JPH11508121A

JPH11508121A - 昆虫レチノイドレセプター組成物および方法

Info

Publication number: JPH11508121A
Application number: JP3507301A
Authority: JP
Inventors: ユージンオロ，アンソニー; マークエバンズ，ロナルド
Original assignee: ザソークインスティテュートフォアバイオロジカルスタディーズ
Priority date: 1990-03-22
Filing date: 1991-03-21
Publication date: 1999-07-21
Also published as: EP0522054A4; AU7668391A; US6281330B1; AU655417B2; EP0522054A1; US6265173B1; WO1991014695A1; CA2075192A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、同種の応答エレメントに結合することにより、ある種の遺伝子の転写を調節する、新規昆虫レセプターポリペプチドの発見に関する。本発明の新規レセプターは細胞がレチノイン酸にさらされたときに活性化される。本発明は、新規レセプター、発現ベクター、このような発現ベクターにより形質転換された細胞、このような発現ベクターと転写を調節するためのこのようなレセプターの活性化をモニターするための、該発現ベクターと試験ベクターとにより共形質転換された細胞、およびこのような共形質転換された細胞を用いた、化合物のレセプターを活性化し得る能力、および化合物の潜在的な殺虫剤としてのこのような活性化を妨げる能力をスクリーニングする方法を提供する。本発明は、さらに本発明の新規レセプターが属する、図示されたような、昆虫のあるいは他の動物の、レチノイドレセプターをコードするＤＮＡを同定するためのＤＮＡおよびＲＮＡのプローブを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】昆虫レチノイドレセプター組成物および方法技術分野本発明は、新規なステロイドホルモンレセプター様タンパク質とその生成法および使用法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は昆虫中に存在し、作用を受けたプロモーター部位で転写調節効果を有し、該タンパク質を有する昆虫細胞が培養されている培地中のレチノイン酸、他のレチノイドおよびビタミンＡ代謝物の存在に対して応答性を有する、タンパク質に関する。発明の背景レチノイドはレチノイン酸、レチノール（ビタミンＡ）、レチナール、酢酸レチニル、パルミチン酸レチニル、およびこれらの一連の天然および合成誘導体を含む化合物の群を包含する。これらは、共に多種多様なシステムにおいて成長と分化に大きな影響を及ぼす。初期の研究の中心は上皮細胞の成長と分化に及ぼすレチノイドの影響であったが、レチノイドの作用が、広範囲にわたることが明かにされてきている。近年の多くの研究で、ヒト前骨髄球性白血病細胞系HL60を含む、種々の培養新生細胞型に及ぼすこれらの分子の影響について調べられている。このような細胞中ではレチノイン酸が顆粒球分化の誘引物質としての効果を有するらしい。F9胚癌細胞においては、レチノイン酸が後期マウス未分化胚芽細胞の特性を有する壁内胚葉の分化を引き起こす。レチノイン酸はまた発育中の鳥類の肢で、あるいは再生中の両性類の肢で時空軸を定めるのに重要な役目を果たしているらしい。レチノイン酸は、分別スクリーニングによって遺伝子産物が単離されている、数種のｃＤＮＡの転写を誘引することが明らかにされている。このことは、レチノイン酸が、ステロイドホルモンあるいは甲状腺ホルモンが標的遺伝子に影響を及ぼす方式に類似して、レセプタータンパク質に媒介される遺伝子の発現の調節を介して、その作用を発揮するという仮説を指示している。昆虫遺伝子の転写に影響を及ぼすことが出来る化合物を同定する能力は、殺虫剤として有用な化合物を同定するのに重要な価値が有るにちがいない。このことについて重要なのは、昆虫遺伝子の転写を調節するレセプタータンパク質の同定である。レチノイン酸，ビタミンＡ，あるいはビタミンＡの代謝物の存在を調べるために、溶液、体液等をモニターするのに有用な装置は、種々の分析的な生化学の応用に有用であり得、医学上の診断にも有用であり得るかも知れない。分子クローニングの研究によって、ステロイド，レチノイド，および甲状腺ホルモンに対する哺乳類のレセプターは、すべて構造上類似しており、そしてシス作用エレメントに直接に結合することによってホルモン刺激に応答する特異的な遺伝子発現を調節し得る調節タンパク質のスーパーファミリーを包含することが実証可能となった(Evans，Science 240，889(1988)；Green and Chambon，Trend s genet．4，309(1988))。変異型レセプターとの構造上の比較ならびに機能的研究によって、これらの分子が一連の別個の機能領域を含むこと、すなわち最も顕著なものには、典型的に66-68個のアミノ酸より構成される、亜鉛フィンガーを含有する、ＤＮＡ結合ドメイン、およびリガンド結合ドメインを包含する約250 個のアミノ酸のカルボキシ末端伸長部を含むことが確認され得た（上記Evansによる）。このファミリーを特徴付けるにあたっての重要な進歩は、低緊縮ハイブリダイゼーション法によって単離された遺伝子産物の増加するリストを描写することであって、これにはホルモンレセプターの構造上の特徴が含まれている。レチノイン酸依存の転写因子は、RAR-α（レチノイン酸レセプター−α）と称され、同定されている。これに続いて２種類の他のRAR関連遺伝子が単離され、少なくとも異なる3種類のRARサブタイプ（α，β，およびγ）がマウスおよびヒトに存在することが知られている。これらのレチノイン酸レセプター(RARs)はステロイドホルモンならびに甲状腺ホルモンレセプターのスーパーファミリーと相同であり、類似のリガンド依存機構によって特異的な遺伝子発現を調節することが明らかにされている(Umesono ら、Nature 336,262(1988))。これらのRARサブタイプは発育中および成熟した生物において独特な型で発現される。最近、RXR-αと称される別のレチノイン酸依存の転写因子が、ヒト細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリー中で同定された。RXR-αは、一次アミノ酸配列において、ヒトRAR-α、および他の既知の哺乳類ステロイド／甲状腺ホルモンのレセプタースーパーファミリーのメンバーとは大いに異なっている。RXR-αは、レチノイン酸およびレチナールにさらされた哺乳類ならびに昆虫の細胞内で、および多種の合成スーパーレチノイドにさらされた哺乳類細胞内でトランス作用の転写活性化（「トランス活性化」）に影響を及ぼすために活性化される。CV-1サル腎臓細胞中におけるRXR-αによるトランス活性化の用量−応答はヒトRAR-αによるものとは大きく異なっている。参考としてここ援用されている、1990年2月9日出願の同一出願人による同時係属中の米国特許出願第07/478,071号を参照のこと。本発明の理解および実施に有用な他の情報は、同一出願人による同時係属中の 1987年10月20日出願の米国特許出願第108,471号、1988年11月30日出願の第276,5 36号、1989年3月17日出願の第325,240号、1989年6月22日出願の第370,407号、19 89年11月16日出願の438,757号に見られる。これらすべての出願は参考として援用されている。以下に、より詳しく述べるように、本発明のレセプターは、甲状腺ホルモン応答エレメントに結合することで遺伝子の転写を調節するものであって、その遺伝子のプロモーターに関してこのレセプターのこの結合に生じるような調節のために、作動可能に位置を定めて結合する。このような甲状腺ホルモン応答エレメントには、TREp，β-レチノイン酸応答エレメントならびにきわめて関連したエレメント（1989年11月16 日出願の出願第438,757号参照）、およびエストロゲン応答エレメント（1989年3 月17日出願の出願番号第325,240号参照）がある。発明の要旨我々は昆虫の細胞中において、その細胞が、レチノイン酸、レチノール、レチナール、酢酸レチニル、あるいはパルミチン酸レチニルのようなレチノイドにさらされたとき、細胞中のある種の遺伝子の転写を調節するために活性化される新規レセプターを発見した。この新規の昆虫レセプターは既知のRAR-α，β，およびγレセプターとは一次配列が大いに異なるが、RXR-αとは確実な相同性を有する。本発明のレセプターの１つXR2Cは、キイロショウジョウバエ由来であって、ショウジョウバエのultraspiracle遺伝子座に組み込まれていた。この遺伝子座は原型形成のために母系としてもおよび接合子としても必要なことが知られている。それゆえ、本発明のレセプターによるトランス活性化を妨害するあるいは変化させる化合物は殺虫性であると期待される。本発明は、新規昆虫レセプターをコードするＤＮＡを提供する。そのＤＮＡには、動物細胞、とりわけ昆虫細胞中でのレセプター発現のための発現ベクターを含有する。そして、本発明はまた、細胞がこのような活性化を導く化合物にさらされた時に、転写を調節するためのレセプターの活性化をモニターするために、このような発現ベクターと試験ベクターとにより共形質転換された細胞を提供する。ならびに、本発明はさらに、このような共形質転換された細胞の以下のような使用法も提供する：（１）トランス活性化のためにレセプターを活性化し得る化合物（例えばレチノイン酸）の存在を調べるために該細胞に接触させた液体のアッセイ；（２）このようなレセプターの活性化を導き得る化合物のスクリーニング；および（３）レセプターによるトランス活性化の拮抗剤である化合物（すなわち、その阻害化合物と通常はレセプターを活性化してトランス活性化する化合物（例えばレチノイン酸）との両方にさらされている細胞中で、レセプターによるトランス活性化を阻害し得る化合物）のスクリーニング。このようなトランス活性化の拮抗剤は昆虫にとって毒性あるいは致死性であると考えられる。本発明はさらに、RXR、とりわけ昆虫RXR（つまり、本発明のXR2Cを包含するヒトRXR-αと同じクラスのレセプターである）をコードするＤＮＡの同定のためのＤＮＡならびにＲＮＡプローブを提供する。本発明はまた、細菌中で、レセプターをコードするＤＮＡを発現することによる、本発明のレセプターの作成法を提供する。これらの細菌によって産生されたレセプターは、レセプターに結合するレセプター作用剤およびレセプター拮抗剤をアッセイするのに有用である。本発明に基づく動物細胞、とりわけ昆虫細胞は、その中でレセプターが本発明のＤＮＡより発現され、実施例でさらに十分に教示するが、レチノイン酸の存在を調べるための液体のアッセイに使用し得る。上述したように、本発明の動物細胞、とりわけ昆虫細胞は、殺虫剤としての潜在的な価値のある化合物をスクリーニングするために使用し得る。図の簡単な説明図１は、本発明に基づくレセプターポリペプチドであるXR2Cをコードする断片を包含するＤＮＡ断片のコーディング配列である。図はまたXR2Cのアミノ酸配列も示している。このアミノ酸配列の中でＤＮＡ結合ドメインの66個のアミノ酸は 104位-169位のアミノ酸である。配列が図１に示されているこのＤＮＡ断片は、p Bluescript^R phagemid SK(+)のEcoRI部位に挿入して（EcoRI突出部位がなければ）、本発明のＤＮＡ、pXR2C8を産生する断片である。図２は、XR2C（キイロショウジョウバエのultraspiracle遺伝子座の産物であるので図では"USP"と示されている）のＤＮＡ結合ドメイン("ＤＮＡ")およびリガンド結合ドメイン("LIGAND")と、ヒトRXR-α，ヒトレチノイン酸レセプターα (hRAR-α)，ヒトグルココルチコイドレセプター(hGR)の対応するドメインとのアミノ酸の同一性（すなわち”相同性”）の度合を示している（両方のドメインは 100％の同一性を有するとして）。図において、箱の外の数字は、タンパク質の一次配列中のこの２つのドメインおよびアミノ末端，カルボキシ末端とを明示する、アミノ酸の番号である。本発明の詳細な説明本発明は以下のような特徴を有する新規ポリペプチドに関する：（１）培地中に約5×10^-7Mより濃い濃度のレチノイン酸を含有する昆虫細胞の培養において、 hRXR-αによる転写の活性化により、TREpに作動可能に連結されたプロモーターからの転写速度を増す；および（２）10個のシステイン残基を有する約66個（すなわち64-68個）のアミノ酸よりなり、hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約 75％より多いアミノ酸の同一性と、hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸の同一性がある、ＤＮＡ結合ドメインを有する；ポリペプチド。従って本発明は、以下の様な断片を含む二本鎖ＤＮＡを包含する。該断片は二本鎖の連続配列からなる断片で、アミノ酸トリプレットを含有し、5'末端に翻訳開始コドンをコードするトリプレット、3'末端に翻訳終止コドンをコードするトリプレットを含有する、アミノ酸をコードするトリプレットからなる。該連続配列は次のようなポリペプチドをコードする：（１）培養液中に5×10^-7Mより濃い濃度のレチノイン酸を含有する昆虫細胞の培養において、hRXR-αによる転写活性化により、TREpに作動可能に連結されたプロモーターからの転写速度を増す；および（２）10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸よりなり、hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対する約75％より多いアミノ酸の同一性と、hGRのＤＮＡ結合ドメインに対する約60％より少ないアミノ酸の同一性がある、ＤＮＡ結合ドメインを有する；ポリペプチド。さらに本発明は、培養中の動物細胞（好ましくは昆虫細胞）中で、ＤＮＡのアミノ酸をコードするトリプレットの連続配列によりコードされ、該細胞中で、該連続配列の発現によってタンパク質を産生するために作動する、本発明に基づくＤＮＡを包含する。さらに本発明は、発現ベクターにより形質転換された培養動物細胞（好ましくは昆虫細胞）を包含する。該発現ベクターは、該細胞中で以下のものからなるＤＮＡ断片の発現によりポリペプチドを産生するように作動する；（ａ）二本鎖の連続配列からなる断片で、アミノ酸をコードするトリプレットを含有し、5'末端が翻訳開始コドンをコードするトリプレットで、該トリプレットの連続配列によりコードされるアミノ酸の配列が該ポリペプチドの一次配列であり；および（ｂ）3'末端が翻訳終止コドンをコードするトリプレットである；ＤＮＡ断片。該ポリペプチドは、（１）培地中に5×10^-7Mより濃い濃度のレチノイン酸を含有する昆虫細胞の培養において、hRXR-αによる転写の活性化により、TREpに作動可能に連結されたプロモーターからの転写速度を増す；および（２）10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸よりなり、hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約75％より多いアミノ酸の同一性と、hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸の同一性がある、ＤＮＡ結合ドメインを有する。本発明の動物細胞には、（ａ）細胞内で作動するプロモーター；（ｂ）甲状腺ホルモン応答エレメント；および（ｃ）リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片；を含有する試験ベクターにより共形質転換された細胞が含まれる。ここで、該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片は、そこから転写が始まるように該プロモーターに作動可能に連結され、そして該甲状腺ホルモン応答エレメントは、発現ベクターでの発現により産生されるタンパク質の該応答エレメントに結合されることでそこからの転写が増大するように、プロモーターに作動可能に連結されている。そして該細胞は、培地中のレチノイン酸の濃度が5×10^-7M である、該細胞培養において、該リポータータンパク質の産生速度が、培地中のレチノイン酸の濃度が10^-8Mである時の該細胞培養における該産生レベルよりも有意に増加する（すなわち測定時の実験誤差よりも増加する）。本発明は、化合物が有する、ポリペプチドの転写活性化効果を促進する能力を試験する方法を包含する。該ポリペプチドは、（１）培地中に5×10^-7Mより濃い濃度のレチノイン酸を含有する昆虫細胞の培養において、hRXR-αによる転写の活性化により、TREpに作動可能に連結されたプロモーターでの転写速度を増す；および（２）10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸よりなり、hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約75％より多いアミノ酸の同一性と、hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸の同一性がある、ＤＮＡ結合ドメインを有する；ポリペプチドであり、該方法は以下の工程を包含する：（Ａ）動物（好ましくは昆虫）細胞の第1の培養の培地中に第1の濃度まで該化合物を加える工程であって、該細胞は、（i）該ポリペプチドを産生するよう細胞中で作動可能な発現ベクター、および（ii）（ａ）細胞内で作動可能なプロモーター，（ｂ）甲状腺ホルモン応答エレメント，および（ｃ）リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片；を含む試験ベクターによって共形質転換されている。ここで該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片は、該プロモーターにそこからの転写のために作動可能に連結され、該甲状腺ホルモン応答エレメントは、発現ベクターからの発現により産生されるタンパク質の該応答エレメントに結合されることでそこからの転写が増すように、プロモーターに作動可能に連結されている。培地中のレチノイン酸の濃度が 5×10^-7Mである、該細胞培養において該リポータータンパク質の産生速度が、培地中のレチノイン酸の濃度が10^-8Mである時の該細胞培養における該産生レベルよりも有意に増大する（すなわち測定時の実験誤差よりも増加する）、工程；および（Ｂ）該細胞の対照培養における該リポータータンパク質の産生速度を有する該第1の培養に、該第1の濃度まで該化合物を加えた後のリポータータンパク質の産生速度と、第1の濃度とは有意に（つまり測定可能なほど）異なる第2の濃度まで化合物を加えた後のリポータータンパク質産生速度とを比較する工程。好ましくは本発明における、第1の培養と対照培養は同じ培養からの2つのサブ培養であり、第2 の濃度は0である。本発明は、トランス活性化に影響を及ぼす第1の化合物の能力を、レセプターによるトランス活性化を促進することが知られている第2の化合物によって活性化された本発明のレセプターを用いて試験するための方法を包含する。この方法は、少なくとも2種類の（つまり第１，第２）の動物（好ましくは昆虫）細胞の培養を通して行われる。この細胞は、本発明のレセプターが産生する発現ベクター、および試験ベクターによって共形質転換されたものであって、ここで、上述したように標識タンパク質（すなわち、リポータータンパク質）が、活性化されたレセプターが甲状腺ホルモン応答エレメントに結合することによっておこる、トランス活性化に依存した速度で産生される。この方法では、第1の化合物と第2 の化合物の濃度比は各培養で異なる。第2の化合物で活性化されたレセプターによるトランス活性に対する第1の化合物の影響は、種々の培養中でのリポータータンパク質の産生速度の比較によってアッセイされる。好ましい第2の化合物はレチノイン酸であり、そればかりか他のレチノイドあるいは本発明のレセプターによるトランス活性化を促進することが知られている化合物（例えば、すぐ前の段落で述べられた本発明の試験法で試験されたもの）が第2の化合物として使用され得る。本発明の試験方法によってトランス活性化に影響を及ぼすと同定された第1の化合物、そしてとりわけトランス活性化の促進を阻害あるいは拮抗するものは、殺虫剤として有用であると考えられる。本発明の試験法はさらに以下のように定義される：第2の化合物によるレセプターポリペプチドの転写活性化効果の促進に影響を及ぼす第1の化合物の能力を試験する方法であって、該レセプターポリペプチドは、（１）培地中に5×10^-7Mより濃い濃度のレチノイン酸を含有する昆虫細胞の培養においてhRXR -αによる転写の活性化により、TREpに作動可能に連結されたプロモーターで転写速度を増す、および（２）10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸よりなり、hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約75％より多いアミノ酸の同一性と、hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸の同一性がある、ＤＮＡ結合ドメインを有する。そして該方法は以下の工程を包含する：（Ａ）第1および第2の化合物を第1の濃度比で動物細胞の培養に加え、そして、第1 および第2の化合物を、第1の濃度比とは有意に異なる濃度比で動物細胞に加える工程であって、該動物細胞が、両培養において実質的に同じであり、そして、（ i）該レセプターポリペプチドを産生するよう細胞中で作動可能な発現ベクター；および（ii）（ａ）細胞内で作動可能なプロモーター、（ｂ）甲状腺ホルモン応答エレメント、および（ｃ）リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片；を含む試験ベクターによって共形質転換されている。ここで該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片は、該プロモーターにそこから転写が始まるように作動可能に連結され、そして、該応答エレメントは、該レセプターポリペプチドのエレメントに結合することで、そこからの転写を増すために該プロモーターに作動可能に連結されている。該細胞が、培地中のレチノイン酸の濃度が5×10^-7Mである、該細胞培養において該リポータータンパク質の産生速度が、培地中のレチノイン酸の濃度が10^-8 Mである時の該細胞培養時の該産生レベルよりも有意に増大する（すなわち測定時の実験誤差よりも増加する）状態である、工程；および（Ｂ）第1の培養でのリポータータンパク質の産生速度と第2の培養でのリポータータンパク質の産生速度とを比較する工程であって、ここで両方の培養での第2の化合物の濃度が、もし第1の化合物が該培養に存在しないのなら、細胞中の該レセプタータンパク質によるトランス活性化を促進するのに十分な濃度である、工程。好ましくは、リポータータンパク質の産生速度に影響を及ぼす方法に従って、第1，第2の化合物の個々の濃度比が比較される種々の培養は、すべて同じ培養のサブ培養で等しい第2の化合物濃度を有し、個別の濃度比がアッセイされる一揃いの培養の内の1 つで第1の化合物の濃度が0である。さらに本発明は、本発明に関連するレセプターの関連レセプターの遺伝子を同定するために用いられ得る種々のプローブを包含する。この点に関しては、以下の実施例IVで特に記載する。より詳細には本発明は、検出のためにラベルされた、および少なくとも長さが20塩基の断片を含むＤＮＡあるいはＲＮＡを包含する。該断片は、(i)図１に示されているＤＮＡの塩基1-2271からのＤＮＡ断片の同じ長さの断片、あるいは(ii)該断片の相補体と同じ配列を有する。本発明はさらに以下のようなポリペプチドを作成する方法を包含する：（１）培地中に約5×10^-7Mより濃い濃度のレチノイン酸を含有する昆虫細胞の培養において、hRXR-αによる転写の活性化により、TREpに作動可能に連結されたプロモーターからの転写速度を増す；および（２）10個のシステイン残基を有する約66 個のアミノ酸よりなり、hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約75％より多いアミノ酸の同一性と、hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸の同一性がある、ＤＮＡ結合ドメインを有する。該方法は、以下の断片を包含するＤＮＡを発現するための、細胞中で作動可能な発現ベクターで形質転換された細菌細胞の培養を包含する。5'末端に翻訳開始コドンをコードするトリプレット、3'末端に翻訳終止コドンをコードするトリプレットを含有するアミノ酸をコードするトリプレットの二本鎖の連続配列からなり、該連続配列が該ポリペプチドをコードする断片を含有するＤＮＡを発現するために、細胞内で作動可能な発現ベクターで形質転換された細菌細胞を培養する工程を包含する。本発明の方法においては、E.coliが好ましい細菌種である。本発明の方法に使用し得る多くの細菌用の発現ベクターが、何れも当業者には明かである。これらの発現ベクターには、原核生物発現ベクターpNH8A,pNH16AおよびpNH18Aがあり、これらはStratagene,La Jolla,California USAより入手可能である。本発明に関するさらに詳しい情報は、以下の実施例及び寄託の説明で提供される。実施例Ｉ hRAR-αをコードするＤＮＡのＤＮＡ結合ドメインを含むKpnI/SacI制限断片(5 03bp)(Giguereら、Nature 330，624(1987)；同一出願人により1988年11月30日に出願された米国特許出願第276,536号；ヨーロッパ特許公開第0 325 849号；これらはすべてここに参考として援用されている)は、ニックトランスレーションが行われ、EcoRI消化物、脊椎動物のステロイドホルモンレセプターのホモログを同定するためのキイロショウジョウバエのゲノムＤＮＡのサザーンブロット用のプローブとして用いられた。低緊縮ハイブリダイゼーションの条件のもとで、2 キロベース("kb")から12 kbの大きさの範囲の６種の異なったEcoRIバンドが検出された（Oroら、Nature 336，493(1988)参照）。同じプローブと低緊縮条件を用いて、キイロショウジョウバエλ-gtllのゲノムライブラリーをスクリーニングし、高緊縮下のクロスハイブリダイゼーションに基づく3つのクラスの挿入物を得た。各クラスの代表的なものをそれらの細胞遺伝子位置を同定するために幼虫唾液腺多糸性染色体とハイブリダイズした。それらの挿入物の内の一つのクラスはキイロショウジョウバエの最初の染色体の2C9に座が決定され、そして、それは標識XR2Cである。XR2Cゲノム挿入物の一部でhRAR-αをコードするＤＮＡプローブの断片に最も強くハイブリダイズするものは、pHX3.5と呼ばれ、サブクローニングされて配列分析された。pHX3.5のリーディングフレームの１つの推定アミノ酸配列は、ステロイドレセプターのＤＮＡ結合ドメインの構造特性を有していた。 pHX3.5は、キイロショウジョウバエから、BluescriptR phagemid SK(+)のEcoR I部位(Stratagene,La Jolla,California,USA)で,第3虫齢の幼虫のイマジナルディスクのｃＤＮＡライブラリーすべてをスクリーニングするためにプローブとして用いた。この処置により6種類のｃＤＮＡクローンが同定された。その最も長いものの完全なヌクレオチド配列は、pXR2C8と名付けられ、EcoRI突出末端を除いて、図１に示されている。ヌクレオチド163-1701のpXR2C8の断片によりコードされる513個のアミノ酸XR2Cの推定アミノ酸配列が共に示されている。 XR2Cに対する遺伝子はキイロショウジョウバエのultraspiracle遺伝子座に座を決定した。XR2Cレセプターの機能は通常の発育に不可欠のものであり、発育の過程の初期でのその機能の阻害は致命的であることを示している。実施例II XR2C，hRXR-α（同一出願人により1990年2月9日に出願された米国特許出願第4 78,071号；ここに参考として援用されている）、hRAR-α（ヒトレチノイン酸レセプターα）（Giguere ら、Nature 330，624(1987);同一出願人により1988年11月30日に出願された米国特許出願第276,536号；ヨーロッパ特許第0 325 849号、これらはすべてここに参考として援用されている）、およびhGR（ヒトグルココルチコイドレセプター）（Hollenbergら、Nature 318，635(1985)；同一出願人により1987年10月20日に出願された米国特許第07/108,471号；PCT国際公開第WO 88/03168号、これらはすべて参考としてここに援用されている。）のアミノ酸配列がウィスコンシン大学遺伝子コンピューターグループの"Bestfit"というプログラムによって決定された（上記Devereuxら、）。XR2Cと他のレセプターとの重要な類似部分、すなわち、66-68個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインとリガンド結合ドメインはアミノ酸同一性の百分率として図２に示されている。図２より、XR2Cが他の2つのレセプターよりもヒトRXR-αにより密接に相似していることが明らかである。 XR2CのＤＮＡ結合ドメインは、長さとしては66個のアミノ酸（XR2Cの104位-16 9位のアミノ酸）で、10個のシステインを含有する。実施例III キイロショウジョウバエSchneider系2("S2")細胞(Schneider，Embryol．Exp． Morphol．27，353(1972))は広く容易に入手可能であり、これらを35mm²の各培養皿につき2×10⁶個の割合で植えて、Schneider培地(GIBCO/Life Technologies,In c.,Grand Island,New York,USA)中に維持した。このSchneid er培地には、ペニシリン、ストレプトマイシン、および12％の熱不活性化ウシ胎児血清(Irvine Scientific，Santa Ana，California，USA)が補われている。これらの細胞をリン酸カルシウム沈澱法(Krasnowら、Cell 57，1031(1989))によって、各皿に10μgのプラスミドＤＮＡを用いて、一時的に共トランスフェクションした:4.5μg／皿のエフェクター構築物または対照構築物（XR2Cを産生しない）；0.5μg／皿のリポータープラスミド；0.5μg／皿のレファレンスプラスミド；および4.5μgの不活性プラスミドＤＮＡである。エフェクター構築物、つまりレセプター発現ベクター（4.5μg／皿）では、XR 2Cは、ショウジョウバエのアクチン5Cプロモーター（Thummelら、Gene 74，445( 1988))の制御下で、S2細胞中で構成的に発現される。このプロモーターによって pXR2C8のEcoRI部位に結合された挿入物の転写が推進される。対照のベクター（これもまた4.5μg/ml）では、pXR2C8のEcoRI部位に結合された挿入物は、エフェクター構築物における方向とは逆向きの方向（すなわち、ノンコーディングあるいはナンセンスコーディング）で挿入される。エフェクター構築物は、最初にA5 Cの単一のBamHI部位において 5'-GATCCGATATCCATATGGAATTCGGTACCA の配列のリンカーを挿入され、次に、改変されたA5Cに、XR2Cのコーディングの向きに、pXR2C8のEcoRI部位に結合された挿入物を、リンカーのEcoRI結合部位に挿入した。リポータープラスミド、つまり試験ベクター、ADH-TRE_o-C AT（各皿に付き0.5μg/ml）は、パリンドロームの甲状腺ホルモン応答エレメントTREpを含有している。このTREpは、5'-AGGTCATGACCT［(Glassら、Cell 54，31 3(1988)；ThompsonおよびEvans、Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)86，3494(1989) ］の配列を有し、バックグラウンドのpD33-ADH-CAT(Krasnowら、Cell 57，1031( 1989))の−33位（転写開始部位に対して）に挿入される。pD33-ADH-CATは、キイロショウジョウバエのアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の遠位のプロモーターを有するプラスミドである。この遺伝子は、転写のために作動できるように、細菌(E.coli)のクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（「CAT」）遺伝子、すなわち指標タンパク質であるCATの遺伝子に連結されている。ADH-TREp- CAT作成の際には、 5'-CTAGAGGTCATGACCTTCCAGTACTGGAGATC-5' の配列を有するオリゴヌクレオドを、pD33-ADH-CATの前述の-33位のXbaI部位に挿入した。pD33-ADH-CATは、TREpを持たない場合には、対照のリポーター（すなわちバックグラウンドの）プラスミドとして機能した。アクチン5Cプロモーターにより推進されるβ−ガラクトシダーゼ転写ユニットを含有する対照プラスミドもまたpGEMＤＮＡ（4.5μg／皿）とともにトランスフェクトされ（0.5μg／皿）(Promega,Madison,Wisvonsin)、これによってＤＮＡの最終濃度が各皿に付き10μgとされた。対照プラスミドは、BamHI部位に結合されたβ−ガラクトシダーゼコーディング断片をA5Cの単一のBamHI部位に挿入することによって作成した。対照プラスミドの目的は、トランスフェクシヨン効率の結果を基準化することであった。トランスフェクションから24時間後に、レチノイン酸を培養物に加えた。レチノイン酸はエタノールに溶解し、得られた溶液を培養培地に0.1%V/Vになるように加えた。培養培地中のレチノイン酸の初期濃度は10^-6M、5×10^-7Mあるいは10^- ⁸ Mである。対照試験では、レチノイン酸溶液の代わりに、培地中に0.1%v/vになるようにエタノールが加えられた。培養物を、レチノイン酸添加後に36時間暗所で維持し、それから回収した。この実験の全ての部分は、弱い光の下で行われた。細胞溶解物を遠心分離する。上澄みのβ−ガラクトシダーゼをHerbomelら、Ce ll 39，653-662(1984)の方法に従ってアッセイし、ユニット／mlのβ−ガラクトシダーゼ活性を算出する。上澄みのCAT分析物（β−ガラクトシダーゼ活性に基準化されている）を、75ユニット−時間（”ユニット”とはβガラクトシダーゼ活性のユニットを言う）インキュベートした。これは、Gormanら、Mol．Cell．B iol．2，1044(1982)に記載に従って行い、通常30分間に付き150ユニットである。 ADH-TREp-CATの代わりに対照のリポーターを用いた何れの実験においても、CA T発現のXR2C依存の活化は見られなかった。同様に、エフェクタープラスミドの代わりに対照エフェクタープラスミドを用いた実験でも活性化は実質的に観察されなかった。結果は、レチノイン酸処理細胞におけるCAT活性を未処理（すなわちエタノールのみで処理された）細胞におけるCAT活性と比較した、CAT活性の「誘導倍率」という言葉で表されている。 CATの発現レベルは、10^-6Mのレチノイン酸の初期濃度にさらされた試験細胞から、5×10^-7Mのレチノイン酸の初期濃度にさらされた試験細胞の間で増加が認められる。同様に、5×10^-7Mのレチノイン酸の初期濃度にさらされた試験細胞の発現レベルは、10^-8Mのレチノイン酸の初期濃度にさらされた試験細胞の発現レベルよりも有意に高いことが認められる。実施例４ XR2Cのホモログとしての昆虫ＤＮＡを分析するために、ある特定の種から得た同一のＤＮＡサンプルと、2種類のゲノムＤＮＡのサザーンブロットを並行して調製する。ブロットを、ＤＮＡおよびリガンド結合ドメインのコーディング部分（図１のヌクレオチド番号472-1701）を含有する約1300bpのpXR2C8の［³²P］標識のフラグメント、あるいはＤＮＡ結合ドメイン（図１のヌクレオチド番号472- 669）をコードするＤＮＡを含む約450bpの³²P標識のPstI-BamHIフラグメント（ヌクレオチド番号おおよそ419-ヌクレオチド番号おおよそ774）と高い、あるいは低い緊縮条件下でハイブリダイズする。ブロットを低緊縮のハイブリダイゼーションのためには低緊縮用緩衝液（35%ホルムアミド、IX Denhardt's溶液、5XのSSPE（1XのSSPEは、 0.15M NaCl、10mM Na₂HPO₄および1mM EDTAである）0.1%SDS、10%デキストラン硫酸、100mg/ml変性サケ精子ＤＮＡおよび106cpm³²P標識プローブ）中、42℃でハイブリダイズし、高緊縮ハイブリダイゼーションには、同一の緩衝液にホルムアミドを50%まで加えて改変した緩衝液中で行う。低緊縮のブロットを室温において2回、そして2XのSSCおよび0.1%のSDS中で50℃にて2回洗浄した。高緊縮のブロットを2XのSSC中で室温にて2回、0.5XのSSCおよび0.1%のSDS中で65℃にて2回洗浄した。寄託 1989年11月10日に、pXR2C8によって形質転換されたE．coli DH5の生存培養物を、特許手続き上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定に基づいて、American Type Culture Collection，Rockville，Maryland，USA("ATCC ")に寄託し、この寄託物の受託番号は、ATCC 68171である。 E．coli DH5(pXR2C8)のサンプルは、遅くとも本出願またはその継続出願に対する米国特許が最初に発行される日に、37 CFR 1.801以下の規定によるもの以外には制限なくATCCから公的に入手可能であろう。これ以外の場合には、ブダペスト条約およびこれに基づいて公布された規定にしたがってサンプルがATCCから入手可能になるであろう。この場合にサンプルを入手できるのは、出願すなわちその出願の優先権主張が提出されるかまたはそのような何れかの出願に対する特許が認可されるあらゆる国または国際機関の法律及び規定に基づいてサンプルを受け取る権利を法的に有する全ての人である。本発明は、ここではいくつかの独自性をもって述べられてきたが、当業者は本発明の範囲内でここに述べられたことの変更もしくは改変がおこなわれるものと認識する。これらの変更および改変はまた、本発明の明細書および請求の範囲内であると意図される。

【手続補正書】特許法第１８４条の８【提出日】１９９２年４月２４日【補正内容】請求の範囲１．ポリペプチドをコードする実質的に純粋なＤＮＡ配列であって、該ポリペプチドが、10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有し、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して75％より多いアミノ酸同一性と、（ｂ）hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性と、および（ｃ）hRARαのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性、とを有することを特徴とする、ＤＮＡ配列。２．請求項１に記載のＤＮＡであって、該ＤＮＡによってコードされる前記ポリペプチドが、図１に示されている104位-169位のアミノ酸と実質的におなじ配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含有する、ＤＮＡ。３．請求項２に記載のＤＮＡであって、該ＤＮＡによってコードされる前記ポリペプチドが、図１に示されている1位-513位のアミノ酸と実質的に同じ配列を含有する、ＤＮＡ。４．前記ＤＮＡが、図１に示されている163位-1704位のヌクレオチドと実質的に同じヌクレオチド配列の断片を含有する、請求項３に記載のＤＮＡ。５．pXR2C8である、請求項４に記載のＤＮＡ。６．前記ＤＮＡが、培養昆虫細胞中で作動する発現ベクター中に含まれており、該細胞中で該ＤＮＡの発現により該ポリペプチドを産生する、請求項１から４の何れかに記載のＤＮＡ。７．前記ＤＮＡの転写が、キイロショウジョウバエのアクチン5Cプロモーターにより制御される、請求項６に記載のＤＮＡ８．請求項６あるいは７に記載の発現ベクターによって形質転換された昆虫細胞。９．キイロショウジョウバエSchneider系2細胞である、請求項８に記載の細胞。１０．前記細胞が、リポーターベクターによってさらに形質転換された、請求項８あるいは９に記載の細胞であって、該リポーターベクターが、（ａ）該細胞中で作動可能なプロモーター；（ｂ）ホルモン応答エレメント；および（ｃ）リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片；を含有し、該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片が、該ＤＮＡ断片の転写のために該プロモーターに作動可能に連結されていて、さらに、該ホルモン応答エレメントが、該プロモーターに、その活性化のために作動可能に連結されている、細胞。１１．前記リポーター遺伝子の転写を行う、前記プロモーターが、キイロショウジョウバエアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の遠位プロモーターであり、前記ホルモン応答エレメントが、TREpまたはβ-RAREから選択され、さらに、前記リポータータンパク質が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである、請求項１０に記載の細胞。１２．前記リポーターベクターが、プラスミドADH-TREp-CATである、請求項１１に記載の細胞。１３．レセプターポリペプチドの転写活性化効果を促進する化合物の能力を試験する方法であって、該方法が、レセプターポリペプチドおよびリポーターベクターを含有する細胞を該化合物に接触させて、リポータータンパク質の有無を調べるアッセイを行うことを包含し、該レセプターポリペプチドが、10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有することを特徴とし、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約75％より多いアミノ酸同一性と、（ｂ）hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性と、および（ｃ）hRARαのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性とを有し、さらに、該リポーターベクターが、（ａ）該細胞中で作動可能なプロモーター；（ｂ）ホルモン応答エレメント；および（ｃ）リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片；を含有し、該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片が、該ＤＮＡ断片の転写のために該プロモーターに作動可能に連結されており、さらに、該ホルモン応答エレメントが、該プロモーターに、その活性化のために連結されている、方法。１４．前記レセプターポリペプチドが、該ポリペプチドを産生するために、前記細胞中で作動し得る発現ベクターによって産生される、請求項１３に記載の方法。１５．使用される前記細胞が、キイロショウジョウバエSchneider系2細胞であって、該細胞が、（Ｉ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列であって、該細胞中で該ＤＮＡの発現により該ポリペプチドを産生するために、培養昆虫細胞中で作動し得る発現ベクター中に含有されていて、該ポリペプチドが、10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有し、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約75％より多いアミノ酸同一性と、（ｂ）hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性と、および（ｃ）hRARαのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性、とを有することを特徴とする、ＤＮＡ配列；および（II）ADH-TREp-CAT；によって共形質転換された、方法。１６．検出のために標識され、そして少なくとも20塩基の長さの断片を包含するＤＮＡあるいはＲＮＡであって、（ｉ）図1に示されているＤＮＡの塩基番号1-2271（1,2271を含む）からの断片と同じ長さの断片、あるいは（ｉｉ）該断片の相補体と、実質的に同じ配列を有する、ＤＮＡあるいはＲＮＡ。１７．レセプターポリペプチドを産生する方法であって、該レセプターポリペプチドが、10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有し、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約75％より多いアミノ酸同一性と、（ｂ）hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性と、および（ｃ）hRARαのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性、とを有することを特徴とし、該方法が、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現するために、細胞中で作動し得る発現ベクターで形質転換された細胞を培養することを包含する、方法。１８．前記ＤＮＡによってコードされる前記タンパク質が、図1に示されている104位-169位のアミノ酸配列と実質的に同じ配列であるＤＮＡ結合ドメインを有する、請求項１７に記載の方法。１９．前記ＤＮＡによってコードされる前記タンパク質が、図1に示されている1位-513位のアミノ酸配列と実質的に同じ配列を有する、請求項１８に記載の方法。２０．前記タンパク質が発現されるＤＮＡ配列が、図1に示されている163位-1 704位のヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有する断片を含有する、請求項２０に記載の方法。【手続補正書】【提出日】１９９８年３月２０日【補正内容】請求の範囲１．ポリペプチドをコードする実質的に純粋なＤＮＡ配列であって、該ポリペプチドが、10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有し、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して75％より多いアミノ酸同一性と、（ｂ）hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性と、および（ｃ）hRARαのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性、とを有することを特徴とする、ＤＮＡ配列。２．請求項１に記載のＤＮＡであって、該ＤＮＡによってコードされる前記ポリペプチドが、図１に示されている104位-169位のアミノ酸と実質的におなじ配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含有する、ＤＮＡ。３．請求項２に記載のＤＮＡであって、該ＤＮＡによってコードされる前記ポリペプチドが、図１に示されている1位-513位のアミノ酸と実質的に同じ配列を含有する、ＤＮＡ。４．前記ＤＮＡが、図１に示されている163位-1704位のヌクレオチドと実質的に同じヌクレオチド配列の断片を含有する、請求項３に記載のＤＮＡ。５．pXR2C8である、請求項４に記載のＤＮＡ。６．前記ＤＮＡが、培養昆虫細胞中で作動する発現ベクター中に含まれており、該細胞中で該ＤＮＡの発現により該ポリペプチドを産生する、請求項１から４の何れかに記載のＤＮＡ。７．前記ＤＮＡの転写が、キイロショウジョウバエのアクチン5Cプロモーターにより制御される、請求項６に記載のＤＮＡ８．請求項６あるいは７に記載の発現ベクターによって形質転換された昆虫細胞。９．キイロショウジョウバエSchneider系2細胞である、請求項８に記載の細胞。１０．前記細胞が、リポーターベクターによってさらに形質転換された、請求項８あるいは９に記載の細胞であって、該リポーターベクターが、（ａ）該細胞中で作動可能なプロモーター；（ｂ）ホルモン応答エレメント；および（ｃ）リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片；を含有し、該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片が、該ＤＮＡ断片の転写のために該プロモーターに作動可能に連結されていて、さらに、該ホルモン応答エレメントが、該プロモーターに、その活性化のために作動可能に連結されている、細胞。１１．前記リポーター遺伝子の転写を行う、前記プロモーターが、キイロショウジョウバエアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の遠位プロモーターであり、前記ホルモン応答エレメントが、TREpまたはβ-RAREから選択され、さらに、前記リポータータンパク質が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである、請求項１０に記載の細胞。１２．前記リポーターベクターが、プラスミドADH-TREp-CATである、請求項１１に記載の細胞。１３．レセプターポリペプチドの転写活性化効果を促進する化合物の能力を試験する方法であって、該方法が、レセプターポリペプチドおよびリポーターベクターを含有する細胞を該化合物に接触させて、リポータータンパク質の有無を調べるアッセイを行うことを包含し、該レセプターポリペプチドが、10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有することを特徴とし、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約75％より多いアミノ酸同一性と、（ｂ）hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性と、および（ｃ）hRARαのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性とを有し、さらに、該リポーターベクターが、（ａ）該細胞中で作動可能なプロモーター；（ｂ）ホルモン応答エレメント；および（ｃ）リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片；を含有し、該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片が、該ＤＮＡ断片の転写のために該プロモーターに作動可能に連結されており、さらに、該ホルモン応答エレメントが、該プロモーターに、その活性化のために連結されている、方法。１４．前記レセプターポリペプチドが、該ポリペプチドを産生するために、前記細胞中で作動し得る発現ベクターによって産生される、請求項１３に記載の方法。１５．使用される前記細胞が、キイロショウジョウバエSchneider系2細胞であって、該細胞が、（Ｉ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列であって、該細胞中で該ＤＮＡの発現により該ポリペプチドを産生するために、培養昆虫細胞中で作動し得る発現ベクター中に含有されていて、該ポリペプチドが、10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有し、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約75％より多いアミノ酸同一性と、（ｂ）hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性と、および（ｃ）hRARαのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性、とを有することを特徴とする、ＤＮＡ配列；および（II）ADH-TREp-CAT；によって共形質転換された、方法。１６．検出のために標識され、そして少なくとも20塩基の長さの断片を包含するＤＮＡあるいはＲＮＡであって、（ｉ）図1に示されているＤＮＡの塩基番号1-2271（1,2271を含む）からの断片と同じ長さの断片、あるいは（ｉｉ）該断片の相補体と、実質的に同じ配列を有する、ＤＮＡあるいはＲＮＡ。１７．レセプターポリペプチドを産生する方法であって、該レセプターポリペプチドが、10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有し、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約75％より多いアミノ酸同一性と、（ｂ）hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性と、および（ｃ）hRARαのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性、とを有することを特徴とし、該方法が、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現するために、細胞中で作動し得る発現ベクターで形質転換された細胞を培養することを包含する、方法。１８．前記ＤＮＡによってコードされる前記タンパク質が、図1に示されている104位-169位のアミノ酸配列と実質的に同じ配列であるＤＮＡ結合ドメインを有する、請求項１７に記載の方法。１９．前記ＤＮＡによってコードされる前記タンパク質が、図1に示されている1位-513位のアミノ酸配列と実質的に同じ配列を有する、請求項１８に記載の方法。２０．前記タンパク質が発現されるＤＮＡ配列が、図1に示されている163位-1 704位のヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有する断片を含有する、請求項２０に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims

【特許請求の範囲】１．ポリペプチドをコードする実質的に純粋なＤＮＡ配列であって、該ポリペプチドが、（１）レチノイン酸の存在に対して応答して、単数または複数の関連遺伝子の転写を制御すること；および（２）10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有し、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して75％より多いアミノ酸同一性と、および（ｂ）hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性とを有すること；を特徴とする、ＤＮＡ配列。２．請求項１に記載のＤＮＡであって、該ＤＮＡによってコードされる前記ポリペプチドが、図１に示されている104位-169位のアミノ酸と実質的におなじ配列を有するＤＮＡ結合ドメインを含有する、ＤＮＡ。３．請求項２に記載のＤＮＡであって、該ＤＮＡによってコードされる前記ポリペプチドが、図１に示されている１位-513位のアミノ酸と実質的に同じ配列を含有する、ＤＮＡ。４．前記ＤＮＡが、図１に示されている163位-1704位のヌクレオチドと実質的に同じヌクレオチド配列の断片を含有する、請求項３に記載のＤＮＡ。５．pXR2C8である、請求項４に記載のＤＮＡ。６．前記ＤＮＡが、培養昆虫細胞中で作動する発現ベクター中に含まれており、該細胞中で該ＤＮＡの発現により該ポリペプチドを産生する、請求項１から４の何れかに記載のＤＮＡ。７．前記ＤＮＡの転写が、キイロショウジョウバエのアクチン5Cプロモーターにより制御される、請求項６に記載のＤＮＡ８．請求項６あるいは７に記載の発現ベクターによって形質転換された昆虫細胞。９．キイロショウジョウバエSchneider系2細胞である、請求項８に記載の細胞。１０．前記細胞が、リポーターベクターによってさらに形質転換された、請求項８あるいは９に記載の細胞であって、該リポーターベクターが、（ａ）該細胞中で作動可能なプロモーター；（ｂ）ホルモン応答エレメント；および（ｃ）リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片；を含有し、該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片が、該ＤＮＡ断片の転写のために該プロモーターに作動可能に連結されていて、さらに、該ホルモン応答エレメントが、該プロモーターに、その活性化のために作動可能に連結されている、細胞。１１．前記リポーター遺伝子の転写を行う、前記プロモーターが、キイロショウジョウバエアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子の遠位プロモーターであり、前記ホルモン応答エレメントが、TREpまたはβ-RAREから選択され、さらに、前記リポータータンパク質が、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである、請求項１０に記載の細胞。１２．前記リポーターベクターが、プラスミドADH-TREp-CATである、請求項１１に記載の細胞。１３．レセプターポリペプチドの転写活性化効果を促進する化合物の能力を試験する方法であって、該方法が、レセプターポリペプチドおよびリポーターベクターを含有する細胞を該化合物に接触させて、リポータータンパク質の有無を調べるアッセイを行うことを包含し、該レセプターポリペプチドが、（１）レチノイン酸の存在に対して応答して、単数または複数の関連遺伝子の転写を制御すること；および（２）10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有することを特徴とし、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約75％より多いアミノ酸同一性と、および（ｂ）hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性とを有し、さらに、該リポーターベクターが、（ａ）該細胞中で作動可能なプロモーター；（ｂ）ホルモン応答エレメント；および（ｃ）リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片；を含有し、該リポータータンパク質をコードするＤＮＡ断片が、該ＤＮＡ断片の転写のために該プロモーターに作動可能に連結されており、さらに、該ホルモン応答エレメントが、該プロモーターに、その活性化のために連結されている、方法。１４．前記レセプターポリペプチドが、該ポリペプチドを産生するために、前記細胞中で作動し得る発現ベクターによって産生される、請求項１３に記載の方法。１５．使用される前記細胞が、キイロショウジョウバエSchneider系2細胞であって、該細胞が、（Ｉ）ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列であって、該細胞中で該ＤＮＡの発現により該ポリペプチドを産生するために、培養昆虫細胞中で作動し得る発現ベクター中に含有されていて、該ポリペプチドが、（１）レチノイン酸の存在に対して応答して、単数または複数の関連遺伝子の転写を制御すること；および（２）10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有し、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約75％より多いアミノ酸同一性と、および（ｂ）hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性とを有することを特徴とする、ＤＮＡ配列；および（II）ADH-TREp-CAT；によって共形質転換された、方法。１６．検出のために標識され、そして少なくとも20塩基の長さの断片を包含するＤＮＡあるいはＲＮＡであって、（ｉ）図1に示されているＤＮＡの塩基番号1-2271（1,2271を含む）からの断片と同じ長さの断片、あるいは（ｉｉ）該断片の相補体と、実質的に同じ配列を有する、ＤＮＡあるいはＲＮＡ。１７．レセプターポリペプチドを産生する方法であって、該レセプターポリペプチドが、（１）レチノイン酸の存在に対して応答し、単数または複数の関連遺伝子の転写を制御すること；および（２）10個のシステイン残基を有する約66個のアミノ酸のＤＮＡ結合ドメインを有し、該ＤＮＡ結合ドメインが、（ａ）hRXR-αのＤＮＡ結合ドメインに対して約75％より多いアミノ酸同一性と、および（ｂ）hGRのＤＮＡ結合ドメインに対して約60％より少ないアミノ酸同一性を有すること；を特徴とし、該方法が、該ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現するために、細胞中で作動し得る発現ベクターで形質転換された細胞を培養することを包含する、方法。１８．前記ＤＮＡによってコードされる前記タンパク質が、図1に示されている104位-169位のアミノ酸配列と実質的に同じ配列であるＤＮＡ結合ドメインを有する、請求項１７に記載の方法。１９．前記ＤＮＡによってコードされる前記タンパク質が、図1に示されている1位-513位のアミノ酸配列と実質的に同じ配列を有する、請求項１８に記載の方法。２０．前記タンパク質が発現されるＤＮＡ配列が、図1に示されている163位-1 704位のヌクレオチド配列と実質的に同じヌクレオチド配列を有する断片を含有する、請求項２０に記載の方法。