JPH01502079A - 新規プロテアーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規プロテアーゼ 本発明は、ノカルジオブシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏ　５ｉｓ）のプロテアーゼ産生 菌株、アルカリプロテアーゼの製造方法、ノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏ 　５ｉｓ）に由来するアルカリプロテアーゼ調製物、洗剤添加剤および酵素洗剤 添加剤に関する。

発旦支宜量 バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属する微生物を適当な栄養培地中で培養して 生産されるタンパク分解酵素は、洗剤組成物において広く使用されている。かか る商業的に入手可能なプロテアーゼ生産物の例は、アルカラーゼ（ＡＬＣＡＬＡ ＳＥ”’　）　、エスペラーゼ（ＥＳＰＥＲＡＳＥ（ｌ））　、サビナーゼ（Ｓ ＡＶＩＮＡＳＥ　””）であり、これらは全てノボ・インダストリー（ＮＯＶＯ ＩＮＤＵＳＴＲＩＡ／Ｓ、　Ｄｅｎ＋ｎａｒｋ）から供給される。これらおよび 他の供給者に由来する類似のバシラス（Ｂａｃｉ　ｌ　１ｕｓ）産生酵素生産物 は、ｐＨ値８〜１１の範囲内で、そして通常の・洗剤溶液中に存在する金属イオ ン封鎖剤、界面活性剤および漂白剤の存在する洗剤溶液中で酵素活性を有する。

ＡＬＣＡＬＡＳＥ　”’　中のプロテアーゼは、バシラス・リケニフォルミス（ Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）種の菌株の培養により生産さ れる。ＥＳＰＥＲＡＳＥ　”’　および５ＡＶＩＮＡＳＥ　”’　中のプロテア ーゼは、好アルカリ性バシラス種、例えばそれぞれＮＣＩＢ　１０１４７および ＮＣＩＢ　１０３０９菌株の培養により得ることができる。商業的に入手可能な アルカリプロテアーゼの至適温度は、約６０℃である。しかしながら、これらの 市販の酵素は、室温で相対的により低い活性を示す。

１皿型塁！ 本発明は、アクナノミセス類の微生物に由来する新規なアルカリプロテアーゼの 生産、単離、特性決定および使用に関する０本発明のプロテアーゼは、従来アル カリプロテアーゼを生産することが知られていないアクチノミセスに属するノカ ルジオプシス・エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉｏ■ｉｓ　ＪＬ）ＩＯＲ株およびノカ ルジオブシス・ダッランビレイ　（Ｎｏｃａｒｄｉｏ　ｓｉｓｄａｓｓｏｎｖｉ ｌｌｅｉ）Ｍ５８−１株から単離される。本発明で開示されるプロテアーゼは洗 濯のための洗剤添加剤として有用である。

東ドイツ特許、ｍＤＤ　２，００４，３２８号に記載されるノカルジオプシス・ ダフランビレイ　（籾■劉旦匹ｎｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）菌株のＺＩＭＥＴ ４３６４７株は、繊維素溶解性および生物学的スラッジの浄化を目的とするプロ テアーゼを生産することが知られている。しかしながら、この菌株は、公衆にと って入手可能でな（、基準菌株はプロテアーゼを生産せず、そしてこの種のいか なる他の菌株もプロテアーゼを生産することが知られていない、さらに、前述し た特許のプロテアーゼは、本発明のプロテアーゼの温度分布および至適ｐＨから 非常に相違する性質を有する。

第３図では、本発明のノカルジオプシス・エスピーのプロテアーゼに対するｐＨ 分布が、特許のＺＩＭＥＴ４３６４７株に由来するプロテアーゼについて報告さ れているものと比較された。同じ実験条件下で、ＩＯＲ株とＭ　５Ｂ−１株は両 方とも至適ｐＨ８を存するが、一方ＺＩＭＥＴ４３６４７のプロテアーゼのそれ は、９〜１０である。さらに、本発明のプロテアーゼは、広範囲の至適ｐｎを有 し、ｐＨ７〜１１の間で極大活性の少なくとも６０％を示している。ＺＩ？ＩＥ Ｔ４３６４７のプロテアーゼは、ｐＨ７において極大活性の５０％を有するにす ぎず、そしてＰ）Ｉｌｌでは極大活性の０％である。ＰＨＩＩにおける高いタン パク分解活性の発現は、洗剤添加剤にとっては特に重要である。

本発明のプロテアーゼに対する温度分布は、ＺＩＭＥＴ４３６４７に由来するプ ロテアーゼに対して報告されているそれと、第４図において比較された。４０℃ と５０℃間では、ＺＩＭＥＴ４３６４７のプロテアーゼは、その至適活性の７０ 〜１００％を示し、本発明のプロテアーゼにより示される値（即ち、２５〜６５ ％）より大きい。

前述した相違の他に、本発明の菌株におけるプロテアーゼの生産は、無機塩の添 加に対して異なる応答をする。本発明の菌株は、無機塩が増殖培地に添加されて もされなくとも同じ程度のプロテアーゼ活性物を生産する。ＺＩＭＥＴ４３６４ ７菌株は、増殖培地へ無機塩の添加により改良された応答を示すことが報告され ていて、メタロプロテアーゼの存在の可能性を示している。第２ｂ図に明確に示 されるように、本発明のプロテアーゼは、いかなる検出可能なメタロプロテアー ゼ活性も持たない。

本発明のノカルジオプシス・エスピー１０Ｒ株およびノヵルジオブシス・ダソラ ンビレイＭ　５８−１株のプロテアーゼは、商業的に入手可能なバシルスのプロ テアーゼに比し、低い洗濯温度、例えば冷水、いわば１５〜２５℃における洗剤 添加剤として特に効果的である。さらに、本発明のノヵルジオブシス・エスピー １０Ｒ株およびノカルジオブシス・ダッランビレイＭ　５Ｂ−１株のプロテアー ゼは、バシラスのプロテアーゼより生ずるタンパク加水分解パターンから相違す るそのパターンを生ずる。

多くの類似点、即ち、至適ｐＨおよび温度、安定性、インシュリン消化パターン を有するにもかかわらず、ノヵルジオプシス・エスピー１０Ｒ株およびノヵルジ オプシス・ダッランビレイＭ　５８−１株に由来するプロテアーゼは、識別する ことができる。例Ｖに記載されるように、両プロテアーゼの分子量は、相違する （１０Ｒについては、２３．５００〜２５，０００．　Ｍ　５Ｂ−Ｈ：ツいては 、２０．５００）　、その上、２つのプロテアーゼの等電点は、相違する（１０ Ｒについては、ｐ　Ｉ、Ｔｈ９．５、Ｍ　５８−１については、ｐ　Ｉ　＝９． １５および８．２（２個ノハンド））。さらに、ｌ０Ｒ（７）プロテアーゼに対 する抗体は、Ｍ　５８−１のプロテアーゼに対してほんの部分的な同一性を示す にすぎず、そしてその逆も同様である。

主皿■挟肚 現在、プロテアーゼについては、洗剤工業での利用を含む多（の商業的用途があ る。以下の、新規なノカルジオプシス。

エスピー１０Ｒ株およびノカルジオプシス・ダフンンビレイＭ　５８−１株のプ ロテアーゼの詳細な検討は、洗剤添加剤としての使用法に限定されている。しか し、さらに本発明者等は、タンパク分解酵素に対する他の用途も必ず存在するこ とを認識している。

酵素は、ｐＨｓ温度、および洗剤としての使用ではＥＤＴＡのような金属イオン 封鎖剤の存在を含む使用法の条件に影響されることが認識されなければならない 。従って、高温（６０’Ｃ）で綿織物を洗濯するために開発された５ＡＶＩＮＡ ＳＥ　”’　のようなバシラスのプロテアーゼは、多くの昨今の織物について勧 められる低い洗浄温度（１５〜２５℃）において効果的でないかも知れない。

第４表で明らかなように、同じ酵素活性レベルで使用した場合、ノカルジオプシ ス・エスピー１０Ｒ株およびノカルジオプシス・ダンランビレイＭ　５８−１株 に由来する新規なアルカリプロテアーゼを含んでなるプロテアーゼ配合物は、５ ＡＶＩＮＡＳＥ　”’　プロテアーゼよりも、１５℃における模擬洗濯条件下で 、綿（ＥＭＰＡ　１１６）上のタンパクに基づくよごれを白くするための能力が 約２０〜５０％優れることを示す。

主五皇註組屋■双 本発明のさらにそのほかの態様によれば、アルカリプロテアーゼの製造方法が提 供され、この方法は、プロテアーゼ産生ノカルジオブシス・エスピー（Ｎｏｃａ ｒｄｉｏ　ｓｉｓ　Ｊシ）の菌株を、資化し得る炭素源、窒素源およびリン源を 含有する栄養培地中、好気的条件下で培養し、次いで発酵ブロスからプロテアー ゼ製品を回収することを特徴とする。

さらに本発明の理解のために、ここで添付した図面について言及する： 第１図は、ノカルジオプシス・エスピー１０Ｒ株に由来するプロテアーゼ並びに バシラスのプロテアーゼ生産物ＡＬＣＡＬＡＳＥ”’　、ＥＳＰＥＲＡＳＥ”’ 　および５ＡＶＩＮＡＳＥ　”’　ニよるインシュリンの酸化型Ｂ−ＩＮ処理の １５分および２．５時間後の消化生成物の溶出クロマトグラムを示す。ノカルジ オブシス・ダンランビレイＭ　５８−１株に由来するプロテアーゼは、ノカルジ オブシス・エスピー１０Ｒ株に対する消化生成物と同様なものを与えた（データ は示していない）。

第２図は、ノカルジオブシス・エスピー１０Ｒ株のカゼインに対する活性をｐＨ および温度の関数として図示する。さらにマタ、ＥＤＴＡ　（１０＋＊Ｍ）およ びフェニルメチルスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ、　１　＋ｍＭ）の影響を 示した。ノカルジオプシス・ダフランビレイＭ　５８−１株に由来するプロテア ーゼは、ＰＭＳＦについてはＩＯＲ株と類似の挙動をするが、しかしＥＤＴＡは 活性を阻害しない。これらの結果は、ＩＯＲ株およびＭ　５８−１株に由来する プロテアーゼは、セリンプロテアーゼであり、メタロプロテアーゼでないことを 示す。

第３図は、ノカルジオブシス・エスピー１０Ｒ株、ノヵルジオブシス・ダフラン ビレイＭ　５８−１株および特許のＺＩ？ＩＥＴ４３６４７株間の至適温度の相 違を示す。

第４図は、ノカルジオブシス・エスピー１０Ｒ株、ノカルジオプシス・ダッラン ビレイＭ　５８〜１株および特許のＺＩＭＥＴ４３６４７株間の至適温度の相違 を示す。

微生立 本発明の微生物は、ノカルジオプシス（トリ亘旦胚旦）の好気性の放射菌に属す る。

２つの菌株は、米国のアグリカルチエラル・リサーチ・コレクション（Ａｇｒｉ ｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ＮＲＲＬ）に ブタペスト条約の条件下で次のごとく寄託されている。

寄託者の参照記号　１０ＲＭ　５８−１寄託番号　ＮＲＲＬ　１８２６２　ＮＲ ＲＬ１８１３３寄託日　１９８７年１１月１０日　１９８６年１１月１３日分類 名称　Ｎｏｅａｒｄｉｏ　ｓｉｓ　」−Ｎ、　ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ当該技 術分野で既知の方法により得られるこれらの菌株の変異株および変異体もまた、 本発明の範囲内にある。

両菌株とも増殖温度は、２０℃〜３０℃であり、３５℃以上では増殖しない。増 殖のための至適ｐＨは、９であり、そしてｐＨ８以下ではいかなる増殖も生じな い。前記の増殖パラメーターは、特許のＺＩＭＥＴ４３６４７菌株のものと相違 する。　２１Ｍ２７株は、２５〜３７℃　（好ましくは２８℃）の温度およびｐ Ｈ６，５〜７．２の酸性度で培養される。

ノカルジオプシス・エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉｏ　ｓｉｓ　、！Ｊ！、）株のツ アペック・ドックス（Ｃｚａｐｅｋ　Ｄｏｘ）寒天スラント上での成熟コロニー は、黒い分泌を伴う灰−緑の気中菌糸を示す。ノカルジオブシス・ダッランビレ イ（Ｎｏｅａｒｄｉｏ　ｓｉｓ　ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）Ｍ　５８−１株の ツアペック・ドックス寒天スラント上での成熟コロニーは、白からクリームに着 色した気中菌糸を有する。典型的なノカルジオプシス・ダ、ランビレイ菌株は、 かすかな黄−灰色を伴なう青白い気中菌糸を有する。

ノカルジオプシス・ダフランビレイ　（Ｎｏｃａｒｄｉｏ　５ｉｓｄａｓｓｏｎ ｖｉｌｌｅｉ）　（ＡＴＣＣ２３２１Ｂ）の基準株は、本発明のプロテアーゼを 産生じない、基準株（ＡＴＣＣ２３２１８）および本発明の分離株ノカルジオプ シス・エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉｏ　ｓｉｓ　コシ）は、相違する変異株である と信じられる。さらに、ＩＯＲ株およびＭ　５８−１株は、一般的なプロトプラ スト化試薬、卵白リゾチームおよびノボザイム（ＮｏｖｏＺｙｍ　”’　）　２ ３４に対する応答により相互に他のものから相違する。１０Ｒ株は、リゾチーム および／またはＮｏｖｏＺｙｍ　”’　２３４により細胞壁が溶解されないが、 一方Ｍ　５Ｂ−１株は、リゾチーム単独でプロトプラスト化することができる。

典型的なノカルジオプシス・ダフランビレイ株は、リゾチームに感受性である（ Ｍ、Ｃ，５ｈｅａｒｅｒ等、江旦ム打葺よりａｃｔｅｒｉｏｌ　３３　：　３６ ９−３７４．１９８３）　、これらは、ＩＯＲ株の細胞壁ペプチドグリカンの結 合が、Ｍ　５８−１株のそれとおそらく相違することを示している。細胞壁の分 類学的な解析は、ＩＯＲ株が新菌種であるかなりの可能性を有することを示して いる。

１０Ｒ株についてのさらに詳細な分類学的な同定は、実施中である。

ンパク　”　に　るアーセイ ノカルジオブシス・エスピー培養物中のタンパク分解活性は、周知のアンソン（ Ａｎｓｏｎ）ヘモグロビン法により測定した（Ｊｏｕｒｎａ上ｏｆ　Ｇｅｎｅｒ ａｌ　Ｐｈ　ｓ山江旺し’；ｄ、　７９−８９．１９５９、参照）。

１アンソン単位は、タンパク分解酵素がｐＩ（９，０および温度２５℃において 、１０分の反応時間中にヘモグロビンを分解し、そこに形成されるトリクロロ酢 酸で沈殿され得ない分解生成物が、フェノール試薬により１分光たりにチロシン １ミリ当量の量と同一の着色を与える初速度を有するタンパク分解酵素の量であ る。

また、タンパク分解活性は、カゼインの加水分解、次いでＴＣＡ可溶性タンパク と０−フタルジアルデヒドおよび２−メルカプトエタノールとの反応により測定 した。得られる複合体の吸収を、３４０ｎｍで測定し、セリン標準と比較した。

反応混合物は、２．０％（Ｗ／Ｖ）のハメルスタイン（Ｈａｍｍｅｒｓｔｅｉｎ ）カゼイン１．〇−及び適当な酵素希釈液ｏ、５−〔いずれもＢｒ１ｔｔｏｎお よびＲｏｂｉｎｓｏｎユニバーサル緩衝液（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　Ｂｕｆｆｅｒ ）　Ｉ　（ｐＨ９，５）　（Ｊ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、　１９３Ｌ　１４５１頁） 中〕からなる。混合物を２５℃で３０分間インキュベートした後、２．５　Ｗｌ ｌの停止剤〔脱イオン水中、３．６　（ｗ／ｖ）％のトリクロロ酢酸、６．０　 （Ｗ／Ｖ）％の酢酸ナトリウムおよび３．７８（Ｖ／Ｖ）％の氷酢酸〕を加えて 反応を停止した。

対照の反応物では、酵素を添加する前に停止剤を添加した。

２５℃で２０分後、反応混合物をワットマン濾紙＃４２を通して濾過するか、ま たは遠心した。

濾液の既知量（２００Ｊ１りを、０．０５Ｍの四硼酸ナトリウム、１（Ｗ／Ｖ） ％のドデシルスルホン酸ナトリウム、０．８■／−の０−フタルジアルデヒド（ ＯＰＡ）（最初はエタノールの４０■／−溶液として溶解している）および０． ２（ｖ／ｖ）％の２−メルカプトエタールを含有するＯＰＡ試薬３−に添加した 。２分後に３４０ｎｓ＋における吸収を測定した。同様に、セリンの標準（０， ２ｗ／ｄ）　２００　ｐｌを、ｏＰＡ試薬３１Ｒ１に添加し、そしてＡ　３４゜ を測定した。活性は、ＣＰＵ　（カゼインプロテアーゼ単位）で表示されるが、 ここでＩ　ＣＰＵとは、標準的な条件下で、セリンｌ■−〇ｌに相当する、１分 光たりのＴＣＡで沈殿しない分解生成物の量を生成する酵素量として定義される 。

ローアーゼ９　の置割 本発明のノカルジオプシスは、他の微量栄養素と共に責化し得る炭素および窒素 源を含有する栄養培地であって、原則的に公知技術に従って構成されている栄養 培地において、好気条件下で培養することができる。

好ましい炭素源は、グルコースおよびマルトースのような炭水化物か、または穀 類の種子、麦芽、米およびモロコシのような物質を含有する炭水化物である。培 地に取り込まれる炭水化物濃度は、非常に広範囲、グルコースと等価のものとし て計算されるパーセントで、例えば１〜１５％であってもよいが、通常８〜１１ ％が好ましいであろう。

栄養培地中の窒素源は、有機天然物であり得る。有機窒素源の中で非常に数多く のものが、アクナノミセス類の培養に関連する発酵工程において通常使用される 。例えば、大豆粉、綿実粕、ビーナツツ粉、カゼイン、コーン・ステイープ・リ カー、酵母エキストラクトおよびアルブミンが挙げられる。

さらにまた、栄養培地は、通常の微量物質を含有せしめる。

本発明のノカルジオプシス菌株は、好論性であるため、これらは、３５℃以上で 増殖することができず、培養は２０℃〜３０℃の温度で、かつアルカリのｐＨ値 で行うのが好ましい。

アルカリｐＨは、適当な緩衝剤、例えば炭酸ナトリウムまたは炭酸ナトリウムと 炭酸水素ナトリウムの混合物を、添加（増殖培地の滅菌後）することにより得る ことができる。タンク発酵槽における培養では、人工的な通気を行うことが必要 である０通気速度は、通常のタンク発酵に従うことが可能である。

発酵後、液状の酵素生成物は、ブロスから粗粒状物の除去、さらに所望により低 温での蒸発または逆浸透による濃縮を経て生成することができる。最後に、濃厚 物に防腐剤を添加してもよい。

本発明によれば、また、アルカリプロテアーゼは、本発明のノカルジオプシス菌 株に由来するプロテアーゼおよびその発現についてコードする遺伝子を含有する 微生物を培養し、次いで培養ブロスからのプロテアーゼの回収により調製するこ とができる。培養される前記微生物は、ノカルジオプシス菌株それ自体（変異株 および変異体を含む）であるか、または遺伝子が組換えＤＮＡ手段により挿入さ れた形質転換宿主生物体のいずれかである。かかる手段は、当該技術分野で既知 であり、そして一般に次の段階： ａ）遺伝子の発現を促進する機能をコードするＤＮＡ配列およびノカルジオブシ スのプロテアーゼをコードするＤＮＡ配列を含んでなる適当な組換えＤＮＡクロ ーニングベクターを用意し； ｂ）段階ａ）に由来するクローニングベクターで適当な宿主生物体を形質転換し ；そして Ｃ）前記形質転換宿主を、適当な培地で培養し、そして場合により培養培地から プロテアーゼを回叙するを含んでなる。

好ましい宿主生物体は、ノカルジオブシス（Ｎ０Ｃａｒｄｉ吐ｓ　ｉ　ｓ　）、 ストレプトミセス（旦工翌呻度ｓ）　％酵母およびアスベルギＪＬｔ　ス（ハｙ ｍｇｉ　ｌ　］　ｕ　ｓ　）　の菌株である。ＥＰ　２３８．０２３（Ｎｏｖｏ ）における宿主のごしく、Ａ・オリーゼ（！ｌ！、　（ｍηりを用いることが特 に好ましい。

ペプチドのマツピング インシブ、リンの酸化型Ｂ鎖のプロテアーゼによる触媒的分解により生成される ペプチドを、逆相８円７Ｃで分離した。、ノカルジオブシス・エスピー１０Ｒ株 のプロテア−ぎの作用を通して得られ、そして例Ｖに記載されるように精製され るペプチド分解生成物のクロマトグラムは、第１図に示される。また、対照と１ ．７て、既知のアルカリプロテアーゼ、Ａ　Ｌ　ＣＡ　１．、Ａ　Ｓ　Ｅ　’　 ”ゝ、ＥＳＰＥＲＡＳＥ”　、５ＡＶＩＮＡＳＥ”　テ消化して生じたペプチド も示１７た。酸化型Ｂ鎖インシュリンの消化パターンに関しては、本発明のプロ ５−アービ（１０Ｒ）が、ハシラスのアルカリプロテアーゼのいずれからも明ら かに相違することを理解し得る。

さらに、クロマトグラム上の完全なり　Ｓｋｉインシュリンに相当するピークは 、ＩＯＲ株のプロテアーゼに゛ついてはハシラスのプロテアーゼを用いたものよ りも早い時点で消失する。ノカルジオプシス・ダッランビレイＭ　５８−１株に 由来するプロテアーゼは、ＩＯＲ株のそれに非常に類似する消化パターンを生ず る（データは示していない）。

酵孟塁謂製ｌ 固体酵素調製品は、Ｎａ、ＳＯ，のような塩を用いるか、またはエタノールもし くはアセトンのような水混和性溶媒を用いる沈殿化により精製および／または濃 縮したブロスから調製することができる。また、ブロスからの水の除去には、ス プレードライのような適当な乾燥方法を用いることができる。こうして得られる プロテアーゼ調製品のタンパク分解活性は、一般に０．２〜１゜０ＡＩＪ／ｇ　 （はぼ０．２〜１．０　ＣＰＵ／ｇ）の範囲にある。

本発明のプロテアーゼ調製品は、洗剤添加剤、具体的には微粉末のない顆粒、安 定化した液状または保護した酵素のように、使用目的に適する剤型であるのが好 ましい。

微粉末のない顆粒は、例えば、Ｎ１．１６７．９９３　（Ｎｏｖｏ）、ＬＩＳ　 ４，１０６．９９１　（Ｎｏｖｏ）またはＵＳ　４．６６Ｌ４５２　（Ｎｏｖｏ ）に従って調製することができ、そして場合により当該技術分野で既知の原理に 基づき被覆してもよい。

液状のプロテアーゼ調製品は、例えば、ポリプロピレングリコール、他のグリコ ール類、糖、糖゛アルコールおよび硼酸を添加することにより安定化し得る。

保護された酵素は、ＥＰ　２３Ｌ２１６　（Ｎｏｖｏ、　Ａｌｂｒｉｇｈｔ　＆ 　Ｗｉｌｓｏｎ）に準じて調製することができる。

跣札ｉ」笈 本発明の洗剤組成物は、陰イオン性、非−イオン性、陽イオン性もしくは両性イ オン性、またはこれらの混合物である、−とができる界面活性剤を含んでなる。

陰イオン界面活性剤の具体例は、アルカリ金属の直鎖アルキルベンゼンスルホネ ート　（ＬＡＳ）　、α−〜オレフィンインホネー（（ＡＯ３）、アルコールエ トキシザルフェート（Ａ　Ｅ　Ｓ　）および天然石ケンである。

本発明による洗剤は、当該技術分野で既知のその他の洗剤成分、例えばビルダー 、漂白剤、漂白活性化剤、抗腐蝕剤、金属イオン封鎖剤、汚物再付着防止剤、香 料、並びに酵素および漂白剤のための安定剤等を含むことができる。

本発明の洗剤組成物は、いずれかの都合のよい剤型、例えば粉末、液体等に成形 することができる。プロテアーゼは、酵素安定剤、例えば前述したものを入れる ことにより液体洗剤中で安定化することができる。

一般に、洗剤は、溶液としてｐＨ７〜１２、特に８〜１Ｏ１５を存する。本発明 のプロテアーゼの広範囲な至適ｐＨのため、本発明のプロテアーゼは前記の全範 囲で高い活性を有する。

本発明の洗剤は、本発明のプロテアーゼに加えて、１以上の別の洗剤酵素を包ま せることができる。例えば、リパーゼ、アミラーゼ、セルラーゼおよびプロテア ーゼ（本発明のプロテアーゼ以外）、例えばアルカリ・ハシラス（Ｂａｃｉ　１ ｌｕｓ）のプロテアーゼである。２　（または２以上）の酵素を、別々にか、ま たは組み合わせた添加剤の剤型で加えることができる。

園ｌ■周隼産説、朋− 第１図は、本発明のＩＯＲプロテアーゼによるインシュリンの酸化型Ｂ鎖の消化 生成物の溶出クロマトグラムを示す、消化していない基質並びに５ａｖｉｎａｓ ｅ＠およびＡｌｅａｌａｓｅｅ　（既知プロテアーゼ）による消化後についての 同様のクロマトグラムも示した。

第２図は、本発明のＩＯＲプロテア・−ゼに対する温度−活性およびｐＨ−活性 曲線を示す。

第３図および第４閏は、本発明の２つのプロテアーゼ（１０ＲおよびＭ　５８− １）に対するｐＨ−活性および温度−活性曲線を、ＺＩＭＥＴ４３６４７のプロ テアーゼについて公表されているデータと比較して示す。

氾 ノカルジオプシス・エスピー（吹用諌服旦ｙ　、　）　１０　Ｒ株を、下記の組 成の培地５０３１１！を含有する２５０−の３重のじゃま板を備えた（ｔｒｉｐ ｌｅ−ｂａｆｆｌｅｄ）エーレンマイヤーフラスコ中で、回転振盪性の台上、３ ０℃において培養した。

１β当たり培地組成（ｇ）： マルトデキストリント１００　２０ 大豆粉　２０ 酵母エキストラクト　２ に！ＨＰＯ４９ ＣａＣＯｚ　５ 滅菌後、炭酸ナトリウム／炭酸水素ナトリウム　緩衝剤の１Ｍ溶液（ｐＨ９，２ ）５−の添加により培地のｐＨを９．０に調節した、インキュベーションの２な いし５日後、ブロスのタンパク分解活性を、前記のＡｎｓｏｎアッセイ法を用い て測定した。

９３．５時間インキュベーション後のＩＯＲブロスの酵素活性は、１３−３ＡＵ ／　ｆであった。

ノカルジオプシス・ダフランビレイ　（Ｎｏｃａｒｄｉｏ　５ｉｓｄａｓｓｏｎ ｖｉｌｌｅｉ）　Ｍ　５Ｂ−１を、インキュベーションが２５℃である以外は、 記載されているのと同様に培養した。インキュベーションの１４０．５時間後、 ブロスは９．６ＡＵ／ｆの酵素活性をノカルジオプシス・エスピー１０Ｒ株を例 Ｉに記載したのと同様の培地および条件下で培養した。２６時間増殖後、その培 養物２１を用い発酵槽中の例Ｉに記載した培地５（１（培地のｐＨは滅菌後調節 していない）に接種した。

接種後、発酵槽の増殖ｐＨは、２ＭのＮａ、ＣＯ，および１０％のＨｓＰＯａで ８．７に調節した。温度を３０℃に維持した。９０時間後、プロテアーゼの力価 は、Ａｎｓｏｎアフセイ法を用いて測定したところ１１．５Ａｎｓｏｎ単位／７ ！を示した。

培養ブロスを遠心して細胞を除去した。次に、上澄を濾過しく０．４５μ）そし て限外濾過（１０，０００分子量カットーオフ）により、以下の例で使用される 生成物になるまで濃縮した。

ノカルジオブシス・ダ７ランビレイＭ　５８−１株を、インキュベーション温度 を２５℃とした以外は例Ｉに記載したのと同じ培地および同じ条件下で培養した 。２４時間の増殖後、培養物２１を用いて次の成分（ｇ／ｌ）からなる発酵槽培 地５（ｌに接種した。

マルトデキストリン　４０ セレローズ（Ｃｅｒｅｌｏｓｅ）　４０大豆粉　６０ ＫｔＨＰ０．　５．５ Ｍｇ５Ｏａ　０．４０ ＣａＣｊ！ｚ　Ｏ，３０ 微量ミネラル溶液　７１Ｒ１ 発酵温度は、３０℃に制御した。初発ｐＨは８．６に設定し、そして８．５以下 にならないように２ＭのＮａ、ＣＯ，を添加して調節し、またさらに８．８を越 えないように８３ＰＯ４の添加により調節した。グルコースが消費されそしてり 、０．のパーセントが上昇し始めた場合は、グルコースをフィードした。フィー ド流は、グルコース溶液（水５００ｇ中セレローズ５００　ｇ　）からなる。グ ルコースは、２０ｇ／ｊ！のグルコースが加えられるまで（約１２時間）　、３ ．５ｍｌ／１／時の一定速度で供給した。

プロテアーゼは、４０時間で蓄積し始め、１２０時間で最高の力価５３ＡＵ／ｌ を得た。

培養ブロスを遠心して細胞を除去した。次に、上澄液を濾過（０，４５μ）し、 そして限外濾過（１０，０００分子量カントーオフ）により、次の例で使用され る生成物になるまで濃縮した。

Ｌ ｐＨおよび温度の関数としての例■由来のＩＯＲ株のプロテアーゼ活性を、前述 のアッセイ方法に従い、基質としてカゼインを用いて測定した。さらに、プロテ アーゼ活性に対するＥＤＴＡ　（１０ｓａＭ）およびフェニルメチルスルホニル フルオライド（ＰＭＳＦ　、　１　ｍＭ）の影響を試験した。結果を第２図にグ ラフ化した。第２　（ａ）図から理解できるように、市販のプロテアーゼＡｌｃ ａｌａｓｅと同様に、至適温度は６０℃に等しいか、またはそれ以上にある。プ ロテアーゼは、ｐＨ８〜９間に極大活性を示し、そしてｐＨ７〜１１の範囲内で 極大活性の少くとも８５％の活性を示す、　ＥＤＴＡは、プロテアーゼ活性に何 等の影響も及ぼさないが、一方ＰＭＳＦの添加は、殆んど完全な阻害をもたらし 、本プロテアーゼがセリン型であることを示して２５℃または４０℃において種 々の洗剤成分の存在下で、１０Ｒ株およびＭ　５８−１株に由来するプロテアー ゼの安定性を次のように測定した。

第１表に示した添加成分の存在下または不存在下で０．０１　Ｍの硼酸緩衝液（ ｐＨ９，５）中にプロテアーゼを０．５ＡＵ／Ｉ！まで希釈した。

試験したノカルジオプシス・エスピーのプロテアーゼの両方とも、２５℃かまた は４０℃のいずれにおいてもそれらの本来の活性の少くとも８３％を維持した。

第１表 ゛　の　にお番るノカルジオプシス・エスピー１ＯＲおよびノカルジオプシス・ 　゛−ランビレイＭ　５８−１に　るプロ孟ヱ二亙Ω安定性 残存活性％ ■ヱ 例■で生産したノカルジオブシス・エスピー１ＯＲに由来するプロテアーゼを、 次のように精製した。

まず最初に、濃厚細胞除去ブロスを、０．０５ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７） で平衡化したセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）−Ｇ２Ｓカラム（並のグレー ド）にかけた。タンパクを、同じ緩衝液で溶出し、プロテアーゼ活性を含有する 画分を集めた。所望により、集めた酵素溶液を水または緩衝液を用いて希釈して 適当なイオン強度を与えた後、０．０５ＭのＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７）で平衡化し たＣＭ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）速流性カラムにかけた。

約５０％の総プロテアーゼ活性を樹脂に吸着させ、次いで直線塩ダラージェント （０〜７５５ＭのＮａＣｌ　）で連続的に溶出した。

このＣＭ−セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）精製プロテアーゼは、２１．０ ＡＵ／ｇ　（１５ＣＰＵ／ｇ）の比活性を有する。

５Ｏ５−ＰＡＧＥに分析した場合、精製プロテアーゼは、それぞれの２５．００ ０および２３，５００の分子量を存する１の主成分および１の副成分の２つの組 成分を含有することがわかった。ノヵルジオプシス・ダンランビレイＭ　５８− １株に由来スるプロテアーゼを、同様に精製したところ、分子量２０．５００を 有する５ＤＳ−ＰＡＧＥ上に１のバンドから構成されていた。

策ｌ衷 耳３　のプロテアーゼ１斐ｌ）迦。

５ｅｐｂａｄｅｘ−Ｇ２５　１６．８　０．８９　９２　６．２　１．０ＣＭ− Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　２．２９　０．４４　４５　２１．０　３．４劃厘 ノカルジオブシス・エスピー由来のプロテアーゼは、商品プロテアーゼＡＬＣＡ ＬＡＳＥｏ、　ＳＩＮ’１ＮＡＳＥｅ　、　オよびＥＳＰＥＲＡＳＥｅ　カら、 インシュリンの酸化型Ｂ鎖の消化についてのそれらのパターンにより識別された 。プロテアーゼ（２，７ｘ　１０−’ＣＰＩＪ）を、ｐＨ９，０の緩衝液中のイ ンシュリンの酸化型Ｂ鎖（０，１？（ｗ／ｖ）％〕に加え、そして２５℃で１５ 分間または２．５時間インキュベートした。反応を停止するために２０分煮沸し た後、サンプルを０．１　Ｍの硫酸アンモニウム（ｐＨ３）で平衡化した逆相Ｈ ＰＬＣカラム（Ｂａｋｅｒｂｏｎｃｌ　Ｗｉｄｅｐｏｒｅ　Ｃ＋＊）に注入した 。ペプチドは、０〜５０％のアセトニトリルの直線的ダラージェントにより溶出 した。

クロマトグラムは第１図に示され、そして本発明のプロテアーゼが、バシラスア ルカリブロテアーゼのいずれからも、酸化型インシュリンＢ鎖消化のクロマトグ ラムパターンに関して異なることを示す。さらに、ＩＯＲ株のプロテアーゼでは 、クロマトグラム上の完全なインシュリンのＢ鎖に相当するピークが、バシラス のプロテアーゼ用いたものよりも早い時点で消失する。

氾 洗浄試験は、テスト・ファブリフクス社（Ｔｅｓｔ　ＦａｂｒｉｃｓＩｎｄ、＋ 　Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ　ＮＪ、）より供給されるＥＭＰＡ　１１６試験布見本（ 血液、ミルクおよびカーボンブラックにより染がつけられている綿）を用い、１ ５℃で１０分間Ｔｅｒｇ−０−Ｔｏｓｅｔｅｒ中で実施した。０．０２５　、０ ．０５　、０．１　ＣＰＩＪ／　ｆの酵素量をタイド（Ｔｉｄｅ９　）　（リン 酸塩：　＜　０．５、酵素未含有、ｐＨ１０，４）に添加した。プロテアーゼは 、ＩＯＲ株由来のものおよび５ＡＶＩＮＡＳＩＪを使用した。

プロテアーゼの清浄性は、反射率の変化（ΔＲ）、即ち、酵素洗浄試験見本の反 射率値を、酵素用いないで洗浄した試験見本のそれで差し引いたもの、により測 定した０反射率値は、ガーディナー・レフレフトメーター（ＧａｒｄｉｎｅｒＲ ｅｆｌｅｃｔｏｍｅｔｅｒ）ＸＬ　８００　（Ｂｅｔｈｅｄａ、　ＭＤ）を使用 して読み取った。

結果を第■表に表す。これらは、同じ使用量において、１０Ｒプロテアーゼは５ ａｖｉｎａｓｅを用いるよりも２０〜５０％大きい清浄性を得ることができるこ とを示す。

第１去 邸ジＬ月旦：ヱ！Ｕ頂ニア”０βつ一二竺皇オ、乏５ａｖｉｎａｓｅの：′ １０ＲＯ，０２５３，９５０％ ０．０５　７．１　２９％ ０．１０　１１．５　２０％ ５ａｖｉｎａｓｅ　Ｏ，０２５２，６−０，０５５，５− ０，１０９，６− 男」（支 ■１ 洗浄試験は、ノカルジオブシス・エスピー１０Ｒ株およびノカルジオブシス・ダ フランビレイＭ　５Ｂ−１株に由来するプロテアーゼを用い、市販のプロテアー ゼＡＬＣＡＬＡＳＩＪおよびＳＡＶ　ＩＮＡＳＥ＠との比較のために実施した。

　ＥＭＰＡ　１１６試験布見本（血液、ミルクおよびカーボンブランクにより染 がつけられている綿）は、テスト・ファブワックス社（Ｔｅｓｔ　Ｆａｂｒｉｃ ｓＩｎｄ−＋　Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、　ＮＪ）から入手し、そしてホウレンソウ 見本および血液見本は、新鮮なホウレンソウ抽出液またはウシの血液を所望の綿 布に付着した後、空気乾燥して自社調製した。

洗浄試験は、次の組成の洗剤において１５℃で１０分間、Ｔｅｒｇ−０−Ｔｏｒ ａｅｔｅｒ中で実施した。

■底　１１６Ｌ ＬＡＳ　（Ｎａｎｓａ　８０Ｓ、　８０％の活性）０．４ＡＥ　（Ｂｅｒｏｌ　 ０６５）　０．１５石ケン（Ｓｕｎｌｉｇｈｔ、　８０％の活性）　０．１５ト リポリリン酸ナトリウム　１．７５ ケイ酸ナトリウム　０．４ カルボキシメチルセルロース　０．０５ＥＤＴＡ　Ｏ，０１ 硫酸ナトリウム　２．１ 水 （ドイツ硬度９°ｄＨ，ｐＨ９，５に調節）０．０５ＣＰＵ／　１の酵素量をＥ ＭＰＡおよびホウレンソウの染に使用し、０．５ＣＰＵ／ｆｉの酵素量を血液の 染に使用した。

反射率値は、ガーディナー・レフレフトメーターＸＬ　８００（ＥＭＰＡおよび ホウレンソウ）を用いるか、または４６０ｎｍ　（血液）においてエルレボ（Ｅ ｌｒｅｐｈｏ）　２０００を用いて読み取った。

プロテアーゼの清浄性は、反射率変化（ΔＲ）、即ち、酵素洗浄試験見本の反射 率値から酵素を用いないで洗浄した見本のそれを差し引いて測定した。結果を、 第■表にまとめた。

この結果から、ノカルジオプシス・エスピー１０Ｒ株およびノカルジオプシス・ ダフランビレイＭ　５８−１株のプロテアーゼは、すべてのタイプの染の試験に おいて、等しい使用量に基づき同等の優れた挙動を示すことが明らかである。

特に、Ｍ　５Ｂ−１株由来のプロテアーゼは、ＥＭＰ＾１１６について使用する ために好ましく、ＩＯＲ株由来のプロテアーゼは、血液の染について使用するた めに好ましい。

国際出願番号ＰＣＴ／ 国際出願番号ＰＣＴ／ ５　１０　１５　２０　２５　３０　３５　４ＯＬ４５ケ ５　１０　１５　２０　２５　３０　３５　叩　４５令 ＦＩＧ、　ＩＡ 分 今 ＦＩＧ、　ＩＢ 分 ＦＩＧ、　１ｃ ＦＩＧ、　２ ％ １間　腔　！思　審　紹　牛 第１頁の続ぎ ［相］Ｉｎｔ　ｅｌ、’　識別記号　庁内整理番号［相］発明　者　ストロベル 、ロバート、ジョー　ア。

シフ、ジュニア　ス・ ０発　明　者　オーバーホルト、ジャネット、　ア。

エム、　ブ１ メリカ合衆国、コネチカット　０６８１０．ダンバリー、オール　マケット　レ イン　１９ メリカ合衆国、コネチカット　０６８１１．ダンバリー、オールドロックフィー ルド　ロード　１６６、ユニット　１７−６

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．増殖のための至適ｐＨが約９でありｐＨ８以下では実質的に増殖せず、増殖 のための至適温度が２０〜３０℃であり約３５℃以上では実質的に増殖せず、そ してＮ・ダフソンビレイ（Ｎ．ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）または１０Ｒ株によ り特定される新菌種に属することを特徴とするノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄ ｉｏｐｓｉｓ）のプロテアーゼ産生菌株。
2. ２．Ｎ・ダッソンビレイ（Ｎ．ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ）Ｍ５８−１もしくは ノカルジオプシス・エスピー（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓｓｐ．）１０Ｒ、また はそれらの変異菌もしくは変異体である請求の範囲第１項記載の菌株。
3. ３．適当な炭素源および窒素源を含有するアルカリ性のｐＨ、好ましくはｐＨ８ 〜１０における液内条件下でノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）菌 株を培養し、そしてこの培養を２０℃〜３０℃の温度範囲で行うことを含んでな り、そしてこれらの後、培養プロスから酵素を回収することを特徴とするアルカ リプロテアーゼの製造方法。
4. ４．請求の範囲第１−２項記載の菌株を使用する請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．請求の範囲第１−２項記載の菌株に由来するプロテアーゼおよびプロテアー ゼの発現についてコードする遺伝子を含有する微生物の培養を含んでなり、そし て培養後、培養ブロスからプロテアーゼを回収することを特徴とするアルカリプ ロテアーゼの製造方法。
6. ６．培養するための微生物が、請求の範囲第１−２項記載の菌株である請求の範 囲第５項記載の方法。
7. ７．培養するための微生物が、前記遺伝子を挿入した形質転換宿主生物体である 請求の範囲第５項記載の方法。
8. ８．宿主生物体が、ノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）菌株、スト レプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）菌株、酵母またはアスペルギルス（ Ａｓｐｅｒｉｇｉｌｌｕｓ）菌株、好ましくはＡ．オリーゼ（Ａ．Ｏｒｙｚａｅ ）である請求の範囲第７項記載の方法。
9. ９．請求の範囲第３項ないし第８項に記載のアルカリプロテアーゼ調製品。
10. １０．基質としてカゼインを用いて測定した場合に、ｐＨ７〜１１の範囲内でア ルカリプロテアーゼの極大活性の少くとも６０％を有することを特徴とするノカ ルジオブシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）に由来するアルカリプロテアーゼ調 製品。
11. １１．請求の範囲第１−２項記載の菌株に由来するものであることを特徴とする 請求の範囲第１０項記載のプロテアーゼ調製品。
12. １２．プロテアーゼが、ノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）の菌株 に由来するプロテアーゼおよびプロテアーゼの発現についてコードする遺伝子を 含有する微生物菌株の培養により生産されるものであることを特徴とするアルカ リプロテアーゼを含んでなる洗剤添加剤。
13. １３．ノカルジオプシス（Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ）菌株が、請求の範囲第１ −２項記載の菌株であるか、またはＮ．ダッソンビレイ（Ｎ．ｄａｓｓｏｎｖｉ ｌｌｅｉ）のプロテアーゼ産生菌株である請求の範囲第１２項記載の添加剤。
14. １４．基質としてカゼインを用いて測定した場合に、ｐＨ７〜１１の範囲内でそ の極大活性の少くとも６０％を有することを特徴とする請求の範囲第１２−１３ 項記載の添加剤。
15. １５．微粉末の存在しない顆粒としてか、または安定化した液状物として提供さ れる請求の範囲第１２−４項記載の添加剤。
16. １６．０．５〜１０ＣＰＵ／ｇのタンパク分解活性を有する請求の範囲第１２− １５項記載の添加剤。
17. １７．さらにアルカリ・バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）プロテアーゼを含んでな る請求の範囲第１２−１６項記載の添加剤。
18. １８．請求の範囲第１２−１７項記載のタンパク分解性添加剤を含んでなること を特徴とする酵素洗剤組成物。
19. １９．０．００１〜０．５ＣＰＵ／ｇのタンパク分解活性を有する請求の範囲第 １８項記載の組成物。