JPH06507417A - リポソーム型プロスタグランジン製剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 リポソーム　プロスタグランジン′ 且皿五圀互 本発明は、リポソーム型プロスタグランジン製剤に関し、更に詳しくは、細胞活 性化／接着症候群（ｃｅｌｌ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｓｙ ｎｄｒｏｍｅＳ）の治療でのかがる製剤の使用に関するものである。

旦ユ凹背量 プロスタグランジン並びにエイコサトリエン酸、アラキドン酸及びエイコサペン タエン酸の関連生成物は、炭素数２０の必須脂肪酸から得られるため、パエイコ サノイド”と呼ばれる化合物の類に属している。プロスタグランジン、プロスタ サイクリン（プロスタグランジンエ系）、トロンボキサン、ロイコトリエンを始 めとするエイコサノイドの構造と合成をもっと完全に考察するためには、ここに 参照のために引用した、Ｇｉ１ｍａｎ等編、グツドマン、ギルマンの治療の薬理 学原論（Ｇｏｏｄｍａｎ　ａｎｄ　Ｇｉ１ｍａｎ’ｓ　Ｔｈｅ　Ｐｈａｒｍａｃ ｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）　、第８版 、Ｐｅｒｇａｍｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、６ｏｏ〜６１１頁（１９９０ ）を参照のこと。本考察の目的のためには、′プロスタグランジン”という用語 は、プロスタサイクリン、トロンボキサン、リボキシン、ロイコトリエンとして 同定されているエイコサノイドを含むものとする。

上記Ｇｉｌｍａｎ等で考察されているように、プロスタグランジンは、実質的に 全てのヒトの組織及び体液中で見出されている物質であり、事実上あらゆる生体 機能を含む広範囲にわたる作用をもたらす。プロスタグランジンは、通称ブロス タン酸を有する化合物と類似体であると考えることができ、構造的には、１つの シクロペンタン環と２つの側鎖を含んでいる。プロスタグランジンは、一般に、 アルファベットで示され、シクロペンタン環上の置換により区別されるいくつか の種類に大きく分かれる。Ｅ及びＤ系のプロスタグランジンは、ヒドロキシケト ンであり、一方、Ｆプロスタグランジンは、ジオールである。

Ｄ、Ｅ及びＦ系の化合物は、Ｇ及びＨプロスタグランジンの代謝生成物であり、 Ａ、Ｂ及びＣの種類のプロスタグランジンは、対応するＥ系の化合物から順次得 られる。プロスタサイクリン（ＰＣＩ）とトロンボキサンも、Ｇ及びＨ系プロス タグランジンから得られる。大きく分けた種類は、下付き添字１．２又は３で示 される側鎖の二重結合の数に応じて、更に細分される。プロスタグランジンＥｌ 　（”ＰＧＥ、”　）は、本発明において特に重要である。

これらのプロスタグランジンは、血管拡張作用、末梢血循環の改善、抗脂肪分解 などのさまざまな生理作用を有している。プロスタグランジンは、動脈管、流産 のほかに工期分娩誘導をもたらす子宮収縮の刺激、気管支喘息の治療、動物の胃 潰瘍の抑制などの多くの状態において、治療的に適用されることが知られている 。

細胞活性化及び接着は、ここではパ細胞活性化／接着症候群″と総称することに する種々の医学的病状に影響を及ぼす、重要な問題である。ある種の細胞は、そ の細胞の接着部位が活性化されると、他の細胞に対して高い接着性を示すことが 認められている。例えば、血管の、複数の、心臓周囲の、又は腹部内皮細胞のよ うな内皮細胞は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）又は腫瘍壊死因子−アルフ ァ（ＴＮＦ−アルファ）及び／又は菌体内毒素などのサイトカインによって活性 化される。同様に、血球、特に好中球と血小板は、ＧＭ−Ｃ３Ｆ、菌体内毒素、 細菌性化学誘引剤、ＴＮＦ−アルファ等の作動物質、特に補体のＣ５ａ成分によ って活性化される。補体とは、ある種の細菌及び特定の補体結合性抗体により感 作されることのできる他の細胞を破壊する熱不安定性物質を意味する用語である 。活性化された好中球及び血小板は、接着部位を有しており、それにより、血球 が互いにくっつくか、あるいは同様に活性化された内皮細胞に接着する。これら の接着により、血管の内皮細胞に接着して、集塊が形成され、肺や心臓に見られ るような小さい血管が填塞することとなり、その結果、脱顆粒〔スーパーオキシ ドアニオン（０２−）、蛋白分解酵素のような、細胞損傷のメゾイエイタ−の放 出〕が生ずる。これらの作動物質は、血管内皮及び周辺組織を破壊し、毛細血管 損傷の原因ともなる。

このような填塞及び脱顆粒の一つの発現は、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）で あり、これは、肺の小さい血管が遮断されて、その結果、活性化された好中球に より内皮細胞が破壊されることによるものである。もう一つ別の発現は、小さい 血管が内皮損傷を受けるリウマチ様血管炎又は全身性血管炎である。細胞活性化 ／接着症候群に起因する組織損傷により、虚血あるいは外傷性ショックや火傷の ような他の破壊状態により損傷を受けた組織の壊死面積が増大する結果ともなり つる。これは、損傷を受けた組織が、更に多量の接着活性化物質、例えばＣ５ａ を放出し、これが、上述のように、細胞活性化／接着症候群効果により、局所的 、全身的共に、更に別の損傷の原因となるからである。つまり、Ｃ５ａやその他 の活性化物質を放出し、それらが、細胞活性化／接着症候群により更に組織損傷 を引き起こし、更に多くの活性化物質を放出するという組織損傷の破壊サイクル がある。

このサイクル効果は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）に関して、Ａｂｒａｍ ｓｏｎ等、“補体分裂生成物及びＳＬＥの病因（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　５ｐｌ ｉｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ　ｏｆ　 ５ＬＥ）”、　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、２３　（１２）：４５〜 ５６　（１９８８）で考察されている。この論文では、補体の血管内活性化が、 Ｃ３ａ、Ｃ５ａ及びその他の補体分裂生成物のようなアナフイラトキシンの血行 内への放出を誘発するものと仮定している。分裂生成物は、好中球や血小板のよ うな炎症細胞を引きつけて活性化し、それらを凝集させ、血管内皮に接着させ、 小さい血管を閉塞させ、有毒メゾイエイタ−（例えば、０２−、エラスターゼ、 メタロプロテアーゼ）を放出させる。このように、循環補体の活性化によって、 閉塞性血管障害、好中球の脱顆粒及び広く拡がった組織障害が生じる。

このように、細胞活性化／接着症候群は、例えば、菌体内毒素やＣ５ａによる細 胞の活性化を特徴とするものである。この活性化が、内皮及び周辺組織を破壊す ることになる有毒メゾイエイタ−放出の原因となる。とりわけ、本発明が関連す る細胞活性化／接着症候群の中には、次のものがある。

１、閉塞血管の再潅流、又は移植手術や血流が一時的に止まる他の手術に付随す る再潅流に関連する障害のような、再潅流障害２、菌体内毒素を血行内に放出す る感染のような１敗血症性シヨツク３、心筋梗塞 ４、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ） ５、リウマチ様血管炎 ６、全身性血管炎 ７、循環免疫複合体を含む狼癒 ８、外傷後ショック、及び ９、火傷 １０、血管形成後の再狭窄 細胞活性化／接着症候群の影響については、心臓再潅流障害に関して、Ｓｅｅｗ ａｌｄｔ−Ｂｅｃｋｅｒ等、゛′再潅流障害に及ぼす抗接着性抗体の影響（Ｅｆ ｆｅｃｔ　ｏｆ　Ａｎｔｉ−Ａｄｈｅｓｉｖｅ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ｏｎ　 Ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｊｕｒｙ）″、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ等編、白血球接 着分子（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ）、Ｓｐ ｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、　ニューヨーク、１３８〜１４８頁（１９９０） で、更に考察されている。血管に閉塞がある場合は、その下流側に血液が流れな い虚血組織のほかに、罹患血管の内皮細胞にも必然的に損傷がある。物理的又は 化学的手段によるなどして、閉塞が取り除かれた場合は、一般に、内皮細胞には 更に損傷がある。このような損傷を受けた細胞が、好中球及び血小板における活 性化を順次引き起こす。つい゛で、これらの活性化された細胞により、活性化／ 接着細胞損傷が生じ、これを血流の回復後の“″再潅流障害”と言う。

罹患血管の再潅流後、できるだけ速く血流を回復して、虚血による一層の組織損 傷を防ぐことが重要である。しかし、好中球と内皮細胞との間の細胞接着が強く なると、以前からの虚血性領域での急速な再潅流が抑制されるということがわか っており、“非再潅流現象（ｎｏ−ｒｅｆｌｏｗ　ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ）　” と呼ぶことがある。この現象は、活性化された好中球と血小板の凝集による毛細 血管閉塞によっても影響を受ける。

更に、好中球と内皮細胞との間の接着は、毛細血管組織を損傷し、損傷を受けた 細胞から放出される細胞障害の種々のメゾイエイタ−を冠状動脈組織に到達させ 、一層の障害を起こさせる。

再潅流障害及び他の細胞活性化／接着症候群の影響については、Ｓｐｒｉｎｇｅ ｒ等編、′病気と治療における接着（Ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｄｉｓｅａｓｅ 　ａｎｄＴｈｅｒａｐｙ）”、白血球接着分子（Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ　Ａｄｈｅ ｓｉｏｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌｅｓ）、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨ ーク、８５〜１５６頁（１９９０）でも考察されている。

プロスタグランジン、特にＰＧＥ、は、細胞活性化／接着症候群のサイクルによ る損傷を低減させる潜在的有用性（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ　ｕｔｉｌｉｔｙ）を有 していることがわかっている。活性化物質の受容体を持っている同じ細胞が、プ ロスタグランジンの受容体を持っていることもわかっている。ＰＧＥ、ＰＣＩの ようなプロスタグランジンが、これらのプロスタグランジン受容体に付着すると 、細胞間接着部位を不活性化すると考えられている。この機構は、プロティンキ ナーゼＡによる環状ＡＮＩＰの細胞内濃度の増加であると考えられている。しか し、この機構にもかかわらず、重要な点は、プロスタグランジン受容体の活性化 によって、細胞の接着部位が不活性化されるということである。このように、細 胞のプロスタグランジン部位を活性化することのできる化学薬品であれば、種々 の細胞活性化／接着症候群の破壊サイクルを破ることができる。そのような化学 薬品は、プロスタグランジンであるには及ばず、細胞プロスタグランジン受容体 を活性化することができる物質であればよい。

閉塞された血管を再び開放した後、冠状動脈疾病の治療で生じるような再潅流障 害を低減させるためにプロスタグランジンを使用することが、Ｊｕｇｄｕｔｔ等 、″意識のある犬での冠状動脈閉塞後のプロスタサイクリン、プロスタグランジ ンＥ、プロスタグランジン心筋梗塞サイズの相違（Ｄｉｓｓｉｍｉｌａｒ　ｏｆ 　Ｐｒｏｓｔａｃｙｃｌｉｎ、　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ　Ｐｒｏｓｔ ａｇｌａｎｄｉｎ　Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ　Ｉｎｆａｒｃｔ　５ｉｚｅ　ａｆｔ ｅｒ　Ｃｏｒｏｎａｒｙ　０ｃｃｕｌｕｓｉｏｎ　ｉｎ　Ｃｏｎ５ｃｉｏｕｓ　 Ｄｏｇｓ）”、　Ｃ１ｒｃｕｌａｔｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（サーキュレー ション−リサーチ）、４９　（３）、６ｇ５〜７００　（１９８１）で考察され ている。この論文では、冠状動脈の周りに閉塞わな（ｏｃｃｌｕｄｅｒ　５ｎａ ｒｅ）を置くことによる心筋梗塞のシミュレーション後に再潅流した犬において 、ＰＧＥ、とＰＧＩ、は、共に、梗塞サイズを小さくする顕著な効果を有してい ることがわかった。報告されたテストでは、６時間にわたる連続動脈注入により プロスタグランジンを投与して、比較的多量の薬剤を投与する結果となった。こ の連続注入を行う理由は、ＰＧＥ。

のようなプロスタグランジンは生体内での半減期が極めて短く、有効血中濃度を 維持するためには連続的に補給しなければならないからである。更に、プロスタ グランジンは、血液が肺を通過すると、急速に不活性化し、そのため、より簡単 な静脈内投与よりも動脈注入が必要になると考えられている。更に、ＰＧＥ、が 生体内に高濃度に分布していると、低血圧、頻脈、下痢などの全身的な影響が生 じることが知られている。

このように、プロスタグランジンをベースとした薬剤の開発には種々の問題が存 在するのである。プロスタグランジンは非常に不安定であり、そのままでは、薬 剤学的に許容されつる製剤に製造するのが困難である。治療投与量において、プ ロスタグランジンは、低血圧、反射性頻脈、下痢、潮紅、傾眠、妊婦の流産を引 き起こし、薬剤の９５％は、肺、肝臓及び腎Ｒ（大部分は肺）を最初に通過した 際に取り除かれてしまうため、連続注入が必要となる。

プロスタグランジンを少量投与するために提案されている一つの方法は、水鳥（ Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ）等、“結合組織疾患に付随する末梢血管病における脂質マ イグロスフェアに取り入れられたリボ−ＰＧＥ、、ＰＧＥ、のマルチセンター二 重盲検制御試験（Ａ　Ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ　Ｄｏｕｂｌｅ　Ｂ１１ｎｄ　Ｃ ｏｎｔｒｏｌｌｅｄ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　Ｌｉｐｏ−ＰＧＥ、　、　ＰＧＥ、　 Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ　ｉｎ　ＬｉｐｉｄＭｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ、　ｉ ｎ　Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ　Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ　５ｅｃｏｎｄ ａｒｙ　ｔｏ　Ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）” 、Ｊ＋Ｒｈｅｕｍａｔｏ１．．１４：９７〜１０１（１９８７）に示されている 。この文献及び更にそこに引用されている引例では、薬剤を“リボ−ＰＧＥ、’ として搬送することが考察されており、この薬剤は、″′脂質マイクロスフェア ”の形をしていることが示されており、“′リポソームに類似”しているとして 記載されている。実際のところ、水鳥等に発行された米国特許第４，４９３，８ ４７号に記載されているように、′リポーＰＧＥ、”は、ＰＧＥ、を含む脂肪エ マルジョンであり、リポソームではない。しかしながら、このようなエマルジョ ンは、本発明で用いるリポソームにカプセル化したＰＧＥ、の安定性を示さない 。

リポソームは、取り込まれた水性容積を含む完全に閉鎖された脂質単分子膜であ る。リポソームは、単ラメラ小胞（１個の二分子膜を有する）であっても、多重 ラメラ小胞（複数の膜状二分子膜が、水性層により、それぞれ隣接する膜から分 離されていることを特徴とする玉葱状構造物）であってもよい。二分子膜は、疎 水性尾”領域と親水性頭”領域とを有する２つの脂質単分子膜で構成されている 。膜状二分子膜の構造は、脂質単分子膜の疎水性（非極性）′尾”が二分子膜の 中心に向かって配向し、一方、親水性“頭″が水性相に向かって配向するように なっている。

一つの種類のリポソームは、米国特許第５，０３０，４５３号に記載されている ように、実質的に同じラメラ溶質分布を有していることを特徴とするものである 。この種類のリポソームは、Ｌｅｎｋ等、米国特許第４，５２２，８０３号で定 義されているような安定複ラメラ小胞（Ｓ　Ｐ　ＬＶ）　、　Ｆｏｕｎｔａｉｎ 等、米国特許第４，５８８，５７８号に記載されているような単相性小胞、及び Ｃｕ１ｌｉｓ等、米国特許第４゜９７５．２８２号に記載されているような、小 胞を少なくとも１回の凍結解凍サイクルに付する凍結解凍多重ラメラ小胞（ＦＡ ＴＭＬＶ）と呼ばれる。これらの米国特許は、全て、ここに参照のために記載し た。

リポソーム個体群のラメラ性（ｌａｍｅｌ　１ａｒｉｔｙ）を減らしてもよく、 単ラメラ小胞は、ここに参照のために引用したＣｕ１ｌｉｓ等、米国特許第５， ００８，０５０号に記載されているような、リポソームを加圧下にフィルターか ら押し出す押出法を用いて、製造することができる。

リポソーム−薬剤搬送系においては、薬剤のような生物活性剤をリポソーム中に 取り込むが、あるいはリポソームと結合させて、治療しようとする患者に投与す る。例えば、Ｒａｈｍａｎ等、米国特許第３，９９３．７５４号；　５ｅａｒｓ 等、米国特許第４，１４５，４１０号；　Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ等、 米国特許第４，２３５，８７１号；　５ｃｈｎｅｉｄｅｒ等、米国特許第４，１ １４，１７９号；　Ｌｅｎｋ等、米国特許第４，５２２゜８０３号：及びＦｏｕ ｎｔａｉｎ等、米国特許第４，５８８，５７８号参照。

ここに参照のために引用した、１９８８年５月１８日出願、１９９２年１月２１ 日発行のＬｅｎｋ等、米国特許第５，０８２，６６４号（１９８８年１２月１日 に対応ＰＣＴ出願公開第ＷＯ３８１０９１７０号として公開）には、他のプロス タグランジン及びエイコサノイドのほかに、ＰＧＥ、をリポソーム内にカプセル 化する方法が開示されている。

刀１塚と【匠 本発明の一態様によれば、抗細胞活性化／接着症候群有効量の、リポソームと結 合したプロスタグランジンを投与する工程を含む、ヒトを始めとする動物の細胞 活性化／接着症候群を治療する方法が提供される。本発明のある特定の実施態様 においては、プロスタグランジンは、リポソーム内にカプセル化される。

本発明のある特定の実施態様では、方法は、下記のものからなる群から選ばれた 細胞活性化／接着症候群を治療することに関するものである。

１、閉塞血管の再潅流、又は移植手術や血流が一時的に止まる他の手術に付随す る再潅流に関連する障害のような、再潅流障害２、菌体内毒素を血行内に放出す る感染のような、敗血症性ショック ３、心筋梗塞 ４、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ） ５、リウマチ様血管炎 ６、全身性血管炎 ７、循環免疫複合体を含む狼癒 ８、外傷後ショック、及び ９、火傷 １０、血管形成後の再狭窄 本発明によれば、有効量のプロスタグランジンをリポソーム形態で搬送して、プ ロスタグランジンを遊離又は非結合形態で投与した場合よりも実質的に少ない投 与量率で、細胞活性化／接着症候群を治療できることがわかった。特定の理論や 機構に拘束されることなく、リポソームは、活性化された細胞に特に引きつけら れ、活性化された表面に付着するものと考えられる。従って、プロスタグランジ ンは、障害の部位で容易に用いることができ、その抗細胞接着作用を発揮する。

接着活性化細胞にリポソームが引きつけられることに関する一つの理論は、リポ ソームが、血液中のフィブロネクチンとビトロネクチンによってオプソニン作用 を受けるというものである。オプソニン作用は、細菌が、食細胞によってより効 率的に飲み込まれ易くなるように、変えられる過程である。このようにオプソニ ン作用を受けたリポソームは、フィブロネクチンとビトロネクチンの受容体を示 す活性化された好中球に引きつけられ易くなり、それによって、結合プロスタグ ランジンを罹患部位へ搬送する。

上で考察したように、生体内での遊離プロスタグランジンの代謝が速いため、治 療中の患者の有効血中濃度を維持するには、比較的多量のこれらの薬剤を長時間 連続注入する必要がある。しかし、高血中濃度のプロスタグランジンによって、 低血圧、頻脈、下痢が生ずるため、遊離の形態で有効量のプロスタグランジンを 投与することは、実行不可能であった。更に、プロスタグランジンのコストが高 いため、このように多量の投与を行うと、とても手が出せない高価なものとなる 。

プロスタグランジンを、本発明のリポソーム型プロスタグランジン製剤で投与す ると、目的とする生物活性効果を得るために必要とするプロスタグランジンの全 投与量は、はるかに少なくなる。同時に、プロスタグランジンがリポソームと結 合しているため、血流中の遊離プロスタグランジンの量は、低血圧や下痢などの 副作用を防いだり、あるいはできるだけ少なくするのに十分な低濃度に維持され る。このように、本発明の方法は、低コストで、副作用の少ないプロスタグラン ジンの有効投与を助ける。事実、多くの治療において、本発明は、おそらく、プ ロスタグランジンを投与する唯一の有効な方法を提供するであろう。

リポソーム−ＰＧＥ、は、プロスタグランジンをベースにした薬剤の開発に関連 した問題を克服する。薬剤をリポソーム膜内に挿入した後、凍結乾燥するため、 分子が水から遮蔽され、長期間の保存に際し加水分解しない。リポソーム−ＰＧ Ｅ、は、冷凍温度では、１．５年間安定に保たれることができ、室温では、少な くとも１年間は安定であろう。リポソームＰＧＥ、は、ＡＲＤＳの予防及び治療 にも有効であり、治療量を投与した場合、遊離ＰＧＥ、に通常関連する血圧低下 、心拍数増加又は下痢をまったく示さない。一つの理論は、ＰＧＥ、がリポソー ムに結合しているので、その薬物動態挙動が、薬剤ではなく、主としてリポソー ムによって指令されるというものである。従って、リポソーム−ＰＧＥ、は、遊 離の薬剤はど速くは血液から取り除かれず、そのため、数時間又は数日にわたっ て注入する代わりに、急速注入で投与することができる。

ＰＧＥ、は、好中球と血小板の両者の凝集及びこれらの細胞の活性化された血管 内皮細胞への結合の有効な抑制剤であることがわかっている。それは、炎症を防 ぐ、即ち予防の能力と、多くの因子の中のどれかによって一旦始まった炎症を消 す、即ち治療の能力を有している。

従来、この可能性については、上記の製剤の中毒及び薬理問題のために、調べら れていなかったが、リポソーム−ＰＧＥ、がこれらの問題を克服した。

皿皿五皿皿 第１図は、本発明により作られたリポソーム−ＰＧＥ、　（Ｌ−ＰＧＥ、）の血 小板凝集に及ぼす影響を示す図式表示である。各対のカラムＡ、Ｂは、市販の凝 集刺激剤、コラーゲン及び０４６６１３、をそれぞれ用いたテストを示す。量は 、対照、即ちＬ−ＰＧＥ、無しで投与された各刺激剤のパーセントとして表され る。投与量は、テスト動物１ｋｇ当たりの薬剤μｇで示される。テスト４は、テ スト３と同じＬ−ＰＧＥ、投与量であるが、９０分遅＜（＋９０分）測定した。

第２図は、処理及び対照大における実験の継続時間に対する心拍数（回／分）を 示すグラフである。継続時間は、実験の進行に相対的な時間で表される。血管の 急性閉塞（ＡＣＵＴＥ　０ＣＣＬ）後、テスト薬剤の１回量を投与した（ＤＯ３ ＥＩ　）。次のテスト時点は、閉塞から１時間及び２時間後（ＯＣＣＬ　ＩＨＲ ，０ＣＣＬ　２ＨＲ）であり、その後、急性再潅流（ＡＣＵＴＥ　ＲＥＰＥＲ） を行い、次いで、潅流から３０分、１時間及び２時間後（ＲＥＰＥＲ３０ＭＩＮ 、　ＲＥＰＥＲＩＨＲ，ＲＥＰＥＲ２１（Ｒ）に行った。これらの図の全てにお いて示されるテスト投与量は、リポソーム−ＰＧＥ、（Ｌ−ＰＧＥ、）、対照、 単純リポソーム（ＰＮ−ＬＩＰＯ）及び非カプセル化ＰＧＥ１である。各テスト について、テスト動物の数（Ｎ）を示す。

第３図は、第２図に示したものと同じ実験について、実験の継続時間に対する左 心房内圧を水銀のミリメーター（ｍｍＨｇ）で示すグラフである。

第４図は、テスト動物における梗塞サイズを、危険ゾーンに対するパーセント（ ＩＮＦＡＲＣＴ　５ＩＺＥ／ＺＯＮＥ　ＡＴ　ＲＩＳＫ　（％））として示すグ ラフである。Ｐ値は、テスト結果の差が、偶然の結果である確率の統計的な計算 である。０．０６未満のＰ値は、値に有意差があると考えられることを示す。

第５図は、テスト動物の心筋組織からのミエロペルオキシダーゼ放出を、組織１ ００ミリグラム当たりの標準単位（ｕ／１００ｍｇ組織）として測定して示すグ ラフである。テストサンプルは、テスト動物の心臓の４つの部分から採取した。

梗塞ゾーン（Ａ）、境界ゾーン（Ｂ）、危険領域（Ｃ）及び対照ゾーン（Ｄ）第 ６図は、リポソーム−ＰＧＥ、で前処理されたラットの皮膚熱損傷の後に、肺損 傷が防止されることを示す図式表示である。このグラフは、パーセントアルブミ ン漏れ（％ＡＬＢＵＭＩＮ　ＬＥＡＫ）を、テスト動物の血液中の放射性トレー サーの１分出たりのカウント数（ｃｐｍ）に対する右肺内のトレーサーの１分出 たりのカウント数の比として示す。

Ｃ０ＮＴＲ０Ｌは、熱的な損傷を受けていない動物、ＢＵＲＮは、熱的に損傷さ れた動物、Ｌ−ＰＧＥ１＋　ＢＵＲＮは、損傷され、Ｌ−ＰＧＥＩを投与された 動物である。

第７図は、６μｇ／ｋｇのリポソームＰＧＥＩ投与と比較して、■Ｌ−１を気管 内投与したラットにおける空のリポソーム又は遊離ＰＧＥ、の肺漏れ（ｌｕｎｇ 　１ｅａｋ）に及ぼす影響を示す図式表示である。肺漏れは、血液中の放射性ト レーサーの１分出たりのカウント数（ＣＰＭ）に対する肺内のそれの比として表 す。

且皿五詳星１皿皿 本発明によれば、抗細胞活性化／接着症候群有効量の、リポソームと結合したプ ロスタグランジンを投与する工程を含む、ヒトを始めとする動物の細胞活性化／ 接着症候群を治療する方法が提供される。がかる治療は、現在ある症状の治療だ けでなく、このような症候群の発生を防ぐため、あるいはそれらの発病度を減ら すための、ががるリポソームプロスタグランジンの予防投与をも含むものである 。

本発明のある特定の実施態様では、方法は、下記のものからなる群から選ばれた 細胞活性化／接着症候群を治療することに関するものである。

１、閉塞血管の再潅流、又は移植手術や血流が一時的に止まる他の手術に付随す る再潅流に関連する障害のような、再潅流障害２、菌体内毒素を血行内に放出す る感染のような、敗血症性ショック ３、心筋梗塞 ４、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ） ５、リウマチ様血管炎 ６、全身性血管炎 ７．１環免疫複合体を含む狼癒 ８、外傷後ショック、及び ９、火傷 １０、血管形成後の再狭窄 炎症の結果としての組織破壊は、種々の状態の病因、中でも再潅流障害、成人呼 吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、敗血症性ショック、炎症性腸疾患及びリウマチ様血 管炎と結びついている。炎症の過程は、破壊酸素種（０２−）及び分解酵素を、 好中球、通常は侵入する病原体に対する体の防御の第一線であると考えられる白 血球、から放出することによって終了する複雑な一連の事象を含んでいる。炎症 過程においては、正常な免疫反応が活性化されるが、標的は、細菌の代わりに宿 主組織である。

炎症の過程は、傷害、細胞活性化、細胞−細胞接着、組織損傷のメゾイエイタ− の細胞放出の４つに分けることができる。傷害の原因は、病気によって異なる。

例えば、ＡＲＤＳは、大きい外傷や敗血症のような因子によって引き起こされ、 心臓再潅流障害は、冠状動脈を閉塞している血栓の溶解又は除去が原因となり、 再狭窄は、血管形成がら生じる血管損傷の結果であり、敗血症性ショックは、あ る種の血液感染の結果として生ずることが多い。

傷害が一度起こると、インターロイキンｌ　（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮ Ｆ）、補体活性化の結果として作られるペプチド（Ｃ５ａ及びＣ３ａ、アナフロ トキシンとも呼ばれる）、菌体内毒素などの体液メゾイエイタ−が血液内に放出 されて、好中球と血小板（両方とも白血球）及び血管壁を内張すしている内皮細 胞を活性化する。これらの細胞は、全て、各活性化物質に特異的な受容体を有し ている。活性化物質と受容体との間に一旦結合が起こると、細胞が、６オンとな った”又は活性化された状態に切り替わる。活性化された細胞に起こる大きな変 化の一つは、新しく作られた受容体かあるいは細胞表面にすでに存在する休眠受 容体の活性化が発現することである。多くのこのような受容体は、それぞれ、他 の細胞の相補分子（リガンド）と関連して存在する。これらの受容体−リガント 対が、好中球と内皮細胞の間、好中球と好中球の間、血小板と内皮細胞の間、及 び血小板と血小板の間（血小板凝集）の結合を媒介することができる。

炎症の過程の最後の段階は、血管壁を内貼りしている内皮細胞に結合している好 中球かあるいは血小板（大部分は好中球）からの０２−及び分解酵素の放出を含 む。これらの因子の放出が内皮細胞を破壊し、炎症細胞を周辺組織内へ管外遊出 させ、その結果、組織を破壊することになる。

血小板凝集、血小板の相互接着、は、これらの同一過程の多くによって引き起こ すことができる。しかし、０２−又は分解酵素の放出の代わりに、血小板凝集が 、動脈を閉塞する血栓を形成することになり、再閉塞及び／又は再梗塞が起こる 結果となるかもしれない。

肺が、罹患した主器官であれば、その状態をＡＲＤＳと言う。急激な血圧低下の ような他の兆候があれば、その状態は、ショックとして知られる。敗血症／外傷 症候群は、外傷及び感染のような傷害にかかっており、ショック及び器官障害が 起こる可能性がある状態で、ＴＮＦ、ＩＬ−１等のような因子が放出されている 、広範なグループの患者に関係する。

患者が、ＡＲＤＳ、例えば、外傷、火傷、敗血症、脂味、酸素過剰症になりつる 傷害にかかつている場合、肺以外の多くの体内器官が侵されることができる。こ の状態の原因及び臨床コースは、大幅に変わりつる。例えば、重い感染症患者の 場合、菌体内毒素が細菌細胞壁から放出され、炎症カスケードが開始し、敗血症 性ショックとなる。また、敗血症／外傷症候群は、感染に対する因果関係で限定 されることはないので、菌体内毒素は含まれないが、それにもかかわらず、ＴＮ Ｆ、ＩＬ−１補体、ロイコトリエンなどの因子の放出が引き起こされることが可 能である。敗血症／外傷症候群に含まれる論理及び生物学は、ＡＲＤＳのそれに 匹敵し、唯一の相違は、カスケードの最終標的が肺だけでなく、多数の器官であ るということである。

血管形成術は、閉塞された血管内に風船を挿入し、閉鎖された血管を開くために ふくらませる技術である。この技術は、冠状動脈疾病の処理ではまったく普通に なっているが、この処置後６カ月の期間内に、治療した患者の３３％を超える者 が、前に開いた血管の再狭窄及び再閉塞を経験している。この状態は、風船処置 の結果しばしば生じる血管内皮への損傷から始まる。露出した細胞外基質は、数 層の活性化された血小板と急速に結合するであろう。血小板が一旦結合すると、 種々の成長因子を放出して、血管が再閉塞されるようになる点まで、血管の下に ある平滑筋細胞が成長することになるであろう。血小板が細胞外マトリックスと 結合するのを防ぐことによって、再狭窄が生ずることになる事象のカスケードを 壊すことができる。このように、血管形成処置の時点において、血小板結合を防 ぐ薬剤を急速投与することによって、再狭窄を防ぐことができるであろう。

最近、　Ｄｅ　５ｅｒｖｉ等、Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｈｅａｒｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ 、’ＰＴＣＡを受けている不安定狭心症患者におけるプロスタグランジンＥ投与 ：予備結果（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ　Ｅ　ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ 　ｉｎ　ｕｎｓｔａｂｌｅ　ａｎｇｉｎａ　ｐａｔｉｅｎｔｓｕｎｄｅｒｇｏｉ ｎｇ　ＰＴＣＡ）″、１９９０年８月、が、血管形成術前及び後に。

ＰＧＥ、を冠状動脈内注入で投与した不安定狭心症患者の臨床試験結果を発表し た。この研究の結果から、ＰＧＥ、での治療を２４時間続けただけでも、ＰＧＥ 、治療群における血管形成術後６力月の再狭窄の割合が、未治療対照群に対して ほとんど５０％低下することがわかった。

急性心筋梗塞（もつと一般的には、心臓発作という）は、通常は血栓によって生 ずる、心臓筋肉への血液供給の遮断に関連する。もし、あまりにも長い間、血液 が心臓に到達するのが妨げられると、患者は死亡するであろう。冠状動脈の閉塞 が起こった場合は、組織プラスミノーゲン活性因子（ＬＰＡ）やストレプトキナ ーゼなどの血栓溶解剤で患者を治療して、血栓を溶解するか、あるいは遮断それ 自体を取り除いてもよい。両方の例において、心臓の虚血性（酸素欠乏の）領域 への血流を再開する。心臓へのこの血流再開を、再潅流という。再潅流は、患者 の生命を救うために必要であるけれど、それが、更に再潅流障害と呼ばれる心臓 筋肉に対する障害を引き起こす。再潅流障害は、炎症カスケードの最後の結果で あるということが知られている。

血栓除去に続く再潅流障害の問題に加えて、心筋梗塞に罹っている患者は、他の 第二の問題で苦しむかもしれない。例えば、心臓への正常血流が回復した後、好 中球と血小板の両方が活性化される。活性化された血小板は、しばしば互いに接 着し、冠状動脈を再閉塞し始め、心臓への血流速度が時間につれて低下する状態 となる。ある場合には、完全な再閉塞が起こるであろう。内皮細胞への好中球結 合を防止することに加えて、ＰＧＥ、は、血小板凝集を防ぎ、非再潅流現象をな くすことはできなくても、それを減らすものである。

Ｓｈａｒｍａ等、Ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃａｒｄ ｉｏｌｏｇｙ、”急性心筋梗塞での冠状動脈内プロスタグランジンＥ３およびス トレプトキナーゼ（Ｉｎｔｒａｃｏｒｏｎａｒｙ　Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ 　ＥＩ　Ｐｌｕｓ　５ｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ　ｉｎ　Ａｃｕｔｅ　Ｍｙｏｃ ａｒｄｉａｌ　Ｉｎｆｒａｃｔｉｏｎ）　”、５８春、１１６１頁、１９８６年 １２月、は、急性心筋梗塞の臨床装置（ｓｅｔｔｉｎｇ）において、冠状動脈内 ストレプトキナーゼと共に、ＰＧＥ、を徐々に冠状動脈内注入で投与することに より、冠状動脈内ストレプトキナーゼを単独で投与した対照群と比較して、ポジ ティブな臨床結果が得られることを示している。この結果から、再潅流までの時 間が短くなり、必要なストレプトキナーゼ投与量が減少し、１０日後に開いた血 管のパーセンテージが高くなり、駆出分画が高くなることがわかった。この研究 の欠点は、薬剤を冠状動脈内注入で徐々に投与しなければならず、それはわずら れしく、専用の設備及び高度に訓練された要員を必要とするということである。

また、このアプローチでは、顕著な血圧低下を知ることができるように、ＰＧＥ 、の投与量を注意深く滴定する必要がある。

リポソームＰＧＥ、は、好中球と血小板の両方に対して、実質的に同等に働くこ とができる点で特異的である。

炎症のメゾイエイタ−の好中球による細胞外放出を、環状アデノシン−リン酸（ ｃＡＭＰ）及び環状グアノシン−リン酸（ｃＧＭＰ）の細胞内蓄積の増加及び消 耗によって変えることができる。ｃＡＭＰの増加は、炎症のメゾイエイタ−の放 出を低減させ、一方、ｃＧＭＰの濃度増加は、これらのメゾイエイタ−の排出を 高める。ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの細胞内濃度を高めることにより炎症を消すことができ るので、最初は炎症を起こさせる因子であるにもかかわらず、ｃＡＭＰを“°万 能オフスイッチ（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ｏｆｆ−ｓｗｉｔｃｈ）　”と言うこと もある。重要なことは、ＰＧＥ、のようないくつかのプロスタグランジンがｃ　 Ａ　Ｍ　Ｐを増加させて、ＰＧＥ、を抗炎症剤として使用するための理論的根拠 を与えているということである。ＰＧＥ、は、”万能スイッチオフ”を活性化す ることのできる作用物質であると考えることができる。ＰＧＥ、は、細胞−細胞 結合を媒介するのに必要な受容体の活性化を防ぐことによって、好中球及び血小 板の内皮細胞との結合のほかに、それら自身との結合を抑制することが、現在、 生体外でわかっている。この抑制は、細胞内ｃ　Ａ　Ｍ　Ｐの増加と一致する。

細胞−細胞結合がなければ、０２−及び種々の分解酵素のような補助因子を放出 することができず、組織損傷は排除される。従って、ＰＧＥ、は、有効な抗炎症 剤として、実際に作用する。媒介因子がＩＬ−１、ＴＮＦ、補体、ロイコトリエ ンあるいはその他のものであるかどうかにかかわらず、炎症を防ぐと共に、炎症 を消すことができる。

本発明で用いられるリポソームは、リポソームと結合した生物活性エイコサノイ ド、特にプロスタグランジンを提供する。かかる結合としては、リポソームの外 部又は内部膜表面とプロスタグランジンとの結合のほかに、リポソーム内へのプ ロスタグランジンの取り込みを挙げることができる。

本発明の方法で使用するのに好ましいプロスタグランジンの中には、Ｅ系（ＰＧ Ｅ）及びＩ系（ＰＣＩ又はプロスタサイクリン）のプロスタグランジンがあり、 プロスタグランジンＥ、は、細胞活性化／接着症候群の治療に特別な効用を示す 。このようなプロスタグランジンは、細胞上の接着レセプター部位を不活性化す ることがわかっている。上で考察したように、プロスタグランジンは、次には接 着部位の不活性化をもたらすことになる細胞上のプロスタグランジンレセプター 部位を活性化すると理論づけられる。この結果は、有効なプロスタグランジン部 位活性化物質である非プロスタグランジン化合物によっても達成することができ る。即ち、そのような化合物は、本発明の方法のたメニハ、゛′プロスタグラン ジンー有効（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）”であると考 えることができる。このため、本発明の方法に関しては、プロスタグランジンと いう用語は、このようなプロスタグランジン−有効化合物を含むものとする。

リポソームと結合したプロスタグランジンの゛抗細胞活性化／接着症候群有効量 ″は、当業者が容易に決定できる。ある特定の症候群について、選ばれたリポソ ームプロスタグランジンの投与量決定試験を行い、有効、非毒性投与量水準を決 定する。下記実施例３で考察する抗潅流障害治療については、投与量決定試験を 用いて、適当な投与量を決定し、動物体重１ｋｇ当たりＰＧＥ、が約０．５ｕｇ であった。

このような投与量決定は、他の症候群についても、同じ方法で容易に実施するこ とができる。

製剤の投与形態によって、化合物が搬送される生体内の部位及び細胞が決まる。

本発明のリポソームは、単独で投与することもできるが、一般には、目的とする 投与経路及び標準的な医薬プラクティスに関連して選ばれた医薬担体と混合して 投与される。製剤は、非経口で、例えば、動脈内又は静脈内に注射してもよい。

非経口投与に関しては、例えば、他の溶質、例えば、溶液を等張にするのに十分 な塩又はグルコースを含んでもよい無菌水溶液の形で使用することができる。本 発明のプロスタグランジンＥ１リポソームは、例えば、体重１ｋｇ当たり約０． ５ｕｇの投与量で、１０分間にわたって、１日１回又は２回、非経口投与しても よい。当業者であれば、製剤の特殊な性質に応じて、他の使用法を考えることが できるであろう。

本発明のリポソームは、任意の公知のリポソーム形成方法によって形成すること ができ、上で考察し、ここに参照のために引用したＬｅｎｋ等、米国特許第５， ０８２，６６４号に開示されている方法に従って、生物活性剤を装填することが できる。更に、イオン化しうる抗腫瘍剤についての同様な方法が、Ｂａ１ｌｅｙ 等、ＰＣＴ出願第８６１０１１０２．１９８６年２月２７日、で考察されており 、ここに参照のために引用する。

一般に、本発明の実施に際しては、発明の背景において述べたリポソーム形成方 法の任意のものを用いることができるが、単ラメラ小胞を形成する方法が好まし く、最も好ましくは、大半ラメラ小胞である。

これらの単ラメラ小胞を形成する好ましい方法は、生物活性剤を装填するために 、Ｂａ１ｌｙ等（上記）に記載されているような膜内外濃度勾配を用いるＢａｔ ｚｒｉ等、Ｂｉｏｃｈｉｍ、ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａｃｔａ、、　２９８　 ：　１０１５（１９７３）の技術と同様な、エタノール中の脂質と生物活性剤（ 薬剤、特にプロスタグランジン）との結合である。

この技術においては、脂質とプロスタグランジンを、エタノールのような水混和 性有機溶剤に共に溶解し、次いで第１の水溶液に徐々に加える。ブチル化ヒドロ キシトルエン（ＢＨＴ）のような防腐剤を、溶液中の脂質と任意に混合すること ができる。第１の水溶液は、乾燥保護剤を含むべきであり、更に、酢酸塩、クエ ン酸塩、リン酸塩などの緩衝液を含んでもよい。乾燥保護剤は、スクロース、マ ルトース、ラクトース、デキストロースなどの糖類、又はスクロース、マルトー ス、ラクトース若しくはデキストロースのいずれかとマニトールとの組合せのよ うな糖類の組合せであってもよい。マルトースを用いるのが好ましい。その他の 糖類としては、例えば、マンノース、ガラクトース、ラフィノース、トレハロー スを挙げることができる。一方、デキストラン、アルブミン、ポリビニルアルコ ールのような他の保護剤を用いてもよい。緩衝液は、相対的に酸性、即ち約５． ０未満のｐＨを有していてもよい。

得られたリポソーム分散液は、例えばフィルター、好ましくは細孔サイズが１１ ００ｎのものから押し出すことによって、更に均質な個体群に粉砕してもよい。

このフィルターは、直路（ｓｔｒａｉｇｈｔ　ｐａｓｓ）型であるか、あるいは 屈曲路Ｑｏｒｔｕｏｕｓ　ｐａｓｓ）型である。この方法で用いられる好ましい フィルターは、アノチックセパレーション（Ａｎｏｔｅｃ　５ｅｐａｒａｔｉｏ ｎ）製のアノボア（Ａｎｏｐｏｒｅ）　（商標）フィルターのような酸化アルミ ニウム多孔フィルムである。これらのフィルターについては、同時係属米国特許 出願第０７１５９３，２００号、１９９０年１０月５日出願、で考察されている 。

このようなリポソーム個体群は、先に、ここに参照のために記載したＣｕ１ｌｉ ｓ等、米国特許第５，００８，０５０号の押出方法により形成することができる 。このような押出方法では、リポソームを加圧下でフィルターに通し、それによ って、サイズに関して均一なリポソーム個体群が形成される。押出は、例えば、 直路膜フイルタ−（例えば、Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ　（登録商標）ポリカーボネー トフィルター）や屈曲路フィルター（例えば、ＮｕｃｌｅｐｏｒｅＲＭｅｍｂｒ ａｆｉｌ　（商標）フィルター（混合セルロースエステル））などのフィルター に、１回又は数回通すことによって実施することができる。リポソームをフィル ターに２回以上通す場合は、必要な通過回数は、目的とするリポソームのサイズ を達成するのに必要な回数によって決められるであろう。

本発明で用いられるフィルターサイズは、最終リポソーム製品の目的とするサイ ズに従って選択される。本発明においては、平均直径が約２００ｎｍ未満のリポ ソームが好ましい。本発明の個々のリポソームは、直径が約５００ｎｍであるこ とが好ましく、直径が１１００ｎ〜３００ｎｍであることが好ましい。本発明に おいては、直径が約２００ｎｍ未満のリポソームが特に好ましい。なぜならば、 このサイズのリポソームは、肺の毛細血管床を通過することが知られており、そ のために、他の器官及び組織へ通過できるからである。従って、約１１００ｎの 細孔サイズを有するフィルターが、押出工程で使用するのに選ばれる。

上記のような均質サイズ分布にリポソームをの大きさを減少させる他の方法とし ては、超音波処理、フレンチプレス技術、流体力学的剪断、例えばコロイドミル やガラリン（Ｇａｕｌｉｎ）ホモジナイザーを用いる均質化、あるいはその他の 技術がある。

得られたサイズを減少されたリポソームは、サイズに関して均質であることが望 ましく、平均直径が約２００ｎｍであり、約２０ｎｍから約５００ｎｍの範囲で 、ガウスサイズ分布を有していることが好ましい。このサイズ減少生成物は、更 に水溶液で希釈し、乾燥し、使用まで貯蔵することができる。サイズ減少リポソ ームは、例えば、２２０ｎｍミリパック　（Ｍｉｌｌｉｐａｋ）フィルター（ミ リポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ。

Ｉｎｃ、）　、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）に通すことによって、除菌してもよ い。

使用直前に、凍結乾燥した生成物を、ｐＨが相対的に酸性である、即ち約５．０ 未満である水溶液で再構成してもよい。このような外部媒体のｐＨ調整によって 、生物活性剤（プロスタグランジン）が、リポソーム膜内及び／又はリポソーム 膜を透して分配され、プロスタグランジンがリポソーム内へ有効に装填される。

プロスタグランジン結合リポソームは、技術上知られている任意の方法で脱水又 は凍結乾燥してもよい。この乾燥操作では、リポソーム懸濁液に乾燥保護剤を添 加することが必要である。この乾燥保護剤は、リポソーム内の脂質の再配列を防 ぐので、乾燥操作中及び脱水中、サイズ及び含有量が保持される。このような乾 燥保護剤にとって適当な特性は、強い水素結合受容体であり、リポソーム二分子 膜成分の分子内間隔を維持する立体化学的特徴を持っているということである。

一群の乾燥保護剤である糖類は、リポソーム製剤に含まれた場合、再水和後のリ ポソーム粒子サイズを維持するのに特に有用であることがわかっている。この特 定の群の糖類としては、例えば、デキストロース、スクロース及びマルトースが 挙げられ、これらは、水性相の約５〜約２０重量％、好ましくは約１０重量％で 用いることができる。用いることのできる他の糖類は、マンノース、ガラクトー ス、ラフィノース、トレハロース、ラクトース又はトリオース類である。マニト ールは、糖類のうちの任意のものと組み合わせて用いることができるが、驚くべ きことに、単独で用いた場合は、リポソームサイズを維持するのに成功しないこ とが知られている。マニトールは、約０〜２％濃度、好ましくは１％濃度で、糖 類と併用することができる。用いる糖類の全濃度は、約５％から約２０％、好ま しくは１０％から１２％、最も好ましくは約１０％の範囲である。ＢＨＴやＥＤ ＴＡのような防腐剤が、例えば、エタノール１ｍＬ当たりＢＨＴ５ｍｇ、１０％ デキストロース中０．０１％ＥＤＴＡで、製剤に更に含まれてもよい。尿素、ア ルブミン、デキストラン又はポリビニルアルコールなどの他の物質を用いてもよ い。

本発明のリポソームの脱水又は凍結乾燥は、リポソームを脱水又は凍結乾燥する ことについて、技術上知られている任意の方法により行うことができる。脱水に 関しては、例えば、ここに参照のために記載したＪａｎｏｆｆ等、米国特許第４ ，８８０，６３５号の方法に従って、リポソームを乾燥することができる。

脱水又は凍結乾燥技術にかかわらず、この方法により、サンプルの含水量が約２ ％未満、好ましくは約１％未満に低下する。この方法を用いて、０〜２％の含水 量、好ましくは０〜１％の含水量となる点まで、リポソームプロスタグランジン 製剤を凍結乾燥する。

凍結乾燥したプロスタグランジン−リポソーム製剤は、６℃又は２５℃で貯蔵し た場合、少なくとも１年間は安定であることができる。

高速液体グロマトグラフィ−（ＨＰＬＣ）分析を用いる製剤の安定性検討から、 ６℃で１年間貯蔵した後、ＰＧＥ、の分解生成物は存在しなかったことがわかっ ている。

凍結乾燥リポソームを使用しようとする場合は、水溶液、例えば蒸留水、注射用 蒸留水（ＷＦＩ）又は緩衝液若しくは上述のような適当なｐＨの水溶液をリポソ ームに加えて、再水和を行う。次いで、穏やかに撹拌することにより、リポソー ムを水溶液中に再懸濁させることができる。再水和は、約２５℃で行うことがで きる。

次の実施例は、説明の目的でのみ与えられるものであり、発明の範囲を限定しよ うとするものではない。

叉施■土 １５００ｍＬバッチのリポソームＰＧＥ、を、次の成分で構成した。

５００ｍＬ 成分　当たり　ｍＬ当たり マルトース−水和物　１５０．Ｏｇ　１００ｍｇエタノール（無水）　８．３８ ｍＬ　０．００５５８ｍＬＰＧＥ、　１５ｍｇ　Ｏ，Ｏ１ｍｇ 注射用蒸留水、ＵＳＰ　ｑｓ１５００ｍＬ調製： 注射用蒸留水１３５０ｍＬをビーカーに加え、３０分以上窒素を吹き込んでセッ トした。マルトース（ジェイ、ティー、ベイカー（Ｊ、　Ｔ。

Ｂａｋｅｒ）　、　Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ　ＮＪ）　１５０　ｇをこの水に 加え、窒素吹き込みを続けながら、溶解するまで混合した。これにより、ｐＨ４ ，８１で１４４０ｍＬの混合物が得られた。

別のビーカー内で、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）（日本油脂、兵庫、日本 ）７．０６ｇをエタノール（無水）６ｍＬと合わせて、溶解するまで混合した。

この混合物に、ＰＧＥ、１５ｍｇを加えて、溶解するまで混合し、残りの２．３ ７ｍＬのエタノールを、秤量容器中に残ったＰＧＥ、を洗浄するのに使用して、 混合物に加えた。

このエタノール溶液を、１０ｍＬ容量のガラス注射器に吸引して、１４ゲージの カニユーレを通し、１１分間かけて、急速な混合を行いつつ、窒素吹き込みを続 けながら、マルトース溶液にゆっくり注入した。エタノールを添加し、急速混合 すると、この溶液は濁り、リポソームの形成を示した。次いで、最終容積が１５ ００ｍＬとなるように、残りの注射用蒸留水懸濁液をで希釈した。

次いで、リポソーム分散液を、細孔サイズが０．２ｕｍのＮｕｃｌｅｐ。

ｒｅ　（登録商標）ポリカーボネート直路型フィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ、 ＰＩｅａｓａｎｔｏｎ　ＣＡ）がら３回押し出した後、相当する０、１ｕｍフィ ルターから５回押し出した。得られたリポソームの粒子サイズは、準弾性光散乱 （Ｑ　Ｅ　Ｌ　Ｓ　）　（Ｎｉｃｏｍｐ　Ｐａｒｔｉｃｌｅ　５ｉｚｅｒ）を用 いて測定し、０゜１６９ｕｍ（標準偏差０．０４１）であった。次いで、サイズ 処理を行ったリポソーム分散液を２２０ｎｍミリパック（Ｍｉｌｌｉｐａｋ）除 菌フィルターに通した。最後に、分散液を１０．５ｍＬずつバイアルに満たし、 実施例２として記載された方法に従って凍結乾燥し、凍結乾燥品を作った。これ は、すぐに使うこともできるし、将来の使用のために貯蔵することもできる。

凍結乾燥品をｌ　ＯｍＬの０，０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，３）で再水和して、 ｐＨが約４．３の懸濁液を得た。リポソーム内へのＰＧＥ１の取り込みを、ＨＰ ＬＣで測定し、有効ＰＧＥ、の少なくとも９８パーセントが、再水和分散液１ｍ Ｌ当たりＰＧＥ、約９．Ｏｕｇの濃度で、リポソーム内に取り込まれていること がわかった。

ｌ凰廻ｌ 凍結乾燥工程 上が分かれた（ｓｐｌｉｔ−ｔｏｐ）ブチルゴム栓付きの、容積が５０ｍＬのフ リント（Ｆｌｉｎｔ）凍結乾燥バイアルに、ＰＧＥ、を含む水性懸濁リポソーム １０．５ｍＬを満たした。これらのバイアルを、凍結乾燥機（ＰＶ−２４スト− ゲス（Ｓｔｏｋ６ｓ）凍結乾燥機）内の棚に載せた。バイアルを、０℃に１．５ 時間保持した。次いで、０．８℃／分の速度で、棚の温度を一４５℃に下げ、１ 時間保持し、その後、１００１００ｕの真空をかけた。次いで、真空をｌｏｏｕ ｍＨｇとしたまま、０゜５℃／分の速度で、棚の温度を一２８℃に上げた。

バイアルを、１１００ｕの真空で、−２８℃に５０時間保持した。

次いで、０．５℃／分の速度で、棚の温度を＋２５℃に上げ、２２時間保持した 。次いで、部分真空下で、バイアルに栓をした。

１作土皿梗皇 尖り偲ｌ リポソームＰＧＥ、の生体内テスト 実施例１の再水和リポソームを、閉塞した血管に起因する心筋梗塞の治療に付随 する再潅流障害を低減させる手段として、生体内でテストした。合計５３匹の調 整した２５〜３５ｋｇの犬について、投与量決定試験及び梗塞試験を行った。次 の理由のある犬は分析から除外された。梗塞ゾーンへの広い側副核化（ｃｏｌｌ ａｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）　（４）　、剖検における心臓虫（ｈｅａｒＬｗｏ ｒｍｓ）　（１）及び閉塞中の心停止（１）。

４０匹の犬が生き残り、そのうちの２７匹が分析に適していた。その内訳は対照 、リポソームＰＧＥ、、リポソーム一対照（空リポソーム）の各群で７匹ずつ、 ＰＧＥ、一対照（遊離Ｐ　Ｇ　Ｅ、　）群で６匹であった。

まず、投与量決定試験を行い、心筋梗塞試験で用いる適当な投与量を決定した。

増加量のリポソームＰＧＥ、を投与し、心拍数、平均動脈圧、心送血量及び肺毛 細管楔入圧を測定した。血小板凝集試験のために、血液サンプルも間隔をおいて 採取した（第１図）。巨丸剤として、１０〜２０分にわたって、２．Ｏｕｇ／ｋ ｇを超える投与を行うと、著しい頻脈及び心送血量の顕著な増加（２倍）を伴う 一時的低血圧が生ずる。０．１ｕｇ／ｋｇで、血小板凝集が部分的に抑制され、 ０．６ｕｇ／ｋｇで、全体的に抑制される。０．５ｕｇ／ｋｇを１０分にわたっ て投与すると、心拍数と心送血量がわずかに増えるだけであるように見える。潜 在的結果を最適にするために、リポソームＰＧＥ、を０．５ｕｇ／ｋｇずつ、２ 回に分けて投与することを選んだ。

１回目の注射は、梗塞関連動脈の閉塞直後に投与し、２回目は、再潅流直前に投 与した。この治療規制（ｒｅｇｉｍｅｎ）が、虚血の期間及び再潅流の初期期間 を通じて、効果を確実なものとしたようである。リポソームＰＧＥ、の効果は、 投与後、しばらくの間持続するように思われた。この観察結果は、血小板凝集並 びに内皮細胞及び細胞外マトリックスへの接着に直接関係する、再潅流後の閉塞 及び血管形成に続く再狭窄に対して重要である。リポソームＰＧＥ、、遊離ＰＧ Ｅ、、空リポソーム及び対照群が心拍数に及ぼす影響を検討した。テスト犬は、 ナトリウムベンドパルビタールで麻酔をかけ、静脈内ベンドパルビタール及びイ ノバー（Ｉｎｏｖａｒ）　（登録商標）（ドロペリドール／フェンダニール）投 与を続けた。左下行大動脈を結紮することによって、動脈閉塞をシミュレートし た。結紮１０分後に、０．５ｕｇ／ｋｇのリポソーム結合ＰＧＥ、を、第１群の 犬に１０分にわたって静脈内投与し、第２群の対照動物は、処理しないままにし た。リポソーム注入は、心拍数を増加させる傾向があり、その増加は、少量のイ ノバーを追加投与することにより部分的に打ち消された。テストから、実験を通 じわかった。閉塞１００分後に、２回目の０．５ｕｇ／ｋｇを、１ｏ分にわたっ て投与した。２時間後、結紮を取り除いて、血管を急性再潅流させた。２時間後 に、犬を安楽死させ、心筋梗塞損傷について心臓を調べた。その結果を第２図に まとめる。遊離ＰＧＥ、を投与された群は、最初の投与後に心拍数の顕著な上昇 を示し、再潅流まで続いた。

この上昇は、残りの３群の動物には、どれにも認められなかった。この上昇は、 血管拡張による代償性頻脈に起因している。

対照群には、合計７匹の犬が含まれ、７匹の犬をリポソームＰＧＥ１で処理した 。テスト期間中、平均大動脈圧は、相対的に一定のままであり、対照群と処理群 との間には、有意差はなかった。閉塞後、平均左動脈圧は、各群で上昇したが、 群間に有意差はなかった。結果を第３図にまとめる。

予想されるように、＋５ｕｍの放射性マイクロスフェアで測定した場合、心筋血 流は、閉塞後のすべての群の動物において、著しい増加を示した。リポソームＰ ＧＥ、の微小血管拡張作用が最小であることを示唆しているテスト動物において 、リポソームＰＧＥ、注入後の側副血流に著しい改善はなかった。

再潅流により、対照動物に比較して、処理犬において血流が著しく増加した。心 臓の検査から、危険領域のパーセント（即ち、虚血中の低流量の面積）として表 される心筋梗塞サイズが、未処理対照犬に比較して、リポソームＰＧＥ、で処理 した犬では、約５０％小さくなったようであることがわかった。更に、リポソー ムＰＧＥ、の投与によって、血液中の血小板凝集がほとんど全部抑制された。

リポソームＰＧＥ、、遊離ＰＧＥ、、空リポソーム又は食塩水のいずれかを投与 した４群の犬についての結果を、第４図にまとめる。リポソームＰＧＥ、は、そ れぞれ、１０分にわたる２回の０，５ｕｇ／ｋｇ注入で、合計投与量１．ｏｕｇ ／ｋｇにて投与された。遊離ＰＧＥ１は、ｌｕｇ／ｋｇ／分、９　ｕ　ｇ　／　 ｋ　ｇの合計投与量で、９０分にわたって連続的に注入された。

また、心臓の虚血組織内への白血球浸潤を測定するためのテストも行った。動物 から心臓を摘出した直後に、ｌ）梗塞ゾーン、２）危険領域内の梗塞ゾーンの境 界ゾーン、３）危険（虚血）領域（Ｃ）及び４）危険領域の外側の対照ゾーンか らサンプルを得た（危険領域は、閉塞血管によって供給される心臓の部分であっ た。）。液体窒素を用いて組織をフラッシュ凍結し、分析するまで、−７０℃に 保持した。

次いで、ミエロペルオキシダーゼ（好中球にたけ見出される酵素）活性を、４つ のゾーンのそれぞれについて、各動物心臓にて分析した。

最初に、６匹の対照動物をこの方法でテストした。これらのうちの１匹（表の対 照４）は、テストを通じて異常であると考えられたが、完全を期して表に含めた 。リポソームＰＧＥ、で処理した動物の内の４匹（リボ１〜４）だけがこの試験 のこの部分に含まれた。この結果を表１に示す。ミエロペルオキシダーゼの濃度 は、比較のために、酵素の任意量位で表されている。

心筋組織から放出されたミエロペルオキシダーゼ対照１　２２，８　１７，８　 １，１　１．３対照２　１８．２　０　６　０ 対照３　２３．３　２９，０　１７．９　０．７対照４　０　０　０　０ 対照５　２３．５　２４，４　１９．６　３．９対照６　２．７　３．０　１， ２　１．７平均　１５，１　１２．４　７．６　１．３標準　１０．９　１３． ０　８，９　１．５リボ１　１，７　０　０　０．６ リポ４　２．７　０．５　０　０．２ 平均　１．９　０．２　０　０．３ 標準　０．７　０．３　０　０．３ 各群で更にほかの犬もテストした。テストした４群のそれぞれにおいて、分析に 適した犬全体の結果を、第５図にまとめる。

上記の表において、ダッシュは、その特定の値について測定を行わなかったこと を示す。

’　ＡＲＤＳ ＡＲＤＳは、外傷、火傷、敗血症、脂味、酸素過剰症を含むが、これらに限定さ れるものではない各種の傷害に付随する状態である。この状態は、毛細血管損傷 による間質性水腫を特徴としている。一旦肺に液体がたまると、呼吸が困難にな り、５〜６０％の患者が死亡する。

破滅的結末となる一連の事象は、最初の傷害の性質によって変わり得る。Ｃ３ａ 、Ｃ５ａ、ＩＬ−１，ＴＮＦなとの因子は、好中球を活性化する。ＰＧＥ、の作 用の態様は、細胞活性化の機構とは無関係である。ＰＧＥ、の存在下では、好中 球を活性化することができず、すでに活性化していれば、消されて病気を防ぐ。

熱損傷又はＩＬ−１の直接気管内注入によって肺損傷が起こっているＡＲＤＳに ついて、鋸歯類モデルで試験を行った。次の実施例でわかるように、リポソーム ＰＧＥ、の投与は、肺内への液体の漏れを防ぎ、肺内への好中球の流入を著しく 低減させる。

災施立工 ＡＲＤＳの予防についての生体内テスト実施例１の再水和リポソームＰＧＥ、を 、成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の発症に対する予防薬として、生体内でテス トした。テストラットを、それぞれ７又は８匹の３群に分け、熱損傷（７０℃の 水に４５秒間浸すことによる）と同時又はその後で、８　ｕ　ｇ　／　ｋ　ｇの リポソームＰＧＥ、か食塩水のいずれがで処理した。第１の群は、リポソームＰ ＧＥ、で処理し、第２の群は、リポソームＰＧＥ、で処理しないが、同じ外傷を 与え、第３の群は、処理もせず、外傷を起こさせることもしなかった。ラットを 犠牲にする１時間前に、肺内への液体漏れのマーカーとして、１２５１−アルブ ミンを静脈注射した。熱損傷から４時間後に、動物を犠牲にした。この試験の結 果を第６図にまとめる。

このような外傷を起こさせることの結果が、罹患動物の肺内でアルブミン濃度が 増えることによって証明されているように、ＡＲＤＳの発症であるということが 知られている。未処理の外傷を起こさせた動物は、すべて肺内で高いアルブミン 濃度を示した。更に、これらの７匹のテスト動物のうち、６匹が死亡した。リポ ソームＰＧＥ、で処理した動物のアルブミン濃度は、外傷を起こさせなかった対 照群の濃度と略同程度に低いか、あるいはそれよりも低いことがわかった。更に 、７匹のＰＧＥ、処理動物では、外傷の結果として死亡したものはなかった。こ れらの結果は、ＡＲＤＳの発症に対する予防薬として、リポソームＰＧＥ、が有 効であることを示している。

１鳳烈旦 ＩＬ−１の気管内注入によって生じたＡＲＤＳの治療に関する生体内テスト： 組替えＩＬ−１の気管内点滴注入によって、好中球の流入及びラットの肺損傷が 生じる（第７図）。リポソームＰＧＥ、処理によって、肺損傷及び好中球流入を 引き起こすＩＬ−１が減少するであろう。５０ｎｇの市販インターロイキン１　 （ＩＬ−１）又は食塩水（対照群で）をラットの気管内に点滴投与して、肺内へ の好中球流入及び気泡内への液体の漏れを起こさせた。ＩＬ−１を与えたラット へのＩＬ−１点滴注入から２．５時間後に、実施例１の再水和リポソームＰＧＥ 、、遊離ＰＧＥ、又は空リポソームのいずれかの６　ｕ　ｇ　／　ｋ　ｇを静脈 内処理で投与した。これらのラットのうち、食塩水のみを与えたちの４０匹、Ｉ Ｌ−１を与え、処理しなかったちの５４匹、ＩＬ−１を与え、リポソームＰＧＥ 、で処理したもの６匹、ＩＬ−１を与え、空リボソームで処理したちの６匹、及 びＩＬ−１を与え、遊離ＰＧＥ、で処理したちの６匹を分析した。

ＩＬ−１を投与して４時間半後に、多くの好中球がすでに組織内に浸透した後、 血流内のマーカーとして、１２５Ｉアルブミンをラットに注射した。アルブミン を注射して１時間半後に、動物を犠牲にし、肺を取り除き、組織内の同位元素の 量を測定することにより、肺内への液体の漏れを定量した。肺内の標識１２５Ｉ −アルブミンの１分光たりのカウント数（ｃｐｍ）を血流中の標ｊｌｌ１２５Ｉ −アルブミンで割って、肺漏れ指数を計算した。肺漏れを第７図のＹ軸に示す。

第７図に示すように、ＩＬ−１を点滴注入して、処理を行わないことによって、 肺漏れが、擬似処理をした（ｓｈａｍ）即ち食塩水を投与した動物よりも多く、 ２．５倍に増える。しかし、ＩＬ−１の点滴注入後、リポソームＰＧＥ、処理を 行った場合は、肺漏れ指数は、擬似の処理をした対照で見られたものと同じであ った。重要なことは、遊離ＰＧＥ、での処理も、空リポソームでの処理も、肺漏 れに影響を及ぼさなかったということである。

この一連の事象は、臨床セツティング（ｓｅｔｔｉｎｇ）において起こるかもし れないことを示している。損傷を引き起こし、適当な診断を行った後で、処理を 開始した。

ここで用いられてきた用語及び語句は、説明の用語として使用されているもので あって、限定するものではなく、このような用語及び語句の使用には、記載され た特徴の如何なる均等物又はその一部を排除する意図はなく、請求された本発明 の範囲内で、種々の変更が可能であると認識される。

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Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．哺乳動物の細胞活性化／接着症候群を治療するために製造された、リボソー ムと結合したプロスタグランジンを含む組成物。
2. ２．プロスタケランジンが、該リボソーム内にカプセル化されることによって結 合している請求の範囲１記載の組成物。
3. ３．哺乳動物がヒトである請求の範囲１記載の組成物。
4. ４．細胞活性化／接着症候群が、再潅流障害、敗血症性ショック、心筋梗塞、成 人呼吸窮迫症候群、リウマチ様血管炎、全身性血管炎、狼瘡、外傷後ショック、 火傷及び血管形成術後の再狭窄からなる群がら選ばれる請求の範囲１記載の組成 物。
5. ５．細胞活性化／接着症候群が、再潅流障害である請求の範囲４記載の組成物。
6. ６．細胞活性化／接着症候群が、成人呼吸窮迫症候群である請求の範囲４記載の 組成物。