JPH06508505A - ブチリルコリンエステラーゼの製法と用途 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ブチリルコリンエステラーゼの製法と用途この発明は、ブチリルコリンエステラ ーゼに関するものであり、より詳細にはその製法と用途に関する。

発明の背景 ブチリルコリンエステラーゼ（アシルコリン　アシル加水分解酵素、ＥＣ３，１ ，１，８，更には擬コリンエステラーゼとして知られる）はそれが探索されたす べてのを推動物の他の組織の中でも血漿中で発見された一つの酵素である（Ａ、 シルバー、「コリンエステラーゼの生物学」ノースホランド、アムステルダム、 １９７４年）。人の血漿にこの酵素が存在することは、正式には５０年前に証明 された（Ｇ、Ａ、アレスおよびＲ，Ｃ，ホース「生物化学ジャーナルＪ　１３３ ：３７５゜１９４０年）が、その正常な生理的役割は未知のままであった。しか しブチリルコリンエステラーゼは、現在臨床用物質であるスクシニルコリンおよ び関連麻酔剤などのような筋肉弛緩剤の加水分解および不活性化の原因となる（ Ｂ、Ｍ、レイデュ「ニューヨークアカデミ−・オブ・サイエンス年報、１７９： ６４８．１９７１年）。更にブチリルコリンエステラーゼは、麻薬常用者により 摂取されたコカインの大部分を分解するものとなる（Ｄ、Ｊ、スチュワード他。

「生活化学Ｊ２０：１５５７．１９７７年。Ｐ、ジャドロー他、「麻酔とアナゲ ネシス（改善）Ｊ　５８：２３５．１９７９年。Ｄ、Ｊスチュワード他。「臨床 薬理療法Ｊ　２５：４６４，１９７９年）。

人のブチリルコリンエステラーゼの遺伝子は、「野生型」（正常）対立遺伝子お よび人口の５％はどに存在するいくつかの欠損対立遺伝子として存在する（Ｍ、 ライタツカ−「麻酔法Ｊ　３５：　１７４．１９８０年、Ｒ，Ｔ、工ヴアンス、 ＣＲＣ臨床実験科学りリティカルレヴユーで検討された）。２８００個体に約１ の割合で、その遺伝子型がブチリルコリンエステラーゼを甚だしく欠損した形で 現れる。手術に先立ちこれらの個体が全身麻酔を誘導中にスクシニルコリンで治 療を受けると、通常の個体群に比べて生じる麻痺が異常に長び（。この期間患者 は息をすることが出来ず無呼吸として知られる状態になり、スクシニルコリンが 二次医療で分解されるまで人工呼吸を行う必要がある。これは潜在的には生命を 脅かす事態と見做される。ブチリルコリンエステラーゼ活性は更に、肝炎のよう なある種の病気（Ｄ、Ｃ，シン他「産業医療協会ジャーナル」６６：４９，１９ ７６年）によって、あるいは各種の薬物治療の結果（Ｆ、Ｆ、フォールズ「麻酔 学における酵素Ｊスブリンガー出版社、ニューヨーク、１９７８年）として、妊 娠時に正常水準からスクシニルコリン感度を誘導するまで十分に低下させること が出来る（Ｊ、Ａ、Ｗ、ワイルドスミス「麻酔」２７：９０，１９７２年。Ｄ、 Ｂ、ワイスマンおよびＪ、エレンワース「麻酔と鎮痛Ｊ　６２：４４４．１９８ ３年）。

毒物学上、コカインはまた個体群の大多数により十分に許容される。しかしなが ら、急性コカイン濫用に関連して発生率は少ないものの突然死の例がある（Ｄ、 クルーエツト他「コカイン濫用と毒性のメカニズムＪＮＩＤＡ研究論文８８゜Ｃ ，ジョハンソンおよびＭ、Ｗ、フィッシュマン「薬理学レヴユー」４１：３，１ ８８９年）。罹病性におけるこの差異について、生理学上の基礎がどこにあるか は知られていない。しかしながら、ブチリルコリンエステラーゼの欠損が個体の 感度に寄与することが出来ることはこれまでに論議されてきている（Ｄ。

Ｊ、スチュアート他、前掲文献、１９７９年、ジャドロー他、前掲文献、１９７ ９年。Ａ、Ｈ，アンドン他、［医薬品知的治療および薬理学Ｊ　２２：９１４， １９８８年。Ｐ、デヴエニル「内服薬年報Ｊ　１１０：１６７．１９８９年）。

数多（の有機リン酸塩タイプの化合物が殺虫剤（例えばマラチオン）あるいは神 経毒性化学兵器剤として使用される。（例えばソーマン、Ａ、シルバー、前掲文 献１９７４年、Ｗ、Ｎ。

オルトリッジおよびＥ、ライナー「基質としての酵素阻害剤」ノースホランド、 アムステルダム、１９７２年）。これらの化合物は、適切な神経系機能あるいは 神経筋機能において基本的役割を果す赤血球およびコリン作動性シナプシス上で 見出された酵素であるアセチルコリンエステラーゼを阻害するように、その毒性 の効果を発揮する。ブチリルコリンエステラーゼは更にアセチルコリンエステラ ーゼの活性部位と類似の活性部位を有するため、これらの化合物により阻害され る（Ｈ，ソレークおよびＣ，Ａ、プロディ「受容体配位子相互作用のコンピュー ター支援モデル形成」アランＲ，リス社、ニューヨーク。

１９８９年）。従って血漿ブチリルコリンエステラーゼおよび赤血球アセチルコ リンエステラーゼは、これら神経毒からシナプシス・アセチルコリンエステラー ゼに対しある種の保護を与えるが、それは毒素自身がこれらの酵素を阻害する反 応によって不活性イヒされるためである。血漿コリンエステラーゼに反応しない で循環系内で生残するこれら毒素分子のみがシナプシス・アセチルコリンエステ ラーゼを攻撃出来る。当然の帰結として、これらの化合物に対する個体の感受性 は、一部分は血漿中に存在するコリンエステラーゼの量で決定されることになる 。マウスに対しウシ血清アセチルコリンエステラーゼを投与すると、その有機リ ン酸塩毒性に対する抵抗が増大することが提示された（Ｌ、ローチ、Ｙ、アシャ ナイ、Ｄ、レヴイ、Ｄ。

ドラ・ホズ、Ａ、Ｄ、ヴオルフおよびＢ、Ｐ、ドクター「生化学と薬理学Ｊ　３ ８：５２９，１９８９年）。

ブチリルコリンエステラーゼは人の血漿、血清あるいは全血内に存在する。血漿 からブチリルコリンエステラーゼを得る方法が開発された。それは２グループに 分類された。一つは血漿が沈澱法で第一次分画されるものであり、他は血漿が直 接クロマトグラフ吸着されるものである。

最初の方法は沈澱剤としてエタノールもしくは硫安を使用した。コーン他（「ア メリカ化学会ジャーナルＪ　６８　：　４５９゜１９４６年）は、エタノールに よるヒト血漿の分画の間に、大多数の「血漿エステラーゼｊがＩＶ−４と指定さ れる一つの部分に分画されることを発見した。続いてサージナーおよびエリス（ 「アメリカ化学会ジャーナルＪ　７６：６０４９，１９５４年）は、反復沈澱に よりこの方法を拡張し、（分画ＩＶ−６−４と指定される）約２０％の純度のヒ ト　ブチリルコリンエステラーゼを７％の収率で産出した。この方法で得られた 中間分画（ＩＶ−６−３）は、更にヒドロキシルリん灰石およびダウエックス陰 イオン交換樹脂のクロマトグラフィーで精製された（モルストローム他「スカン ジナビア化学会報」ｌｏ：１０７７．１９５６年）。この手法は高純度（少（と も８０％）のブチリルコリンエステラーゼを産出したが、全体としての収率は低 く、３％以下であった。

初期の段階においては硫安沈澱法を採用するい（っかの方法が開発された。これ らの方法は粗酵素を産出（純度１０％以下、Ｈ，Ｗ、ゲット他、「ヒトの遺伝Ｊ 　１：３１１，１９６５年）するか、もしくは調製電気泳動を組み込んだもので あり、収率約１０％以上で高純度を達成するためには、いずれの大規模な工程に とっても非現実的な手法であった（０．スヴエンスマルクおよびＰ、クリステン セン、「生化学および生物物理学会報」６７：４４１．１９６３年）。Ｈ，ハウ ブト他、「血液（Ｂｌｕｔ）Ｊ　１４：６５，１９６６年）、こうした欠点のた めに、これらの方法は、大量（大規模）に高純度のブチリルコリンエステラーゼ を必要とする適用からはいずれも放棄された。

現在の方法は繊維素除去血漿からブチリルコリンエステラーゼをクロマトグラフ ィー精製する方法を採用し、酸性条件（ｐＨ４）下で酵素を従来の陰イオン交換 樹脂に結合する能力に基礎をおくものである（Ｇ、Ｅ、　コンネルおよびＲ，Ｗ 、ショー「生化学・生理学カナディアンジャーナルＪ　３９　：１０１９゜１９ ６１年）、最適化された場合、ｐＨ４でのヒト血漿の陰イオン交換クロマトグラ フィーは、１段階でブチリルコリンエステラーゼの４００倍から８００倍までの 精製（すなわち純度２−４％までの精製）を達成する（Ｐ、に、ダスおよびＪ。

リップル「生化学ジャーナルＪ　１１６：８７５．１９７０年。

Ｈ，メンシュ他「生化学ヨーロピアンジャーナル」７０：２１７．１９７６年） 。更に酵素の純度を高めるためにこれらのグループで使用された次の段階は、プ ロカインアミド・アガロース上のアフィニティー・クロマトグラフィーにより取 って代られ（０，ロックリッジおよびＢ、Ｍ、レイデュ、［生物学化学ジャーナ ルＪ　２５３：３６１，１９７８年）、この方法はブチリルコリンエステラーゼ を２段階精製し純度８８％、収率７０％を達成した。更にこの方法が改善されて 、ｐＨ７で追加の陰イオン交換段階が加えられ（０，ロックリッジおよびＢ。

Ｍ、レイデュ「生物学化学ジャーナルＪ　２８７：１２０１２゜１９８２年。０ ．ロックリッジ他［生物学・化学ジャーナル」２６２：５４９，１９８７年）、 事実上相同酵素を全体の収率３０〜４０％で産出した。

発明の要約 この発明の一局面に従って、ブチリルコリンエステラーゼは、陰イオン交換クロ マトグラフィーおよびアフィニティー・クロマトグラフィーの組合せを利用して 、ＩＶ−４として知られる血漿分画から、もしくは分画ＩＶ−４およびＩＶ−１ の混合血漿分画から回収される。望ましい一局面に従って、この方法は最初の陰 イオン交換クロマトグラフィー、および続くアフィニティー・クロマトグラフィ ーよりなり、上記２段階が少くともあと１回は繰返される。

図面の簡単な説明 表１＝ヒトのブチリルコリンエステラーゼの精製において、調製法の各段階の定 量分析を示す。

表２：調製法１の試料で示された精製の結果と、他の２種のブチリルコリンエス テラーゼ調製法の結果を比較して示す。

発明の詳細な説明 陰イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティー・クロマトグラフィーの 組合せを利用して、言及された分画からのブチリルコリンエステラーゼの回収は 、ヒト血漿に存在するブチリルコリンエステラーゼの平均量に依存して少（とも ８０％（望ましくは少くとも９０％）の純度で、少くとも３０％の収率であるブ チリルコリンエステラーゼを産出することが出来る。

陰イオン交換カラムは、多種多様な陰イオン交換カラムのいずれでもよい。言及 された分画からブチリルコリンエステラーゼを回収するのに有効である代表的な 材料としては、デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミド、ポリスチレン 、シリカあるいはアクリルもしくはビニルポリマーなとの支援媒体の一つに共有 結合されたアミン、第三級アミンあるいは第四級アミンよりなる前述の媒体であ ることが出来る。望ましいカラムは架橋結合されたジエチルアミノエチル・アガ ロース・カラム（例えばファーマシア社で販売されるＤＥＡＥセファロース・フ ァスト・フロー媒体）である。望ましい実施例において、そのような陰イオン交 換クロマトグラフィーは４．０から４．５のｐＨで実施される。

アフィニティー・クロマトグラフィは、アフィニティー・クロマトグラフィーに よりブチリルコリンエステラーゼを回収するのに適切な各種の材料のいずれかに より達成される。このような材料の代表的な例としては、ブチリルコリンエステ ラーゼのなんらかの基質あるいは可逆性阻害剤、ブチリルコリンエステラーゼに 特有の抗体あるいは特に結合性の高いシアル酸残基を結合することが出来るもの に特有のレクチン、前記のもののようにクロマトグラフィーに適した支援媒体に 直接あるいは「スペーサー」を通して共有結合することが出来るいずれかのもの あるいはすべてのものに言及することが可能である。望ましい材料はアミノへキ サノン酸アガロースに共有結合されるプロ力インアミド（ｐ−アミノ−Ｎ−（２ −ジエチルアミノエチル）ベンズアミド）である。望ましい実施例において、ア フィニティー・クロマトグラフィーは、ブチリルコリンエステラーゼ活性が最適 であるｐＨ（６−９）の範囲内で処理される。

前に言及したヒト血漿分画は商業的利用が可能であり、既知の方法で生産される 。とりわけ既知の技術で知られているように、そのような分画け、エタノール沈 澱法を利用して血漿から得られる。

ブチリルコリンエステラーゼは、それが血漿内にあろうとあるいは高度に精製さ れた形態であろうと、この酵素の調製の際に何らかの残存ウィルスの耐熱不活性 化を許容するような温度上昇の下では十分な安定性はない。しかし、Ｂ型肝炎ウ ィルス、非Ａ非Ｂ型肝炎ウィルスおよびＨＴＬＶ−［１（ヒトＴ細胞リンパ球性 ウィルス丁型）などのウィルスを不活性化するのに十分な濃度でリン酸トリーｎ −ブチルおよびコール酸ナトリウムで処理を拡張することで酵素は影響されない ことを我々は確認した（Ｂ、ホロヴイッツ、Ｍ、Ｅ、ウィーブ、Ａ、リッピンお よびＮ、Ｈ，ストライカ−［輸血Ｊ　２５．５１６．１９８５年、Ｃ，Ｄ、エド ワーズ、Ｍ、Ｐ、Ｊ、ビエット、Ｓ、チンおよびＢ、ホロヴイッツ「ヴオクス・ サンギニス（血液の声）」５２：５３．１９８７年）。この方法で使用された溶 媒と洗剤は、ブチリルコリンエステラーゼを精製するのに用いられるクロマトグ ラフィー吸着法で容易に除去されるので、ウィルスの不活性化は精製のいずれの 段階でも実施することが出来る。

従って、精製過程にこの方法を含めること、および精製された酵素を０．２２ミ クロン以下の有効口径のフィルターを通過させることによって、完全に活性なブ チリルコリンエステラーゼを無菌でウィルス不活性に調製することが出来る。

この発明は、更に下記の実施例に関連して記述される。しかし、この発明の範囲 はそれだけに限定されない。他に限定されない限り、ここで使用されるすべての 技術および科学用語は、この発明が属する従来の技術の一つにより普通に理解さ れるように同一の意味を持つ。ここで記載されたものと類似もしくは同等の何ら かの方法および材料がこの発明の実施および試験に使用することは出来るけれど も、より望ましい方法および材料がここで記述されている。言及されたすべての 刊行物が参考文献としてここに組込まれている。

材料および方法 酵素の定量分析 ブチリルコリンエステラーゼは、ｐＨ７，４のＭ／１５リン酸塩緩衝液の中で、 ２５℃での５０ｕＭのベンゾイルコリンの加水分解の間に２４０ｎｍで最適密度 の減少をモニターすることで定量分析される（Ｗ、力ロー、およびＡ、リンゼイ 「生化学カナディアンジャーナルＪ　２３　：８６８，１９８８年）。酵素の濃 度は加水分解の速度が少なくとも１分内はコンスタントになるよう調節される。

加水分解速度は、６７００Ｍ−’ｃｍ−’の産出物と基質の間の消散係数におけ る差異から計算される。

１ユニツトの活性は１分当り基質１μｍｏＩ２を加水分解するのに必要な酵素の 量である。これらの条件下で、１ｍｇのブチリルコリンエステラーゼは２００ユ ニツトの酵素活性に等しく、別の表現では２００ユニット／ｍｇの比活性となる （ロックリッジおよびレイデュ、前掲同書、１９８２年）。他の基質あるいは定 量分析も同様に使用出来る。

電気泳動 ＳＤＳの存在下での分離はレームリにより実施された（「ネイチャーｊ　２２７ ．６８０．１９７０年）。非変性ゲルはジュールにより追跡され（「臨床化学会 報Ｊ１９：２０８゜１９６８年）、ブチリルコリンエステラーゼと同じように、 もしも汚染されたエステラーゼが存在すればそれを発見出来る非比基質としてナ フチルブチレートを使用してエステラーゼ活性のため染色された（Ｈ，ハリス他 「ネイチャー」１９６：１２２９６，１９６２年）。

クロマトグラフィー媒体 陰イオン交換クロマトグラフィーとしては、ＤＥＡＥ−セファロース・イースト ・フロー（ファーマシア社）のような機械的化学的に安定した媒体が洗浄および 再生のためには望ましい。他の陰イオン交換媒体もまた利用可能である。

アフィニティ・クロマトグラフィーのために、プロ力インアミド（ｐ−アミノ− Ｎ−（２−ジエチルアミノエチル）ベンズアミン）は、１−エチル−３−（３− ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）により媒介された濃縮反応 を通して６−アミノヘキサノン酸アガロースに共有結合される。

この反応は、膨潤ゲルｍ２当りカルボキシル基を少なくとも１５ｕｍｏｆｆ含む 膨潤アガロースの体積の約５倍の量の水で処理される。これに（固定化カルボキ シル基に関連して）４倍モル濃度過剰のプロ力インアミドおよび４００倍モル濃 過剰のＥＤＣが加えられる。この混合物は２４時間攪拌される。最初の４時間は Ｏ，１Ｍの塩酸を加えることで、ｐＨは約５．２８に維持される。このゲルは無 反応の材料や尿素に拘束されないように洗浄され、適当なカラムに充填される。

これらの条件下で誘導体化は殆ど定量的であり、少なくとも１５ＬＬｍＯＩ２の プロ力インアミドが各ｍ４２当りのアガロースに結合される。

タンパク質濃度 精製の間、タンパク質の濃度は、比色分析法（Ｍ、Ｍブラッドフォード「生化学 分析Ｊ　７２　：　２４８．１９７６年）により、あるいは２８０ｎｍの光学吸 収環によりモニターされる。

精製されたブチリルコリンエステラーゼの濃度は、消散係数を１．８＋ｎＪ２． ｍｇ−’ｃｍ−’と仮定し、２８０ｎｍでその吸収度により決定された（ロック リッジ他、前掲同書、１９７９年）。

精製工程 始動材料は、複数個体からプールされたヒト血漿である。この血漿は、それが新 鮮であるか「陳腐化」したままか、あるいは血液冷却（Ｃｒｙｏ−ｐｏｏｒ）を 生じる従来の処理を施された後か、もしくは繊維素除去血漿として使用すること が出来る。血漿はそれから、（Ｅ、Ｊ、コーン他、前掲同書。

１９４６年に）記載されているように、一連のエタノール添加およびｐＨ調整に よるか、もしくは血漿の等量分側化を実施するよう設計されたこの方法の何れか の修飾によって処理される。分画ＩＶ−４で指定された沈澱物あるいは分画ＩＶ −１プラスＩＶ　−４で指定された組み合わせ沈澱物が集められる。この材料は 直ちに更に処理されるか、もしくは後の使用のために貯蔵される。

ブチリルコリンエステラーゼおよびエタノール沈澱物の他の成分は、（タンパク 質沈澱物の重量に比例して）４−５容量の緩衝液（２０ｍＭ酢酸、くえん酸ある いは同様のもの）がイオン除去水で再溶解され、緩衝液の酸性成分でｐＨ４で酸 度滴定され、遠心分離あるいは濾過で不純物除去され、同一の２５容量緩衝液に 対し平衡近くまで透析されるが、後の３段階の順位はあまり重要ではない。ブチ リルコリンエステラーゼ溶液の組成物が調節されるこの段階および続くすべての 段階において、透析、ゲル濾過あるいは希釈の方法が使用出来る。

ブチリルコリンエステラーゼ溶液は、その後、透析で使用されたのと同じ緩衝液 で平衡化され（適用された溶液の１／２容量以下の）陰イオン交換カラムに適用 される。カラムは結合されない材料の大部分を除去するためにこの緩衝液で洗浄 され、ブチリルコリンエステラーゼはカラム内を流れる緩衝液のイオン強度を増 強することで溶離される。ブチリルコリンエステラーゼを含む溶離物のその部分 はｐＨ７に酸度滴定されほぼ同量の水で希釈される。この溶液はその後、（１０ ０ｍＭ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸塩などの）ｐＨ７，０〜７．４の中位の イオン強度緩衝液で平衡化されたプロ力インアミド・アガロースに適用される。

このカラムの容量はもとのタンパク質沈澱物量の約１／１０である。カラムは約 ２容量の平衡緩衝液で洗浄され、ブチリルコリンエステラーゼは、全体で７−１ ０カラム容量で、１Ｍ塩化ナトリウムの当量まで徐々にイオン強度を増強して溶 離される。ブチリルコリンエステラーゼを含む渚難物のこの部分が、ｐＨ７，４ で２０ｍＭリン酸塩などの低イオン強度の緩衝液の１５〜２０容量に対し、平衡 近くまで透析される。この溶液は、透析に使用された同じ緩衝液で平衡化された 第２次陰イオン交換カラムに適用される。このカラム容量は第１次陰イオン交換 カラムの約１／１０である。ブチリルコリンエステラーゼは徐々にイオン強度を 増して溶離され、全体で４カラム容量で２５０ｍＭ塩化ナトリウムの当量となる 。ブチリルコリンエステラーゼを含む溶離物の部分は、ｐＨ７，４での２０ｍＭ リン酸塩のような低イオン緩衝液の１容量で希釈される。この溶液は最初の量の 約１／１０の第２次プロ力インアミド・アガロース・カラムに適用される。この カラムは、すべての量がカラムのサイズに比例して同じ割合を維持するように調 節されることを除き、第１次のものと同じように溶離される。このカラムから溶 離するブチリルコリンエステラーゼは、電気泳動等質性および酵素活性の基準に より、他の血漿タンパク質とは十分に異なったものとなる。

実施例 ヒト血漿分画ｒＶ−４からのブチリルコリンエステラーゼの精製 この調製において各段階の定量分析は表１で見出される。始動材料は分画［Ｖ− ４（ヒト血漿から回収され米国赤十字社より得られまたバクスター社ハイランド 事業部で処理されたロフト番号０２０８）であった。この材料はタンパク質沈澱 物とじて凍結され、使用の際まで一７０℃で貯蔵された。抽出の１２時間前に沈 澱物は一２０℃に移された。続くすべての段階は４℃−６℃で実施された。

１８２５グラムノ分画ＩＶ−４がｐＨ４，Ｃ１）２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液 ９．ＩＩ２で抽出され、１８時間機械的に攪拌された。生じた懸濁液は１３，７ ００ｘｇで９０分間遠心分離され、組み合わせ上澄み液は４５εの同じ緩衝液で 一晩中透析された。翌朝この試料は次の２４時間新鮮な４５εバツチの透析緩衝 液に移された。透析に次いで、ｐＨの調節はそれ以上必要なかったが、綿状物が 発生したので、前と同じように遠心分離で除去された。この溶液の最終容量（「 抽出物」）は１０．９２であった。

この抽出物は抽出および透析に使用されたものと同じ緩衝液で前もって平衡化さ れたＤＥＡＥ−セファロース・ファスト。

フロー５εを入れたカラムに充填された。カラムは１０βのこの緩衝液で洗滌さ れ、その後同じ緩衝液の５２の２００ｍＭ塩化ナトリウムで溶離された。ブチリ ルコリンエステラーゼを含むこれらの分画は最終量３．３Ｊ２　（ＤＥ−ｎブー ル）でプールされた。

ＤＥ−ｎブールは３８０ｒｒ＋４２の０．８Ｍ二二塩性性リン酸ナトリウムｐＨ ７，０まで酸度滴定され４ｊ２の水で希釈された。

その後この溶液は、ｐＨ７，４の２０ｍＭのリン酸塩緩衝液、１００ｍＭ塩化ナ トリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡで前もって平衡化された２００ｒｒ＋ｊ２のプロ力 インアミドの入っているカラムに充填された。カラムは４００ｍｇの同一緩衝液 および６００ｍＩ２の同じではあるが２００ｍＭの塩化ナトリウムの緩衝液で洗 滌された。カラムはその後、１Ｍ塩化ナトリウムに対し線型勾配の１．４βで溶 離された。ブチリルコリンエステラーゼを含むこれらの分画は、最終容量１β（ ＰＡＭ−１プール）でプールされた。

ＰＡＭ−ｎブールはｐＨ７，４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液１８ρで一晩中透析さ れ、同一の緩衝液で前もって平衡化された４８０ｍｇのＤＥＡＥ−セファロース ・ファスト、フローを入れたカラムに充填された。カラムは直ちに同じ緩衝液で ８０−２５０ｍＭの塩化ナトリウムの２β勾配で溶離された。

ブチリルコリンエステラーゼを含虎れらの分画は最終容量２７０ｍｌ２（ＤＥ− Ｉｎブール）でプールされた。

ＤＥ−ｎプールはｐＨ７，４の２０ｍＭリン酸塩緩衝液。

１００ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭ　ＥＤＴＡの２２のものに対し一晩中透析さ れ、同じ緩衝液で平衡化された２０ｍＱのプロ力インアミド・セファロースを入 れたカラムに充填された。

このカラムは同一の緩衝液内で１２０ｍＩ２の２００ｍＭ塩化ナトリウムで洗滌 され、２８０ｍｇからＩＭの塩化ナトリウムの勾配で溶離された。ブチリルコリ ンエステラーゼを含むこれらの分画は２００ｒｒ＋Ｊ２の最終容量でプールされ た（ＰＡＭ−Ｉｔプール）。

ＰＡＭ−［［プールは５０，０００名目分子量遮断フィルターに適合する圧力濾 過で２６ｍ尼の最終容量に濃縮された。この溶液はそれからｐＨ７，４の２０ｍ Ｍリン酸塩、１８４ｍＭ塩化ナトリウム、０．８ｍＭ　ＥＤＴＡ　２１２に対し 一晩中透析された。精製されたブチリルコリンエステラーゼは４℃で貯蔵された 。

精製ブチリルコリンエステラーゼの特性精製された酵素を評価する主要な基準は その触媒活性である。基質としてベンゾイルコリンを使用して測定をした時、こ こで記述された調製品の比活性は１８１ユニット／ｍｇであった（表■）。この 活性は等質性酵素に対し報告された最大値の９１％であり、汚染されたタンパク 質が９％のみ存在し、その精製工程の間ブチリルコリンエステラーゼ不活性化が ９％のみであることを示している。第２の基質であるプロピオニルチオコリンを 使用するとこの調製品の比活性は７００ユニット／ｍｇとなり、過去に報告され た最高値に等しかった。（ロックリッジおよびレイデュ、前掲同書、１９８２年 ）。

この調製品は更にＳＤＳゲルで分析された。この方法によって、精製されたブチ リルコリンエステラーゼは、単一サブユニットに対応するＭ＊　９０，０００の ポリペプチドを多数部分とし、Ｍ、１８０，０００のバンドを少数部分とするも ので構成されている。精製されたヒト、ブチリルコリンエステラーゼは、主要素 の単一サブユニットの（二硫化物以外の共有結合により多分架橋結合された）Ｍ ｌｌ　＝１８０，０００二量体を含んでいることがこれまでに示されている（ロ ックリッジ他、前掲同書、１９７９年）。従って、ＳＤＳゲル上の高分子量およ び低分子量のバンドの双方がブチリルコリンエステラーゼを含んでいる、数多く の汚染の少ないポリペプチドがその比活性から推定される酵素の高純度に一致し て、存在するタンパク質の小さな分画を供給することになる。

非変性条件下での電気泳動の間に、未変性ブチリルコリンエステラーゼはＭｌ＋ ３４０．０００の単一バンドとして泳動する。これは流体駆動法で測定された大 量の四量体酵素に合致する。（Ｈ，ハウブト他、前掲同書、１９６６年）、更に エステラーゼ活性のためのこの種のゲルの組織化学的染色法により、酵素活性が 事実上はこのタンパク質と連結しており、また他のエステラーゼが発見出来ない （示されない）ということが示された。

この精製法自体は再生出来るようにみえる０表■は、ここで示される精製の結果 （調製品ｌ）を他の２個と比較する。産出量は３５％から４３％に、純度は９１ ％から事実上等質性まで変動する。３種の調製品すべての組成物特性は、非変性 ゲルおよびＳＤＳゲルの双方とも類似である。

精製ブチリルコリンエステラーゼの貯蔵のために選ばれた緩衝液は、注射のため の適切な溶剤である等張リン酸塩の緩衝食塩水である。酵素はこの緩衝液内で高 濃度（３−６ｍｇ／ｒｒ＋ｊ２）で冷却されると著しく安定する。３ケ月間でも との活性の８％以下が失われただけであった。これは、この酵素の注射が可能な 製剤形態がより長期間にわたり貯蔵出来ることを示す。

分画ＩＶ−４を製造するエタノール沈澱法を前記記載のクロマトグラフィー技術 と結合することにより、ブチリルコリンエステラーゼの精製に際し、従来のもっ とも効率的な方法を少なくとも１０倍スケールアップすることができる。特に１ 分画ＩＶ−４で始動する方法に含まれる容量は、全血漿を始動材料とするものの １０％もしくはそれ以下である。更に、産出される酵素の量と関連して、最初の 陰イオン交換カラムのサイズは、前記引用のもとの方法から２０倍も減少した。

この方法で分離されたブチリルコリンエステラーゼのこれら２種類の改善および 純度、安定性更には活性は、この酵素の商業生産を実施可能なものとする。

この発明に基づいて生産されたブチリルコリンエステラーゼは少なくとも９０％ の純度を有し、多種多様の潜在用途をもつ。

一つの用途は、ブチリルコリンエステラーゼ欠損の患者が全身麻酔の間熱呼吸に なることを防ぐために、スクシニルコリンの効果を逆転させることである。かく して、この発明の一局面に従って、ブチリルコリンエステラーゼ欠損を有する人 は、スクシニルコリンの効果を逆転する効果的な量で、少なくとも８０％（また 望ましくは少なくとも９０％）の純度を有するブチリルコリンエステラーゼを投 与することにより、スクシニルコリンの効果を逆転させるように治療を受ける。

ブチリルコリンエステラーゼを用いる有効な治療は、ブチリルコリンエステラー ゼの欠損が知られているか、あるいは疑わしい場合にも、スクシニルコリンの投 与を進めることが出来た。あるいは、ブチリルコリンエステラーゼによる治療は 、薬剤に対する異常な反応が明らかである時でも、スクシニルコリンの投与を続 けることが出来た。

一般にブチリルコリンエステラーゼは、体重１ｋｇ当り少なくともＯ，０１ｍｇ の量で（また望ましくは体重１ｋｇ当り０．１ｍｇの量で）投与される。一般に この量は体重１ｋｇ当り４ｍｇ　（また望ましくは体重１ｋｇ当り０．４ｍｇ） を越える必要はない。

このような純度のブチリルコリンエステラーゼは、許容可能なキャリアと組み合 わせて使用される。選択されるキャリアとは、投与の方法に依存する。投与のこ のような方法は以下のものを含む：静脈注射、筋肉注射、エアロゾルあるいは目 薬としての吸入である。投与の望ましい形態は静脈注射であり、この方法に対し ては前記のキャリア、リン酸塩緩衝等張食塩水が望ましい、他の方法の用途とし ては、（ヒト血清アルブミンなどのような）キャリアタンパク質、抗酸化剤、界 面活性剤、消泡剤などを含めることが適当である。

一般に、少なくもと純度９ｏ％のブチリルコリンエステラーゼは、３　ｍ　ｇ　 ／　ｍβから３０　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｊ２もしくはそれ以上の量で薬品組成物の 中に存在する。

この発明に基づいて生産されたブチリルコリンエステラーゼは、クロロプロ力イ ン、ミヴアキュリウムｆｍｉｖａｃｕｒｉｕ票）、ヴエキュロニウム（ｖｅｃｕ ｒｏｎｉｕｍｌなどのような他の薬剤を非活性化するためにも使用される。前記 の薬剤はこの酵素に対する基質であり、先天性あるいは後天性ブチリルコリンエ ステラーゼの遺伝子欠損の個体に投与されるものである。プチリルコリンエスラ テーゼは更に、コカインあるいはこの酵素の基質である非医療およびもしくは不 法に投与された化合物の毒性効果を非活性化し軽減するために投与することが出 来る。ブチリルコリンエステラーゼは、無呼吸の治療に関して前記記載のものに 類似した量のコカインの毒性を軽減するのに有効な量で投与される。

ブチリルコリンエステラーゼは、また殺虫剤あるいは神経毒に使用されるカルバ メートおよび有機リン酸塩に対する（ブチリルコリンエステラーゼ正常個体およ びブチリルコリンエステラーゼ欠損個体の双方に）抵抗を強めるために投与され る。

この用途に関して、毒素に対する予想された被曝に先立ちこの酵素が予防薬ある いは治療薬として投与され、体内にある未反応の毒素のプールを軽減するために 被曝の後でも投与される。ブチリルコリンエステラーゼはこの用途に単独で、あ るいは核性化合物（例えばオキシム）と併用して使用される。この核性物質は、 もとの付加物が基本的に不可逆形態に転換する前に、毒素と酵素の間で付加物を 加水分解する。このようにして、活性酵素は酵素−毒素複合体から再生するにの ような核性物質は、酵素と一緒に、その前に、あるいはその後で投与することが 出来る請求核性物質は、酵素と同じルートで、あるいは筋肉注射により投与する ことが出来る請求核性物質の投与量は現在の医療診療と類似（体重１ｋｇ当り約 ５０ｍｇ）するが、血漿中にブチリルコリンエステラーゼが高い濃度で存在すれ ばより効果的である。ブチリルコリンエステラーゼは、無呼吸の治療に関連して 一般に前記記載された量でカルバメートあるいは有機リン酸塩のような毒素の有 毒効果を軽減するために有効な量で投与される。

この発明により生産され使用されるブチリルコリンエステラーゼは少なくとも９ ０％の純度を有し、理論的最大の比活性（５０μＭのベンゾイルコリンが基質と して２５℃で定量分析される場合には、理論的最大値は２００μｍＯβ　ｍ１ｎ −’ｍ　ｇ−１あるいは２８０　ｓ−’）である少なくとも９０％の比活性を持 つ。ブチリルコリンエステラーゼは注射可能なキャリアのような適切な薬剤キャ リアでは、２ｍｇＺｍＯβ以上の高い濃度で使用されることが望ましい。

この発明についての数多くの修正および変化が前記の技術に照らし合わせて可能 である。従って、添付された請求の範囲内で、この発明は特に記載された他にも 実施することが出来る。

表！ ヒト・ブチリルコリンエステラーゼの精製タンパク質　合計　比　活　性　産出 量価（−（１ニヲト）（−（ユニット／−（ｌ１ｇ／ｗＪ（％）０、ｒＭｔＳ、 ９１５，０００８０ＪＯ４０４０，０１４０，００００？−１，５）Ｗ（ＩＶ− ４１５８１，０００？９．９５０４０００．１３７Ｇ、［１００７１ＱＯ２、抽 出物　４３５，０００　６９，６３０　３４８　０．１６０　［１，ＤＯＯＪｌ 　８７３、ＤＥ−Ｉブール３１，７１３　５３．４６０　２６７　１．６９　０ ．０１１１１４　８７４、ＰＡＭ−１ブール１．７２７　３８，６７０　１９３ 　２２．４０　０．１１２　４８５、ＤＥ−Ｉ［ブール２７７　３１，１１６４ 　１５９　１１５．００　０．５７５　４１１６、ＰＡＭ−ＩＩブーＡ、　１６ ９　３１．３ＢＯ１５７１８１，０００，９０５３９テキストの１資料として使 用された精製の結果、この工程は１，８２５の分画ＩＶ−４で開始さね分画はヒ ト血漿的９１４から沈澱した材料の量である。血漿に対する値はこの量、平均タ ンパク質濃度の６５ｍｇ／ｍβおよび平均ブチリルコリンエステラーゼ濃度０． ９ユニット／ｍ１（４，４ｍｇ／Ａ＋を基礎にして推定されている。

表■ ブチリルコリンエステラーゼ調製品の要約調製品　産　出　量　比　活　性 ｆｓｇｌ　（％ｌ　ｆＵ／ｍｇｌ　Ｉ■ｇ／■ｇ）１　１５７　３９　１８１　 ０．９１ ２　１５７　４３　１９５　０．９７ ３　１２３　３５　１９１　０．９５ 国際調査報告

Claims (16)

【特許請求の範囲】
1. １．ブチリルコリンエステラーゼを得る一つの方法であって、 血漿分画Ｗ−４あるいは血漿分画Ｗ−４および血漿分画ＩＶ−１の混合物を陰イ オンクロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィーの双方にさらし 、そこからブチリルコリンエステラーゼを少なくとも９０％の純度で回収する方 法。
2. ２．血漿が最初陰イオンクロマトグラフィーに、次いでアフィニティクロマトグ ラフィーにさらされる請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．陰イオンクロマトグラフィーがｐＨ３．８から４．２までの間で実施される 請求の範囲第２項記載の方法。
4. ４．アフィニティクロマトグラフィーがｐＨ６．０から９．０の間で実施される 請求の範囲第３項記載の方法。
5. ５．陰イオンクロマトグラフィーが架橋結合ジエチルアミノエチル・アガロース ・カラムの上で実施される請求の範囲第４項記載の方法。
6. ６．アフィニティクロマトグラフィーがアミノヘキサノン酸アガロースに共有結 合されたプロカインアミドのカラムの上で実施される請求の範囲第５項記載の方 法。
7. ７．陰イオンクロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィーの組み 合わせが少なくとも２回実施される請求の範囲第６項記載の方法。
8. ８．請求の範囲第２項で、更に非活性ウィルスを含む請求の範囲第２項記載の方 法。
9. ９．一つの組成物であって、 少なくとも９０％の純度を有し、また薬剤許容キャリアを有するブチリルコリン エステラーゼよりなる組成物。
10. １０．前記組成物が静脈注射に適している請求の範囲第９項記載の組成物。
11. １１．前記組成物がスクシニルコリンの効果を逆転するのに有効な量でブチリル コリンエステラーゼを含有する請求の範囲第９項記載の組成物。
12. １２．前記組成物がコカインの毒性効果を軽減するのに有効な量でブチリルコリ ンエステラーゼを含有する請求の範囲第９項記載の組成物。
13. １３．ブチリルコリンエステラーゼが有機リン酸塩毒素の毒性効果を軽減するの に有効な量で存在する請求の範囲第９項記載の組成物。
14. １４．患者に対するスクシニルコリンの効果を逆転させる一つの方法であって、 ブチリルコリンエステラーゼ欠損から生じるスクシニルコリンエステラーゼの効 果を逆転させるのに有効な量で少なくとも９０％の純度を有するブチリルコリン エステラーゼを患者に投与することによりなる一つの方法。
15. １５．コカイン、有機リン酸塩毒素およびカルバメート毒素よりなるクループか ら選択されたメンバーの毒性効果を逆転もしくは予防する一つの方法であって、 前記メンバーの毒性効果を逆転もしくは予防するのに有効な量で少なくとも９０ ％の純度を有するブチリルコリンエステラーゼを患者に投与することよりなる一 つの方法。
16. １６．前記ブチリルコリンエステラーゼが理論最大比活性の少なくとも９０％で ある比活性を有する請求の範囲第２項記載の方法。