JPH06508507A - 受容体認識配列組成物およびこれを用いた分析法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 受容体認識配列組成物およびこれを用いた分析法本発明は、米国国立衛生研究所 により与えられた政府援助の下に行った。米国政府は本発明における所定の権利 を有する。

発明の分野 本発明は、ステロイド／甲状腺ホルモンレセプターと発明は、プロモーターの転 写活性を制御するのに用いることかできる新規な受容体認識配列を得ることに関 する。

本発明の背景 真核性分子の生物学における中心的な課題は、特異的なりＮＡ結合タンパク質の 制御配列か細胞機能および運命にとのような影響を与えるかということである。

ステロイド／甲状線のホルモンレセプターは、リガンド依存性転写因子のスーパ ーファミリーを形成するか、これは前記のような細胞機能および運命にある役割 を果たしていると考えられる。例えば、これらのレセプターは、特異的なエンハ ンサ−配列を包む標的遺伝子（ホルモン受容体認識配列またはＨＲＥと表わされ る）へ細胞外ホルモンのシグナルを形質導入することが知られている。各レセプ ターは、リガンド結合領域およびＤＮＡ結合領域を有する。レセプターは、リガ ンドに結合するときコンフォメーションの変化を受ける。このコンフォメーショ ンの変化により、レセプター−リガンド複合体は、同種の受容体認識配列を結合 させ、関連するプロモーターの転写活性を制御することかできる。プロモーター の転写活性により、機能的に関連した構造遺伝子が転写される。

糖質コルチコイドレセプター（ＧＲ）のようなホルモンレセプターの配列比較お よび突然変異分析により、転写の活性化および抑制、核の局在化、ＤＮＡ結合、 およびホルモン結合に関与する機能領域が同定されている。

転写を活性化する上で必要なりＮＡ結合領域は、６６〜６８のアミノ酸から成り 、その内の９個のシスティン（ＣＩ−Ｃｔ　）を含む約２０個の部位は様々なレ セプター間で不変のものである。このレセプタースーパーファミリーのメンバー のモジュール構造により、１つの領域を別の領域と交換し、機能的なキメラレセ プターを造ることかできる。

このように同定されたホルモン受容体認識配列は、通常は構造上は関連している か、実際上は異なる機能を存する。ＧＲの受容体認識配列［即ち、糖質コルチコ イド受容体認識配列（ＧＲＥ）］　、エストロゲンレセプターの受容体認識配列 ［即ち、エストロゲン受容体認識配列（ＥＲＥ）］および甲状腺ホルモンレセプ ターの受容体認識配列［即ち、甲状腺ホルモン受容体認識配列（ＴＲＥ）］は詳 細に特性決定されており、これらは各各パリンドローム対の半部位（ｈａｌｆ　 ５ｉｔｅｓ）から成っている（Ｅｖａｎｓ、５ｃｉｅｎｃｅ、２４０゜８８９　 （＋９８８）、Ｇｒｅｅｎ及びＣｈａｍｂｏｎ。

Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、４，３０９（１９８８）］。　最適化 した偽または共通受容体認識配列に関しては、ＧＲＥおよびＥＲＥでは半部位当 たり２個のヌクレオチドのみが異なる［Ｋ　ｌ　ｏ　ｃ　ｋら、Ｎａｔｕｒｅ、 ３２９，７３４　（１９８７）］、一方、ＥＲＥおよびＴＲＥには同一の半部位 が見られるか、その間隔は異なっている［Ｇ　Ｉ　ａ　ｓ　ｓら、Ｃｅ１ｌ、５ ４゜３１３（１９８８）参照］。更ニ、Ｔ　ＲＥ　Ｉｔ、ＣＶ−１中のトランス フェクションされたレチノイン酸レセプター　（ＲＡＲ）による転写活性化を媒 介することが示されているが、トランスフェクションされていない細胞では全く 応答がない［Ｕｍｅｓｏｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ、６゜２６２（１９８８）コ。言 い換えれば、ＴＲ及ＲＡＲレセプターはいずれも、ＴＲＥを活性化できる。

これまでごく僅かのステロイド／甲状線のスーパーファミリーのメンバーの受容 体認識配列についてしか報告されていないため、他のスーパーファミリーのメン バーの受容体認識配列については報告されていない。

本発明の要約 本出願人らは、細胞中のプロモーターの転写活性について、レチノイン酸または その誘導体に対する応答性を付与する作用を有する受容体認識配列であるＤＮＡ セグメントを見出し、配列により特性決定を行った。本出願人らは、本発明の受 容体認識配列の転写活性増強効果が、レチノイン酸またはその誘導体の存在下で は総ての哺乳類細胞に見られ、レチノイン酸レセプターまたはレチノイドＸレセ プター、または本発明の受容体認識配列により認識される他のオーファンレセプ ターが、これら総ての細胞に内因的に存在することを示していることも見出した 。

ＧＲＥ、ＥＲＥおよびＴＲＥについて当該技術分野で報告されている内容とは異 なり、本明細書に開示されている新規な受容体認識配列はＧＲＥ、ＥＲＥおよび ＴＲＥについて報告されている回文配列とは対照的に直列の反復配列を有してい る。更に、本発明の受容体認識配列は、既知の受容体認識配列（ＧＲＥ、ＥＲＥ 、ＴＲＥ）と比較し、同種でないレセプター（例えば、エストロゲンレセプター （ＥＲ）　、ＧＲ１甲状腺ホルモンレセプター（ＴＲ）等）により転写活性化さ れにくい。

本発明の受容体認識配列および機能プロモーターを含む転写制御領域を用いるこ とにより、遺伝子を含む組換えＤＮＡベクター、プロモーターか制御する転写（ およびそれによる発現）、レチノイン酸またはその誘導体が関与する（およびこ れらによって増加した）転写活性を供給することかできる。

図の簡単な説明 第１図は、ｐＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＣＡＴレポータープラスミドの一部を模式的に 表わしたものである。

第２図は、レチノイン酸の存在下および非存在下におけるＲＸＲによる本発明の 受容体認識配列のトランス活性化を纏めたものである。

第３ａ図は、ＲＡＲまたはＲＸＲ発現プラスミドおよび様々なレポータープラス ミドを、ＣＶ−１細胞に同時トランスフェクションした結果を示す。

第３ｂ図は、レチノイン酸の存在下（または非存在下）において、ＲＸＲかｐＣ ＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＣＡＴをトランス活性化する能力を阻害するＲＡＲの能力を示 す。この図において、黒丸はレチノイン酸の存在下で行った実験を表わし、白丸 はレチノイン酸の非存在下にて行った実験を表わす。

発明の詳細な説明 本発明によれば、配列 ５’　ＮＮＮＮＮＮ　（Ｎ　ＮＮＮＮＮＮ）、３’（式中、それぞれのＮは、Ａ 、Ｔ、Ｃ，Ｇから独立に選択されるか、但し、ヌクレオチドのそれぞれの−ＮＮ ＮＮＮＮ−基の少なくとも３種類のヌクレオチドは配列−ＡＧＧＴＣＡ−に匹敵 する位置におけるヌクレオチドと同一であり、 Ｘは、１以上の整数） を存する実質的に純粋なりＮＡか提供される。

或いは、本発明の受容体認識配列は、 配列、 ５’　−ＡＧＧＴＣＡ−（Ｎ−ＡＧＧＴＣＡ）、−３’（式中、ＮおよびＸは、 前記に定義した通りてあり、ヌクレオチドのそれぞれの−ＡＧＧＴＣＡ−基のう ち、３個までのヌクレオチドをＮに代えることができる）を有する実質的に純粋 なりＮＡとして記載することができる。

本発明のもう一つの態様によれば、通常レチノイン酸またはその誘導体による転 写活性化の支配を受けないプロモーターに適当に連結した前記の受容体認識配列 を含んで成るＤＮＡ構造体であって、ＤＮＡとプロモーターか適当に連結して、 適当なリガンドおよびその関連レセプターの存在下で、このプロモーターに転写 活性化活性を付与するＤＮＡ構造体が提供される。次いで、前記のＤＮＡ構造体 を遺伝子に適当に連結し、転写することができる。次に、生成する遺伝子を含む ＤＮＡ構造体をベクターに組み込んで、発現させることかできる。生じたベクタ ーは、適当な宿主細胞に形質転換することがてきる。

次に、前記のベクターを含む細胞を用いて、好適なリガンドおよびその関連レセ プターの存在または非存在に応じ、所望の遺伝子の制御された発現を行うことが てき本発明の更にもう一つの態様によれば、レチノイン酸（またはその誘導体） のアゴニストとしての試験化合物の活性を試験する方法であって、 （ａ）レチノイドレセプターの存在下および更に試験化合物の存在または非存在 下において、（前記の）細胞を培養した後、 （ｂ）この試験化合物の存在下または非存在下において、培養中に発現した所望 のタンパク質の量を比較することを含む方法か提供される。

本発明の更にもう一つの態様において、レチノイン酸（またはその誘導体）のア ンタゴニストとしての試験化合物の活性を試験する方法であって、 （ａ）レチノイドレセプターおよびレチノイン酸（またはその誘導体）の存在下 、および （１）本試験化合物の存在下、または （ｉｉ）試験化合物の非存在下 て（前記の）細胞を培養し、 （ｂ）（ｉ）および（１１）の培養工程中に発現した所望のタンパク質の量を比 較することを含む方法か提供される。

本発明のもう一つの態様によれば、レチノイン酸またはその誘導体に対する応答 性が、ＲＸＲに独特な経路を介して、ＲＡＲに対して起こるか否かを識別する方 法であって、 本発明の受容体認識配列（前記に記載した通り）を含むベクターをレチノイン酸 またはその誘導体と接触させ、ＲＡＲ：　ＲＸＲ発現ベクターの比率を変化させ た後、レチノイン酸またはその誘導体による前記受容体認識配列の転写活性化に 対するＲＡＲ：　ＲＸＲの比率を増大することによる影響を測定することを含む 方法か提供される。

本発明のもう一つの態様によれば、細胞中のＲＸＲ発現を調節する方法であって 、レチノイン酸またはその誘導体の存在下にて、本発明の受容体認識配列を、Ｒ ＸＲによる同じＤＮＡへのその結合に優先して競合的に結合させるのに有効な量 のＲＡＲを前記の細胞に投与することを含む方法が提供される。

本発明のもう一つの態様によれば、化合物をスクリーニングしてオーファンレセ プターのりガントとして作用する化合物を同定する方法であって、 前記の化合物を細胞（前記に記載した通り）と接触させ（但し、前記の細胞を、 更にオーファンレセプターの発現ベクターにより更にトランスフェクションさせ 、このオー）了ンレセブターは、同種のリガンドの存在下で、本発明の受容体認 識配列に結合することかできる）だ後、レポータータンパク質を発現について分 析を行うことを含む方法が提供される。

本明細書および請求の範囲では、本明細書で使用するため特に定義されている句 および用語は、下記のように表わされる。

ｒＲＡＲβ」または「βＲＡＲＪは、共にレチノイン酸しセブターヘーターを表 わし、 ｒｃＡＴ」は、クロラムフエニコールアセチルトランスフエラーセを意味し、 １’ＬＵＣ」は、ホタルルシフエラーセを意味し、「β−ＧａｌＪは、β−ガラ クトシダーセを意味し、ｒｃＯｓ」は、Ｔ抗原（Ｔａｇ）を発現するサル腎細胞 ［例えば、Ｇｌｕｚｒｎａｎ、Ｃｅ１ｌ、２３：ｌ７５（１９８１年）を参照さ れたい］を意味し、ｒＣＶ−Ｎは、「Ｃｖ−１」として表わされる細胞ラインか らのマウス腎細胞を意味する。ＣＶ−１は、ＣＯ８の親ラインである。５Ｖ４０ Ｔ抗原（Ｔａｇ）を発現するために形質転換されたＣＯ８細胞と異なり、ＣＶ− １細胞は、Ｔ抗原を発現しない。

「転写制御領域」または「転写制御要素」は、プロモーターに効果的に連結し、 プロモーターの転写活性にリガンド応答を付与する受容体認識配列から成るＤＮ Ａセグメントを意味し、 「効果的に連結し」とは、このようにして連結したＤＮＡセグメントの間の連結 （即ち、ＤＮＡセグメント）が、連結したセグメントの１つの他方に対する前記 の効果をもたらすことのできるようになっているものを意味する。本明細書に記 載の様々な目的のために効果的な連結を生しることは、十分に当業者の技術の範 囲内にあり詳細には本明細書に教示されており、「自然にはリガンドに応答しな いプロモーター」とは、本発明の受容体認識配列を組換え型ＤＮＡまたは遺伝子 工学的な方法により、その転写の方向に対して（プロモーターの上流の）プロモ ーターを含むＤＮＡセグメントに接合または挿入し、プロモーターからの転写活 性がリガントに効果的に応答するようにプロモーターに連結しない限り、リガン ドは細胞（例えば、哺乳類細胞）中ではプロモーターからの転写を観察可能な程 度まで向上させないことを意味し、 ［実質的な配列相同性」とは、本明細書に開示され、請求されている実際の配列 と僅かしか配列か変化しておらず且つ同じ機能を保持しているＤＮＡまたはＲＮ Ａ配列を意味し、 「レチノイドレセプター」とは、レチノイン酸またはその誘導体（本明細書中に 広義に定義したような）と組み合わせて本発明の（複数の）受容体認識配列の転 写を活性化するのに有効なレセプターのステロイド／甲状線のスーパーファミリ ーのメンバーを意味し、例えばレチノイドＸレセプター（例えは、Ｍａｎｇｅｌ ｓｄｏｒｆら、Ｎａｔｕｒｅ、３４５．２２４−２２９　（１９９０）コ、およ び超過気孔レセプター［例えば、Ｏｒｏら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４７．２９８− ３０１　（１９９０）を参照されたいコ等であり、 ［オーファンレセプター」とは、特異的なリガンドかまた同定されていないレセ プターのステロイド／甲状線のスーパーファミリーの同定されたメンバーを意味 する。

例としては、ＨＮＦ４［例えば、５ｌａｄｅｋら、Ｇｅｎｅｓ　＆　Ｄｅｖｅｌ ｏｐｍｅｎｔ、４．２３５３−２３６５．１９９０］、レセプターのＣ０ＵＰフ アミリー、　［例えば、Ｍｉｙａ　ｊ　ｉｍａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１６．１１０５７−１１０７４　（１９８８）、Ｗａｎｇ ら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４０．１６３−１６６　（１９８９）を参照されたい］ 、Ｃ０ＵＰ一様のレセプターおよびＣ０ＵＰの相同体、例えば、Ｍ　ｌ　ｏ　ｄ 　ｚ　ｉ　ｋら。

Ｃｅ１ｌ、６０．２１１−２２４　（１９９０）、およびＬａｄｉａｓら、５ｃ ｉｅｎｃｅ、２５１，５６１−５６５（１９９１）に記載されたもの、超過気孔 レセプター（例えば、ｏｒｏら、同上）、等がある。

ホルモンレセプターの「適当なリガンド」とは、同種のレセプターと組合せて同 種のレセプターか結合する受容体認識配列の転写を活性化させるのに有効な（複 数の）特異的なリガンドを表わし、 「レチノイン酸（ＲＡ）またはその誘導体」とは、広義には同族体およびその誘 導体を含むレチノイド化合物を意味し、例えば「レチノイド」第１．２巻、５ｐ ｏｒｎ、Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｇｏｏｄｍａｎら監修、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ ｓ、Ｉｎｃ、出版、ニューヨーク（１９８４年）に記載されているものがある。

本明細書中に現れる様々なヌクレオチド配列に含まれるヌクレオチドは、当該技 術分野で慣例的に用いられている通常の一文字表示（Ａ、Ｇ、Ｔ、ＣまたはＵ） で表わす。

本明細書および請求の範囲において、ギリシア文字はアルファ、ベーター等と表 示することができ、またはこれに対応するギリシア文字記号（例えば、α、β等 ）を用いる場合もある。

本発明の受容体認識配列は、２つ以上の「半部位」から構成することかでき、こ こで各半部位は配列−ＮＮＮＮＮＮ−を含むか、但し半部位記列におけるヌクレ オチドの少なくとも３つは、配列−ＡＧＧＴＣＡ−の対応する位置のヌクレオチ ドと同一である。半部位の１つが好ましい配列−ＡＧＧＴＣＡ−と３つのヌクレ オチドだけ変化する場合、受容体認識配列の他の半部位は、好ましい配列とは３ 個未満のヌクレオチドだけ変化していることが好ましい。半部位のそれぞれの対 の３′−半部位（または下流の半部位）が、好ましい配列とはたかだか１個のヌ クレオチドか変化しているだけであることか、本発明では好ましい。

本発明により考えられる代表的な受容体認識配列は、例えば−ＡＧＧＴＣＡ−１ −ＡＧＴＴＣＡ−１−ＣＴＧＴＣＡ−１−ＧＧＧＴＣＡ−１−ＡＴＴＴＣＡ−１ −ＡＴＧＴＣＡ−１−ＣＧＧＴＣＡ−１−ＡＧＣＴＣＡ−、−ＡＧＧＣＣＡ−１ −ＡＧＧＴＧＡ−１−ＡＧＧＴＴＡ−１−ＡＧＧＴＣＣ−１−ＡＴＧＴＣＧ−な とから選択される配列を有する半部位の様々な組み合わせから得られる。本発明 に好ましい半部位は、−ＡＧＧＴＣＡ−１−ＡＧＴＴＣＡ−または−ＣＴＧＴＣ Ａ−から選択した配列を存するものである。

スペーサーヌクレオチドはＣ，Ｔ、ＧまたはＡのいずれであることもてきるが、 Ｃをスペーサーヌクレオチドとして用いることか本発明に好ましいか、これは自 然に存在する受容体認識配列において最も一般に見られるスペーサーだからであ る。

本発明により考えられる本発明に好ましい受容体認識配列は、５’−ＡＧＧＴＣ Ａ−Ｃ−ＡＧＧＴＣＡ−３’、５’　−ＡＧＧＴＣＡ−Ｃ−ＡＧＧＴＣＡ−Ｃ− ＡＧＧＴＣＡ−Ｃ−ＡＧＴＴＣＡ−３’、５’　−ＣＴＧＴＣＡ−Ｃ−ＡＧＧＴ ＣＡ−Ｃ−ＡＧＧＴＣＡ−Ｃ−ＡＧＧＴＣＡ−Ｃ−ＡＧＴＴＣＡ−３′なとであ る。

本発明の転写制御領域の一部であるプロモーターについては、そのようなプロモ ーターの転写活性か天然ではレチノイン酸およびその誘導体に応答しない場合、 そのようなプロモーターの転写活性を（本発明の受容体認識配列かプロモーター の上流に適当に位置するとき）本発明の受容体認識配列によって増加させること ができる限り、実際にはあらゆるプロモーターを用いることかてきる。そのよう なプロモーターには、マウス乳房の腫瘤ウィルスのデルタ−ＭＴＶプロモーター 、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーター、塩基性シミアンウィル ス５Ｖ−４０プロモーター、ショウジヨウバエアルコールデヒドロゲナーゼ（Ａ ＤＨ）プロモーター等がある。本発明に好ましいものは、活性に受容体認識配列 を必要とするプロモーターである。

実質的にはあらゆる所望のタンパク質またはポリペプチドは、本発明の発現ベク ターにより形質転換した細胞から作ることができる。そのようなタンパク質には 、ホルモン、リンフ才力イン、レセプターまたはレセプターサブユニット、免疫 グロブリン鎖等がある。ＬＵＣｌＣＡＴおよびβ−Ｇａｌのようなインジケータ タンパク質も、同様に作ることができる。

本発明により形質転換することができる細胞の型には、哺乳類細胞、鳥類細胞、 昆虫細胞等かあり、例えばＣＶ−１、ＣＯ３，Ｆ９、ＰＩ３、ＣＨＯ，ＨｅＬａ 、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｕＴｕ　８０、Ｒａｔ２線維芽細胞、ＨＴ１０８０．Ｔ、ヒ ヨコ胎児線維芽細胞、ウズラＱＴ６、ショウジヨウバエのシュナイダーＳ２細胞 等がある。

レチノイン酸またはその誘導体のアゴニストまたはアンタゴニストとしての試験 化合物の活性の本発明の測定法は、当該技術分野で周知の標準的分析技術を用い て実行することができる。例えば、Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、Ｎａｔｕｒｅ、 ３４５．２２４−２２９　（１９９０）を参照されたい。

本発明によるスクリーニングに考えられる試験化合物には、本発明の受容体認識 配列によりレセプターのトランス活性を促進する能力に潜在的に影響を及はすこ とのできるあらゆる化合物がある。

本発明の具体的な態様によれば、レチノイン酸（またはその誘導体）への応答性 か、（ＲＡＲと比較して）ＲＸＲに特有の経路により起こるのかまたは他の経路 により起こるのかを識別することか可能てあり、ＲＡＲ経路によるレチノイン酸 （またはその誘導体）への応答性は、ＲＡＲ発現の増加に伴ってトランス活性化 の量が増加し、ＲＸＲ経路によるレチノイン酸（またはその誘導体）への応答性 は、ＲＡＲ発現の増加に伴ってトランス活性化の程度は減少する（トランス活性 化の程度の減少は、ＲＸＲによるＲＡＲの漸進的に阻害する活性化によって引き 起こされる）。

レセプター、分析法、その他本明細書の主題に関係する主題は、参考として本明 細書に引用されている下記の文献に見出すことができる。１９８７年１０月２０ 日に出願され、ＰＣＴ国際的公表第ＷＯ３８，０３１６８号明細書として公表さ れた共通に誼渡された米国特許出願連続番号第１０８．４７１号明細書、１９８ ８年１１月３０日に出願され、欧州特許出願公表第０　３２５　８４９号明細書 として公表された共通に請渡された米国特許出願連続番号第２７６．５３６号明 細書、１９８９年６月２２日に出願された共通に誼渡された米国特許出願連続番 号第３７０．４０７号明細書てあって、前記の出願明細書にはガンマー−レチノ イン酸をコードするｃＤＮＡを有するプラスミドの、ブダペスト条約による寄託 を掲げており、この寄託手続きは１９８９年６月２２日に行われ、Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎＡｃｃｅｓｓｉｏｎ第４ ０６２３号を有するもの：Ｚｅｌｅｎｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３３９．７１４　（ １９８９）；Ｐｅｔｋｏｖｉｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ、３３０゜４４４　（１９８ ７）、Ｂｒａｎｄら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２．８５０　（１９８８）。

本発明の受容体認識配列から成るＤＮＡセグメントは比較的短いので、それらは 合成により、すなわち当該技術分野で知られるように、受容体認識配列を含むオ リゴヌクレオチドをＤＮＡ合成装置上で合成することにより提供することがてき る。オリゴマーエンドの３′−および５′−末端に制限エンドヌクレアーゼ部位 を提供して、転写活性を高め、所望の遺伝子を転写させるプロモーターの上流部 位のＤＮＡ発現ベクターに、合成の受容体認識配列を好都合に挿入することかで きるようにすることが頻繁に熱望されている。当業者てあれば理解されるように 、本発明の受容体認識配列は他の受容体認識配列同様、配向および位置とは全く 無関係てあり、広い許容範囲を存する。したかって、本発明の受容体認識配列は いずれの配向ても機能し、影響を受けるプロモーターの約３０ヌクレオチド上流 から約１０．０００ヌクレオチド上流の、任意の好都合な位置に置くことができ る。

本発明の受容体認識配列を含む転写制御領域を用いた発現系で用いられる好まし い細胞は、ＣＯ８細胞およびＣＶ−１細胞のような哺乳類細胞である。ＣＯ３− １（ＣＯ３として表わす）細胞は、５Ｖ４０Ｔ抗原（Ｔ　ａ　ｇ）を発現するマ ウス腎細胞であるが、ＣＶ−１細胞はＳＶ４０Ｔａｇを発現しない。ＣＶ−１細 胞か好都合であるが、これは低濃度のβＲＡＲを産生ずることコルチコイドまた は他の既知のステロイドまたは甲状腺ホルモンレセプターを欠いているからであ る。このように、本発明の転写制御領域の制御下で、非対応遺伝子を含む適当な 発現ベクターによる遺伝子導入により、これらの宿主細胞をレチノイン酸または その誘導体による誘導に応答して所望のタンパク質を大量に産生する形質転換細 胞へ転換することが可能である。

複製のＳＶ４０源を含む発現プラスミドは、ＳＶ４０Ｔａｇを発現するあらゆる 宿主細胞においてかなりの複製数まで増殖することができる。このように複製の ＳＶ４０源を存する発現プラスミドは、ＣＯ８細胞ては複製することかできるか 、ＣＶ−１細胞では複製することができない。多数のコピーにより発現を増加す ることが望ましいか、それは本明細書に述べる分析系にとって重要てはない。宿 主として任意の特定の細胞ラインを使用することも同様に重要ではないか、ＣＶ −１細胞は特に好都合であるので、本発明に好ましい。

本発明を、下記の非限定的な実施例に関して詳細に説明する。

実施例 細胞のレチノール結合タンパク質ＩＴ壓（ＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ）は、豊富に存在す る腸のタンパク質である。ラットのＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ遺伝子プロモーターの位置 −９８８から＋５０までの部分［Ｄｅｍｍｅｒら、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　２６２　二　２４２５−２４６７（１９８７年）を 参照のことコは、細菌性クロラムフエニコールアセチルトランスフヱラーゼ（第 １図を参照のこと）というレポーターの発現を制御するプラスミドに導入した。

得られるレポータープラスミド、ｐＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＣＡＴは、マウス胎児悪 性奇形腫Ｆ９細胞へトランスフェクションした後に、レチノイン酸（ＲＡ）応答 を試験した。Ｆ９細胞は、大量のレチノイン酸レセプター（ＲＡＲ）を内因性発 現し、ＲＡＲβ遺伝子の、十分特性決定されたＲＡ誘導性のプロモーターを含む レポータープラスミドを効率的にトランス活性化することかできる（＞　１００ 倍）［ｄｅ　Ｔｈｅら、Ｎａｔｕｒｅ、　３４３．１７７−１８０　（１９９０ ）および５ｕｃｏｖら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８７：５３９２−５３９６　（１９９０）を参照のこと コ。しかしながらＣＡＴは、これらの細胞において、基礎の、またはＲＡ−誘導 性のＣＡＴ活性を何ら付与しなかった。ラミニンレチノイン酸受容体認識配列の 場合と同様にＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉプロモーターの制御には高濃度のＲＡＲか必要で あり［ＲＡＲＥ、Ｖａｓｉａｓら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８６：９０９９−９１０３　（１９８９）参照］、また はその制御がアイソフオーム特異的であるという可能性を除くために、ＲＡＲの ３つのサブタイプを総て有する発現ベクターをそれぞれ別個にｐＣＲＢＰ　Ｉ　 Ｉ−ＣＡＴと共にＦ９細胞へ同時トランスフェクションした。

過度の発現の後でも、ＲＡＲα、ＲＡＲβおよびＲＡＲγは、ｐＣＲＢＰ　Ｉ　 Ｉ−ＣＡＴにＲＡ応答を付与することができない。次に、これがレチノイドＸレ セプター（ＲＸＲ）についても言えるのかどうかということを試験した。ＲＸＲ は、ＲＡにも特異的に応答する核レセプタースーパーファミリーのメンバーであ るが、−次構造およびリガント特異性かＲＡＲとは実質的に異なるＣＭａｎｇｅ 　Ｉ　５ｄｏｒ　ｆら、Ｎａｔｕｒｅ、３４５゜２２４−２２９　（１９９０） を参照のこと］。

顕著なことには、ヒトＲＸＲαをコードする発現ベクターをｐＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ −ＣＡＴレポーターと共にＦ９細胞中に同時トランスフェクションしたところ、 ＲＡはＣＡＴ活性の劇的な増加（１００倍）を引き起こした。

このＲＸＲによるＣＲＢＰ　Ｔ　Ｉプロモーターの誘導は、リガンド濃度及びレ セプター濃度のいずれによっても変化する。

ＲＸＲ受容体認識配列（ＲＸＲＥ）として機能するＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉプロモータ ー中の正確な配列を評価するために、一連の５′−欠失突然変異体を、親レポー タープラスミドｐＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＣＡＴから出発して構成した（第２図参照 ）。ＲＡがない時には、これらの構造体は皆、ＲＸＲで同時トランスフェクショ ンしたＦ９細胞において、ＣＡＴ活性が非常に低かった。ＲＡを追加すると、プ ロモーター配列が−７４１（ｐＣＲＢＲＸＲＥが、ＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ遺伝子プロ モーターの塩基−７４１から−６０４の間に位置していることを示唆している。

この領域の検査により、５個の−ＡＧＧＴＣＡＣ−のほぼ完全な直列反復を含む 、−６３９から−６０４の塩基の顕著な配列が明らかになった。これらの半部位 （ｐΔＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＣＡＴ、第２図）を含む配列が欠失すると、ＲＸＲ依 存性の誘導がなくなることから、この配列がＲＸＲＥとして機能するという直接 的な証拠が提供される。重要なことは、ＣＲＢＰ　Ｉ　Ｔ−ＲＸＲＥは、最小の ＳＶ４０の早期プロモーターのような異種プロモーターに融合てき、ＲＡおよび ＲＸＲ依存性の活性化を付与する（第２図のＰΔ５Ｖ−ＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＣＡ Ｔ参照、以下も参照のこと）。

ＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＲＸＲＥがＲＸＲの正統な結合部位であることを示すため、 一部精製され、細菌により合成された受容体タンパクを、［”Ｐ］を標識したＤ ＮＡプローブを用いてゲル遅延分析により調査した。コントロールとしてＲＡＲ もこれらの研究に入れた。先の研究では、細菌性により産生したＲＡＲは、リガ ンドおよびＤＮＡ結合の両方に好適であることを示していた［Ｙａｎｇら、Ｎａ 　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、Ｕ、Ｓ。

Ａ１．印刷中（１９９１）参照］。驚くべきことには、多量のＲＡＲを［”Ｐ］ 　ＣＲＢＰ　Ｔ　Ｉ−ＲＸＲＥと共にインキュベートすると、最終的には分類し たプローブの総てを満たした主要なタンパク質−ＤＮＡ複合体を形成することか できた。ＲＡＲのＲＸＲＥに′対する結合の親和性は、そのβＲＥへの結合より 大きいと思われる（既知のＲＡＲＥ；ｄｅ　Ｔｈｅら、同上文献、および５ｕｃ ｏｖら、同上文献参照）。更に、未標識のＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＲＸＲＥは、［” Ｐ］βＲＥのＲＡＲへの結合に関し、少なくとも未標識のＰＲＥと同様に競合し た。ＲＡＲのβＲＥおよびＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＲＸＲＥに対する特異性を、非特 異的オリゴヌクレオチド（ＧＲＥＴ）が競合不能であることにより、更に説明す る。

ＲＸＲタンパク質を使用して同様の分析を行ったところ、もう一つの予想外の結 果が見られた。多量のＲＸＲは予測通りＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＲＸＲＥプローブに 強力かつ特異的に結合したが、ＲＸＲとＲＸＲＥの間に形成されたタンパク質− ＤＮＡ複合体は、ＲＡＲとＲＸＲＥの間に形成された複合体（双方のレセプター が同じ大きさであるとしても）よりはるかに遅い電気泳動移動度で移動する。更 に、弱いＲＸＲ受容体認識配列でＲＸＲ結合に関しＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＲＸＲＥ とあまり競合性のないβＲＥも、ＣＲＢＰ　Ｔ　Ｉ−ＲＸＲＥのものよりはるか に弱く且つ速やかに移動するＲＸＲとの複合体を形成する。

これらの結果から、ＲＡＲとは異なりＲＸＲはマルチマーとしてＣＲＢＰ　Ｉ　 Ｔ−ＲＸＲＥに結合することか分かる。このより高度な複合体は、ＣＲＢＰ　Ｉ 　Ｉ遺伝子プロモーターをトランス活性化するＲＸＲの独占的な能力に寄与する ことがてきる。ＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＲＸＲＥの中には、模範的な単要素−ＡＧＧ ＴＣＡ−の４個の完全な直接反復体かあり、各々が１個のヌクレオチドによって 隔離されている。これは、ＲＸＲが四量体としてＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＲＸＲＥに 結合することを示唆する。

ＲＡＲは、ＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＲＸＲＥを緊密に結合するので、ＣＲＢＰ　Ｉ　 Ｉ遺伝子プロモーターのトランス活性化しないが、ＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ発現の制御 におけるＲＡＲの潜在的な役割について調査した。レチノイドレセプターのＲＸ ＲＥに対する特異性を調査するため、Ｆ９細胞とは異なり高濃度の内因性ＲＡＲ を発現しないＣＶ−１細胞において、同時トランスフェクションを検討した。こ れらの実験に用いたレポータープラスミドは、ＴＲＥｐ、既知のＲＡＲＥ及びＲ ＸＲＥ　（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら、Ｎａｔｕｒｅ、３４５．２２４−２２９ 　（１９９０）およびＵｍｅｓｏｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ、３３６゜２６２−２６ ５　（１９８８）参照］、およびＣＲＢＰ　Ｉ　Ｔ−ＲＸＲＸｔｌ−１ｐΔ５Ｖ −ＣＡＴの最小のプロモーターへ導入することによって構成した（Ｋ。

ＵｍｅｓｏｎｏおよびＲ，Ｅｖａｎｓ、作成中）。第３図および先に証明された （Ｕｍｅｓｏｎｏら、同上文献）ように、ＴＲＥｐは、ＲＡＲまたはＲＸＲのい ずれかの存在下で、ＲＡに著しく応答する。しかしながら、天然のＣＲＢＰ　Ｉ 　Ｉプロモーターに就いての実験と同様に（第２図）、ＲＸＲＥはＲＸＲの存在 下でのみＲＡ一応答性である。

次に、ＲＡＲのＲＸＲＥに結合する能力により、ＲＸＲトランス活性化を阻害す ることもてきるか否かについての試験を行った。多量のＲＡＲ発現プラスミドを 一定濃度のＲＸＲ発現プラスミドと同時トランスフェクションすると、ＲＸＲ活 性化は著しく減少し、ＲＡＲとＲＸＲに対する発現ベクターの濃度が等しいとき には、９０％抑制された（第３ｂ図参照）。これらの結果は、ビタミンＡ代謝物 が、ＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉの発現をフィードバック調節することができ、この調節は 、含まれているレチノイドレセプターの型およびその濃度によって正または負の どちらにもなることを示唆している。

ＣＲＢＰ　Ｉ　Ｉ−ＲＸＲＥの発見は、ＲＸＲにビタミンＡのホメオスタシスの 調整において特異的な役割を与え、ＲＸＲおよびＲＡＲ作用の経路を区別する育 用な手段を提供する。

本発明について、その好ましい態様に関して詳細に説明してきたが、修正及び変 更が本明細書及び請求の範囲に記載されている発明の精神および範囲がら離反し ないことを理解されるであろう。

補正書の写しく翻訳文）提出書く非法組８４条の８）

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．配列 ５′−ＮＮＮＮＮＮ−（Ｎ−ＮＮＮＮＮＮ）ｘ−３′（式中、それぞれのＮは、 Ａ、Ｔ、ＣまたはＧから独立に選択され、但し、ヌクレオチドの各−ＮＮＮＮＮ Ｎ−基の少なくとも３個のヌクレオチドは、配列−ＡＧＧＴＣＡ−に相当する位 置のヌクレオチドと同じであり、 ｘは、１以上の整数） を有する実質的に純粋なＤＮＡ。
2. ２．ｘがｌであり、ヌクレオチドの各 −ＮＮＮＮＮＮ−基が配列−ＡＧＧＴＣＡ−を有する、請求項１に記載のＤＮＡ 。
3. ３．−Ｎ−が−Ｃ−である、請求項２に記載のＤＮＡ。
4. ４．ｘが３であり、ヌクレオチドのそれぞれの−ＮＮＮＮＮＮ−基が配列−ＡＧ ＧＴＣＡ−または−ＡＧＴＴＣＡ−を有する、請求項１に記載のＤＮＡ。
5. ５．−Ｎ−が−Ｃ−である、請求項４に記載のＤＮＡ。
6. ６．配列、 ５′−ＡＧＧＴＣＡ−Ｃ−ＡＧＧＴＣＡ−Ｃ−ＡＧＧＴＣＡ−Ｃ−ＡＧＴＴＣＡ −３′を有する、請求項５に記載のＤＮＡ。
7. ７．ｘが４であり、ヌクレオチドのそれぞれの−ＮＮＮＮＮＮ−基が配列−ＡＧ ＧＴＣＡ−、−ＡＧＴＴＣＡまたは−ＣＴＧＴＣＡ−を有する、請求項１に記載 のＤＮＡ。
8. ８．−Ｎ−が−Ｃ−である、請求項７に記載のＤＮＡ。
9. ９．配列 ５′−ＣＴＧＴＣＡ−Ｃ−ＡＧＧＴＣＡ−Ｃ−ＡＧＧＴＣＡ−Ｃ−ＡＧＧＴＣＡ −Ｃ−ＡＧＴＴＣＡ−３′ を有する、請求項８に記載のＤＮＡ。
10. １０．レチノイン酸またはその誘導体による転写活性化を通常は受けないプロモ ーターに効果的に連結した請求項１に記載のＤＮＡを含んで成る実質的に純粋な ＤＮＡ構造体であって、ＤＮＡおよびプロモーターが効果的に連結して、好適な リガンドおよびその関連レセプターの存在下で、前記のプロモーターに転写活性 化活性を付与する、ＤＮＡ構造体。
11. １１．前記の適当なリガンドおよびその関連レセプターが、レチノイン酸または その誘導体、およびＲＸＲを含む、請求項１０に記載のＤＮＡ構造体。
12. １２．プロモーターがマウス乳房腫瘤ウィルスのデルターＭＴＶプロモーター、 ＳＶ４０の早期プロモーター、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼプロモー ターまたはショウジョウバエアルコールデヒドロゲナーゼプロモーターから選択 される、請求項１０に記載のＤＮＡ構造体。
13. １３．効果的に連結して遺伝子に転写される、請求項１０に記載のＤＮＡ構造体 を含んで成る、実質的に純粋なＤＮＡ構造体。
14. １４．細胞に所望のタンパク質を発現するベクターであって、このベクターが、 請求項１３に記載の実質的に純粋なＤＮＡ構造体を含んで成り、この遺伝子が所 望のタンパク質をコードする、ベクター。
15. １５．所望のタンパク質が、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルト ランスフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼの中から選択される、請求項１４ に記載のベクター。
16. １６．請求項１４のベクターにより形質転換した細胞。
17. １７．細胞が、ＣＶ−１、ＣＯＳ、Ｆ９、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＮＩＨ　３Ｔ３、 ＨｕＴｕ８０、Ｒａｔ２線維芽細胞、ＨＴ１０８０．Ｔ、ヒヨコ胚線維芽細胞、 ウズラＱＴ６またはショウジョウバエシュナイダーＳ２細胞の中から選択した種 類の哺乳類、鳥類または昆虫細胞である、請求項１６に記載の細胞。
18. １８．所望の遺伝子の制御した発現の方法であって、好適なリガンドおよびその 関連レセプターの存在下または非存在下において請求項１６に記載の細胞を培養 することを含む、方法。
19. １９．前記の好適なリガンドおよびその関連レセプターが、レチノイン酸または その誘導体、およびＲＸＲを含む、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．レチノイン酸またはその誘導体のアゴニストとしての試験化合物の活性を 試験する方法であって、（ａ）レチノイドレセプターの存在下で、および試験化 合物の存在下または非存在下で、請求項１６に記載の細胞を培養した後、 （ｂ）試験化合物の存在下または非存在下での培養中に発現した前記のタンパク 質の量を比較することを含む、方法。
21. ２１．レチノイン酸またはその誘導体のアンタゴニストとしての試験化合物の活 性を試験する方法であって、（ａ）レチノイドレセプターおよびレチノイン酸ま たはその誘導体の存在下で、更に （ｉ）この試験化合物の存在下で、 （ｉｉ）またはこの試験化合物の非存在下で、請求項１６に記載の細胞を培養し 、その後に、（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ）の培養工程中に発現した前記のタンパ ク質の量を比較することを含む、方法。
22. ２２．レチノイン酸またはその誘導体への応答がＲＡＲに比較してＲＸＲに特有 の経路によって起こるか否かを識別する方法であって、 請求項１４に記載のベクターをレチノイン酸またはその誘導体と接触させ、ＲＡ Ｒ：ＲＸＲ発現ベクターの比率を変化させた後、 ＲＡＲ：ＲＸＲの比率の増大による、レチノイン酸またはその誘導体による前記 の受容体認識配列の転写活性化に対する影響を測定することを含む、方法。
23. ２３．細胞のＲＸＲによって誘導される発現を調節する方法で、レチノイン酸ま たはその誘導体の存在下で、請求項１に記載のＤＮＡを競合的に結合するのに有 効な量のＲＡＲを、同じＤＮＡへのＲＸＲの結合に優先して、前記の細胞に投与 することを含む、方法。
24. ２４．化合物をスクリーニングして、オーファンレセプターのリガンドとして作 用する化合物を同定する方法であって、 前記の化合物を請求項１６に記載の細胞に接触させ、前記の細胞を更にオーファ ンレセプターの発現ベクターによりトランスフェクションすることを含み、この オーファンレセプターは、その同種のリガンドの存在下において、配列 ５′−ＮＮＮＮＮＮ−（Ｎ−ＮＮＮＮＮＮ）ｘ−３′（式中、それぞれのＮは、 Ａ、Ｔ、ＣまたはＧから独立に選択されるが、但しヌクレオチドの各−ＮＮＮＮ ＮＮ−基の少なくとも３個のヌクレオチドが、配列−ＡＧＧＴＣＡ−の相当する 位置のヌクレオチドと同一であり、 Ｘは１以上の整数である） を有する実質的に純粋なＤＮＡに結合させることができ、次いで、前記の所望の タンパク質の発現について分析することを含む、方法。