、界面活性剤としてグラナボンＤＧ　１６０（Ｂｕｓｓｅｔｔｉより入手可 ）がオートクレーブにかけられる前に加えられている培地の中で実施例２に記載 の通りに培養した。その結果を下記の表に示す。

ヘム濃度　グラナボン濃度　７２時間後のＰＯＤ活性Ｏｍｇ／ｍｌ　Ｏｍｌ／　 ｌ　３００　ｐｏｏｕ／纏１この表から明らかな通り、加えられたグラナボンは ペルオキシダーゼ収率におけるヘミンとの優れた相乗作用を有す。

実施例５ ヘミン、ヘモグロビン及び赤血球細胞を含む発酵培地中でのＡ、　オリザ株にお ける組換コブリヌス　シネレウスペルオキシダーゼの製造 前記した通りに獲得した７！、主ＩＪ　４１１’形質転換体を、ヘミン、ヘモグ ロビン（Ｍｅｒｃｋ　Ａｒｔ　４３００）又は赤血球（スプレー乾燥せしめたブ タとウシの混合赤血球細胞、食品級）の加えである培地（オートクレーブの前又 は後に）の中で実施例２に記載の通りに培養した。ヘモグロビン及び赤血球はオ ートクレーブ及び滅菌濾過にかける前にｐＨ１０，５（ＮａＯＨ）で溶解させた 結果は下記の表よりわかる。

７２１１　間後のペルオキシダーゼ活性ヘム起源　滅菌濾過　オートクレーブ ２０分、１２１℃ 表から明らかな通り、ヘム族がグロブリンに結合しているヘム起源はペルオキシ ダーゼ収率の顕著な上昇をもたらした。更なる利点は、それらが非常に安価で獲 得できること、及びヘム族が加熱滅菌の際の分解に対して守られていることにあ る。

実施例６ ヘモグロビンを含む発酵培地中での２リツトルの発酵槽におけるＡ。

オリザ株における組換コプリヌス　シネレウスペルオキシダーゼの製造 前記の通りに獲得したｎ、ｔ＋ｔｑ形質転換体を下記の供給ハツチ法において２ リツトルの実験室発酵槽の中で発酵させた：タンク培地：　ＭｇＳＯ４・７Ｈ１ ０２ｇ／　ＩＫＨ！Ｐ０．　２　ｇ　／　１ にｔｓＯ＊　３　ｇ　／　１ クエン酸　４ｇ／Ｉ 微量金属 酵母抽出物　Ｌｇ／ｌ プルロニック　０．２ｍｌ／　１ 供給培地：マルトース　２５０ｇ／ｌ 酵母抽出物　７ｇ／ｌ Ｆｅ５Ｏａ　’　７Ｈ！０　１　ｇ　／　１尿素　２０ｇ／ｌ プルロニック　２ｍｌ／１ 発酵条件：２．０１の発酵槽 温度、３４°Ｃ ｐＨ−７，８ ｐ０２　＞２０％（撹拌スピードの上昇による）通気：　Ｉ　ＶＶＭ 供給プロフィール：３ｇ／Ｉｘｈ　□〜２４時間６　ｇ／　ｌ　ｘ　ｈ　２４〜 １４４−２４時間目のＡＳＰＯ３振盪フラスコ培養物５ｏ■Ｉで接種。

滅菌中、タンク培地及び／又は供給培地に関するｐＨは（ヘモグロビンを供給す ると）　１０．５まで上昇した。ヘモグロビンはｐ［１１０，５にて、１２１℃ で４０分間オートクレーブにかけた０発酵前のｐｉは７．８に調整した。

７４　０ｇ／ｌ　ｔｏ。

７８　１ｇ／ｌ　１１７ ７９　５ｇ／ｌ　２５０ １１５（赤血球細胞）３００ ５ｇ／Ｉ　Ｌｏｇ／ｌ 的に１００％に設定 ペルオキシダーゼの収率は発酵培地にヘモグロビンを加えることによって顕著に 上昇しうることか表から明らかである。ヘミンによって同程度の収率の上昇を得 ることは不可能であった。

１３０　１４０　Ｌ５０　１６０　１７０　１１！０ＣＡＧＣＣｋＧＴＧＣＴＧ ＣＧＴＣＴＧＧＴＴＣＧｋＣにＴＴＣＴＡＧＡＣＧＡＴＣＴＴＣＡＧＡＣＣ入λ ＣＴＴＣＴＡＣＣλ入ＧＧＦｉｇ、１ａ ９７０　９＋１０　９９０　１０００　１０１０　１０２０ＴＧＴＧＴＣＣλλ ＣＡＡＣＧＣ丁ＧＣ？ＣＣＴＧ丁Ｔ入ＴＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＣ’ｌ”ｒλＣ’ ｌ’ＧＴＣＧＡＴＧλτ入丁ＣＧＡＧＧs Ｇ入λｋＧｋｋＪｕＡＣλ入Ｃλ入ＴＧＣＡＡＣＧＴＧＡＧＣ入Ｇλ入λＴＣ入 ＧＣ入入ＡＡＡＡＡＴＡＡＡＴＣＡＧＴ入ＴＡＣτＡＦｉｇ、１ｂ 国際調査報告 ■−＋−−−＋＋＋ＩＩｌ＋−＋−，−１−＋＋ｐｍＴ／ｎ１（Ｑ７／１１＋１ ｎＲＲＡｃｃｕｒｄＬｎｇ１ｙ、ｎｕ　５ｅａｒｃｈ　ｗａｓ　ｐｅｒｒｕｒｍ ｅｄ　Ｉ”ｕｒ　ｃｌａｉｍ　１０゜フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／３１・ ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：６９） （Ｃ１２Ｎ　９１０２ Ｃ１２Ｒ１：６９） （Ｃ１２Ｎ　１５１５３ Ｃ１２Ｒ１：６４５） Ｉ

Claims (12)

【特許請求の範囲】
1. １．糸状菌類における異種ヘムタンパク質の細胞外製造のための方法であって、 （ａ）異種ヘムタンパク質をコードするＤＮＡ配列及び発現ヘムタンパク質の分 泌を可能にするプレ領域をコードするＤＮＡ配列を含んで成る組換ＤＮＡベクタ ーによって適当な糸状菌類を形質転換させ、次いで （ｂ）ヘムタンパク質の製造を誘発せしめる条件のもとで、適当な培養培地の中 で、この形質転換糸状菌類を培養せしめること、を含んで成る方法。
2. ２．前記の糸状菌類がアスペルギルス種の株である、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記アスペルギルス種がアスペルギルスオリザである、請求項２に記載の方 法。
4. ４．前記プレ領域が、アスペルギルス種のアミラーゼもしくはグルコアミラーゼ をコードする遺伝子、リゾムコールミーヘイのリパーゼもしくはプロテアーゼを コードする遺伝子、又はコプリヌスのペルオキシダーゼをコードする遺伝子に由 来する、請求項１に記載の方法。
5. ５．前記プレ領域が、Ａ．オリザのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガーの中性α− アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーのグルコアミラ ーゼ、又はコプリヌスシネレウスもしくはマクロリズスにより製造されるペルオ キシダーゼをコードする遺伝子に由来する、請求項４に記載の方法。
6. ６．前記ヘムタンパク質がオキシドリダクターゼである、請求項１〜５のいづれ か１項に記載の方法。
7. ７．前記オキシドリダクターゼがペルオキシダーゼ又はハロペルオキシダーゼで ある、請求項６に記載の方法。
8. ８．前記ペルオキシダーゼをコードするＤＮＡ配列がコプリヌス種、特にコプリ ヌスマクロリズス又はシネレウスに由来する、請求項７に記載の方法。
9. ９．工程（Ｃ）において、形質転換糸状菌類により製造されるヘムタンパク質を 培養物からその後回収する、請求項１に記載の方法。
10. １０．コプリヌス種のペルオキシダーゼをコードする図１Ａ〜１Ｂに示すＤＮＡ 配列又はその適当な改質体を含んで成るＤＮＡ構築体。
11. １１．請求項１０に記載のＤＮＡ構築体を含んで放る組換発現ベクター。
12. １２．請求項１１に記載のベクターにより形質転換された糸状菌類の宿主細胞。