JPH06508031A

JPH06508031A - ヘレグリンの構造、生産および用途

Info

Publication number: JPH06508031A
Application number: JP5500302A
Authority: JP
Inventors: バンドレン，リチャード・エル; ホルムズ，ウイリアム・イー
Original assignee: ジェネンテク，インコーポレイテッド
Priority date: 1991-05-24
Filing date: 1992-05-21
Publication date: 1994-09-14
Anticipated expiration: 2019-12-02
Also published as: AU2347492A; IE921654A1; IL101943A0; IL144904A0; DK0586607T3; DE69233137D1; CA2108473A1; JP3595552B2; EP1114863A2; CA2331239A1; WO1992020798A1; IL123873A0; DE69233137T2; NZ242857A; EP0586607B1; IL123872A0; EP0586607A1; CA2108473C; AU659863B2; ES2206448T3

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ヘレグリンの構造、生産および用途本発明は、細胞の増殖に関連するレセプターに結合するポリペプチドリガンドに関するものである。特に本発明は、ｐｌ　８５ＨＥＲ２レセプターに結合するポリペプチドリガントに関するものである。

背景および関連文献の説明細胞のプロトオンコンーンは、正常な細胞の増殖および分化を調節すると考えられている蛋白をコードしている。それらの構造におけるまたはそれらの発現の増幅における変化は、異常な細胞増殖を導き、発がんに関連している［ＪＭ・ビショップ、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３５巻３０５−３１１頁（１９８７）コ；［ＪＳ・リムス、キャンサー・ディテクション・アンド・プリペンション（Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）１１巻１３９−１４９頁（１９８８）］　：　［］ＰＣ−ナウウエルキャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４６巻２２０３−２２０７頁（１，９８６）］　；　［ＧＬ・ニコルリン、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４７巻１４７３−１４８７頁（１９８７）］。プロトオンコジーンは二つの試みによって最初に同定された。第一に、形質転換するレトロウィルスのゲノムの分子的性格決定により、ウィルスの形質転換能の原因となる遺伝子は、多くの場合、正常細胞のゲノム中に見いだされる遺伝子の変形であることが示された。正常型がプロトオンコンーンであり、これは突然変異によって腫瘍遺伝子を生ずる。このような遺伝子対の一例は、ＥＧＦレセプターおよびｖ−ｅｒｂ−Ｂ遺伝子産物によって示される。ウィルスによってコードされたｖ−ｅｒｂ−Ｂ遺伝子産物は、先端の切除およびこれを構造的に活性とし且つこれに細胞の形質転換誘発能力を与えるその他の変化を受ける［ヤーデン等、アニュアル・レビュー・オン・バイオケミストリー　（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｊｏｃｈｅｍ、）５７巻４４３−４７８頁、１９８８］。

優勢に働く細胞の形質転換遺伝子を検出する第二の方法は、様々な種の腫瘍細胞由来の細胞ＤＮＡをヘテロローガスな種の非形質転換標的細胞中にトランスフェクトさせることを含む。これは、ヒト、トリ、またはラットのＤＮＡをマウスＮＩＨ３Ｔ３セルラインにトランスフェクトさせることによってなされることが最も多い［ＪＭ−ビショップ、サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）２３５巻３０５− ３１１頁（１９８７）］　：　［ＪＳ・リムス、キャンサー・ディテクション・アンド・プリベンンヨン（Ｃａｎｃｅｒ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）１１巻１３９−１４９頁（１９８８）］　；　［］ＰＣ−ナウウェルキャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４６巻２２０３−２２０７頁（１９８６）］＋　［ＧＬ−ニコルソン、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４７巻１４７３−１４８７頁（１９８７）］　：　［ヤーデン等、アニュアル・レビュー・オン・バイオケミストリー（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）５７巻４４３−４７８頁（１９８８）］。数サイクルのゲノムＤＮＡの分離および再トランスフエクンヨンの後、このヒトまたは他の種のＤＮＡは、マウスのバックグラウンドから分子クローニングされ、続いて性格決定された。幾つかの場合、形質転換ウィルスの直接的性格決定によって同定されたものと同じ遺伝子が、トランスフェクションおよびクローニング後に分離された。

別の場合には新規な腫瘍遺伝子が同定された。このトランスフェクション検定によって同定された新規な腫瘍遺伝子の一例は、ｎｅｕ腫瘍遺伝子である。これはウニインバーブとその仲間によって、出発ＤＮＡが、発癌物質により誘発されたラットの神経芽腫から誘導されている、トランスフェクション実験中に発見された［バブイー等、セル（Ｃｅｌｌ）２８巻８６５−８７１頁（１９８２）］　：　［］シェヒター、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１２巻５］、３−５１６頁（１９８４）］、このラットｎｅｕ腫瘍遺伝子の性格決定により、これが成長因子レセプターチロシンキナーゼの構造を有すること、ＥＧＦレセプターとの相同性を有すること、そして、これはその貫膜ドメインにおける突然変異を活性化するという点で正常遺伝子ｎｅｕプロトオンコジーンと異なっていることが明らかとなった［バーブマン等、セル（Ｃｅｌｆ）４５巻６４９−６５７頁（１９８６）］。ｎｅｕｉ：１．対すルヒトノ相当物がＨＥＲ２プロトオンコンーンであり、ｃ−ｅｒｂ−８２とも呼称される［クッセンズ等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３０巻１１３７−１１３９頁（１９８５）］　、ＷＯ３９１０６６９２コ　。

ＨＥＲ２プロトオンコジーンと癌とのつながりは、さらに第三の試み、即ちヒト乳癌とのつながりによって確立された。ＨＥＲ２プロトオンコジーンは、ＥＧＦレセプターとの相同性によってｃＤＮＡライブラリー中で最初に発見され、これは全体的に構造上の類似性をＥＧＦレセプターと共有している［ヤーデン等、アニュアル・レビュー・オン・バイオケミストリー（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）５７巻４４３−４７８頁（１９８８）］ｏ　ｐ１８５””をコードしているｃＤＮＡ配列から誘導される放射性プローブを、乳癌患者由来のＤＮＡ試料のスクリーニングに使用した場合、この患者の試料の約３０％にＨＥＲ２プロトオンコジーンの増幅が観察された［スラモン等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２３５巻１７７−１８２頁（１９８７）］。さらなる研究により、この最初の観察が確認され、そしてこれが、ＨＥＲ２プロトオンコジーンの増幅および／または過剰発現と、卵巣腫瘍および非小細胞肺癌における予後不良との間の重要な相関を示唆するまでに拡大された［スラモン等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４４巻７０７−７１２頁（１９８９）］　；　［ライト等、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）４９巻２０８７−２０９０頁（１９８９）］　；パイク等、ジャーナル・オン・クリニカル・オンコロジー（Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ）８巻１０３−１１２頁（１９９０）］　：バーチャック等、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）５０巻４０８７’−４０９１頁（１９９０）］　；ケム等、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）５０巻５１８４−５１９１頁（１９９０）　コ。

上記のように、ＨＥＲ２の増幅／過剰発現と攻勢な悪性腫瘍との関連は、それがヒトの癌の進行において重要な役割を有しているかも知れないことを意味している。しかしながら、多くの腫瘍関連細胞表面抗原が過去に述べられているが、疾病の発生または進行において直接的役割を有すると思われるものは殆ど無い［シュローム等、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）５０巻８２〇− ８２７頁（１９９０）］　；　［スザーラ等、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　］、Ａｃａｄ、Ｓｃ１　）９８巻３５４２−３５４６頁］。

このプロトオンコジーンのなかに、細胞質蛋白の内質のキナーゼ燐酸化を介して働く細胞成長因子をコードしているものがある。ＨＥＲＩ遺伝子（またはｅｒｂ −Ｂｌ）は表皮成長因子（ＥＧＦ）レセプターをコードしている。血小板由来成長因子のβ鎖はｃ−ｓｉｓ遺伝子によってコードされている。顆粒球マクロファージコロニー刺激因子はｃ−ｆｍｓ遺伝子によりコードされている。ｎｅｕプロトオンコ／−ンはエチルニトロソウレアにより誘導されるラットの神経芽腫中に同定された。ＨＥＲ２遺伝子は、ヒト表皮成長因子レセプターに対する相同性を有する、１２５５個のアミノ酸の、チロシンキナーゼレセプタ一様糖蛋白ｐ１８５１１ＥＲ２をコードしている。

既知のレセブターチロシンキナーゼは全て同じ一般的構造モチーフロリガンドを結合する細胞外ドメイン、およびシグナルの形質導入および形質転換に必要な細胞内チロシンキナーゼドメイン、とを持っている。これら二つのドメインは、貫膜連結配列と呼ばれる、殆どは疎水性のアミノ酸からなるおよそ２０個のアミノ酸のひと続きによって連結している。この貫膜連結配列は、リガンドの結合によって生成する／グナルを細胞の外部から内部へ移動させる役割を果たしていると考えられている。この一般的構造と一致して、細胞表面に位置するヒトｐ１８５　ＨＥＲ２糖蛋白は、三つの主要な部分：細胞外ドメイン、またはＥＣＤ　（ＸＣＤとしても知られる）１貫膜連結配列、および細胞質の細胞内チロシンキナーゼドメインに分けられる。この細胞外ドメインはりガントレセプターであると推定されるが、ｐｌ　ｓ　５　ＨＥＲ２リガンドはまだ明確に同定されていない。

ルプ等［サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）２４９巻１．５５２−１５５５頁（１９８９）コが、ｐ１８５１″ＥＲ２に対する推定的リガンドであると言われている、ヒト乳癌細胞から分泌される３０ｋＤａの阻害性糖蛋白を記載してはいるが、ｐ１８５１１ｒＲ２に結合する特異的リガンドは同定されていない。ルブ等［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４９巻１５５２−１５５５頁（１９９０）；プロシーディングズ・オン・ジ・アメリカン・アソシエーション・フォア・キャンサー・リサーチ（Ｐｒｏｃｅｅｄｊｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ａｓ５ｏｃ、ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）３２巻、抄録２９７頁、１９９１年３月］り、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から３０ｋＤの因子を、そして５Ｋ−ＢＲ−３細胞からｐｌ　８５８ＥＲ２を刺激する７５ｋＤの因子を精製したと報告した。報告によると、この７５ｋＤの因子はｐ１８５ＨＦｌ＋２の燐酸化を誘導し、ｐＩ　Ｂ　５　ＨＥＲ２レセプターを過剰発現する５Ｋ−ＢＲ− ３細胞のコロニー形成および細胞増殖を調節する。３０ｋＤの因子はｐ　１８５ＨＦＲ２との結合に関してｍｕＭａｂ　４Ｄ５と競合し、５Ｋ−ＢＲ−３細胞に及ぼすその成長効果は３０ｋＤの濃度に依存する（低濃度では刺激的であり高濃度では阻害的）。さらに、これはＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞の増殖を刺激しくＥＧＦ−Ｒ陽性、ｐ１８５ＨＥＲ２陰性）、これはＥＧＦレセプターの燐酸化を刺激し、そしてこれは５Ｋ−ＢＲ−３細胞から得ることができる。ラットのｎｅｕ系において、ヤーデン等［バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）３０巻３５４３−３５５０頁、１９９１］は、ｎｅｕに対する候補リガンドである３５ｋＤａの糖蛋白が、ラス形質転換繊維芽細胞により分泌されるレセプターをコードしていることを記載している。ドバシ等、ブロンーディングズ・オン・す・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）８８巻８５８２−８５８６頁（１９９１）；バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、）１７９巻１５３６−１５４２頁（１９９１）は、ヒトＴ細胞セルラインＡＴＬ−２により分泌され、８−２４ｋＤの範囲の分子量を有するｎｅｕ蛋白特異的活性化因子（ＮＡＦ）を記載した。活性化されたマクロファージ由来の２５ｋＤのリガンドもまた記載された［タラコツスキー等、ジャーナル・オン・キャンサー・リサーチ（Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、）２１８８−２１９６頁（１９９１）〕。

ＨＥＲ２特異的モノクローナル抗体を用いる腫瘍のインビボ検定の方法およびＨＥＲ２特異的モノクローナル抗体を用いる腫瘍細胞の処置方法が、ＷＯ３９１０６６９２号に記載されている。

ｐＩ　Ｂ　５　ＨＥＲ２を活性化する実際のリガンドを同定することに対する、そして細胞増殖および分化、細胞の形質転換ならびに悪性新生物の創生におけるそれらの役割を包含するそれらの生物学的役割を同定することに対する、当分野における現存するそして持続する必要性が存在する。

したがって、ｐｌ　８５　ＴＩＥＲ２を結合しこれを刺激する１またはそれ以上の新規なｐ１８５＋″■２リガンドポリペプチドを同定し精製することが本発明の一つの目的である。

さらなる目的は、新規なｐ１８５１！ＥＲ２結合リガンドポリペプチドをコードしている核酸を提供すること、そしてこの核酸を使用して、治療的または診断的用途のために、そして、腫瘍および腫瘍発生性細胞の死滅、阻害および／または診断的イメージングを包含する（しかし、必ずしもこれらに限定されるわけではない）ある種の代謝異常に使用するための治療的アンタゴニストを製造するために、ｐＩ　Ｂ５１ＩＥＲ２結合リガンドポリペプチドを組替え細胞培養中で産生ずることである。

さらなる目的は、アミノ酸配列変異体、ｐ１８５１ＩＦＲ２結合リガンドとヘテロローカスな蛋白とが結合した融合ポリペプチド、およびｐｌｓ　５　ＨＥ　Ｒ２結合リガンドの共有結合誘導体を包含する、新規な糖蛋白リガンドの修飾型および誘導体を提供することである。

さらに別の目的は、ｐｌ　ｓ　５　ＨＥＲ２結合リ結合リカン型る抗体を作製させるための免疫原を製造すること、ならびに、係るリガンドに結合することのできる抗体、および、ｐｌｓ　５１１ＥＲ２結合リガントに結合し該リガンドがｐ１８５ＨＥＲ２を活性化するのを妨げる抗体を取得することである。さらなる目的は、免疫原性のヘテロローガスなポリペプチドと融合したｐ１８５１″Ｆ′Ｒ２結合リガンドを含む免疫原を製造することである。

これらのおよび他の本発明の目的は、本明細書を全体として考慮する場合、当業者には明らかとなろう。

発明の要約本発明の目的に従い、本発明者等は、ｐＩ　Ｂ　５　Ｈ１４２に結合する新規なりガントファミリーを同定し分離した。これらのりガントはへレグリン（ＨＲＧ）ポリペプチドと命名され、ＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２、ＨＲＧ −β３、および、これらのファミリーの成員に対する抗体と交叉反応し、モして／または下に定義されるように実質上ホモローガスである、他のＨＲＧポリペプチドを包含する。好ましいＨＲＧは、ＨＲＧ−αと呼称される図４に開示されるリガンドおよびそのフラグメントである。その他の好ましいＨＲＧは、図８に開示されＨＲＧ−β１と呼ばれるリガンドおよびそのフラグメント、図１２に開示されるＨＲＧ−β２、および図１３に開示されるＨＲＧ−β３である。

別の態様において、本発明は、その供給される環境から分離されるＨＲＧを含む組成物、特にヒトポリペプチドに汚染されていないＨＲＧを提供する。ＨＲＧは、ヘパリンセファロースへの吸収、陽イオン（例えばポリアスパラギン酸）交換樹脂、および逆相ＨＰＬＣによって精製される。

ＨＲＧまたはＨＲＧフラグメント（これはインビトロ法によっても合成され得る）を免疫原性ポリペプチドと融合（組み替え発現またはインビトロペプチド結合によって）し、次いでこの融合ポリペプチドを、ＨＲＧエピトープに対する抗体の作製に使用する。抗ＨＲＧ抗体は、免疫された動物の血清から回収する。別法として、インビトロの細胞から、またはインビボの免疫した動物から、常法によってモノクローナル抗体が製造される。常套的スクリーニングにより同定された好ましい抗体は、ＨＲＧに結合するが、ＥＧＦのような他の既知のリガンドのいずれとも実質上交叉反応せず、ＨＲＧがｐ１８５１１ｔＲ２を活性化するのを防止するであろう。さらに、ＨＲＧファミリーの個々のファミリー成員、例えばＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２、ＨＲＧ−β３と特異的に結合することができ、それにより、それらの特異的アンタゴニストとして働（ことのできる、抗ＨＲＧ抗体が選択される。

ＨＲＧはまたインヒドロで誘導体化されて、特にＨＲＧまたはその抗体の診断目的のため、またはＨＲＧ抗体の親和精製のために、固定化ＨＲＧおよび標識されたＨＲＧが製造される。固定化抗ＨＲＧ抗体は、ＨＲＧの診断（インビトロまたはインビボ）または精製に有用である。成る好ましい態様において、ＨＲＧおよび他のペプチドの混合物をカラムに通し、これに抗ＨＲＧ抗体を結合させる。

ＨＲＧの置換、欠失または挿入変異体をインビトロまたは組み替え法によって製造し、例えば天然型ＨＲＧとの免疫交叉反応性について、そしてＨＲＧアンタゴニストまたはアゴニスト活性について、スクリーニングする。

別の好ましい態様において、正常細胞中のｐ１８５１″ＥＲ２の活性を刺激するためにＨＲＧを使用する。また別の好ましい態様においては、ＨＲＧの変異体をｐｌ８５ＨＦＲ２の刺激を阻害するアンタゴニストとして使用する。

ＨＲＧ、その誘導体、またはその抗体は、特に治療用途のために、生理学的に許容し得る媒質中に配合される。係る媒質は、ＨＲＧまたはＨＲＧ変異体の持続放出製剤を包含する。ＨＲＧおよび薬学上許容し得る担体からなる組成物、ならびにヘテロローカスなポリペプチドに融合したＨＲＧを含む単離されたポリペプチドもまた提供される。

さらに別の態様において、本発明は、ＨＲＧをコードしている単離された核酸（ここてこの核酸は検出可能な基によって標識されてもされていなくてもよい）、および、ＨＲＧをコードしている核酸配列に対し相補的、またはこれと緊縮条件下でハイブリダイズする核酸配列を提供する。

この核酸配列は、さらに、ＨＲＧをコードしている（またはそれに相補的な）ＤＮＡ　（またはＲＮＡ）を被験試料の核酸にハイブリダイズさせ、ＨＲＧの存在を決定することからなる、ＨＲＧの存在を決定する方法において、モしてＨＲＧ核酸のためのハイブリダイゼーション検定において、有用である。さらに本発明は、核酸ポリメラーゼ（連鎖）反応をＨＲＧをコードしている（またはそれに相補的な）核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）で開始することからなる、核酸被験試料の増幅方法を提供する。

さらに別の態様において、この核酸はＤＮＡであり、さらに、ベクターにより形質転換される宿主によって認識される調節配列と操作可能に連結したＨＲＧをコードしている核酸を含む複製可能なベクター、該ベクターにより形質転換された宿主細胞：ならびに、形質転換された宿主細胞の培養中でＨＲＧ核酸を発現させ、その宿主細胞培養からＨＲＧを回収することからなる、ＨＲＧをコードしている核酸を用いてＨＲＧの産生をさせる方法を含む。

さらなる態様において、本発明は、ＨＲＧを産生させる方法であって、転写調節要素を、ＨＲＧ核酸に対してその転写に影響を及ぼす（抑制または刺激）に充分な近さおよび方向で、ＨＲＧをコードしている核酸を含む細胞のＤＮＡ中に挿入し、所望により、さらに、この転写調節要素およびＨＲＧ核酸を含む細胞を培養する工程を含む、ＨＲＧの産生方法を提供する。

さらに別の態様において、本発明は、ＨＲＧをコードしている核酸と、ＨＲＧ核酸に対して、その転写に影響を及ぼすに充分な近さおよび方向にある外因性転写調節要素とをコードしている核酸を含む細胞；ならびに、宿主細胞により認識される外因性調節配列と操作可能に連結したＨＲＧをコードしている核酸を含む宿主細胞を提供する。

図面の簡単な説明図１　ポリアスパラギン酸カラム上でのヘレグリンの精製。

ヘレグリンーαのポリアスパラギン酸カラムクロモグラフィーを実施し、蛋白の溶出プロフィルをＡ２．４において測定した。ヘパリンセファロース精製工程からの０．６Ｍ　ＮａＣｌプールを水で０．２Ｍ　ＮａＣｌに希釈し、３０％エタノールを含む１７ｍＭ燐酸Ｎａ、ｐＨ６，８に平衡化したポリアスパラギン酸カラムにロードした。０３から０．６Ｍに至るＮａＣｌの直線勾配を時刻０で開始し、時刻３０分で終了した。両分をＨＲＧチロシン自己燐酸化検定で試験した。

ビークＣに対応する画分を、Ｃ４逆相ＨＰＬＣでさらに精製するためにプールした。

図２　へレグリン−２のＣ４逆相精製。

Ａ図　・　ポリアスパラギン酸カラムからのプールＣを、０．１％ＴＦＡで平衡化したＣＪＨＰＬＣカラム（シンクロバックＲＰ−４）に適用し、蛋白を０゜２５％／分のアセトニトリル直線勾配で溶出した。Ｃ４−１７と番号を付した実施の吸収の軌跡を示す。１ｍｌの両分を検定のために集めた。

８図　：　画分の１０μｍ等分試料をＨＲＧチロシン自己燐酸化検定で試験した。ｐ１８５Ｈ′Ｒ２蛋白中のホスホチロシンのレベルを特異的抗ホスホチロシン抗体によって定量し、横座標上に自由裁量による単位で示した。

０図　＋　１０μ＋の画分を取り、レムリ［ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ）２２７巻６８１６８５頁、１９７０］の方法に従って、４−２０％アクリルアミド勾配のケル上でＳＤＳゲル電気泳動に付した。標準蛋白の分子量を、標準を含む列の左に示す。画分１７に見いだされるチロシン燐酸化活性の最大ピークは、顕著な４５０００Ｄａのバンドを伴った（ＨＲＧ−α）。

図３　へレグリン−αの精製を示すＳＤＳポリアクリルアミドゲル。

分子量マーカーを第１列に示す。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１条件培地からの等分試料（第２列）、ヘパリンセファロースカラムからのＱ、６Ｍ　ＮａＣ］プール（第３列）、ポリアスパラギン酸カラムからのプールＣ（第４列）およびＨＰＬＣカラムからの画分１７　（Ｃ４−１７）（第５列）を４−２０％勾配のゲル上で電気泳動し、銀染色した。第６列および第７列は緩衝液のみを含み、５０−６５ＫＤａ分子量修域にゲルアーティファクトの存在を示す。

図４　ａ　−４ｄは、λｇｔ、ｏｈｅｒ１６に含まれるｃＤＮＡの推定アミノ酸配列を示す（配列番号１２および配列番号１３）。ヌクレオチドは各行の上部左に番号を付し、三文字コードで書かれたアミノ酸は各行の下部左に番号を付した。プローブに対応するヌクレオチド配列はヌクレオチド６８１−７２０である。

予想される貫膜ドメインはアミノ酸２８７−３０９である。ＥＧＦモチーフの６個のシスティンは２２６．２３４．２４０．２５４．２５６および２６５である。３個のアミノ酸からなるＮ一連結グリコシル化サイトであると思われる５つの箇所は、１６４−１６６．１７０−１７２．２０８−２１０．４３７−４３９および６０９−６１１である。可能性あるセリン−スレオニンＯ−グリコジル化サイトは２０９−２２１である。セリン−グリシンジペプチドの可能性あるグリコサミノグリカン付加サイトはアミノ酸４２−４３．６４−６５および１５１−１５２である。開始メチオニン（ＭＥＴ）は図４の４４５位にあるが、処理を受けるＮ末端残基はＳ４６である。

図５　ＭＤＡ−ＭＢ−２３１および５ＫＢＲ３ＲＮＡのノーザンプロット分析。

左から右に名称を付したのは以下の通りである＋　１）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ポリＡマイナス−ＲＮＡ　（ポリＡ含有ＲＮＡを除去した後に残るＲＮＡ）；　２）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ポリＡプラス−ｍＲＮＡ　（ポリＡを含むＲＮＡ）；　３）ＳＫＢＲ３ポリＡマイナス−ＲＮＡ：および、４）ＳＫＢＲ３ポリＡプラス −ｍＲＮＡ０この分析に使用したプローブは、λｇｔｌＯｈｅｒ１６のｃＤＮＡ部分からの放射標識された（３２Ｐ）内部ｘｈｏｌＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼフラグメントてあった。

図６　蛋白のＥＧＦファミリーにおける配列比較。

ンステインドメインのまわりの幾つかのＥＧＦ様蛋白の配列（配列番号１４．１５．１６．１７．１８、および１９）をＨＲＧ−αの配列と共に並べる。図６におけるシスティンの位置ならびに２３８位および２６４位の非変異グリシンおよびアルギニンは、ＨＲＧ−αがＥＧＦファミリーの一員であることを明確に示している。図６中、ＨＲＧ−αに対してこのファミリー成員のアミノ酸一致が最も高い（３０−４０％）領域は、Ｃｙｓ２３４およびＣｙｓ２６５の間に見いだされる。最大の一致（４０％）は、ヘパリン結合ＥＧＦ　（ＨＢ−ＥＧＦ）種にある。ＨＲＧ−αはＣｙｓ２４０およびＣｙｓ２５４の間に特異な３個のアミノ酸挿入を有する。可能性ある貫膜ドメインは四角で囲んである（２８７−３０９）。

縦線はＥＧＦおよびＴＧＦ−αについてのカルボキシ末端サイトを示し、ここで蛋白分解的開裂により、成熟した成長因子がその貫膜付随プロ型から分離される。

ＨＢ−ＥＧＦはヘパリン結合表皮成長因子であり：　ＥＧＦは表皮成長因子であり：ＴＧＦ−αはトランスフォーミング成長因子αてあり；そして神経鞘腫は神経鞘腫由来の成長因子である。図６中の残基番号は図４の規定を反映している。

図７　ＨＲＧ−αによる細胞増殖の刺激。

三つの異なったセルラインを］、ｎＭのＨＲＧ−αに対する増殖応答について試験した。細胞蛋白はクリスタルバイオレット染色により定量し、応答は、対照、非処置細胞に対して正規化した。

図８ａ−８ｄ（配列番号７）は、ヘレグリンーβ１の予想されるコード化ＤＮＡヌクレオチド配列の全体、および、λｈｅｒ１１．Ｉｄｂｌ中に含まれるｃＤＮＡの推定アミノ酸配列（配列番号９）を示している。ヌクレオチドは各行の上部左に番号を付し、三文字コードで書かれたアミノ酸は各行の下部左に番号を付した。予想される貫膜アミノ酸ドメインはアミノ酸２７８−３００である。ＥＧＦモチーフの６個のシスティンは２１２．２２０．２２６．２４０．２４２および２５１である。３個のアミノ酸からなるＮ一連結グリコシル化サイトであると思われる５つの箇所は、１．５０−１５２．１５６−１５８．１９６−１９８．４２８−４３０および６００−６１２である。可能性あるセリン−スレオニンＯ− グリコ／ル化サイトは１９５−２０７である。セリン−グリシンジペプチドの可能性あるグリコサミノグリカン付加サイトはアミノ酸２８−２９．５０−５１および１３７−１３８である。開始メチオニン（ＭＥＴ）は＃３１位にある。ＨＲＧ−β１はＮ末端残基Ｓ３２に対して処理を受ける。

図９は、ヘレグリンーαおよび−β１のアミノ酸配列の比較を示す。横線（−）は、その位置にアミノ酸が無いことを示す。（配列番号８および配列番号９）。

この図は図４および６の番号付けの規定を使用している。

図１０は、ＨＥＲ２チロシン燐酸化により測定される、組み替えＨＲＧ−αを用いたＨＥＲ２自己燐酸化の刺激を示している。

図１１は、λ１５’ｈｅｒ１３のヌクレオチドおよび入力されたアミノ酸配列（配列番号２２）を示す。アミノ酸残基の番号付けの規定はこの図面に独特のものである。

図１２ａ−１２ｅは、ヘレグリンーβ２（配列番号２３）をコードしているλｈｅｒ７６のヌクレオチド配列を示している。この図はアミノ酸残基の番号付けが、発現されるＮ末端ＭＥＴで始まっている。Ｎ末端はβ２である。

図１３ａ−１３ｃは、ヘレグリンーβ３（配列番号２４）をコードしているλｈｅｒ７８のヌクレオチド配列を示している。この図は、図１２のアミノ酸番号付けの規定を用いている。β２は処理を受けるＮ末端である。

図１４ａ−１４ｄは、ヘレグリンーβ２様ポリペプチド（配列番号２５）をコードしているλｈｅｒ８４のヌクレオチド配列を示している。この図は、図１２のアミノ酸番号付けの規定を用いている。β２は処理を受けるＮ末端である。

図１５ａ−１５ｃは、既知のへレグリン類（上から順にα、β１、β２、β２様およびβ３）間のアミノ酸相同性を示し、異なった型を識別するアミノ酸の挿入、欠失または置換を例示している（配列番号２６−３０）。この図は図１２−１４のアミノ酸番号付けの規定を用いている。

好ましい態様の詳細な説明 ■　定義一般に、以下の語または句は、本明細書中の記載、実施例および請求の範囲に使用される時、示される定義を有する。

ヘレグリン（ｒＨＲＧＪ）は、本明細書中、図４．８．１２．１３、または１５に開示されるポリペプチド、およびフラグメント、対立遺伝子またはその動物の類似体の生物活性を有する任意の単離されたポリペプチド配列、またはそれらの動物の類似体であると定義される。ＨＲＧは、３５Ｕ、Ｓ、Ｃ，１０２の下で予想される既知の任意のポリペプチドを包含する、これまでに同定されている任意のポリペプチド、および、特にＥＦＧ、ＴＦＧ−α、アムフィレグリン［ブララマン等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ　１．　Ｃｅ　１１゜Ｂｉｏｌ、）１０巻１９６９頁（１９９０）Ｌ　ＨＢ−ＥＧＦ　［ヒガシマヤ等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５１巻９３６頁（１９９１）：ｌ、神経鞘腫因子またはそれらにより自明のポリペプチドを包含する、３５Ｕ、Ｓ、Ｃ，１０３の下で係る既知のポリペプチドにより自明のポリペプチド、を除外するものである。

本明細書中の目的のための「生物活性」とは、ＨＲＧポリペプチド（天然であるか変性した配座であるかに拘らず）により、またはその結果により、直接または間接的に遂行されるインビボエフェクターまたは抗原機能を意味する。エフェクター機能は、現在知られているか固有のものであるかに拘らず、レセプターの結合または活性化、分化の誘導、分裂促進もしくは増殖促進活性、免疫モジュレーノヨン、ＤＮＡ調節機能等を包含する。抗原機能は、天然に存在する、または変性したＨＲＧポリペプチドまたはそのフラグメントに対して産生された抗体と交叉反応することのできる抗原サイトまたはエピトープの所有を包含する。

生物活性なＨＲＧは、エフェクターおよび抗原機能の両者、または係る機能のうち一つだけを有するポリペプチドを包含する。そのアンタゴニストが天然ＨＲＧのエピトープを含むならば、ＨＲＧはＨＲＧに対するアンタゴニストポリペプチドを包含する。ＨＲＧの主たる既知のエフェクター機能は、ｐｌ　ｇ　５ＭＥＲ２に結合し、レセプターチロノンキナーゼを活性化する能力である。

ＨＲＧは、それらが生物活性を有するならば、本明細書中の図面に開示されるヒトＨＲＧの全長（プロＨＲＧ）の翻訳されたアミノ酸配列：脱グリコジル化または非グリコリル化誘導体二アミノ酸配列変異体：およびＨＲＧの共有結合誘導体を包含する。ＨＲＧの天然のプロ型は恐らくは膜に結合したポリペプチドであると思われるが、機能的貫膜ドメインを欠（型（プロＨＲＧまたはそのフラグメント）のような可溶性の型もまたこの定義内に包含される。

無傷のＨＲＧのフラグメントはＨＲＧの定義内に包含される。二つの主要なドメインがこのフラグメントの中に含まれる。これらは、ＥＧＦファミリーにホモローガスな成長因子ドメイン（ｒＧＦＤＪ）であって、大体残基５２１６−Ａ２２７ないしＮ２６８−Ｒ２８６に位置する（図９、ＨＲＧ−α；他のＨＲＧについてのＧＦＤドメイン（図１５）はホモローガスな配列である）。好ましくは、ＨＲＧ−α、β１、Ｒ２、β２様およびβ３についてのＧＦＤは、それぞれＧ１７５−に２４１、Ｇ１７５−に２４６、Ｇ１７５−に２３８、Ｇ１７５−に２３８およびＧ１７５−Ｅ２４１　（図１５）である。

興味のもたれるもう一つのフラグメントはＮ末端ドメイン（ｒＮＴＤＪ　）である。ＮＴＤは、処理を受けるＨＲＧ　（Ｓ２）のＮ末端から、ＧＦＤのＮ末端残基に隣接する残基、即ち、はぼＴ１７２−Ｃ１８２（図１５）および好ましくはＴ１７４まで伸長している。さらなるフラグメントの群は、ＨＲＧ−αおよびβ 。

−Ｒ２の細胞外ドメインと等価なＮＴＤ−ＧＦＤドメインである。もう一つのフラグメントは、約２０残基の、Ｎ末端ないし貫膜ドメインの第一残基に、単独で、またはＨＲＧのＣ末端残部と組み合わさって位置する、Ｃ末端ペプチド（ｒＣＴＰＪ）である。

好ましい態様において、抗原性の点で活性なＨＲＧは、天然に存在するＨＲＧ配列に対して産生された抗体に対して少なくとも約１０’ｌ／ｍｏ］ｅの親和性で結合するポリペプチドである。普通、このポリペプチドは少なくとも約１０’］／ｍｏｌｅの親和性で結合する。最も好ましくは、抗原性の点で活性なＨＲＧは、その天然の配座にあるＨＲＧのひとつに対して産生された抗体に結合するポリペプチドである。天然の配座にあるＨＲＧは、一般に、例えば非還元、非変性サインングゲル上での移動によって決定される、ＨＲＧの三次元構造を実質的に修飾する、カオトロピック剤、熱または他の処理によって変性されていない、天然に見いだされるようなＨＲＧである。この測定に使用される抗体は、フロイント完全アジュバント中に、ウサギ以外の種から得た天然ＨＲＧを調合し、この調合物をウサギに皮下注射し、そしてこの調合物を、抗ＨＲＧ抗体の力価がプラトーに達するまで腹腔内注射することにより免疫応答をブースティングすることによって産生される、ウサギポリクローナル抗体である。

通常、生物学的に活性なＨＲＧは、ＨＲＧ配列と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列の一致を有する。本明細書中、ＨＲＧ配列についての一致または相同性は、同一の残基とするための同類置換を考慮することなく、必要ならば、最大の相同性パーセントを達成するための間隙を導入して配列を並べた後の、候補配列中の、図１５におけるＨＲＧ残基と同一のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。ＨＲＧ配列へのいかなるＮ末端、Ｃ末端もしくは内部伸長、除去、または挿入も、相同性に影響を及ぼすとはみなされない。

したがって、本発明の主体である生物学的に活性なＨＲＧポリペプチドは、発現さねまたはプロセシングされたＨＲＧ配列の各々；少なくとも５．１０．１５．２０．２５．３０または４０個のアミノ酸残基の連続配列を有するそれらのフラグメント：１個のアミノ酸残基がＨＲＧ配列または上記定義によるそのフラグメントの、またはその内部のＮもしくはＣ末端に挿入されている、ＨＲＧのアミノ酸配列変異体：１個の残基が別の残基に置換されている、ＨＲＧ配列または上記定義によるそのフラグメントのアミノ酸配列変異体、を包含する。ＨＲＧポリペプチドは、例えば位置指定突然変異誘発またはＰＣＲ突然変異誘発による、予め定められた突然変異を含むものを包含する。ＨＲＧは、ウサギ、ラット、ブタ、ヒト以外の霊長類、ウマ、マウス、およびヒツジのような種由来のＨＲＧならびに対立遺伝子または他の天然に存在する前記のものの変異体、ＨＲＧまたはそのフラグメントが、置換、化学的、酵素的、またはその他の適当な手段により、天然に存在するアミノ酸以外の基（例えば酵素または放射性同位体のような検出し得る基）で共有結合により修飾されている、ＨＲＧの誘導体または上記定義によるそのフラグメント：ＨＲＧのグリコジル化変異体（適当な残基の除去、挿入または置換によるグリコリル化部位の挿入またはグリコリル化部位の除去）、および、ＨＲＧの可溶性型、例えばＨＲＧ−ＧＦＤまたは機能的貫膜ドメインを欠くもの、を包含する。

特に興味が持たれるのは、ＨＲＧ−ＮＴＤを含むが、問題のＨＲＧ−ＮＴＤに通常付随するＧＦＤを含まない融合蛋白である。ＮＴＤの最初の２３個のアミノ酸は荷電した残基により支配されており、核が標的とするための一致配列モチーフに酷似した配列（ＧＫＫＫＥＲ；残基１３−１８、図１５）を含んでいる［ロバーツ、ビオキミカ・エトラ・ビオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉ。

ｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、）１００８巻２６３頁（１９８９）］。したがって、ＨＲＧは、ＮＴＤ、または少なくともその最初の約２３残基を含むポリペプチドが、末端において非ＨＲＧポリペプチドまたは他のＨＲＧファミリー成員のＧＦＤと融合している融合を含む。この態様における非ＨＲＧポリペプチドは、調節蛋白、ＥＧＦもしくはＴＧＦ−αのような成長因子、または細胞レセプター、特にその調節が望まれる細胞、例えば癌細胞の表面に見いだされる細胞表面レセプターに結合するポリペプチドリガンドである。

別の態様において、残基１３−１８の１またはそれ以上が個別に異なって、核が標的にすることのできない配列を生成する。例えば、Ｇ１３が、ＰＳＬ、Ｉ。

〜７ＸＡ、Ｍ、Ｆ、に、ＤまたはＳを包含する他の天然に存在する残基のいずれかに突然変異し；に１４−に１６のいずれか１個またはそれ以上が、Ｒ，Ｈ，Ｄ。

Ｅ、ＮまたはＱを包含する他の天然に存在する残基のいずれかに突然変異し：Ｅ１７が、Ｄ、Ｒ，Ｋ、）（、ＮまたはＱを包含する他の天然に存在する残基のいずれかに：そしてＲ１８が、Ｋ、Ｈ，ＤＳＥ、ＮまたはＱを包含する天然に存在する残基のいずれかに突然変異する。残基１３−１８の全てまたはいずれか１個が同様に除去され、または外来の残基がこれらの残基と隣接して挿入される：例えば、残基１３−１．８に隣接して挿入される残基は、残基それ自身としては上に示唆された置換と同一である。

別の態様においては、酵素または転写調節因子のような核調節蛋白を、ＨＲＧ− ＮＴＤ、ＨＲＧ−ＮＴＤ−ＧＦＤ、またはＨＲＧ−ＧＦＤと融合する。この酵素または因子はＮもしくはＣ末端に融合し、またはＮＴＤおよびＧＦＤドメインの間に挿入され、または最初の約２３残基とＧＦＤとの間のＮＴＤの領域と置換される。

「単離されたＪ　ＨＲＧとは、同定され、その天然環境の構成成分を含まないＨＲＧを意味する。その天然環境の汚染成分は、ＨＲＧの診断的または治療的使用を妨害する物質を包含し、蛋白、ホルモン、およびその他の物質を包含する。好ましい態様において、ＨＲＧは、（１）ローリ−法または他の有効な蛋白測定法により測定される、９５％（重量）以上の蛋白、最も好ましくは９９％（重量）以上の蛋白にまで、（２）本出願の出願日において市場にある最も優れた市販のアミノ酸配列決定機の使用により、少な（とも１５残基のＮ末端または内部アミノ酸配列が得られるに充分な程度まで、または、（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いる５ＤＳ−ＰＡＧＥによる等質性が得られるまで、精製する。単離されたＨＲＧは、少なくとも一つのＨＲＧ天然環境構成成分も存在しないのであるから、ヘテロローガスな組み替え細胞内のインサイトウのＨＲＧを包含する。単離されたＨＲＧは、成る生物種の組み替え細胞培養中の、別な生物種由来のＨＲＧを包含する。何故ならこのような状況のＨＲＧには原ポリペプチドが無いからである。しかしながら、通常は、単離されたＨＲＧは少な（とも一つの精製工程によって調製されるであろう。

本発明によれば、ＨＲＧ核酸は、生物学的または抗原的に活性なＨＲＧをコードしており、または係るＨＲＧをコードしている核酸配列に対し相補的であり、または係るＨＲＧをコードしている核酸配列とハイブリダイズして緊縮条件下でこれと安定に結合し続ける、１０以上の塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡである。

好ましくは、ＨＲＧ核酸は、ＨＲＧ配列と、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは９０％１．そして最も好ましくは９５％の配列の一致を示すポリペプチドをコードしている。好ましくは、ハイブリダイズするＨＲＧ核酸は、少なくとも２０、より好ましくは少なくとも約４０、そして最も好ましくは少なくとも約９０個の塩基を含む。しかしながら、このようなハイブリダイズするまたは相補的な核酸は、３５Ｕ、Ｓ、Ｃ，１０２の下で新規であり、且つ３５Ｕ、Ｓ、Ｃ，１ｏ３の下で、いかなる先行文献の核酸からも明白でないものとして定義され、そして、本出願の出願日現在明白である、ＥＧＦＳＴＧＦ−α、アムフィレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、神経鞘層因子をコードしている核酸またはそのフラグメントもしくは変異体を除外するものである。

単離されたＨＲＧ核酸は、通常ＨＲＧ核酸の天然の供給源に付随する少な（とも一つの汚染核酸をも含まない核酸を包含する。即ち単離されたＨＲＧ核酸は、それが天然に見いだされる型または設定以外で存在する。しかしながら、単離されたＨＲＧをコードしている核酸は、通常ＨＲＧを発現する細胞中のＨＲＧ核酸を包含し、ここでこの核酸は、天然細胞の位置とは異なった染色体位置にあり、またはそうではな（天然に見いだされるＤＮＡとは異なったＤＮＡ配列に隣接している。ＨＲＧをコードしている核酸、とりわけ他の知られているＤＮＡ配列とハイブリダイズしないＨＲＧコード化配列配列部分、例えば図６のＥＧＦ様分子をコードしているものは、特異的ハイブリダイゼーション検定に使用することができる。

「緊縮条件」とは、（１）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば５０℃ て０．０１５Ｍ　ＮａＣ１１０，００１５Ｍクエン酸ナトリウム１０／１％ＮａＤｏｄｓｏ、を使用し：　（２）ハイブリダイゼーションの間にホルムアミドのような変性剤、例えば、０．１％牛血清アルブミン、０．１％フィコール、０゜１％ポリビニルピロリドン、７５０ｍＭＮａＣ］、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６，５の５０ｍＭ燐酸ナトリウム緩衝液を添加した５０％（容量／容量）ホルムアミドを４２℃で使用し、または、（３）５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＣ（０，７５Ｍ　ＮａＣ１、領　０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭ燐酸ナトリウム（ｐＨ６，８）　、０．１％ピロ燐酸ナトリウム、５ｘデンハート溶液、超音波処理した鮭精子ＤＮＡ　（５０ｇ／ｍｌ）　、０．１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストランを４２℃で使用し、０．２ｘＳＳＣおよび０．　１％ＳＤＳ中４２℃での洗浄を使用する条件である。

個々のＨＲＧ−α核酸は、図４ａ−４ｄから選択され１７以上の塩基（ヒト小型多分散環状ＤＮＡ　（ＨＵＭＰＣ１２５）　、ニワトリｃ−ｍｏｓプロトオンコジーン同族体（ＣＨＫＭＯ８）　、基底膜硫酸ヘパリンプロテオグリカン（ＨＵＭＢＭＨ５Ｐ）およびヒトリポコルチン２偽遺伝子（完全なｃｄｓ様領域、ＨＵ　Ｍ　ＬＩＰ２Ｂ）の核酸配列を除外する場合）、通常２０以上の塩基、好ましくは２５以上の塩基をその相補的配列と共に含む、またはこれらによって構成される、核酸またはオリゴヌクレオチドである。

個々のＨＲＧ−β１１−β２または一β３核酸は、図８ａ−８ｄ１１２ａ−１２ｅまたは１３ａ−１３Ｃから選択され２０以上の塩基を含むが図面に示される各遺伝子の３°末端に見いだされるポリＡ配列は含まないヌクレオチド配列を、係る配列の相補物と共に含む、またはこれらによって構成される、核酸またはオリゴヌクレオチドである。好ましくは、この配列は２５以上の塩基を含む。ＨＲＧ −β配列はまた、ヒト小型多分散環状ＤＮＡ配列（ＨＵＭＰ−Ｃ１２５）を除外し得る。

その他の態様において、ＨＲＧヌクレオチド配列は、１５またはそれ以上の塩基のＨＲＧ配列を含み、ＧＦＤのＮ末端から貫膜配列のＮ末端まで伸長しているＨＲＧドメインをコードしている配列（またはその核酸配列の相補物）の中から選択される。例えば、ＨＲＧ−αに関しては、このヌクレオチド配列は配列６７８ −８６９　（図４ｂ）の中から選択され、且つＨＲＧ核酸のこの部分由来の１５またはそれ以上の塩基の配列を含む。

別の態様において、ＨＲＧ核酸配列は、１４塩基以上であり、且つ各サブタイプに特異なヌクレオチド配列、例えばＨＲＧサブタイプの各々に特異なアミノ酸配列をコードしている核酸配列（またはその核酸配列の相補物）から選択される。

これらの配列は、種々のサブタイプの発現、およびサブタイプＤＮＡの特異的増幅のための診断的検定に有用である。例えば、目的とするＨＲＧ−α配列は、特異なＮ末端をコードしている配列またはＧＦＤ−貫膜結合配列、例えば大体ｂｐ７７１−８６０から選択されるであろう。同様に、特異なＨＲＧ−β１配列は、最後の１５個のＣ末端アミノ酸残基をコードしている配列であって、この配列はＨＲＧ−αには見いだされない。

一般に、上記の塩基数以上のもの以外のＨＲＧ−αまたはβ配列の長さは重要でなく、何故ならこのような核酸はすべてプローブとしてまたは増幅のプライマーとして有用であるからである。選択されたＨＲＧ配列は、正常なフランキング配列またはＨＲＧ核酸の他の領域のいずれかである、さらなるＨＲＧ配列、ならびに他の核酸配列を含むことができる。ハイブリダイゼーションの目的のためにはＨＲＧ配列のみが重要である。

「調節配列」という語は、特定の宿主生物において操作可能に連結したコード化配列の発現に必要なりＮＡ配列を意味する。前核生物に好適な調節配列は、例えばプロモーター、所望によりオペレーター配列、リボゾーム結合部位、および恐らくはその他の未だよく理解されていない配列を包含する。真核生物細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサ−を利用することが知られている。

核酸は、これが他の核酸配列と機能的関係にあるよう位置するとき、「操作可能に連結」している。例えば、前記列または分泌リーダーのためのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参加するプレ蛋白としてこれが発現されるならば、そのポリペプチドのためのＤＮＡと操作可能に連結しており；プロモーターまたはエンハンサ−は、その配列の転写にこれが影響を及ぼすならば、コード化配列と操作可能に連結しており５または、リボゾーム結合部位は、翻訳を促進するようこれが位置するならば、コード化配列と操作可能に連結している。一般に、「操作可能。

に連結した」とは、連結しているＤＮＡ配列が接触しており、そして分泌リーダーの場合は、接触しており且つ読み取り相内にあることを意味する。しかしながら、エンハンサ−は接触している必要が無い。連結は、都合の良い制限部位においてライゲーションすることによって達成される。このような部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカ−を、常法に従って使用する。

「外因性」要素とは、本明細書中、その細胞にとって外来の、またはその細胞に対しホモローガスではあるが通常その要素が見いだされない宿主核酸中の位置にある核酸配列を意味する。

本明細書中使用される「細胞」、「セルライン」、および「細胞培養」とは、互換性をもって使用され、係る表記は全て子孫を包含する。したがって、「形質転換体」および「形質転換された細胞」という語は、第一次当該細胞と、移動の回数に拘らずそれらから誘導された培養を包含する。さらに、全ての子孫は、故意または偶然の突然変異のために、ＤＮＡ含量が正確に等しいという訳ではない。

元の形質転換された細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物活性を有する突然変異体の子孫が包含される。これは、明確な表示が意図されている文脈から明らかである。

「プラスミド」は、大文字および／または数字が先行する、モして／または後続する、小文字ｒｐＪによって示される。本明細書中の出発プラスミドは市販されており、誰でも無制限に入手でき、またはこのような入手し得るプラスミドから、公表されている方法に従って組み立てることができる。これに加えて、他の同等なプラスミドが当分野において知られており、当業者には明らがであろう。

ＤＮＡの「制限酵素消化」は、ＤＮＡの成る一定の位置にのみ作用する酵素によるＤＮＡの触媒的開裂を意味する。このような酵素は制限エンドヌクレアーゼと呼ばれ、各々が特異的な部位は制限サイトと呼ばれる。本明細書中用いられる種々の制限酵素は市販されており、酵素の供給者により確立されたそれらの反応条件、補助因子、およびその他の必要要件が使用される。一般に制限酵素は、各制限酵素が最初に取得された微生物を表わす大文字とこれに続く他の文字、次いて個々の酵素を指定する数字から構成される略語によって表示される。一般に、約１μｇのプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを、約２０μｍの緩衝溶液中の酵素的１−２単位と共に使用する。個々の制限酵素のための適当な緩衝液および基質の量は製造者により特定されている。３７℃で約１時間のインキュベーションが通常用いられるが、供給者の指示によって異なることもある。インキュベーションの後、蛋白またはポリペプチドをフェノールおよびクロロホルムによる抽出により除去し、消化された核酸を、エタノールによる沈澱により水性画分から回収する。ＤＮＡフラグメントの二つの制限開裂された末端が、制限サイトにおける別のＤＮＡフラグメントの挿入を妨げる「環化」または閉鎖ループの形成を行なうことを防ぐため、制限酵素による消化後に、末端５′燐酸の細菌性アルカリホスファターゼ加水分解を行なうことができる。別途記載の無い限り、プラスミドの消化後に５゛末端の脱燐酸化は行なわない。脱燐酸化のための方法および試薬は、サムプルツク等［モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａ　ｌ）　、ニューヨーク：コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ −・プレス、１９８９］の１．５６−１．６１の節に記載されているような、常套的なものである。

「ライゲーション」とは、二つの核酸フラグメントの間にホスホジエステル結合を形成する１稈を意味する。ＤＮＡフラグメントをライゲーションしてつなぐためには、そのＤＮＡフラグメントの末端が互いに相客れるものでなければならない。幾つかの場合においては、その末端は、エンドヌクレアーゼ消化の後直ちに相客れるものとなる。しかしながら、ライゲーションのために相客れるものとなるようにするためには、通常エンドヌクレアーゼ消化後に生成される互い違いに切断された末端を、まず平滑末端に変換することが必要であるかも知れない。

末端を平滑化するためには、そのＤＮＡを適当な緩衝液中、４種のデオキシリボヌクレオチド三燐酸の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントまたはＴ４ＤＮＡポリメラーゼ約１０単位により１５℃で１５分間処理する。次いでこのＤＮＡをフェノール−クロロホルム抽出およびエタノール沈澱により精製する。ライゲーションすべきＤＮＡフラグメントは大体当モル量で溶液中に投入する。さらにこの溶液は、ＡＴＰ、リガーゼ緩衝液、およびＴ４ＤＮＡリガーゼのようなりガーゼを、ＤＮＡ０．５μｇ当り約１０単位含むであろう。ＤＮＡをベクター中にライゲーションしたい場合は、そのベクターをまず適当な制限エンドヌクレアーゼによる消化によって線状とする。次いでこの線状化されたフラグメントを、ライゲー゛／ヨン工程中の自己ライゲーションを防ぐため、細菌性アルカリホスファターゼ、または子牛の腸のホスファターゼで処理する。

本明細書において用いられる「ポリメラーゼ連鎖反応」またはｒＰＣＲＪという技術は、一般に、核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定な微量の破片を、米国特許第４６８３１９５号（１９８７年７月２８日登録）に記載されるように増幅することを意味する。一般に、オリゴヌクレオチドプライマーを設計することができるといった、そしてこれらのプライマーが、増幅されるべき鋳型の反対側の鎖と同一または類似の配列であろうといった、目的とする領域の末端からの情報またはそれ以上を得ることが必要である。二つのプライマーの５°末端ヌクレオチドは、増幅されたものの末端と合致し得る。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、総ケノムＤＮＡ由来の特定のＤＮＡ配列、および総細胞ＲＮＡから転写されたＣＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミドの配列等の増幅に使用することができる。一般には、ミュリス等、コールド・スプリング・ハーバ−・シンポジア・オン・クラオンティタテイブ・バイオロン−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ、Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、）５１巻２６３頁（１９８７）：エーリッヒ編、ＰＣＲテクノロジー（ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、（ストックトン・プレス、ニューヨーク、１９８９）を参照されたい。本明細書において使用されるＰＣＲは、既知の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）をプライマーとして使用することからなる、被験核酸試料を増幅するための核酸ポリメラーゼ反応法の一例であるが、これが唯一の例ではなく、また、核酸の特定の断片を生成させるまたは増幅するために、または特定の核酸に対し相補的な核酸の特定の断片を生成させるまたは増幅するために、核酸ポリメラーゼを利用する。

ＨＲＧリガンドの存在を検出するためのｒＨＲＧチロシン自己燐酸化検定」を使用して２１ｇ５ＨＥＲ２レセプターに対するリガンドの精製を監視した。この検定は、ＥＧＦおよびそのＥＧＦレセプター自己燐酸化の刺激と同様に、ｐ１８５１１Ｅ１１２レセプターに対する特異的リカンドが、該レセプターの自己燐酸化を刺激するであろうという推定に基づいている。高レベルのｐｌ　ｓ　５　ＨＥ１１２レセプターを含み無視し得るレベルのヒトＥＧＦレセプターしか含まないＭＤＦ７細胞またはＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックヒル、Ｍｄ、から入手しくＡＴＣＣＮｏ、ＨＴＲ−１３１）　、ＤＭＥＭ／ＨａｍｓＦ１２　（１：　１）培地中１０％牛脂児血清を添加した組織培養中に維持した。

検定のためにこの細胞をトリプシン処理し、約１５００００細胞／ウエルで２４ウエルの皿（コスタ−）に蒔いた。血清含有培地と共に一夜インキユベーションした後、この細胞を検定前に無血清培地に２−１８時間装いた。１００ｕＬ等分被験試料を各ウェルに加えた。この細胞を３７℃で５−３０分間（典型的には３０分間）インキュベートし、培地を除いた。各ウェル中の細胞を１００ｕＬのＳＤＳゲル変性緩衝液（セプロゾール、エンポテク、Ｉｎｃ、）で処理し、平板を１００℃で５分間加熱して細胞を溶解し蛋白を変性させた。各ウェルがらの等分試料を、製造者の指示に従って５−２０％勾配のＳＤＳケル（ノペックス、エンノニタズ、ＣＡ）上で電気泳動した。色素の先端がゲルの基部に到達した後に電気泳動を終了し、Ｐ　Ｖ　Ｄ　Ｆ膜（プロプロット、ＡＢＩ）１枚をゲルの上に乗せ、２００ｍＡｍｐのプロッティング室（バイオラド）中で３０−６０分間、蛋白をゲルから膜に移した。プロッティングの後、非特異結合をブロックするために、５％ＢＳＡを添加した０、１％トゥイーン２０デターシエント緩衝液を含有するトリス緩衝化食塩水と共に膜をインキュベートし、次にマウス抗ホスホチロシン抗体（アブステイト・バイオロジカル弓ｎｃ、　、Ｎ、　Ｙ、　）で処理した。続いて膜のプロットを、アルカリホスファターゼにコンジュゲートさせたヤギ抗マウス抗体で処理した。ゲルはプロメカのプロトプロットシステムを用いて発色させた。膜を乾燥させた後、各試料列のｐ　１８５””に対応するバンドの密度を、マツキントラシュコンピューターに接続したヒユーレット・パラカード・スキャンジェット・プラス・スキャナーにより定量した。ＭＤＡ−ＭＢ−４５３またはＭＣＦ−７細胞における細胞当りのレセプターの数は、これらの実験条件の下でｐ１８５１１川レセプター蛋白が、標識された主要な蛋白であるような数であった。

「蛋白微量配列決定」は、以下の方法に基づいて実施した。最終的ＨＰＬＣ工程からの蛋白は、１２０Ａ　ＰＴＨアミノ酸分析機を備えたモデル４７０Ａアプライド・ハイオシステムズ気相配列決定機を用いた自動ニドマン分解によって直接配列決定するか、または種々の化学物質または酵素で消化した後に配列決定する。ＰＴＨアミノ酸はクロムパーフェクトデータシステム（シャステイス・イノベーションズ、バロ・アルド、ＣＡ）を用いて統合した。配列の解釈は、ＶＡＸ１１／７８５ディジタル・イクイップメント・コーポレーションのコンピューターで、記載されるように［ヘンゼル等、ジャーナル・オン・クロマトグラフィー（Ｊ、Ｃｈｒｏｍａ、ｔｏｇｒａｐｈｙ）４Ｑ４巻４１−５２頁（１９８７）］実施した。幾つかの場合には、ＨＰＬＣ画分の等分試料を５−２０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動し、ＰＶＤＦ膜（プロプロット、ＡＢＩ、フォスター・ンティー、ＣＡ）に電気的に移し、クーマシー・ブリリアント・ブルーで染色した［Ｐ　マツダイラ、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６２巻＋１００３５−１００３８頁、１９８７］。

特異的な蛋白をＮ末端配列決定のためにプロットから切り取った。内部蛋白の配列決定のために、ＨＰＬＣ画分を減圧で乾燥しくスピードバク）、適当な緩衝液に再警濁し、そして臭化シアン、リジン特異的酵素Ｌｙｓ−Ｃ（ワコー・ケミカルズ、リッチモンド、ＶＡ）またはＡｓｐ−Ｎ（ベーリンガー・マンハイム、インディアナポリス、Ｉｎｄ、）で消化した。消化後得られたペプチドを混合物として配列決定するか、または、０．１％ＴＦＡ中のプロパツール勾配で展開する０４カラム上のＨＰＬＣにより分離した後、上記のように配列決定した。

＋　１．ＨＲＧポリペプチドの使用および調製。

１、変異体を含むＨＲＧポリペプチドの調製。

ＨＲＧポリペプチドの調製に用いられる系は、選択される個々のＨＲＧ配列による。その配列が充分小さい場合は、ＨＲＧはインビトロポリペプチド合成法によって調製される。しかしながら最も一般的には、ＨＲＧは、下記の宿主−ベクター系を用いる組み替え細胞培養で調製する。

一般に、哺乳動物の宿主細胞が使用され、このような宿主は、普通の方法においてＨＲＧプロ配列をプロセシングするための翻訳後の系を含んでも含まなくてもよい。もし宿主細胞がこのような系を含むならば、ＨＲＧ−ＧＦＤまたはＨＲ（、−ＮＴＤ−ＧＦＤのような天然のサブドメインフラグメントを培養から回収することが可能であろう。もし含まないならば、必要とされる酵素で宿主を形質転換することにより、またはインビトロで前駆体を開裂させることにより、適正なプロセシングを達成することができる。しかしながら、ＨＲＧ−ＧＦＤのようなＨＲＧ配列のフラグメントの産生のみを所望とする場合は、選択されたＨＲＧのための完全なプロ配列をコードしているＤＮＡで細胞を形質転換する必要はない。

例えばＨＲＧ　−Ｇ　Ｆ　Ｄを調製するためには、出発コドンをＨＲＧ−ＧＦＤをコードしているＤＮＡの５゛末端にライゲーションし、このＤＮＡを使用して宿主細胞を形質転換すると、生成物がＭｅｔＮ末端型として直接発現される（所望ならば余計なＭｅｔをインビトロでまたは内性Ｎ末端デメチオニラーゼにより除去することができる）。別法として、ＨＲＧ−ＧＦＤは宿主細胞により認識されるシグナル配列との融合物として発現され、これは、下にさらに記載されるように、成熟ＨＲＧ−ＧＦＤをプロセシングし分泌する。天然ＨＲＧ−ＧＦＤ配列のアミノ酸配列変異体は同じように産生される。

ＨＲＧ−ＮＴＤは、５１７２−Ｃ１８２のうちの一つの後ろの停止コドンを有する、ＨＲＧ−ＮＴＤのみをコードしているＤＮＡの発現から生成される事以外は、全長の分子と同じやり方で生成される（図１５）。

これに加えて、ＨＲＧ変異体は、ＧＦＤおよびＮＴＤ両者のドメインがそれらの適正な方向を向いているが、ＮＴＤ−ＧＦＤ連結サイトにおける（例えば配列５１７２−Ｃ１８２の中に位置する）アミノ酸の挿入、欠失または置換を含む、蛋白をコードしているＤＮＡから発現される。別の態様においては、停止コドンがＮＴＤ−ＧＦＤコード化配列配列゛末端に位置する（図１５の任意の残基Ｔ／Ｑ２２２−Ｔ２４５の後）。その結果が、貫層配列を欠＜ＨＲＧ−αまたは一β、または−β２の可溶性型である（この配列は内部シグナル配列でもあるが、貫層配列と称される）。この態様のさらなる変形において、天然ＨＲＧ貫膜貫層インを別のポリペプチドの内部シグナル配列で置換し、または、別の細胞膜ポリペプチド、例えばレセプターキナーゼでＨＲＧ−αまたはＨＲＧβ１−β２細胞質ペプチドを置換する。

さらに別の態様において、ＨＲＧおよび他のＥＧＦファミリー成員のＮＴＤ。

ＧＦＤおよび貫膜ドメインを互いに置換、例えばＥＧＦのＮＴＤ相当領域でＨＲＧのＮＴＤを置換し、または、ＨＲＧのＧＦＤで、プロセシングされた可溶性プロ型であるＥＧＦを置換する。別法として、ＨＲＧまたはＥＧＦファミリー成員の貫膜ドメインを、ＨＲＧ−Ｆ３のＣ末端Ｅ２３６上に融合させる。

さらなる変異体において、Ｒ２４１からＣ末端にわたるＨＲＧ配列をそのＮ末端において非ＨＲＧポリペプチドのＣ末端に融合させる。

別の態様は、ＣＴＰ、ＧＦＤ−貫層連結ドメイン中の蛋白分解的プロセシングサイトの機能的または構造的除去を含む。例えば、プロセシングされたＨ　ＲＧ　 −αまたはβ１−Ｒ２の推定Ｃ末端リジン（Ｒ２４１）を除去し、別の残基、Ｒ２４１およびＲ２４２の間に挿入されるＫまたはＲ以外の残基で置換し、またはその他の損傷性突然変異をプロ配列に施す。

別の態様において、（ｂ）Ｃ２２１に対応する（ａ）そのシスティンから該ファミリー成員のＣ末端残基にまで伸長している任意のＥＧＦファミリー成員のドメインて、ＨＲＧ−αまたは一βｌまたは一β２の類似ドメインを置換する（またはＨＲＧ−Ｆ３のＣ末端に融合させる）。このような変異体は、親ＨＲＧとではなくそのファミリー成員と同じやり方で宿主細胞を離れてプロセシングされるであろう。より洗練された態様においては、他の特異的開裂サイト（例えばプロテアーゼサイト）が、ＣＴＰまたはＧＦＤ−貫層連結ドメイン（大体残基Ｔ／Ｑ２２２−Ｔ２４５、図１５）中に置換される。例えば、アムフィレグリン配列Ｅ８４−に９９またはＴＧＦα配列Ｅ４４−に５８てＨＲＧ−α残基Ｅ２２３−に２４１を置換する。

さらなる態様において、変異体（ＨＲＧ−ＮＴＤｘＧＦＤと称する）を製造するが、ここて（１）ＮＴＤ−ＧＦＤ結合配列ＶＫＣ（残基１．８０−１８２、図１５）中に見いだされるリジン残基を除去し、または（好ましくは）Ｒ以外の別の残基、例えばＨＳＡ、ＴまたはＳにより置換し、そして、（２）配列ＲＣＴまたはＲＣＱ　（残基２２０−２２２、図１５）中、Ｃ１もしくはＴ　（ＨＲＧ−α に対して）またはＱ　（ＨＲＧ−βに対して）の代わりに停止コドンを導入する。

ｐ　１８５”Ｒ２に対する結合親和性を有する好ましいＨＲＧ−αリガンドは、図４のアミノ酸２２６−２６５を含む。このＨＲＧ−αリガンドは、さらに、図４からのアミノ酸２２６に先行する追加の１−２０のアミノ酸、および図４からのアミノ酸２６５に続＜　１−２０のアミノ酸までを含み得る。β１８５ＨＥＲ３に対する結合親和性を有する好ましいＨＲＧ−βリガンドは、図８のアミノ酸２２６−２６５を含む。このＨＲＧ−βリガンドは、図８からのアミノ酸２２６に先行する追加の１−２０のアミノ酸、および図８からのアミノ酸２６５に続＜１−２０のアミノ酸までを含み得る。

ＧＦＤ配列は、ＥＧＦファミリーの他の成員に対応する１またはそれ以上の残基が除去されもしくは置換されまたはそれに隣接して挿入された残基を有する配列を包含する。例えば、ＨＲＧのＦ２１６がＹにより置換され、Ｆ２０２がＥで、Ｆ１８９がＹて置換され、または５２０３−Ｆ２０５が除去される。

ＨＲＧはさらに、最初の約１ないし３細胞外ドメイン残基（ＱＫＲ，残基２４０ −２４３、ＨＲＥ−α、図１５）または最初の約１−２貫膜領域残基のうちの一つの位置に、そのＣ末端を有しているＮＴＤ−ＧＦＤを包含する。これに加えて、幾つかのＨＲＧ−ＧＦＤ変異体においては、コドンがＧＦＤ−ｈランスメンバープロ蛋白分解サイトにおいて、置換、挿入または欠失により修飾されている。

ＧＦＤ蛋自分解サイトは、ＧＦＤのＣ末端残基と、この残基から約５個のＮ末端残基および５個のＣ末端残基を含むドメインである。この時点において、Ｍｅｔ＝２２７末端およびＶａ　ｌ−２２９末端ＨＲＧ−α−ＧＦＤが生物学的に活性であることは知られているが、ＨＲＧ−αまたはＨＲＧ−βに対する天然のＣ末端残基はいずれも同定されていない。ＨＲＧ−αＧＦＤに対する本来のＣ末端は、恐ら＜Ｍｅｔ−２２７、Ｌｙｓ−２２８、Ｖａｎ−２２９、Ｇｌｎ−２３０、Ａｓｎ−２３１またはＧｌｎ−２３２であり、ＨＲＧβ１−β、−ＧＦＤＩ：対しテハ恐ら＜Ｍｅ　ｔ−２２６、Ａｌａ−２２７，５ｅｒ−２２８、Ｐｈｅ−２２９、Ｔｒｐ−２３０、Ｌｙｓ２３１または（ＨＲＧ−β１に対して）Ｒ２４０または（ＨＲＧ−Ｒ２に対して）Ｒ２４６である。ＧＦＤ配列が所望の活性を有している限り、ＨＲＧ−ＧＦＤが本来の末端を持っているという事は決定的な事ではないが、本来のＣ末端はＣ末端配列決定により容易に決定される。ＨＲＧ− ＧＦＤ変異体の幾つかの態様においては、ＣＴＰ中のアミノ酸の変化を、インビトロ蛋白分解に抵抗する、そしてＨＲＧ−ＧＦＤの生成を司るプロテアーゼを阻害する能力についてスクリーニングする。

全長のＨＲＧポリペプチドの製造が望まれ、且つ所定のＨＲＧの５′または３′ 末端がここに記載されていない場合、欠けているドメインが、より完全なＨＲＧ核酸からのホモローガス領域により供給される核酸を製造する必要があるかも知れない。別法として、欠けているドメインを、図面に開示されているＤＮＡまたはそのフラグメントを用いてライブラリーをブロービングすることにより、得ることができる。

Ａ、ヘレグリンをコードしているＤＮＡの単離。

ＨＲＧをコードしているＤＮＡは、ＨＲＧのｍＲＮＡを有し且つこれを検出可能レベルで発現すると信ぜられる組織から調製される任意のｃＤＮＡライブラリーから取得することができる。

目的とする遺伝子またはそれによりコードされている蛋白を同定するよう設計された分析手段またはプローブを用いて、ライブラリーをスクリーニングする。

ｃＤＮＡ発現ライブラリーのためには、好適なプローブは、ＨＲＧを認識しこれに特異的に結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体；同じまたは異なった種由来のＨＲＧｃＤＮＡの既知または推測される部分をコードしている約２０−８０塩基の長さのオリゴヌクレオチド；および／または相補的もしくはホモローガスなｃＤＮＡまたは同遺伝子もしくはハイブリダイズする遺伝子をコードしているそのフラグメント、を包含する。ゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングする適当なプローブは、オリゴヌクレオチド；　ｃＤＮＡまたは同ＤＮＡもしくはハイブリダイズするＤＮＡをコードしているそのフラグメント；および／またはホモローガスなゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントを包含するが、これらに限定される訳ではない。選択されたプローブによるｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーのスクリーニングは、サムプルツク等、上記、の１０−１２章に記載されるような標準的手法を用いて実施できる。

ＨＲＧをコードしている遺伝子を単離する別の手段は、サムプルツク等、上記、の１４節に記載されるようなポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を使用することである。この方法は、ＨＲＧとノゾブリダイズするであろうオリゴヌクレオチドプローブの使用を必要とする。オリゴヌクレオチドの選択方法は下に記載する。

目的とする遺伝子を取得するためのこれに代わるもう一つの方法は、エンジェルズ等［Ａｇｎｅｗ、Ｃｈｅｍ、Ｉｎｔ、Ｅｄ、Ｅｎｇｌ、　、２８巻７１６−７３４頁、１９８９年］の記載する方法の一つを用いてこれを化学的に合成することである。これらの方法は、トリエステル、ホスファイト、ホスホルアミダイトおよびＨ−ホスホナート法、ＰＣＲおよびその他の自己プライマー法、ならびに固体支持体上でのオリゴヌクレオチド合成を含む。これらの方法は、当該遺伝子の核酸配列の全体が知られているならば、またはコード化鎖に対し相補的な核酸の配列が入手できるならば、使用することができ、これとは別にもし標的アミノ酸配列が既知であるならば、各アミノ酸残基に対する既知の且つ好ましいコード化残基を用いて、可能性ある核酸配列を推論することができる。

本発明を実施する好ましい方法は、注意深く選択されたオリゴヌクレオチド配列を使用して、種々の組織、好ましくはヒトの乳房、結腸、唾液腺、胎盤、胎児、脳、および癌腫セルラインからのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることである。ヘレグリン様リガンドをコードしているＤＮＡのその他の生物学的供給源は、他の哺乳動物および鳥類を包含する。哺乳動物の中では以下の順に好ましい：ウシ、ヒツジ、ウマ、マウス、および薩歯動物。

プローブとして選択されるオリゴヌクレオチド配列は、充分な長さを持ち、且つ偽陽性を最小限とするに充分明確なものであるべきである。実際のヌクレオチド配列は通常、ＨＲＧ−αの保存されたまたは高度にホモローガスなヌクレオチド配列または領域に基づいている。このオリゴヌクレオチドは１またはそれ以上の位置において縮重していてよい。一つのライブラリーをその種における好ましいコドンの使用法がわかっていない種からスクリーニングする場合、縮重オリゴヌクレオチドの使用は特に重要となり得る。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー中のＤＮＡとハイブリダイズする際に検出できるよう、標識されなくてはならない。好ましい標識方法は、当分野で良く知られているように、３２ｐ−標識ＡＴＰをポリヌクレオチドキナーゼと共に使用して該オリゴヌクレオチドを放射標識することである。しかしながら、ビオチニル化または酵素標識を包含する他の方法を用いてオリゴヌクレオチドを標識することもできるが、これらに限定される訳ではない。

最も興味深いのは、全長のプロポリペプチドをコードしているＨＲＧ核酸である。幾つかの好ましい態様において、この核酸配列は、本来のＨＲＧシグナル貫膜泥膜配列む。選択されたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーをスクリーニングし、そして必要ならばサムプルツク等、上記、の７．７９節に記載されるような常套的プライマー伸長法を用いて前駆体を検出し、そして、ｃＤＮＡに逆転写されなかったｍＲＮＡの中間体をプロセシングすることにより、全蛋白コード化配列を有する核酸が得られる。

ＨＲＧコード化ＤＮＡを使用して、上記方法を用いたハイブリダイゼーションによる他の動物種由来の類似リガンドをコードしているＤＮＡの単離が行なわれる。好ましい動物は、哺乳動物、特にウシ、ヒツジ、ウマ、ネコ、イヌおよび醤歯頚、より詳細にはラット、マウスおよびウサギである。

Ｂ、ヘレグリンのアミノ酸配列変異体。

ＨＲＧのアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチドの変更をＨＲＧＤＮＡ中に導入、または所望ＨＲＧポリペプチドのインビトロ合成によって製造する。このような変異体は、例えば、ヒトＨＲＧ配列に対して示されるアミノ酸配列内の残基の除去、または挿入もしくは置換を含む。最終組み立て物が所望の性質を有する限り、除去、挿入および置換の任意の組合せを施して最終組み立て物に到達することができる。アミノ酸の変化はさらに、グリコジル化サイトの数または位置の変更、膜に付随する性質の変更、挿入、除去またはその他の方法で本来のＨＲＧの泥膜配列に影響を及ぼすことによりＨＲＧの細胞内位置を変更すること、または蛋白分解的開裂の受け易さを修飾すること、のような、ＨＲＧ−αの翻訳後プロセシングを変えることができる。

ＨＲＧのアミノ酸配列変異体を設計する際、突然変異サイトの位置および突然変異の性質は、修飾されるべきＨＲＧの性格に依存するであろう。突然変異の部位は、例えば、（１）最初に同類アミノ酸の選択により、そして次に、達成される結果に応じてより過激な選択による置換を行なうことにより、（２）標的残基を除去することにより、または（３）存在する部位に隣接する他のリガンドの残基を挿入することにより、個別に、または連続して修飾することができる。

ＨＲＧ残基または突然変異誘発領域の同定のための有用な方法は、カニングノ＼ムおよびウェルズ［サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２４４巻１０８１−１０８５頁（１９８９）］によって記載されたように「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここて、一つの標的残基または標的残基の群を同定しく例えばａｒｇ、ａｓｐ％ｈｉｓ、Ｉｙｓ、およびｇｌｕといった荷電した残基）、アミノ酸と、細胞内外を取り巻く水性環境との相互作用に影響を及ぼすために、中性のまたは負に荷電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまたはポリアラニン）に置き替える。次いで、さらなるまたは他の変異体を置換部位にまたは置換部位のだめに導入することにより、置換に対する機能的感受性を示すドメインを精密とする。したがって、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されているが、突然変異自体の性質は予め決定する必要が無い。例えば、与えられた部位における突然変異の挙動を最適なものとするために、ａｈａスキャニングまたは無作為突然変異誘発を標的コドンまたは領域で実施し、発現されたＨＲＧ変異体を所望活性の最適な組合せについてスクリーニングする。

アミノ酸配列変異体を組み立てる際、二つの主要な変異要素、即ち突然変異部位の位置および突然変異の性格がある。これらはＨＲＧ配列由来の変異体であって、天然に存在する対立遺伝子（これはＨＲＧＤＮＡの操作を必要としない）、または、対立遺伝子もしくは天然に見いだされない変異体のいずれかに到達する、ＤＮＡの突然変異により作られる前もって決定された突然変異型を表わすことができる。一般に、選ばれる突然変異の位置および性格は、修飾されるＨＲＧの性質に依存するであろう。明らかに、例えばＨＲＧを既知のレセプターリガンドに変換する、このような変異は、本発明の範囲内には含まれず、また、新規でな（且つ先行技術から明らかである他のいかなるＨＲＧ変異体またはポリペプチド配列もまた本発明の範囲内には含まれない。

アミノ酸配列の除去は一般に約１ないし３０残基、より好ましくは約１ないし１０残基、典型的には約１ないし５の隣接する残基の範囲である。ＨＲＧの活性を修飾するために、他のＥＧＦファミリー前駆体との相同性の低い領域に除去を導入することができる。他のＥＧＦファミリーの配列と実質上ホモローガスな領域におけるＨＲＧからの除去は、ＨＲＧの生物活性をより著明に修飾する傾向があるであろう。連続した除去の数は、影響を受けたドメインにおけるＨＲＧの三次構造、例えばシスティン架橋、βプリーツンートまたはαヘソックスを保存するように選択されるであろう。

アミノ酸配列の挿入は、１個の残基から１００またはそれ以上の残基を含むポリペプチドまでの範囲の長さのアミノ−および／またはカルボキシ−末端融合、ならびに単一または多数のアミノ酸残基の配列内挿入を包含する。配列内挿入（即ちＨＲＧ配列内での挿入）は一般に約１ないし１０残基、より好ましくは１ないし５残基、最も好ましくは１ないし３残基の範囲とすることができる。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基（細菌の組み替え細胞培養中でのＨＲＧの直接発現の所産）、および、組み替え宿主細胞からの成熟ＨＲＧの分泌を促進するための、ヘテロローガスＮ末端シグナル配列の、ＨＲＧのＮ末端への融合を包含する。

このような／グナル配列は、一般に、意図される宿主細胞種から得られ、したがってそれに対しホモローガスとなるであろう。好適な配列は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のためには５ＴＩＩまたはＩｐｐ、酵母のためにはα因子、モして哺乳動物細胞のためにはヘルペスｇＤのようなウィルスのシグナルを包含する。

その他のＨＲＧの挿入変異体は、ＨＲＧのＮ−またはＣ−末端の、免疫原性ポリペプチド、例えばβ−ラクタマーゼまたはＥ、ｃｏｌｉ　ｔｒｐ遺伝子座によりコードされる酵素のような細菌性ポリペプチド、または酵母蛋白、牛血清アルブミン、および走化性ポリペプチドへの融合を包含する。ＷＯ２９１０２９２２号（１９８９年４月６日公開）に記載されるような、ＨＲＧ−ＮＴＤ−ＧＦＤの、長い半減期を有する蛋白、例えば免疫グロブリンネ変領域（またはその他の免疫グロブリン領域）、アルブミン、またはフェリチンとのＣ末端融合が包含される。

変異体のもう一つの群はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、ＨＲＧ分子内の少なくとも１個のアミノ酸残基が除去され、その場所に異なった残基が挿入されている。置換突然変異のための最も興味の持たれる部位は、ＨＲＧの活性部位として同定されている部位、および、様々な種由来のＨＲＧリガンドに見いだされるアミノ酸が、側鎖のかさ、電荷、および／または疎水性の点で実質止具なっている部位を包含する。

ＨＲＧの細胞質領域のアミノ末端を、ヘテロローガスな泥膜ドメインおよびレセプターのカルボキン末端に融合させて、ヘテロローガスなレセプターに結合するりガントの細胞内ノブナル生成に有用な融合ポリペプチドを形成させることができる。

興味の持たれるまた別の部位は、様々な種から得られるＨＲＧ様リガンドの特定の残基が等しい部位である。これらの位置は、ＨＲＧの生物活性にとって重要であり得る。これらの部位、特に少なくとも３個の等しく保存されている相異なる部位を有する配列中にある部位は、相対的に保存性のあるやり方で置換される。

このような同類置換を「好ましい置換」という表題の下に第１表に示す。このような置換が生物活性の変化をもたらす場合は、第１表中、例示置換と呼称される、またはアミノ酸のクラスに関して下にさらに記載されるような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングする。

第１表元の残基　例示置換　好ましい置換＾１ａ（Ａ）　ｖａｌ；ｌｅｕ；ｉｌｅ　ｖａｌＡｒｇ（Ｒ）　ｌｙｓ；ｇｉｎ：ａｓｎ　ｌｙｓ＾５ｎ（Ｎ）　ｇｉｎ；ｈｉｓ：ｌｙｓ；ａｒｇ　ｇｉｎＡｓｐ（Ｄ）　ｇｌｕ　ｇｌｕＣｙｓ（Ｃ）　ｓｅｔ　５ｅｔＧｉｎ（Ｑ）　ａｓｎ　ａｓｎＧｌｕ（Ｅ）　ａｓｐ　ａｓｐＧｌｙ（Ｇ）　ｐｒｏ　ｐｒ。

Ｈｉｓ（Ｂ）　ａｓｎ；ｇｉｎ：ｌｙｓ：ａｒｇ　ａｒｇｌｌｅ（Ｉ）　ｌｅｕ；ｖａｌ；ｍｅｔ；ａｌａ；ｐｈｅ；ノルロイノン　１ｅｕＬｅｕ（Ｌ）　ノルロイノン＋ｉｌｅ；ｖａｌ；ｍｅｔ：ａｌａ；ｐｈｅ　１ｌｅＬｙｓ（Ｋ）　ａｒｇ；ｇｉｎ；ａｓｎ　ａｒｇＭｅｔ（Ｍ）　ｌｅｕ；ｐｈｅ；ｉｌｅ　１ｅｕＰｈｅ（Ｆ）　ｌｅｕ；ｖａｌ；ｉｌｅ：ａｌａ　１ｅｕＰｒｏ（Ｐ）　ｇｉｙ　ｇｉｙＳｅｒ（Ｓ）　ｔｈｒ　ｔｈｒＴｈｒ（Ｔ）　ｓｅｒ　５ｅｒＴｒｐ（Ｖ）　ｔｙｒ　ｔｙｒＴｙｒ（Ｙ）　ｔｒｐ＋ｐｈｅ；ｔｈｒ；ｓｅｒ　ｐｈｅＶａｌ（Ｖ）　ｉｌｅ；ｌｅｕ；ｍｅｔ：ｐｈｅ；ａｌａ：ノルロイノン　１ｅｕ（ａ）置換領域におけるポリペプチドバックボーンの構造、例えばシートまたはらせんコンホメーション、（ｂ）標的部位における分子の疎水性もしくは電荷、または（Ｃ）側鎖のかさ、の維持に及ぼすそれらの影響が著しく相違する置換を選択することにより、ＨＲＧの免疫学的同一性または機能の実質的な修飾を達成する。天然に存在する残基は、共通する側鎖の性質に基づき、群に分けられる：１）疎水性・ノルロイノン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、Ｉｅｕ、ｉｌｅ：２）中性親水性：ｃｙｓＳｓｅｒ、ｔｈｒ；３）酸性　ａｓｐ、ｇｌｕ；４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、Ｉｙｓ、ａｒｇ；５）鎖の方向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；および、６）芳香性：　ｔ　ｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ０非同類置換は、これらのクラスのうち一つの成員を別のものに交換することを伴う。このような置換された残基は、他のレセプターリガンドとホモローガスなＨＲＧの領域、またはより好ましくは該分子の非ホモローガス領域中に導入することができる。

本発明の一つの態様において、分子中に存在する１またはそれ以上のプロテアーゼ開裂部位を不活性化することが望ましい。これらの部位は、コード化されたアミノ酸配列を調査することによって同定される。プロテアーゼ開裂部位であると思われる部位、例えばに２４１Ｒ２４２が同定されたならば、標的残基を別の残基、好ましくはグルタミンのような塩基性残基またはセリンのような親水性残基て置換することにより、その残基を除去することにより：またはその残基の直後にプロリル残基を挿入することにより、これらを蛋白分解的開裂に対し不活性とする。

別の態様において、出発メチオニル残基以外の任意のメチオニル残基、または各々の係るメチオニル残基のＮ−またはＣ−末端の約３残基以内に位置する任意の残基を、別の残基で置換（好ましくは第１表に従って）、または除去する。本発明者等は、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）発現の過程における２個のＧＦＤ　Ｍ残基の酸化がＧＦＤ活性を甚だしく低下させると思われることを見いだした。即ち、これらのＭ残基を第１表に従って突然変異させる。別法として、大体１−３残基を、係る部位に隣接して挿入する。

ＨＲＧの適正なコンホメーションの維持に関わっていない任意のシスティン残基もまた、一般にセリンで置換して、該分子の酸化的安定性を改善し、異常型の架橋を防ぐことができる。

置換、除去または挿入のために、またはフラグメントとしての使用のために特に好適な部位は、図４のＨＲＧ−αのＮ末端から数えて、１）４２−４３．６４− ６５．１５１−１５２位のセリン−グリシンジペプチドの、可能性あるグリコサミノグリカン付加部位：２）１６４．１７０．２０８および４３７位、部位（ＮＤＳ）１６４−１６６、（ＮＩＴ）１７０−１７２、（ＮＴＳ）２０８−２１０、お、、１．びＮＴｓ　（６０９−６１１）にある、可能性あるアスパラギン連結グリコジル化部位。

３）２０９−２１８位のセリンおよびスレオニンの集まりにある、可能性あるＯ −グリコジル化部位。

４）２２６．２３４．２４０．２５４．２５６および２６５位のシスティン：５）２８７−３０９位の泥膜ドメイン：６）システィン２２６および２４０により輪郭の描かれるループ１；７）システィン２３４および２５４により輪郭の描かれるループ２；８）システィン２５６および２６５により輪郭の描かれるループ３；９）２−３．８−９．２３−２４．３３−３４．３６−３７．４５−４６．４８−４９．６２−６３．６ロー６７．８６−８７．１１０−１１１．１２３− １２４．１３４−１３５．１４２−１４３．２７２−２７３．２７８−２７９および２８５−２８６位にある、可能性あるプロテアーゼプロセシング部位；を包含する。

ＨＲＧ−αおよびＨＲＧ−β１中の類似アミノ酸を並べた図９を参照することにより、ＨＲＧ−β１中の類似の領域を決定することができる。類似のＨＲＧ−β １アミノ酸は、ＨＲＧ−αについて上に論じたように突然変異させまたは修飾することができる。ＨＲＧ−β２中の類似の領域は、ＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１およびＨＲＧ−β２中の類似アミノ酸を並べた図１５を参照することにより、決定することができる。類似のＨＲＧ−β２アミノ酸は、ＨＲＧ−αまたはＨＲＧ− β１について上に論じたように突然変異させまたは修飾することができる。ＨＲＧ−β３中の類似の領域は、ＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１およびＨＲＧ−β２中の類似アミノ酸を並べた図１５を参照することにより、決定することができる。

類似のＨＲＧ−β３アミノ酸は、ＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１、またはＨＲＧ−Ｆ２について上に論じたように突然変異させまたは修飾することができる。

ＨＲＧのアミノ酸配列変異体をコードしているＤＮＡは、当分野で知られる種々の方法によって製造する。これらの方法は、天然供給源からの単離（天然に存在するアミノ酸配列変異体の場合）またはオリゴヌクレオチド仲介（または位置指定）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、およびＨＲＧの初期調製変異体もしくは非変異型のカセット突然変異誘発による製造を包含するが、これらに限定される訳ではない。これらの技術は、ＨＲＧ核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）　、またはＨＲＧ核酸に対し相補的な核酸を利用することができる。

オリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発は、ＨＲＧ　ＤＮＡの置換、除去、および挿入変異体を製造するための好ましい方法である。この技術は、アーデルマン等、ＤＮＡ、、２巻１８３頁（１９８３）に記載されるように当分野では良く知られている。

一般に、少なくとも２５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドが使用される。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードしているヌクレオチドの両側において鋳型に対し完全に相補的である、１２ないし１５のヌクレオチドを有するであろう。この事は、そのオリゴヌクレオチドが一本鎖ＤＮＡ鋳型分子と適正にハイブリダイズすることを保証するものである。該オリゴヌクレオチドは、フレア等［プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７５巻５７６５頁、１９７８］に記載されるように、当分野において知られる技術を用いて容易に合成される。

一本鎖ＤＮＡ鋳型もまた、標準技術を用いて二本鎖プラスミド（または他の）ＤＮＡを変性させることによって生成させることができる。

本来のＤＮＡ配列の改変のために（例えばアミノ酸配列変異体の生成のため）、該オリゴヌクレオチドを適当なハイブリダイゼーション条件の下で一本鎖鋳型にハイブリダイズする。次にＤＮＡ重合酵素、通常ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントを加え、合成用プライマーとして該オリゴヌクレオチドを用いて鋳型の相補的鎖を合成する。こうして、ＤＮＡの一方の鎖がＨＲＧの突然変異した型をコードし、他方の鎖（元の鋳型）が本来の、変化していないＨＲＧ配列をコードしている、ヘテロ二本鎖分子が形成される。次にこのヘテロ二本鎖分子を適当な宿主細胞、通常Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩのような前核生物中に導入する。

細胞が増殖した後、これらをアガロース平板上に蒔き、３２Ｐ−ホスファ−トで放射標識したオリゴヌクレオチドブライマーを用いてスクリーニングし、突然変異したＤＮＡを含む細菌コロニーを同定するする。次いで、突然変異した領域を除去し、蛋白産生のための適当なベクター、一般に適当な宿主の形質転換のために典型的に使用される型の発現ベクターに入れる。

直前に記載した方法は、プラスミドの両方の鎖が突然変異を含む、ホモ二本鎖分子が作られるよう、修飾することができる。この修飾は以下の通りであるニー末鎖オリゴヌクレオチドを上記のように一本鎖鋳型にアニーリングする。３種のデオキシリボヌクレオチド、デオキシリボアノシン（ｄＡＴＰ）　、デオキシリボグアノシン（ｄＧＴＰ）およびデオキシリボチミジン（ｄＴＴＰ）の混合物を、ｄＣＴＰ−（ａＳ）と呼ばれる修飾されたチオーデオキシリボシトシン（アマーノヤム・コーポレーション）と合する。この混合物を鋳型−オリゴヌクレオチド複合体に添加する。この混合物にＤＮＡポリメラーゼを添加すると、突然変異した塩基を除いては鋳型と同一のＤＮＡ鎖が生成する。さらに、この新たなりＮＡ鎖はｄＣＴＰの代わりにｄＣＴＰ−（ａＳ）を含み、これが制限エンドヌクレアーゼ消化からこれを保護する役割を果たす。適当な制限酵素でヘテロ二本鎖の鋳型鎖に切れ目を入れた後、鋳型鎖を、Ｅｘｏｌｌｌヌクレアーゼまたは他の適当なヌクレアーゼによって、突然変異が誘発されるべき部位を含む領域を越えて消化することができる。次いで反応を停止させ、一部分のみが一本鎖である分子を残す。次に、４種の全チオキンリボヌクレオチド三燐酸、ＡＴＰ、およびＤＮＡＮカリゼの存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて、完全な二本鎖ＤＮＡホモ二本鎖を形成させる。次いでこのホモ二本鎖分子を、上記のように適当な宿主細胞、例えばＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭＩＯＩに導入することができる。

任意のＨＲＧに共通する説明的置換は、Ｓ２ＴまたはＤ；　Ｅ３Ｄまたはに、Ｒ４ＫまたはＥ；に５ＲまたはＥ　：　Ｅ６Ｄまたはに；Ｇ７ＰまたはＹ；Ｒ８ＫまたはＤ：Ｇ９ＰまたはＹ：に１０ＲまたはＥ：Ｇ１１ＰまたはＹ；に１２ＲまたはＥ：Ｇ１９ＰまたはＹ：５２０ＴまたはＦ；Ｇ２１ＰまたはＹ、に２２またはＥ：に２３ＲまたはＥ：Ｑ３８Ｄ；５１０７Ｎ；Ｇ１０８Ｐ；Ｎ１２０に；Ｄ１２１に；５１２２Ｔ：Ｎ１２６Ｓ＋　１１２６Ｌ；Ｔ１２７Ｓ＋Ａ１６３Ｖ：Ｎ１６４に：Ｔ１６５−Ｔ１７４　：任意ノ残基１、Ｌ、Ｖ、Ｍ、ＦＳＤ、Ｅ、Ｒ＊ｆ：はＫに；Ｇ１７５ＶまたはＰ＋Ｔ１７６ＳまたはＶ；５１７７ＫまたはＴ；Ｒ１７８ＫまたはＳ：Ｌ１７９ＦまたはＩ　；Ｖ１８０ＬまたはＳ　、に１８１ＲまたはＥ　；Ａ１８３ＮまたＩｔＶ；Ｅ１８４ＫまたＩ；！Ｄ；に１８５ＲまたはＥ　；Ｅ１８６Ｄまたは’に’：に１８７ＲまたはＤ：Ｔ１８８ＳまたはＱ、Ｆ１８９ＹまたはＳ。

Ｖ１９］ＬまたはＤ；Ｎ１９２ＱまたはＨ：Ｇ１９３ＰまたはＡ、Ｇ１９４ＰまたＩｔＡ　：　Ｅ１９５Ｄ＊たＩ；！に：　Ｆ１９７Ｙ＊たは１　、Ｍ１９８Ｖ＊たはＹ、Ｖ１９９ＬまたはＴ：に２００ＶまたはＲ：Ｄ２０１Ｅまたはに；Ｌ２０２Ｅまたはに：５２０３ＡまたはＴ；Ｎ２Ｏ４△＋Ｎ２０４Ｑ＋Ｐ２Ｏ５△ ；Ｐ２Ｏ５Ｇ；５２０６ＴまたはＲ：Ｒ２０７ＫまたはＡ：Ｙ２Ｏ８ＰまたはＦ：　Ｌ２０９１またはＤ：に２１１１またはＤ：Ｆ２１６ＹまたはＩ；Ｔ２１７ＨまたはＳ＋Ｇ２１８ＡまたはＰ　、Ａ／Ｄ２１９ＫまたはＲ，Ｒ２２ＯＫまたはＡ；Ａ２３５／２．４０／２３２ＶＵ：はＦ　；　Ｅ２３６／２４１／２３３ＤまタハＫ　、　Ｅ　２３７／２４２／２３４Ｄまたはに；Ｌ２３８／２４３／２３５１またはＴ；Ｙ２３９／２４４／２３６ＦまたはＴ；Ｑ２４０／２４５／２３７Ｎまたはに；に２４１／２４６／２３８ＨまたはＲ，Ｒ２４２／２４７／２３８Ｈまたはに；Ｖ２４３／２４８／２３９　ＬまたはＴ：Ｌ２４４／２４９／２４０＋またはＳ：Ｔ２４５／２５０／２４１ＳまたはＩ　；　１２４６／２５１／２４２ＶまたはＴおよび下２４７／２５２／２４３ＳまたはＩを包含する。特にＨＲＧ−αに関しては、Ｔ２２２Ｓ、ＫまたはＶ、Ｅ２２３Ｄ、ＲまたはＱ；Ｎ２２４ＱＳＫ＊たはＦ；Ｖ２２５Ａ、ＲまたはＤ：　Ｐ２２６Ｇ、Ｉ、ＫまたはＦ　；Ｍ２２７ＶＳＴ、ＲまたはＹ：に２２８Ｒ，ＨまたはＤ；Ｖ２２９ＬＳＫまたはＤ；Ｑ２３ＯＮ、ＲまたはＹ。

Ｎ２３１Ｑ、ＫまたはＹ：Ｑ２３２Ｎ、ＲまたはＹ＋Ｅ２３３Ｄ、ＫまたはＴおよびに２３４ＲＳＨまたはＤ（これに代わる態様において、隣接するに／Ｒ突然変異は対になって新たな蛋白分解部位を作り出している）である。特にＨＲＧ− β（任意の番号）に関しては、Ｑ２２２ＮＳＲまたはＹ、Ｎ２２３Ｑ、ＫまたはＹ：Ｙ２２４Ｆ、Ｔｌ’：ｌ；ｔＲ：Ｖ２２５Ａ、Ｋま７’：ハＤ　；　Ｍ２２６Ｖ、　Ｔ＊タハＲ：Ａ２２７Ｖ、に、Ｙまたはり、５２２８ＴＳＹまたはＲ，Ｆ２２９Ｙ、ＩまたはＫおよび’ｉ’２３０Ｆ、ＴまたはＲが好適な変異体である。特にＨＲＧ−β１に関しては、Ｋ２３１．Ｒまたはり、Ｈ２３２ＲまたはＤ；Ｌ２３３Ｉ、に、ＦまたはＹ；Ｇ２３４Ｐ、Ｒ，ＡまたはＳ；Ｉ２３５Ｉ、Ｋ、ＦまたはＹ：Ｅ２３６Ｄ、ＲまたはＡ；Ｆ２３７＋、Ｙ、ＫまたはＡ；Ｍ２３８Ｖ、”ｒ、ＲまたはＡおよびＥ２３９ＤＳＲまたはＡが好適な変異体である。

特にＨＲＧ−β１およびＨＲＧ−Ｆ２に関しては、Ｋ２３１ＲまたはＤが好適な変異体である。別法として、これらの残基の各々は除去することができ、または示された置換基をそれと隣接して挿入することができる。さらに、約１−１０の変異体を合して組合せが作られる。これらの変更は、プロＨＲＧ、ＮＴＤＳＧＦＤ、ＮＴＤ−ＧＦＤまたはその他のフラグメントもしくは融合に施される。Ｑ２１３−Ｇ２１５、Ａ２１９およびＣ末端からＣ２２１に至る約１１−２１の残基は、種々のＨＲＧクラスの中で異なっている。これらの位置の残基はＨＲＧクラスまたはＥＧＦファミリー成員の間で交換され、除去され、またはこれらと隣接して残基が挿入される。

１以上のアミノ酸が置換されているＨＲＧ−α突然変異体をコードしているＤＮＡは、幾つかの方法のうちの一つによって生成させることができる。もしアミノ酸がポリペプチド鎖の中に接近して位置しているならば、これらは、所望のアミノ１１１　ｆＪｆ　換の全てをコードしている１個のオリゴヌクレオチドを用いて同時に突然変異させることができる。しかしながら、そのアミノ酸が互いに幾らかの距離をおいて位置している（約１０個以上のアミノ酸により隔てられている）場合、所望の変化全てをコードしている単一のオリゴヌクレオチドを生成させることは、より困難である。その代わりに二つの択一的方法のうち一つを使用することができる。

ＰＣＲ突然変異誘発もまたＨＲＧ−αのアミノ酸変異体の製造に好適である。

以下の議論はＤＮＡについてのものであるが、この技術はＲＮＡにも適用を見いだせると理解できる。一般にＰＣＲ技術は以下の手法をさす（エーリッヒ、上記、Ｒ，ヒグチによる章へ、６１−７０頁を参照されたい）。少量の鋳型ＤＮＡがＰＣＲの出発材料として用いられる場合、鋳型ＤＮＡ中の対応領域と僅かに異なる配列のプライマーを使用して、プライマーが鋳型と相違している位置においてのみ鋳型配列と異なっている、特異的ＤＮＡフラグメントを比較的大量に生成させることができる。突然変異をプラスミドＤＮＡに導入するためには、プライマーの一方を、突然変異の位置と部分的に一致し且つその突然変異を含むように設計し：他方のプライマーの配列は、プラスミドの反対側の鎖の−続きの配列と同一でなければならないが、この配列はプラスミドＤＮＡのどこに位置してもよい。しかしながら、第二のプライマーの配列は、最終的にプライマーが境界となっているＤＮＡの増幅された領域全体が容易に配列決定されるよう、第一のプライマーから２００ヌクレオチド以内に位置することが好ましい。ここに記載されたようなプライマー対を使用するＰＣＲ増幅は、鋳型の複製が幾分誤りがちであるため、プライマーにより特定される突然変異の位置において、そして恐らくは他の位置において、異なっているＤＮＡフラグメントの集団を生成させる。

鋳型が生成物を産生ずる比率が極端に低いならば、ＤＮＡフラグメント生成物の大多数は所望の突然変異を含む。この生成物は、標準的ＤＮＡ技術を用いて、ＰＣＲ鋳型として働くプラスミド中の対応領域と置き換えるために使用する。突然変異体第２プライマーの使用、または異なる突然変異体プライマーによる第二のＰＣＲを実施し、得られた二つのＰＣＲフラグメントをベクターフラグメントに三（またはそれ以上）部ライゲーションで同時にライゲーションすることにより、別個の位置における突然変異を同時に導入することができる。

変異体を製造するもう一つの方法、カセット突然変異誘発は、ウェルズ等［ジーン（Ｇｅｎｅ）３４巻３１５頁、１９８５］により記載された技術に基づいている。出発材料は、突然変異すべきＨＲＧ　ＤＮＡを含むプラスミド（または他のベクター）である。突然変異すべきＨＲＧ　ＤＮＡ中のコドンを同定する。同定された突然変異部位の両側には特異な制限エンドヌクレアーゼサイトがなければならない。係る制限サイトが存在しない場合は、これらをＨＲＧＤＮＡ中の適当な位置に導入するための上記のオリゴヌクレオチド仲介突然変異誘発法を使用してそれらを生成することができる。プラスミド中に制限サイトが導入されたなら、そのプラスミドをこれらの部位で切断して線状化する。制限サイトの間のＤＮＡの配列をコードしているが所望の突然変異を含む二本鎖オリゴヌクレオチドを、標準法を用いて合成する。２本の鎖を別個に合成し、次いで標準技術を用いてハイブリダイズする。この二本鎖オリゴヌクレオチドをカセットと称する。このカセットは、プラスミドに直接ライゲーションできるよう、線状化したプラスミドの末端と相客れる３゛および５°末端を持つよう設計する。今やこのプラスミドは、突然変異したＨＲＧ　ＤＮＡ配列を含む。

Ｃ，クローニングまたは発現伝達体へのＤＮＡの挿入。

本来のまたは変異体ＨＲＧをコードしているゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを、さらなるクローニングのため（当該ＤＮＡの増幅）または発現のために複製可能なベクター中に挿入する。多くのベクターが入手可能であって、適当なベクターの選択は、１）それがＤＮＡ増幅のために使用されるのかまたはＤＮＡ発現のために使用されるのか、２）ベクター中に挿入されるべきＤＮＡの大きさ、および、３）ベクターをもって形質転換される宿主細胞、に依存するであろう。各々のベクターは、その機能（ＤＮＡの増幅またはＤＮＡの発現）およびそれが共存し得る宿主細胞に応じて種々の構成因子を含む。一般に、ベクターの構成因子は１またはそれ以上の以下のもの：シグナル配列、複製起点、１またはそれ以上のマーカー遺伝子、エンハンサ−要素、プロモーター、および転写終了配列、を包含するが、これらに限定される訳ではない。

（１）シグナル配列構成因子。

一般に、シグナル配列は、ベクターの構成因子であるか、またはベクター中に挿入されているＨＲＧ　ＤＮＡの一部であってよい。本来のＨＲＧＤＮＡは、ポリペプチドのアミノ末端（ＨＲＧをコードしているＤＮＡの５゛末端）にシグナル配列をコードしており、これがポリペプチドの翻訳後プロセシング中に開裂してｐｌ　８５１１Ｌ：Ｒ２レセプターに結合する成熟ＨＲＧポリペプチドリガンドを形成すると信じられているが、在来のシグナル構造は明らかでない。本来のプロＨＲＧは細胞から分泌されるが膜に留まっているかも知れない。何故ならこれは泥膜ドメインおよび細胞質領域を該ポリペプチドのカルボキシ末端領域に含むからである。したがって、分泌された可溶性型のＨＲＧにおいて、泥膜ドメインを含む、分子のカルボキシ末端ドメインは、通常、除去される。先端の切られた変異体をコートしているＤＮＡが、宿主に認識されるシグナル配列をコードしている限り、この、先端の切られた変異体ＨＲＧポリペプチドは細胞から分泌され得る。

本発明のＨＲＧは、直接発現されるのみならず、ヘテロローガスなポリペプチド、好ましくはシグナル配列との、または、成熟蛋白またはポリペプチドのＮ−および／またはＣ−末端に特異的開裂サイトを有する他のポリペプチドとの融合体として発現され得る。一般に、シグナル配列は、ベクターの構成因子であるか、またはベクター中に挿入されているＨＲＧ　ＤＮＡの一部であってよい。本来のシグナル配列が除去されヘテロローカスなシグナル配列に置き換えられているＨＲＧは、本発明の範囲内に包含される。選択されるヘテロローガスなシグナル配列は、宿生細胞によって認識されプロセシングされる、即ちシグナルペプチダーゼによって開裂される配列であるべきである。本来のＨＲＧシグナル配列を認識およびプロセシングしない前核生物宿主細胞のためには、このシグナル配列を、例えばアルカリホスファターゼ、ペプチダ−ゼ、ｌｐｐ、または熱安定性エンテロトキンシＴＩリーダーの群から選択される前核生物のシグナル配列に置換する。酵母の分泌のためには、本来のＨＲＧシグナル配列は、酵母インベルターゼ、 α因子、または酸ホスファターゼリーダーに置換することができる。哺乳動物細胞の発現においては、本来のシグナル配列でよいが、他の哺乳動物のシグナル配列も適当であるかも知れない。

（１１）複製起点構成因子。

一般に、発現およびクローニングベクターはいずれも、１またはそれ以上の選択された宿生細胞中でのベクターの複製を可能にする核酸配列を含んでいる。一般にクローニングベクターにおいては、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製できるようにする配列であって、複製起点または自律的複製配列を含む。このような配列は、種々の細菌、酵母、およびウィルスについて良く知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は殆どのゲノム陰性菌に好適であり、２μプラスミド起点は酵母に好適であり、そして様々なウィルスの起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウィルス、■ＳＶまたはＢＰＶ）は哺乳動物細胞中でのベクターのクローニングに有用である。一般に、複製起点構成因子は哺乳動物の発現ベクターには必要ない（ＳＶ４０起点が、初期プロモーターを含むという理由のみから典型的に使用され得る）。

殆どの発現ベクターは「シャトル」ベクター、即ち、少なくとも一つのクラスの生物中で複製することができるが、発現のための別の生物にトランスフェクトすることができる。例えば、一つのベクターが大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中でクローニングされ、次いで、これが宿主細胞染色体とは独立して複製することができなくとも、同じベクターが発現のために酵母または哺乳動物細胞にトランスフェクトされる。

ＤＮＡは宿主ゲノム中に挿入することにより増幅することもできる。これは、例えば、バチルスのゲノムＤＮＡに見いだされる配列に対し相補的なりＮＡ配列をベクター中に含むことによって、バチルス種を宿主として使用して容易に達成される。このベクターによるバチルスのトランスフェクトは、該ゲノムとのホモローガスな組み替えおよびＨＲＧ　ＤＮＡの挿入をもたらす。しかしながら、ＨＲＧ　ＤＮＡを切り取るための制限酵素消化が必要であるため、ＨＲＧをコードしているゲノムＤＮＡの回収は、外因的に複製されたベクターの回収より複雑である。ＤＮＡはＰＣＲによって増幅でき、いかなる複製要素をも用いずに宿主細胞中に直接トランスフェクトされ得る。

（ｉｉｉ）選択遺伝子構成因子。

発現およびクローニングベクターは、選択マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含んでいなければならない。この遺伝子は、選択的培地中で増殖する形質転換された宿生細胞の生存または増殖に必要な蛋白をコードしている。選択遺伝子を含むベクターで形質転換されなかった宿主細胞は、この培地中で生存しないであろう。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メソトレキサート、またはテトラサイクリンに対する耐性を付与し、（ｂ）栄養要求性の欠如を補い、または、（ｃ）複合培地から得られない重要な栄養素を供給する蛋白をコードしている遺伝子、例えばバチルスのためのＤ−アラニンラセマーゼをコードしている遺伝子である。

選択計画の一例は、宿主細胞の増殖を阻止する薬物を利用する。ヘテロローガス遺伝子によりうまく形質転換された細胞は、薬物耐性を付与する蛋白を発現し、したがって選択処方中で生き残る。このような主たる選択の例は、ネオマイシン薬物［サザン等、ジャーナル・オン・モレキュラー・アンド・アプライド・ジエネティクス（Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ、）１巻３２７頁、１９８２］、ミコフェノール酸［ミュリガン等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２０９巻１４２２頁、１９８０］またはハイグロマイシン［サグデン等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅｌ　１．Ｂｊｏｌ、）５巻、４１０−４１３頁、１９８５］を使用する。上に挙げた三つの例は、それぞれ適当な薬物Ｇ４１８またはネオマイシン（ジエネティシン）、ｘｇｐｔ　（ミコフェノール酸）、またはハイグロマイシンに対する耐性を運ぶために、真核生物の制御の下で細菌遺伝子を使用する。

哺乳動物細胞のための好適な選択マーカーのもう一つの例は、ＨＲＧ核酸を取り上げる能力のある細胞を同定することのできるマーカー、例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはチミジンキナーゼである。哺乳動物細胞形質転換体を、その形質転換体のみが該マーカーを取り上げたが故に特異な生存への適合をする、選択圧の下におく。選択圧は、培地中の選択薬物の濃度を連続的に変え、それにより選択遺伝子およびＨＲＧをコードしているＤＮＡの両者の増幅が導かれる条件の下で形質転換体を培養することによって負荷する。増幅とは、増殖のために決定的な蛋白の産生にとって、より要求性の高い遺伝子を、組み替え細胞の連続する世代の染色体内で縦列に反復する工程である。増幅したＤＮＡからは増加した量のＨＲＧが合成される。

例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子により形質転換された細胞は、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニスト、メソトレキサート（Ｍｔｘ）を含有する培地中で全形質転換体を培養することにより、まず同定される。野生型ＤＨＦＲを使用する場合の適当な宿主細胞は、ウアラウブおよびチェイシン、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７７巻４２１６頁、１９８０による記載のように製造され増殖される、ＤＨＦＲ活性の欠如したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞セルラインである。次に、形質転換細胞を増加したレベルのメソトレキサートに暴露する。これにより、ＤＨＦＲ遺伝子の多数のコピーが合成され、同時に発現ベクターを含む他のＤＮＡ、例えばＨＲＧをコードしているＤＮＡの多数のコピーが合成される。この増幅技術は、例えばＭｔｘに対し耐性の高い突然変異体ＤＨＦＲ遺伝子が使用されるならば、内性ＤＨＦＲの存在にも拘らず、他の点で適当な任意の宿主、例えばＡＴＣＣＮｏ、ＣＣＬ６１　ＣＨＯ−Ｋｌを用いて使用することができる（ＥＰ１１７０６０号）。別法として、ＨＲＧ、野生型ＤＨＦＲ蛋白、およびアミノグリコシド３°ホスホトランスフエラーゼ（ＡＰＨ）のような他の選択マーカーをコードしているＤＮＡ配列で形質転換または同時形質転換した宿主細胞（特に、内性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）は、アミノグリコノド抗生物質、例えばカナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８のような選択マーカーのための選択薬物を含有する培地中で細胞を増殖させることによって選択することができる（米国特許第４９６５１９９号を参照されたしり。

酵母における使用に好適な選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐｌ遺伝子である［ステインチコウム等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２８２巻３９頁、１９７９　；キングズマン等、シーン（Ｇｅｎｅ）７巻１４１頁、１９７９、またはチェンバー等、シーン（Ｇｅｎｅ）１０巻１５７頁、１９８０］。

ｔ　ｒｐｌ遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣＮｏ、４４０７６またはＰＥＰ４−１のための選択マーカーを提供する［ジョーンズ、ジエネティクス（Ｇｅｎｅｔ　ｊｃｓ）８５巻１２頁、１９７７］。次いて、酵母宿主細胞ゲノム中のｔｒｐｌ損傷の存在が、トリプトファンの不在下で増殖させることによる形質転換の検出のための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２−欠損酵母菌株（ＡＴＣＣ２０６２２または３８６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって完全なものとなる。

（ｉｖ）プロモーター構成因子発現およびクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され且っＨＲＧ核酸と操作可能に連結したプロモーターを含む。プロモーターは、構造遺伝子の出発コドンの上流（５゛）に位置する非翻訳配列であって（一般に約１００ないし１０００ｂｐ以内）、特定の核酸配列、例えばそれらが操作可能に連結しているＨＲＧの転写および翻訳を制御する。このようなプロモーターは典型的に二つのクラス、誘導的および構成的クラスに分けられる。誘導的プロモーターは、培養条件における幾らかの変化、例えば成る栄養素の存在もしくは不在または温度の変化に応答して、それらの制御の下に、ＤＮＡからの増加したレベルの転写を開始させるプロモーターである。現時点において、種々の可能性ある宿主細胞により認識される数多くのプロモーターが良く知られている。これらのプロモーターは、制限酵素消化により供給源のＤＮＡからプロモーターをはずし、分離したプロモーター配列をベクター中に挿入することによって、ＨＲＧをコードしているＤＮＡと操作可能に連結する。本来のＨＲＧプロモーター配列および多くのへテロローガスプロモーターのいずれも、ＨＲＧ　ＤＮＡの増幅および／または発現の指令に用いることができる。しかしながら、ヘテロローガスなプロモーターは一般に、本来のＨＲＧプロモーターに比べ、より多くの転写および高収量の発現ＨＲＧをもたらすため、ヘテロローガスなプロモーターが好ましい。

前核生物の宿主との使用に好適なプロモーターは、β−ラクタマーゼおよび乳糖プロモーター系［チャンク等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２７５巻６１５頁、１９７８；およびゲラデル等、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）２８１巻５４４頁、１９７９］、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［ゲラデル、ヌクレイツク・アンズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、）８巻４０５７頁、１９８０およびＥＰ３６７７６号］およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーター［デポーア等、プロンーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）８０巻２１−２５頁、１９８３］を包含する。しかしながら他の知られる細菌のプロモーターも適当である。それらのヌクレオチド配列は公表されており、それにより当業者は、必要な任意の制限サイトを供給するためのリンカ−またはアダプターを用いてＨＲＧをコードしティるＤＮＡにそれらを操作可能に連結することができる［シーベンリスト等、セル（Ｃｅ　ｌ　］）２２０２２６９頁１９８０］。細菌系での使用のためのプロモーターもまた一般に、ＨＲＧをコードしているＤＮＡに操作可能に連結したンヤインーダルガーノ（Ｓ、　Ｄ、　）配列を含むであろう。

酵母宿主との使用のために好適なプロモーター配列は、３−ホスホグリセラードキナーゼのためのプロモーター［ヒッツェマン等、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５５巻２０７３頁、１９８０］または他の解糖酵素［ヘス等、Ｊ、Ａｄｖ、Ｅｎ、ｚｙｍｅ　Ｒｅｇ、、７巻１４９頁、１９６８　；およびホラノド、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）１．７巻４９００頁、１９７８コ、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキンラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−燐酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセラードムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオース燐酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼを包含する。

増殖条件により制御される転写のさらなる利点を有する誘導プロモーターである、その他の酵母プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ１酸ホスフアターゼ、窒素の代謝に関係する分解的酵素、メタロチオネン、グリセルアルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、および、マルトースおよびガラクトースの利用を司る酵素類のプロモーター領域である。酵母の発現における使用に好適なベクターおよびプロモーターは、ヒッツェマン等、ＥＰ７３６５７Ａ号にさらに記載されている酵母エンハンサ−もまた酵母プロモーターと共に有利に使用される。

真核生物のためのプロモーターは既知である。事実、全ての真核生物の遺伝子は、転写の開始位置からおよそ２５ないし３０塩基上流に位置するＡＴに富む領域を有する。多くの遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見いだされるもう一つの配列はＣＸＣＡＡＴ　（配列番号１）［ここでＸは任意のヌクレオチドである］領域である。殆どの真核生物遺伝子の３′末端には、コード化配列の３°末端にポリＡ尾を付加するシグナルとなり得るＡＡＴＡＡＡ配列（配列番号２）がある。これらの配列は全て哺乳動物の発現ベクター中に適切に挿入される。

哺乳動物の宿生細胞におけるベクターからのＨＲＧ遺伝子の転写は、プロモーターが宿主細胞系と共存し得るならば、ポリオーマウィルス、鶏痘ウィルス（英国２２１．１５０４号、１９８９年７月５日公開）、アデノウィルス（例えばアデノウィルス２）、ウソ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、そして最も好ましくはシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のようなウィルスのゲノムから取得されるプロモーター、ヘテロローカスな哺乳動物のプロモーター、例えばアクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーターから取得されるプロモーター、熱衝撃プロモーターから取得されるプロモーター、そしてＨＲＧ配列に通常付随するプロモーターから取得されるプロモーターによって制御される。

５Ｖ４Ｑウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０制限フラグメントとして簡便に得られ、これはＳＶ４０ウィルスの複製起点をも含んでいる［フィアズ等、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）２７３巻１１３頁（１９７８）；ミュリガンおよびバーブ、サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）２０９巻１４２２−１４２７頁（１９８０）；バブラキス等、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７８巻７３９８−７４０２頁（１９８１）］。ヒトサイトメガロウィルスの即時型プロモーターはＨｉｎｄＩＩＩ　Ｅ制限フラグメントとして簡便に得られる［ブリーナラエイ等、シーン（Ｇｅｎｅ）１８巻３５５−３６０頁（１９８２）］。ベクターとしてウシ乳頭腫ウィルスを用いる哺乳動物中でＤＮＡを発現するための系は、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の修飾は米国特許第４６０１．９７８号に記載されている。サルの細胞における免疫インターフェロンをコードしているｃＤＮＡの発現に関する、グレイ等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９５巻５０３−５０８頁（１９８２）；ヘルペス・シンプレックスウィルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの制御の下での、マウス細胞におけるヒトβ−インターフェロンｃＤＮＡの発現に関する、レイニス等、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）２９７巻５９８−６０１頁（１９８２）；培養されたマウスおよびウサギの細胞におけるヒトインターフェロンβ １遺伝子の発現に関する、キャナー二およびバーブ、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ）７９巻５１６６−５１７０頁（１９８２）：および、プロモーターとしてラウス肉腫ウィルスの長末端反復を用いる、ｃｖ−ｉサル腎臓細胞、ニワトリの胚繊維芽細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ヒーラ細胞、およびマウスＮＩＨ−３Ｔ３細胞における細菌性ＣＡＴ配列の発現に関する、ゴーマン等、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエン／ズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７９巻６７７７−６７８１頁（１９８２）をさらに参照されたい。

（１・）エンハンサ−要素構成因子。

高等真核生物による本発明のＨＲＧをコードしているＤＮＡの転写は、エンハンサ−配列をベクター中に挿入することにより、しばしば増強する。エンハンサ− は、プロモーターに作用してその転写を増強する、通常的１Ｏ−３００ｂｐの、ＤＮＡのンス作用要素である。エンハンサ−は、方向および位置に比較的独立しており、イントロン内［バネルシ等、セル（Ｃｅ　ｌ　Ｉ）３３巻７２９頁、１９８３］およびコード化配列自身の中［オスポーン等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ、）４巻１２９３頁、１９８４］の、転写ユニットに対し３゛［ラスキー等、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏ、）３巻１１０８頁、１９８３］および５゛［ライミン等、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ−ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　］、Ａｃａｄ、Ｓｃｊ、ＵＳＡ）７８巻９９３頁（１９８１）に見いだされている。現在、哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサ−配列が知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロティンおよびインシュリン）。しかしながら、典型的には真核生物細胞ウィルス由来のエンハンサ−が使用される。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサ−（ｂｐｌｏｏ−２７０）　、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサ−１複製起点の後期側のポリオーマエンハンサ−１および真核生物プロモーターの活性化のための促進要素上のアデノウィルスエンハンサ−類［ヤニブ、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）２９７巻、１７−１８頁（１９８２）をも参照されたい）が包含される。エンハンサ−は、ＨＲＧ　ＤＮＡに対シて５゛または３゛位においてベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５゛位に位置させる。

（ｖｉ）転写終了構成因子。

真核生物の宿生細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、またはその他の多細胞生物由来の、有核細胞）に使用される発現ベクターは、さらに、転写の終了およびｍＲＮＡの安定化のために必要な配列を含む。このような配列は一般に、真核生物のまたはウィルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５°および時に３゛非翻訳領域から得られる。これらの領域は、ＨＲＧをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分中のポリアデニル化フラグメントとして転写されるヌクレオチド部分を含む。

この３′非翻訳領域は、さらに、転写終了サイトを含む。

１またはそれ以上の上に列挙される構成因子、ならびに所望のコード化および調節配列を含む適当なベクターの組み立てには、標準的ライゲーション技術を用いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを開裂し、調製し、そして必要なプラスミドの生成に望ましい型に再ライゲーションする。

組み立てられたプラスミド中の配列が正しいことを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いてＥ、ｃｏｌｉＫ１２菌株２９４　（ＡＴＣＣ３１４４６）を形質転換し、成功した形質転換体を、アンピシリンまたはテトラサイクリン耐性により、適宜選択する。この形質転換体がらのプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、モして／または、メリック等、ヌクレイツク・アシズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）９巻３０９頁（１９８１）の方法またはマクサム等、メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）６５巻４９９頁（１９８０）の方法によって配列決定する。

本発明の実施において特に有用なのは、ＨＲＧをコードしているＤＮＡを哺乳動物細胞において一時的に発現させる発現ベクターである。一般に、一時的な発現とは、宿生細胞が発現ベクターのコピーを多数蓄積し、次いで該発現ベクターによりコードされている所望ポリペプチドを高レベルで合成するような、宿主細胞中で効率的に複製可能な発現ベクターの使用を含む。適当な発現ベクターと宿生細胞からなる一時的発現系は、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便な正の同定、および、所望の生物学的または生理学的性質についての該ポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一時的発現系は、ＨＲＧ様活性を有するＨＲＧの類似体および変異体を同定する目的のために、本発明において特に有用である。このような一時的発現系はＥＰ３０９２３７号（１９８９年３月２９日公開）に記載されている。組み替えを椎動物細胞培養におけるＨＲＧの合成−・の適合に好適な、その他の方法、ベクター、および宿生細胞は、ギーシング等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）２９３巻、６２０−６２５頁、１９８１：マンティ等、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）２８１巻、４０−４６頁、１９７９　；レビンソン等、ＥＰ１１７０６０号およびＥＰ１１７０５８号に記載されている。ＨＲＧの哺乳動物細胞培養での発現に特に有用な発現プラスミドはｐＲＫ５である（ＥＰ公開Ｎｏ、３０７２４７号）。

Ｄ　宿主細胞の選択および形質転換。

本明細書中のベクターをクローニングまたは発現するために好適な宿主細胞は、上に記載した前核生物、酵母、または高等真核生物細胞である。好適な前核生物は、グラム陰性またはダラム陽性菌のような真性細菌、例えば大腸菌（Ｅ、ｃ。

１ｉ）、Ｂ、サブティリスのようなバチルス、Ｐ、アエルギノーサのようなンユードモナス種、サルモネラ・ティフィムリウム、またはセラティア・マルセセンスを包含する。一つの好ましい大腸菌のクローニング宿主はＥ、ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１４４６）であるが、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｂ、Ｅ、ｃｏｌｉ　ｍ１７７６　（ＡＴＣＣ３１５３７）　、およびＥ、ｃｏｌｉ　Ｗ３１１０　（ＡＴＣＣ２７３２５）のようなその他の菌株もまた適当である。これらの例は限定的ではなく例示的なものである。好ましくは、宿主細胞は、最少量の蛋白分解酵素を分泌する。

別法としてインビトロのクローニング法、例えばＰＣＲまたは他の核酸ポリメラーゼ反応が適当である。

前核生物に加えて、糸状菌または酵母のような真核微生物がＨＲＧコード化ベクターに好適な宿主である。下等な真核宿主微生物の中ではサツカロミセス・セレビンアエ、または通常のパン酵母が最も普通に用いられる。しかしながら、その他の数多くの属、種、および菌株、例えば、ノゾサッカロミセス・ボンベ［ビーチおよびナース、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）２９０巻１４０頁（１９８１）：ＥＰ１３９３８３号（１９８５年５月２日公開）コ、クルイベロミセス宿主［ＵＳ、Ｓ、Ｎ、４９４３５２９号］、例えばに、ラクティス［ローベンコート等、ジャーナル・オン・バクテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、）７３７巻（１９８３）］　：Ｋ　フラギリス、Ｋ、ブルガリクス、Ｋ、サーモトレランス、およびに、マルキシアヌス、ヤロウィア［Ｅ　Ｐ　４０２２２６号コ　：ビチア・パストリス［ＥＰ１８３０７０号］、スリークリシュナ等、ジャーナル・オン・ペイシック・マイク０／＜イオロシー（Ｊ、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）２８巻２６５−２７８頁（１９８８）；カンジダ、トリコデルマ・ジーシア［ＥＰ２４４２３４号］　：ニューロスポラ・クラシア［ケイス等、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７６巻５２５９−５２６３頁（１９７９）、および糸状菌、例えばニューロスポラ、ペニシリウム、トリポフラジラム［ＷＯ９１１００３５７号、１９９１年１月１０日公開］、およびアスペルギルス宿主、例えばＡ、ニドゥランス［バランス等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、）１１２巻２８４−２８９頁（１９８３）；ティルバム等、ジー＞　（Ｇｅｎｅ）２６巻２０５−２２１頁（１９８３）；イニルトン等、プロノーディングズ・オン・す・ナショナル・アカデミ− ・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、］、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）８１巻１４７０−１４７４頁（１９８４）およびＡ、二カー［ケリーおよびハイネス、イーエムビーオー・ツヤ−ナル（ＥＭＢＯＪ）４巻４７５−４７９頁（１９８５）］が、一般に入手でき、本明細書中で使用される。

グリコジル化ＨＲＧポリペプチドの発現に好適な宿主細胞は多細胞生物から誘導される。このような宿主細胞は、複雑なプロセシングおよびグリコリル化作用を行なうことができる。原則として、を椎動物の培養由来であるか無を椎動物の培養由来であるかに拘らず、任意の高等真核生物の細胞培養が使用可能である。

無を椎動物細胞の例は、植物および昆虫細胞を包含する。多数のバキュロウィルス株および変異体ならびに、スポドプテラ・フルキベルダ（毛虫）、アエデス・アエギブティ（蚊）、アエデス・アルボピクトウス（蚊）、ドゥロソフィラ・メラノカスター（ノヨウンヨウハエ）およびボンビクス・そり宿主細胞のような宿主由来の、対応する許容し得る昆虫宿主細胞が同定されている［例えば、ラッコウ等、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ’）６巻４７−５５頁（１９８８）：ミラー等、ジェネティック・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、Ｊ、Ｋ　セットロウ等線、８巻（プレナム出版、１９８６）、２７’ｌ−２７９頁、およびマエダ等、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３１５巻５９２−５９４頁（１９８５）］。例えばオートグラファ・カリフォルニカＮ　Ｐ　ＶのＬ−１変異体およびホンビクス・そりＮＰＶのＢｍ−５株のような、様々なこれらウィルス株が一般に入手可能であり、また、特にスポドプテラ・フルキペルダ細胞のトランスフェクトのために、本発明に係るようなウィルスを使用することがてきる。綿、トウモロコン、ンヤカイモ、大豆、ペチュニア、トマト、およびタバコの植物細胞培養が、宿主として利用できる。典型的には、植物細胞は、前もってＨＲＧ　ＤＮＡを含むよう操作しておいた細菌アグロバクテリウム・トウメファノエンスの成る株と共にインキュベーションすることにより、トランスフェクトする。Ａ、トウメファシエンスと共に植物細胞培養をインキユヘーノヨンする間にＨＲＧをコートしているＤＮＡはこの植物細胞に移され、その結果それはトランスフェクトされ、そして適当な条件の下でＨＲＧ　ＤＮＡを発現する。さらに、ノバリンンンターゼブロモーターおよびポリアデニル化ノグナル配列といったような、植物細胞と両立し得る調節およびシグナル配列が入手できる［デピッカー等、ジャーナル・オン・モレキュラー・アンド・アプライド・ジエネティクス（Ｊ、Ｍｏ１．Ａｌ）り］、Ｇｅｎ、）１巻５６１頁（１９８２）コ。さらに、Ｔ−ＤＮＡ７８０遺伝子の上流領域から単離されるＤＮＡセグメントは、組み替えＤＮＡ含有植物組織において、植物中で発現可能な遺伝子の転写レベルを増強またはこれを活性化することができる［ＥＰ３２１１９６号（１９８９年６月２１日公開）を参照されたい］。

しかしながら、を椎動物細胞における関心が最も太き（、培養中（組織培養）てのを椎動物細胞の増殖は、近年常套的方法となっている［ティシュ−・カルチャー、アカデミツク・プレス、クルーズおよびパダーリン編（１９７３）］。有用な哺乳動物宿主セルラインの例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓Ｃ■ １ライン（ＣＯ８−７、ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）；ヒト胚腎臓ライン（懸濁液培養における増殖のためにサブクローニングされた２９３または２９３細胞、グラハム等、ジャーナル・オン・ジェネラル・パイロロジー（Ｊ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｂ、）３６巻５９頁、１９７７）：新生児ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、、ＡＴＣＣＣＣＬＩＯ）：チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ。

ウアラウブおよびチェイシン、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　］、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７７巻４２１６頁（１９８０）　）；マウスのセルトリ細胞（ＴＭ４、マザー、バイオロジー・オン・レプロダクション（Ｂｉｏｌ、Ｒｅｐｒｏｄ、）２３巻２４３−２５１頁（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶＩ　ＡＴＣＣＣＣｌ７０）；７７リカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣＣＲＬ１５８７）；ヒト子宮頚癌腫細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣＣＣｌ２）：イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣＣＣｌ３４）：バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣＣＣｌ７５）：ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ　Ｇ２、ＨＢ８０６５）ニアウス乳房腫瘍（ＭＭＴ　０６０５６２、ＡＴＣＣＣＣｌ５１）；ＴＲＩ細胞［マザー等、アナパス・オン・ザ・ニューヨーク・アカデミ−・オン・サイエンシズ（ＡｎｎａｌｓＮ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）３８３巻４４−６８頁（１９８２）］　：ＭＲＣ５細胞：ＦＳ４細胞、およびヒト肝癌セルライン（Ｈｅｐ　Ｇ２）である。好ましい宿主細胞は、ヒト胚腎臓２９３およびチャイニーズハムスター卵巣細胞である。

宿主細胞を、本発明に係る上記の発現またはクローニングベクターによりトランスフェクトし、そして好ましくは形質転換し、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望配列をコードしている遺伝子の増幅のために、適宜修飾された常套的栄養培地中で培養する。

トランスフェクトとは、任意のコード化配列が実際に発現されるか否かに拘らず、宿主細胞によって発現ベクターが取り込まれることを意味する。数多（のトランスフェクション法、例えばＣａＰＯ４および電気穿孔が当業者に知られている。このベクターの作用の任意の指令が宿主細胞中で行なわれる時に、一般にトランスフェクトの成功が認められる。

形質転換とは、ＤＮＡが成る生物中に導入され、その結果このＤＮＡが、染色体外要素として、または染色体統合によって複製可能となることを意味する。使用される宿生細胞に応じて、形質転換は、係る細胞に適した標準技術を用いて行なわれる。サムプルツク等、上記、の１８２節に記載される、塩化カルシウムを使用するカルシウム処理は、一般に、前核生物または実質的細胞壁障壁を含んでいるその他の細胞に使用される。ンヤウ等、ジーン（Ｇｅｎｅ）２３巻３１５頁（１９８３）およびＷＯ３９１０５８５９号（１９８９年６月２９日公開）に記載されるように、アグロバクテリウム・トウメファシエンスによる感染は、成る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁の無い哺乳動物細胞に対しては、サムプルツク等、上記、の１６．３０−１６．３７節に記載の燐酸カルシウム沈澱法が好ましい。哺乳動物細胞宿生系形質転換の一般的局面は、アキセルによる米国特許第４３９９２１６号（１９８３年８月１６日登録）に記載されている。酵母の形質転換は、典型的には、パン・ゾーリンゲン等、ジャーナル・オン・バタテリオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔ、）１３０巻９４６頁（１９７７）およびンヤオ等、プロンーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（ＵＳＡ）（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（ＵＳＡ））７６巻３８２９頁（１９７９）の方法に従って実施する。しがしながら、核注入、電気穿孔、またはプロトプラスト融合のような、細胞中にＤＮＡを導入するその他の方法もまた使用することができる。

Ｅ　宿生細胞の培養。

本発明に係るＨＲＧポリペプチドの産生に用いられる前核生物細胞は、サムプルツク等、上記、に概説される適当な培地中で培養する。

本発明に係るＨＲＧの産生に用いられる哺乳動物宿主細胞は、様々な培地中で培養することができる。ハムＦ１０（シグマ）、最少必須培地（［ＭＥＭ］　、シグマ）、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ）、およびダルベツコの改良イーグル培地（［ＤＭＥＭ］　、シグマ）のような市販の培地が、この宿主細胞の培養に適当である。これに加えて、ハムおよびクラス、メソッズ・イン・エンザイモロジ− （Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚ、）５８巻４４頁（１９７９Ｌベイムスおよびサトー、アナリティカル＋／＜イオケミストリ−（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１０２巻２５５頁（１９８０）、米国特許第４７６７７０４号；４６５７８６６号；４９２７７６２号：または４５６０６５５号、ＷＯ９０１０３４３０号、ＷＯ３７１００１９５号および米国特許Ｒｅ３０９８５に記載される任意の培地を、宿主細胞のための培地として使用することができる。これらの培地はいずれも、必要に応じて、ホルモン類および／または他の成長因子（例えばインシュリン、トランスフェリン、または表皮成長因子）、塩類（例えば塩化ナトリウム、カルシウム、マグネ７ウム、および燐酸塩）、緩衝剤（例えばＨＥＰＥＳ）　、ヌクレオシド（例えばアデノンンおよびチミジン）、抗生物質（例えばゲンタミシン（商標）薬物）、微量元素（通常、最終濃度においてマイクロモル範囲で存在する無機化合物として定義される）、およびグルコースまたは同等のエネルギー源を添加することができる。その他の必要な添加物があればそれも、当業者に知られる適当な濃度で含有させることができる。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿生細胞についてかつて採用された条件であり、当業者には明らかであろう。

本開示中言及される宿主細胞とは、インビトロの培養における細胞および宿主動物内にある細胞を包含する。

本発明のＨＲＧは、ホモローガスな組み替えによって、または、当分野で現在使用されている、ＨＲＧをコードしているＤＮＡを既に含む細胞中に導入された調節要素を利用する組み替え産生法によって、産生されるということが、さらに認識される。例えば、強力なプロモーター／エンハンサ−要素、サプレッサー、または外因性転写調節要素が、意図される宿主細胞のゲノム中に、所望ＨＲＧをコードしているＤＮＡの転写に影響を及ぼすに充分な近さおよび方向で挿入される。調節要素は本発明に係るＨＲＧをコードしていないが、このＤＮＡは宿主細胞ゲノム中に存在する。次に、所望に応じて、本発明のＨＲＧを作る細胞、または増強したもしくは低下したレベルの発現をスクリーニングする。

Ｆ　遺伝子の増幅／発現の検出試料中の遺伝子の増幅および／または発瑠は、例えば本明細書に記載される配列に基づく適当に標識されたプローブを使用して、常套的サザンブロッティング、ｍＲＮＡの転写を定量するノーサンブロッティング［トマス、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ（Ｐｒ。

ｃ、Ｎａｔ　］、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７７巻５２０１−５２０５頁（１９８０）］、ドツトブロッティング（ＤＮＡ分析）またはインサイトウハイブリダイゼーションによって、直接試料を測定することができる。様々な標識が使用でき、最も普通には放射性同位元素、特に３２ｐを使用することができる。しかしながら、ポリヌクレオチド中に導入するためのビオチン修飾ヌクレオチドを使用するといったような、他の技術を使用することもできる。その場合ビオチンは、放射性核種、蛍光剤、酵素等のような極めて様々な標識で標識することのできる、抗生物質またはアビジンと結合する部位としての役割を有する。これとは別に、ＤＮＡ二重らせん、ＲＮＡ二重らせん、およびＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重らせんまたはＤＮＡ−蛋白二重らせんを包含する特異的な二重らせんを認識することのできる抗体を使用することができる。次いで抗体を標識し、二重らせんが表面に結合している場合は検定が実施でき、その結果、表面に二重らせんが形成されると、二重らせんに結合した抗体の存在が検出できる。

別法として、遺伝子の発現は、免疫学的方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色、および、遺伝子産物の発現を直接定量するための細胞培養または体液の検定によって測定することができる。免疫組織化学的染色技術については、典型的には脱水および固定によって細胞試料を調製し、その後、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識された抗体と反応させる（この場合、標識は通常目視検出できる、例えば酵素的標識、蛍光標識、ルミネセンス標識等である）。本発明における使用のために好適な特に感受性の高い染色技術は、シュー等、アメリカン・ジャーナル・オン・クリニカル・パソロジ−（Ａｍ、Ｊ、ＣＩ　ｉｎ、Ｐａｔｈ、）７５巻７３４−７３８頁（１９８０）により記載されている。

試料流体の免疫組織化学的染色および／または検定に有用な抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれであってもよく、任意の哺乳動物において作製することができる。簡便には、この抗体は、本来のＨＲＧポリペプチドに対して、または下記の４項にさらに記載されるような本明細書中に供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して作製することができる。

Ｇ、ヘレグリンポリペプチドの精製。

ＨＲＧは、細胞の膜画分から回収する。別法として、蛋白分解的開裂をしたまたは先端の切られた発現された可溶性ＨＲＧフラグメントまたはサブドメインを、可溶性ポリペプチドとして培地から回収する。

ＨＲＧがヒト起源ではない組み替え細胞中で発現される場合、ＨＲＧはヒト起源の蛋白またはポリペプチドを全く含まない。しかしながら、ＨＲＧに関して実質上等質な調製物を得るために、組み替え細胞蛋白またはポリペプチドからＨＲＧを精製することが望ましい。第一段階として、培地または溶菌液を遠心して粒状の細胞断片を除去する。次いで膜および可溶性蛋白の両分を分離する。次にＨＲＧが膜に結合しているか否かに応じて、ＨＲＧを、培養溶菌液の可溶性蛋白画分（プロテアーゼの存在を必要とする）および膜画分の両者から精製する。以下の手法が、好適な精製法の例である・免疫親和またはイオン交換カラム上での分画；エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣニジリカ、ヘパリン、セファロース上、またｆｔＤＥＡＥのような陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィー：クロマトフオーカシング、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　、硫酸アンモニウム沈澱；および、例えばセファデックスＧ−７５を用いるゲル濾過。

残基が除去され、挿入され、または置換されているＨＲＧ変異体は、その変異によって引き起こされた性質の上での実質的な変化を考慮に入れて、本来のＨＲＧと同じやり方で回収する。例えば、別の蛋白またはポリペプチド、例えば細菌のまたはウィルスの抗原とのＨＲＧ融合の調製物は、精製を促進し、該抗原に対する抗体を含む免疫親和カラムを使用して、この融合を吸着することができる。

ウサギポリクローナル抗ＨＲＧカラムのような免疫親和カラムを使用して、これを少なくとも一つの残っている免疫エピトープに結合させることにより、ＨＲＧ変異体を吸収させることができる。フェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）のようなプロテアーゼ阻害剤もまた、精製中の蛋白分解的減成の阻害に有用であり、また、偶発的汚染物質の増殖を防止するため抗生物質を含有させることができる。本来のＨＲＧに対し好適な精製法は、組み替え細胞培養中で発現される時のＨＲＧ変異体の性質の変化を考慮に入れた修飾を必要とすることがあるということが、当業者には理解できるであろう。

Ｈ，ＨＲＧの共有結合的修飾。

本発明の範囲にはＨＲＧポリペプチドの共有結合的修飾が含まれる。本来のＨＲＧおよびＨＲＧのアミノ酸配列変異体はいずれも所望により共有結合的に修飾される。本発明の範囲内に包含される共有結合的修飾の一つの型は、ＨＲＧポリペプチドフラグメントである。約４０までのアミノ酸残基を有するＨＲＧ−ＧＤＦのようなＨＲＧフラグメントは、化学合成によって、または全長ＨＲＧポリペプチドもしくはＨＲＧ変異体ポリペプチドの酵素的もしくは化学的開裂によって簡便に製造される。池の型のＨＲＧまたはそのフラグメントの共有結合的修飾は、ＨＲＧまたはそのフラグメントの標的アミノ酸残基を、選ばれた側鎖またはＮ− もしくはＣ−末端残基と反応することのできる有機合成試薬と反応させることによって、該分子中に導入する。

システィン残基は一般的にはクロロ酢酸またはクロロアセトアミドのようなα− ハロアセタート（および対応するアミン類）と反応させてカルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。システィン残基はさらにプロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドジイル）プロピオン酸、クロロアセチルホスファート、Ｎ−アルキルマレイミド類、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル　２−ピリジル　ジスルフィド、ｐ−クロロ水銀安息香酸、２−クロロ水銀−４−二トロフェノール、またはクロロ−７−ニドロベンゾー２−オキソ−１，３−ジアゾールと反応させることにより、誘導体化される。

ジエチルピロカルボナートはヒスチジン側鎖に対して比較的特異的であるため、ヒスチジン残基はｐＨ５，５−７，０においてこの試薬と反応させることにより誘導体化される。ｐ−ブロモフェナシルプロミドもまた有用であって、この反応は好ましくはｐＨ６，０においてＯ，１Ｍカコジル酸ナトリウム中で実施する。

リシン残基およびアミノ末端残基は、無水コハク酸またはその他の無水カルボン酸と反応する。これらの試薬による誘導体形成は、リジン残基の電荷を逆転させる効果を有する。α−アミノを含む残基を誘導体化するその他の適当な試薬は、メチル　ビコリンイミダートのようなイミドエステル類ニリン酸ピリドキサル；クロロポロヒドリドニトリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソ尿素；２゜４−ペンタンジオン、およびトランスアミナーゼ触媒によるグリオキシラードとの反応を包含する。

アルギニン残基は１または幾つかの常套的試薬との反応により修飾されるが、その中には、フェニルグリオキサル、２．３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンがある。アルギニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫａの故に、反応がアルカリ条件下で行なわれることが必要である。さらに、これらの試薬は、アルギニンのε−アミノ基と共にリジン基とも反応し得る。

芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応により、チロシン残基中にスペクトル標識を導入する、特に興味深い、チロシン残基の特異的修飾を行なうことができる。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを使用して、各々０−アセチルチロシル化合物および３−ニトロ誘導体を形成させる。チロシン残基は１２５Ｉまたは１３１１を用いてヨウ素化して、ラジオイムノアッセイに使用するための標識された蛋白を製造するが、上記のクロラミンＴ法が好適である。

側鎖力ルホキン基（アスパラギン酸またはグルタミン酸）は、１−シクロへキンルー３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル− ３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドのようなカルボッイミド類（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’　［式中ＲおよびＲ゛は異なったアルキル基である］）との反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパラギン酸およびグルタミン酸残基は、アンモニウムイオンとの反応によりアスパラギンおよびグルタミン残基に変換される。

二価の試薬による誘導体化は、抗ＨＲＧ抗体の精製法に使用するための、水不溶性支持体マトリックスまたはその表面へのＨＲＧの架橋およびその逆を行なうのに有用である。一般に用いられる架橋試薬は、例えば１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル類、例えば４−アジドサリチル酸、３，３゛−ジチオビス（スクノンイミノルブロピオナート）のようなジスクシンイミジルエステル類を包含するホモ二価イミドエステル類、および、ビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二価マレイミド類を包含する。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ノチオ］ブロピオイミダートのような誘導体化試薬は、光の存在下で架橋を形成することのできる光活性化可能な中間体を生成する。別法として、米国特許第３９６９２８７号、３６９１０１６号；４１９５１２８号；４２４７６４２号；４２２９５３７号：および４３３０４４０号に記載される臭化ジアゾ活性化炭水化物のような反応性水不溶性マトリックスおよび反応性基質を、蛋白の固定化に使用する。

グルタミンおよびアスパラギン残基はしばしば各々対応するグルタミン酸およびアスパラキン酸残基に脱アミド化される。別法として、これらの残基は緩和な酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの型も本発明の範囲内にある。

その他の修飾には、プロリンおよびリジンのヒドロキシ化、セリンまたはスレオニン残基のヒドロキシ基の燐酸化、リジン、アルギニン、およびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化［Ｔ、Ｅ、クレイトン、プロテインズ：ストラクチャー・アンド・モレキュラー・プロテアーゼ（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）、Ｗ、Ｈ，フリーマン・アンド・Ｃｏ、、サンフラッジスコ、７９−８６頁（１９８３）］　、Ｎ末端アミンのアセチル化、および、任意のＣ末端カルボキン基のアミド化が包含される。

ＨＲＧは所望によりＨＲＧに対しヘテロローガスなポリペプチドと融合させる。

このヘテロローカスなポリペプチドは、所望により、腐敗加速系（ＤＡＦ）に見いだされるような固定配列、即ちリシンのような毒素、シュードモナスエキソトキシン、ゲロニン、または標的細胞に死をもたらすその他のポリペプチドである。

これらのヘテロローカスなポリペプチドは、側鎖を介してまたは末端残基を介してＨＲＧと共有結合している。同様に、ＨＲＧは、哺乳動物の標的細胞に対して毒性のまたは阻害的な他の分子、例えばトリコテセン類、または標的遺伝子の発現をブロックするアンチセンスＤＮＡと複合体を形成する。

さらにＨＲＧは、その本来のグリコジル化様式を変えることにより共有結合的に修飾される。所定の部位で単糖構成要素を付加、除去または変更することにより、またはグリコリル化サイトが付加もしくは除去されるようにＨＲＧ中の残基を修飾することにより、１またはそれ以上の炭水化物置換基が修飾される。

ポリペプチドのグリコジル化は典型的にはＮ一連結または〇一連結のいずれかである。Ｎ一連結とは、その炭水化物部分がアスパラギン残基の側鎖に結合していることを意味する。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリンおよびアスパラキン−Ｘ−スレオニンにこでＸは、プロリン以外の任意のアミノ酸である］が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。

したがって、これらトリペプチド配列のいずれかがポリペプチド中に存在すると、可能性あるグリコリル化サイトが作り出される。〇一連結グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはスレオニン（５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンもまた使用できる）に、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの一つが結合することを意味する。

ＨＲＧのアミノ酸配列を変えて１またはそれ以上の上記トリペプチド配列を含むようにすることによって、ＨＲＧにグリコジル化サイトが付加される（Ｎ一連結グリコシル化サイトのため）。この変更は、１またはそれ以上のセリンまたはスレオニン残基をＨＲＧに付加、または該残基で置換することによっても達成される（〇一連結グリコリル化サイトのため）。簡単にするため、ＨＲＧは、特にＨＲＧをコードしているＤＮＡを予め選択された塩基の位置で、所望アミノ酸に翻訳されるようなコドンが作られるように、突然変異させることにより、好ましくはＤＮＡレベルの変化を介して変更させる。

ＨＲＧへのグリコンドの化学的または酵素的結合は、炭水化物置換基の数を増加させる。これらの方法は、Ｎ−および〇一連連結グリコモ化化可能なポリペプチドの、宿主細胞中での産生を必要としないという点で有利である。用いられる結合様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキン基、（Ｃ）遊離スルフヒドリル基、例えばンステインのもの、（ｄ）遊離ヒドロキシ基、例えばセリン、スレオニン、またはヒドロキシプロリンのもの、（ｅ）芳香族残基、例えばフェニルアラニン、チロシン、またはトリプトファンのもの、または、（ｆ）グルタミンのアミド基、に結合させることができる。これらの方法は、ＷＯ３７１０５３３０（１９８７年９月１１日公開）、およびアブリンおよびリストン（ＣＲＣ・クリティカル・レビューズ・イン・バイオケミストリー（ＣＲＣＣｒ１ｔ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）、２５９−３０６頁（１９８１））に記載されている。

ＨＲＧ上に存在する炭水化物部分もまた、化学的または酵素的に除去される。

化学的脱グリコリル化は、そのポリペプチドをトリフルオロメタンスルホン酸化合物、または同等の化合物に暴露することを必要とする。この処理は、該ポリペプチドを無傷のままとしつつ、連結している糖（Ｎ−アセチルグルコサミンまたはＮ−アセチルガラクトサミン）を除く殆どまたは全ての糖を開裂させる。化学的脱グリコリル化は、ハキムディン等［アーカイブズ・オン・バイオケミストリー・アンド・バイオロジカル（Ａｒｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、）２５９巻５２頁（１９８７）］およびエツジ等、［アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）１１８巻１３１頁（１９８１）］により記載されている。炭水化物部分は、ツタクラ等［メソッズ・イン・エンザイモロジ−（Ｍｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、）１３８巻３５０頁（１９８７）］により記載されているように、種々のエンド−およびエキソ−グリコシダーゼによってＨＲＧから除去される。

細胞での発現中に加えられるグリコジル化は、ダスキン等［ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５７巻３１０５頁（１９８２）］により記載されるように、ツニカマイシンによって抑制される。

ツニカマイシンは蛋白−Ｎ−グリコシド結合の形成をブロックする。

ＨＲＧはさらに、米国特許第４６４０８３５号；４４９６６８９号；４３０１１４４号；４６７０４１７号；４７９１１９２号または４１７９３３７号に開示される方法において、ＨＲＧを種々の非蛋白ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレン類と結合させることによって修飾される。

膜に結合していないＨＲＧのインビボ循環半減期を延長させる一つの好ましい方法は、これを、半減期の延長を与えるポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と複合体形成させることである。［マキシフイールド等、ポリマー（Ｐｏｌ　ｙｍｅｒ）１６巻５０５−５０９頁（１９７５）；Ｆ、Ｅ、ベイジー等、ノニオニツク・サーファクタンツ（Ｎｏｎｉｏｎｉｃ　Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）（Ｍ、Ｊ、シック編）　、７９４−８２１頁（１９６７）；Ａ、アブチョフスキー等、ンヤーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２５２巻３５８２−３５８６頁（１９７７）；Ａ、アブチョフスキー等、キャンサー・バイオケミストリー・バイオフィンリス（Ｃａｎｃｅｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、）７巻１７５−１８６頁（１９８４）　；Ｎ、　Ｖ、カーター等、プロ／−ディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）８４巻１４８７−１４９１頁（１９８７）；Ｒ，グッドソン等、バイオ・テクノロジー（Ｂｉｏ　Ｔｅｃｈｎｏ　ｉ　ｏｇｙ）８巻３４３−３４６頁（１９９０）］。さらに、ＰＥＧに対する複合体形成は免疫原性および毒性を低下させると報告されている［Ａ、アブチョフスキー等、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）２５２巻３５７８−３５８１頁（１９７７）］。

さらにＨＲＧは、例えばコアセルベーンヨン技術によってまたは界面重合によって製造されたマイクロカプセル（例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ−［メチルメタシラートコマイクロカプセル）中に、コロイド薬物デリバリ−系（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中に、またはマクロエマルジョン中に捕らえられる。このような技術は、レミントンズ・ファーマンニーティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｔｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ）１６版、Ａ、オソール編（１９８０）に開示されている。

ＨＲＧは、ＨＲＧのための検定における標準としての抗体の作製（例えばラジオイムノアッセイ、酵素結合イムノアッセイ、または放射性レセプター検定の標準として使用するため、ＨＲＧを標識することにより）、親和精製技術、および　゛放射性ヨウ素、酵素、発蛍光団、スピン標識等で標識される場合は競合型レセプター結合検定に有用である。

当業者は、意図される目的のための最適な変異体を選択するために変異体をスクリーニングすることができるであろう。例えば、ＨＲＧの免疫学的性質の変化、例えば所定の抗原に対するまたはＨＥＲ２レセプターに対する親和性の変化は、天然ＨＲＧ　（特に天然ＨＲＧ−ＧＦＤ）のような標準または対照を使用する競合型イムノアッセイによって測定される。その他の蛋白またはポリペプチドの性質の可能性ある修飾、例えば酸化還元もしくは熱安定性、疎水性、蛋白分解的減成の受け易さ、組み替え細胞培養または血漿中での安定性、または担体とのもしくは多量体への凝集傾向、は、当業者に良く知られる方法によって検定される。

１、ヘレグリンリカノドの治療的用途。

正常な細胞の増殖および分化におけるｐ１８５”ＥＲ２およびそのリガンドの役割は知られていないが、正常な増殖および発達を促進し、且つ異常な増殖、特に悪性または新生物組織の増殖を阻害する、本発明のｐ１８５Ｈ！”リガンドの治療的用途を開発することが、本発明の目的である。

２、ＨＲＧの治療用組成物および投与。

所望の純度を有するＨＲＧ蛋白を、所望による生理学的に許容し得る担体、賦形剤、または安定剤と混合して［レミントンズ・ファーマンティカル・サイエンシズ（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅＳ）、上記コ凍結乾燥固体または水溶液の型とすることにより、保存のためのＨＲＧまたはＨＲＧ抗体の治療用製剤を製造する。許容し得る担体、賦形剤または安定剤は、用いられる用量および濃度において被投与者にとって毒性でな（、燐酸、クエン酸、およびその他の有機酸のような緩衝剤：アスコルビン酸を包含する抗酸化剤：低分子量（約１０残基より小さい）ポリペプチド（メトキシドの形成を防止するため）；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン類のような蛋白：ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマーニゲリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；単糖類、三糖類、および、グルコース、マンノース、またはデキストリン類を包含するその他の炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート試薬；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール類；塩を形成するナトリウムのような対イオン；および／またはトウイーン、プルロニクスまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような非イオン性界面活性剤を包含する。

インビボでの投与に用いられるＨＲＧまたはＨＲＧ抗体は無菌でなければならない。これは、凍結乾燥および再構成の前または後に無菌濾過膜で濾過することによって容易に達成することができる。ＨＲＧまたはＨＲＧに対する抗体は、通常凍結乾燥型または溶液で保存されるであろう。

治療用ＨＲＧまたはＨＲＧ特異抗体組成物は、一般に、無菌的進入孔を有する容器、例えば静脈内溶液袋または皮下注射針が貫通し得る栓を有するバイアル中に入れる。

アンタゴニストとして使用する場合のＨＲＧ、その抗体またはＨＲＧ変異体は、所望により、悪性腫瘍の処置に使用されることが知られている他の薬物と合し、またはこれと共に投与することができる。ＨＲＧが、例えば組織培養中で、ＨＥＲ２レセプターを刺激するアゴニストとして使用される場合、これは、増殖を刺激する他の組成物、例えばＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＥＧＦ、成長ホルモンまたはその他の蛋白成長因子と合し、またはそれらと共に投与することができる。

ＨＲＧまたはＨＲＧ抗体の投与経路は既知の方法、例えば静脈内、腹腔内、脳内、筋肉内、眼内、動脈内、もしくは外傷的経路による、または下記のように持続放出系による注射または注入、に従う。ＨＲＧは注入により連続的に、またはポーラス注射により投与する。ＨＲＧ抗体は同じやり方で、または血流もしくはリンパ中に投与する。

持続放出製剤の好適な例は、該蛋白を含有する疎水性固体ポリマーの半透過性マトリックスを含み、このマトリックスは成型物、例えばフィルム、またはマイクロカプセルの形である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル類［例えば、ランガー等、ジャーナル・オン・バイオメディカル・マテリアルズ・リサーチ（Ｊ、Ｂｉｏｍｅｄ、Ｍａｔｅｒ、Ｒｅｓ、）１５巻１６７− ２７７頁（１９８１）およびランガー、Ｃｈｅｍ、Ｔｅｃｈ、１２巻９８−１０５頁（１９８２）に記載のポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）コ、ポリアクチド類［米国特許第３７７３９１９号、ＥＰ５８４８１号］、Ｌ−グルタミン酸およびγエチルーＬ−グルタミン酸のコポリマー［ノドマン等、パイオポリマーズ（Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ）２２巻５４７−５５６頁（１９８３）］、］非減成エチレンービニルアセタートランガー等、上記コ、ルブロン・デポ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドからなる注射用ミクロフェア）のような、減成可能な乳酸−グリコール酸コポリマー、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸［ＥＰ１３３９８８号］が包含される。エチレン−ビニルアセタートおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間にわたり分子を放出することができるが、ある種のヒドロゲル類は、より短時間蛋白を放出する。カプセルに入った蛋白が体内に長時間留まると、これらは３７℃で水分にさらされた結果として変性または凝集し、生物活性の損失およびことによると免疫原性の変化をもたらすかも知れない。関与している機構に応じて、蛋白の安定化のための合理的な戦略を考案することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィドの交換による分子間Ｓ−８結合の形成であると判明したならば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾することにより、酸性溶液から凍結乾燥することにより、水分含量を管理することにより、適当な添加物を使用することにより、そして特異なポリマーマトリックス組成物を開発することにより、達成することができる。

持続放出ＨＲＧまたは抗体組成物は、さらに、リポソームに入ったＨＲＧまたは抗体を包含する。ＨＲＧまたは抗体を含むリポソームは、自体既知の方法、ＤＥ３２１８１２１号、エプスタイン等、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・ザイエンシズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ）８２巻３６８８−３６９２頁（１９８５）；７７ング等、プロシーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　］、Ａｃａｄ、Ｓｃ　１．ＵＳＡ）７７巻４０３０−４０３４頁（１９８０）；ＥＰ５２３２２号；ＥＰ３６６７６号；ＥＰ８８０４６号、ＥＰ１４３９４９号；ＥＰ１４２６４１号：日本国特許出願８３−１１８００８号、米国特許第４４８５０４５号および４５４４５４５号；ならびにＥＰＩ０２３２４号によって製造する。通常、リポソームは、脂質含量が約３０ｍｏ１％のコレステロールであって、選択される割合は最適なＨＲＧ療法のために調整される、小さな（約２００−８００オングストローム）の単層型を有する。循環時間の向上したリポソームが米国特許第５０１３５５６号に開示されている。

本発明のもう一つの用途は、ＨＲＧポリペプチドまたは抗体を、成型物中に取り込ませることからなる。このようなものは細胞増殖および発育の調節に使用することができる。これに加えて、細胞増殖および分割ならびに腫瘍の侵襲をこれらのものて調節することができる。

治療的に使用されるＨＲＧまたは抗体の有効量は、例えば治療対象、投与経路、および也者の状態に依存するであろう、したがって、治療者は、用量を滴定し必要に応じて投与経路を修飾して最適の治療効果を得るようにする必要があるであろう。典型的な日用量は、上記の因子にもよるが、約１μｇ／ｋｇないし１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲であってよい。典型的には、臨床医はＨＲＧまたは抗体を、所望の効果が達成される用量に到達するまで投与するであろう。この療法の経過は常套的検定により容易に監視される。

３　ヘレグリン抗体の製造および治療用途。

本発明に係る抗体は常套的スクリーニングによって得る。ＨＲＧに対するポリクローナル抗体は、一般に、ＨＲＧおよびアジュバントを複数回皮下（Ｓ　Ｃ）または腹腔内（１ｐ）注射することにより、動物において作製される。二価または誘導体形成試薬、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システィン残基を介する複合体形成）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、５ＯＣ１２、またはＲ’Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ［式中、ＲおよびＲ１は相異なるアルキル基であるコを用いて、標的アミノ酸配列を含むＨＲＧまたはＨＲＧフラグメントを、免疫されるべき種において免疫原性である蛋白、例えばスカノガイヘモンアニン、血清アルブミン、牛チログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤と複合体形成させることが有用であり得る。

動物を免疫する、または抗体産生細胞を取り出し培養する経路および手順は、一般に、確立されたそして常套的な抗体刺激および産生のための技術と調和している。しばしばマウスが免疫されるが、ヒト対象を包含する任意の哺乳動物対象またはそれらから得られる抗体産生細胞を免疫して抗体産生細胞を生成することができるということが理解できる。

典型的には、ＨＲＧ免疫原１ｍｇまたは１μｇ（それぞれウサギまたはマウスについて）をフロイント完全アジュバント３容量と合し、この溶液を複数の部位に陵内注射することにより、対象をＨＲＧまたはその免疫原性複合体もしくは誘導体に対して免疫する。１ケ月後、フロイント完全アジュバント（または適当な他のアジュバント）に入れた免疫原の当初の量の１１５ないし１／１ｏを複数の部位に皮下注射することにより、対象を追加免疫する。フないし１４日後、動物から採血し、血清を抗ＨＲＧ抗体力価について検定する。力価がプラトーに達するまで対象を追加免疫する。異なった架橋試薬を介して、モして／または異なった蛋白と複合体形成させる以外は、対象は好ましくは同じＨＲＧの複合体で追加免疫する。さらに複合体は蛋白融合物として組み替え細胞培養中で生成させることができる。また、免疫応答を促進させるため、ミョウバンのような凝集試薬を使用する。

免疫の後、免疫リンパ系細胞（典型的には膵臓細胞またはリンパ腺組織由来のリンパ球）を免疫した動物から回収し、常套的やり方で、例えば骨髄腫細胞との融合によって、またはエプスタイン−バー（Ｅ　Ｂ）ウィルス形質転換によって、この細胞を不死化し、そして所望の抗体を発現しているクローンをスクリーニングすることにより、モノクローナル抗体を調製する。コーラ−およびミルシュタイン、ヨーロピアン・ジャーナル・オン・イミュノロジー（Ｅｕｒ、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．）６巻５１１頁（１９７６）に最初に記載されたハイブリドーマ技術は、多くの特異的抗原に対するモノクローナル抗体を高レベルで分泌させるハイブリッドセルラインを産生させるために、広く適用されている。

成る生物種の細胞を他のものと融合させることは可能である。しかしながら、免疫された抗体産生細胞の供給源と骨髄腫とは、同じ生物種であることが好ましい。

抗ＨＲＧ４産生ずるハイブリドーマセルラインは、培養上清を、ＨＲＧに結合する抗体についてスクリーニングすることにより同定する。これは、可溶性ＨＲＧ調製物を用いる常套的イムノアッセイによって、または細胞結合ＨＲＧおよび標識された候補抗体を用いるＦＡＣ３によって、日常的に達成される。

このハイブリッドセルラインは、細胞培養基中でインビトロで培養中に維持することができる。本発明に係るセルラインは、ヒポキサンチンーアミノブテリンチミシン（ＨＡＴ）培地中、連続的セルラインを含む組成物中で選択しモして／または維持することができる。事実、いったんハイブリドーマセルラインが確立されると、これは様々な栄養学的に適合する培地上で維持することができる。

そのうえ、ハイブリッドセルラインは、凍結および液体窒素の下での保管を含むかなり多数の常套的方法で保管し保存することができる。凍結されたセルラインは、回復させ、モノクローナル抗体の合成および分泌を再開させながら無期限に培養することができる。分泌された抗体は、沈澱、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー等のような常套的方法によって、組織培養上清から回収する。本明細書に記載される抗体は、ＩｇＧまたはＩｇＭの精製のための常套的方法によってもハイブリドーマ細胞培養から回収される。何故ならこの事例は、これまで、プールされた血漿からこれらの免疫グロブリン類を精製するのに用いられてきた事例、例えばエタノールまたはポリエチレングリコール沈澱法であるからである。精製された抗体は無菌濾過し、所望により、被験試料中のＨＲＧの診断的検定に使用するために、酵素またはスピン標識のような検出可能なマーカーと複合体形成させる。

マウスのモノクローナル抗体が日常的に使用されるが、本発明はこれに限定される訳ではなく、実際にはヒトの抗体を使用することができ、これは好ましいものであることが証明できる。このような抗体はヒトハイブリドーマを使用することにより取得てきる［コテ等、モノクローナル・アンテイボディーズ・アンド・キャンサー・セラビー（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄＣａｎｃｅｒ　Ｔｈｅｒａｐｙ）、アラン・Ｒ，リス、７７頁（１９８５）］。

マウス抗ＨＲＧ可変領域および適当な生物活性（例えばヒトの補体を活性化しＡＤＣＣを仲介する能力）を有するヒトの不変領域を含むキメラ抗体、キャビンー等［モリソン等、プロンーディングズ・オン・ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）８１巻６８５１頁（１９８４）；ノイバーガー等、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３１２巻６０４頁（１９８４）；タケダ等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３１４巻４５２頁（１９８５）］は、本発明の範囲内にあり、常套的ＣＲＤ−移植法によって産生された、人間に適合させた抗ＨＲＧ抗体もまた同様である。

モノクローナル抗体の生成に副行路を付ける、抗体分子の抗原結合領域の組み替えＤＮＡ版（Ｆａｂまたは可変領域フラグメントとして知られる）を作り出す技術は、本発明の実施内に包含される。免疫された対象から採取された免疫系細胞由来の抗体特異的なメツセンツヤ−ＲＮＡ分子を抽出し、これらを相補的ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ）に転写し、このｃＤＮＡを細菌の発現系にクローニングし、そして所望の結合特性を選択する。スクリプス／ストラタジーン法は、発現されたＦａｂ蛋白を周辺腔（細菌の細胞膜と細胞壁の間）に移動させ、または分泌させる、リーダー配列を含むバクテリオファージラムダベクター系を使用する。所望の性質を有するＨＲＧを結合するものを同定するための極めて多数の機能的Ｆａｂフラグメントを迅速に生成且つスクリーニングすることができる。

ＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２およびＨＲＧ−β３に対し特異的な抗体を、上記のやり方で生成し使用することができる。本発明に係るＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２およびＨＲＧ−β３特異抗体は、好ましくはＥＧＦファミリーの他の成員（図６）と、または互いに交叉反応しない。

ＨＲＧ−ＮＴＤＳＨＲＧ−ＧＦＤまたはＨＲＧ−ＣＴＰと特異的に結合することのできる抗体が、とりわけ興味深い。ＧＦＤお上び泥膜ドメインの間の蛋白分解的プロセシングサイトに特異的に結合することのできる抗体もまた興味深い。

これらの抗体は、自体常套的な方法によって同定される。例えば、ＨＲＧ−ＥＣＤまたはプロＨＲＧに結合することのできる一連の候補抗体を、完全なプロＨＲＧての免疫を用いる上の方法によって取得する。次いでこれらは、常套的マツピング技術を用いて、種々のＨＲＧドメインに結合する能力により、さらに分割できる。より好ましさは小さいが、予め決められたドメインに対し特異的な抗体を、対象を、実質上問題のドメインのみからなるポリペプチド、例えばＮＴＤまたはＣＴＰポリペプチドを含まないＨＲＧ−ＧＦＤで免疫することによって、まず作製する。これらの抗体は、特定のエピトープへの結合が所望でない限り、マツピングの必要はないであろう。

蛋白分解的プロセシングサイトに結合することのできる抗体は特に興味深い。

これらは、ＣＴＰプロセシングサイトを含むＨＲＧフラグメント、無傷のＨＲＧ。

またはＨＲＧ−ＮＴＤ−ＧＦＤのいずれかで免疫し、次いで、ＨＲＧをＮＴＤ− ＧＦＤフラグメントにプロセシングすることのできる分離されたセルラインまたは組み替え宿生細胞によって、ＨＲＧからＮＴＤ−ＧＦＤへの蛋白分解的プロセシングをブロックまたは阻害する能力についてスクリーニングすることによって生成される。これらの抗体はＮＴＤ−ＧＦＤの放出の抑制に有用であり、故にＮＴＤ−ＧＦＤの放出およびＨＥＲ−２レセプターの刺激を防止する用途について有望である。これらはまた、細胞増殖および複製の制御にも有用である。抗ＧＦＤ抗体は、同じ理由で有用であるが、プロセシングサイトに対する抗体はど生物学的に有効ではないかも知れない。

ＨＲＧファミリーの成員のうち、ただ一つ、例えばＨＲＧ−αまたはＨＲＧ−β イソ型のうちいずれか一つにのみ結合することのできる抗体を選択する。ＨＲＧファミリー成員の各々は明確なＧＦＤ−泥膜トメイン開裂サイトを持っていることから、これらの特異な配列に対して特異的に作製された抗体は、ＧＦＤの各々またはプロセシングサイトの高度に特異的な阻害を可能とし、それにより所望の生物学的応答を正確にする。例えば、ＨＥＲ−２依存性の乳癌腫細胞は、実際は一つのＧＦＤイソ型によってのみ活性化され、そうでないとしても、ＧＦＤの活性化は、ＨＥＲ−２を有する細胞自身またはＧＦＤ生成細胞のいずれかにある特定のプロセシング配列からのみ始まり得る。ＧＦＤまたはプロセシングサイトを活性化する標的の同定は、ＨＥＲ−２依存性癌腫を分析する簡単な仕事であって、例えば、組織を、該レセプターを伴う特定のＧＦＤファミリー成員の存在について分析、または、組織を成るＨＲＧファミリー成員（これはしかる後治療的標的として働（）の発現について分析することによる。これらの選択的抗体は、上に記載されたのと同じやり方で生成され、標的配列またはドメインによる免疫によって、またはより広い特異性を有する一連の抗体から選択することによって、生成される。

上記のように、該抗体は、標的配列に対して高い特異性および親和性を持っていなくてはならない。例えば、ＧＦＤ配列に対して作製された抗体は、ＧＦＤに対して、ＧＦＤがＨＥＲ−２レセプターに対して有する親和性より高い親和性を持っていなくてはならない。このような抗体は日常的なスクリーニング法によって選択される。

４、ヘレグリンおよびその抗体の非治療的用途。

ＨＲＧをコードしている核酸は、組織特異的な分類のための診断薬として使用できる。例えば、インサイトウハイブリダイゼーション、ならびにノーザンおよびサザンブロッテイング、ならびにＰＣＲ分析を使用して、ＨＲＧをコードしているＤＮＡおよび／またはＲＮＡが、評価される型の細胞に存在するか否かを決定することができる。特にこの核酸は、成る型の腫瘍細胞、例えば乳腺、胃および結腸の腺癌、唾液腺およびｐｌ　８５１１ｔＲ２を含むその他の組織のための特異的プローブとして有用であり得る。

分離されたＨＲＧは、未知の量のＨＲＧを含有する試料と比較することのできる標準または対照として、定量的診断検定に使用することができる。

分離されたＨＲＧは、インビトロ細胞培養のための成長因子として、そしてｐ１８５”内または他の類似のレセプターを含む細胞の増殖をインビボで促進する成長因子として使用することができる。

ＨＲＧ抗体は、特異的細胞または組織におけるＨＲＧの発現のための診断的検定に有用である。この抗体は、上記のＨＲＧと同じやり方で標識し、そして／または不溶性マトリックス上に固定化する。

ＨＲＧ抗体はさらに、組み替え細胞培養または天然からのＨＲＧの親和精製に有用である。他のＨＲＧと検出し得るほどに交叉反応しないＨＲＧ抗体は、他の既知のりガントまたは汚染蛋白を含まないＨＲＧの精製に使用することができる。

ＨＲＧおよびその抗体のための適当な診断的検定は自体既知である。係る検定は、競合的およびサンドイッチ検定、ならびに立体阻害検定を包含する。競合的およびサンドイツチ法は、その方法の重要な部分として相分離工程を使用し、一方、立体阻害検定は、単一の反応混合物中で実施する。検定される物質の分子量に応じて成る方法が好ましいということはあるが、基本的には、ＨＲＧとＨＲＧを結合する物質の検定には同じ方法が用いられる。故に、試験される物質は、抗原または抗体としてのその資格に関わりなく、本明細書においては被検体と呼ばれ、被検体に結合する蛋白は、それらが抗体であれ、細胞表面レセプターであれ、または抗原であれ、結合相手と称される。

ＨＲＧまたはその抗体の分析法は全て１またはそれ以上の以下の試薬を使用する：標識された被検体類似体、固定化された被検体類似体、標識された結合相手、固定化された結合相手および立体的複合体。標識された試薬は「トレーサー」としても知られる。

使用される標識（これはＨＲＧをコードしている核酸をプローブとしての使用のために標識するのにも有用である）は、被検体およびその結合相手の結合を妨害しない任意の検出可能な官能性である。イムノアッセイのための数多くの標識が知られており、その例には、蛍光色素、化学ルミネセンス、および放射性標識のような直接検出され得る部分、ならびに、検出されるためには反応し、または誘導体化されねばならない、酵素のような部分が包含される。このような標識の例には、放射性同位元素３２ｐ、＋４ＯＳ＋２ｆｉｌ、３Ｈ，および１３１■、発蛍光団、例えば希土類キレートまたはフルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルンフエラーゼ、例えばホタルのルンフエラーゼおよび細菌ルノフエラーセ（米国特許第４７３７４５６号）、ルシフエロン、２，３−ジヒドロフタルアジンジオン類、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）　、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サツカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼおよびグルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ、ヘテロ環オキシダーゼ、例えば、ＨＲＰ１ラクトペルオキシダーゼ、またはミクロペルオキシダーゼのような色素前駆体を酸化するために過酸化水素を使用する酵素と結合させた、ウリカーゼおよびキサンチンオキシダーゼ、ビオチン／アビジン、スピン標識、バクテリオファージ標識、安定なフリーラジカル等が包含される。

これらの標識を蛋白またはポリペプチドに共有結合で結合させるために、常法が利用できる。例えば、ンアルデヒド類、カルボンイミド類、シマレイミド類、ビスーイミダート類、ビス−ジアゾ化ベンジジン等のような結合試薬を用いて、抗体を、上記の蛍光、化学ルミネセンス、および酵素標識と結合させることができる。例えば、米国特許第３９４０４７５号（蛍光定量法）および３６４５０９０号（酵素）：ハンター等、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）１４４巻９４５頁（１９６２）；ディピッド等、バイオケミストリー（Ｂ　ｉ　ｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ）１３巻１０１４−１０２１頁（１９７４）；ペイン等、ジャーナル・オン・イミュノロシカル・メソッズ（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ）４０巻２１９−２３０頁（１９８１）およびニグレン、ジャーナル・オン・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｊ、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ、ａｎｄ　Ｃｙｔｏｃｈｅｍ、）３０巻４０７−４１２頁（１９８２）を参照されたい。ここで好ましい標識は、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼのような酵素である。酵素を包含するこのような標識の、抗体との複合体形成は、イムノアッセイ技術における通常の知識を有するものにとって標準的な操作法である。例えば、メソッズ・イン・エンザイモロシー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ。

１ｏｇｙ）、Ｊ、Ｊ、　ランボーンおよびＨ，パン・バナキス編、７３巻（アカデミツク・プレス、ニューヨーク、ニューヨーク、１９８１）　、１４７−１６６頁の、オサリバン等、「メソッズ・フォア・ザ・プリバレージョン・オン・エンザイムーアンティボディ・コンジュゲイッ・フォア・ユース・イン・エンザイム・イムノアッセイ」を参照されたい。このような結合法は、すべて蛋白である、ＨＲＧまたはその抗体との使用に好適である。

成る種の検定法には、試薬の固定化が必要である。固定化は、溶液中に遊離で存続するいかなる被検体からも結合相手を分離する必要がある。通常これは、結合相手または被検体類似体を、検定操作の前に、水不溶性マトリックスまたは表面に吸着させることによって［ベニンヒ等、米国特許第３７２０７６０号］、共有結合によって（例えばグルタルアルデヒド架橋を用いて）、または、例えば免疫沈降により、結合相手もしくは類似体を後で可溶化することによって、達成される。

競合的またはサンドイッチ検定として知られる他の検定法は、商業的診断薬産業において充分確立され広く使用されている。

競合的検定は、トレーサー類似体が、共通の結合相手上の限られた数の結合サイトを、被験試料の被検体と競合することに拠るものである。結合相手は一般に、競合の前または後において不溶化されており、次いでこの結合相手に結合したトレーサーおよび被検体を、非結合トレーサーおよび被検体から分離する。分離は、デカンテーションによって（結合相手が前もって不溶化されている場合）または遠心によって（結合相手を競合反応後に沈澱させる場合）達成する。被験試料被検体の量は、マーカー物質の量によって測定される結合したトレーサーの量に逆比例する。既知量の被験体による用量−反応曲線を作成し、試験結果と比較して、被験試料中に存在する被検体の量を定量的に決定する。これらの検定は、検出可能マーカーとして酵素が用いられる場合、ＥＬＩＳＡ系と呼ばれる。

「等質」検定と呼ばれるもう一種類の競合検定は、相の分離を必要としない。

ここでは、酵素と被検体の複合体を作成し、抗−被検体が被検体に結合する時に、抗−被検体の存在が酵素活性を修飾するように使用する。この場合、ＨＲＧまたはその免疫学的に活性なフラグメントを、二価有機橋によって、ペルオキシダーゼのような酵素と複合体形成させる。複合体は、抗ＨＲＧと共に使用して抗ＨＲＧ抗体の結合が標識の酵素活性を阻害または増強するように選択する。この方法自体はＥＭＩＴという名称の下に広〈実施されている。

立体的複合体は、等質検定のための立体障害法に使用される。これらの複合体は、低分子量のハブテンを小型の被検体に共有結合させることによって合成され、その結果ハブテンに対する抗体は、抗−被検体として同時に該複合体と結合することが実質上できない。この検定法の下では、被検試料中に存在する被検体は抗 −被検体に結合し、それにより抗−ハブテンを該複合体に結合させ、その結果複合体ハブテンの性格上の変化、例えばハブテンが発蛍光団である場合には蛍光の変化をもたらす。

サンドイッチ検定は、ＨＲＧまたはＨＲＧ抗体の測定にとって特に有用である。

連続的サンドイッチ検定においては、固定化された結合相手を用いて被検試料の被検体を吸着し、被検試料を例えば洗浄によって除去し、結合した被検体を用いて標識された結合相手を吸着し、そして次に、結合した物質を、残留しているトレーサーから分離する。結合したトレーサーの量は、被検試料の被検体に直接比例する。「同時」サンドイッチ検定においては、被検試料は標識された結合相手を添加する前に分離しない。一方の抗体として抗ＨＲＧモノクローナル抗体、そして他方の抗体としてポリクローナル抗ＨＲＧ抗体を使用する連続的サンドイッチ検定は、被験試料をＨＲＧ活性について試験する際に有用である。

上に述べたのは、ＨＲＧおよび抗体に対する診断的検定の例に過ぎない。前記の生物検定を包含する、これらの被検体の測定のために現在または今後開発される他の方法も本発明の範囲内に包含される。

ＨＲＧポリペプチドは、ｐｌ　ｓ　５　ＨＣｌ２およびＨＲＧ、より詳細にはＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２およびＨＲＧ−β３に対する結合親和性を有する他の類似のレセプター、の親和精製に使用することができる。ＨＲＧ− α、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２およびＨＲＧ−β３を使用して、ＨＲＧ部分が核酸およびハブテンへの親和結合に有用である、融合ポリペプチドを形成させることができる。

ＨＲＧポリペプチドは、ｐ１８５…２への結合についての可能性あるアゴニストまたはアンタゴニストの競合的スクリーニングのためのリガンドとして使用することができる。ＨＲＧ変異体は、それらが、用いられる分析系によって認識される、例えば抗ＨＲＧ抗体であるならば、ＨＲＧのための検定の標準または対照として有用である。変性したＨＲＧまたはそのフラグメントに結合できる抗体は、ＨＲＧが検定前に変性されている検定に使用され、この検定において、変性したＨＲＧまたはフラグメントは標準または対照として使用される。好ましくは、ＨＲＧ−α、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２およびＨＲＧ−β３は検出し得るよう標識され、結合したｐ１８５’…に対する競合検定は、標準的検定法を用いて実施する。

本明細書中ＨＲＧ−αに関して記載した方法および操作は、ＨＲＧ−β１、ＨＲＧ−β２およびＨＲＧ−β３ならびに他の新規なＨＲＧリガンドならびにそれらの変異体にも同様に適用することができる。限定のためにではなく例示のために以下の実施例を供する。

実施例実施例１　乳癌細胞の上清の調製。

ヒト乳癌腫ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の上清からへレグリン−αを分離した。ＨＲＧが放出され細胞培養基から分離された。

ａ　細胞培養。

アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できるヒト乳癌腫細胞ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣＨＴＢ２６）を、まず、連続的継代によって、２５ｃｍ２組織培養フラスコから８９０ｃｍ２のプラスチックローラー瓶（カミング、カミング、ＮＹ）の規模に拡大し、種菌をローラー瓶の規模に維持した。

細胞を継代し種菌を維持するために、フラスコおよびローラー瓶をまず燐酸緩衝化塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、次いでトリプシン／ＥＤＴＡ　（シグマ、セントルイス、Ｍｏ）と共に３７℃で１−３分間インキュベートした。次に、分離した細胞を、牛胎児血清（ＦＢＳ）（ンブコ、グランド・アイランド、ＮＹ）を含有する新たな培地中で数回ピペット操作して、細胞凝集塊を破壊し、トリプシンを不活性化した。最後にこの細胞を１．１０の比率で新たな培地に分け、新しいフラスコまたは瓶に移し、３７℃でインキュベートし、はぼ密集成長するまで増殖させた。細胞が維持される成長培地は、幾つかのアミノ酸、ビタミン、糖、および塩の濃度に関して修飾し、５％ＦＢＳを添加した、混合ＤＭＥ／ハムーＦ−１２培地処方であった。同じ基本培地を無血清リガンド産生のために使用し、０．５％ブリマトーンＲＬ（シェフイールド、ノーウィック、ＮＹ）を添加する。

ｂ、大規模生産。

大規模ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞増殖を、加重した架橋ゼラチン製のバーセル・バイオリティカマイクロキャリア−（ハイクローン・ラボラトリーズ、ローガン、ＵＴ）を使用することにより達成した。マイクロキャリアーは、まず水和させ、オートクレーブにかけ、そして製造者の指示に従ってすすいだ。１０本のローラー瓶からの細胞をトリプシン処理し、成長培地３リツトルおよび水和したマイクロキャリアー１０−２０ｇを入れた接種回転容器に加えた。細胞を約１時間穏やかに攪拌し、成長培地７リツトルを入れた、機器を備えた１０リットル発酵槽に移した。マイクロキャリアーの懸濁を維持するために培養を６６５−７５ｒｐで攪拌した。発酵槽は３７℃に調節し、炭酸ナトリウムおよびＣＯ２の添加によりｐＨを７．　０−７．　２に維持した。空気および気体酸素を散布して、培養を約４０％の空気飽和に維持した。細胞数を蛍光生体染色（二酢酸フルオレセイン）により顕微鏡的に監視し、トリバンブルー染色と比較して、細胞の相対的生存および細胞によるマイクロキャリアー進入の程度を評価した。細胞−マイクロキャリアー凝集体の大きさの変化を、顕微鏡写真により監視した。

マイクロキャリアーが９０−１００％密集性となったと思われた時に、培養を無血清培地て洗浄して血清を除去した。これは、攪拌および他の制御を停止し、担体を容器の底に沈ませることによって達成した。およそ９リツトルの培養上清をポンプで容器から抜き、同容量の無血清培地で置き換えた（プリマトーンＲＬを添加したまたは添加していない上記と同じ基本培地）。マイクロキャリアーを簡単に再懸濁させ、ＦＢＳの１０００倍の除去が達成されるまで、同じ工程を反復した。次に、細胞を無血清培地中で３−５日間インキュベートした。培養のグルコース濃度を毎日監視し、必要に応じてグルコースを添加し、発酵槽中の濃度をＩｇ／Ｌまたはそれ以上に維持した。収穫の時点でマイクロキャリアーを前記のように沈ませ、上清を無菌的に取り、精製用に２−８℃で保存した。新たな無血清培地を発酵槽に入れ、マイクロキャリアーを再懸濁し、培養をインキュベートし前記のように収穫した。この操作は４回反復することができた。

実施例２　成長因子活性の精製。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの条件培地（１０−２０リツトル）をソーパル遠心機中１１００００ｒｐでの遠心によって透明とし、０．２２ミクロンのフィルターで濾過し、次に１０ｋＤａカツトオフのポリスルホン膜を付けたミニタン・タンンエンンヤル・フロー・ユニット（ミリポア・Ｃｏｒｐ、）により、室温で１０−５０　（およそ２５）倍に濃縮した。別法として、ＹＭ３膜を付けた２、５Ｌのアミコン・スタート・セルにより、培地を４℃で濃縮することもできる。

濃縮後、培地を１１００００ｒｐで再度遠心し、上清を３５３５−５Ｏ等分試料として一８０℃で凍結した。

ヘパリンセファロースをファルマンア（ピスカタウェイ、ＮＪ）から購入し、製造者の指示に従って調製した。５ｍｌの樹脂をカラムに詰め、よく洗浄しく１００カラム容量）、燐酸緩衝化塩水（ＰＢＳ）で平衡化した。濃縮した条件培地を融解し、０２２ミクロンのフィルターで濾過して粒子物質を除き、ヘパリン−セファロースカラムに流速１ｍｌ／分でロードした。通常のロードは、４０倍濃縮の培地３０３０−５Ｏとした。ローディング後、２８０ｎｍの吸収が、蛋白の溶出が開始する前の基線に戻るまで、カラムをＰＢＳで洗浄した。カラムを、ＰＢＳ中で作成した０、３Ｍ、０．６Ｍ、０．９Ｍおよび（所望により）２．０ＭＮａＣｌの連続的段階的塩により、１ｍ１／分で溶離した。各段階は、吸収が基線に戻るまで、通常６−１０カラム容量継続させた。１ｍｌ容量の画分を集めた。

各洗浄または塩の段階に対応する全ての画分をプールし、次のＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞検定のために保存した。

チロシン燐酸化刺激活性の大半がＱ、５ＭＮａＣ１のプールに見いだされ、これを次の精製工程に使用した。ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーからの活性画分を融解し、脱イオン（ミリＱ）水で３倍に希釈して塩濃度を低下させ、そして、１７ｍＭ燐酸Ｎａ、ｐＨ６，８で平衡化したポリアスパラギン酸カラム（ポリＣＡＴ　Ａ、４．６ｘ１００ｍｍ、ポリＬＣ，ニア０ンビア、ＭＤ）にロードした。この精製工程のための緩衝液は全て、このカラム上の蛋白の溶解を改善するため、３０％エタノールを含有させた。ローディングの後、カラムを平衡緩衝液で洗浄し、１７ｍＭ燐酸Ｎａ、ｐＨ６，８緩衝液中のＮａＣｌ　０．３Ｍから０．６Ｍに至る塩の直線勾配で溶出した。カラムを１ｍｌ／分でローディングおよび展開し、１ｍｌの両分を、勾配溶離の間集めた。両分は４℃で保存した。

次の精製工程のための充分な材料を得るため、複数のヘパリン−セファロースおよびポリＣａｔカラムを処理した。ポリＣａｔＡカラムからの典型的な溶出プロフィルを図１に示す。１０−２５μＬの等分試料を、検定およびＳＤＳゲル分析のために、それぞれの画分から採取した。

チロシン燐酸化刺激活性は、ポリＣＡＴ　Ａカラムの溶出画分全体に見いだされ、その活性の大半は、クロマトグラムのビークＣに対応する画分（およそ０゜４５Ｍ　ＮａＣｌの塩濃度）に見いだされた。これらの両分をプールし、０．１容量の１％ＴＦＡの添加により０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に調節した。

２容量の脱イオン水を添加して前工程からの塩およびエタノールを希釈し、そして、この試料を、１５％アセトニトリルを加えた水に入れた０、１％ＴＦＡからなる緩衝液中で平衡化したＣ４逆相カラム（シンクロパックＲＰ−４，４，６Ｘ１００ｍｍ）を利用する高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によるさらなる精製に付した。このＨＰＬＣ操作は室温下に、１ｍｌ／分の流速で実施した。

試料をローディングした後、カラムを０４１％ＴＦＡ／１５％アセトニトリルで再平衡化した。１０分間でアセトニトリル濃度が１５％から２５％に増加する（１％／分）アセトニトリルの勾配を確立させた。次に、６０分間で２５から４０％アセトニトリルに至る勾配（０，２５％／分）でカラムを展開した。１ｍｌの両分を集め、蒸発を防ぐためにキャップをし、４℃で保存した。１ｏないし５０ μＬの等分試料を取り、減圧下に蒸発乾固しくスピードバク）、チロシン燐酸化検定用に検定緩衝液（０，１％牛血清アルブミンを加えたＰＢＳ）で再構成した。

さらに１０ないし５０μＬの等分試料を取り、ＳＤＳゲル電気泳動による分析のために、上記のように乾燥した。典型的なＨＰＬＣプロフィルを図２に示す。

活性の王たるピークは画分１７に見いだされた（図２Ｂ）。ＳＤＳゲル分析により、画分１７は、４５０００ダルトン分子量標準と共に移動する単一の生たる蛋白種を含むことが判明した（図２Ｃ，３）。別の調製物において、４５０００ダルトンの蛋白の存在は、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞検定におけるチロシン燐酸化活性の刺激と共に移動した。この４５０００ダルトンの蛋白のクロマトグラフィー特性は非定型的であって、調製物中の他の多くの蛋白とは対照的に、４５０００ダルトンの蛋白は２または３両分以内に逆相カラムから溶出されなかった。その代わり、これは５−１０画分にわたって溶出した。これは恐らく、広範囲にわたる翻訳後修飾によるものであろう。

ａ　蛋白配列の決定。

４５０００ダルトン蛋白を含有する両分を、アミノ酸配列決定のために減圧乾燥した。試料を７０％蟻酸に再溶解し、Ｎ末端配列決定のために、アプライド・バイオシステムズ、Ｉｎｃ、のモデル４７０Ａ気相配列決定機にロードした。識別し得るＮ末端配列は得られず、これはＮ末端がブロックされていることを示唆するものである。この蛋白をまずＳＤＳゲルに付し、プロプロット膜にブロッティングし、クーマノ−ブリリアントブルーによる迅速染色により位置を決定した後に４５０００ダルトンのバンドを切り取った場合にも同様の結果が得られた。

４５０００ダルトンの蛋白を含有する画分を、メチオニン残基の位置で開裂する臭化ノアン、リジン残基のＣ末端側で開裂するリジン−０１またはアスパラギン酸残基のＮ末端側で開裂するＡｓｐ−Ｎのいずれかを用いる部分消化に付すことにより、内部アミノ酸配列を得た。消化後の試料は直ちに配列決定するか、または、このペプチドを、０，１％ＴＦＡで平衡化し、０．１％ＴＦＡ中１−プロパツールの勾配で溶離する、ジンクローム０４カラム（４０００Ａ、２ｘ１００ｍｍ）上のＨＰＬＣクロマトグラフィーによってまず分離した。クロマトグラフィーの実施から得られるピークを、配列決定前に減圧乾燥した。

１５番（リシンＣ−１５）と名付けられたピーク中のペプチドの配列決定の際、幾つかのアミノ酸が各実施サイクル上に見いだされた。注意深く分析したところ、この画分は、幾つかの異なったＮ末端を有する同じ塩基性アミノ酸を含み、これが各サイクルに複数のアミノ酸を生じさせていることが明らかとなった。デコンボルーション後に以下の配列が決定された（配列番号３）：［Ａコ　ＡＥＫＥＫＴＦ　［Ｃ］　ＶＮＧＧＥＸＦＭＶＫＤＬＸＮＰｌ　５　１０　１５　２０（括弧内の残基は不確実であり、一方Ｘは、その中のアミノ酸の同定が不可能である環を表わす）最初の収量は８．５ｏｍｏ！であった。２４のアミノ酸を含むこの配列は、既知のいかなる蛋白にも対応しなかった。残基１は、後に、ｃＤＮＡ配列からＣｙＳであることが判明し、残基９は正しいことがわかった。１５および２２位の未知のアミノ酸は、各々ＣｙｓおよびＣｙｓであることがわかった。

ＨＰＬＣによる分離をせずに臭化シアンおよびＡｓｐ−Ｎ消化の後に試料の配列決定を行なって、ｃＤＮＡ配列を確認した。得られた配列は第１表に示すが、これはｃＤＮＡ配列から推理された４５０００蛋白についての配列を確認するものである。この蛋白のＮ末端は未知の保護基でブロックされているようである。

成る時、ＰＶＤＦプロットからの４５０００ダルトンバンドの直接配列決定によって、極めて微量の初期収量（０，２ｏｍｏ　Ｉ）のこの配列（配列番号４）：ＸＥＸＫＥ　（Ｇ）（Ｒ）ＧＫ　（Ｇ）Ｋ　（Ｇ）ＫＫＫＥＸＧＸＧ　（Ｋ）（決定され得なかった残基はｒＸＪで表わし、仮の残基は括弧内に示す）が明らかとなった。これは、ＨＲＧｃＤＮＡ配列の現存するＮ末端付近の４６位のセリンで始まる配列に対応し、この事は、４５０００蛋白のＮ末端が該配列中のこの点またはこれより前にあることを示唆するものである。

実施例３　ヒトヘレグリンのクローニングおよび配列決定。

ｐｌ　ｓ　５　ＨＥ１１２リガンドのｃＤＮＡクローニングを以下のように達成した。リジンＣ−１５ペプチドのアミノ酸配列の一部を、４５ｋＤ　ＨＲＧ−α リヵノドをコードしているｃＤＮＡ用のプローブを設計するために、解読した。

アミノ酸配列（配列番号５）ＮＨ２−・曲・ＡＥＫＥＫＴＦＸＶＮＧＧＥに対応する、以下のような３９残基長の８倍縮重デオキシオリゴヌクレオチドを化学合成した（配列番号６）３°　ＧＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＡＣＣＴＴＣＴＧＴ／ＣＧＴＧＡＡＴ／ＣＧＧＡ／ＣＧＧＣＧＡＧ　５’ このアミノ酸配列中、Ｘで示される未知のアミノ酸残基には、プローブの設計のためにノステインを割り当てた。このプローブは放射性燐酸化し、低緊縮ハイブリダイゼーションによって、λｇｔｌｏ中でヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ｍＲＮＡから組み立てられたオリゴｄＴでブライミングされたｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに使用した［ヒュングら、１９８４、ＤＮＡクローニング、１巻、ア・プラクティカル・アプローチ（Ｄ、　グローバー編）　、４９−７８頁、ＩＲＬブレス、オフスフオード］。λｇｔｌｏｈｅｒ１６およびλｇｔｌＯｈｅｒ１３と命名された二つの陽性クローンが同定された。ＤＮＡ配列分析により、これら二つのクローンが同一であることが明らかとなった。

λｇｔｌｏｈｅｒ１６の２０１０塩基対のｃＤＮＡヌクレオチド配列（図４）は、ヌクレオチド位３−５のアラニンで始まりヌクレオチド位２００７−２００９のグルタミンで終わる６６９アミノ酸の単一の長い開放読み取り枠を含んでいる。翻訳された配列には停止コドンは見いだされない。しかしながら、後のヘレグリンβ型クローンの分析は、ヌクレオチド位１３５−１３７にコードされているメチオニンが開始メチオニンであることを示している。プローブとのヌクレオチド配列相同性は、塩基６８１−７１９の間（この数を含む）に見いだされている。プローブによりコードされているアミノ酸配列と、リジンｃ−１５フラグメントに対して決定されたアミノ酸配列で該プローブの両端に隣接しているアミノ酸配列との相同性は、分離されたクローンが少なくとも４５ｋＤ蛋白のりジンＣ− １５フラグメントをコードしている事を立証するものである。

バイトロバシー分析は、残基２８７−３０９を含む極めて疎水性の強いアミノ酸領域（図４）の存在を示し、この蛋白が泥膜または内部シグナル配列ドメインを含み、故に、細胞の膜に結合していることを示す。

２０１０ｂｐ　ｃＤＮＡ配列によりコードされている６６９アミノ酸配列は、アスパラキン１６４．１７０．２０８．４３７および６０９位にアスパラギン結合グリコジル化のための可能性ある部位を含んでいる［Ｒ，ウィンッラー、ホーモナル・プロテインズ・アンド・ベプタイズ、（Ｃ，Ｈ，り一編）１−１５頁、アカデミツク・プレス、ニューヨーク（１９７３）］。可能性ある０−グリコジル化サイト［Ｒ，Ｄ、マーシャル、（１９７４）、バイオケミカル・ソサイアティー゛ンンポウンアム（Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、Ｓｙｍｐ、）４ｏ巻１７−２６頁コは、アミノ酸２０９−２１８位のセリンおよびスレオニン残基の群を含む領域に示される。３個の可能性あるグリコサミノグリカン付加サイト［Ｌ、　Ａ、　ゴールドツユタイン等、（１９８９）、セル（Ｃｅ　］　Ｉ）５６巻１０６３ −１０７２頁］は、アミノ酸４２−４３．６４−６５および１５１−１５２に存在するセリンーグリシンノペプチドに位置している。グリコリル化は、恐らく、ＨＲＧのＮＴＤ−ＧＦＤ　（細胞外）領域について算出された約２６ＫＤというＮＷと、精製されたＨＲＧについて観察される約４５ＫＤというＮＷの間の矛盾を説明するものであろう。

このアミノ酸配列は、１）成熟型が蛋白分解的に放出される、各成長因子のプロ型の存在［Ａ　グレイ、Ｔ、Ｊ　ダル、およびＡ、ウルリッヒ、（１９８３）、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３０３巻７２２−７２５頁、Ｇ、１．ベル等、（１９８６Ｌヌクレイツク・アンド・リサーチ（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）１４巻８４２７−８４４６頁：Ｒ，プリンク等、（１９８４）、セル（Ｃｅｌｌ）２８７−２９７頁］　、２）およそ４０のアミノ酸（ＥＧＦ様構造モチーフ）［ＲＣ，サベッジ等（１９７３Ｌジヤーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２４８巻７６６９−７６７２頁］にわたって特徴的に位置している６個のシスティン残基、即ちＨＲＧ−αシスティン２２６．２３４．２４０．２５４．２５６および２６５の保存：ならびに、３）ＥＧＦホモローガス領域のカルボキシ末端側の近位に存在する貫層ドメインの存在（図４および６）、を包含する、幾つかの特徴を、貫層結合成長因子の表皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリーと共有している［Ｇ、カーペンタ−およびＳ、コーエン（１９７９）、アニュアル・レビュー・オン・バイオケミストリー（Ａｎｎ、Ｒｅｖ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、）４８巻１９３−２１６頁：Ｊ、マセンク（１９９０）、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６５巻２１３９３−２１３９６頁コ。

幾つかのヒトＥＧＦ関連蛋白のＥＧＦモチーフおよび隣接貫層ドメインの領域のアミノ酸配列を並べると（図６）、ＥＧＦモチーフＨＲＧの第一および第六システィンの間が、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）に最も類似（５０％）していることが示される［Ｓ、ヒガシャマ等（１９９１）、サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）２５１巻９３６−９３９頁〕。この同じ領域において、ＨＲＧはアムフィレグリン（ＡＲ）と〜３５％ホモローガスであり［Ｇ、　Ｄ、プラウマン等、（１９９０Ｌモレキユラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ。

Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）１０巻１９６９−１９８１頁コ、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）（８）と〜３２％ホモローガスであり、ＥＧＦと２７％ホモローカスであり［Ｇ、１．ベル等、（１９８６）、ヌクレイツク・アシド・リサーチ（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、）、１４巻８４２７−８４４６頁コ　、そして神経硝種由来成長因子と３９％ホモローガスである［Ｈキムラ等、ネイチャー　（Ｎａｔｕｒｅ）３４８巻２５７−２６０頁、１９９０］　、ＥＧＦのシスティン残基間のジスルフィド結合が、ＥＧＦについて決定された［Ｒ，Ｃサベッジ等、１９７３）、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２４８巻７６６９−７６７２頁コ。これらのジスルフィドは、この領域の二次構造を規定し、三つのループの境界を形成している。アミノ末端上の１から始まってシスティンに番号を付けることにより、ループ１はシスティン１および３で表わされ；ループ２はシスティン２および４；そしてループ３はシスティン５および６で表わされる。このファミリーの他の成員について、該領域におけるジスルフィドの正確な立体配置は決定されていないが、６個のシスティン、ならびに他の幾つかの残基、即ちグリシン２３８および２６２ならびに２６４位のアルギニンの厳密な保存は、これらもまた同じ配置を有するであろう事を示している。ＨＲＧ−αおよびＥＧＦは共にループ１に１３のアミノ酸を持っている。ＨＢ−ＥＧＦ、アムフィレグリン（Ａ　Ｒ）およびＴＧＦαはループ１に１２のアミノ酸を持っている。各成員は、ＨＲＧ−αが１３個である以外はループ２に１０個の残基を有している。５つの成員は全て第三ループに８個の残基を有している。

ＥＧＦ、ＡＲ，ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦ−αは全て、それらの貫層ドメインの効により、膜結合蛋白として新たに合成される。プロ蛋白はその後プロセシングされて成熟した活性分子を生成する。ＴＧＦ−αの場合、膜に付随する該分子のプロ型もまた生物学的に活性であり［Ｒ，ブラハマン等、（１９８９Ｌセル（Ｃｅ　Ｉ　Ｉ）５６巻６９１−７００頁］、この特色はＨＲＧ−ａ（Ｄ場合にもまた真であり得るという証拠がある。ＥＧＦは１１６８アミノ酸の貫層結合プロＥＧＦとして合成され、これは、アルギニン９７０およびアスパラギン９７１の間のアミノ末端ならびにアルギニン１０２３およびヒスチジン１０２４の間のカルボキシ末端で開裂して［Ｇ、　カーペンタ−およびＳ、コーエン（１９７９Ｌアニュアル−Ｌ／ビュー・オン・バイオケミストリー（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）４８巻１９３−２１６頁］、三つのループ、３個のジスルフィド結合の特徴的構造を含む５３個のアミノ酸の成熟ＥＧＦ分子を生成する。２５２アミノ酸プロＡＲは、アスパラギン酸１００およびセリン１０１の間、ならびにリジン１８４およびセリン１８５の間で開裂して、成熟ＡＲの８４アミノ酸型を生成し、そして、グルタミン１０６およびバリン１０７の間のＮｌ２−末端開裂により、７８アミノ酸型が生成する［Ｇ、Ｄ、プラウマン等（１９９０）、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ　ｌ　１．Ｂｉｏｌ、）１０巻１９６９−１９８１頁］。ＨＢ−ＥＧＦはその２０８アミノ酸の第一次翻訳産物がら、アルギニン７３およびバリン７４の間、ならびにカルボキン末端方向におよそ８４アミノ酸だけ離れた第二の部位で開裂することにより、提唱されているその８４アミノ酸型へとプロセシングされる［Ｓ、ヒガシャマ等、およびＭ、クラゲスバーン（１９９１）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２５１巻９３６−９３９頁］。ＴＧＦαの１６０アミノ酸プロ型は、一方ではアラニン３９およびバリン４０の間の開裂、そして下流のアラニン８９およびバリン９０の間の開裂によって、成熟した５０アミノ酸蛋白にプロセシングされる［プリンク等、（１９８４）、セル（Ｃｅ　ｌ　］）］３８巻２８７−２９７頁コ上記分子の各々について、ＥＧＦモチーフの第六システィンおよび巻層ドメインの開始位を境界とする領域において、Ｃ００Ｈ−末端のプロセシングが起こる。

ＨＲＧの第一および第六システィンの間の残基が、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）に最も類似（４５％）している。この同じ領域において、これらはアムフィレグリン（ＡＲ）と３５％一致し、ＴＧＦ−αと３２％一致し、モしてＥＧＦと２７％一致している。ＥＧＦモチーフの外では、ＨＲＧと他のＥＧＦファミリー成員の間には殆ど類似性が無い。ＥＧＦ、ＡＲ，ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦ−αは全て膜に結合したプロ蛋白から誘導され、これがＥＧＦ構造単位の両側でプロセシングされて５０−８４アミノ酸の成熟蛋白（１６−１９）を生成する。他のＥＧＦファミリー成員と同様に、ＨＲＧは膜結合プロ型から誘導されるよってあるが、成熟蛋白の生成には、システィン群に対するＣ末端のただ一つの開裂を必要とするだけである。

ＨＲＧは、そのレセプターに結合し成長調節シグナルの形質導入の引金となることによってその生物学的機能を発揮し得る。これは可溶性分子として、または、時にＴＧＦαの場合にそうであるように、恐らくはその膜結合型として達成され得る［Ｒ，ブラハマン等、（１９８９）、セル（Ｃｅ　Ｉ　Ｉ）５６巻６９１− ７００頁］。シグナル形質導入の刺激とは逆に、またはそれに加えて、ＨＲＧは標的細胞によって内在化し、その場合、次いで他の調節遺伝子の制御領域と相互作用し、その結果、細胞の核にそのメツセージを直接伝達することができる。ＨＲＧがこのような機構によってその作用を仲介するという可能性は、核の位置シグナルと思われるもの［ロバーツ、バイオヶムーバイオフィズ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ）（１９８９）１００８巻２６３−２８０頁コが、５８−６０位の３個のりジン残基付近の領域に存在するという事実によって示唆される（図４）。

図４のＤＮＡ配列を用いてヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１から組み立てられたｃＤＮＡライブラリーからさらなるｃＤＮＡ配列を選択することにより、ＨＲＧ−αの全長ｃＤＮＡの分離を達成する。ＨＲＧ−αをコードしている全長ｃＤＮＡクローンは、３°および５゛の両方向においてより長＜ＨＲＧ−αをコードしているｃＤＮＡを同定し、次いで異なったｃＤＮＡの混成物をスプライスすることによって得る。さらなるｃＤＮＡライブラリーは、この目的に沿って組み立てられる。

以下のものは、組み立てられ得る三つの型のｃＤＮＡライブラリーである＝１）オリゴ−ｄＴでプライミングされるｃＤＮＡライブラリー。この場合、ポリアデノジン残基のつながりが専らプライミングされる、２）ｍＲＮＡのいかなる特定の領域に対しても非特異的である、短い合成デオキシオリゴヌクレオチドを用いて無作為にプライミングされるｃＤＮＡライブラリー、および、３）ｍＲＮＡの所望領域に対し特異的な短い合成デオキシオリゴヌクレオチドを用いて特異的にプライミングされるｃＤＮＡライブラリー。このようなｃＤＮＡライブラリーの分離方法は前に記載した。

実施例４　ノーサン分析によるＨＲＧ−αｍＲＮＡ発現の検出。

高緊縮条件下でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１および５Ｋ−ＢＲ−３細胞ｍＲＮＡのノーサンプロット分析は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１のｍＲＮＡに、少なくとも５個のハイブリダイズするハンドを示し、その場合６．４Ｋｂのバンドが優勢であり、他の、より弱いバンドは９，４．６．９．２．８および１．８Ｋｂの位置である（図５）。５Ｋ−ＢＲ−３のｍＲＮＡにはハイブリダイズするバンドは見られない（このセルラインはｐｌ　ｓ　５　ＨＥＩＨを過剰発現する）。ＭＤＡ−ＭＢ −２３１細胞中のこれらの複数のメツセージの存在は、該遺伝子の交互のスプライシング、遺伝子の一次転写物の様々なプロセシング、または、別のホモローガスなメツセージの転写物の存在、のいずれかを示すものである。これらのメツセージのうちの一つは、ＨＲＧ−αの可溶性非貫膜結合型をコードすることができる。係るメツセージ（図５）は、ＨＲＧ−αの可溶性非貫膜結合型をコードしているｃＤＮＡの産生に使用することができる。

実施例５　ヘレグリンーαによる細胞増殖の刺激。

ＥＧＦレセプターまたはｐｌ　ｓ　５　ＨＥＩＲ２レセプターを発現する幾つかの異なった乳癌セルラインを、リガンド調製により、それらの増殖阻害または刺激に対する感受性について試験した。試験されたセルラインは、ｐｌ　ｓ　５１１２Ｒ２を過剰発現するセルライン５Ｋ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣＨＴＢ３０）；ＥＧＦレセプターを過剰発現するラインＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＡＴＣＣＨＴＢ１３２）；および、中等度レベルの　Ｉ　Ｂ　５１ｔ　Ｅ　Ｒ２の発現を行なうＭＣＦ−７細胞（ＡＴＣＣＨＴＢ２２）であった。これらの細胞は、確立された培養技術に従って培養中に維持され継代された。細胞は、１０％牛脂児血清を含むＤＭＥＭおよびＦ−１２の１：１混合物中で増殖させた。検定のために、保存培養をトリプシンで処理して細胞を培養皿から分離し、約２００００細胞／ウエルのレベルで９６ウエルの微量滴定板に分配した。この増殖検定の実施中、これらは１％牛脂児血清を添加した培地中に維持した。この被験試料を０．２２ミクロンフィルターで濾過することにより滅菌し、４個ずつのウェルに加え、細胞を３７℃で３−５日間インキュベートした。増殖期間の終わりに培地を各ウェルから吸引し、細胞をクリスタルバイオレットで処理した［Ｇ　ルイス等、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）３４７巻５３８２−５３８５頁（１９８７）］、各ウつル中の細胞数に比例するクリスタルバイオレット吸収の量を、フロー・プレイド・リーダー上で測定した。各被験試料について重複しているウェルの値を平均した。各皿において、処置されていないウェルは対照の役割を有する。結果を、対照細胞と比較した増殖のパーセントとして表現した。

精製されたＨＲＧ−αリガンドを細胞増殖検定において活性を試験し、その結果を図７に表わす。およそ１ｎＭのリガンド濃度において、ｐ１８５Ｈ■２レセプターを発現するセルラインはいずれも（ＳＫ−ＢＲ−３およびＭＣＦ−７）　、対照と比較して増殖の刺激を示したが、ＥＧＦレセプターのみを発現する細胞型（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）は認め得る応答を示さなかった。これらの結果は、種々のセルラインを用いた自己燐酸化実験から得られる結果と一致した。これらの結果は、ＨＲＧ−αリガンドがｐＩ　Ｂ　５１１ｉ＋＋　２レセプターに対し特異的であって、これらの濃度においてはＥＧＦレセプターとの認め得る相互作用を示さないということを立証した。

ＨＲＧはｐ１８５１ＩＥゝ２の細胞外ドメインに対して作成された抗体と競合しないが、抗ｐ１８５１ＩＥ′′２Ｍａｂ　２Ｃ４および７Ｆ３（これらは自身抗増殖的である）はＨＲＧに拮抗する。

実施例６　ヘレグリンーβ１のクローニングおよび配列決定。

ＨＲＧ−β１ｃＤＮＡの分離は、ＨＲＧ−αをコードしているＤＮＡ配列のハイブリダイズするフラグメントを用いて、ヒトＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から組み立てられるｃＤＮＡライブラリーからさらなるｃＤＮＡ配列を選択することによって達成した。クローンλｈｅｒ１１．１ｄｂｌ　（ヘレグリンーβ１）を、ＭＤＡ　ＭＢ２３１ポリＡ’ｍＲＮＡから誘導されるλｇｊ＋ｏオリゴｄＴ開始ｃＤＮＡライブラリー中でジーした。λｈｅｒ１６（ＨＲＧ−α）の５°および３ °末端に対応する放射標識された合成りＮＡプローブを、高緊縮条件下でのハイブリダイゼーション反応に使用して、λｈｅｒ１１．１ｄｂｌクローンを分離した。

λｈｅｒ１１．１ｄｂｌクローンのＤＮＡヌクレオチド配列を図８に示す（配列番号９）。ＨＲＧ−β１アミノ酸配列は、下記の位置を除いて、ＨＲＧ−αのＡｓ　ｐ　］、　５位のアミノ末端からＨＲＧ−αの３°末端まで、ＨＲＧ−αとホモローカスである。さらに、ＨＲＧ−β１をコードしているＤＮＡは、３°方向にλｈｅｒ１６より１８９塩基対長く伸長しており、Ｖａ１６７５の後に停止コドンを供給している。λｈｅｒ１１．１ｄｂｌのヌクレオチド位２４７にはＡの代わりにＧがあり、その結果、図９の第２行に示されるように、ＨＲＧ−β１においてＡｒｇ（Ｒ）の代わりにＧｌｎ（Ｑ）が置換されている（配列番号８および配列番号９）。

ＥＧＦモチーフの領域には、ＨＲＧ−αおよびＨＲＧ−β１との間にさらなる相違がある。これらの相違を、ＥＧＦモチーフまたはＧＦＤ　（成長因子ドメイン）の領域におけるＨＲＧ−αおよびＨＲＧ−β１の間の相同性を拡大視して、下に例示する。ここに示される配列は、図９に示されるＨＲＧ−αアミノ酸２２１ −２８６に対応する。星印は、下の比較において同一の残基を示す（配列番号１０および配列番号１１）。

ヘレグリン−ａ　５ＨＬＶＫＣＡＥＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥＣヘレグリンーβ１　＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊ヘレグリンーα　ＦＭＶＫＤＬＳＮＰＳＲＹＬＣＫＣＱＰＧＦヘレグリンーβｌ　＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊ＰＮＥ＊ヘレグリンーα　ＴＧＡＲＣＴＥＮＶＰＭＫＶＱＮＱＥＫ−−ヘレグリンーβ１　＊＊Ｄ＊＊ＱＮＹ＊ＭＡＳＦ’ｉ’ＫＨＬＧＩＥヘレグリンーα 　−−−ＡＥＥＬＹＱＫＲ（−貫膜）ヘレグリンーβＩ　ＦＭＥ＊＊＊＊＊＊＊＊　（−貫膜）実施例７　大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中てのヘレグリンの発現。

ヘレグリンをコートしている図４および図８のＤＮＡ配列を用い、アルカリホスファターゼプロモーターおよび５ＴＩＩリーダー配列の制御の下で、ＨＲＧ−α およびＨＲＧ−β１を大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で発現させた。最初のへレグリン活性の性格決定においては、ヘレグリン分子の天然のアミノおよびカルボキン末端は正確に規定されなかった。しかしながら、ヘレグリンをＥＧＦおよびＴＧＦ−α配列と比較した後に、本発明者等は、５ｅｒ２２１付近で始まりＧｌｕ２７７付近で終わる図４の短縮型ヘレグリンが生物学的活性を有するのではないかと予想した。全てのへレグリンの類似の領域を同定し発現させることができる。

Ｎ末端Ａｓｐ残基の後にＨＲＧ−αの残基２２１ないし２７７が続（、一つの短縮型を組み立てた。Ｇ］ｕ２７７の後の偶発的フレームシフト突然変異のために、ＨＲＧ−α配列はカルボキシ末端上で１３アミノ酸だけ伸長した。したがって、カルボキン末端は、その後に１３アミノ酸配列ＲＰＮＡＲＬＰＰＧＶＦＹＣが続＜ＨＲＧ−ａのＧｌｕ２７７となった（配列番号２０）。

この細胞を燐酸塩を涸渇させた培地で約２０時間増殖させることにより、この組み立て物の発現を導いた。細胞のペーストを収穫し、１０ｍＭ）リス（ｐＨ８）に再懸濁し、ホモジナイズし、４℃で４０分間インキュベートし、そしてその？＆１５Ｋｒｐｍで遠心（ソーパル）することにより、組み替え蛋白を精製した。

上清を３０に限外濾過膜（アミコン）上で濃縮し、濾液を１０ｍＭトリス（ｐＨ８）で平衡化したモノＱカラムに適用した。モノＱカラムから流出した画分を０゜０５％ＴＦＡ　（トリフルオロ酢酸）に調節し、Ｃ４逆相ＨＰＬＣに付した。

０゜１％ＴＦＡ／Ｈ２０中１０−２５％アセトニトリルの勾配で溶出した。溶媒を凍結乾燥により除去し、精製された蛋白を燐酸緩衝化塩水中の０．１％牛血清アルブミンに再懸濁した。図１０は、精製された大腸菌誘導蛋白に応答したＭＣＦ−７細胞を用いたＨＥＲ２レセプターの自己燐酸化のデータを示す。この材料は、ＥＣ５゜が０．８ｎＭという完全な生物活性を示した。この精製された材料はさらに細胞増殖検定（実施例５）においても試験し、強力な細胞増殖の刺激剤であることが判明した。

ＨＲＧ−β１の合成のための組み替え発現ベクターをＨＲＧ−αと類似の方法で組み立てた。この発現ベクターは、５ｅｒ２゜７からＬ　ｅ　ｕ　２７３までのＨＲＧ−β１アミノ酸をコードしているＤＮＡを含んだ（図４）。このＨＲＧ− β１をコードしているＤＮＡを、発現ベクター中のアルカリホスファターゼプロモーターおよび５ＴＩＩリーダー配列より下流に、組み替えによってスプライスした。この組み替え組み立て工程の結果として、さらなるセリン残基がカルボキシ末端上にスプライスされた。ＨＲＧ−β１をコードしている発現ベクターを用いて大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）を形質転換し、燐酸塩涸渇培地中で発現させた。誘導された大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）をペレット化し、１０ｍＭトリス（ｐＨ７，５）中に再懸濁し、超音波処理した。細胞断片を遠心によりペレット化し、上清を、検定に先立ち無菌フィルターで濾過した。ＭＣＦ−７細胞中でＨＥＲ２レセプターの自己燐酸化を刺激する能力を有する蛋白が検出されたことにより、ＨＲＧ −β１の発現が確認された。

類似の発現ベクターを、セリン残基の代わりにＣ末端チロシンを用いて、ＨＲＧ −β１（上記）について記載されたように組み立てた。このベクターを大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中に導入し、前記のように発現させた。この組み替え蛋白の精製を、組み替えＨＲＧ−αについて記載したように実施した。質量分析により、精製された蛋白が、予想より短い型からなることが判明した。アミノ酸配列決定は、この蛋白が所望のＮ末端残基（Ｓｅｒ）を有することを示したが、質量分析により、これはＣ末端で先端が切除されていることが見いだされた。この蛋白の大半（〉８０％）は、Ｃ末端にメチオニンを有する５１アミノ酸長の型から成っていた（ＭＥＴ２７１）（配列番号９）。ＶＡＬ２６９において先端が切除された、より短い型（４９残基）も少量検出された。しかしながら、いずれの短縮型も、ＨＥＲ２レセプター自己燐酸化検定において完全な生物活性を示した。

実施例８　ヘレグリンβ２およびβ３変異体の分離。

５゛方向にさらに伸長しているｃＤＮＡクローンを取得するため、ヘレグリンー β２および一β３変異体を分離した。特別にプライミングさせたｃＤＮＡライブラリーを、化学合成されたアンチセンスプライマー：３°ＣＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＴＣＧＣＴＣＣ（配列番号２１）を用いることによりλｇｔ１０中で組み立てた。このプライマーは、λｈｅｒ１６の配列中ヌクレオチドエ６７−１９０の間に位置する（図４）。クローンλ５’ｈｅｒ１３（λｈｅｒ１３と混同してはならない）の分離を、特別にプライムさせたｃＤＮＡライブラリーをもって、高緊縮条件下でλｈｅｒ１６の５′末端に対応する合成りＮＡプローブをハイブリダイズさせることによって達成した。λ５’ｈｅｒ１３のヌクレオチド配列を図１１（配列番号２２）に示す。λ５’ｈｅｒ１３の４９６塩基対ヌクレオチド配列は、λ５’ｈｅｒ１３のヌクレオチド３０９−４９６およびλｈｅｒ１６の３−１９０の間でλｈｅｒ１６の配列とホモローガスである。λ５’ ｈｅｒ１３はλｈｅｒ１６の開放読み取り枠を１０２アミノ酸だけ伸長している。

変異体へレグリン−β型の分離を、新しく調製したオリゴｄＴブライミングλｇｔ　ＩＯＭＤＡ−ＭＢ−２３１ｍＲＮＡ＝誘導ｃＤＮＡライブラリーを、λ５゜ｈｅｒ１３の５°末端に対応する合成プローブおよびλｈｅｒ１６のシスティンに富むＥＧＦ様領域を用いてブロービングすることによって達成した。ヘレグリンーβの三つの変異体が同定され、分離され、そして配列決定された。全ヘレグリンの間のアミノ酸相同性を図１５に示す（配列番号２６−３０）。

推定されるアミノ酸配列はＥＧＦ様モチーフのシスティン１およびシスティン６の間で同一ではあるが、それらの配列は、恐らくλｈｅｒ１１．１ｄｂｌ中のアミノ酸２４８で始まる予想貫層ドメインの前で異なっていることから、ＨＲＧポリペプチドλｈｅｒ７６（ヘレグリンーβ２）（配列番号２３）、λｈｅｒ７８（ヘレグリンーβ３）（配列番号２４）およびλｈｅｒ８４　（ヘレグリンーβ ２様）（配列番号２５）はλｈｅｒ１１．１ｄｂｌ　（ヘレグリンーβ１）の変異体であると考えられる。λｈｅｒ７６、λｈｅｒ７８およびλｈｅｒ８４のヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列を図１２．１３および１４に示す。

変異体はそれぞれ、それらの配列中の最初のメチオニンコドンの１４８塩基５゜側にＴＧＡ停止コドンを含む。故に、λｈｅｒ１６のヌクレオチド位１３５−１３７のＡＴＧコドンおよび他のへレグリンクローン中の対応するＡＴＧは、開始メチオニン（アミノ酸１）として定義することができる。λｈｅｒ１１．１ｄｂ）、λｈｅｒ７６、λｈｅｒ８４およびλｈｅｒ７８のクローンはすべてアミノ酸３８位にグルタミンをコードしている（図１５）が、一方クローンｈｅｒ１６はアルギニンをコードしている（図４．８２位）。

λｈｅｒ７６　（ヘレグリンーβ１）の推定アミノ酸配列は、６３７アミノ酸をコードしている全長のクローンを明らかにしている。これは、λｈｅｒ１１．１ｄｂ＋のアミノ酸２３２−２３９に対応する残基が欠失している以外はλｈｅｒ１１．１ｄｂｌと同一の推定アミノ酸配列を共有している。λｈｅｒ８４の推定アミノ酸配列は、これが、開始メチオニン（アミノ酸１、図１５）からＥＧＦ様領域および貫層ドメインに至るまで、λｈｅｒ７６と同じアミノ酸配列を持っていることを示している。しかしながら、λｈｅｒ８４はアルギニン４２１（λｈｅｒ８４の番号付け）における初期停止コドンがある。この後に３′非翻訳配列が異なる。λｈｅｒ７８　（ヘレグリンーβ３）の推定アミノ酸配列は、ヘレグリンβ１および−β２と、アミノ酸２３０までホモローガスであり、ここで配列は１１のアミノ酸について異なり、そして終止する。したがって、ヘレグリンー β３は貫層領域を持たない。この３゛非翻訳配列は他のクローンとはホモローガスでない。

実施例９　ヘレグリンβ型の発現。

ヘレグリンーβ型を哺乳動物細胞で発現させるために、λｈｅｒ７６（ヘレグリンーβ２）またはλｈｅｒ８４からの全長ｃＤＮＡヌクレオチド配列を、哺乳動物発現ベクターｐＲＫ５．１中にサブクローニングした。このベクターは、５゜イントロンが後に続くサイトメガロウィルスプロモーター、クローニングボＩＪ　ＩＪンカーおよびＳＶ４０初期ポリアデニル化シグナルを含むｐＲＫ５の誘導体である。Ｃ０８７、サルまたはヒトの腎臓２９３細胞をトランスフェクトし、条件培地をＭＣＦ−７細胞ｐ１８５／ｈｅｒ２自己燐酸化検定で検定した。正の応答により、λｈｅｒ７６（ヘレグリンーβ２）およびλｈｅｒ８４　（ヘレグリンーβ３）からのｃＤＮＡの発現を確認した。

大規模な一時的発現実験からの上清をＹＭＩＯ膜（アミコン）上で濃縮し、実施例１に記載のようにヘパリンセファロースカラムに適用した。０．６Ｍ　ＮａＣ１溶出液のプールに活性（チロシン燐酸化検定）が検出され、これをさらに前記のようにポリアスパラギン酸カラム上で精製した。ＳＤＳゲル分析および活性の検定により、このカラムの活性画分は高度に精製され、見かけの分子量４５０００ダルトンを有する単一のバンドの蛋白が含まれていた。このように、発現された蛋白は、ＭＤＡ２３１細胞から最初に分離されたヘレグリンの本来の型と極めて類似のクロマトグラフィーおよび構造特性を有している。λｈｅｒ８４ｃＤＮＡから作成された組み立て物の小規模一時的発現実験からは、さらに、この変異体型からの細胞上清に、同等レベルの活性のある事が判明した。貫層の無い変異体、ヘレグリンーβ３の発現は、現在研究中である。

実施例１０プロＨＲＧ−αおよびプロＨＲＧ−β、ｃＤＮＡを、サイトメガロウィルスプロモーターを含むエプスタインバーウィルス由来の発現ベクター中にスプライスした。エプスタインバーウィルスＥＢＮＡ−１トランスアクティベーターを発現している安定にトランスフェクトされたＣＥＮ４細胞［ヒト腎臓２９３細胞（ＡＴＣＣＮｏ、１５７３）の無血清条件培地から、ｒＨＲＧを精製した（本質的には実施例２の記載の通り）。別の実験において、全長のプロＨＲＧ−α、−β。

および−β２の一時的発現組み立て物が、トランスフェクトされたＣ０８７サル腎臓細胞の条件培地中にｐ１８５ＨＥＲ２燐酸化活性を提供した。しかしながら、全長のプロＨＲＧ−β３の同様の組み立て物は活性を産生ぜず、この事は、プロＨＲＧ−β３に欠けているが他のプロＨＲＧには存在する疎水性ドメインが、成熟蛋白の分泌に必要であることを示唆している。各々ＧＦＤ構造単位および直接隣接した領域をコードしている、プロＨＲＧ−α（６３アミノ酸、セリン１７７ないしチロシン２３９）およびプロＨＲＧ−β１（６８アミノ酸、セリン１７７ないしチロシン２４１）の先端を切除された型もまた大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）中で発現され、ＨＲＧ−β３のホモローガスな先端を切除された型は、活性分子として発現されると予想される。これら先端を切除された蛋白は、組み替え蛋白を分泌するよう設計された発現ベクターにより形質転換された大腸菌（］：、ｃｏｌｉ）の周辺校および培養ブロスから精製された［Ｃ，Ｎ、チェインジ、Ｍ、レイ、Ｂ。

ボチェン、Ｈ，ヘイネカー、Ｇ、グレイ、ジーン（Ｇｅｎｅ）５５巻１８９頁（１９８７）］。これらの蛋白はさらに、ｐＩ　Ｂ　５１１Ｅｌ１ｍのチロシン燐酸化を刺激するがｐ１０７″′川のそれは刺激せず、この事は、ＨＲＧの生物活性は該蛋白のＥＧＦ様ドメインに存在し、炭水化物部分はこの検定における活性に必須でないことを示している。ＮＴＤはこの活性を阻害または抑制しない。

実施例１１様々なヒトの組織をＨＲＧｍＲＮＡの存在について調べた。転写物は、乳房、卵巣、精巣、前立腺、心臓、骨格筋、肺、肝臓、腎臓、唾液腺、小腸、および膵臓（胃にはない）、膵臓、子宮または胎盤に見いだされた。これらの組織の殆どはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞と同じ三つのクラスの転写物（６，６ｋｂ、　２．　５ｋｂおよび１．８ｋｂ）を示すが、６．６ｋｂのメツセージのみが心臓および骨格筋に観察された。脳内には２．２ｋｂの単一の転写物が観察され、精巣には６５ｋｂ転写物が２．２ｋｂ、１．９ｋｂおよび１．５ｋｂ転写物と共に現われている。ＨＲＧについて観察される組織特異的発現パターンはｐｌｓ　５　ＨＥＲ２についてのそれとは異なっており、例えば、成人の肝臓、膵臓、および脳はＨＲＧを含むがｐ１８５ＨＥ”転写物を含まず、一方胃、膵臓、子宮および胎盤は、ｐ１８５ＨＥ″２転写物を含むがＨＲＧ　ｍ　ＲＮ　Ａを欠（。

配列表（１）　一般的情報（ｉ）　特許出願人：ジエネンテク、インコーポレイテッド（ｉｉ）　発明の名称：ヘレグリンの構造、生産および用途（ｉｉｉ）　配列の数＝３０（ｉｖ）　連絡先：（Ａ）　名宛人：ジェネンテク、インコーポレイテッド（Ｂ）　通り：ポイント・サン・ブルーノ・ブールバー）’４６０番（Ｃ）　市：サウス・サン・フランシスコ（Ｄ）　州：カリフォルニア（Ｅ）　国：アメリカ合衆国（Ｆ）　ＺＩＰ：９４０８０（Ｖ）　コンピューター解読書式（Ａ）　媒体型：５．２５インチ、３６０Ｋｂフロツピーデイスク（Ｂ）　コンピューター：ＩＢＭＰＣ適合（Ｃ）　オペレーティング・シスチムニＰＣ−ＤＯ８／ＭＳ−Ｄｏｓ（Ｄ）　ソフトウェア：　Ｐａｔｆｎ　（ジェネンテク）（ｖｉ）　本出願のデータ：（Ａ）　出願番号：　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０４２９５（Ｂ）　出願日：　１９９２年５月２１日（Ｃ）　分類：（ｖｉｉ）　優先権主張出願のデータ：（Ａ）　出願番号：０７／７０５２５６（Ｂ）　出願日：１９９１年５月２４日（ｖｉｉ）　優先権主張出願のデータ：（Ａ）　出願番号：０７／７６５２１２（Ｂ）　出願日：１９９１年９月２５日（ｖｉｉ）　優先権主張出願のデータ：（Ａ）　出願番号・０７／７９０８０１（Ｂ）　出願日：１９９１年１１月８日（ｖｉｉ）　優先権主張出願のデータ・（Ａ）　出願番号：０７／８４７７４３（Ｂ）　出願日：１９９２年３月６日（ｖｉｉｉ）　弁理士／代理人情報（Ａ）　氏名：ヘンスレイ、マックス・ディ（Ｂ）　登録番号：２７，０４３（Ｃ）　参照／整理番号ニア１２Ｐ４（ｉｘ）　電話連絡先情報：（Ａ）　電話番号：４１５／２２５−１９９４（Ｂ）　ファックス番号：　４１５／９５２−９８８１（Ｃ）　テレックス　９１０／３７１−７１６８（２）　配列番号１の情報：（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ、６塩基（Ｂ）　型、核酸（Ｃ）　鏑の数ニ一本積（Ｄ）　トポロジー　直鎖状（ｘｉ）　配列・配列番号ｌ。

ＣＮＣ＾＾Ｔ６（２）　配列番号２の情報：（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ・６塩基（Ｂ）　型：核酸（Ｃ）　鎖の数ニ一本積（Ｄ）　トポロジー、直鎖状（ｘｉ）　配列：配列番号２：＾＾ＴＡＡＡ　６（２）　配列番号３の情報：（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ：２４アミノ酸（Ｂ）　型二アミノ酸（Ｄ）　トポロジー：直鎖状（ｘｉ）　配列：配列番号３：Ｐｈｅ　１ｌｅｔ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｘａａ　Ａｓｎ　Ｐｒ。

（２）　配列番号４の情報：（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ：２１アミノ酸（Ｂ）　型二アミノ酸（Ｄ）　トポロジー：直鎖状（ｘｉ）　配列：配列番号４：Ｇｌｕ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ（２）　配列番号５の情報：（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ＝１３アミノ酸（Ｂ）　型二アミノ酸（Ｄ）　トポロジー二直鎖状（ｘｉ）　配列：配列番号５・（２）　配列番号６の情報：（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ：４２塩基（Ｂ）　型　核酸（Ｃ）　鎖の数−一本鎖（Ｄ）　トポロジー　直鎖状（ｘｌ）　配列、配列番号６ＧＣＴＧＡＧ＾＾ＧＧ　ＡＧＡＡＧＡＣＣＴＴ　ＣＴＧＴＣＧＴＧＡＡ　ＴＣＧＧＡＣＧＧＣＧ　ＡＧ　４２（２）　配列番号７の情報・（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ：２１９９塩基（Ｂ）　型・核酸（Ｃ）　鎖の数・一本積（Ｄ）　トポロジー：直鎖状（ｘｉ）　配列・配列番号７；ＧＧ　ＧＡＣ＾＾ＡＣＴ丁　ＴＴＣＣＣＡ　ＡＡＣＣＣＧ　ＡＴＣＣＧＡ　ＧＣＣＣＴＴ　ＣＧＡ　３８Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＣＣＡ　ＡＡＣＴＣＧ　ＣＣＴ　ＧＣＧ　ＣＣＧ　ＡＧＡ　’ＧＣＣＧＴＣＣＧＣＧＴＡ　ＧＡＧ　ＣＧＣ７７ＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧＧＣＧＡＧ　ＡＴＧ　ＴＣＣＧＡＧ　ＣＧＣＡＡＡ　ＧＡＡＧＧＣＡＧＡ　１１６Ｓｅｒ　Ｖａｌ、　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＧＧＣＡＡＡ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＧＧＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＣＧＡ　ＧＧＣＴＣＣＧＧＣ１５５Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ＾＾Ｇ　ＡＡＧ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＴＣＣＧＣＧ　ＧＣＧ　ＧＧＣＡＧＣＣＡＧ　ＡＧＣＣＣＡ　ＧＣＣ１９４Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ＾ｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ＾１ａＴＴＧ　ＣＣＴ　ＣＣＣＣＡＡ　ＴＴＧ　ＡＡＡ　ＧＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＡＧＣＣＡＧ　ＧＡＡ　ＴＣＧ　２３３１−ｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　５ｅｒＧＣＴ　ＧＣＡ　ＧＧＴ　ＴＣＣＡＡＡ　ＣＴＡ　ＧＴＣＣＴＴ　ＣＧＧ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＡＣＣＡＧＴ　２７２＾１ａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　５ｅｒ丁ＣＴＧ＾＾　ＴＡＣＴＣＣ丁ＣＴ　ＣＴＣＡＧＡ　ＴＴＣＡＡＧ　ＴＧＧ　ＴＴＣＡＡＧ　ＡＡＴ　３１１Ｓｅｒ　ＧＬｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　ＡｓｎＧＧＧ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＴＴＧ＾＾Ｔ　ＣＧＡ　ＡＡ＾＾＾ＣＡＡＡ　ＣＣＡ　ＣＡＡＡＡＴ　ＡＴＣ３５０Ｇｌｙ　Ａｓｎ　ＧＬｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＡｒｇＬｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　ｌ１ｅ＾ＡＧ　ＡＴＡ　Ｃ＾＾＾ＡＡ　ＡＡＧ　ＣＣＡ　ＧＧＧ＾＾Ｇ　ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＣＴＴ　ＣＧＣＡＴＴ　３８９Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＩｃｅＡＡＣ＾＾＾ＧＣＡ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＧＡＴ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＴＡＴ　ＡＴＧ　ＴＧＣ４２８＾ｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　ＣｙｓＡ＾＾　ＧＴＧ　ＡＴＣＡＧＣＡＡＡ　ＴＴＡ　ＣＧＡ　＾＾丁　ＧＡＣＡＧＴ　ＧＣＣＴＣＴ　ＧＣＣ４６７Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ＾１．ａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ＾＾Ｔ　ＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧ　ＧＡＡ　ＴＣＡ　ＡＡＣＧＡＧ　ＡＴＣＡＴＣＡＣＴ　ＧＧＴ　５０６Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　ＧｌｙＡＴＧ　ＣＣＡ　ＧＣＣＴＣ＾＾ＣＴＧ＾＾ＧＧＡ　ＧＣＡ　ＴＡＴ　ＧＴＧ　ＴＣＴ　ＴＣＡ　ＧＡＧ　５４５Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ＋７０１７５１８０ＴＣＴ　ＣＣＣＡＴＴ　ＡＧＡ　ＡＴＡ　ＴＣＡ　ＧＴＡ　ＴＣＣＡＣＡ　ＧＡＡＧＧＡ　ＧＣＡ　ＡＡＴ　５８４Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇ］、ｙ　Ａｌａ　ＡｓｎＧＴＧ＾＾Ｔ　ＧＧＡ　ＧＧＧ　ＧＡＧ　ＴＧＣＴＴＣＡＴＧ　ＧＴＧ＾＾＾ＧＡＣＣＴＴ　ＴＣＡ７０１Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ八ｓへ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　ＰｈｅＡＣＴ　ＧＧＴ　ＧＡＴ　ＣＧＣＴＧＣＣＡＡ　ＡＡＧ　ＴＡＣＧＴＡ　ＡＴＧ　ＧＣＣＡＧＣＴＴＣ７７９Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　１ｉｅｔ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　ＰｈｅＴｙｒ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇａｙ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　１ｌｅｔ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＧｌｕＣＴＧ　ＴＡＣＣＡＧ　ＡＡＧ　ＡＧＡ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＡＣＣＡＴＡ　ＡＣＣＧＧＣＡＴＣＴＧＣ８５７Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　ＧＬｙ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ＾ＴＣＧＣＣＣＴＣＣＴＴ　ＧＴＧ　ＧＴＣＧＧＣＡＴＣＡＴＧ　ＴＧＴ　ＧＴＧ　ＧＴＧ　ＧＣＣ８９６１１ｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　ｌ１ｅｔ　Ｃｙｓ　Ｖａｔ　Ｖａｔ　ＡｌａＴＡＣＴＧＣ＾＾Ａ　ＡＣＣＡＡＧ　ＡＡＡ　ＣＡＧ　ＣＧＧ　ＡＡ＾＾＾Ｇ　ＣＴＧ　ＣＡＴ　ＧＡＣ９３５Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ｔｌｉｓ　ＡｓｐＣＧＴ　ＣＴＴ　ＣＧＧ　ＣＡＧ　ＡＧＣＣＴＴ　ＣＧＧ　ＴＣＴ　Ｇ＾＾ＣＧ＾＾＾ＣＡＡＴ　ＡＴＧ　９７４＾ｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇ］、ｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　１ｉｅｔＡＴＣＡＡＣＡＴＴ　ＧＣＣＡＡＴ　ＧＧＧ　ＣＣＴ　ＣＡＣＣＡＴ　ＣＣＴ　ＡＡＣＣＣＡ　ＣＣＣ１０１１０ｌ３　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ＾ｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

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（２）　配列番号２５の情報：（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ：２４３１塩基（Ｂ）　型・核酸（Ｃ）　鎖の数ニー重鎖（Ｄ）　トポロジー・直鎖状（ｘｉ）　配列：配列番号２５：ＧＡＧＧＣＧＣＣＴＧ　ＣＣＴＣＣ＾＾ＣＣＴ　ＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡ　ＧＧＴＧＧＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＧＧＣＡＡ　５０ＴＴＧＡＡＡＡＡＧＡ　ＧＣＣＧＧＣＧＡＧＧ　ＡＧＴＴＣＣＣＣＧＡ＾ＡＣＴＴＧＴＴＧＧ　ＡＡＣＴＣＣＧＧＧＣ１００ＴＣＧＣＧＣＧＧＡＧ　ＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴ　ＧＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＧＡ　ＣＧＡＴＧＧＧＡＧＣ１５０ＧＴＧＡＧＣＡＧＧＡ　ＣＧＧＴＧＡＴ＾＾ＣＣＴＣＴＣＣＣＣＧＡ　ＴＣＧＧＧＴＴＧＣＧ　ＡＧＧＧＣＧＣＣＧＧ　２００ＧＣＡＧＡＧＧＣＣＡ　ＧＧＡＣＧＣＧＡＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧＡＣＣＣＡＴＣＧＡＣＧＡＣＴＴＣＣ２５０ＣＧＧＧＧＣＧＡＣＡ　ＧＧＡＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡＧＡＧＣＣＡＧ　ＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＧＴ　３００ＧＧＣＣＧＧＡＣＣＧ　ＣＣＣＧＣＣＧＣＧＴ　ＣＣＧＣＧＣＣＧＣＧ　ＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧ　ＧＣＡＡＣＧＧＧＡＧ　３５０ＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＡＧＣＧＣＧＡＧ　ＣＧＣＣＴＣＡＧＣＧ　ＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧ　ＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴ　４００ＣＧＡＧＧＧＡＣ＾＾＾ＣＴＴＴＴＣＣＣ＾＾＾ＣＣＣＧＡＴＣＣＧＡＧＣＣＣＴＴＧＧ　ＡＣＣＡＡＡＣＴＣＧ　４５０ＧＧＡ　ＡＡＴ　ＧＡＣＡＧＴ　ＧＣＣＴＣＴ　ＧＣＣＡＡＴ　ＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧ　ＣＡＡ８８８ＣＣＴＧＣＧＣＣＧＡ　ＧＡＧＣＣＧＴＣＣＧ　ＣＧＴＡＧＡＧＣＧＣＴＣＣＧＴＣＴＣＣＧ　ＧＣＧＡＧ　ＡＴ　４９７ｅｔＧ　ＴＣＣＧＡＧ　ＣＧＣＡＡＡ　ＧＡＡ　ＧＧＣＡＧＡ　ＧＧＣＡＡＡ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＧＧＣＡＡＧ　５３７Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　ＬｙｓＡＡＧ　ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＣＧＡ　ＧＧＣＴＣＣＧＧＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＴＣＣＧＣＧ　５７６Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ＡｌａＧＣＧ　ＧＧＣＡＧＣＣＡＧ　ＡＧＣＣＣＡ　ＧＣＣＴＴＧ　ＣＣＴαＩ　ＣＡＡ　ＴＴＧ　ＡＡＡ　６１５＾１ａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　ＬｙｓＧＡＧ　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ＡＧＣＣＡＧ　ＧＡＡ　ＴＣＧ　ＧＣＴ　ＧＣＡ　ＧＧＴ　ＴＣＣＡＡＡ　ＣＴＡ　６５４Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ＬｅｕＧＴＣＣＴＴ　ＣＧＧ　ＴＧＴ　ＧＡ＾＾ＣＣＡＧＴ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＴＡＣＴＣＣＴＣＴ　ＣＴＣ６９３Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ＾ＧＡ　ＴＴＣＡＡＧ　ＴＧＧ　ＴＴＣＡＡＧ　ＡＡＴ　ＧＧＧ＾＾Ｔ　ＧＡＡ　ＴＴＧ　ＡＡＴ　ＣＣＡ７３２Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＡｒｇＡＡＡ　ＡＡＣＡＡＡ　ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＡＡＴ　ＡＴＣＡＡＧ　ＡＴＡ　Ｃ＾＾＾＾Ａ　ＡＡＧ　ＣＣＡ　７７１Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＣＴＴ　ＣＧＣＡＴＴ　ＡＡＣＡＡＡ　ＧＣＡ　ＴＣＡ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　８］、０Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＡｌａＧＡＴ　ＴＣＴ　ＧＧＡ　ＧＡＧ　ＴＡＴ　ＡＴＧ　ＴＧＣＡＡＡ　ＧＴＧ　ＡＴＣＡＧＣＡＡＡ　ＴＴＡ　８４９＾ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕｌｌｏ　１１５ＧＣＣＣＴＣＣＴＴ　ＧＴＧ　ｆ’；ＴｒｒＺ（’：　ＡＭ　ＡＴ（’；　ＴＧＴ　Ｉ’：Ｔｌ’：　ＣＴＣＭｒ　ＴＡｒ　１７ＱＧｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　ＧｌｕＡｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ＾ｌａ　ＴｙｒＡＧＣＡＧＣＣＣＡ　ＡＣＴ　ＧＧＧ　ＧＧＣＣＣＡ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　ＣＧＴ　ＣＴＴ　ＡＡＴ　ＧＧＣ１６６ｇ５ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　ＧｌｙＡＣＡ　ＧＧＡ　ＧＧＣＣＣＴ　ＣＧＴ　ＧＡＡＴＧＴ　ＡＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＧＧ　ＣＡＴ　１７０７Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＨｉｓＧＣＣＡＧＡ　ＧＡＡ　ＡＣＣＣＣＴ　ＧＡＴ　ＴＣＣＴＡＣＣＧＡ　ＧＡＣＴＣＴ　ＣＣＴ　ＣＡＴ　１７４６＾１ａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ＾ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＨｉｓＡＧＴ　ＧＡＡ　ＡＧＧ　ＴＡＡＡＡ　ＣＣＧＡＡＧＧＣＡＡ　ＡＧＣＴＡＣＴＧＣＡ　ＧＡＧＧＡＧＡＡＡＣ１７９０Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　ＡｒｇＴＣＡＧＴＣＡＧＡＧ　ＡＡＴＣＣＣＴＧＴＧ　ＡＧＣＡＣＣＴＧＣＧ　ＧＴＣＴＣＡＣＣＴＣＡＧＧＡＡＡＴＣＴＡ　１８４０ＣＴＣＴ＾＾ＴＣＡＧ　ＡＡＴＡＡＧＧＧＧＣＧＧＣＡＧＴＴＡＣＣＴＧＴＴＣＴＡＧＧＡ　ＧＴＧＣＴＣＣＴＡＧ　１８９０ＴＴＧＡＴＧＡＡＧＴ　ＣＡＴＣＴＣＴＴＴＧ　ＴＴＴＧＡＣＧＧＡＡ　ＣＴＴＡＴＴＴＣＴＴ　ＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴ　１９４０ＣＴＣＧＴＣＧＴＣＣＣＡＧＴＧＡＣＴＧＡ　ＣＡＧＧＣＡＡＣＡＧ　ＡＣＴＣＴｒＡ＾＾Ｇ　ＡＧＣＴＧＧＧＡＴＧ　１９９０ＣＴＴＴＧＡＴＧＣＧ　ＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧ　ＣＡＣＡＴＧＧＡＧＴ　ＴＴＣＣＡＧＣＴＣＴ　ＧＧＣＣＡＴＧＧＧＣ２０４０ＴＣＡＧＡＣＣＣＡＣＴＣＧＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＧＴＣＣＴＣＡ　ＧＴＴＧＴＡＡＣＡＴ　ＴＡＧＡＧＡＧＡＴＧ　２０９０ＧＣＡＴＣＡＡＴＧＣＴＴＧＡＴＡＡＧＧＡ　ＣＣＣＴＴＣＴＡＴ＾＾ＴＴＣＣ＾＾ＴＴＧ　ＣＣＡＧＴＴＡＴＣＣ２１４０ＡＡＡＣＴＣＴＧＡＴ　ＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧ　ＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＧＴＧＴＴＣＴＴＡＴ　ＣＴＧＣＴＡＡＣＣＣ２１９０ＴＧＴＣｎＡαゴＴＣＣＡＧＣＣＴＣＡ　ＧＴＴＡＡＧＴＣＡＡ　ＡＴＣＡＡＧＧＧＣＴ　ＡＴＧＴＣＡＴＴＧＣ２２４０ＴＧＡＡＴＧＴＣＡＴ　ＧＧＧＧＧＧＣＡＡＣＴＧＣＴＴＧＣＣＣＴ　ＣＣＡＣＣＣＴＡＴＡ　ＧＴＡＴＣＴＡＴＴＴ　２２９０ＴＡＴＧＡＡＡＴＴＣＣＡＡＧＡＡＧＧＧＡ　ＴＧＡＡＴＡＡＡＴＡ　ＡＡＴＣＴＣＴＴＧＧ　ＡＴＧＣＴＧＣＧＴＣ２３４０ＴＧＧＣＡＧＴＣＴＴ　ＣＡＣＧＧＧＴＧＧＴ　ＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡ　ＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ　２３９０ＡＡＡＡＡ＾＾ＡＡＡ　ＡＡ＾＾＾＾＾＾＾＾＾ＡＡＡＡＡ＾＾＾＾＾ＡＡ＾＾＾＾ＡＡＡ＾２４３１（２）　配列番号２６の情報・（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ：６２５アミノ酸（Ｂ）　型、アミノ酸（Ｄ）　トポロジー・直鎖状（ｘｉ）　配列：配列番号２６・Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓｌ　５　１０　１５Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　５ｅｒＧｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ＾ｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　５ｅｒＳｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　ＬｙｓＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ＾］、ａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ＾１ａ９５　１００、　１０５＾ｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ＾ｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ＾ｌａ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　ｌ１ｅ１１ｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　１ｌｅｔ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　５ｅｒＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｎ　ＴｈｒＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　ＬｅｕＶａ１Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＧｌｕＣｙｓ　Ｐｈｅ　１ｌｅｔ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＣｙｓＬｙｓ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａ１Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇ１ｎＬｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ｒｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａ１Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ＾ｌａ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　、Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇ１ｎ＾ｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　ＧｌｕＡｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　ＡｓｎＰｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ＬｙｓＡｓｎ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　％’ａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　ＴｈｒＳｅｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＴｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　ＴｈｒＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　５ｅｒＶａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ＾ｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ＾ｒｇ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　１ｌｉｓＳｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　１ｌｅｔ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　５ｅｒＰｒｏ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　５ｅｒＧｌｕ　１ｌｅｔ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　１ｌｅｔ　Ｐｒｏ　５ｅｒ４５５　４６０　’　４６５ｌｅｔ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＬｅｕＶａｔ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｓｐ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｐｒ。

Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　ｆｌｉｓ　Ｈｉｓ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ＡｓｎＳｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＴｙｒＧｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＬｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ＾ｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ１１ｅ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　５ｅｒＳｅｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ５００　５ｔ！ｔｏ　５８５Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ＾１ａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ＾ｌａ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　ＡｌａＧｌｙ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇ１ｎ（２）　配列番号２７の情報：（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ：６４５アミノ酸（Ｂ）　型二アミノ酸（Ｄ）　トポロジー：直鎖状（ｘｉ）　配列；配列番号２７：Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ＾ｌａ　Ｇｌｙ　５ｅｒＧｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　１ｌｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　５ｅｒＳｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　ＬｙｓＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ＡｌａＡｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＡｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　ｌ１ｅ１１ｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　５ｅｒ１．４（１１４５１５０Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｎ　ＴｈｒＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｖａ１１１ｅｔ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　丁ｙｒ　Ｌｙｓ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｇｌｕ　ＡｌａＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ１１ｅ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　１ｌｅｔ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　ＣｙｓＬｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　［Ｉｉｓ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇ１ｎＳｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ｍｅｔ　１ｌｅｔ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｓｎ　ＧｌｙＰｒｏ　ｆｌｉｓ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ＾５ｎＧｉｎ　Ｔｙｒ　ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ＾ｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＳｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｖａ１１１ｅ　Ｖａｔ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＴｈｒＧｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ＧｌｕＣｙｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ＾ｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｖａｔ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＰｒｏ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒ。

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Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＧｉｎ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ＡｓｎＳｅｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ＾ｓｎ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ＾ｌａ　ＡｓｎＡｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ＾ｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　５ｅｒＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ＰｈｅＬｅｕ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒ。

Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　ＰｈｅＳｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ＾ｌａ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ａｌａ＾ｓｎ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｖａ１（２）　配列番号２９の情報：（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ＝４２０アミノ酸（Ｂ）　型・アミノ酸（Ｄ）　トポロジー：直鎖状（ｘｉ）　配列：配列番号２９：１［ｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓｌ　５　１０　１５Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ＾Ｌａ　Ｇｌｙ　５ｅｒＧｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　５ｅｒＳｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｇｌｎ　ＬｙｓＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ＾ｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ＾ｓｐ　Ｓｅｒ　ＧＬｙ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＡｓｐ　Ｓｅｒ＾ｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　ｌ１ｅ１１ｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　５ｅｒＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ａｓｎ　ＴｈｒＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｖａ１Ｌｙｓ　Ｃｙｓ＾ｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＧｌｕＣｙｓ　Ｐｈｅ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＣｙｓＬｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｖａ１Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａ１Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　Ｃｙｓ　Ｉｌｅ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ｌ１ｅＭｅｔ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　ＬｙｓＬｅｕ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ａｓｎ２７５　２ｇ０　２８５Ｍｅｔ　Ｎｅｔ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ＾ｓｎ　Ｇｉｎ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　！ｓｎ　Ｖａｌ　ｌ１ｅＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　５ｅｒＴｈｒ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ＾ｌａ　Ｈｉｓ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ＴｈｒＧｉｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ｌ１ｅＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　ｆｌｉｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＡｓｎＳｅｒ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ＡｓｎＧｌｙ　Ｔｈｒ　Ｇ］、ｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ＾１ａＡｒｇ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ｌ１ｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ（２）　配列番号３０の情報：（ｉ）　配列の特徴（Ａ）　長さ＝２４１アミノ酸（Ｂ）　型二アミノ酸（Ｄ）　トポロジー：直鎖状（ｘｉ）　配列：配列番号３０゜Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓｌ、　５　１０　１５Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　５ｅｒＧｉｎ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇ１ｎＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　５ｅｒＳｅｒ　Ｇｌｕ　丁ｙｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　ＡｓｎＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　ＬｙｓＬｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａ１．ａＡｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｍｅｔ　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ＾ｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　ｌ１ｅ１ｉｅ　Ｔｈｒ　Ｇ］、ｙ　Ｍｅｔ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ＾ｌａ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　５ｅｒＧｌｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｎ　ＴｈｒＳｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｖａ１Ｌｙｓ　Ｃｙｓ＾ｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ＧｌｕＣｙｓ　Ｐｈｅ　１ｌｅｔ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　ＣｙｓＬｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｖａ１２１５　２２０　’　２２５Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒ。

ｌｕ分ＦＩＧ、２Ｂ　画分番号　（分）ＦＩＧ、２Ｃｍ分番号ＦＩＧ、　３、ＺＪ、Ｇ　ＡＡＡ　ＣＡＧ　ＣＧＧ　ＡＡＡ　ＡＡＧ　ＣＴＧ　ＣＡＴ　ＧＡＣＣＧＴ　ＣＴＴ　ＣＧＧ　ＣＡＧ　９７４ＡＳｎ　ｐｒｏ　Ｌｅｕ　入１ａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｐｈ＝τ ＝　：、＝、ＣＡＧ　Ｇλ−Ｇλ入ＡＴ：　ＣＡＧ　Ｇ　２０１０ＦＩＧ、　５ヘレグリン２−アルファによる細胞増殖刺激　。

対照　５ＫＢＲ−３ＭＣＦ−７ＭＢ−４６８ＦＩＧ、　７ＧＧ　ＧＡＣＡＡＡ　ＣＴＴ　ＴＴＣＣＣＡ　ＭＣ”ｎｃＧ　ＡＴＣＣＧＡ　ＧＣＣＣＴＴ　ＧＧＡ　３ＢＦＩＧ、８ＡＨＥＲ２自動リン酸化刺激８日Ｇ２（７Ｋ）［ｎＭ］ＦＪｏ、１０ＡＡ　ＡＧＡ　ＧＣＣＧＧＣＧＡＧ　ＧＡＧ　ＴＴＣＣｅＣＧＡＡ　ＡＣテ　７０丁　ＴＧＧ　ＡＡＣ３ＢＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧ　ＧＧＣＡＡＴＴＧＡＡ　ＡＡＡＧＡＧＣＣＧＧ　ＣＧＡＧＧＡＧＴＴＣＣＣＣＧＡＡＡＣＴＴ　５０ＧＴＴＧＧ入ＡＣＴＣＣＧＧＧＣＴＣＧＣＧ　ＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧ　ＧＡＧＣＴＧＡＧＣＧ　ＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧ　１００ＣＣＧＧＡＣＧＡＴＧ　ＧＧＡＧＣＧＴＧＡＧ　ＣＡＧＧＡＣＧＧＴＧ　ＡＴＡＡＣＣＴＣＴＣＣＣＣＧＡＴＣＧＧＧ　１５０ＴＴＧＣＧＡＧＧＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡＧＡ　ＧＧＣＣＡＧＧＡＣＧ　ＣＧＡＧＣＣＧＣＣＡ　ＧＣＧＧＣＧＧＧＡＣ２００ＧＣＧＣＣＣＧＴＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＧ　ＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＴＣＣＧＣＧ　ＣＣＧＣＧＣＴＣ（こ　３００ＴＧＣＡＧＧＣＡＡＣＧＧＧＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＣＡＧＣＧＣＧＡＧＣＧＣＣＴ　ＣＡＧＣＧＣＧＧＣＣ３５０ＧＣＴＣＧＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＧＡＧＧ　ＧＡＣＡＡＡＣＴＴＴ　ＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣＧＡＴＣＣＧＡＧＣＣ４００ＣＴＴＧＧＡＣＣＭ　ＡＣＴＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＧＡＧＡＧＣＣＧＴＣＣＧＣＧＴＡＧ　ＡＧＣＧＣＴＣＣＧＴ　４５０ＴＡＴＴＴＴＡＴＡＴ　ＡＡＴＡＡＡＧＴＡＴ　ＴＣＣＡＣＣＴＴＡＡ　ＡＴＴＡＡＡＣＡＡＴ　ＴＴＡＴＴＴＴＡＴＴ　２４６０ＴＴＡＧＣＡＧＴＴＣＴＧＣＡＡＡＴＡＡＡ　Ｎμ ＡｖＡＭ講２４９０ＦＩＧ、　ｆ２ＥＧＣＧＣＣＴＧＣＣＴ　ＣＣＡＡＣＣＴＧＣＧ　ＧＧＣＧＧＧＡＧＧ’ｒ　ＧＧＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＧＧＣＪＷＴＧ　５０ＡＡＡＡＡＧＡＧＣＣＧＧＣＧＡＧＧＡＧＴ　ＴＣＣＣＣＧＡＡＡＣＴＴＧＴＴＧＧＡＡＣＴＣＣＧＧＧＣ’ｒＣＧ　１００ＣＧＣＧＧＡＧＧＣＣＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧ　ＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＧＣＣＧＧＡＣＧＡ　ＴＧＧＧＡＧＣＧＴＧ　１５０ＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧ　ＴＧＡＴＭＣＣＴＣＴＣＣＣＣＧＡＴＣＧ　ＧＧＴ’ｒＧＣＧＡＧＧ　ＧＣＧＣＣＧＧＧＣＡ　２００ＧＡＧＧＣＣＡＧＧＡ　ＣＧＣＧＡＧＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＧ　ＡＣＣＣＡＴＣＧＡＣＧＡＣ？ＴＣＣＣＧＧ　２５０ＧＧＣＧＡＣＡＧＧＡ　ＧＣＡＧＣＣＣＣＧＡ　ＧＡＧＣＣＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＣＧＴ　ＴＣＣＡＧＧＴＧＧＣ３００ＣＧＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＣＧＣＧＴＣＣＧ　ＣＧＣＣＧＣＧＣＴＣＣＣＴＧＣＡＧＧＣＡ　ＡＣＧＧＧＡＧＡＣＧ　３５０ＣＣＣＣＣＧＣＧＣＡ　ＧＣＧＣＧＡＧＣＧＣＣＴＣＡＧＣＧＣＧＧ　ＣＣＧＣＴＣＧＣＴＣＴＣＣＣＣＡＴＣＧＡ　４００ＧＧＧＡＣＡＡＡＣＴ　ＴＴＴＣＣＣＡＡＡＣＣＣＧＡＴＣＣＧＡＧ　ＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＡＡＡＣＴＣＧＣＣＴ　４５０ＴＴＡＣＣＡＧＡＴＣＴＭＴＡＴＴＧＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＴＧＴＣＧＣＡＴＧＡ　ＧＡＡＣＡＴＴＡＡＣ１３４０ＡＡＡＡＧＣＡＡＴＴ　ＧＴＡＴＴＡＣＴＴＣＣＴＣＴＧＴＴＣＧＣＧＡＣＴＡＧＴＴＧＧ　ＣＴＣＴＧＡＧＡＴＡ　１３９０ＣＴＡＡＴＡＧＧＴＧ　ＴＧＴＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＡＴＧＴＴＴＣＴＧＧＡＡＴＴＧＡＴ　ＡＴＴＧＡＡ’Ｉ’ＧＡＴ　１４４０ＧＴＧＡＴＡＣＡＡＡ　ＴＴＧＡＴＡＧＴＣＡ　ＡＴＡＴＣＡＡＧＣＡ　ＧＴＧＡＡＡＴＡＴＧ　ＡＴＭＴＡＡＡＧＧ　１４９０ＣＡＴＴＴＣＡＡＡＧ　ＴＣＴＣＡＣＴＴＴＴ　ＡＴＴＧＡＴＡＡＡＡ　ＴＡＡＡＡＡＴＣＡＴ　ＴＣＴＡＣＴＧＡＡＣ１５４０ＡＧＴＣＣＡＴＣＴＴ　ＣＴＴＴＡＴＡＣＡＡ　ＴＧＡＣＣＡＣＡＴＣＣＴＧＡＡＡＡＧＧＧ　ＴＧＴＴＧＣＴＡＡＧ　１５９０ＣＴＧＴＡＡＣＣＧＡ　ＴＡＴＧＣＡＣＴＴＧ　ＡＡＡＴＧＡＴＧＧＴ　ＭＧＴＴＡＡＴＴＴ　ＴＧＡＴＴＣＡＧＭ　１６４０ＴＧＴＧＴＴＡＴＴＴ　ＧＴＣＡＣＡＡＡＴＡ　ＭＣＡＴＭＴＭ　ＡＡＧＧＡＧＴＴＣＡ　ＧＡＴＧＴＴＴＴＴＣ１６９０ＴＴＣＡＴＴＡＡＣＣＡＡＡＡＡ　１７１５ＦＩＧ、　１３ＣＧＡＧＧＣＧＣＣＴＧ　ＣＣＴＣＣＭＣＣ”ｒ　ＧＣＧＧＧＣＧＧＧＡ　ＧＧＴＧＧＧＴＧＧＣＴＧＣＧＧＧＧＣ入＾　５０ＡＡＡ　ＭＣＡＭ　ＣＣＡ　ＣＡＡ　ＭＴ　ＡＴＣＭＧ　ＡＴＡ　ＣＭ　入ＡＡ　ＡＡＧ　ＣＣＡ　７７１ＡＣＡ　ＧＧＡ　ＧＧＣＣＣＴ　ＣＧＴ　ＧＡＡ　ＴＧＴ　ＡＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＣＡＧＧ　ＣＡＴ　１７０７ＧＣＣＡＧＡ　ＧＡＡ　Ａに　ＣＣＴ　ＧＡＴ　ＴＣＣＴＡＣＣＧＡ　ＧＡＣＴＣＴ　ＣＣＴ　ＣＡＴ　１７４６八ＧＴ　ＧＭ　ＡＧＧ　ＴＡＡＡＡ　ＣＣＧＡＡＧＧＣＡＡ　ＡＧＣＴＡＣＴＧＣＡ　ＧＡＧＧＡＧＡＡＡＣ１７９０ＴＣＡＧＴＣＡＧＡＧ　ＡＡＴＣＣＣＴＧＴＧ　ＡＧＣＡＣＣＴＧＣＧ　ＧＴＣＴＣＡＣＣＴＣＡＧＧＡＡＡＴＣＴＡ　１８４０ＴＣＡＧＡＣＣＣＡＣＴＣＧＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＧ？ＣＣＴＣＡ　ＧＴ’！’ＧＴＡＡＣＡＴ　ＴＡＧＡＧＡＧＡＴＧ　２０９０ＧＣＡＴＣＭＴＧＣＴＴＧＡＴＭＧＧＡ　ＣＣＣＴＴＣＴＡＴＡ　ＡＴＴＣＣＭＴＴＧ　ＣＣＡＧＴＴＡＴＣＣ２１４０ＡＡＡＣＴＣＴＧＡＴ　ＴＣＧＧＴＧＧＴＣＧ　ＡＧＣＴＧＧＣＣＴＣＧＴＧＴＴＣＴＴＡＴ　（ＪＧＣＴＡＡＣＣＣ２１９０ＴＧＭＴＧＴＣＡＴ　ＧＧＧＧＧＧＣＡＡＣＴＧＣＴＴＧＣＣＣＴ　ＣＣＡＣＣＣＴＡＴＡ　ＧＴＡＴＣ’ｒＡＴＴＴ　２２９０ＴＡＴＧＡＭＴＴＣＣＭＧＡＡＧＧＧＡ　ＴＧＭＴＡＡＡＴＡ　ＭＴＣＴＣＴ’ｌ’ＧＧ　ＡＴＧＣＴＧＣＧＴＣ２３４０ＴＧＧＣＡＧＴＣＴＴ　ＣＡＣＧＧＧＴＧＧＴ　ＴＴＴＣＡＡＡＧＣＡ　Ｇんυ彷Ａ〜ｖＡλＰＪＪＡλＭいＡ２３９０Ａλ〜りぴＪ訊＾ＡＡλ〜υすζ３＾Ａ　Ａ　２４３１ＦＩＧ、　１４Ｄ０ｏＯｏｏ　零；♀；　冨；ｇ８　写；♀♀へへへ“へ　へへ〜へ　〜の〜へ　のののの宕；冨ｇ　零；雪　鵞；ｇ　写；♀　宮；２０寸りΩ　寸す寸　寸の寸　りｈψ　りのり墳−Ｑマ　リ一ゆ　１Ｐψ　１−１　１ｔすｖ−Ｐ１％　ＣＤ　Ｉ−ｒ　Ｎ　ｒ　ｒ　さ？−ｆｆ　さ１”’　？　１％国際調査報告　。ｒ？／ＩＦ。つ７゜□ワ。９フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　１３１００　８３１８−４ＨＣ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４Ｂ１５／１２　ＺＮＡＣ１２Ｐ　２１１０８　８２１４−４ＢＣ１２Ｑ　１／６８　Ａ　７８２３−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２Ｃ１２Ｒ１：１９）（Ｃ１２Ｎ　５／１０Ｃ１２Ｒ１：９１）（３１）優先権主張番号　７９０，８０１（３２）優先日　１９９１年１１月８日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ）（３１）優先権主張番号　８４７，７４３（３２）優先日　１９９２年３月６日（３３）優先権主張国　米国（ＵＳ）Ｉ（３１）優先権主張番号　８８０，９１７（３２）優先日　１９９２年５月１１日ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＡＵ、ＣＡ、ＪＰ

Claims

【特許請求の範囲】１．分離されたへレグリンポリペプチドを含む組成物。２．ヘレグリンが抗原的に活性である、請求項１の組成物。３．ヘレグリンが生物学的に活性である、請求項１の組成物。４．ヘレグリンがＨＲＧ−ＧＦＤである、請求項３の組成物。５．ヘレグリンがヘレグリン−α、−β１、−β２、または−β３である、請求項１の組成物。６．ヘレグリンがヒトヘレグリン−α−ＧＦＤである、請求項３の組成物。７．ヘレグリンがヒトヘレグリン−β１−ＧＦＤ、ヘレグリン−β２−ＧＦＤまたはヘレグリン−β３−ＧＦＤである、請求項３の組成物。８．薬学上許容し得る担体をさらに含む、請求項１の組成物。９．ヘレグリンがヘレグリンＧＦＤである、請求項８の組成物。１０．免疫アジュバントをさらに含む、請求項９の組成物。１１．ヘレグリンＧＦＤが免疫原性非ヘレグリンポリペプチドを含む、請求項１０の組成物。１２．ヘレグリンがＮＴＤ−ＧＦＤである、請求項１の組成物。１３．ヘレグリンがＮＴＤ−ＧＦＤ−β３ポリペプチドである、請求項１の組成物。１４．ヘレグリンがＨＲＧ−ＧＦＤである、請求項１の組成物。１５．ヘレグリンが細胞質ドメインを含む、請求項１の組成物。１６．ヘレグリンがＮＴＤ−ＧＦＤであり、且つこれが天然のヘレグリン−α、 −β１、−β２、−β３ＮＴＤ−ＧＦＤ配列と少なくとも８５％ホモローガスなアミノ酸配列を有する、請求項１の組成物。１７．ヘレグリンポリペプチドが酵素を含む、請求項１の組成物。１８．ヘレグリンがＨＲＧ−αである、請求項１６の組成物。１９．ヘレグリン−αが、残基１−２３、１０７−１０８、１２１−１２３、１２８−１３０および１６３−２４７のうちいずれか一つに隣接するアミノ酸を置換、除去または挿入させている、請求項１８の組成物（図１５）。２０．ヘレグリンがＨＲＧ−β１である、請求項１６の組成物。２１．ヘレグリン−β１が、残基１−２３、１０７−１０８、１２１−１２３、１２８−１３０および１６３−２５２に隣接するアミノ酸を置換、除去または挿入させている、請求項２０の組成物（図１５）。２２．ヘレグリンがＨＲＧ−β２である、請求項１６の組成物。２３．ヘレグリン−β２が、残基１−２３、１０７−１０８、１２１−１２３、１２８−１３０および１６３−２４４のうちいずれか一つに隣接するアミノ酸を置換、除去または挿入させている、請求項２２の組成物（図１５）。２４．ヘレグリンがＨＲＧ−β３である、請求項１６の組成物。２５．ヘレグリン−β３が、残基１−２３、１０７−１０８、１２１−１２３、１２８−１３０および１６３−２４１のうちいずれか一つに隣接するアミノ酸を置換、除去または挿入させている、請求項２４の組成物（図１５）。２６．ヘレグリンポリペプチドを結合させることのできる、分離された抗体。２７．ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２、またはヘレグリン−β３に特異的に結合することのできる、請求項２６に記載の分離された抗体。２８．分離された、ヘレグリンをコードしている核酸。２９．ヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２、またはヘレグリン−β３ポリペプチドをコードしている、請求項２８の核酸。３０．ヘレグリン−ＧＦＤをコードしている、請求項２８の核酸。３１．請求項２８の核酸を含む発現ベクター。３２．核酸がヘレグリン−ＧＦＤをコードしている、請求項３１の発現ベクタ３３．請求項３１のベクターにより形質転換された宿主細胞。３４．請求項３３の宿主細胞を培養してヘレグリンを発現させ、そのヘレグリンを宿主細胞から回収することからなる方法。３５．ヘレグリンかヘレグリン−α、ヘレグリン−β１、ヘレグリン−β２、またはヘレグリン−β３である、請求項３４の方法。３６．ヘレグリンがヘレグリン−ＮＴＤ−ＧＦＤである、請求項３４の方法。３７．ヘレグリンがヘレグリン−ＧＦＤである、請求項３４の方法。３８．請求項２８の核酸を被験試料の核酸と接触させ、ハイブリダイゼーションが起こったか否かを決定することからなる、ヘレグリン核酸の存在を決定する方法。３９．請求項２８の核酸で核酸のポリメラーゼ連鎖反応を開始させることからなる、核酸被験試料を増幅する方法。４０．汚染された溶液由来のヘレグリンをヘパリンセファロースまたは陽イオン交換樹脂上に吸着させることからなる、ヘレグリンを精製する方法。