JPH06506592A - 新規プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規プロテアーゼ 技術分野 本発明は、洗剤プロテアーゼの分野に存する。更に詳しくは、本発明は、デンド リフイエラ（Ｄｅｎｄｒｙｐｈｉｅｌｌａ）および／又はスコレコバシジウム（ Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕ＊）属／？ＪＩ数の属の不完全菌類の株由来の新 規アルカリプロテアーゼに関する。更に詳しくは、本発明はプロテアーゼの製造 方法、洗剤用酵素としてのプロテアーゼの使用、および本発明のプロテアーゼを 含んでなる洗剤組成物に関する。

他の酵素、又はそれらの混合物を含んでなる。商業的に最も重要な新しいタイプ のプロテアーゼが市場に表われ、種々の特定条件の下（ＳＡｖＩＮＡＳＥ）　（ 登録商４１）であり、全てノボノルディスク社、デンマークより提供されている 。これらの及び他の商業的起源からのＭ似の酵素製品は、洗剤溶液中、８〜１１ の範囲内のｐｉ（値でかつ金属イオン封鎖側、界面活性剤および過ホウ酸ナトリ ウムの如き漂白剤の存在下で活性である。アルカラーゼ（ＡＬＣＡＬＡＳＥ）　 （登録商標）は、種バシラスリケニホルミスの株によって生産される。エスペラ ーゼ（ＥＳＰＥＲＡＳＥ）　（登録商標）およびサビナーゼ（ＳＡｖＩＮＡＳＥ ）　（登録商標）は、好アルカ↑Ｊ性バシリ（Ｂａｃｉｌｌｉ）を培養すること によって得られる。

発明の要約 本発明によれば、新規洗剤用プロテアーゼが提供される。

第一の面に於て、本発明はデンドリフィエラ属又はスコレコバシジウム属の株か ら得ることのできる。

より特異的な面に於て、本発明は約９．１のｐｒ、約１８〜２０ｋＤの分子量ヲ 有し、ヘモグロビン、カゼイン、スキムミルクおよび５ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ− Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡに対し活性であり、そして株り、アレナリア、ＤＳＭＮ ｏ、６２６０．又は株り、サリナ、ＤＳＭ、　Ｎｏ、６３３１由来のプロテアー ゼの免疫化学的性質と同−又は部分的同一の免疫化学的性質を有するプロテアー ゼを提供する。

他の特異的面に於て、本発明は９．５を超えるｐ＋、約２８ｋＤの分子量および デンドリフィエラ　アレナリア、ＤＳＭ　Ｎｏ、６２６０由来のプロテアーゼの 免疫化学的性質と同−又は部分的同一の免疫化学的性質を有するプロテアーゼを 提供する。

第二の面に於て、本発明は炭素および窒素源並びに無機塩を含をする適当な栄養 源培地中で、デンドリフィエラ属又はスコレコバシジウム属のプロテアーゼ生産 株を培養し、引き続き所望の酵素を回収することを含んでなる、プロテアーゼの 製造方法を提供する。

第三の面に於て、プロテアーゼの製造方法を提供するものであり、この方法はプ ロテアーゼをコードするＤＮＡ断片を単離し、ＤＮＡ断片を適当なプラスミドベ クター中の適当な発現シグナルと結合させ、自己複製プラスミドとして又は染色 体に組込むかのいずれかでプラスミドベクターを適当な宿主に導入し、プロテア ーゼの発現に至る条件のもとて宿主生物を培養し、次いでプロテアーゼを培養培 地から回収することを含んでなる。

第四の面に於て、本発明は洗剤用酵素用プロテアーゼの使用を権利要求する。こ の面のより特異的な態様において、本発明はプロテアーゼを含んでなる洗剤組成 物を提供する。この面の他の特異的態様において、洗剤組成物は洗剤用添加剤、 好ましくは無粉塵性粒質物又は安定化された液体の形態で提供される。

発明の詳細な開示 ■ 本発明の新規洗剤プロテアーゼは、デンドリフィエラおよびスコレコバシジウム 属の構成員から提供され得る。デンドリフィエラおよびスコレコバシジウムは、 不完全菌類に属する。Ｄ、サリナ（スーザランド）パフ　エト　ニコット（学術 名：Ｓ、サリナム（スーザランド）　Ｍ、Ｂ、エリス、セルコスポラ　サリナ（ スーザランド）およびり、アレナリア　ニコント（学術名：Ｓ、アレナリウムに コツト）Ｍ、Ｂ、エリス）は、２個の密接に関係のある種でありこれらは岸辺に 近い領域内で海産生育地から普通に単離される０例としては、株０゜アレナリア 　ニコノト、ＤＳＭがありこれは分解性ネレオサイティスアルガから元々単離さ れ、更にり、サリナ（スーザランド）とューエト　ニコノト、０５１１６３３１ がある。他の種は例えば次の如くである；Ｄ、ビノザ（ベルト　アンド　タルト ）レインシンガー；Ｄ、インファスカンス（トルーメン）Ｍ、Ｂ、エリ−；Ｓ、 カテニボラム　マツシマ； Ｓ、エンノフィラム（マノサロンゴ）ズートン；Ｓ、フジフォルメ　マツシマ； Ｓ、ロンシボラム　マツシマ； Ｓ、サルモニカラー　ザーレル； Ｓ、チリウム　アボンド； Ｓ、チュヴイステエ（ドーティ　アンド　スラター）マクジニスアンド　アジェ ロ Ｓ、コンスティクタム　アボット； Ｓ、フミコラ　ポロン　アンド　ブソンユ；Ｓ　オポバタム　マツシマ； Ｓ、バリアビレ　ハロン　アンド　ブツシュ；Ｓ、アニμ　グラニチ； Ｓ、ベルクロサム　ロイ、ヴイベディ　アンド　ミシアラ；Ｓ、グリロカルビ　 門、Ｂ、エリス； 一つの例は、Ｓ、グリロカルビＭ、Ｂ、エリスの株、ＤＳＭ　６３３２である。

微生−葛豊１ 本発明の微生物は、他の必須の栄養源と共に同化性の炭素および窒素を含有する 栄養源培地中、好気的条件のもとで培養することができ、培地は公知技術の原則 に従って構成される。Ｄ、サリナおよびＤ、アレナリアの株は、海水をベースに しているか又は海塩を含む培地中で培養することができるが、しかしそれは予し め必要ではない。

生物は、ＰＤＡ　（ポテト　デキストロース　寒天）　、ＹＰＧ（４ｇ／ｌの酵 母抽出液；１５ｇ／Ｆ！のグルコース；　１　ｇ／ｆｆのＫＪＰＯ４；　０．５ ｇ／ｌのＭｇＳＯ４７ＨｚＯ；　２０　ｇ　／　１の寒天；ｐＨ７，３〜７．５ 滅菌前）およびノ＼クト酵母をモホロジー寒天（ディフコ：　Ｄｉｒｃｏ（登録 商標）の様な多くの普通に用いられる寒天培地上で室温で例えば増殖できる。Ｄ 、アレナリアおよびり、サリナは又、ＫＭＶ寒天（１ｇ／ｌのグルコース；０． １ｇ／ｊ！の酵母抽出液；　０．１ｇ／ｌのグクトロ（Ｂａｃｔｒｏ）　（登録 商標）ペプトン；　１　ｇ／ｌのゼラチン加水分解物；１２ｇ／ｆの寒天；４０ ｇ／ｌのシグマ（Ｓｉｇｍａ）（登録商標シーソルト）上で増殖することができ る。

適当な炭素源は、スクロース、グルコースおよびデンプンの如き炭水化物、又は 大豆穀物、綿実粉末、穀物、麦芽、米およびモロコシの如き物質を含有する炭水 化物である。培地中に導入される炭水化物の濃度は、広く変化することができ、 例えば２５％までそして０．１％までであるが、通常１〜１０％が適当であり、 パーセントはグルコースの当量として計算される。

栄養源培地中の窒素源は、無機性および／又は有機性のものであってよい。適当 な無機源はニドラードおよびアンモニウム塩である。

有機窒素源の内で、全く多くのものが、発酵プロセスに於て正規に用いられる。

それらの例は、大豆ミル、綿実ミル、ビーナツツミル、カゼイン、とうもろこし 、コーンスチーブリカー、酵母抽出物、尿素およびアルブミンである。加えて、 栄養源培地は又通常の微量物質を含有すべきである。

プロテアーゼの口　および 発酵後、菌類によって生産される細胞外プロテアーゼは、例えば遠心分離又はド ラム濾過により培養ブロスから粗い物質の除去、蒸発又は限外濾過によるプロス の濃縮、およびアニオン−交換クロマトグラフィーによる精製のような工程を用 い、公知の技術の原則に従って回収しそして精製できる。

諮□１いヵ＝ヨ 本発明のプロテアーゼは又組換えＤＮＡ工学によって得ることができる。

プロテアーゼの製造方法は、プロテアーゼをコードするＤＮＡ断片を単離し、Ｄ ＮＡ断片を適当なプラスミドベクター中の適当な発現シグナルと結合させ、自己 複製プラスミドとして又は染色体に組込むかのいずれかでプラスミドベクターｆ Ｊ当な宿主に導入し、プロテアーゼの発現に至る条件のもと宿主生物を培養し、 次いでプロテアーゼを培養培地から回収することを含んでなる。

この組換え的プロセスを構成する種々の工程は、自体業界公知の方法である。

好ましい宿主生物はＥ、コリ、又はバシラス属、アスペルギルス属又はストレプ トマイセス属の構成員である。

ゞの 蓋白質分解活性は、基質としてカゼインについて測定される。１力ゼインプロテ アーゼ単位（ＣＰＵ）は、標準条件下、すなわち２５°ＣでかつｐＨ９，５で３ ０分間インキュベーションして毎分ＩＩＩＭの第一級アミノ基（セリン標準と比 較することによって測定）を放出する酵素の量として比較される０分析法を記載 する、折りたたんだ印刷物ＡＦ２２８／　１は、要求によりノボノルディスク社 、デンマーク国から入手可能であり、この印刷物は参考のため本明細書に導入さ れる。

笠！ 本発明の酵素は、新規な洗剤用プロテアーゼである。酵素は、デンドリフィエラ 属およびスコレコバシジウム属から、例えばり、サリナ、Ｄ、アレナリア、又は Ｓ、カルピの株から、例えば、株り、アレナリア、ＤＳＭ　６２６０．　Ｄ、サ リナ、ＤＳ阿６３３１、又はＳ、グリコ力ルビ、ＤＳＭ　６３３２から得ること ができる。

本発明のプロテアーゼは、ＬＫＢ　ＰＡＧプレート（ｐＨ３，５〜９．５）によ って測定される如く８．０を超える等電点（ｐｒ）を有する。

本発明の特有の１０テアーゼは、約９．１のρＩ、約１８〜２０ｋＤの分子量を 育し、ヘモグロビン、カゼイン、スキムミルクおよび５ｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ− Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡに対し活性であり、そして株り、アレナリア、ＤＳＭＮ ｏ、６２６０、又は株り、サリナ、ＤＳＭ、　Ｎｏ、６３３１由来のプロテアー ゼの免疫化学的性質と同−又は部分的同一の免疫化学的性質を有するプロテアー ゼを提供する。

本発明の他の特有のプロテアーゼは、９．５を超えるｐ＋、約２８ｋＤの分子量 およびデンドリフィエラ　アレナリア、ＤＳＭ　Ｎｏ、６２６０由来のプロテア ーゼの免疫化学的性質と同−又は部分的同一の免疫化学的性質を有するプロテア ーゼを提供する。

免疫上ヱ血１！ 免疫化学的性質を交差反応同一性試験によって免疫学的に測定できる。同一性試 験は、周知のオフテルロニー二重免疫拡散法又はアレクセン、Ｎ、Ｈ，（Ｈａｎ ｄｂｏｏｋ　ｏｆ　ｒｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｊｏｎ−ｉｎ−Ｇｅｌ　 Ｔｅｃｈｎｊｑｕｅｓ；　ブラックウェル　サイエンティフィック　パブリケー シリン（１９８３）、５章および１４章）に従った双頭交差免疫電気泳動によっ て行うことができる。語句（抗原の同一性」および「部分的抗原の同一性Ｊは同 書中、５章、１９章および２０章に記載されている。

丘五亘底宜 本発明の洗剤組成物は、１種又はそれ以上の界面活性剤を含むことができ、この 界面活性剤は、アニオン、非イオン、カチオン、両性又は双性イオンタイプ又は これらの混合物である。アニオン界面活性剤の典型的例は、直鎖アルキルベンゼ ンスルホナート（ＬＡＳ）、アルキルスルフェート（ＡＳ）、αオレフインスル ホナート（ＡＯ５）　、アルコールエトキシスルフニー）（Ａｃ３）および天然 脂肪酸のアルカリ金属塩である。非イオン界面活性剤の例は、アルキルポリエチ レングリコールエーテル、ノニルフェノールポリエチレングリコールエーテル、 スクロースおよびグルコースの脂肪酸エステルおよびポリエトキシル化アルキル グルコシドである。

本発明の洗剤組成物は、又業界公知の他の洗剤用成分、例えばビルグー、漂白剤 、漂白活性化剤、耐蝕側、金属イオン封ｇ荊、抗土壌−再付着剤、香料、酵素安 定化剤 増白側、起泡増ｌＩ！荊、キレート化剤、充てん剤、布帛柔軟側等を含有するこ とができる。本１発明の洗剤組成物は、Ｊ、フォルベによって記載される如く実 質的に製剤化できる〔フォルベ、Ｊ、　；５ｕｒｆａｃｔａｎｔｓｉｎ　Ｃｏｎ ｓｕｍｅｒ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｔｈｅｏｒｙ、　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎ ｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ；スブリンゲル　フェルラーク　１９８７、特に「 液体／粉末重賀洗荊用フレーム製剤化」の標題が付けられた節を参照のこと〕。

現在、以下のように考察されている。すなわち、本発明の洗剤組成物は、洗液１ ｊ？当たり蛋白質分解酵素のｏ、ｏｏｏｓ〜０．５　ＣＰＵに相当する量の酵素 調製品を含有できる。

本発明の洗剤組成物は、任意の好都合の形態、例えば粉末、液体等に製剤化でき る。

本発明の洗剤組成物は、好都合には１種又はそれ以上の他の酵素、例えばリパー ゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、および／又はペルオキシダーゼを 洗剤組成物中に好都合に含まれて含有できる。

本発明のプロテアーゼは、洗剤用プロテアーゼを含む別個の添加剤を添加するこ とにより、又は異なる洗剤用酵素を含んでなる混合添加剤を添加することにより 洗剤組成物中に含有せしめることができる。

本発明の添加剤は、例えば粒質物、液体、スラリー等として配合できる。好まし い洗剤用添加剤製剤は、無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー、又 は保護された酵素である。無塵の粒質物は、例えば英国特許１，３６２，３６５ 又は米国特許４，１０６，９９１に従って製造でき、そして所望により業界公知 方法により被覆できる。洗剤用酵素は造粒前又は造粒後混合できる。

液体酵素調製品は、例えば、確立された方法に従い例えばプロピレングリコール の如きポリオール、媚もしくは糖アルコール、乳酸又はホウ酸を添加することに より安定化できる。他の酵素安定化剤は当業者に十分周知である。保護された酵 素はヨーロッパ特許公開公報第２３８．２１６号に開示された方法に従って調製 できる。

本発明を更に次の実施例において説明するが、これはいかなる場合もクレームさ れた如き本発明の範囲を制限するものではない。

実施例１ 旦１■ 株り、アレナリア、ＤＳＭ　Ｎｏ、６２６０を、以下の組成（！当たり）の培地 １００Ｉ１１を含有する５００ｊｄのバフル化エルレンマイヤーフラスコ中、回 転振動テーブル（２５０ｒ、ｐ、ｍ、）上で３０°Ｃで培養した：大豆穀物　５ ０ｇ Ｍｇ５ＯａニアＨ２ＯＯ，２ｇ ＮａｔＨＰＯｎ；２Ｈｚ０　１０　ｇ プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）　（登録商［）［，６１０，１ｍオートクレ ーブ処理前にｐＨを７．０に調節培養後、ブロスの酵素活性は３．７　ＣＰＵ／ ｌであった。

株り、サリナ、ＤＳＭ　６３３１を同様に培養したが、但し、培養培地は更に４ ０ｇ／４２のシグマ　シ　ソルトを含有していた。

培養後、ブロスの酵素活性は５．２　ＣＰυ／ｌであった。ブロスは約９．１の ｐｒを有する１つの主プロテアーゼ成分を含有していた。

実施例２ ！１班 実施例１に従って得られた如く、Ｄ、アレナリア、ＤＳＭ　６２６０の培養ブロ スを、ベックマンＪ−６遠心分離機内で４０００ｒｐ園で３０分間遠心分離した 。上澄みを集め次いで１０μｍフィルターネットで濾過した。

かくして７．５１の上澄みを得、これを引続きフィルトロン装置を用い１０００ カツトオフのポリスルホン膜で限外濾過により１．０ｋｇに濃縮した。

プロテアーゼを更にアニオン交換クロマトグラフィー法により、引続きＩＩＰＬ ｃカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法により精製した。

アニオン交換に対し、上記で得られた濃縮物をバッチプロセスで２５−Ｍポレー ト、５−Ｍ　ＣａＣ１ｚ　：ｐＨ８，５中、ＤＥＡＥ−セファテックスＡ−２５ と反応させた。プロテアーゼはマトリックスに結合することなく物質中に残る。

アニオン交換からプロテアーゼ含有物質のアフィニティクロマトグラフィーは） ＩＰＬＣカラムで行なわれた。

かくして得られたプロテアーゼ調製品は、２つのプロテアーゼを含有していた０ 株り、アレナリア、ＤＳＭ　Ｎｏ、６２６０の培養によって得られるプロテアー ゼ調製品の主成分は、ＬＫＢアムホリン（Ａｍｐｈｏｌｉｎｓ）（登録商標）　 ＰＡＧプレート（ｐＨ３，５〜９．５）に間する等電点電気泳動により測定され る如＜９．１のｐｌおよび５Ｏ５−ＰＡＧＥにより測定される如く約２０．００ ０の分子量によって特徴づけられた。マイナー成分は、９．５を超えるｐｌおよ び約２８．０００の分子量によって特徴づけられた。５ＯＳ−ＰＡＧＥにより判 断される如く、プロテアーゼは全蛋白質含量の約５０％を含んでいた。

主プロテアーゼ成分は、カゼイン（ハンマーステン（Ｈａｎｇａｒｓ　ｔｅｎ） （登録商標））、ヘモグロビン、スキムミルクおよびＮ−スクシニル−Ａｌａ　 −Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ　−ｐ−ニトロアニリドを分解するたの能力によ って更に特徴づけられる。プロテアーゼは、色原体物質ＢＡｐＮＡ（Ｎ−α−ベ ンゾイル−０，−アルグーｐ−ニトロアニリド）およびＺ　−Ｇｌｕ　ｐＮＡ（ Ｎ−ヘンジイルオキシカルボニル−Ｇｌｕ−Ｐ＝ニトロアニリドに対して全く活 性を有しないか又は極めて低い活性を有する。プロテアーゼはＥＤ丁Ａによって 阻害されない。

株り、サリナ、ＤＳＭ　Ｎｏ、６３３１の培養によって得られるプロテアーゼは 、前記と同様に本質的に精製された。それは、更に、５ＯＳ−ＰＡＧＥによって 測定される如く約１８．０００〜２０，０００の分子量により、カゼイン、（ハ ンマーステン（Ｈａｖｗａｒｓｔｅｎ）　（登録商標））、ヘモグロビン、スキ ムミルク、およびＮ−スクシニル−Ａｌａ　−Ａｌａ　−Ｐｒｏ　−Ｐｈｅ　− ｐ　−ニトロアニリドを分解するその能力によって特徴づけられる。プロテアー ゼは、色原体物質ＢＡｐＮＡおよびＺ　−Ｇｌｕ−ｐＮＡに対して活性を有しな いか又は極めて低い活性を有する。

実施例３ 透亙ふユ皿 洗たく性能試験を、草の汁で汚した綿について２０°Ｃで等温的に１０分間モデ ル洗たくにおいて行った。

２種のアメリカのタイプの洗荊製荊、粉末洗剤組成物と液体洗剤組成物を試験に おいて用いた。実施例２で記載した酵素製剤を洗たく試験に対して用いた。用い た酵素用量を下記の表に掲げる。繊維／洗液比は、洗液１２に対し６ｇの繊維で あった。

２．０　ｇ　／　ｆｆの商業上のアメリカのタイプの粉末洗剤を用いた。洗剤を 約６°ｄｌ＋（ドイツ硬度）水中に溶解した。　ｐＨは９．５であった。

２．０ｇ／ｌの商業上のタイプの液体洗剤を用いた。洗剤を約６°ｄ）ｌ水中に 溶解した。ｐＨは７．８であった。

洗たくに引き続き、布帛を流れる水道水で２５分間すすぎ次いで風乾した。

プロテアーゼの性能を、データーカラー　エレフォメーター２０００を用い、４ ６０ｎｓで測定した規約反射率（％Ｒ）の変化（ΔＲ）によって測定した。ΔＲ はプロテアーゼを添加して洗たくした規約反射率からプロテアーゼを添加しない で洗たくした規約反射率を差し引いたものである。

試験結果を表１および表２に示す。

ｌ上 アメリカのタイプの粉末洗剤組成物中で洗たく後測定した差規約反射率、ΔＲ 紅 アメリカのタイプの液体洗剤組成物中で洗たく後に測定した差規約反射率、ΔＲ 差規約反射率の値により示される如く、本発明のプロテアーゼは、洗剤用酵素と して使用に適している。

実施例４ 々のプローアーゼ　の 株り、アレナリア、ＤＳＭ　Ｎｏ、６２６０を、１０Ｉ！、の以下の基質中、１ ６０時間、チェマツプ（Ｃｈｅｍａｐ）発酵槽中で培養した：大豆フレーク　５ ０　ｇ　／　ｌ Ｍｇ５１ｍ　ニアＨ１００，２ｇ　／　ＩＮａＪＰＯａ；２Ｈｚ０　１０　ｇ　 ／　ＩＫＪＰＯｎ　２　ｇ　／　１ グルコース　１０　ｇ　／　１ プルロニツク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）　（登録商１）Ｌ６１　１ａｆ／ｆ滅菌前に ｐＨを７．０に調節 発酵中、希釈８３ＰＯ，を添加することによりｐＨを８．０未満に保持した。

培養ブロスを実施例２に記載される如く濃縮した。濃縮物のｐａを７．５に調節 した。この１００ｄに、７０ｄのアセトンを添加し、次いで沈殿物を遠心分離に より除去し、次いですてた。上澄み液に１００ｍのアセトンを添加した。プロテ アーゼを含有する沈殿物を遠心分離により回収し次いで２５−Ｍのボレート、５ −ＭのＣａＣＩｚ；ｐｉ（８，５に溶解した。

この物質を例２に記載する如く、アニオン交換およびアフィニティクロマトグラ フィーにより精製した。

ＨＰＬＣアフィニティクロマトグラフィーからの溶出液中の２種のプロテアーゼ を、モノ（Ｍｏｎｏ）Ｓ　ＨＲ５／　５カラム（ファルマシア）を用いたカチオ ン交換クロマトグラフィーにより分離した。ＨＰＬＣからの溶出液を、２０＋＊ ＭのＮａ−アセテート、５０ｍＭのホウ酸、２ｍＭのＣａＣＩｚ；ｐＨ４，５を 含有する緩衝液に対して透析した。これをモノ（Ｍｏｎｏ）Ｓカラムに通用し、 このカラムからＮａＣｌの勾配で２種のプロテアーゼが個別の分画において溶離 した。

５０５−ＰＡＧＥにより判断される如＜、ｐｌ９．１および分子量２０．０００ を有する主プロテアーゼ成分の純度は９０％以上であった。

９．５を超えるｐｌおよび２８，０００の分子量を有する少量プロテアーゼ成分 の調製品は５０％以上の純度であった。しかし５Ｏ５−ＰＡＧＥにより判断され る如く、約３３，０００の分子量を有する他の蛋白質の著るしい量を未だ含存し ていた。汚染蛋白質は蛋白分解活性を有しなかった。

実施例７ Σ二末亙■ガ 上記で記載した如く、プロテアーゼ調製品の生成分をＮ−末端配列決定に委ねた 。

株り、アレナリア、ＤＳＭ　Ｎｏ、６２６０からの主成分のＮ−末端配列は次の ように見出された： Ａ−Ｔ　−Ｖ−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｙ−Ｙ　−１−Ｎ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ−３− ５−Ｖ−Ｇ−Ｆ−５−Ｖ−５−Ｘ−Ｇ　−’／−シー１．。

株り、サリナ、ＤＳＭ　Ｎｏ、６３３１からの主成分のＮ−末端配列は次のよう に見出された・ Ｘ　−Ｘ−Ｖ　−Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｄ−Ａ−Ｙ−Ｙ　−１−Ｎ−Ｒ−Ａ−Ｇ−Ｒ−Ｘ −Ｓ−Ｖ−Ｇ−Ｆ−５−Ｖ−５−Ｇ−Ｇ−Ｙ−Ｖ−５−Ａ−A、。

デンドリフィエラ　プロテアーゼのＮ−末端配列は、実質的に同一であり、そし てそれ故プロテアーゼは密接に関連している。

国際調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　リンデガールト、ポールデンマーク国、デーニー−２１００コ ペンハーゲン　ニー１．ニーステル　セーガゼ

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．デンドリフィエラ属又はスコレコバシジウム属の株から得ることのできるプ ロテアーゼ。
2. ２．Ｄ．サリナ、Ｄ．アレナリア、Ｄ．インファスカンス、Ｄ．ビノザ、Ｓ．グ リロカルビ、Ｓ．フジフォルメ、Ｓ．アニレ、Ｓ．コンスティクタム、もしくは Ｓ．カテニボラムの株、又はそれらの突然変異体もしくは変異体から得ることの できる、請求の範囲第１項記載のプロテアーゼ。
3. ３．Ｄ．サリナ（スーザランド）ピューアンドニコット又はＤ．アレナリアニコ ットもしくはＳ．グリロカルピＭ．Ｂ．エリスの株又はそれらの突然変異体もし くは変異体から得ることのできる、特許請求の範囲第１項記載のプロテアーゼ。
4. ４．株Ｄ．アレナリアニコット、ＤＳＭ　Ｎｏ．６２６０から、又は株Ｄ．サリ ナ（スーザランド）ピューエトエコット、ＤＳＭ　Ｎｏ．６３３１から、もしく は株Ｓ．グリロカルピＭ．Ｂ．エリス、ＤＳＭ　Ｎｏ．６３３２から、又はそれ らの突然変異体もしくは変異体から得ることのできる、特許請求の範囲第３項記 載のプロテアーゼ。
5. ５．８．０を超えるｐＩを有することを特徴とする、請求の範囲第１〜４項のい ずれかに記載のプロテアーゼ。
6. ６．次の（ａ）〜（ｄ）の特性を有することを特徴とする、プロテアーゼ： （ａ）約９．１のｐＩ； （ｂ）約１８〜２０ｋＤの分子量； （ｃ）ヘモグロビン、カゼイン、スキムミルクおよびＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ− Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡに対して活性である；（ｄ）株Ｄ．アレナリア、ＤＳＭ 　Ｎｏ．６２６０又は株Ｄ．サリナ、ＤＳＭ　Ｎｏ．６３３１由来のプロテアー ゼの免疫化学的性質と同一又は部分的同一の免疫化学的性質。
7. ７．次の（ａ）〜（ｃ）の特性を有することを特徴とする、プロテアーゼ： （ａ）９．５を超えるｐＩ； （ｂ）約２８ｋＤの分子量； （ｃ）デンドリフィエラアレナリア、ＤＳＭ　Ｎｏ．６２６０由来の免疫化学的 性質と同一又は部分的同一の免疫化学的性質。
8. ８．請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のプロテアーゼの製造方法であって 、炭素および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養源培地中で、デンドリフ ィエラ属又はスコレコバシジウム属のプロテアーゼ生産株を培養し、引き続き所 望の酵素を回収することを含んでなる、前記方法。
9. ９．請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のプロテアーゼの製造方法であって 、プロテアーゼをコードするＤＮＡ断片を単離し、ＤＮＡ断片を適当なプラスミ ドベクター中の適当な発現シグナルと結合させ、自己複製プラスミドとして又は 染色体に組込むかのいずれかでプラスミドベクターを適当な宿主に導入し、プロ テアーゼの発現に至る条件のもとで宿主生物を培養し、次いでプロテアーゼを培 養培地からの回収することを含んでなる、前記方法。
10. １０．宿主生物がＥ．コリ、又はバシラス属、アスペルギルス属もしくはストレ プトマイセス属の構成員である、請求の範囲第９項記載のプロテアーゼ。
11. １１．洗剤用酵素としての請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のプロテアー ゼの使用。
12. １２．請求の範囲第１〜７項のいずれに記載のプロテアーゼを含んでなる洗剤組 成物。
13. １３．更に１種又はそれ以上の他の酵素、特にアミラーゼ、リパーゼ、セルラー ゼ、オキシダーゼ、および／又はペルオキシダーゼを含んでなる、請求の範囲第 １２項記載の洗剤組成物。
14. １４．無粉塵性の粒質物、液体、特に安定化された液体、スラリー、又は保護さ れた酵素の形態で提供される、請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のプロテ アーゼを含んでなる洗剤用添加剤。