JPH08512197A

JPH08512197A - 受容体アゴニストのスクリーニング方法

Info

Publication number: JPH08512197A
Application number: JP6522489A
Authority: JP
Inventors: マクドネル，ドナルド・ピー; ツケルマン・マティ
Original assignee: Ligand Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ligand Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-04-07
Filing date: 1994-04-06
Publication date: 1996-12-24
Also published as: WO1994023068A1; BR9406616A; EP0694078A1; AU6556194A; CA2160135A1; EP0694078A4

Abstract

(57)【要約】レセプターアゴニストのアッセイ方法。その方法は、プロモーターからの転写を活性化することの出来る第一のＴＡＦ領域、およびそれ自身ではプロモーターの転写を活性化することは出来ないが第二のＴＡＦ領域の機能的状況を持つ変異した第二ＴＡＦ領域、をもつレセプターをコードする核酸を提供する段階を含む。核酸は、第二のＴＡＦ領域のみの存在下ではプロモーターからの転写を示すことは出来ないが、第一のＴＡＦ領域存在化ではプロモーターからの転写を示すことのできる、細胞内に提供される。さらに、細胞はプロモーターを含むレポーター構築物を含む。レポーター構築物は、プロモーターが第一のＴＡＦ領域存在下で活性化された場合に、転写される。さらに、レセプターの既知のアゴニストと細胞との接触がプロモーターからの転写を引き起こし、レポーター構築物の生成物のレベルを増加させるような条件下で、可能性のあるアゴニストと細胞を接触させる方法を含む。最終的には、可能性のあるアゴニストのアゴニスト活性の指標として、レポーター構築物の生成物の増加のレベルを測定する方法を含む。

Description

【発明の詳細な説明】受容体アゴニストのスクリーニング方法発明の背景本発明はホルモン受容体（例えばエストロゲン受容体）のような細胞の受容体に対して活性なアゴニストを同定またはスクリーニングするために有用な方法及び構築物（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）に関する。以下は関連技術の議論であるが、いずれも本発明の請求の範囲の先行技術となるものではない。 Evansらの米国特許5,071,773号（参考文献として本明細書中に取り込まれる）には、ホルモン受容体、このような受容体に対するリガンド、及びホルモン受容体の転写活性化能を有するタンパク質を検出することができるアッセイについて記載されている。一般に、アッセイには作動性リポーター遺伝子につながったホルモン応答の要素（例えばプロモーター）をコードするＤＮＡ、及び受容体タンパク質をコードするＤＮＡの双方を含有する細胞の利用を含む。適当なホルモンまたはリガンドが細胞に提供されると、ホルモン受容体とホルモンの複合体が形成され、適当なＤＮＡ結合領域に運ばれ、それによってホルモン応答要素を活性化し、リポーター遺伝子の発現を引き起こす。リポーター遺伝子の活性化は、リポーター遺伝子の産物を検出するために用いられる標準的な方法によって検出される。 Pierre Chambonと彼のグループは、エストロゲン受容体の種々の性質、及びその細胞型やプロモーターに依存する活性について記載している。これらの実験は、概してＴＡＦ１及びＴＡＦ２と呼ばれる２つのドメインの全て、または一部を欠如した受容体を発現する１つまたは複数個の不完全な（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）エストロゲン受容体コード遺伝子を利用することによって行われた。これらのドメインはエストロゲンによって調節されていると考えられており、プロモーターの活性化を引き起こす。第３のドメインはこれら２つの間に位置し、受容体−ホルモン複合体によって活性化されるプロモーターの近くのＤＮＡに結合すると考えられている（Kumar et al.，51 Cell 941(1987)）。より具体的には、Webster et al.，54 Cell 199(1988)では、転写活性化機能に関与する領域の位置を決めるのにキメラ受容体が利用されている。著者らは、ホルモンは受容体がＤＮＡ応答要素を認識できるようにすること、及びホルモンがホルモン結合ドメインにおいて転写活性化機能を引き起こすことを提示している。 Tora et al.，59 Cell 477(1989)には、ヒトのエストロゲン受容体の不完全変異体が分析され、ＴＡＦ１及びＴＡＦ２が受容体における２つの転写活性化機能として記載されている。これらの活性化因子は細胞型特異性及びプロモーター状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）への依存性を示すと言われている。著者らはＴＡＦ２が上流の要素と相乗的に働くことを示している。 Meyer et al.，57 Cell 433(1989)には、プロゲステロン受容体による転写刺激がエストロゲン受容体の共発現によって阻害されることが記載されている。著者らはこの観察が制限的転写因子の受容体による競合を反映していると述べている。 Berry et al.，9 EMBO Journal 2811(1990)には、エストロゲン応答性遺伝子に対する、いわゆるプロモーター−及び細胞−特異的なアゴニストの効果について記載されている。同じ、または異なる起源のＴＡＦ１及び／またはＴＡＦ２領域を含有する不完全でキメラなエストロゲン受容体が利用された。 Tassett et al.，62 Cell 177(1990)には、ＴＡＦ領域の比活性の比較及び競合性構築物によって、ＴＡＦ１及びＴＡＦ２領域の相互作用及び制限因子による競合（squelching）が記載されている。 Fawell et al.，60 Cell 953(1990)には、エストロゲン−受容体の二量体化及び分子の変異によるその変化が記載されている。 Metzger et al.，20 Nucleic Acids Research 2813(1992)には、酵母サッカロマイセスセレビシアエ（Saccharomyces cerevisiae）のＴＡＦ１及びＴＡＦ２領域のプロモーター−及び細胞−特異性について記載されている。不完全な（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）受容体、またはこれらで削除された領域を有する受容体が分析において用いられた。 Danielian et al.，11 EMBO Journal 1025(1992)には、エストロゲン受容体で保存されている領域について記載され、以下のことが述べられている： “ＴＡＦ１及びＴＡＦ２の活性は応答性プロモーター及び細胞の型に依存して変化し、いくつかのケースでは完全な転写刺激のためには双方が必要とされる。” 著者らはホルモン依存性の転写刺激に必須といわれる、マウスのエストロゲン受容体とグルココルチコイド受容体のＣ−末端近傍のアミノ酸を同定している。完全な長さの受容体中、あるいはＴＡＦ１領域のなくなった内部欠失変異の中に点突然変異を起こすことによって、著者らはＴＡＦ１の存在下または非存在下におけるＴＡＦ２活性に対する変異の効果をつきとめることができた。発明の概要本出願人は受容体におけるＴＡＦ１及びＴＡＦ２領域の活性は相互に依存しあっていることを発見した。すなわち、一方の領域の活性は、使用し得る他方の領域が機能的状況（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｃｏｎｔｅｘｔ）を有することに依存している。（“機能的状況”の語は、１方の領域で数個のアミノ酸（すなわち１０個まで）、または好ましくは１−３個のアミノ酸のみが変化し、ホルモンまたは転写因子とその領域との相互作用の変化が最小限である（好ましくは相互作用に変化がない）ことを意味する。こうした相互作用では、変化しない、または変異していない領域の活性が完全に発現できるだろう。このように、一方のＴＡＦ領域の機能的状況には、アゴニストの結合、二量体化、及び熱ショックタンパク質の相互作用の点では他方のＴＡＦ領域の機能的な活性が含まれるが、転写活性化能の点では含まれない。）本出願人の発見により、選択された受容体のアゴニストの検出のための適当なアッセイ法は、ＴＡＦ１またはＴＡＦ２領域に、変異していない他の領域の活性に明かな影響を与えることなくその領域を不活性化する、すなわち機能をなくさせる最小限の変異を起こした受容体構築物を必要とすることが示唆される。従って、一つの例として、ＴＡＦ１はその機能的活性を示すことができるようにしたままで、ＴＡＦ２の機能をなくす変異をＴＡＦ２領域に起こさせるものがある。欠失領域のあるＴＡＦ１またはＴＡＦ２を用いる先行技術と異なり、本発明のアッセイでは容易に解釈できる再現性ある結果が得られる。これまでの構築物では、選択した受容体における選ばれた分子のアゴニストまたはアンタゴニスト活性を定量するために必要な情報を提供することができなかった。詳細には、本出願人は、受容体のＴＡＦ１またはＴＡＦ２領域の一方のみと相互作用する受容体のアゴニストをスクリーニングするアッセイ法を提供することが可能であることを発見した。アゴニストに対するこうした特殊なアッセイ法は、多数のアゴニストの中から特異的で望まれる性質を有するアゴニストを迅速にスクリーニングすることを可能にする。一例として、エストロゲン受容体に対するアゴニストは、例えばエストロゲン、タモキシフェン（ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）、あるいは他の既知のアゴニストに類似の活性を有するものとして速やかに同定することができる。すなわち、このようなアッセイ法ではアゴニストが特異的に同定できるだけでなく、アゴニストの型も決定することができる。より詳細には、本出願人は、修飾した受容体を利用することによって、受容体のＴＡＦ１またはＴＡＦ２活性のために必要なプロモーター−及び細胞型に特異的な条件を同定するための方法を確立した。今ではプロモーター−及び細胞型に特異的な活性の変化を決定するために実験を行うことができる。特別な理論に拘束されることはないが、本出願人は、こうしたプロモーター− 及び細胞型特異性は、ＴＡＦ１領域は優性な転写活性化因子として働き、ＴＡＦ２領域は転写促進因子として働くというモデルによって説明できると考える。すなわち、ＴＡＦ２領域はＴＡＦ１活性のための転写機構を整えるために働く。この調整は基本的な転写因子の供給、染色体構造の改変、あるいは転写抑制因子の除去であるかも知れない。あるいはまた、ＴＡＦ２領域は他の転写活性化因子のために転写機構を整えるかも知れないし、単独で本来の転写活性化作用をわずかながら有しているかも知れない。このようなモデルにおいて、ＴＡＦ１領域は、ＴＡＦ２領域がＴＡＦ１作用のために適当にそれを整えるために働くまで転写機構に近づくことができない。本出願人は、ＴＡＦ１またはＴＡＦ２活性に対する細胞特異性は、ＴＡＦ１またはＴＡＦ２の存在をそれぞれまねる細胞内のＴＡＦ１またはＴＡＦ２型の機能の存在または非存在を反映していると考える。細胞内におけるこうした模倣によって、変異した、また不活性化したＴＡＦ１またはＴＡＦ２領域を有する受容体構築物が活性をもつことができるだろう。すなわち、受容体の不活性な部分を細胞内に存在する活性のある機能で埋め合わせることができる。同様なモデルがプロモーター特異性について存在するかも知れない。すなわち、選ばれたプロモーターのみがこれらのプロモーターにある機能に依存して、特定の細胞のＴＡＦ１またはＴＡＦ２によって活性化されるだろう。このモデルでは、種々のアゴニスト間のアゴニスト活性の違いは、ＴＡＦ１領域またはＴＡＦ２領域に対するそのアゴニストの効果、及びＴＡＦ１またはＴＡＦ２領域と選ばれたプロモーターまたは一般的な転写機構との相互作用に依存する。本出願人はこれらの知見を利用して、受容体のアゴニストが容易に同定できるアッセイ法を発展させた。この方法において、選択されたＴＡＦ１及び／またはＴＡＦ２活性を有し、作動性（例えば速やかに検出し得る酵素活性をコードする）リポーター遺伝子につながった適当な（例えばプロモーター領域を含有する）応答要素を有する特定の受容体構築物が細胞に提供される。応答要素は、アゴニストの活性が特定の条件下でのみ観察されるように、特定の細胞と関連して選択される。従って、一つの例として、受容体は活性のあるＴＡＦ１領域と、ＴＡＦ２の機能的状況を提供する変異した（不活性な）ＴＡＦ２領域を有し、細胞は選ばれたプロモーターに対する受容体のＴＡＦ２領域の機能をまねる、または置き換える成分を有するようなものが選ばれる。プロモーターまたはこの成分が目的のＴＡＦ機能を示すことができるように適当な結合環境を提供する。このようにして、ＴＡＦ１領域に働くアゴニストは、受容体において活性のあるＴＡＦ２領域を欠如していてもリポーター遺伝子の発現を引き起こすことができることで容易に同定することができる。このように、最初の側面として、本発明は選択された受容体に対するアゴニストをスクリーニングまたはアッセイする方法に特徴がある。この方法はＴＡＦ１及びＴＡＦ２領域を有する受容体をコードする核酸を含有する細胞を提供することを含む。これらＴＡＦ１及びＴＡＦ２領域の一方は選ばれたプロモーターからの転写を活性化することができ、他方の領域は、その領域の機能的状況を提供しながら、他方のＴＡＦ領域に非依存的なプロモーターの転写を活性化することができないように変異している。細胞は、上記の変異体に相当する変異していないＴＡＦ領域のみを有する（そして他方のＴＡＦ領域を有さない）受容体の存在下で、プロモーターの転写がないか、または最小限であるように選択される。細胞はまた、転写が上記の変異していない領域のみを有する受容体の存在下で生じるように選択される。例えば、作動性ＴＡＦ１領域及び変異した非作動性ＴＡＦ２領域を有する受容体構築物において、プロモーターの転写は作動性ＴＡＦ２領域のみを有する受容体の存在下では生じない（すなわち、有意な転写レベルは検出できない、通常、正常レベルの５−１０％未満である）が、作動性ＴＡＦ１領域のみを有する受容体の存在下では生じるだろう。前に論じたように、本出願人は、こうした細胞は受容体のＴＡＦ２機能をまねる因子を含有していると仮定する。細胞は更に、上記のように変異していない活性のあるＴＡＦ領域を有する受容体の存在下でリポーター遺伝子の転写を引き起こすように活性化されるプロモーター領域を有するリポーター構築物を含有する。プロモーターは上記の変異したＴＡＦ領域のみを含有する受容体の存在によっては活性化されない。本発明の方法は更に、細胞の正常なアゴニスト（例えばエストロゲン受容体に対するエストロゲン）との接触がプロモーターからの転写を引き起こし、その結果リポーター遺伝子産物のレベルを増大させるような条件下で、細胞をアゴニストになり得るものと接触させる段階を有する。この方法は、アゴニストの適用前にはリポーター構築物は細胞内で基底（低い、または最小限の）レベルで転写されていることを含んでもよい。あるいはまた、この方法ではアゴニストを最初に適用し、次いでリポーター構築物が転写されてもよい。受容体は２つのＴＡＦ領域を有してもよい。本発明に用いることのできる受容体の制限的でない例としては、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、またはこれらの受容体の変異体がある。最後に、この方法にはアゴニストになり得る物質のアゴニスト活性の指標として、リポーター遺伝子産物の増加の度合を測定する段階が含まれる。好ましい具体例において、アゴニストはヒトのホルモンアゴニストであり、核の受容体、例えばヒトのホルモン受容体は細胞内の核酸によってコードされている。１つの例として、受容体は変異したＴＡＦ２領域を有し、細胞及びプロモーターはＴＡＦ２の存在に対して応答を示さないか、または最小限の応答を示すようなものが選択される。こうした細胞の例の１つは、作動性ＴＡＦ２領域を有する受容体が活性をもたない肝細胞（特にＨｅｐＧ２細胞）である。すなわち、細胞内にＴＡＦ２領域のみが存在してＴＡＦ１領域が存在しない受容体では本来の転写活性はないが、利用できる作動性ＴＡＦ１領域のみを有する受容体では転写活性がある。最も好ましくは、プロモーターは選ばれた細胞内で提供されるＴＡＦ２機能を有する受容体を必要としないように選択され、従って受容体構築物内の機能的なＴＡＦ１と関連して働くアゴニストはそのアゴニスト活性を示すことができる。もう１つの側面として、本発明は、機能的なＴＡＦ１及びＴＡＦ２領域を有する変異していない受容体を有する細胞の利用によるアゴニスト活性の検出方法に特徴がある。細胞はＴＡＦ１またはＴＡＦ２疑似活性を欠いたものが選ばれる（すなわち、活性のあるＴＡＦ１またはＴＡＦ２領域のいずれかを有する受容体は単独でこの細胞内の転写の活性化を引き起こさない）。プロモーターは、１方のＴＡＦ領域を通してのみ働き、双方を通しては働かない受容体に対するアゴニストの存在下で、この細胞内でこのプロモーターから活性化が達成されるように選ばれる。例えば、肝細胞（例えばＨｅｐＧ２）と複合化Ｃ３プロモーターによってＴＡＦ１領域のみで活性のあるアゴニストに対する有用なアッセイが提供される。肝細胞及びＣ３プロモーターはＴＡＦ２活性を有するが、プロモーターは活性のあるＴＡＦ２領域のみを有する受容体の存在下では活性化されない。しかし、活性のあるＴＡＦ１領域の存在下ではプロモーターは活性がある。このように、受容体のＴＡＦ１領域に働くアゴニストは、リポーター遺伝子の発現を引き起こすものとして同定することができる。好ましい態様において、この方法はＴＡＦ２領域が変異し、選ばれた細胞及びプロモーター状況の中で提供される受容体の利用に関する。この細胞によって、試験したアゴニストの型を決定する有用なスクリーニング試験が提供される。観察される転写レベルは以下に例示するようなアゴニストの型に関係する。（変異した、また変異していない受容体構築物を用いた）上記の２つの方法は、選ばれた受容体に対するアゴニストの検出、グレード分けまたはタイプ分けのために組み合わせて利用することができる。もう１つの側面として、本発明はエストロゲンの関連する疾患あるいは状態を治療または予防する方法に関する。“エストロゲンの関連する疾患”の語は、ホルモンであるエストロゲンの量の増加または減少によって引き起こされる、あるいはこれに関連する疾患を意味する。“ホルモン”とは、受容体のアゴニストとして機能する自然に生じる生化学物質を意味する。合成ホルモンはより適切にアゴニストとして呼ぶ。エストロゲンの関連する疾患の例としては、骨孔症、乳癌、子宮癌、及び子宮内膜症がある。エストロゲンの関連する状態の例としては、血管運動異常、熱閃光（hot flashes）、抑鬱症、他の精神医学的な異常、及び子宮類線維腫がある。いくつかの疾患において、患者は体が必要とする量のエストロゲンを産生することができない可能性がある。他の疾患ではエストロゲンは過剰生産されている可能性がある。治療は腫瘍がそれ以上に成長するのを妨害する効果及び／または存在する腫瘍を小さくさせる効果を有するものである。本発明の方法はホルモン代替治療に関する。この方法において、患者は最初に標準的な方法でこのような疾患にかかっている、または状態にあると決定され、次に以下に記載するように治療する。この方法はケオキシフェン様の転写能を有する（またはこのような化合物をインビボで産生させる）ケオキシフェン（ｋｅｏｘｉｆｅｎｅ）以外の化学物質を患者に投与することを含む。“ケオキシフェン様の転写能”の語は、ケオキシフェンに類似する正常な応答をさせることを意味する。この能力は低濃度の化合物に対して比較的低いＴＡＦ１応答を示すが、高濃度の化合物に対しては比較的高い応答を示す。更に、全ての濃度においてＴＡＦ２応答はわずかであるか、応答しないのが良い。また、より高濃度（約１０^-7Ｍ、図８Ａ−Ｄと比較して図８Ｅを参照）において、野生型の受容体よりも高い（約２倍またはそれ以上の）ＴＡＦ１応答をすべきである。ケオキシフェン様転写能を有するこれらの化学物質の投与は、骨を保護する活性及び子宮／乳房を助ける活性を示すことが予想される。“骨を保護する活性”とは、標準的な技術で測定し得る骨吸収を阻害する活性を意味する。骨吸収はエストロゲンの損失と典型的に関連する。骨吸収は典型的には骨孔症と関連し、カルシウムの損失に起因する骨溶解によってあらわれる。“ 子宮／乳房を助ける活性”とは、標準的な技術で測定し得る腫瘍細胞の増殖の阻害または縮小を意味する。ケオキシフェン様転写能を有するか否かを決定するためにスクリーニングできる化合物の例は１９８３年１１月２９日に発行され、また本明細書中に参考文献として取り込んだJonesの米国特許No.4,418,068号に記載されている。Jonesの特許が明らかにしているように、スクリーニングできる他の化合物としてジヒドロナフタレン及びベンゾチオフェンがある。スクリーニングできる他の化合物として、ケオキシフェンまたはケオキシフェン様の同族体に類似の化学構造を有する化合物がある。これらの化合物のいくつかはケオキシフェンの窒素含有環の中で１−１０個の炭素数の長鎖アルキル、アルケニル、または類似の型の炭素鎖で置換をさせて製造することができた。他の変更としては、窒素含有環をケオキシフェン化合物の他の部分につなぐアルキル鎖（例えば０−１０個の炭素原子）の長さまたは飽和度を変えることが含まれる。ケオキシフェン様の性質をスクリーニングできる他の化合物としては、タモキシフィン（ｔａｍｏｘｉｆｉｎｅ）またはタモキシフィン同族体に類似の化学構造を有する化合物がある。この分野の熟練者であれば、ケオキシフェン様の性質をスクリーニングできる化合物に対して行える他の修飾及び置換を容易に認識できるであろう。本発明はまた、薬理学的に有効な量の上記の物質を薬理学的に許容し得る担体または希釈剤中に含有する、保存及びこれに続く投与のために調製される薬理学的に許容し得る組成物を提供する。本発明の他の特徴及び利点は、好ましい具体例についての以下の記載、及び請求の範囲から明かとなるであろう。好ましい実施態様の説明初めに、図面を簡単に説明する。図面図１。ＥＲ−ｗｔ（野生型エストロゲン受容体）および切断されたＥＲ突然変異体による転写活性化。ＥＲ−ｗｔ、ＥＲＮ２８２ＧおよびＥＲ１７９Ｃの模式構造（Ａ）。ＣＶ１（Ｂ）、ＨｅｐＧ２（Ｃ）およびＨＳ５７８Ｔ（Ｄ）細胞を、増加濃度の指示されたような種々の受容体発現ベクターと、９．５μｇ／ｍｌのＥＲＥ−ｔｋ−ＬＵＣリポータープラスミド、およびトランスフェクション効率の内部対照としての５μｇ／ｍｌのｐＲＳＶ−β−ｇａｌ発現ベクターとを一緒に用いて一時的に同時トランスフェクトした。担体ＤＮＡ（ｐＧＥＭ４）を加えて、ＤＮＡの総量を２０μｇ／ｍｌに調整した（以下を参照されたい）。培養を指示されたように１０^-7Ｍ１７−β−エストラジオール（Ｅ₂）を用いてまたは用いることなく３６時間処理し、且つβ−ガラクトシダーゼおよびルシフェラーゼ活性について検定した（ＬＵＣ活性はβ−ｇａｌ活性に標準化される）。ルシフェラーゼ比活性は、ある一定の点の標準化されたルシフェラーゼ値を、トランスフェクトされた受容体またはリガンドの不存在下で得られた値で割ることによって計算される。４回の独立した実験の典型的な１回の実験を前記に詳述している。示されたデータは、三重反復試験推定値の平均±ＳＥ（ｍ）を示す。図２。ＴＡＦ２活性欠損ＥＲ突然変異体による転写活性化。この実験で用いられたＥＲ−ｗｔおよび突然変異体ＥＲｓの模式構造（Ａ）。ＣＶ１（Ｂ）、ＨｅｐＧ２（Ｃ）およびＨＳ５７８Ｔ（Ｄ）細胞を、増加濃度の指示されたような種々の受容体発現ベクターと、９．５μｇ／ｍｌのＥＲＥ−ｔｋ−ＬＵＣリポータープラスミド、５μｇ／ｍｌのｐＲＳＶ−β−ｇａｌ発現ベクターとを一緒に用いて一時的に同時トランスフェクトした。担体ＤＮＡを加えて、全ＤＮＡ２０μｇ／ｍｌにした。培養を１０^-7Ｍ１７−β−エストラジオール（Ｅ₂）を用いてまたは用いることなく３６時間処理し、且つルシフェラーゼおよびβ−ｇａｌ活性について検定した。ルシフェラーゼ比活性は、ある一定の点の標準化されたルシフェラーゼ値を、トランスフェクトされた受容体またはリガンドの不存在下で得られた値で割ることによって計算される。４回の独立した実験の典型的な１回の実験を前記に詳述している。示されたデータは、三重反復試験推定値の平均±ＳＥ（ｍ）を示す。図３。ヒトＣ３遺伝子プロモーターに対するＴＡＦ１およびＴＡＦ２の活性。ＣＶ１（Ａ）、ＨｅｐＧ２（Ｂ）およびＨＳ５７８Ｔ（Ｃ）細胞を、０．５μ ｇの指示された受容体発現ベクター、９．５μｇのＣ３−ＬＵＣリポータープラスミド、５μｇのｐＲＳＶ−β−ｇａｌおよびＤＮＡ総量２０μｇまでの担体ＤＮＡを用いて一時的に同時トランスフェクトした。更に、負の受容体対照を含んだ。培養を１０^-7Ｍ１７−β−エストラジオール（Ｅ₂）を用いてまたは用いることなく３６時間処理し、そしてルシフェラーゼ活性について検定した。示されたデータは、同様の結果を伴って６回反復された実験の典型的な曲線である。曲線は、ｐＲＳＶ−β−ｇａｌ転写活性の同時推定によってトランスフェクション効率について平均化され且つ標準化された四重反復試験データポイントの平均を示す。図４。種々のプロモーター構築物に対するＥＲ−ＴＡＦ１およびＥＲ１７９Ｃの活性。ＣＶ１（Ａ）およびＨｅｐＧ２（Ｂ）細胞を、０．５μｇの指示された受容体発現ベクター、９．５μｇのｐＡ₂−ＬＵＣリポータープラスミド、５μｇのｐＲＳＶ−β−ｇａｌおよび総量２０μｇまでの担体ＤＮＡを用いて一時的に同時トランスフェクトした。ＣＶ１（Ｃ）およびＨｅｐＧ２（Ｄ）細胞を、ｐＥＲＥＭＬＴ−ＬＵＣリポーターを用いて前記のように同時トランスフェクトした。培養物を、１０^-7Ｍ β−エストラジオール（Ｅ₂）を用いてまたは用いることなく３６時間処理し、そしてルシフェラーゼ活性について検定した。示されたデータを図１に記載する。図５。トリフェニルエチレン由来エストロゲン部分的アゴニストによるＥＲ− ＴＡＦ１およびＥＲ１７９Ｃの活性化。ＨｅｐＧ２細胞を、０．５μｇの指示された受容体発現ベクター、９．５μｇのＣ３−ＬＵＣリポーター、５μｇのｐＲＳＶ−β−ｇａｌおよび総量２０μｇまでの担体ＤＮＡを用いて同時トランスフェクトした。培養物を１０^-7Ｍ１７ −β−エストラジオール（Ａ）、Ｅ₂、タモキシフェン（Ｂ）、４−ヒドロキシタモキシフェン（Ｃ）、ナフォキシジン（Ｄ）、クロミフェン（Ｅ）によって３６時間処理し、そしてルシフェラーゼ活性について検定した。示されたデータを図１に記載した。図５において、ＥＲはＥｒ−ｗｔを表わし、ＥＲ^mはＥｒ−ＴＡＦ１を表わし、ＴＡＦ２はＥｒ−１７９ｃを表わし、そしてＴＡＦ２^mはＥｒ −Ｎｕｌｌを表わす。図６。エストロゲンアゴニストによるＥＲ−ｗｔおよびＥＲ−ＴＡＦ１タンパク質に対するエストラジオール結合の置換。ＥＲ−ｗｔ又はＥＲ−ＴＡＦ１を発現する細胞から製造された酵母細胞質ゾルを、５ｎＭの³Ｈ−１７−β−エストラジオールを単独でか、または指示された濃度の種々のエストロゲンアゴニスト存在下で４℃で一晩中インキュベートした。リガンド結合は、ヒドロキシルアパタイトを用いる結合および遊離リガンドの分離後に、シンンチレーション計数によって決定された。図７。転写の機能的に依存性の活性化因子としてのＴＡＦ１およびＴＡＦ２のモデル。この略図は、エストロゲン受容体の個々のトランスアクティベーターのプロモーターおよび細胞特異性の仮説を概説する。受容体とリガンドとの相互作用は、受容体ＤＮＡ結合性部分（ＤＢＤ）を暴露し且つＥＲとＤＮＡとの会合を促進する一連の事柄を開始する。「エストロゲン様化合物」のみが受容体のＴＡＦ２部分を機能的に活性化することができる。活性化（Ｂ）により、受容体のＴＡＦ２部分は転写リプレッサー（Ｉ）と相互作用し、それを置換しまたはその構造を変化させて（Ｃ）、ＴＡＦ１活性化配列を一般的な転写装置（ＧＴＡ）に接近させる。ある種細胞中およびある種のプロモーター上において、受容体のＴＡＦ２機能は他の転写因子によって与えられることができ、受容体のＴＡＦ１部分をＴＡＦ２とは無関係に機能させることができる。したがって、ＤＮＡに対する受容体の結合はトランスアクティベーションと同義であり、両方のエストロゲンアゴニストによって、更にはＤＮＡに対する受容体の供給を可能にするアンタゴニストによって達成されることができる。このモデルにおいて、トリフェニルエチレン由来エストロゲンアゴニストの部分的アゴニスト活性は、リガンドによって誘導されたコンホメーションおよび、転写装置に対してＴＡＦ１が与えるもの（ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）に対してこのコンホメーションが有する作用に依る。図８は、トリフェニルエチレン由来アンチエストロゲンの部分的アゴニスト活性がＴＡＦ１機能に依ることを示す。ＨｅｐＧ２細胞を０．５μｇの指示された受容体発現ベクター、９．５μｇのＣ３−ＬＵＣリポーター、５μｇのｐＲＳＶ −β−ｇａｌおよび総量２０μｇまでの担体ＤＮＡとしてのｐＧｅｍ４によって同時トランスフェクトした。培養を、種々の濃度の１７−β−エストラジオール（Ａ）、クロミフェン（Ｂ）、ナフォキシジン（Ｃ）、４−ＯＨ−タモキシフェン（Ｄ）およびケオキシフェン（Ｅ）で３６時間処理し、そしてルシフェラーゼ活性について検定した。パネルＥのデータは、他のパネルとは異なるエストラジオール対照に相対して得られた。したがって、パネルＥにおけるピークは、パネルＡにおいて用いられたのと同様のエストラジオール対照に相対するデータが得られた場合に考えられるよりも約５倍高いと考えられる。ルシフェラーゼ比活性は、図１について記載のように計算された。６回の独立した実験の典型的な１回の実験を詳述する。示されたデータは、三重反復試験推定値の平均±ＳＥ（ｍ）を示す。図９。模擬の骨髄（対照）、ＯＶＸ（卵巣摘出されたラット）、ＯＶＸ＋エストロゲン、並びにＯＶＸ＋ケオキシフェンで処理されたラットの破骨可能性を共培養検定において評価した。骨髄を、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３および上皮小体ホルモンの存在下において一次骨芽細胞と８時間混合し、そして酒石酸ホスファターゼ耐性多核細胞（ＴＲＡＰ＋ＭＮＣ）の数を評点した。模擬操作された動物におけるＴＲＡＰ＋ＭＮＣの数を１００％に設定した。図１０。ＭＣＦ−７細胞増殖に対するケオキシフェン（ｋｅｏｘ）のエストロゲンアゴニスト活性。この検定におけるエストロゲンの活性は１０^-10Mで最大であり、対照の１５００％までの増殖を誘導する。図１１は、ｐＣ３−ＬＵＣを示す略図である。方法上記で簡単に論及された方法は、種々の受容体のアゴニストを識別するのに有用である。例えば、骨粗鬆症の治療に有用であるエストロゲンアゴニストを識別することができる。疾患状態においては、ＴＡＦ１活性だけで骨損失の防止に十分であるかのように見える。したがって、受容体のＴＡＦ１部分においてのみ活性を有し、且つＴＡＦ２部分で活性がないアゴニストは疾患治療に有用である。本明細書中に記載の方法は、有用なアゴニストを検出するのに困難な手順を必要とする従来の方法とは異なり、可能性のあるアゴニストの迅速なスクリーニングを可能にする。この方法を用いることができる他の有用な受容体としては、ヒト由来の細胞のみならず他の真核性細胞系、例えば、ニワトリおよび酵母（本発明のスクリーニングに有用な生物である）におけるプロゲステロン、グルココルチコイド、アンドロゲンおよびミネラルコルチコイド受容体がある。以下は、本発明の方法の具体的な実施例である。これらの実施例はエストロゲン受容体を利用するが、本発明においてはこれに制限されない。当業者は、他の均等な受容体、細胞およびプロモーターを、本請求の範囲の範囲内の均等な方法で容易に用いることができることを理解する。エストロゲン受容体エストロゲン受容体（ＥＲ）は、ステロイド類、ビタミン類または甲状腺ホルモンによってその機能が調節される転写因子のクラスである核受容体スーパーファミリーのメンバーである（ビート（Ｂｅａｔｏ）、５６Ｃｅｌｌ３３５，１９８９年）。このファミリーの調節タンパク質は、それらがホルモンに対して暴露されるまでは細胞中において転写的に不活性であるという点で共通の機械的特徴を有する。ホルモンによる占有は、受容体を活性化状態へと形態変換させ、それによってそれと標的遺伝子の調節部分の特異的ＤＮＡ配列とを生産的に相互作用させる。特異的遺伝子転写に対して得られた結合受容体の正または負の作用は、細胞種およびプロモーターの状況に依存性である。それにもかかわらず、相対作用は何等かの特定の細胞／プロモーター構築物において測定することができる。したがって、広範囲の種類の構築物において所望の作用を観察することができる。ＥＲのｃＤＮＡをクローン化し且つ用いて、異種哺乳動物細胞におけるエストロゲン応答性転写単位を再構築した（クマー（Ｋｕｍａｒ）ら、５ＥＭＢＯＪ．２２３１，１９８６年およびグリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、２３１Ｓｃｉｅｎｃｅ１１５０，１９８６年）。これは、タンパク質中の機能性ドメインについての詳細な試験を可能にした（クマーら、５１Ｃｅｌｌ９４１，１９８７年）。いくつかの系におけるＥＲのドメインの機能性試験は、種々のホルモン応答性終点を生じる臨界的細胞成分と相互作用することができる受容体中の類似の構造的特徴を示した（ダニエリアン（Ｄａｎｉｅｌｉａｎ）ら、１１ＥＭＢＯＪ．１０２５，１９９２年）。特に、２種類の別個のトランスアクティベーションドメイン、すなわち、ＴＦＡ１と称する受容体のアミノ末端の配列およびＴＡＦ２と称するカルボキシル６０アミノ酸に限定された配列は決定されており（ダニエリアンら、上記；ベリー（Ｂｅｒｒｙ）ら、９ＥＭＢＯＪ．２８１１，１９９０年；およびタセット（Ｔａｓｓｅｔ）ら、６２Ｃｅｌｌ１１７７，１９９０年）、いずれも本明細書中に援用されている。最近、細胞内受容体研究に携わる研究者らは、ＴＡＴＡ結合性タンパク質関連因子（ダインラクト（Ｄｙｎｌａｃｈｔ）ら、６６Ｃｅｌｌ，５６３，１９９１年）の発見およびクローニングとの混同を避けるためのＡＦドメイン（例えば、カバイルズ（Ｃａｖａｉｌｌｅｓ）ら、Ｊ．ｏｆＣｅｌｌｕｌａｒＢｉｏ．，３４１，１９９４）としてＴＡＦドメインを好んで論及している。ホルモン結合性ドメインのアミノ末端部分の負荷残基の変化は、同族ホルモンの受容体親和性を変化させることなくＥＲ転写活性を増加させるまたは減少させることができると考えられる。したがって、残基５３０付近の領域（ダニエリアンら、上記）およびシステイン３８１付近の領域（パクデル（Ｐａｋｄｅｌ）ら、７ＭｏｌＥｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，１４０８，１９９３年）はそれ自体、ＴＡＦ−２中のＡＦサブドメインを構成することができる。その結果、システイン３８１領域の残基などのこのようなドメインの変化は、本明細書中に詳述されたように得られた結果と平行して、エストロゲンとアンチエストロゲンリガンドとを区別しうる突然変異受容体を生じることができるということになる。更に、ＥＲのＴＡＦ−１部分の別個の残基に同様の状態が存在しうると考えられる。ＥＲ−ＴＡＦ１およびＥＲ−ＴＡＦ２の細胞標的はまだ同定されていない。哺乳動物細胞におけるＥＲ−ＴＡＦ１およびＥＲ−ＴＡＦ２機能の厳密な試験はまだ達成されていない。実施例以下の実験は、哺乳動物細胞におけるＥＲ−ＴＡＦ１およびＥＲ−ＴＡＦ２活性の、細胞−およびプロモーター−状況への依存性並びにこれらの相違の表現におけるリガンド（アゴニスト）の役割を特性決定する。これらの実験のいくつかは、本明細書中に参考文献として取り込まれるツカーマン（Ｔｚｕｋｅｒｍａｎ）ら、８Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎ２１，１９９４年に記載されている。以下の材料および方法を実施例において用いた。受容体発現ベクターＥＲ−ｗｔおよびＴＡＦ１を欠失した受容体誘導体をコードしているｃＤＮＡ配列を、それぞれプラスミドＹＥｐｗｔＥＲおよびＹＥｐＥＲ１７９ＣからＢｆｒＩおよびＳａｃＩを用いて切断した。ＴＡＦ１受容体誘導体をコードしているＤＮＡを、プラスミドＹｅＰＥＲＮ２８２ＧからＢｆｒＩおよびＫｐｎＩを用いて切断した。ベクターＹＥｐｗｔＥＲ、ＹＥｐＥＲ１７９ＣおよびＹＥｐＥＲＮ２８２Ｇの構築は前に記載された（ファム（Ｐｈａｍ）ら、６Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．１０４３，１９９２年）。切断されたＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（ベーリンガー・マンハイム・カンパニー（ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍＣｏ．）で処理し、そして哺乳動物発現ベクターｐＲＳＴ７中の固有のＥｃｏＲＶ部位中に連結させた（バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら、４１Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７３３，１９９２年）。受容体突然変異野生型エステロゲン受容体ｃＤＮＡを、ｐＧＥＭ−１１Ｚｆ（＋）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン）にクローン化した。部位特異的突然変異誘発（クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）ら、１５４ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ３６７，１９８７年）を用いて５３８位、５４２位および５４５位に位置したアミノ酸の代わりにアラニンを置換することによって特異的突然変異を受容体のホルモン結合性ドメイン中に導入して、プラスミドｐＧＥＲｍを生成した。このベクターのＢｇｌＩＩ−ＳａｃＩＣ末端フラグメントをｐＧＥＲｍからの同様の突然変異フラグメントと交換することによって突然変異ホルモン結合性ドメインをＥＲ−ｗｔおよびＥＲ１７９Ｃ中に導入した。リポータープラスミドリポーターＥＲＥ−ｔｋ−ＬＵＣは、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）に結合した単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター配列の上流にビテロゲニンＥＲＥの単一コピーを含む。１．８ｋｂのヒトＣ３遺伝子プロモーター（−１８０７〜＋５８）（ヴィク（Ｖｉｋ）ら、３０Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１０８０，１９９１年）を含むＣ３−ＬＵＣリポーター。固有の制限部位Ｘｈｏ１およびＢａｍＨ１をＣ３プロモーター中に導入した後、ＤＮＡをベクターｐ１−ＬＵＣの同族部位中にクローン化し（バーガーら、４１Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７３３，１９９２年）、そこにおいて多クローン性部位はＭＭＴＶ−ＬＵＣベクター中に挿入された（図１１を参照されたい）。当業者は、均等なベクターを容易に構築することができる。ｐＡ２−ＬＵＣは、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）ビテロゲニンＡ２遺伝子プロモーター（ヴィクら、３０Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１０８０，１９９１年）の８３５ｂｐフラグメント（−８２１〜＋１４）を含む。ｐＥＲＥＭＬＴ−ＬＵＣは、アデノウイルス主要後期プロモーター配列（−４４〜＋１１）上流に単一のＥＲＥを含む（フー（Ｈｕ）およびマンリー（Ｍａｎｌｙ）、７８Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２０，１９８１年）。細胞培養ＣＶ１およびＨＳ５７８Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（ハイクローン・ラボラトリーズ（ＨｙｃｌｏｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ユタ）を補足したダルベッコ修飾イーグル培地−ＤＭＥＭ（バイオウィッタカー（Ｂｉｏｗｉｔｔａｋｅｒ）、メリーランド）中で通常通り維持された。ＨｅｐＧ２細胞は、１０％ＦＣＳ含有イーグル最少必須培地−ＭＥＭ（バイオウィッタカー、メリーランド）中で維持された。一時的トランスフェクション検定トランスフェクションの２４時間前に、細胞を平底９６ウェル組織培養プレート（細胞５ｘ１０³個／ウェル）中の１０％ＦＢＳを含むフェノールレッド不含ＤＭＥＭ中に播種した。リン酸カルシウム沈殿を用いてＤＮＡを細胞中に導入した。プラスミドＤＮＡを、１ｍｌの１ｍＭトリス、ｐＨ７．４、０．１ｍＭＥＤＴＡ、０．２５ＭＣａＣｌ₂中で希釈した。ＤＮＡ溶液を、等容量の２ＸＨＢＳｐＨ６．９（２８０ｍＭＮａＣｌ、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、１．５ｍＭＮａ₂ＨＰＯ₄）中に撹拌しながら滴加し、そして沈殿を２０分間生成させた。トランスフェクション（ＤＮＡ混合物１１μｌ／ウェル）をバイオメク（Ｂｉｏｍｅｋ）１０００自動制御実験室ワークステーション（ＡｕｔｏｍａｔｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｙＷｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）（ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）、カルフォルニア）で実施した。細胞を６時間トランスフェクトさせた後、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して沈殿を除去した。細胞を、１０％炭（ch arcoal）処理ＦＢＳを含むフェノールレッド不含培地中において、本文中に示されたようにホルモンを用いてまたは用いることなく更に３６時間インキュベートした。細胞抽出物をバーガーら、４１Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７３３，１９９２年に記載のように製造し、そしてそのルシフェラーゼおよびβ−ガラクトシダーゼ活性を検定した。測定は全て、少なくとも２種類の独立した実験の三重反復試験で行なわれ、内部対照としてのβ−ガラクトシダーゼの発現を用いることによってトランスフェクション効率に対して標準化された。酵母受容体タンパク質の製造ＥＲ−ＴＡＦ１を生じる発現ベクターを、ＹＥｐＥ１０（ファムら、８８Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ３１２５，１９９１年）のＢｆｒ１−Ｍｌｕ１フラグメントをｐＲＳＴ７ＥＲ−ＴＡＦ１の対応するフラグメントで置換することによって構築した。このベクターおよび野生型受容体を生じるベクター（ＹＥＰＥ１０）を酵母ＢＪ２１６８系統（マクドネル（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ）ら、３９Ｊ．ＳｔｅｒｏｉｄＢｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．２９１，１９９１年によって前に記載された）中に形質転換させた。個々の形質転換細胞を採取し、且つＯＤ₆₀₀＝１まで増殖させた。次に、培養を１００μ ＭＣｕＳＯ₄および２ｍＭクロロキンによって３０℃で１６時間誘導した。次に、細胞をペレット化し且つ冷水で洗浄した。細胞を、２〜５Ｘペレット容量の１０ｍＭトリス、０．４ＭＫＣｌ、２ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭＰＭＳＦ、１μｇ／ｍｌのアプロチニン、２ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．６中に再懸濁させ、そして断続的に氷上で冷却しながら０．４５〜０．５ｍｍガラスビーズと一緒に、少なくとも９０％の細胞が破裂していることが観察されるまで激しく撹拌すること（ｖｏｌｔｅｘｉｎｇ）によって溶解させた。抽出物を１３，０００ｘｇで遠心分離し、そして上澄みを回収した。タンパク質濃度をバイオ・ラド・プロテイン・アッセイ（Ｂｉｏ−ＲａｄＰｒｏｔｅｉｎＡｓｓａｙ）（バイオ・ラド、リッチモンド、ＣＡ）によって決定した。 β−エストラジオール結合競合検定いずれの方法も、バイオメク１０００自動制御ワークステーション（ベックマン・インスツルメント（ＢｅｃｋｍａｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、フラートン、ＣＡ）を用いて行なった。試験される化合物の１０倍連続希釈を、１０ｍＭトリス、０．３ＭＫＣｌ、５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．６中で製造し、そして１００μｌの最終濃度１０^-4Ｍ〜１０^-11Ｍで希釈された化合物、５ｍＭ³Ｈ−β−エストラジオール（アマーシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、ＵＫ）、およびＥＲまたはＥＲ−ＴＡＦ１を生産する系統に由来する総タンパク質２２μｇが入っているポリスチレン試験管に移した。４℃で一晩中インキュベーション後、１０ｍＭトリス、５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．６中６％ヒドロキシアパタイトスラリー１００ μｌを加えた。試験管を４℃で更に３０分間インキュベートし、最初の１５分間が過ぎたら混合した。ヒドロキシルアパタイトペレットを、１０ｍＭトリス、５ｍＭＤＴＴ、ｐＨ７．６中１％トリトンＸ−１００の１ｍｌで４回洗浄した。最後に、ヒドロキシルアパタイトペレットを、エコシント（Ｅｃｏｓｃｉｎｔ）Ａシンチレーション液（ナショナル・ダイアグノスティクス（ＮａｔｉｏｎａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、マンビル、ＮＪ）８００μｌ中に再懸濁させた。それぞれの試料中の活性をＬＳ６０００ＩＣシンチレーション計数計（ベックマン・インスツルメンツ、フラートン、ＣＡ）を用いて測定した。実施例１：ＴＡＦ１およびＴＡＦ２の切除されたレセプターによる転写活性化図２に示すように、ＴＡＦ１またはＴＡＦ２活性化配列のどちらかが欠損したヒトのエストロゲンレセプターの切除形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄｆｏｒｍ）、それぞれＥＲ１７９ＣまたはＥＲＮ２８２Ｇ（図２Ａを参照のこと）、を調製した。これらの構築物は、文献に記載された哺乳類細胞（Ｂｅｒｒｙら、ＥＭＢＯＪ．，９，２８１１，１９９０）および酵母細胞（Ｐｈａｍら、Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏ．，６，１０４３，１９９２）で用いられた物と構造的に類似したタンパク質をコードしている。これらＥＲ誘導体の転写活性は、ビテロゲニン（ｖｉｔｅｌｌｏｇｅｎｉｎ）−エストロゲン応答エレメント（ｅｓｔｒｏｇｅｎｒｅｓｐｏｎｓｅｅｌｅｍｅｎｔ）（ＥＲＥ）（Ｋｌｅｉｎ−Ｈｉｔｐａｓｓら、Ｃｅｌｌ，７６，１０５３，１９８６）をチミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターの上流に挿入したコピー（ＥＲＥ−ｔｋ−ＬＵＣ）を一つ含むレポータープラスミドを用いて評価した。レポータープラスミド、および高濃度のＥＲまたはＥＲ変異体の発現ベクターは、一時的に、ＥＲ陰性細胞系ＣＶ−１（サル腎臓繊維芽細胞）、ＨｅｐＧ２（ヒト肝細胞カルシノーマ）およびＨＳ５７８Ｔ（ヒト乳癌細胞）にトランスフェクションされ、図２Ｂに示すように活性を評価した。すべてのトランスフェクションは、１７−β−エストラジオールの非存在下、または存在下（濃度範囲、１０^-5Ｍから１０^-11Ｍ）で行った。この方法で数多くのデータ（＞２，５００）が得られたが、１０^-7Ｍの１７−β−エストラジオールを用いた場合のみ活性が得られたことにより、この濃度が試験したすべての細胞系で最大の転写応答を引き出す濃度であることを示している。ＥＲ−ｗｔはすべての細胞系で活性であった。このプロトコールを用い、ＥＲＮ２８２Ｇの欠損の状況（ｃｏｎｔｅｘｔ）においてアッセイした場合、ＴＡＦ１−仲介転写活性は、ＣＶ−１、ＨｅｐＧ２、ＨＳ５７８Ｔ（図２Ｂ，Ｃ，Ｄ）並びにＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ（データは示していない）のいずれの細胞においても、はっきりとは検出できなかった。しかしながら、これに対して、ＴＡＦ２活性化機能（ＥＲ１７９Ｃ）は、これらの細胞（図２Ｂ、ＣおよびＤ）において、実質的に活性を示した。ＥＲ１７９Ｃを用いたＴＡＦ２の転写活性の程度は細胞の型に依存した。この分離した活性化因子は、飽和状態のレセプターを作り出すＤＮＡ濃度でも、野性型のレセプターと比較して低い効力を示した。ＨｅｐＧ２細胞では、ＥＲ１７９ＣはＥＲ−ｗｔの約３５％ほどの活性であった（図２Ｃ）が、ＣＶ−１およびＨＳ５７８Ｔでは、ＥＲ１７９Ｃは、ＥＲ−ｗｔの活性のそれぞれ７０％および６５％を示した（図２ＢおよびＤ）。トランスフェクション効率および組換え体の発現程度は、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリー分析による間接的評価と同様であった（データは示していない）。この分析から得られた結果は、ＴＡＦ１およびＴＡＦ２配列が、機能上、別個の転写活性化因子に相当するという仮説と一致する。野性型のレセプターの活性は、両活性化領域、または個々の活性化因子が最大転写活性を示す様な完全な（ｉｎｔａｃｔ）レセプターの状況、のいずれかを必要とする。上記のＥＲ変異株で認められる部分的活性に加えて、ＣＶ−１およびＨＳ５７８Ｔ細胞にトランスフェクションするＥＲ−ｗｔ濃度を高くすると、ホルモン依存性転写活性が累進的に減少した（図２ＢおよびＤ）。この様な現象は他でも認められ、活性化されたレセプター機能が損なわれる程に過剰に発現したホルモン活性化レセプターによって調節転写因子または標的が隔離されることから得られる結果と類似している（Ｔａｓｓｅｔら、Ｃｅｌｌ，６２，１１７７，１９９０）。この“スケルチング（ｓｑｕｅｌｃｈｉｎｇ）”または“転写干渉”は、ＥＲが適切に機能するためにはさらに細胞内に調節転写因子を必要とするという見解を支持する。ＨｅｐＧ２細胞系ではＥＲ−ｗｔによる“ｓｑｕｅｌｃｈ”が認められない（図２Ｃ）のは、必要とされる補助因子が多量に増加したこと、またはこの過程で他の細胞の特別な成分が関与していることを示唆している。実施例２：ＴＡＦ２活性の不完全なＥＲ変異体による転写活性以前は、ＴＡＦ１およびＴＡＦ２の機能は、ＥＲ応答プロモーターの転写を補助する能力を持つエストロゲンレセプター内の個々のドメインとして定義されていた（Ｂｅｒｒｙら、ＥＭＢＯＪ．，９，２８１１，１９９０、およびＴａｓｓｅｔら、Ｃｅｌｌ，６２，１１７７，１９９０）。この文献中で試験された哺乳類の細胞を用い、ＥＲＮ２８２Ｇの欠損の状況で分析した場合、本発明者らは、ＴＡＦ１配列に明確な活性を見いだせなかった。それ故、全長のレセプターの状況以外でのこのトランス活性化因子の分析は、その真の生物学的活性を反映していないかもしれないと考えた。以前、Ｄａｎｉｅｌｉａｎら（上記）は、ＴＡＦ２の転写活性を含むマウスのエストロゲンレセプターのカルボキシ末端の５３５から５５０の間の残基のうち３アミノ酸を変化させることができることを示したが、結果として得られたレセプターは、やはり、野性型の親和性を持ち、特異的ＤＮＡおよび同種のリガンドの両方と結合する能力を持っており、このような変化はタンパク質の全体的な構造異常を引き起こさなかったことを示唆している。それ故、本発明者らは部位特異的突然変異誘発を用いて、ヒトＥＲのカルボキシ末端の５３８、５４２および５４９残基（Ｄａｎｉｅｌｉａｎら、上記）に同様のアミノ酸変化を作り出した（図１のＥＲ−ＴＡＦ１構築物を参照のこと）。また、この３か所の突然変異をＥＲ１７９Ｃに導入し、ヌル（ｎｕｌｌ）エストロゲンレセプターを作成した（図１のＥＲ−Ｎｕｌｌ構築物を参照のこと）。この後者の構築物は、ＴＡＦ２機能上でのこれらの変異の影響を明確に決定することができる。この様に、ＥＲ−ＮｕｌｌおよびＥＲ−ＴＡＦ１は両方共、試験される機能を不活性化するので、優れた対照として供される。これらの構築物の内の一つが、ここに示す全ての実験に用いられた。これらの３つのアミノ酸の変異は、その領域を不活性化するがＴＡＦ領域の前後関係（ｃｏｎｔｅｘｔ）を維持することの出来る唯一の例として提供される。当業者は、同じまたは他のアミノ酸の同等の変異を標準的技術で容易に作り出すことができることを認識しているであろう。これらＥＲ変異体の転写活性は、ＥＲＥ−ｔｋ−ＬＵＣレポーターと共に、ＣＶ−１細胞内に一過的にトランスフェクションすることによって評価した。ＥＲ１７９Ｃの３か所への突然変異の導入は、ＴＡＦ２活性を完全に破壊した（図１Ｂ）。この様に、野生型ＥＲへのこの様な変異の導入は、ＴＡＦ２活性の干渉を排除して、全長のレセプターの状況でＴＡＦ１活性を試験することを可能にするであろうと確信した。この方法でヒトエストロゲンレセプター内のＴＡＦ２活性化因子を特異的に変異しうることは、マウスＥＲで以前報告された結果と一致し、同等の変異が他のレセプターのＴＡＦ領域にも作れることを示唆している。３か所の変異を含む全長のレセプター（ＥＲ−ＴＡＦ１）は、完全なレセプターの状況において、ＴＡＦ１の機能を分析するために用いられた。野生型のレセプター、ＥＲ−ＴＡＦ１、ＥＲ１７９Ｃまたはヌルエストロゲンレセプターをコードする構築物は、ＥＲＥ−ｔｋ−ＬＵＣレポーターと共に、ＣＶ−１、ＨｅｐＧ２、またはＨＳ５７８Ｔ細胞にトランスフェクションした。結果を図１に示す。全ての細胞系で、ＥＲ１７９Ｃが転写活性をもつことは比較的早い時期に認められた（図１Ｂ、ＣおよびＤ）が、ヌルレセプターは活性を示さなかった。興味あることに、ＣＶ−１細胞では、機能的なＴＡＦ２活性化配列が存在しなくても、ＥＲ−ＴＡＦ１タンパク質は有意な転写活性を示した（図１Ｂ、ＣおよびＤ）。この様に、全長のレセプター分子の状況において分析した場合、ＴＡＦ１活性化因子の活性は、ここに見られるように、欠失変異体（ＥＲＮ２８２Ｇ、図２）を分析した場合の活性とは異なっていた。この事は、ＴＡＦ１の活性は独立的に機能せず、むしろ、適切に機能するために追加のカルボキシ末端配列を必要とすることを示唆している。興味深いことに、トランスフェクションしたＥＲ−ＴＡＦ１ＤＮＡの濃度を高めても、その結果、レセプター依存性の転写活性の“スケルチング”を生じなかった。この所見は、ＴＡＦ１およびＴＡＦ２の両活性化因子、並びに、多分、全長のレセプターの状況が、このスケルチング機能を必要としていることを示唆している。これらのレセプターのそれぞれの発現レベルの比較は、発現ベクターをＣＶ− １細胞内へトランスフェクションし、さらに得られたサイトゾル抽出物中のホルモン結合活性を分析する、ことによって行った（データは示さず）。ＥＲ−ｗｔ、ＥＲ−ＴＡＦ１およびＥＲ１７９ＣのＫｄＳは同じであった。ＥＲ−ｗｔおよびＥＲ−ＴＡＦ１は、ホルモン結合活性によって測定した場合に、同等のレベルで合成されたが、これに対してアミノ末端の欠損したＥＲ１７９Ｃおよびヌルレセプターは、ＥＲ−ｗｔの約２５％程度、発現していた。それぞれのレセプターで検出した転写応答は全て、到達しうる最大応答であるため、レセプターの発現レベルが実験結果の重要な因子であるとは考えにくい。実施例３：ＥＲ−ＴＡＦ１およびＥＲ１７９Ｃ活性はプロモーター特異的である。ＥＲＥ−ｔｋ−ＬＵＣレポーターを用いて得られた上記の結果から、エストロゲンレセプター機能のＴＡＦ１活性化因子は、弱くではあるが、完全なＴＡＦ２機能が存在しなくても機能することが、示唆された。さらに、ＴＡＦ１活性は、細胞の型に依存して現れた。他のエストロゲン応答プロモーターに対する個々の活性化因子機能の効率を試験するために、研究を広げた。この目的のために、最近強いＥＲＥが同定された、エストロゲン応答Ｃ３プロモーター（Ｚａｗａｚ）ＧｅｎｅＥｘｐ．，２、３９、１９９２）（Ｖｉｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０，１０８０，１９９１）を選んだ。ＥＲ−ｗｔ，ＥＲ−ＴＡＦ１およびＥＲ１７９Ｃ活性化因子の活性は、図３に示すように、Ｃ３プロモーターの支配する転写を上昇させた。ＨＳ５７８Ｔ細胞では、Ｃ３プロモータはＥＲ−ｗｔ、ＥＲ−ＴＡＦ１およびＥＲ１７９Ｃのいずれによっても等しく良く活性化された（図３Ｃ）。しかしながら、これに対して、ＨｅｐＧ２細胞では、ＥＲ−ＴＡＦ１活性化因子は、野性型のＥＲと同程度の転写活性を示したが、ＥＲ１７９Ｃ活性化因子は活性を示さなかった（図３Ｂ）。これらのデータは、Ｃ３プロモーターに関していえば、ＥＲトランス活性化因子機能において、細胞の型による強い偏向性があることを示唆している、ＣＶ−１細胞では、活性化配列の組み合わせが最大活性に必要であることを示している（図３Ａ）。累積すると、これらのデータは、ＥＲ内でのＴＡＦ１およびＴＡＦ２活性化因子は、細胞の型およびプロモーターに依存性を示し、さらに、Ｃ３の発現において、ＥＲが仲介する制御の優位の活性化因子はＴＡＦ１であることを、示唆している。個々のＥＲＴＡＦドメインのＥＲ機能に関する寄与の相関性を分析するために、さらに２つのプロモーター、エストロゲン応答エレメントを含むアデノウイルスの主要後期プロモーター（ｍａｊｏｒｌａｔｅｐｒｏｍｏｔｅｒ）およびビテロゲニンプロモーター、を用いた（図４）。これらの両プロモーターは、ＥＲ−ｗｔ存在下ではエストロゲンに応答した。しかしながら、Ｃ３プロモーターとは異なり、ＥＲの個々の活性化ドメインは、試験した両細胞系で極微の活性を示した。この事は、むしろ、エストロゲンレセプター活性化ドメインのプロモーター特異性を目立たせる。上述の試験と同様の試験は、上記のアゴニストアッセイに用いる有用なプロモーターおよび細胞の組み合わせを迅速に同定するために用いることができる（実施例４を参照のこと）。実施例４：エストロゲンレセプターアゴニストによるＥＲ−ＴＡＦ１およびＥＲ１７９Ｃ活性の制御ある種の、トリフェニルエチレン由来のエストロゲンレセプターアンタゴニスト（すなわち、タモキシフェン、ナホキシジン(ｎａｆｏｘｉｄｉｎｅ)）は、部分的にアゴニスト活性を示すことが報告されている。それ故、これらの化合物がＴＡＦ１またはＴＡＦ２のトランス活性化因子のどちらを優先的に活性化するかについて試験した。一連のこれらの化合物は、ＥＲ−ＴＡＦ特異的レセプター誘導体およびＣ３プロモーターを用い、ＨｅｐＧ２細胞で評価した。このプロモーターを用いると、タモキシフェン、４−ヒドロキシ−タモキシフェン、ナホキシジンおよびクロミフェン（ｃｌｏｍｉｐｈｅｎｅ）は、全て、ＥＲ−ｗｔの仲介するＣ３遺伝子の転写の有力な活性化因子であった（図５Ｂ−Ｅ）。しかしながら、この実験に関して言えば、これらの化合物はいずれも、エストロゲンほど効果的ではなかった。（図５Ａ）。さらに、エストロゲンはＥＲ−ＴＡＦ１の優れた活性化因子であったが、部分的なエストロゲンアゴニストはエストロゲンほど有効ではなかった。この細胞とプロモーターの状況では、ＥＲ１７９Ｃはエストラジオールおよび部分的エストロゲンアゴニストのいずれによっても活性化されなかった。これらのデータは、たとえＴＡＦ１活性が必要であっても、それだけでは、トリフェニルエチレン誘導体の抗ホルモンによって、このプロモーターが活性化されないことを暗示し、それらの作用機序はエストロゲンのそれとは機序的に異なっているらしいと思われる（図５Ａ−Ｆ）。これらのレセプター誘導体のホルモン応答性の違いは、タンパク質のリガンドへの親和性の変化とは関係しない。図６ＡおよびＢに示すように、ＥＲ−ｗｔとＥＲ−ＴＡＦ１のリガンドへの親和性および特異性は、識別できない。このシステムで試験した抗ホルモンの全てが、同じ転写プロフィールを持つわけではないことは注目に値する（図５Ｂ −Ｅ）。それらのＴＡＦ１を活性化する能力が異なるために、個々の抗ホルモンの絶対的効力が異なり、これらのリガンドのアゴニストとしての性質に微妙な機序的な違いが生ずると考えられる。これらの例は、ヒトのエストロゲンレセプターへの部位特異的突然変異（ｓｐｅｃｉｆｉｃｐｏｉｎｔｍｕｔａｔｉｏｎ）の導入が、ＥＲの転写活性化機能に影響を与えることを示している。この方法でＴＡＦ２を変異させても、エストロゲン、タモキシフェンおよび４−ヒドロキシ−タモキシフェンに関しては、野性型の結合親和性と同じパターンである。意外にも、ＴＡＦ１は、ＴＡＦ２が変異していても、少なからぬ転写活性を残していた。ＴＡＦ２配列全体を欠損させた（ＥＲＮ２８２Ｇ）場合、試験した全ての細胞系でＴＡＦ１の残存転写活性を認めることは出来なかった。このことから、ＴＡＦ２または全長のレセプターの状況のいずれかが、ＴＡＦ１の活性を全て出現させるのに必要であると考えられる。これに対して、Ｂｅｒｒｙらは、ＥＲＮ２８２Ｇと同一の構築物がトリＣＥＲ細胞でも活性であることを見出だした（Ｂｅｒｒｙら、ＥＭＢＯＪ．，９，２８１１，１９９０）。このことは、哺乳類とトリの細胞では、エストロゲンレセプター機能が異なることを示唆し、２組の結果の本質的な違いを反映しているものではないと思われる。修飾したレセプターを用いて、細胞およびプロモーターに特異的な差異をＥＲ −ＴＡＦ１およびＥＲ１７９Ｃの活性の中に同定することができた。発現の程度およびトランスフェクション効率の制御実験では、両活性化因子は、プローモータおよび細胞の型に特異的な違いを、その活性で示すことが分かった。これの最も印象的な例としては、ＥＲ１７９ＣがＨｅｐＧ２細胞内ではどのプロモーターを用いても良く機能しないことが上げられる。他方、ＥＲ−ＴＡＦ１活性化因子は、Ｃ３プロモーター複合体で非常に良く機能するが、試験したその他のプロモーターでは余り良く機能しなかった。ＥＲ−ＴＡＦ１とＥＲ１７９Ｃの活性プロフィールは明らかに別個のものであり、異なる作用機構を示唆している。Ｃ３プロモータ複合体では、ＴＡＦ１とＴＡＦ２の間に明らかな相乗作用は認めらないが、他のプロモーターでは明らかに存在する。このことは、このプロモーターでは、ＥＲ活性化ドメインが異なる転写因子と相互に影響しあうであろうことを示唆している。ＨｅｐＧ２細胞中でＣ３プロモーターを用いて得られたデータは、ＴＡＦ１がＥＲ−ｗｔと同様に良い転写活性化因子であるように、これらの細胞ではＴＡＦ２に機能的にとって変わることのできる転写因子が存在することを示唆している。しかしながら、ＴＡＦ２単独では転写を活性化しないため、この特定の細胞系では、このプロモーターの転写のためのＴＡＦ１の擬似体が存在しないことを示唆している。異なる作用機構ならびにプロモーターおよび細胞の型の特異性は、ＴＡＦ１が優性の転写活性化因子であり、且つＴＡＦ２が転写促進因子であるというモデル（図７のモデルを参照のこと）によって説明することができる．ＴＡＦ２の機能は、ＴＡＦ１のために転写装置を“調製”することであると考えられる。この“ 調製”機能とは、基本的転写因子の補充、クロマチン構造の改造、または転写レプレッサーの影響の克服、が出来ることである。他方、ＴＡＦ２は、もう一つの転写活性化因子のための転写装置を“調製”することができるが、それ自身では、固有の転写活性をほとんど持たない。この仮説を支持するように、ＴＡＦ２活性化因子は、最小プロモーターでは活性に乏しい。また、プロモーターに依存するこの複雑さは、ＥＲ−ＴＡＦ１活性でも認められる。ＴＡＦ２の促進因子としての役割を支持する他の証拠として、酵母では、ＴＡＦ１活性化因子は最小プロモーターでは不活性であるということがあげられる。しかしながら、ＳＳＮ６座（転写の細胞内レプレッサー）の変異（Ｋｅｌｅｈｅｒら、Ｃｅｌｌ，６８，７０９，１９９２）は結果として、ＥＲ−ＴＡＦ１活性を（ＥＲ−ｗｔと比較できる程度まで）１００倍上昇させたが、ＥＲ１７９Ｃ活性は影響を受けなかった（ＭｃＤｏｎｎｅｌｌら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９，１０５６３，１９９２）。この細胞内変異はＴＡＦ２の機能を真似る効果を持ち、且つ哺乳類細胞内では、ＴＡＦ２は同じ様な役割を持っていると考えられる。このシステムでは、ＴＡＦ１は、阻害因子による立体障害の結果として、転写装置に接近できない。ＴＡＦ２が有効な場所では、次に、阻害因子が置換され、ＴＡＦ１が転写装置と相互に作用できる。実施例５：ケオキシフェン様転写プロフィールを持つ化合物のスクリーニングおよび使用ヒトでは、トリフェニルエチレンから誘導した抗エストロゲンケオキシフェンは、子宮の増殖には明らかな影響を示さないが、骨のスペアリング（ｓｐａｒｉｎｇ）活性を示す。対照的に、タモキシフェン、抗エストロゲン関連物質、は骨スペアリングではあるが、子宮の望ましくない増殖効果を促進する点で、部分的にエストロゲンアゴニストとして機能する。タモキシフェンおよびケオキシフェンの生体内（ｉｎｖｉｖｏ）での生物学的活性の相違を、転写を活性化するＴＡＦ１へのそれらの異なる能力によって一致させうるか決定するために、これらの化合物を、ＨｅｐＧ２細胞内で、ＥＲ−ＴＡＦ特異的レセプター誘導体をＣ３プロモーター存在下で用いて、実験した。結果を図８Ｄおよび８Ｅに示す。ケオキシフェンは、このプロモーターおよび細胞の状況では、独特の転写プロフィールを持っていた。とくに、ケオキシフェンは、低濃度で、ＥＲ転写活性を剌激した。より高い濃度では、ケオキシフェンはＥＲの基礎的転写活性を阻害し、さらなる転写活性化の原因とならなかった（図８Ｅを参照のこと）。ＥＲ−ＴＡＦ１構築物ではケオキシフェンは、Ｃ３プロモーター転写をバックグラウンドの５倍以上に誘導することを含む部分的なアゴニスト活性を有意に示した。ケオキシフェンが関連分子タモキシフェンとは性質のことなる転写プロフィールを示す機構は明らかではない。しかしながら、これらの化合物は、一般的な転写装置とＥＲ−ＴＡＦとの異なった相互作用を促進するように、レセプター構造に微妙な変化を誘導するものと思われる。この生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）アッセイでケオキシフェンによって示された独特のプロフィールは、同様の転写プロフィールを演ずる他の化合物もまた、望ましい骨保護／子宮スペアリング活性を示すであろう事を示唆した。この目的にために、タモキシフェンから誘導した幾つかの化合物をこのアッセイシステムを用いて研究し、ＴＡＦ１活性を調節するこれらの化合物の能力に基づいて、これらの化合物を３つの別個のグループに分けることができた。第一のカテゴリーはエストロゲン活性を類似する化合物を含み、第二のグループはタモキシフェンの活性を類似し、第三のグループは、ケオキシフェンと同様のプロフィールを示す。ケオキシフェン様化合物を卵巣摘出したラットモデルでアッセイした場合、それらは、骨を保護し、子宮栄養（ｕｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ）活性を示さないと予想される。ラットは以下の方法で背面子宮摘出をほどこされる。動物はケタミン：キシラジン（ｋｅｔａｍｉｎｅ：ｘｙｌａｚｉｎｅ）で麻酔され、手術が行われる。麻酔されたラットの背中中央部を剃る。脊椎と平行に約１インチの長さで皮膚を縦に切開する。鋏の先で、筋肉層から結合組織を離して開く。肋骨郭の根元の部分、脊椎柱（ｓｐｉｎａｌｃｏｌｕｍｎ）から約１インチのところを、鋏で筋肉を小さく切る（１／４”）。小さな鉗子で、卵巣脂肪を引き出す。卵巣は、子宮角の先端に付いた、クラスター様構造物として見ることができるであろう。それらをひとまとめに保っている結合組織を切断する。止血する。体腔に脂肪を戻す。反対側で繰り返す。皮膚をまとめてクリップで留め、切開時にベタジン（ｂａｔａｄｉｎｅ）を用いて感染を予防し、クリップの除去を減らす。次の日から、注射を始める。注射は、臀部の皮下に毎日（通常は朝）行なう。ベヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）は１０％エタノールであり、注入量は３００μｌである。注射を始めてから２８日後、動物は首を脱臼させることによって麻酔下で犠牲にし、体重および子宮重量を測定する。後肢を組織学および組織形態計測のために取り除く。生体外でケオキシフェンによって示された転写のプロフィールは、骨に選択的なエストロゲン活性を示す作用を予想させる。このように、これらのＥＲ−ＴＡＦ構築物を用いて、このプロモーターおよび細胞内の状況において試験することは、骨粗鬆症の治療に有用な化合物の有効なスクリーニング法を提供する。生体内での研究では、ラットが模擬的にまたは真に卵巣摘出され、５日間回復させる。次いで、ラット（１グループ当たり４−６匹）は、ベヒクル、またはエストロゲン、ケオキシフェンもしくは試験化合物を含むベヒクルを、毎日、最長で２８日の間、皮下注射される。動物は犠牲にされ、体重を測定し、子宮の湿潤重量、全血清コレステロール、および骨のミネラル密度について評価する。末梢大腿骨骨幹端の骨のミネラル密度をホロジック（Ｈｏｌｏｇｉｃ）ミネラル密度計を用いて測定することを除いて、確立された方法が用いられる。試験動物の骨髄は、始原骨芽細胞を用いた共同培養アッセイで、破骨細胞の潜在性について評価する。骨髄は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３および副甲状腺ホルモンの存在下で、８日間、始原骨芽細胞と共に置かれ、酒石酸ホスファターゼ耐性の多核化細胞（ｔａｒｔｒａｔｅａｃｉｄｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｔｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｅｄｃｅｌｌ）（ＴＲＡＰ＋ＭＮＣ）の数を数える。模擬手術した動物のＴＲＡＰ＋ＭＮＣの数を、１００％とする。酒石酸耐性酸性ホスファターゼ（＋）の多核化細胞は、発生期の破骨細胞として、標準的な方法で数えられる。生体外でのＭＣＦ−７乳細胞の増殖への化合物の影響に付いても研究することができる。ＭＣＦ−７ヒト乳癌腫（カルシノーマ）細胞への、エストロゲン、ケオキシフェン、および試験化合物の部分的アゴニスト活性は、７日間、化合物の非存在下または存在下では化合物の濃度を上昇させて、細胞を処理することによって評価する。細胞は０日目および４日目に化合物で処理する。７日で実験を終了して、三組の穴で細胞数を評価する。このアッセイでのエストロゲン活性は、１０-10Ｍで最大になると予想され、対照の１５００％の増殖が誘導される。次いで、ケオキシフェンおよび試験化合物の生体外プロフィールを決定することができた。ＨｅｐＧ２細胞における、Ｃ３プロモーターのＥＲ、ＥＲ−ＴＡＦ１およびＥＲ−ｎｕｌｌレセプターのトランス活性化に関係する高濃度化合物の活性は、本書類に記載するような標準的方法で測定される。このようにして、与えられた濃度で骨の保護および子宮／乳房のスペアリング活性の両方を示す化合物を同定することができる。ケオキシフェンより高い有効性をもつ化合物が望ましい。“有効性”とは、所望の効果を作り出すのに必要な化合物の量を意味する。このように、有効性の高い化合物はケオキシフェンより大きい親和性でレセプターに結合するであろう。高い有効性を持つ化合物は最小の投薬量で最大の効果を生み出す。図８に示すように、高い有効性を持つ化合物は、低い有効性を持つ化合物のピークより、さらに右側にピークを持つ。使用法アゴニストおよびそれらの形は、上記のシステムで迅速に同定されうる。具体的には、実施例４に記載し、図５に示した実験は、アゴニストを同定し、次いでその活性の型を決めるのに有用である。例えば、このアッセイでは、野生型のレセプター（ＥＲ−ｗｔ）を用いると、試験化合物がアゴニストであるか、即ち、アッセイで活性を持つか、が示唆されるであろう。全機能的な状況を有する変異させたレセプター（ＥＲｍ）を用いると、アッセイでは、アゴニストの型、即ち、どの様なレベルの活性が認められるか、が示唆されるであろう。様々な試験化合物で予想される結果の範囲の例を図５に示し、実施例４で考察している。その様なアッセイを用いると、所望のアゴニスト活性、例えば、エストロゲン活性を擬態し、骨粗鬆症の治療に有効なＴＡＦ１領域のみで活性なアゴニスト活性、について容易にスクリーニングすることができる。薬剤組成物また、本発明は、薬学上許容しうる担体または希釈剤中に上記の生成物を薬剤として有効な量含む、貯蔵用、およびその後の投与用に調製した薬剤組成物をも包含する。治療に使用するために許容しうる担体または希釈剤は、薬学の分野では熟知されており、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ ”，ＭａｃｋＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ．，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、１９８５）に記載されている。保存剤、安定化剤、染料、および香味剤が、薬剤組成物中に提供されても良い。例えば、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸およびｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルは、保存剤として加えられても良い。同上１４４９。さらに、抗酸化剤および懸濁剤が用いられても良い。同上本発明の組成物は、経口投与のための、錠剤、カプセルまたはエレキシル；直腸投与のための座剤；注入投与のための無菌溶液、懸濁液；およびその類似物など、として調合し用いても良い。注射可能物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの従来の形で、注入前に液体中に溶解または懸濁するのに適した固体の形で、またはエマルジョンとして調製することができる。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、マンニトール、ラクトース、レシチン、アルブミン、グルタミン酸ナトリウム、システイン塩酸塩、およびその類似物などである。さらに、所望するならば、注射可能な薬剤組成物は、湿潤剤、ｐＨ緩衝剤、およびその類似物のような、少量の毒性のない補助物質を含んで良い。所望するならば、吸収増強調製物（例えば、リポソーム）を用いても良い。一回の投与量として必要とされる、薬学上効果的な組成物量は、投与経路、治療する動物のタイプ、考慮中の具体的な動物の身体的特徴に依存するであろう。投与量は、最適の効力に達するように調整することができるが、重量（体重）、日常の飲食物、併用している薬剤、および医療業者に認識されているであろう他の因子に依存するであろう。本発明の方法を実施するにあたって、生成物または組成物は、単独で、互いに組み合わせて、または他の治療薬もしくは診断薬と組み合わせて、用いることができる。これらの生成物は、生体内では、通常は哺乳類、望ましくはヒトで、または生体外で用いることができる。それらを生体内で用いるに当たっては、生成物または組成物は、非経口、静脈、皮下、筋肉内、結腸、直腸、鼻、または腹腔内、を含む様々な方法で、様々な投薬の形を用いて、哺乳動物に投与することができる。当業者には容易に明らかなように、投与される有用な生体内への投薬量および投与の個々の様式は、年齢、体重、および治療される哺乳類の種、用いられる個々の化合物、およびこれらの化合物を用いる具体的な使用に依存して変化するであろう。有効な投与量レベルの決定、即ち、所望する結果に到達するのに必要な投与量レベルは、当業者の範囲の内にあるであろう。典型的には、生成物のヒトへの医療的適用は、低い投薬量で開始し、所望の効果に達するまで投与量を増加させる。ヒト以外の動物を用いた研究では、生成物の適用は、より高い投与量で開始し、所望する効果にもはや到達しなくなる、または副作用が出なくなるまで、投与量を減少させる。本発明の生成物の投与量は、所望する影響および治療の指示に依存して、範囲を広くとることができる。典型的には、投与量は約１０μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重の間、望ましくは、約１００μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ体重の間であって良い。毎日を基本にした、経口投与が望ましい。他の実施態様は以下の請求の範囲の内にある。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．プロモーターからの転写を活性化することの出来る第一のＴＡＦ領域、および第二ＴＡＦ領域の機能的状況をもつがプロモーターの転写を活性化できない様に変異させた第二のＴＡＦ領域、を有するレセプターをコードする核酸を提供し、ここにおいて、核酸は第二ＴＡＦ領域のみを持つレセプターの存在下でプロモーターからの転写を示すことは出来ないが、第一ＴＡＦ領域を持つレセプターの存在下でプロモーターからの転写を示すことのできる細胞内に提供され、さらに、細胞はプロモーターを含むレポーター構築物を含み、レポーター構築物は、プロモーターが第一ＴＡＦ領域をもつレセプター存在下で活性化される時に転写される；レセプターの既知のアゴニストと細胞との接触がプロモーターからの転写を引き起こし、且つレポーター構築物の生成のレベルが増加するような条件下で、可能性のあるアゴニストと細胞とを接触させ；そして可能性のあるアゴニストのアゴニスト活性の指標としてレポーター構築物の生成物の増加レベルを測定する；ことからなる、レセプターアゴニストのアッセイ方法。２．該アゴニストがヒトのホルモンのアゴニストである、請求項１記載の方法。３．該レセプターが変異させたＴＡＦ２領域を持つ、請求項１記載の方法。４．該細胞が肝細胞である、請求項３記載の方法。５．該プロモーターがＣ３プロモーターである、請求項４記載の方法。６．該アッセイがケオキシフェン様転写プロフィールを持つケオキシフェン以外の化合物を提供する、請求項１記載の方法。７．細胞内に機能的な第一および第二のＴＡＦ領域をもつレセプターをコードする核酸を提供し、ここにおいて機能的なＴＡＦ１またはＴＡＦ２領域のみを持つレセプターは細胞内でプロモーターからの転写を引き起こさず、さらに細胞は一つのＴＡＦ領域を通してのみ作用し、両方の該ＴＡＦ領域を通しては作用しないアゴニストの存在下で活性化されるプロモーターを含むレポーター構築物を含む；レセプターの既知のアゴニストと細胞との接触がプロモーターからの転写を引き起こし、且つレポーター構築物の生成物のレベルを増加させるような条件下で、細胞を可能性のあるアゴニストと接触させ；そして可能性のあるアゴニストのアゴニスト活性の指標としてレポーター構築物の生成物の増加レベルを測定する；ことからなる、レセプターアゴニストのアッセイ方法。８．該細胞が肝細胞であり、且つ該プロモーターがＣ３プロモーターである、請求項７記載の方法。９．該アッセイがケオキシフェン様転写プロフィールをもつケオキシフェン以外の化合物を提供する、請求項７記載の方法。１０．ケオキシフェン様転写プロフィールを持つケオキシフェン以外の化学的化合物をエストロゲンに関係する病気に掛かった患者に投与することからなる、該患者を治療する方法。１１．該病気が骨粗鬆症である、請求項１０記載の方法。１２．該病気が子宮癌である、請求項１０記載の方法。１３．該病気が乳癌である、請求項１０記載の方法。１４．該治療が医薬として許容しうる量の該化合物を該患者に投与することからなる、請求項１０記載の方法。１５．該投与が経口で行われる、請求項１４記載の方法。１６．該化合物がケオキシフェンより大きい効能を持つ、請求項１０記載の方法。