JPH09503664A

JPH09503664A - Ｈ▲下２▼ｏ▲下２▼安定ペルオキシダーゼ変異体

Info

Publication number: JPH09503664A
Application number: JP7511202A
Authority: JP
Inventors: イェルホルトペデルセン，アンデルス; ビン，イェスペル; スベンセン，アラン; アール．チェリー，ジョエル; ラムサ，マイケル; シュナイデル，パレ; ロストガールトイェンセン，ビルゲル
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1993-10-13
Filing date: 1994-10-13
Publication date: 1997-04-15
Also published as: AU7853194A; FI961650A0; CN1133062A; KR960705029A; CA2173946A1; FI961650L; WO1995010602A1; KR100338786B1; FI961650A7; BR9407808A; EP0724631A1; US5817495A

Abstract

(57)【要約】本発明は秀れた過酸化水素安定性を示すコプリナス・シネレウスの新規変異体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 H₂O₂安定ペルオキシダーゼ変異体発明の分野本発明は、ペルオキシダーゼの新規変異体、および該ペルオキシダーゼ変異体を含んでなる漂白組成物又は洗剤組成物に関する。発明の背景洗浄手順における漂白剤並びに洗剤組成物の成分としての使用は、当業界において公知である。従って、漂白剤は、商業的に入手可能な洗剤組成物の主成分の成分として配合されるか又は市販されている。洗剤組成物中に配合される重要な通常の漂白剤は、洗浄プロセス中形成される過酸化水素の前駆体として作用する化合物である。パーボラートおよびパーカーボナートは漂白剤として用いられそしてこの形式で漂白効果を示す化合物の重要な例である。これらの漂白剤により漂白の詳しい機構は、現在公知であるが、一般に次の内容が推定されている；すなわち洗浄中形成される過酸化水素は、着色物質（布帛上のしみの原因である）を、酸化により非着色物色に変えてそして着色物質の酸化は、ポーボラート又はパーカーボナートとそれらの直接相互作用に起因して生じるかもしれない。以下の内容が見出された；すなわち基質として過酸化水素を利用するペルオキシダーゼは、洗浄中過酸化水素の漂白効果を高めることができる。布帛上のしみを漂白するペルオキシダーゼの使用は、国際公開(W／O)89／09813に記載されている。また、以下の内容が見出された; すなわち染色布帛から浸出した着色物質は過酸化水素と共にペルオキシダーゼによって漂白できる。このように染色移行を阻害するためのペルオキシダーゼの使用はWO91／05839に記載されている。発明の要約驚くべきことに以下の内容が見出された；すなわち、アルカリ条件下過酸化水素に対し改善された安定性を有するペルオキシダーゼ変異体が、組換をDNA工学により作製できる。従って、本発明は親ペルオキシダーゼ、配列番号１で示される配列によってコードされるコプリナス・シネレウス(Coprinus cinereus)ペルオキシダーゼのアミノ酸残基48〜56，76，109，214，239，258〜262，264，266〜272の領域における１個又はそれ以上のアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換によって特徴づけられる、アルカリ条件で改善された過酸化水素安定性を有するペルオキシダーゼ変異体に関する。親ペルオキシダーゼの結晶構造に関する情報は、Ｘ線回折および親ペルオキシダーゼのアミノ酸配列を他の公知ペルオキシダーゼアミノ酸配列に整列させることによって得られた(K.G.ウリンデル等、“Structure and evolution of peroxi dases”in Plant Peroxidase Biochemistry and Physiology，K.G．ウリンデル等（編．）、コペンハーゲンおよびジエネバ大学 1993)。本発明に関し、語句「改善された過酸化水素安定性」とは、ペルオキシダーゼ変異体が0.20mMまでのH₂O₂濃度で過酸化水素の存在下、親ペルオキシダーゼよりも少なくとも10％より安定であることを示すものとする。より特異的には、このことは10℃〜60℃の温度範囲内のある温度又は複数の温度でそして20mMまでのH₂ O₂の１又はそれ以上のH₂O₂濃度でペルオキシダーゼ変異体は、野性型ペルオキシダーゼ（親ペルオキシダーゼ）よりも少なくとも10％より長い半減期を有する。（半減期は、残留活性を最初の桁の減衰に適合させることにより測定される）。語句「アルカリ条件」は、７〜11のpH範囲を示すことが意図される。他の面において、本発明は本発明に係るペルオキシダーゼおよび過酸化水素源を含んでなり、所望により追加して酸化性基質を含んでなる漂白組成物；および界面活性剤、本発明に係るペルオキシダーゼ変異体および過酸化水素源を含んでなり、所望により追加的に酸化性基質を含んでなる洗剤組成物に関する。図面の簡単な説明本発明を更に添付の図面により説明する。第１図はプラスミドpHD414を示し、これはプラスミドp775（ヨーロッパ特許238023に記載される）から誘導される。プラスミドpHD414は、例１に従って得られる。発明の詳細な開示本記載及び請求の範囲において、次の略記号が用いられる。アミノ酸：Ａ＝Ala＝アラニンＶ＝Val＝バリンＬ＝Leu＝ロイシンＩ＝Ile＝イソロイシンＰ＝Pro＝プロリンＦ＝Phe＝フェニルアラニンＷ＝Trp＝トリプトファンＭ＝Met＝メチオニンＧ＝Gly＝グリシンＳ＝Ser＝セリンＴ＝Thr＝トレオニンＣ＝Cys＝システインＹ＝Tyr＝チロシンＮ＝Asn＝アスパラギンＱ＝Gln＝グルタミンＤ＝Asp＝アスパラギン酸Ｅ＝Glu＝グルタミン酸Ｋ＝Lys＝リシンＲ＝Arg＝アラギニンＨ＝His＝ヒスチジン本発明に係るペルオキシダーゼ変異体において、次の命名法が引用を容易にするため用いられる。もとのアミノ酸：位置：置換アミノ酸（１以上）命名法によれば、例えば位置48でリシンをセリンにより置換することは、K48S として示され；同じ位置でのリシンの欠失はK48^*として示され；そして追加のアミノ酸残基例えばチロシンの挿入は、K48KYとして示される。多重置換は、プラスにより分離される、すなわち：E214L＋E239Lは、位置214 および259においてロイシンをグルタミン酸で置換した突然変異を示す。親ペルオキシダーゼは、配列番号１で示されるアミノ酸配列によってコードされる。該配列はコプリナス・シネレウス(Coprinus cinereus)から由来することができる。本発明のペルオキシダーゼ変異体の一つの態様において、１又はそれ以上のアミノ酸残基が、配列番号１で示されるアミノ酸によりコードされる親ペルオキシダーゼのアミノ酸残基48〜56，76，109， 214，239，258〜262，264，266〜272の領域内で欠失しているか、挿入されているか又は置換されている。本発明に係るペルオキシダーゼ変異体の他の態様において、１又はそれ以上のアミノ酸残基は、次の如く好適合に置換され得る： K48S, V53K,A, G72Q, A91C, N92K, H109K, Q118E, M125A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM125S,T, S147Q, I152C, P155C, M166A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM166S,T, N192K, I195K, V206R, E214L, K218R, F229G, A230C, E239A,V,L,I,P,F,W,M,G,S,T,C,Y,N,Q,D,K,R,H, 特にE239K,G,S,L,Q,M, M242A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM242S,T, S244C, S252P, W258F,H, M261A,V,L,I,P,F,W,G,S,T,C,Y,N,Q,D,E,K,R,H, 特にM261F,V,I,L,Q, M268A,V,L,I,P,F,W,G,S,T,C,Y,N,Q,D,E,K,R,H, 特にM268F,V,I,L,Q, Y272A,V,L,I,P,F,W,G,S,T,C,M,N,Q,D,E,K,R,H, 特にY272F, M276A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM276S,T, K278R, M279A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM279S,T, A304E, V314P 。択一的態様において、本発明に係るペルオキシダーゼ変異体は、前記ペルオキシダーゼ変異体のフラグメントであってよい。本発明によれば、ペルオキシダーゼの２以上のアミノ酸残基は次の如く置換されていてもよい： K41R＋K48R, V53K＋Q118E, V53A＋E239G, I152C＋A91C, P155C＋A230C, M166F＋E239K, G167N＋V176L, E214L＋E239L, R241E＋E239K, S244C＋P155C, E239K＋M242I＋Y272F, M166F＋E239K＋M242I＋Y272F, M125L＋M166F＋E239K＋M242I＋Y272F 。本発明によれば、本発明で開示した置換、挿入又は欠失は、国際公開WO93／24 618に開示された置換、挿入又は欠失と組合わされることができ、ここにおいて１又はそれ以上のアミノ酸残基が、配列番号１で示される如き本発明で示される親ペルオキシダーゼのアミノ酸残基79〜94，125，153〜157，161〜204の領域内で欠失され、挿入され又は置換される。そのような組み合わせの例は、変異体M2 42I＋Y272F＋E239Kであり、これは例４で実証されるように極めて良好な過酸化水素安定性である。親ペルオキシダーゼをコードするDNA配列を、当業界で周知の種々の方法により対象のペルオキシダーゼを生産する任意の微生物から単離できる。最初に、ゲノムDNAおよび／又はcDNAライブラリーが、研究されるべきペルオキシダーゼを生産する生物体から染色体DNA又はメッセンジャーRNAを用いて構築されるべきである。次いで、もしもペルオキシダーゼのアミノ酸配列が公知であるならば、相同の標識したオリゴヌクレオチドプローブが合成できそして細菌DNAのゲノムライブラリー由来の又は菌類cDNAライブラリー由来のペルオキシダーゼをコードするクローンを同定するために用いられる。択一的に、菌類のもう一つの菌株由来のペルオキシダーゼに相同の識別化オリゴヌクレオチドプローブ含有配列が、低めのストレンジェンシーのハイブリッド形成および洗浄条件を用い、ペルオキシダーゼをコードするクローンを同定するためプローブとして用いることができる。ペルオキシダーゼ生産クローンを同定するためのもう一つの方法は、ゲノムDN Aのフラグメントを発現ベクタ、例えばプラスミドに挿入し、生成ゲノムDNAライブラリーでペルオキシダーゼ−陰性細菌を形質転換し、次いで形質転換された細菌を、ペルオキシダーゼに対する基質を含有する寒天上にプレートする。ペルオキシダーゼ−担持プラスミドを含有するこれらの細菌は、過酸化水素の添加により、分泌されたペルオキシダーゼによる酸化のため、透明な寒天のハローにより囲まれたコロニーを生産する。択一的に酵素をコードするDNA配列は、合成的に確立された標準法、例えばベアウカーゲおよびM.H.カルザースにより記載されたホスホアミダイト法、Tetera hedon Letters 22，1981，1859-1869頁、又はマテス等により記載された方法、1 981，1859-1869頁、TheEMBO J．3，1984，801-805頁により合成的に調製できる。ホスホアミダイト（phosphodmidite）法によれば、オリゴヌクレオチドが例えば自動DNA合成株で合成され、精製され、アュールされ、結合されそして適当なベクター中でクーロン化される。最初に、DNA配列は、合成のゲノムの又はcxDNA起源（適当な場合）のフラグメントを結合することによって作成される混合ゲノムおよび合成、混合合成および cDNA又は混合ゲノムおよびcDNA起源から作成されるものであってよく、フラグメントは標準法に従い全DNA配列の種々の部分に相当する。DNA配列はまた、例えば米国特許4,683,202又はR.K.サイキ等、Science 239，1988，487-491頁に記載される如き特異的プライマーを用いてポリメラーゼ鎖反応（PCR）により調製できる。一度、ペルオキシダーゼをコードするDNA配列を単離されそして突然変異のための望ましい部位が同定されると、突然変異が合成ネクレオチドを用いて導入され得る。これらのオリゴヌクレオチドは、所望の突然変異部位に隣接するヌクレオチドを含有し；突然変異ヌクレオチドはオリゴヌクレオチド合成中に挿入される。特異的方法において、ペルオキシダーゼをコードする配列を架橋する、DNA の一本鎖ギャップが、ペルオキシダーゼ遺伝子を有するベクター中で作られる。次いで、所望の突然変異を担持する合成ヌクレオチドを、一本鎖DNAの相同部分にアニールする。次いで残りのギャップはDNAポリメラーゼＩ（クレノウフラグメント）でフィルインされ次いで構築体をＴ４リガーゼを用いて結合する。この方法の特異的例は、モリナガ等(1984，Biotechnology ２：646-639)に記載されている。1988年７月26日に発行されたエステルによる米国特許4,760,025は、カセットの小部分の変更を行うことによる、多重突然変異をコードするオリゴヌクレオチドの導入を開示しているが、しかし、より多様の突然変異がモリナガの方法によりいつでも導入できる、何故なら種々の長さの多数のオリゴヌクレオチドが導入できるからである。ペルオキシダーゼをコードする配列に突然変異を導入するもう一つの方法は、ネルソンおよびロング、Analytical Biochemistry 180，147-151頁に記載されている。その論文はPCR反応においてプライマーの一つとして、化学的に合成されたDNA鎖を用いることにより導入された所望の突然変異を含有するPCRフラグメントの３工程作成を含む。PCR−作成フラグメントから、突然変異を有するDNAフラグメントは制限エンドヌクレアーゼを用いて切断することにより単離できそして発現プラスミドに再挿入できる。本発明によれば、前記の方法又は当業者に公知の択一的方法によって生産した突然変異したペルオキシダーゼをコードする配列は、発現ベクターを用い、酵素形で発現でき、該発現ベクターは典型的にはプロモーター、オペレーター、リポソーム結合部位、翻訳開始シグナル、および所望によりレプレッサー遺伝子又は種々の活性化遺伝子をコードする調節配列を含む。発現されたタンパク質の分泌を許容せしめるため、シグナル配列をコードするヌクレオチドは、ペルオキシダーゼをコードする配列の前に挿入できる。調節配列の方向下での発現に対し、標的遺伝子は、適当な読み枠内で調節配列に操作的に結合される。プラスミドベクター内に挿入でき、そして変異体ペルオキシダーゼ遺伝子の翻訳を支持できるプロモーター配列は、原核β−ラクタマーゼプロモーター(ビラ−カマロフ等、1978，Proc.Natl.Acad.Sci．U.S.A 75：3727-3721)およびtacプロモーター(デボエル等、1983，Proc.U.S.A．80：21-25)に制限されない。更に、文献が「Useful Proteins from recombinant bacteria」in Scientific American ，1980，242：74-94において見出される。一つの態様によれば、Ｂ．ズブチリス（subtilis）が、突然変化したDNAを有する発現ベクターにより形質転換される。もしも発現が分泌する微生物例えばＢ．ズブチリス（subtilis）内が生起すべき場合、シグナル配列が翻訳開始ジグナルにつづきそして対象のDNA配列に先行する。シグナル配列は翻訳生成物を細胞壁に輸送し該壁ではそれを分泌により生成物から分解される。先に定義した如き語句「調節配列」は、存在する場合シグナル配列を含むことが意図される。本発明のペルオキシダーゼ変異体をコードするDNA配列で形質転換された宿主生物体は、酵母、好ましくはサッカロマイセス(Saccharomyces)、例えばサッカロマイセスセレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）又はシゾサッカロマイセスポムベ(Schizosaccharomy ces pombe)、又はピチア（Pichia）、例えばピチアパストリス(Pichia pastoris )の菌株であってよい。本発明のペルオキシダーゼ変異体を生産する今日の好ましい方法において、線維状菌類が宿主生物体として用いられる。線維状菌類宿主生物体は、好都合には、組換えタンパク質を生産するために宿主として既に用いたものであってよく、例えばアスペルギルス(Aspergillus)sp．例えばＡ．ニガー(niger)，Ａ．ニダルアンス（nidulans）又はＡ．オリゼ（oryzae）の菌株である。組換えタンパク質の生産におけるＡ．オリゼ（oryzae）の使用は、例えばヨーロッパ特許238023において広範囲に記載されている。アスペルギルス(Aspergillus)におけるペルオキシダーゼ変異体の発現に対し、ペルオキシダーゼ変異体に対してコードするDNA配列がプロモーターにより先行される。プロモーターはアスペルギルス(Aspergillus)中で強い転写活性を示す如何なるDNA配列であってよくそしてアミラーゼ、グルコアミラーゼ、プロテアーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、セルラーゼ又は解糖酵素の如き細胞外又は細胞内タンパク質をコードする遺伝子から由来できる。適当なプロモーターの例は、Ａ．オリゼ(oryzae)TAKAアミラーゼ、リゾムコールマイヘイ(Rhizomucor miehei)アスパラ銀酸プロテアーゼ、Ａ．ニガー(niger) 中性アミラーゼ、Ａ．ニガー(niger)酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガー(nige r)グルコアミラーゼ、リゾムコールマイヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼ、Ａ．オリゼ（oryzae）アルカリプロテアーゼ又はＡ．オリゼ（oryzae）トリオースホスファートイソメラーゼをコードする遺伝子から由来するプロモーターである。特に、宿主生物体がＡ．オリゼ（oryzae）であるとき、本発明方法において使用するための好ましいプロモーターは、それがＡ．オリゼ（oryzae）中で強い翻訳活性を示すように、Ａ．オリゼ（oryzae）TAKAプロモーターである。TAKAアミラーゼプロモーターの配列は、ヨーロッパ特許238023 に開示される。停止およびポリアデニル化配列は、プロモーターと同じ起源から適当に由来できる。菌類宿主細胞を形質転換するために用いられる技術は、ヨーロッパ特許238023 に記載されるような適当なものでよい。宿主細胞からペルオキシダーゼ変異体の分泌を確保するため、ペルオキシダーゼ変異体をコードするDNA配列は、シグナル配列によって先行されることができ、このシグナル配列は天然シグナル配列又はその官能部分又は細胞からタンパク質の分泌を与える合成配列であってよい。特に、シグナル配列は、アスペルギルス(Aspergillus)sp．アミラーゼもしくはグルコアミラーゼをコードする遺伝子、リゾムコールマイヘイ(Rhizomucor miehei)リパーゼもしくはプナテアーゼをコードする遺伝子、又はフミコラ（Humicola）セルラーゼ、キシラナーゼ又はリパーゼをコートする遺伝子から由来できる。シグナル配列は、好ましくはＡ．オリゼ(oryzae)TAKAアミラーゼ、Ａ．ニガー(niger)中性アミラーゼ、Ａ．ニガー( niger)酸安定性α−アミラーゼ、コプリナス・シネレウス（Corprinus cinereus ）又はマクロリザス(macrorhizus)ペルオキシダーゼ、又はＡ．ニガー(niger)グルコアミラーゼをコードする遺伝子から由来する。形質転換された細胞を培養するために用いられる培地は、アスペルギルス(Asp ergillus)細胞を増殖するのに適した全ての普通培地である。形質転換体は通常安定でありそして選択圧力の不存在下で培養できる。しかし、もしも形質転換体が不安定であることが見出された場合、細胞へ導入される選択マーカーが選択に対して使用できる。宿主細胞から分泌される成熟ペルオキシダーゼタンパク質は、遠心分離又は濾過による培地から細胞の分離、次いで塩例えば硫酸アンモニウムにより培地のタンパク質成分の沈殿、引き続きイオンクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー等のクロマトグラフィー手段を含む周知の手段により培地から好都合に回収できる。ペルオキシダーゼ変異体の漂白効果を得るため、過酸化水素又は過酸化水素の前駆体、好ましくはパボラート又はポーカーボナート、又は過酸化水素発生酵素系、例えばオキシダーゼおよびその基質、又はペルオキシカルボン酸又はその塩がペルオキシダーゼ変異体に対し基質として本発明の漂白組成物中に存在すべきである。着色物質のペルオキシダーゼ漂白の機構が布帛又は洗液中に存在するけれども、今日以下のように信じられている；すなわち酵素は過酸化水素を還元させそして着色物質（電子供与体基質）を酸化することによって作様し、これにより無色の物質を発生させるか又は布帛に吸着されない物質を与える。この反応は、下記の反応図式Ｉで示される。反応図式Ｉ：供与体基質＋H₂O₂ペルオキシダーゼ酸化された供与体＋H₂O 過酸化水素に感受性の少ない本発明に係るペルオキシダーゼ変異体を用いることにより、少量の酵素を漂白／洗液に加えそして満足な漂白効果を得ることが可能である。漂白組成物において、ペルオキシダーゼ変異の量は、0.1〜20PDPU／mlの洗液中の濃度に相当し、そして過酸化水素又は過酸化水素前駆体又は過酸化水素酵素系又は過カルボン酸又はそれらの塩は20mMまでのH₂O₂の過酸化水素濃度に相当する。ペルオキシダーゼ活性の測定１ペルオキシダーゼ単位（PODU）は、次の分析条件下毎分１μmolの過酸化水素の変換する触媒する酵素の量である：0.88mMの過酸化水素、1.67mMの２，２′ −アジノビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホナート）、0.1Ｍホスファート緩衝剤、pH7.0、30℃でインキュベートする、418nmで光度測定的に追跡される。漂白組成物として本発明のペルオキシダーゼ変異体の使用に対し、以下の内容が見出された；すなわち、洗浄および／又はすすぎ工程の当初又はそれら中で、（本発明のペルオキシダーゼ変異体に対する）もう一つの酸化性基質の添加は、用いられるペルオキシダーゼ変異体の漂白効果を高めることができる。このことは、着色基質の漂白又は他の変形に関与するこの基質のラジカル又は他の酸化状態の形成に起因すると考えられている。そのような酸化性基質の例は、有機化合物例えばフェノール化合物、例えばｐ−ヒドロキシベンゼンスルホメートである。本発明に対し使用できるフェノール化合物の他の例は、Ｍ．カートおよびＳ．シミズ、Plant Cell physiol．26(7)，1985，1291-1301頁（注特に表１）又はB. C.サンダース、Peroxidase，ロンドン、1964，141頁以降において与えられるものである。国際公開WO94／12621において他のタイプの増強剤が開示されそしてこれらは本発明の目的に対し使用でき、例えばフェノチアジンおよびフェノキサジンおよびそれらの誘導体例えば10−メチルフェノチアジン、10−フェノチアジン−プロピオン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−10−フェノチアジン−プロピオナート、10−エチル−４−フェノチアジンカルボン酸、10−エチルフェノチアジン、10−プロピルフェノチアジン、10−イソプロピルフェノチアジン、メチル−10−フェノチアジンプロピオナート、10−フェノニルフェノチオチアジン、 10−アリルフェチアジン、10−（３−（４−メチル−１−ピペラジニル）プロピル）フェノチアジン、10−（２−ピロリジノエチル）フェノチアジン、プロアジン、２−クロロ−10−メチルフェノチアジン、２−アセチル−10−メチルフェノチアジンおよび10−Ｘチルフェノキサジンである。酸化性基質の量は、0.1μＭ〜100μＭの洗液中の濃度に相当する。洗剤組成物本発明によれば、ペルオキシダーゼ変異体は洗剤組成物の成分として添加できる。そのようなものとして、ペルオキシダーゼ変異体は洗剤用添加剤の形で洗剤組成物中に含ましめることができる。洗剤組成物並びに洗剤添加剤は、１種以上の他の酵素、例えばプロテアーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、クチナーゼあるいはセルラーゼを追加的に含んでなることができる。特異的面において、本発明は洗剤用添加剤を提供する。酵素は１種又はそれ以上の酵素を含有する別個の添加剤を添加することにより、又は全てのこれらの酵素を含んでなる組合された添加剤を添加することにより洗剤組成物中に含ましめることができる。本発明の洗剤用添加剤、すなわち別個の添加剤又は組合された添加剤は、例えば粒質物、液体、スラリー等として調合できる。好ましい洗剤用添加剤調合物は、粒質物、特に無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー、又は保護された酵素である。無粉塵性粒質物は、例えば米国特許4,106,991 および米国特許4,661,452（双方ともノボノルディスクＡ／Ｓに付与）に開示される如く製造できそして所望により当業者に公知の方法で被覆できる。洗剤用酵素は造粒前又は造粒後に混合され得る。ろうのようなコーティング材料の例は、平均分子量1000〜2000を有するポリ（エチレンオキシド）製品；16〜50個の酸化エチレン単位を有するエトキシル化ノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を含有しそして15〜80個の酸化エチレン単位が存在するエトキシル化脂肪アルコール；脂肪アルコール；脂肪酸；および脂肪酸のモノ−およびジーおよびトリグリセリドである。流動床技術により適当に対し適当なフィルム形成コーティング材料の例は、英国特許1483591に示される。液体酵素調製品は、例えば確立された方法に従い、ポリオール例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することにより安定化され得る。保護された酵素は、ヨーロッパ特許238,216に記載された方法に従って製造できる。本発明の洗剤組成物は、あらゆる通常の形態であってよく、例えば粉末、顆粒又は液体である。液体洗剤は典型的には70％までの水および０〜30％の有機溶剤を有するか、又は非水性であってよい。洗剤組成物は、１種又はそれ以上の界面活性剤を含むことができ、これらの各々はアニオン、非イオン、カチオン、双性又はこれらのタイプの混合物であってよい。洗剤は通常０〜50％のアニオン界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホナート(LAS)、α−オレフィンスルホナート(AOS)、アルキルスルファート (脂肪アルコールスルファート)(AS)、アルコキシエトキシスルファート(AEOS又はAES)、第二級アルカンスルホナート(SAS)、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニルコハク酸又は石けんを含有するであろう。洗剤組成物はまた０〜40％の非イオン界面活性剤例えばアルコールエトキシラート（AEO 又はAE）、カルボキシル化アルコールエトキシラート、ノニルフェノールエトキシラート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド、又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸アミド（例えばWO92／06154に記載の如し）を含有していてもよい。洗剤組成物は１種又はそれ以上の他の酵素、例えばアミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼおよびセルラーゼを追加的に含むことができる。洗剤は、１〜65％の洗剤用ビルダー又は錯化剤例えばビオライト、ジホスファート、トリホスファート、ホスホナート、シトラート、ニトロトリ酢酸(NTA)、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTMPA)、アルキル−又はアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は層状シリケート（例えば、ヘキストからのSKS−６）を含有してもよい。洗剤はまたビルダーを含まなくてもよく、すなわち洗剤用ビルダーを本質的に含まなくてもよい。洗剤は、１種以上のポリマーを含んでいてもよい。その例は、カルボキシメチルセルロース(CMC)、ポリ(ビニルピロリドン)(PVP)、ポリエチレングリコール(P EG)、ポリ(ビニルアルコール)(PVA)、ポリカルボキシラート例えばポリアクリラート、マレイン酸／アクリル酸コポリマーおよびラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーである。洗剤は、漂白系を含有でき、この漂白系はポーボラート又はパーカーボナートの如きH₂O₂源を含んでいてもよくそしてそのH₂O₂源は過酸−形成漂白活性化剤、例えばテトラアセチルエチレンジアミン（TAED）又はノナノイルオキシベンゼンスルホナート（NOBS）と組合せることもできる。択一的に、漂白系は、例えばアミド、イミド又はスルホンタイプのペルオキシ酸を含んでいてもよい。本発明の洗剤組成物の酵素は、通常の安定剤、例えばポリオール例えばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又はホウ酸誘導体例えば芳香族ボラートエステルを用いて安定化でき、そして組成物は例えばWO92／19709およびWO92／19708に記載される如く調合できる。洗剤は又他の通常の洗剤成分、例えば粘土を含む布帛柔軟剤、起泡増進剤、起泡抑制剤、耐蝕剤、土壌−沈殿防止剤、抗土壌−再付着剤、染料、殺菌剤、蛍光増白剤又は香料を含有できる。（使用濃度で水性溶液中で測定される）pHは通常中性であるか又はアルカリ性であり、例えば７−11であろう。本発明の範囲内の洗剤組成物の特定の形態には次下のものが含まれる：１）以下の成分を含んでなる少なくとも600ｇ／１の嵩密度を有する粒質物として配合される洗剤組成物： −直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算）７−12％ −アルコールエトキシスルファート (例えばＣ_12-18アルコール、１−２ EO)又は −アルキルスルファート（例えばＣ_16-18）１−４％ −アルコールエトキシラート（例えばＣ_14-15 アルコール、７ EO）５−９％ −ナトリウムカーボナート（Na₂CO₃として） 14−20％ −可溶性シリケート（Na₂O，２SiO₂として）２−６％ −ゼオライト（NaAlSiO₄として） 15−22％ −ナトリウムスルファート（Na₂SO₄として）０−６％ −ナトリウムシトラート／クエン酸（C₆H₅Na₃O₇／C₆H₈O₇として）０−15％ −ナトリウムパボラート（NaBO₃.H₂Oとして） 11−18％ −TAED ２−６％ −カルボキシメチルセルロース０−２％ −ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、PVP，PEG）、０−３％ −酵素０−５％ −少量成分（例えば気泡抑制剤、香料、蛍光増白剤、光漂白）０−５％２）以下の成分を含んでなる少なくとも600ｇ／１の嵩密度を有する粒質物として配合される洗剤組成物： −直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算）６−11％ −アルコールエトキシスルホナート（例えばＣ_12-18 アルコール、１−２ EO)又は −アルキルスルファート（例えばＣ_16-18）１−３％ −アルコールエトキシラート（例えばＣ_14-15 アルコール、７ EO）５−９％ −ナトリウムカーボナート（Na₂CO₃として） 15−21％ −可溶性シリケート（Na₂O，２SiO₂として）１−４％ −ゼオライト（NaAlSiO₄として） 24−34％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）４−10％ −ナトリウムシトラート／クエン酸酸（C₆H₅Na₃O₇／C₆H₈O₇として）０−15％ −カルボキシメチルセルロース０−２％ −ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、PVP，PEG）、１−６％ −酵素０−５％ −少量成分（例えば気泡抑制剤、香料）０−５％３）以下の成分を含んでなる少なくとも600ｇ／１の嵩密度を有する粒質物として配合される洗剤組成物： −直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算）５−９％ −アルコールエトキシラート（例えばＣ_12-15 アルコール、７ EO）７−14％ −脂肪酸の如き石けん（例えばＣ_16-22）１−３％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として） 10−17％ −可溶性シリケート（Na₂O，２SiO₂として）３−９％ −ゼオライト（NaAlSiO₄として） 23−33％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）０−４％ −過ホウ酸ナトリウム（NaBO₃.H₂O）８−16％ −TAED ２−８％ −ホスホナート（例えばEDTMPA）０−１％ −カルボキシメチルセルロース０−２％ −ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、PVP，PEG）０−３％ −酵素０−５％ −少量成分（例えば気泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）０−５％４）以下の成分を含んでなる少なくとも600ｇ／１の嵩密度を有する粒質物として配合される洗剤組成物： −直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算）８−12％ −アルコールエトキシラート（例えばＣ_12-15 アルコール、７ EO） 10−25％ −ナトリウムカーボナート（Na₂CO₃として） 14−22％ −可溶性シリケート（Na₂O，２SiO₂として）１−５％ −ゼオライト（NaAlSiO₄として） 25−35％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）０−10％ −カルボキシメチルセルロース０−２％ −ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸コポリマー、PVP，PEG）、１−３％ −酵素０−５％ −少量成分（例えば気泡抑制剤、香料）０−５％５）以下の成分を含んでなる水性液体洗剤組成物： −直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算） 15−21％ −アルコールエトキシラート（例えばＣ_12-15 アルコール、７ EO又はＣ_12-15 アルコール、５ EO） 12−18％ −脂肪酸の如き石けん（例えばオレイン酸）３−13％ −アルケニルコハク酸（Ｃ_12-14）０−13％ −アミノエタノール８−18％ −クエン酸２−８％ −ホスホナート０−３％ −ポリマー（例えばPVP，PEG）０−３％ −ボラート（B₄O₇として）０−２％ −エタノール０−３％ −プロピレングリコール８−14％ −酵素０−５％ −少量成分（例えば分散剤、気泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）０−５％６）以下の成分を含んでなる水性構成化液体組成物： −直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算） 15−21％ −アルコールエトキシラート（例えばＣ_12-15 アルコール、７ EO 又はＣ_12-15 アルコール、５ EO）３−９％ −脂肪酸の如き石けん（例えばオレイン酸）３−10％ −ゼオライト（NaAlSiO₄として） 14−22％ −クエン酸カリウム９−18％ −ボラート（B₄O₇として）０−２％ −カルボキシメチルセルロース０−２％ −ポリマー（例えばPEG，PVP）０−３％ −定着ポリマー例えばラウリルメタクリレート／アクリル酸ポリマー；モル比25：１；分子量3800 ０−３％ −グリセロール０−５％ −酵素０−５％ −少量成分（例えば分散剤、気泡抑制剤、香料、蛍光増白剤）０−５％７）以下の成分を含んでなる少なくとも600ｇ／１の嵩密度を有する粒質物として配合される洗剤組成物： −脂肪アルコールスルファート５−10％ −エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド３−９％ −脂肪酸の如き石けん０−３％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として）５−10％ −可溶性シリケート（Na₂O，２SiO₂として）１−４％ −ゼオライト（NaAlSiO₄として） 20−40％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）２−８％ −過ホウ酸ナトリウム（NaBO₃.H₂Oとして） 12−18％ −TAED ２−７％ −ポリマー（例えば、マレイン酸／アクリル酸コポリマー、PEG）１−５％ −酵素０−５％ −少量成分（例えば蛍光増白剤、気泡抑制剤、香料）０−５％８）以下の成分を含んでなる粒質物として配合される洗剤組成物： −直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算）８−14％ −エトキシル化脂肪酸モノエタノールアミド５−11％ −脂肪酸の如き石けん０−３％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として）４−10％ −可溶性シリケート（Na₂0，２SiO₂として）１−４％ −ゼオライト（NaAlSiO₄として） 30−50％ −クエン酸ナトリウム（Na₂SO₄として）３−11％ −クエン酸ナトリウム（C₆H₅Na₃O₇として）５−12％ −ポリマー（例えばPVP，マレイン酸／アクリル酸コポリマー、PEG）１−５％ −酵素０−５％ −少量成分（例えば気泡抑制剤、香料）０−５％９）以下の成分を含んでなる粒質物として配合される洗剤組成物： −直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算）６−12％ −非イオン界面活性剤１−４％ −脂肪酸の如き石けん２−６％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として） 14−22％ −ゼオライト（NaAlSiO₄として） 18−32％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄として）５−20％ −クエン酸ナトリウム（C₆H₅Na₃O₇として）３−８％ −過ホウ酸ナトリウム（NaBO₃・H₂Oとして）４−９％ −漂白活性化剤（例えばNOBS又はTAED）１−５％ −カルボキシメチルセルロース０−２％ −ポリマー（例えばポリカルボキシラート又はPEG）１−５％ −酵素０−５％ −少量成分（例えば蛍光増白剤、香料）０−５％ 10）以下の成分を含んでなる水性液体洗剤組成物： −直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算） 15−23％ −アルコールエトキシスルファート（例えばＣ_12-15 アルコール、２−３ EO）８−15％ −アルコールエトキシラート（例えばＣ_12-15 アルコール、７EO又はＣ_12-15 アルコール、５ EO）３−９％ −脂肪酸の如き石けん（例えばラウリン酸）０−３％ −アミノエタノール１−５％ −クエン酸ナトリウム５−10％ −ヒドロトロープ（例えばトルエンスルホン酸ナトリウム）２−６％ −ボラート（B₄O₇として）０−２％ −カルボキシメチルセルロース０−１％ −エタノール１−３％ −プロピレングリコール２−５％ −酵素０−５％ −少量成分（例えばポリマー、分散剤、香料、蛍光増白剤）０−５％ 11）以下の成分を含んでなる水性液体洗剤組成物： −直鎖アルキルベンゼンスルホナート（酸として計算） 20−32％ −アルコールエトキシラート（例えばＣ_12-15 アルコール、７EO又はＣ_12-15 アルコール、５ EO）６−12％ −アミノエタノール２−６％ −クエン酸８−14％ −ボラート（B₄O₇として）１−３％ −ポリマー（例えばマレイン酸／アクリル酸ポリマー、定着ポリマー、例えばラウリルメタクリレート／アクリル酸コポリマーおよびCMC）０−３％ −グリセロール３−８％ −酵素０−５％ −少量成分（例えばヒドロトロープ、分散剤、香料、蛍光増白剤）０−５％ 12）以下の成分を含んでなる少なくとも600ｇ／１の嵩密度を有する粒質物として配合される洗剤組成物： −アニオン界面活性剤（直鎖アルキルベンゼンスルホナート、アルキルスルファート、α−オレフィンスルホナート、 α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アルカンスルホナート、石けん） 25−40％ −非イオン界面活性剤（例えばアルコールエトキシラート）１−10％ −炭酸ナトリウム（Na₂CO₃として）８−25％ −可溶性シリケ−ト（Na₂O，２SiO₂として）５−15％ −硫酸ナトリウム（Na₂SO₄して）０−５％ −ゼオライト（NaAlSiO₄として） 15−28％ −過ホウ酸ナトリウム(NaBO₃・４H₂O として) ０−20％ −漂白活性化剤（TAED又はNOBS）０−５％ −酵素０−５％ −少量成分（例えば香料、蛍光増白剤）０−３％ 13）１）−12）において記載した如き洗剤調合物であって、ここで直鎖アルキルベンゼンスルホナート又はその一部の含量が、アルキルスルファート（Ｃ₁₂− Ｃ₁₈）により置換されている。 14）１）−13）において記載した如き洗剤調合物であって、この調合物は追加の成分として又は既に言及した漂白系に対する置換体として安定化又はカプセル化過酸を含有する。 15）マンガン触媒を追加的に含有する１），３），７），９）および12）に記載の如き洗剤組成物。マンガン(Manganese)触媒は、例えば“Efficient mangane se catalysts for low-temperature beleaching”，Natare 369，1994，637-63 9頁に記載された化合物の一つであってよい。 17）液体非イオン界面活性剤、例えば直鎖アルコキシル化第一級アルコール、ビルダー系（例えばホスファート）酵素およびアルカリを含んでなる非水性洗剤液体として調合される洗剤組成物。この洗剤もまた非イオン界面活性剤および／又は漂白系を含むこともできる。現在、次のように考えられている；すなわち本発明の洗剤組成物において、ペルオキシダーゼ変異体は0.01〜20PODU／mlの洗液中での濃度に相当する量で添加され得る。本発明を、以下の実施例により更に説明するが、いかなる場合も権利要求される本発明の範囲に限定されない。例１コプリナス・シネレウス(Coprinus cinereus)ペルオキシダーゼのK485変異体を発現するプラスミドの構築１．コプリナス・シネレウスペルオキシダーゼをコードするcDNAのクローニングPCRによるプロブの構築ペルオキシダーゼcDNA断片を、コプリナス・マクロリザス（Coprinus macrorh izus）ペルオキシダーゼのアミノ酸配列を基礎にして構築された特異的オリゴヌクレオチドプライマー（R.K.サイキ等、Science 239，1988，487-491頁）を用い、ポリメラーゼ連鎖反応を用いて調製した。PCRは製造者の指示に従い遺伝子A mpキットおよび装置（パーキンエレメーシータス、ノルウォーク、CT、米国より入手可能）を用いて行ったが、但し反応を第一の鎖のcDNA（コプリナス・シネレウス(Coprinus cinereus)，IFO8371から得られるmRNAから調製）に対してより良いハイブリット形成を得るため28℃で最初の３回のサイクルを行い次いで65℃で 30回のサイクルのPCRを行った。次の特異的プライマーをPCRに対して用いた： “Ｎ”は全ての４個のヌクレオチドの混合物を示す。プライマーを次の如く組み合わせる：１と２，３と４，５と７，６と７，１と４，１と７および３と７。５′−末端でEcoRIサイトそして３′−末端でBamHIを有する、PCR断片をこのようにして延長した。PCR反応を１％アガロースゲルで分析した。予期した寸法のバンドを全ての反応において見出した。バンドがペルオキシダーゼ特異性配列に対応することを立証するため、ゲルをサザン法に委ねそして次下の配列を有するオリゴヌクレオチドプローブにハイブリッド形成させた：この配列はPCRプライマー３および４間に位置している。プローブは約130bP， 420bP，540bPおよび240bPのバンドにハイブリッド形成することが見出された、従って観察されたDNAバンドは、ペルオキシダーゼ配列に相当する。種々のPCR反応からのDNAを、EcoRIおよびBamHIで消化し次いでプラスミドpUC1 9中にクロニングした（Ｃ．ヤニシペルロン等、gene 33，1985，103-119頁）。正しいPCR断片を含有するコロニーを、前記オリゴヌクレオチドプローブを用いハイブリッド形成により同定した。陽性コロニーからのDNAを制限酵素地図およびサンガー等、Proc.Natl.Acad．Sci.USA，1977，5463-5467頁により記載された如く部分DNA配列分析により分析した。プライマー１および４を用いることにより得られた、クローンの一つからの430bp断片を用い以下に記載する如くコプリナス・シネレウス(Coprinus cinereus)cDNAをスクリーンした。Ｅ．コリー中のコプリナス・シネレウスcDNAライブラリーの構築ベール等(EMBO J.,３：1097-1102，1984)およびチルクウイン等（Biochemistr y(Wash)，18：5294-5299,1979）によって記載された方法によりペルオキシダーゼの最大活性に対する時間において集められた。均質化コプリナス・シネレウス (Coprinus cinereus)(IFO8371)から全RNAを抽出した。ポリ（Ａ）−含有RNAを、アビブおよびリーダー（PNAS，USA 69：1408-14-12，1972）により記載される如くオリゴ（dT）−セルロース上のアフィニティクロマトグラフィーの２回サイクルにより得る。cDNAを、製造者の指示に従いインビトロゲン（Invitrogen）からのcDNA合成キットにより合成する。コプリナス・シネレウスcDNAライブラリーからの約50,000 Ｅ．コリー組換え体を、ワットマン540ペーパーフィルターに移した。コロニーを、ブリー等(Nucleic Acids Res.７，2115-2135，1979)によって記載される如く溶解しそして固定化した。フィルターを、0.2×SSC,0.1％SDS 中で³²Ｐ−ラベル化430bpペルオキシダーゼ特異性プローブとハイブリッド形成した。フィルターのハイブリッド形成および洗浄を65℃で行い次いで強化スクリーンを用い24時間オートラジオグラフィーにより追跡した。オートラジオグラフィー後、フィルターを上昇温度で洗浄し、引き続き増強スクリーンで24時間オートラジオグラフィーにより追跡した。このようにして、50個以上の正のコロニーを同定した。ミニプレププラスミドDNAを、標準法(バームボイムおよびドリーNu cleic Acids Res.７，1513-1523，1979)によりハイブリッド形成コロニーから単離し、次いでcDNA インサートのDNA配列を、サンガージデオキシ手順(サンガー等、Proc.Natl.Acad .Sci.USA 74, 1977，5467)により測定した。ペルオキシダーゼcDNA断片を、Hind III／XhoIを用い分解によりベクターから切除し次いでアガロースゲル電気泳動により精製し、電気溶出し次いで連結反応に対し準備した。cDNA断片をHindIII ／XhoI消化pHD414に結合させpCipを発生させそしてここにおいてcDNAはアスペルギルスオリゼ（Aspergillus oryzae）からのTAKAプロモーターおよびアスペルギルスニガー(Aspergillus niger)からのAMGターミネーターの翻訳制御下にある。アスペルギルス発現ベクターpHD414の構築ベクターpHD414は、（ヨーロッパ特許238023に記載された）プラスミドp775の誘導体である。p775に対照して、pHD414はプロモーターとターミネーター間の独得の制限部位の鎖を有する。プラスミドを、ターミネーターの３′末端に（好ましくない制限部位を含有する）約200bp長の断片の除去および引き続き、また好ましくない制限部位を含有する、プロモーターの５′末端に約250bp長の断片の除去により構築した。200bp 領域を、(pUCベクター中に位置している)NarIおよび（ターミネーターに対し丁度３′に位置している）XhaIを用いて切断によりp775から除去し、引き続きクレノ−DNA ポリメララーゼおよびdNTPで生成末端を平滑末端にし、ゲル上のベクター断片を精製し次いでベクター断片を再結合した。DNAを前記の如くＥ．コリーM C1061中に形質転換した。10個のコロニー（pHD413−１〜10）を選択し次いで制限酵素分析により分析した。制限酵素分析において予期したバンドパターンを示すクローンの一つをpHD414の構築において用いた。 pHD413を、（プロモーターの５′末端内に置かれた）StuIおよび(pUCベクター内に置かれた)Pvullで切断した。ベクター断片を精製し、再結合しそしてＥ．コリーMC1061内に形質転換した。12個のコロニーを選択しそして制限酵素分析により分析した。全ての12個のクローンは、予期したバンドパターンを示した。プラスミドpHD414を第１図に示す。２．３−工程PCR 変異誘発３−工程の突然変異化は、４個のプライマーの使用を含む：プライマーＡおよびＢを、20pmole／μｌに希釈した。プライマーＣおよびＤを、100pmole／μｌに希釈した。全ての３工程を以下の成分を含有する10×PCR緩衝液中で行った：1000mMトリス−HCl，pH8.3，500mM KCl、15mM MgCl₂、0.1％ゼラチン、各々２mM dATPの200 μｌ、２mM dCTPの200μｌ、２mMdGTPの200μｌ、２mM TTPの200ｍμｌおよび20 0μｌのH₂O 。工程１において、10μｌの10×PCR緩衝液、50μｌの２×ヌクレオチド溶液、５μｌのプライマーＡ、５μｌのプライマーＢ、１μｌのpCiP（0.05μｇ／μｌ）、30μｌのH₂O、0.5μｌのTaqポリメラーゼおよび80μｌのパラフィンから構成される反応混合物を、94℃で２分からなる１サイクル、94℃で１分、50℃で１分および72℃で２分から成る15回のサイクル、94℃で１分、50℃で１分および72 ℃で３分から成る15回のサイクルおよび72℃で５分から成る１回のサイクルによって操作した。 10μｌのPCR生成物をアガロースゲル上で精製し次いで10μｌのH₂Oに溶解した。次いで、工程２を行った。10μｌの10×PCR緩衝液、50μｌの２×ヌクレオチド溶液、工程１の精製生成物５μｌ、１μｌのpCiP （0.05μｇ／μｌ）、30μｌのH₂O、0.5μｌのTaqポリメラーゼおよび80μｌのパラフィンから構成される反応混合物を、94℃で５分、50℃で２分そして72℃で 10分から成る１回のサイクルで操作した。工程２の反応混合物に対し、１μｌのプライマーＣおよび１μｌのプライマーＤを添加した。PCR反応を工程１で記載した如く行なった。３．変異誘発された制限断片の単離工程３からの生成物をアガロースゲルから単離し次いで20μlのH₂Oに再溶解した。次いで、全容量20μｌ中でウシ血清アルブミン(BSA)を加えたNEBuffer、２（ニューイングランド、バイオラボ）に溶解した制限酵素XbalおよびKpnIを用い37℃で一夜それを消化した。570bpのXbaI／K pnI断片をアガロースゲルから単離した。４．発現ベクターpCipへの結合発現プラスミドpCiPを、前記の条件下XbaIおよびKpnIで切断し、次いで大きな断片をアガロースゲルから単離した。このベクターに、前記の単離した変異誘発した断片を結合させ次いで結合混合物を用いＥ．コリーを形質転換した。断片の存在および配向を、制限酵素を用い形質転換体からのプラスミド調製物の切断により立証した。配列の分析は、サンガーにより開発されたジーデオキシ停止法を用い二本鎖プラスミドについて行った。生成プラスミドは、改変コドンを除きpC iPと同一である。例２コプリナスペルオキシダーゼの他の変異体を発現するプラスミドの構築次の突然変異体を例１で記載した方法と同じ方法を用いて構築した。但し他の制限酵素をPCR−生成物の消化のため用いそしてベクターを変異誘発した断片の再クローニングのため用いた。修飾のために用いた変異体およびプライマーを以下に掲げる。以下の内容は注目すべきである；すなわち、位置１−29の中にある変異体を、 BSAが加えられたNEBuffer３（ニューイングランド、バイオラボ）中BamHI およびXbaIで消化し、160bpの断片を生成した。位置30−219における変異体を、BSA が加えられたNEBuffer２中XbaI／KpnIで消化し、570bpの断片を生成した。位置2 20-277における変位体を、BSAが加えられたNEBuffer２中KpnI／MscIで消化し、170bpの断片を生成した。位置278-363における変異体を、BSAが加えられたNEBuffer２中Ms cI／XhoIで消化し、420bpの断片を生成した。例３アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）中でのコプリナスペルオキシダーゼ変異体の発現アスペルギルス・オリゼ又はアスペルギルス・ニガーの形質転換（一般的手段） 100 mlのYPD培地（シャーマン等、Methods in Yeast Genetics，Cold Spving Harbor Laboratory，1981）に、Ａ．オリゼ又はＡ．ニガーの胞子を接種し次いで37℃で振とうしながら一夜インキュベートした。菌糸をミラクロス(miracloch )を通して濾過により集め次いで0.6ＭのMgSO₄ 200mlで洗浄した。菌糸を15mlの1 .2Ｍ MgSO₄．10mM NaH₂PO₄ pH＝5.8中に懸濁させた。懸濁液を氷上で冷却し、次いで120mgのノザザイム(Novozym)(商標)234、バッチ1687を含有する１mlの緩衝液を加え、次いで穏やかな攪拌を伴うインキュベーションを、多数のプロトプラストが顕微鏡下で検査したサンプルにおいて可視できるまで、37℃で1.5−2.5時間継続した。懸濁液をミラクロスを通して濾過し、濾液を滅菌管に移しそして５mlの0.6Ｍソルビトール、100mMトリス−HCl、pH＝7.0で加層した。遠心分離を100×ｇで15 分間行ない、次いでプロトプラストをMgSU₄クッションの頂部から採取した。２容量のSTC(1.2Ｍソルビトール、10mMトリス−HCl、pH−7.5、10mM CaCl₂)をプロトプラスト懸濁液に加え次いで混合物を1000×ｇで５分間遠心分離した。プロトプラストペレットを３mlのSTC中に再懸濁させ次いで再度小球にした。この手順をくりかえした。最後に、プロトプラストを 0.2−１mlのSTC中に再懸濁させた。 100μｌのプロトプラスト懸濁液を、10μｌのSTC中で５−25μｇの適当なDNA と混合した。Ａ．オリゼのA1560菌株(IFO4177)からのプロトプラストをpToC186( Ａ．ニドランスamds遺伝子含有プラスミド)と混合した。混合物を室温で25分間放置した。60％PEG4000(BDH29576)、10mM CaCl₂および10mMトリス−HClの0.2ml( pH＝7.5)を注意深く混合し（２回）次いで最後に同溶液0.85mlを加えそして注意深く混合した。混合物を室温で25分間放置し、2500×ｇで15分間回転させそしてペレットを２mlの1.2Ｍソルビトールに再懸濁させた。他の沈降後、プロトプラストを適当なプレート上に拡げた。pToC186で形質転換されたA1560菌株からのプロトプラストを、1.0Ｍスクロース、pH＝7.0、窒素源として10mMアセトアミドおよびバックグラウンド増殖を阻止するための20mM CsClを含有する最少プレート( Cove Biochem.Biophys.Acta 113(1966)51-56)上に拡げた。37℃で４−７日間インキュベーション後、胞子を精製し、滅菌水中で懸濁し次いで第二回の再単離後単一コロニーの胞子を定義した如き形質転換体として保存した。Ａ．オリゼ菌株内での組換え体コプリナス・シネレウスペルオキシダーゼ変異体の生産ペルオキシダーゼ遺伝子内に適当な変異を含有するプラスミドを、pCiPおよび pToC186の同量（各々約５μｇ）の混合物を用い前記の如くＡ．ニドランス（nid ulans）からamds遺伝子を含有するpToC186を用い共形質転換によりＡ．オリゼA1 560内に変質転換した。それらの唯一窒素源としてアセトアミドを用いることができた形質転換体を２回再単離した。３回間YPD培地（シャーマン等1981）上で増殖後培養上澄みをペルオキシダーゼ活性分析（PODU）により分析した。例４過酸化水素安定性前記の如く作製した野性型組換え体コプリナス・シネレウス(Coprinus cinere us)ペルオキシダーゼ（rCip）および変異体E239K，Y272F，M276S，M242I＋Y272F ＋E239Kを、H₂O₂の存在下それらの安定性に対し試験した。試験した変異体のサンプルを次の方法で精製した：５１の培養ブロスをプロプレクス(Proprex)布を通して吸引濾過することにより澄明化した。3.51を、穏やかに攪拌しながら1378ｇを硫酸アンモニウム（最終濃度2.5Ｍ）に加えた。混合物を５℃で16時間放置した。沈殿物を、５℃で30分間2500ｇで遠心分離することにより集めた。沈殿物をCaCl₂溶液（５mM）に溶解し、最終濃度は200mlであった。30mlのこの溶液を12.5mMトリスpH6.0緩衝液に対して透析し；５１を４時間そして５１を16時間透析した。 23mlの透析物をＱ−セファロースHPカラム（ファルアシア、直径26mm、100mm の床高）に適用した。カラムを12.5mM Bis−トリスpH6.0緩衝液で平衡化した。流速は４ml／分であった。400mlの出発緩衝液をカラムに通過させ、次いで12.5m M Bis−トリスpH6.0緩衝液に溶解した0.25Ｍ NaClの線状グレージエントを適用した。総グレージエン量は540mlであった。10mlの分画を集めた。ペルオキシダーゼは0.16Ｍ NaClで20ml内に溶出した。0.1Ｍリン酸ナトリウムpH７で溶出させるセファデックスG25SFのカラム(16mmφ400mm)に、流速４ml／分で４mlを適用した。２mlの分画を集めた。ペルオキシダーゼは６ml内に溶出された。過酸化水素安定性を試験するための条件：酵素 25nM 過酸化水素 0.5mM 温度 30℃ pH 10.5 カーボナート緩衝剤 20mM試験：炭酸ナトリウム緩衝液22mM pH10.5；1.807ｇのNa₂CO₃および0.416ｇのNaHCO₃ を脱イオン水に溶解し最終容積１１とする。pHをチエックする。 H₂O₂：2.2mM 過酸化水素溶液：セファデックスG25SFからのプールを炭酸ナトリウム緩衝液2 2mMpH10.5でOD₄₀₄＝0.0030に希釈する。（これは27.5nMに対応する）。仕上げ：炭酸ナトリウム緩衝液を30℃に予備加熱する。ペルオキシダーゼ溶液を作成する。ペルオキシダーゼ溶液のサンプルを直ちにとり出しそして希釈しそしてABTS −アッセイに委ねる。５mlのペルオキシダーゼ溶液を、0.5mlの2.2mM H₂O₂と混合し次いで混合物を30℃の水浴中に置いた。４，８，12および16分後、サンプルをとり出し、希釈し次いでABTS−アッセイに委ねる。残留活性は、第一次減衰に適合しておりそして半減期を計算する。rCiPは常に含まれている。過酸化水素安定性試験の結果を以下の表１に示す。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９５年１２月１２日【補正内容】請求の範囲１．アルカリ条件で改善された過酸化水素安定性を有するペルオキシダーゼ変異体であって、親ペルオキシダーゼ、配列番号１で示されるアミノ酸配列によってコードされるコプリナス・シネレウス(Coprinus cinereus)ペルオキシダーゼのアミノ酸残基48〜56，239，258〜262，264，266〜272の領域における１個又はそれ以上のアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換によって特徴づけられている、前記ペルオキシダーゼ変異体。２．１又はそれ以上のアミノ酸残基が、次の如く： K48S, V53K,A, E239A,V,L,I,P,F,W,M,G,S,T,C,Y,N,Q,D,K,R,H, 特にE239K,G,S,L,Q,M, W258F,H, M261A,V,L,I,P,F,W,G,S,T,C,Y,N,Q,D,E,K,R,H, 特にM261F,V,I,L,Q, M268A,V,L,I,P,F,W,G,S,T,C,Y,N,Q,D,E,K,R,H, 特にM268F,V,I,L,Q, Y272A,V,L,I,P,F,W,G,S,T,C,M,N,Q,D,E,K,R,H, 特にY272F 置換されている、請求の範囲第１項記載のペルオキシダーゼ変異体。３．アルカリ条件下で改善された過酸化水素安定性を有するペルオキシダーゼ変異体であって、親ペルオキシダーゼ、配列番号１で示されるアミノ酸によってコードされるコプリナス・シネレウスペルオキシダーゼのアミノ酸残基の１個又はそれ以上のアミノ酸残基が、次の如く： G72Q, A91C, N92K, Q118E, M125A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM125S,T, S147Q, I152C, P155C, M166A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM166S,T, N192K, I195K, V206R, K218R, F229G, A230C, M242A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM242S,T, S244C, S252P, M276A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM276S,T, K278R, M279A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM279S,T, A304E, V314P, K41R＋K48R, V53K＋Q118E, V53A＋E239G, I152C＋A91C, P155C＋A230C, M166F＋E239K, G167N＋V176L, E214L＋E239L, R241E＋E239K, S244C＋P155C, E239K＋M242I＋Y272F, M166F＋E239K＋M242I＋Y272F, M125L＋M166F＋E239K＋M242I＋Y272F 置換されている、前記ペルオキシダーゼ変異体。４．請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のペルオキシダーゼ変異体の断片である、ペルオキシダーゼ変異体。５．請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載のペルオキシダーゼ変異体および過酸化水素又は過酸化水素前駆体、例えばパボラートもしくはパーカーボナート、又は過酸化水素発生酵素系、例えばオキシダーゼおよびその基質、又はペルオキシカルボン酸又はその塩を含んでなる漂白組成物。６．ペルオキシダーゼ変異体の量が、１ml当たり0.01〜20PODUの洗液中の濃度に相当し、そして過酸化水素又は過酸化水素前駆体又は過酸化水素発生酵素系又はペルオキシカルボン酸又はその塩の量が、20mMまでのH₂O₂の洗液中の過酸化水素濃度に相当する、請求の範囲第５項記載の漂白組成物。７．酸化性基質、例えば有機化合物、例えばフェノール性化合物又はフェノチアジン誘導体又はフェノキサジン誘導体を追加的に含んでなる、請求の範囲第５又は６項記載の漂白組成物。８．酸化性基質の量が、0.1μＭ〜100μＭの洗液中の濃度に相当する、請求の範囲第７項記載の漂白組成物。９．界面活性剤、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載のペルオキシダーゼ変異体および過酸化水素又は過酸化水素前駆体、例えばパボラートもしくはパーカーボナート、又は過酸化水素発生酵素系、例えばオキシダーゼおよびその基質、又はペルオキシカルボン酸又はその塩を含んでなる洗剤組成物。 10．ペルオキシダーゼ変異体の量が、１ml当たり0.01〜20PODUの洗液中の濃度に相当し、そして過酸化水素又は過酸化水素前駆体又は過酸化水素発生酵素系又はペルオキシカルボン酸又はその塩の量が、20mMまでのH₂O₂の洗液中の過酸化水素濃度に相当する、請求の範囲第９項記載の洗剤組成物。 11．酸化性基質、例えば有機化合物、例えばフェノール性化合物又はフェノチアジン誘導体又はフェノキサジン誘導体を追加的に含んでなる、請求の範囲第９又は10項記載の洗剤組成物。 12．酸化性基質の量が、0.1μＭ−100μＭの洗液中の濃度に相当する、請求の範囲第11項記載の洗剤組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:69） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者スベンセン，アランデンマーク国，デーコー―3460 ビルケレーズ，バッケレゼト 28 (72)発明者チェリー，ジョエルアール. アメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デービス，アンダーソンロード 916 (72)発明者ラムサ，マイケルアメリカ合衆国，カリフォルニア 95616, デービス，ブルーバードプレイス 641 (72)発明者シュナイデル，パレデンマーク国，デーコー―2750 バレルップ，リュドトフテン 43 (72)発明者イェンセン，ビルゲルロストガールトデンマーク国，デーコー―3500 ベールレーセ，ストームリュ 32

Claims

【特許請求の範囲】１．アルカリ条件で改善された過酸化水素安定性を有するペルオキシダーゼ変異体であって、親ペルオキシダーゼ、配列番号１で示されるアミノ酸配列によってコードされるコプリナス・シネレウス(Coprinus cinereus)ペルオキシダーゼのアミノ酸残基48〜56，76，109，214，239，258〜262，264，266〜272の領域における１個又はそれ以上のアミノ酸残基の挿入、欠失又は置換によって特徴づけられている、前記ペルオキシダーゼ変異体。２．１又はそれ以上のアミノ酸残基が、次の如く： K48S, V53K,A, H109K, E214L, E239A,V,L,I,P,F,W,M,G,S,T,C,Y,N,Q,D,K,R,H, 特にE239K,G,S,L,Q,M, W258F,H, M261A,V,L,I,P,F,W,G,S,T,C,Y,N,Q,D,E,K,R,H, 特にM261F,V,I,L,Q, M268A,V,L,I,P,F,W,G,S,T,C,Y,N,Q,D,E,K,R,H, 特にM268F,V,I,L,Q, Y272A,V,L,I,P,F,W,G,S,T,C,M,N,Q,D,E,K,R,H, 特にY272F 置換されている、請求の範囲第１項記載のペルオキシダーゼ変異体。３．アルカリ条件下で改善された過酸化水素安定性を有するペルオキシダーゼ変異体であって、親ペルオキシダーゼ、配列番号１で示されるアミノ酸によってコードされるコプリナス・シネレウスペルオキシダーゼのアミノ酸残基の１又はそれ以上のアミノ酸残基が、次の如く： G72Q, A91C, N92K, Q118E, M125A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM125S,T, S147Q, I152C, P155C, M166A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM166S,T, N192K, I195K, V206R, K218R, F229G, A230C, M242A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM242S,T, S244C, S252P, M276A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM276S,T, K278R, M279A,P,W,G,S,T,C,Y,N,D,E,K,R,H, 特にM279S,T, A304E, V314P, K41R＋K48R, V53K＋Q118E, V53A＋E239G, I152C＋A91C, P155C＋A230C, M166F＋E239K, G167N＋V176L, E214L＋E239L, R241E＋E239K, S244C＋P155C, E239K＋M242I＋Y272F, M166F＋E239K＋M242I＋Y272F, M125L＋M166F＋E239K＋M242I＋Y272F 置換されている、前記ペルオキシダーゼ変異体。４．請求の範囲第１〜３項のいずれか１項に記載のペルオキシダーゼ変異体の断片である、ペルオキシダーゼ変異体。５．請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載のペルオキシダーゼ変異体および過酸化水素又は過酸化水素前駆体、例えばパボラートもしくはパーカーボナート、又は過酸化水素発生酵素系、例えばオキシダーゼおよびその基質、又はペルオキシカルボン酸又はその塩を含んでなる漂白組成物。６．ペルオキシダーゼ変異体の量が、１ml当たり0.01〜20PODUの洗液中の濃度に相当し、そして過酸化水素又は過酸化水素前駆体又は過酸化水素発生酵素系又はペルオキシカルボン酸又はその塩の量が、20mMまでのH₂O₂の洗液中の過酸化水素濃度に相当する、請求の範囲第５項記載の漂白組成物。７．酸化性基質、例えば有機化合物、例えばフェノール性化合物又はフェノチアジン誘導体又はフェノキサジン誘導体を追加的に含んでなる、請求の範囲第５又は６項記載の漂白組成物。８．酸化性基質の量が、0.1μＭ〜100μＭの洗液中の濃度に相当する、請求の範囲第７項記載の漂白組成物。９．界面活性剤、請求の範囲第１〜４項のいずれか１項に記載のペルオキシダーゼ変異体および過酸化水素又は過酸化水素前駆体、例えばパボラートもしくはパーカーボナート、又は過酸化水素発生酵素系、例えばオキシダーゼおよびその基質、又はペルオキシカルボン酸又はその塩を含んでなる洗剤組成物。 10．ペルオキシダーゼ変異体の量が、１ml当たり0.01〜20PODUの洗液中の濃度に相当し、そして過酸化水素又は過酸化水素前駆体又は過酸化水素発生酵素系又はペルオキシカルボン酸又はその塩の量が、20mMまでのH₂O₂の洗液中の過酸化水素濃度に相当する、請求の範囲第９項記載の洗剤組成物。 11．酸化性基質、例えば有機化合物、例えばフェノール性化合物又はフェノチアジン誘導体又はフェノキサジン誘導体を追加的に含んでなる、請求の範囲第９又は10項記載の洗剤組成物。 12．酸化性基質の量が、0.1μＭ〜100μＭの洗液中の濃度に相当する、請求の範囲第11項記載の洗剤組成物。