JPH06506458A

JPH06506458A - カゼインからのホスホペプチドの生成

Info

Publication number: JPH06506458A
Application number: JP4507910A
Authority: JP
Inventors: チャールズレイノルズ，エリック
Original assignee: ザユニバーシティオブメルボルン; ザ　ビクトリアン　デイリー　インダストリー　オーソリティ
Priority date: 1991-04-19
Filing date: 1992-04-16
Publication date: 1994-07-21
Anticipated expiration: 2016-12-04
Also published as: ES2149771T3; GR3034594T3; ATE194623T1; CA2108678C; CA2108678A1; AU1646892A; DE69231246D1; EP0580694A1; EP0580694A4; NZ242415A; DK0580694T3; US6448374B1; EP0580694B1; DE69231246T2; JP3234222B2; WO1992018526A1; AU653401B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】カゼインからのホスホペプチドの生成発朋旬−野本発明は、カゼインから抗食原性質及び他の性質を有するホスホペプチドの生成に関する。

発明の分野オーストラリア特許第５９３３６５号において、本発明者は、カゼインのトリプシン消化により放される多くのホスホペプチドのうち４種が抗食原性（歯−崩壊 −阻害）活性を有することを記載している。

それらのペプチドはすべて、次の活性配列−３ｅｔ　（Ｐ）　−Ｓｅｔ　（Ｐ） −３ｅｔ（Ｐ）　−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−を含み、そしてａｓ、（５９７９）配列番号２（ＴＩ）、　β（２−２５）配列番号３（Ｔｉ、α−ｚ　（４６７０）配列番号４　（Ｔ、　）及びα５ｆｆｉ　（２−２１）配列番号”ｔ　（Ｔｉ　）に対応する。抗食原性ホスホペプチドの製造について記載される方法は、選択的沈殿法及びイオン交換クロマトグラフィーである。それらの方法はそれらのペプチドのひじょうに純粋な調製物を生成するが、それらは、それらの費用及び必要とされる技術熟練のレベルにより酪農産業において一般的な許容性は得ていない。

最近、膜限外濾過が牛乳処理のために酪農産業において広い許容性であることが見出された。アメリカ特許第４，３５８，４６５号、第４．３６１．５８７号及び第４，４９５．１７６号（Ｂｒｕｌｅなど）は、栄養食物としてカゼインホスホペプチドの製造のための限外濾過法を記載する。

この方法は、調製物に多量の非−抗食原性ホスホペプチドの存在により、抗食原性ホスホペプチドの製造のためには適切でないことがわかっている。

■　び　・の　・限外濾過を用いてカゼインから選択されたホスホペプチドを調製するための方法を提供することが本発明の目的である。

本発明は、選択されたホスホペプチドの調製方法を提供し、ここでその方法とは、溶液におけるカゼインの可溶性−価カチオン塩を完全に消化し、前記消化された溶液における少なくとも選択されたホスホペプチドの凝集を引き起こすために二又は三価金属イオンを導入し、そして前記凝集されたホスホペプチドを保持するように選択された分子量排除限界を有するフィルターを通して前記凝集イオンを含む溶液を、多量の残存するホスホペプチドを通しながら濾過する段階を含んで成る。

Ｂｒｏｌｅなどにより記載される方法においては、その目的は、栄養物として使用するためにカゼインから広範囲のホスホペプチドを得ることである。従って、Ｂｒｕｌｅなどは、カゼイン化合物が完全に加水分解されるべきであり、そして溶液の通過を可能にしながら、それらのホスホペプチドの濾過を可能にするサイズに所望するホスホペプチドを凝集するように、二／三価の金属イオンが添加されるべきことについて教授していない、これは、所望するホスホペプチドに冨んでいる（９０％　ｗ　／　ｗ以上）ｉｊｉ製物をもたらす産業的に許容される抽出方法の使用を可能にするので、技術的な有意な進歩を表わす。

本発明の好ましい形においては、選出されたホスホペプチドは上記に言及される抗食原性ホスホペプチドであり、そして上記の方法の濾過段階の間に採用された分子排除限界は１０，０００〜２０，０００の範囲内に実質的に落いる。

カゼインの可溶性−価カチオン塩、たとえばナトリウムカゼイネート又はカリウムカゼイネートは、０．１〜５０％　ｗ　／　ｗの範囲内に実質的に落いる濃度で溶液に存在し、これは好ましくは、タンパク質分解酵素、たとえばトリプシン及びキモトリプシンを用いて又は化学的手段、たとえば臭化シアンにより消化される。酵素：カゼインの比は、１　：　１０００〜１　：　１０　（ｗ　：　ｗ）の範囲であるが、しかしこれは上記に定義されたようにカゼインの完全な消化を可能にするために選択される。加水分解のｐＨは好ましくは、酵素が完全にカゼインの消化を可能にするために最適に調節されるべきである。温度はまた、完全な消化のために最適化されるべきであるが、しかし温度誘発消化（脱アミン反応、脱リン酸化及びペプチド分解）は最少化されるべきである。最適温度は約２０°Ｃ〜６０°Ｃである。

本発明の好ましい形においては、消化の後、ＨＣＩが室温で添加され、約ｐＨ４，７にされ、そしてすべての沈殿物（これは最少であるべきである）が除去される。次に、ＣａＣＩｇが約１．０％　ｗ　／　ｖのレベルまで上清液に添加される。１．０％　ｗ　／　ｖのカルシウム（ＩＩ）の存在下でのホスホペプチドが凝集する。抗食原性ホスホペプチド（すなわち配列−５ｅｒ（Ｐ）　−５ｅｒ（Ｐ）−５ｅｒ（Ｐ）　−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−を含む）は、好ましくは１．０％　ｗ　／　ｖのＣａＣＩｚ溶液による１０．０００分子量排除限界フィルターを通しての集中的なシアフィルトレージョンにより小さな非−抗食原性ホスホベブチドから分離されるヘキサマーを形成する。膜フィルターの好ましい分子量排除限界は、１０，０００以下ではなく又は約２０．０００以上であるべきでない。ＣａＣ１ｚ溶液又はいくらかの他の適切な二価／三価の金属イオン、たとえば亜鉛（Ｉｔ）又は鉄（ＩＩＩ）の添加は、抗食原性ホスホペプチド凝集体の結合性を維持するためにシアフィルトレージョンのために必要であり、従って非−抗食原性ホスホペプチドから抗食原性ホスホペプチドの分離を可能にする。

数体積の１．０％　ＣａＣ１，ｗ／Ｗが抗食原性ホスホペプチドの９０％以上の純度を達成するために膜フィルターに通された後、抗食原性ホスホペプチドを含む超保持物が、所望によりカルシウムを除去するために１，０００分子量排除限界フィルターを通して水によりシアフィルトレートされ得る０次に、その保持物が濃縮され、そして噴霧乾燥される。

抗食原性ホスホペプチド調製物（ＡＣＰＰ）のカルシウム、亜鉛及び鉄の塩が、カルシウムＡＣＰＰの１０％　ｗ　／　ｖ溶液を低いｐＨ２すなちゎｐＨ２にＨＣＩにより酸性化することによって、ナトリウム塩に転換される。１　、０００分子量排除限界フィルターを通しての集中的なシアフィルトレージョンの後、その保持物がＮａＯＨによりｐＨ７，０に中和され、そして次に、同じフィルターを通して水によりシアフィルトレートされ、過剰の塩化ナトリウムが除去される。

カルシウムＡＣＰＰは、ＣａＣ１ｇ及びＮａ２　）ＩＰＯ４の添加によりリン酸カルシウムへＣＰＰに転換され、ここでＣａ／Ｐの最終比は１．６７である。ペプチドαｓ、　（５９−７９）は２１Ｃａ及びｔ３ｐｏａを結合できる。上記工程の濾液は、サイズ及び電荷−基礎の分離技法による他の生物活性カゼインペプチドの精製のために適切であり、そして微生物の増殖培地として、虚弱後の栄養補足物として又は窒素肥料として使用され得る。

本発明の好ましい態様が、次の例により記載されるであろう。

例ナトリウムカゼイネートを、牛乳を０．１　ＭのＨＣＩによりｐＨ４，７まで酸性化し、そしてその沈殿物をＮａＯＨによりｐＨ７，ｏまで中和することによって調製した。ナトリウムカゼイネートの１０％　ｗ　／　ｖ　ｆｌ液を調製し、そしてｐ）Ｉ８．ｏに調整した。トリプシン（Ｎｏｖｏ）を０．２％ｗ　／　ｖまで添加し、そしてその加水分解は、ＮａＯＨの一定した添加によるｐＨ８，０への調整により５０°Ｃで完結を進行せしめた。次に、溶液のｐ）を、５ＭのＨＣＩによりｐＨ４，７に調整し、そして沈殿物を室温での遠心分離により除去した。上清液を８ミクロンのフィルターを通してマイクロ濾過し、そして次にＮａＯＨによりｐ）１７．０に中和し、そしテＣａＣＩｇ　ヲ１．０％　ｗ　／　ｖのレベルまで添加した。次に、その溶液を、Ａｍ１ｃｏｎ　ＹＭＩＯ（１０，０００分子分子量排除限界通して１．０％　ｗ　／　ｖのＣａＣＩｒの３〜５体積によりシアフィルトレートした。次に、保持物を、八−１ｃａｎ　ＹＭＩフィルター（１、０００分子量排除限界）を通して１体積の蒸留／脱イオン水により洗浄した。この調製物の個々のペプチドを、イオン交換ＦＰＬＣ及び逆相ＨＰＬＣにより前記特許に記載されるようにして分離し、そしてＳｅｔ　（Ｐ）残基のＳ −エチルシスティンへの転換の後、アミノ酸組成及び配列分析により固定した。

調製物の分析は表１に示される。

ペプチド笈　Ｍ α３□（１−２１）　（配列番号８　）　０．８β（１−２５）（配列番号１　）　２２．３α３．（１２）（配列番号７）　（Ｔｔ　）　５．７β（２−２５）　（配列番号３）　（Ｔ、　）　１７．９αｓ、　（５９−７９）　（配列番号２）　（Ｔ、　）　２１．４デサミド７′α（５Ｌ−７９）　（配列番号５　）　６．３α５ｚ（４６７０）　（配列番号４）　（Ｔ、　）　６．８デサミド７Ｌ７１　αｓ、（５９７９）　（配列番号６　）　６．４α−＋　（４３７９）　（配列番号９　）　３．３ＮＡＰ・　９．１ ”　ＮＡＰ　＝非−抗食原性ペプチドこの調製物は、前記特許に記載される４種の抗食原性ホスホペプチドを含み〔β （２−２５）　、　Ｔｔ　、αｓ＋　（５９−７９）　、　Ｔ、　、α。

（２２１）、Ｔｓ及びＪｔ　（４６−７０）　、　Ｔ４　）　、＋レラ４；！　ｌ−ＩＪプシンにより不完全に加水分解されたペプチドに関連し〔αｓｔ　（１２１）。

β（１−２５）及びα５ｌ（４３７９）　）　、そして温度誘発脱アミド化に起因するα＝＋　（５９７９）　、デスアミド１４及びデスアミド７４・７ｓの２種の脱アミド化形の重要でないレベルにも関し、これは、高い温度及び極端なｐＨによりナトリウムカゼイネートの商業的製造において高い程度生じ、但し、脱アミド化された形の存在は、抗食原性ホスホペプチドの活性に対して効果を有さない、その抗食原性ホスホペプチドは、生成されるペプチドの９０．９％　ｗ　／　ｗであった。

純粋なＣ８，−カゼインがカゼインの代わりに使用される場合、αｓ、（５９− ７９）が、加水分解条件に依存して、このペプチドの少量の脱アミド化された形を伴ってこの方法により得られるであろう。

純粋なβ−カゼインが使用される場合、β（１−２５）及びβ（２−２５）のみがこの方法を用いて得られるであろう。

粗酵素が使用される場合（たとえばバンクレアチン）、９種の列挙されるホスホペプチドのわずかな切断（Ｎ−及びＣ−末端）が生じる。この切断が単にわずかである限り、活性の損失は存在しない。

実際、パンクレアチンは、精製されたトリプシンに比較される場合、重量に基づいてわずかに高い比活性を有する調製物を生成する。

前記特許のペプチドＴ１〜Ｔ４を含む、９種のペプチドの配列、及び上記に言及される他のペプチドが、次の列挙される配列に詳しく記載される。

配列の列挙（１）一般情報：（ｉ）出願者：　ＲＥＹＮＯＬＤＳ、ＥＲＩＣＣＨＡＲＬＥＳ（ｉｉ）発明の名称：カゼインからのホスホペプチドの製造（ｉｊ）配列の数：９（ｉｖ）通信先：（Ａ）住所：（Ｂ）通り：（Ｆ）郵便番号：（Ｖ）コンピューター読み取りフオーム：（Ａ）媒体型：フロノビ−ディスク（Ｂ）コンピューター：　ＩＢＭ　ＰＣＣＯＭＰＡＴＩＢＬＥ（Ｃ）操作システム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）ソフトウェアー：　ＷＯＲＤ　ＰＥＲＦＥＣＴ（ｖｉ）現在の出願日：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分１１゜（ｖｉ）前の出願日：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（ｖｉ）アトニー／エージェント情報：（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）（ｉｘ）電信情報：（Ａ）（Ｂ）（Ｃ）（２）配列番号Ｉについての情報：（ｉ）配列の特＠：（Ａ）長さ＝２５（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー二直鎖状（ｉｉ　）配列の種類：タンパク質（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１５（Ｄ）他の情報：後翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１７（Ｄ）他の情報：後翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１８（Ｄ）他の情報：後翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１９（Ｄ）他の情報：後翻訳的にリン酸化されたセリン（ｘｉ）配列：配列番号１：（２）配列番号２についての情報：（１）配列の特＠：（Ａ）長さ：２１（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の種ｗ４：タンパク質（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ピログルタメート（Ｂ）位置：１（Ｄ）他の情報ニ一定量がこの形で存在するであろう（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：６ＣＤ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：８ＣＤ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：９（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１０（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位Ｉｆ　：　１７（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｘｉ）配列：配列番号２：（２）配列番号３についての情報：（ｉ）配列の特＠：（Ａ）長さ＝２４（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種Ｗ４：タンパク質（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１４（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１６（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｔｘ）特徴＝（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位ｉｆ　：　１７（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位Ｉｆ　：　１８（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｘｉ）配列：配列番号３：（２）配列番号４についての情報：（１）配列の特徴：（Ａ）長さ：２５（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（１１）配列の１１タンパク質（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１１（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１２（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特ｆ１１！：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１３（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置＝１６（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｘｉ　）配列：配列番号４二（２）配列番号５についての情報：（ｉ）配列の特＠：（Ａ）長さ：２１（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：タンパク質（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置＝６（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：８（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリンＣＢ）位置：９（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（１ｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１Ｏ（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ　）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１７（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｘｉ）配列：配列番号５：（２）配列番号６についての情報：（１）配列の特＠：（Ａ）長さ：２１（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種′Ｒ：タンパク質（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：６（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特ｒ＆：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：８（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置＝９（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１０（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｔｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置＝１７（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｘｉ）配列：配列番号６：（２）配列番号７についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２０（Ｂ）型二アミノ酸（ＣＨＩＯ数ニ一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：タンパク質（ｉｘ）特ｒＩＩ：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置＝７（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリンＣＢ）位置＝８（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：９（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１５（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｘｌ）配列：配列番号７：＾ｓｎ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｈ４ｓ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　５ｅｒ（２）配列番号８についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：２１（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：タンパク質（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置二８（Ｄ）他の情報；後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置＝９（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１０（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：１６（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｘｉ）配列：配列番号８：（２）配列番号９についての情報：（ｉ）配列の特＠：（Ａ）長さ：３７（Ｂ）型二アミノ酸（Ｃ）鎖の数ニー末鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｉｉ）配列の種類：タンパク質（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：４ＣＤ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠、：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：６（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリンＣＢ）位置：２２（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：２４（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特徴：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位Ｉｆ　：　２５（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置＝２６（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｉｘ）特＠：（Ａ）名称／キー：ホスホセリン（Ｂ）位置：３３（Ｄ）他の情報：後−翻訳的にリン酸化されたセリン（ｘｉ　）配列：配列番号９：補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成５年ｉｏ月１９日

Claims

【特許請求の範囲】

１．選択されたホスホペプチドの調製方法であって、溶液におけるカゼインの可溶性一価カチオン塩を完全に消化し、前記消化された溶液における少なくとも選択されたホスホペプチドの凝集を引き起こすために二又は三価金属イオンを導入し、そして前記凝集されたホスホペプチドを保持するように選択された分子量排除限界を有するフィルターを通して前記溶液を、濾液における多量の残存するホスホペプチド通しながら濾過する段階を含んで成る方法。
２．前記選択されたホスホペプチドが抗食原性ホスホペプチドであり、そして前記濾過段階の間に採用される分子量排除限界が１０，０００〜２０，０００の範囲内に実質的に落いる請求の範囲第１項記載の方法。
３．前記カゼインの可溶性一価カチオン塩が０．１〜５０％ｗ／ｗ内に実質的に落いる濃度で溶液に存在する請求の範囲第１又は２項記載の方法。
４．前記消化段階が、タンパク質分解酵素を用いて行なわれ、そして溶液中のタンパク質分解酵素：カゼインの可溶性一価カチオン塩の比が、カゼイン塩の完全な消化を可能にするために選択される１：１０００〜１：１０（ｗ：ｗ）の範囲内に実質的に落いる請求の範囲第１〜３のいづれか１項記載の方法。
５．前記溶液のｐＨ及び温度がカゼイン塩の完全な消化を可能にするために調節される請求の範囲第１〜４項のいづれか１項記載の方法。
６．前記溶液の温度が２０℃〜６０℃の範囲内に実質的に落いる請求の範囲第５項記載の方法。
７．抗食原性及び他の活性を有する選択されたホスホペプチドの調製方法であって、タンパク質分解酵素により溶液中のカゼインの可溶性一価カチオン塩を完全に消化し、ｐＨを約４．７に調整するために溶液に無機酸を添加し、いづれかの生成される沈殿物を除去し、前記消化された溶液における少なくとも選択されたホスホペプチドの凝集を引き起こすためにＣａＣｌ２を約１．０％ｗ／ｖのレベルまで添加し、そして前記溶液から凝集されたホスホペプチドを、１０，０００〜２０，０００の範囲内に実質的にある分子量排除限界を有するフィルターを通して濾液における多量の残存するホスホペプチド及び溶液を通しながら、濾過し、フィルターを通して水により前記分離されたホスホペプチドをダイアフィルトレートし、そして保持物を濃縮し、そして乾燥することにより分離する段階を含んで成る方法。
８．前記カゼインの可溶性一価カチオン塩が、ナトリウムカゼイネート及びカリウムカゼイネートから選択される請求の範囲第１又は７項記載の方法。
９．前記タンパク質分解酵素がパンクレアチン、トリプシン、ペパイン、キモトリプシン及びその混合物から選択される請求の範囲第７又は８項記載の方法。
１０．前記特定の例にこれまで実質的に記載されたような抗食原性ホスホペプチドの調製方法。
１１．請求の範囲第１〜９のいづれか１項記載の方法により生成されるホスホペプチド。
１２．請求の範囲第１〜９のいづれか１項記載の方法の濾液。