JPH06506968A - 硫酸化オリゴ糖、製造方法、製薬学的組成物および用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 硫酸化オリゴ糖、製造方法、製薬学的組成物および用途本発明は低分子量多糖の 分野に関する。より具体的には極めて良好な薬理学的および抗トロンビン特性を 有するオリゴ糖組成物に関するものである。

一般に抗トロンビン的処置は主要二部門の薬剤、即ち抗凝固剤および抗血小板剤 の使用を必要とする。

抗ビタミンに化合物は抗凝固剤中非常に重要な系列を構成する。該化合物は経口 投与で活性であるとされ、数多くの指標に用いられる。しかしながら、これらの 使用はある種の欠点、特にそれらに起因する出血の危険や長期処置への投薬適合 性の困難さによりなお限定されたものとなっている。

ヘパリンは抗凝固剤の第二部門を構成する。これらは種々の鎖長および硫酸化度 を有するオリゴ糖化合物であるグリコサミノグリカン系列の抽出性生化学的物質 である。ヘパリンは種々の型の血栓において、特に他の療法と任意に組み合わせ に静脈血栓の治療または予防において用いられる。

ヘパリンの短所は出血の起因となる強い抗凝固性活性、およびかなりの高用量の 使用を要するｐｆ４の様なある種の血清因子に対する感受性にある。

さらにヘパリンは非常に不均一な生成物である。従って、ヘパリンの作用機作を 評価し、そしてヘパリンの総活性における各々の成分の貢献度を算定することは 鴫であり、その結果副作用の増加を伴うことなく抗トロンビン活性を増スさせる ことは困難である。

上述の短所に対する最初の解決策は低分子量のヘパリンにより与えられた。これ らのヘパリンは化学または酵素剤を用いたオリゴ糖鎖の断片化（解重合）により 得られる。特に、解重合は強塩基の存在下でのヘパリンエステル処理により表さ れている（欧州特許第４０１４４号）。解重合はまた亜硝酸の存在下でのヘパリ ンの処理により、またはヘバリナーゼの作用によっても実施できる可能性がある （欧州特許第６４４５２号）。これら種々の方法はヘパリンをつくる多糖類の一 般的構造を有するが、より小さい重量平均分子量を有するオリゴ糖の混合物をも たらす。

さらに詳細には、研究は非常に短いオリゴ糖鎖を有するヘパリンから誘導された 混合物へと主に向けられた。こうして、欧州特許第２７０８９号は、８個の糖単 位以下を含有するヘパリン誘導されたオリゴ糖混合物が、ヘパリンよりすぐれた 抗トロンビン比活性を有することを示している。同様に大端類が生成され、それ らの抗トロンビン特性が研究された（欧州特許第６４４５２号）。ヘパリンから 誘導された多糖類、たとえば六−１五−および四糖類に関するより最近の特許欧 州特許第８４９９９号および同３０１６１８号も挙げることができる。

しかしながらこれまで述べた生成物は、ヘパリンが直面する問題を完全に満足の いく態様で解決比きていない。特に、生成物の重量平均分子量とその副作用の相 互関係を生体中で確認することは不可能であった。

本出願人は、ここに天然または解重合ヘパリンから、非常に改良された抗トロン ビン特性を有し、従ってより良好な治療的可能性を有するオリゴ糖混合物が得ら ＾ることを明らかにした。

事実上、思いがけなく本出願人は、ヘパリンの抗トロンビン活性のかなりの部分 が少量且つ均一な両分中に存在することを明らかにした。

より詳細には、本発明は重量平均分子量約６ＫＤを有し高い抗トロンビン活性を 所有するヘパリンの単分散画分の同定に起因するものである。

従って、実施例で具体的に説明する様に、分子量の規制および多分散性の減少に よる特に高い抗トロンビン活性を有する混合物を得ることが可能である。

本発明の一つの主題は、重量６±Ｑ、５ＫＤの重量平均分子量および多分散性約 １を有し、且つトロンビンの発生を抑制する能力を所有することを特徴とするヘ パリンの構成オリゴ糖の一般的構造を有する硫酸化オリゴ糖の混合物である。

多分散性は数平均分子質量に対する混合物の重量平均分子量の比に相当する。こ の値が混合物の分子の均一性に関する情報を提供する。この値が１に近い種混合 物は均一である。

その抗トロンビン特性に加え、本発明の混合物は特に有利な薬物動態学的特性を 有する。

従って、天然はヘパリンおよびその解重合化形態物に比較し、本発明の混合物は 血清因子たとえばｐｆ４に対してより低い感受性を示し、これは治療的可能性を 増大させるものである。

本発明の混合物の他の利点は、特にある種の望ましくない副作用を減少させるこ とにある、副作用はたとえばニー血小板減少作用。ヘパリンから誘導された既知 混合物の短所の一つは、それらが引き起こし得る血小板数の低下に端を発する。

この好ましくない作用は本発明二４合物を用いる際にはかなり減少する。

−免疫原性反応。ご３した反応が強過ぎる際には生成物の治療的効力が減少する ことは明らかである。本発明の混合物の弱い免疫原性はもう一つの非常に有利な 薬理学的特徴を成す。

さらに本発明の混合物の他の利点は特に、極めて良好な血漿性生物学的利用能お よび半減期である。

上に述べた特性は特に静脈または動脈血栓症の予防および治療における殊に効果 的な薬理学的使用を可能にする。さらにこれらは出血の危険を増加することなく 生体内でのより多量な服用量使用を可能にするはずである。

好ましい態様において、より具体的には、本発明の混合物は解重合ヘパリンの画 分である。

上に示した様に、解重合ヘパリンはいかなる化学的、酵素的または当業者にとっ て既知の他の技法によっても得られ、これらの技法がヘノ々リンのオリゴ糖鎖を 断片化することを可能にする。特に、欧州特許第４０１４４号、同第３７３１９ 号または同第３３７３２７号明細書に記載される方法が本発明に適している、 一層より好ましくは、本発明の混合物は２−ｐ−スルホ−４−エノピラノースウ ロン酸を末端の一つに有するオリゴ糖から成る。

特に有利な混合物は、ヘパリンエステルに塩基を作用させることにより解重合さ れたヘパリンの画分から成る。

本発明の混合物の抗トロンビン活性はトロンビンの発生がヒトトロンボプラスチ ンの存在下で（外因系）または接触により（内因系）始まるという試験で証明す ることができる。こうした試験は以前に記載されている（Ｈｅｍｋｅｒｆｉｉｌ Ｔｈｒｏｍｂ、Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、５６．９〜１７．１９８６）。

この活性はトロンビンの発生の２５％抑制に要する生成物の量により定量的に表 すことができる。従って本発明の混合物の活性の増加は生体内でのその抗トロン ビン比活性が初めに用いられたヘパリンに比較し１００％以上の率で驚異的に増 加することから疑いなく明白である。本発明の混合物の特にすぐれた薬物動態学 的特性を考慮すれば、比活性におけるこの増加は生体内ではさらに一層大きいも のとなる。

より詳細には、本発明の混合物は血小板の少ない血漿に対して行われた試験にお いて３００　ｎ　ｇ／ｍ　１以下の濃度でトロンビンの発生の２５％抑制を可能 にした。

本発明のもう一つの主題は上に定義した混合物の、ヘパリンまたは解重合ヘパリ ンをゲル濾過により分別することを特徴とする製造方法に関する。

本発明の方法は、数種のパラメーターを制御することで最終混合物の分子量を規 制しそしてその多分散性を決定することを可能にする。これらのパラメーターは 、特に溶出剤のイオン強度および用いられた支持体の性質である。

さらに好ましくは、分別は、（ｉ）出発ヘパリンまたは解重合ヘパリンを溶離剤 中に溶解させ、（ｉ　ｉ）こうして得られた溶液を、同じ溶離剤で前もって平衡 化させたゲル濾適用の固体支持体を少な（とも含有するカラムを通し、そして（ ｉ　ｉ　ｉ）所望分子量の両分を回収することから成る段階を連続的に行うこと を特徴とする。

本発明の特定の態様においては、出発ヘパリンとして解重合ヘパリンの使用が好 ましい。

さらにより好ましくは、ヘパリンエステルへの塩基の作用により解重合されたヘ パリンが用いられる。特に、解重合は水性媒体中または不活性有機溶媒中で有機 または無機塩基たとえば水酸化ナトリウムまたはカリウム、アルカリ金属炭酸塩 または第三アミン（トリエチルアミン、トリエチレンジアミン等）の作用下で行 うことができる。エステルへの塩基の作用はヘパリンの部分的および制御された 解重合をその一般的構造を変えずに行うことを可能にする。

さらに一般的に、欧州特許第４０１４４号明細書に記載された解重合条件を本発 明で用いることができる。

種々の型の食塩水たとえば塩化ナトリウム溶液を本発明の方法で使用し得る溶離 剤として挙げることができる。しかしながら本出願人は最上の品質の両分を得る ためには、リン酸緩衝液たとえば特にリン酸カリウム、リン酸ナトリウムまたは Ｎ　Ｈ４Ｈ２Ｐ　Ｏ４から選択した溶離剤を用いて分別を行うことが特に有利で あることを明らかにした。また極めて良好な特徴を有する混合物を得ることを可 能にするＮａＣｌＯ４またはＮＨ４Ｎ０３溶液を用いることも可能である。

溶離剤の濃度、従ってそのイオン強度は目的とする最終混合物に適合させる。特 に、溶離剤の濃度は１Ｍ以下、さらにより好ましくは０．１および０．５Ｍ間が 有利である。

リン酸緩衝液を用いる際は、濃度的０．２Ｍで上記操作を実施することが特に有 利である。

本発明の方法の第二段階において、用いられる支持体は出発混合物（天然または 解重合ヘパリン書）の重量平均分子量、所望の最終生成物の重量平均分子量およ び用いられる溶離剤における出発混合物の挙動の関数として一般に選択される。

有利には、ポリアクリルアミド−アガロース型ゲルが支持体として用いられる。

極めて良好な結果をもたらす、ゲルＡｃＡ３４、ＡｃＡ２０２、セファデックス Ｇ−２５もしくはＧ−５０または代りにＢｉｏｇｅｌ　ｐ３０が例として挙げら れる。

本発明の方法の第一の特に有利な態様では、分別の第二段階の間、固体支持体が 連続的に配置された数本のカラムに分けられる。この本発明の変形は、従来技術 の欠点、即ち本質的沈降現象を伴わずにゲル濾過支持体のかなりの最終量の使用 を可能にする。従って、分離は高分子量範囲内を含め単一の分別操作により実質 的により区別的であり、支持体はよりたやすく再生する。

用いられるカラムの数は、分離効率とゲルの沈降に起因する相反する効果との間 の最良のバランスが得られる様、本技術分野の熟練者により用いられるゲルの容 積および性質の関数として調節される。

実施に関する実際的考察のための本方法の第二段階で一般に用いられるカラムの 好ましい数は２０以下である。

実例によるとＡｃＡ２０２ゲル４０リツトルは４リツトル力ラム１０本に分けら れる。

別の特に有利な本発明の方法の態様では、相違する分離特性を有する少なくとも 二つのタイプの支持体が分別の第二段階において連続的に用いられる。この本発 明の変形はより良好な買を有する最終分別を得ることを可能にする。

例えば、分別は次のゲルの配列順で実施することができる：ＡｃＡ２０２−Ａｃ Ａ５４−ＡｃＡ″２０２゜ 本発明のより良好な実施にとって、より明白な分離を達成しよりすぐれた均一性 を得られる様多量のゲルを用いることが重要である。しかしながらこのタイプの ゲル濾過に用いられるかなり緩慢な流速の場合には、ゲル溶積は分離と縦拡散の 効果間の最良の平衡が得られる様分離される生成物の量に適合させねばならない 。

本発明の方法において有利には、出発ヘパリン（ｇ）／ゲル容積（１）比は２以 下、さらにより好ましくは０．５と１，５の間である。

本発明はまたヘパリンもしくは固体支持体上でのゲル濾過により解重合されたヘ パリンの分別により規制された分子量を有するオリゴ糖の低分散混合物の製造方 法にも関するものであり、該方法は固体支持体が連続的に配置された数本のカラ ムに分けられることを特徴とする。

本発明のもう一つの主題は活性成分として上に定義された混合物を有する製薬学 的組成物に関する。こうした組成物は血栓症の発症の予防または治療もしくは防 止において特に有利な方法で用いる二とができる。

より具体的には、該組成物は以下の場合に用いることができるニー危険が存在す る状況下での静脈血栓症の防止において、−動脈血栓症の発症、特に心筋梗塞の 場合の防止において、−術後養生において、外科的患者の静脈血栓症の防止にお いて、または代りに 一外科的材料における血栓症の防止において。

例示的かつ非制限的であると考えられるべき以下の実施例により本発明をより完 璧に説明することができる。

実施例１：　本発明により！セ物の製造−ヘパリンの解重合 水１２５ｍ１中塩化ベンゼトニウム２５ｇの溶液を水１００ｍ１中ヘパリン酸ナ トリウム１０ｇの溶液に加えた。室温で得られた生成物を濾過し、水で洗浄した 後乾燥した。この様にして得られたヘパリン酸ベンゼトニウム１５ｇを塩化ベン ジル１５ｍ１を加えた塩化メチレン７５ｍ１中に溶解させた。該溶液を温度２５ および３５℃間で２５時間加熱した。メタノール中酢酸ナトリウムの１０％溶液 を次に加えて濾過、メタノールで洗浄し乾燥した。上に述べた条件下ナトリウム 塩の形態で得られたヘパリンベンジルエステル１０ｇを水２５０ｍ１に溶解させ た。約６０℃に加熱した該溶液に水酸化ナトリウム０．９ｇを加えた。温度を１ 時間半の間約６０℃に維持し、次に該反応混合物を２０℃前後に冷却し希塩酸の 添加により中和した。次に該混合物を塩化ナトリウム濃度１０％に調節し、メタ ノール７５０ｍ１中で生成物を析出し、濾過し乾燥した。

一分別に数本のガラスカラムを使用： ａ）ＡｃＡ２０２ゲル（直径６０から１４０μｍ間を有するポリアクリルアミド −アガロースビーズ形態のゲル）１４リツトルが入る直径９５ｍｍおよび高さ２ ｍのカラム１本、 ｂ）ＡｃＡ５４ゲル（直径６０から１４０μｍ間を有するポリアクリルアミド− アガロースビーズ形態のゲル）４リツトルが入る直径５０ｍｍおよび高さ２ｍの カラム１本、 ｃ）ＡｃＡ２０２ゲル２リツトルが入る直径５０ｍｍおよび高さ１ｍのカラム２ 本。

上に述べた条件下で９合されたヘパリン２０ｇを含有する溶液をカラム（ａ）の 先端に置きＪＮａＣＩの０．３３Ｍ溶液から成る移動相を用いて流速２１０ｍ１ ／時で溶離した。

カラム（ａ）の出口で両分を集め、カラム（ｂ）の先端に積載した。

同じ溶液で溶離を行い、集めた両分を連続してカラム（ｃ）２本を通過させた。

この方法は以下の特徴を有する画分が効率的に分離しカラム（Ｃ）の出口で回収 されることを可能にした： 分子量　：６１００＋／−２００ 多分散性：ｉ、ｏｉ 実施例２ニ ーそれぞれＡｃＡ２０２ゲル約０．２５リツトルを含有する内径２．５ｃｍおよ び高さ５０ｃｍのカラム１０本を連結した、一実施例１の条件下で解重合された ヘパリン２ｇ含有の溶液を装置先端にのせ、Ｋ　Ｈ２Ｐ　Ｏ４の０．２Ｍ水溶液 を用いて流速０．４２ｍ１／分で溶離した、 一２１時間目から始めて１２．６ｍｌの両分１１３個を集めた。

該両分の特徴を、屈折率測定法により測定した重量平均分子量で表１方法は実施 例２と同様・ −それぞれＡｃＡ２０２ケル３から４リツトルを含有する内径１０ｃｍおよび高 さ５０ｃｍのカラム１０本を連結した、一実施例１の条件下で解重合されたヘパ リン３０ｇを含有する溶液を装置先端にのせ、ＫＨ２ＰＯ４の０．２Ｍ水溶液を 用いて流速６．８ｍｌ／分で溶離した。

所望の多分散特性を有する画分が得られた。

本発明の混合物の抗トロンビン活性をヒトトロンボプラスチンにより（外因系） または接触により（リン脂質子カオリン、内因系）、上に述べた条件下で測定し た（上述のＨｅｍｋｅｒ他参照）。該活性は緩衝液のみの存在下で行われた対照 に関連するトロンビン発生曲線のピークの減少により算定した。

結果はＩＣ２５（トロンビン発生の２５％抑制を得るために必要な濃度）として 表される。

方法： 試験試料の種々の濃度を含有するウシアルブミン０．５ｍｇ／ｍ＋を含んだｐＨ ７，３５の５０ｍＭトリス−ＨＣ１１ｌ衝液と０．１Ｍ　ＮａＣ＋の１／４体積 を、血漿１体積に加えた。３７℃で５分間インキュベートした後、Ｏ，ＬＭ’　 ＣａＣ１□　（外因系）によりまたはリン脂質（ホスファチジルセリン２０％、 ホスファチジルコリン８０％）６μＭおよびＯ，ＬＭ　ＣａＣｌ２中のカオリン ０．１５ｍｇ／ｍｌ　（内因系）により１．４０に希釈したトロンボプラスチン １／４体積を加えることによりトロンビンの発生が開始された。トロンビンの発 生は、４０５％Ｍのトロンビンに特異的な発色性基質である基質３２２３８への アミド分解（ａｍｙｄｏ　ｌ　ｙ　ｔ　ｉ　ｃ）活性を一定間隔（１５〜３０秒 ）で測定することにより得られた。対照の２５％抑制を得るため試料の種々の濃 度を試験した。

１）外因系 解重合出発ヘパリン　ＩｌＣ２５＝４５０ｎ／ｍｌ実施例１で製造された混合物 ：　ＩｌＣ２５＝２００ｎ／ｍｌ活性増加・１２５％ ２）内因系 解重合出発ヘパリン：　ＩｌＣ２５＝５５０ｎ／ｍｌ実施例１で製造された混合 物：　ＩｌＣ２５＝２５０ｎ／ｍｌ活性増加＝１２０％ 高血小板血漿に対して 解重合出発へパリ：／：　ＩｌＣ２５＝１１００ｎ／ｍｌ実施例１で製造された 混合物：　ＩｌＣ２５＝５００ｎ／ｍｌ同じ条件下では天然ヘパリン（解重合さ れていない、分別されていない）は２５００ｎｇ／ｍｌで抑制活性を所有しなか った。

表１ 補正書の写しく翻訳文）提出書　（特許法第１８４条の８）ｌ″６５′ｆ″１０ ”２０８１

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．重量平均分子量６±０．６ＫＤおよび多分散性約１を有し、且つトロンビン の発生を抑制する能力を有することを特徴とする、ヘパリンの構成オリゴ糖の一 般的構造を有する硫酸化オリゴ糖混合物。
2. ２．解重合ヘパリン画分であることを特徴とする、請求の範囲第１項記載の混合 物。
3. ３．末端の１つに２−■−スルホ−４−エノピラノ−スウロン酸を有するオリゴ 糖から成ることを特徴とする、請求の範囲第２項記載の混合物。
4. ４．ヘパリンエステルヘの塩基の作用により解重合されたヘパリン画分であるこ とを特徴とする、請求の範囲第３項記載の混合物。
5. ５．ヒトトロンボプラスチンまたは接触により促進された低血小板血漿に対する 試験において４００ｎｇ／ｍｌ以下の濃度でトロンビン発生を２５％抑制する能 力を有することを特徴とする、請求の範囲第１項から第４項のいずれかに記載の 混合物。
6. ６．ヘパリンまたは解重合ヘパリンがゲル濾過により分別されることを特徴とす る、請求の範囲第１項から４項のいずれか１項記載の混合物の製造方法。
7. ７．分別が（ｉ）出発ヘパリンまたは解重合ヘパリンを溶離剤に溶解させ、（ｉ ｉ）こうして得られた溶液を少なくとも同じ溶離剤で前以て平衡化したゲル濾過 用固体支持体を含有するカラムを通し、（ｉｉｉ）所望分子量の画分を回収する ことから成る段階から連続的に構成されたことを特徴とする、請求の範囲第６項 記載の方法。
8. ８．解重合ヘパリンが用いられることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法 。
9. ９．ヘパリンエステルヘの塩基の作用により解重合されたヘパリンが用いられる ことを特徴とする、請求の範囲第８項記載の方法。
10. １０．溶離剤がリン酸塩緩衝液、好ましくはリン酸ナトリウムまたはリン酸カリ ウム緩衝液から成るか、あるいはＮａＣｌ４またはＮＨ４ＮＯ３の溶液から成る ことを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
11. １１．分別の第２段階の間、支持体が連続的に配置された数本のカラムに分けら れることを特徴とする、請求の範囲第７項記載の方法。
12. １２．用いられるカラムの数が２０以下であることを特徴とする請求の範囲第１ １項記載の方法。
13. １３．異る分離特徴を有する少なくとも２つの型の支持体を連続的に用いて第２ 段階が行われることを特徴とする請求の範囲第７項記載の方法。
14. １４．用いられる支持体がポリアクリルアミド−アガロース型ゲルであることを 特徴とする、請求の範囲第７、１１、１２および１３項のいずれかに記載の方法 。
15. １５．出発ヘパリン（ｇ）／ゲル体積（ｌ）比が２以下、且つ好ましくは０．５ および１．５間であることを特徴とする、請求の範囲第１４項記載の方法。
16. １６．固体支持体が連続して配置された数本のカラムに分けられることを特徴と するヘパリンまたは解重合ヘパリンの固体支持体上のゲル濾過による分別で規制 された分子量を有するオリゴ糖の低分散混合物の製造方法。
17. １７．請求の範囲第１項から５項のいずれかに記載のオリゴ糖の混合物を活性成 分として含有する製薬学的組成物。
18. １８．静脈および動脈血栓症の治療および防止を意図した請求の範囲第１７項記 載の製薬学的組成物。
19. １９．動脈血栓症の発症、特に心筋梗塞の場合の発症の防止を意図した請求の範 囲第１７項記載の製薬学的組成物。
20. ２０．外科的患者の静脈血栓症の防止における術後養生での使用を意図した請求 の範囲第１７項記載の製薬学的組成物。
21. ２１．外科的材料における血栓症の防止での請求の範囲第１項から第５項のいず れかに記載のオリゴ糖混合物の用途。