JPH06508519A - 実質的に純粋なレセプタ様のＴＧＦ−β１結合分子およびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 実質的に純粋なレセプタ様のＴＧＦ−βｌ結合分子およびその使用 関連出願 この出願は、１９９１年６月１８日に出願されたアメリカ特許出願シリアル番号 ７１７，３１６の一部継続出願である。

発明の分野 二の発明はタンパク質生化学に関する。より具体的には、それは、トランスフォ ーミング成長因子βｌ　（以下、ｒＴＧＦ−βＩＪ）として知られる物質に結合 する分子に関する。また、この発明は、その分子の核酸配列コーディングとその 使用にも関する。

背景と従来技術 ある科の分子はｒＴＧＦ−βＪと呼ばれる。これらは、生体外と生体内の両方で の細胞の成長および分化に多機能的影響を持つ２５ｋｄの二量体タンパク質であ る。ペプチド成長因子およびそのレセプタｌ　（スポーン他、イーディーニス、 ｐｐ４１９〜４７２：スプリンガーパーレク、ヘルリン、１９９０）のロパーツ 他（Ｒｏｂｅｒｔｓ　ｅｔａｌ、ｉｎ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃ ｔｏｒｓ　Ａｎｄ　Ｔｈｅｉｒ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１（Ｓｐｏｒｎ　ｅｔ　ａ 、、ｅｄｓ、、ｐｐ　４１９−４７２；　Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。

Ｂｅｒｌｉｎ、　１９９０）　）　；モージズ他、セル６３：２４５〜２４７　 （１９９０）　（Ｍｏｓｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｃｅ１ｌ　６３：　２４５−２４ ７（１９９０））　；マサク、アン・セル・パイオル、６：５９７〜６　４　１ 　（１９９０）　（Ｍａｓｓａｑｕｅ、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、ｃｅｌｌ、Ｂｉｏｌ。

５：　５９７−６４１　（１９９０））を参照。その科は、少なくとも３つの、 ［ａｌ、β２およびβ３」として特定された、異なる、構造的に関連性のある構 成種を含む。骨形慾形成タンパク質、ミューラ阻害物質、アクチビン（ａｃｔｉ ｖｉｎｓ）、インヒヒン（１ｎｈｉｂｉｎｓ）等を含む他の多くのタンパク質は 関連性かもっと薄い。

元来、ＴＧＦ−βタンパク質料は、正常なラットの腎細胞の足場非依存性成長の 増進に関与するとされていたか、そのタンパク質は、造血細胞、リンパ球、上皮 および内皮細胞を含む種々の細胞型に対する強い成長阻害因子としても認識され ている（オータ他、ネイチャー３２９５３９〜５４１　（１９８７）；ケーり他 、ジェイ・イミュノル１３７　：　３８５５〜３８６０　（１９８６）；モージ ズ他、キャンサーセルズ３（フエラミスコ他、イーディ、コールド・スプリング ・ハーバ−、ニューヨーク、１９８５）；ページ６５〜７１．ベイアート他、ハ イオケム・バイオフィズ・レス・コミュン１３８：４７６〜４８２　（１９８６ ）；フラーターシュレーダー他、ノ）イオケム・ハイオフィズ・レス・コミュン １３７：２９５〜３０２　（１９８６）；ハイマーク他、サイエンス２３３：１ ０７８〜］　０８０　（１９８６）　（Ｏｈｔａｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ ３２９：　５３９−５４１　（１９８７）：　Ｋｅｈｒｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ　１３７：３８５５−３８６０　（１９８６）：　Ｍｏ５ｅｓ　 ｅｔ　ａｌ、、　ｉｎ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｃｅ１ｌｓ　３（Ｆｅｒａｍｉｓｃｏ　 ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄ：　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｆ（ａｒｂｏｒ、　Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋ。

１９８５１　ｐｇ、６５−７１：　Ｂａ１ｒｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅ ｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ　１３８：　４７６−４８２　（１９８６）；　Ｆｒａ ｔｅｒ−３ｃｈｒｏｅｄｅｒｅｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙ ｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ、　１３７：　２９５−３０２（１９８６）、Ｈ ｅｉｍａｒｋ　ｅｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２３３：　１０７８−１０８ ０（１９８６）））。その分子は細胞外マトリックスタンパク質の蓄積に劇的な 効果を持ち（上記マサク）、糸球体腎炎病原論（ホーダ他、ネイチャー３４６・ ３７１〜３７４（１９９０）　（Ｂｏｒｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ 　３４６：　３７１−３７４（＋９９０’））　）　：肝硬変（カスチラ他、エ フ・インク・ソエイ・メト３２４　：　９３：３−９４０　（１９９０）（Ｃａ ｓｔｉｌｌａｅｔａｌ、、　Ｎ、　Ｅｎｇ、　、Ｊ、　Ｍｅｄ、　３２４：　９ ３３−９４０　（１９９０））　）　：および肺繊維症（カーリル他、ＴＧＦ− β１の臨床利用（ホック（也、イーディ、チハ・ファウンデーション・シンポジ ウム１５７、ソヨン・ウィリー・アンド・サンプ、］９９１、ページ１９４〜２ １１　）　（Ｋｈａｌｉｌ　ｅｔ　ａｌ、、　１ｎＣ１ｉｎｉｃａｌ　Ａｐｐｌ ｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＧＦ−β１　（Ｂｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄ。

Ｃ１ｂａ　Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　１５７．　Ｊｏｈｎ　 Ｗｉｌｌｙ　ＦＩ　５ｏｎｓ。

１９９１、　ｐｇ、１９４−２１１）　’）に結び付けられてきた。

ＴＧＦ−β科は、いくつかのレベルで他のタンパク質と相互作用する。これらの １つは、細胞表面レセプタを介する結合の仲介である。技術分野では、タイプ■ 、ＩＩおよびＩＩＩと呼はれる、ＴＧＦ−βに対する３つのはっきりした高親和 性レセプタを認識している。これらの最初の２つは、夫々５３および７０〜８５ ｋｄの分子質量を持ち、３番目のものは、そのプロテオグリカン様の構造のため ［ベータグリカンＪと名付けられ、２００〜４００ｋｄの分子質量によって更に 特徴つけられる。成長因子βの形質転換、化学、生物学および治療学（ピース池 、イーディニス、アン・エフ・ワイ・アカド・サイ５９３．１９９０）、ベーン ５９〜７２のマサク他；ＴＧＦ−βの臨床利用（ポック他、イーディ、チハ・フ ァウンデーション・シンポジウム１５７、ジョン・ウィリー・アント・サンプ、 １９９１、ページ２９〜５０）のセカリニ他（Ｍａｓｓａｑｕｅ　ｅｔ　ａｌ、 、　ｉｎ　ＴｒａｎｓｆｏｒｍｉＢＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ−βｓ：　Ｃｈ ｅｍｉｓｔｒｙ、　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ＜Ｐｉ ｅｚ　ｅｔ　ａｌ、、　ｅｄｓ、、　Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ 、　５９３．１９９０）。

ｐｇ、　５９−７２；　Ｓｅｇａｒｉｎｉ　ｅｔ　ａｔ、、　ｉｎ　Ｃ１１ｎｉ ｃａｌ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆ　ＴＧＦ−βＩ　（Ｂｏｃｋ　ｅｔ　ａｌ 、、ｅｄ、Ｃ１ｂａ　ＦｏｕｎｄａｔｉｏｎＳｙｍｐｏｓｉｕｍ　１５７．　Ｊ ｏｈｎ　Ｗｉｌｌｙ　＆　５ｏｎｓ、１９９１．　ｐｇ、２９−５０）　）。

・′＼−タクリカンは膜プロテオグリカンで、未知の機能的重要性を持つ１００ 〜Ｉ　４０ｋｄのコアタンパク質を持ち、タイプｌおよびＩＩレセプタはＴＧＦ −β細胞効果の導入に関与するものと考えられる。セガリニ他、シェイ・ハイオ ル・ケム２６３・８３６６〜８３７０（１９８８）：チェイフエツ他、ジェイ・ パイオル・ケム２６３：　１６８８４〜１６９９１　（１９８８）（Ｓｅｇａｒ ｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：　８３６ ６−８３７０（１９８８）：　Ｃｈｅｉｆｅｔｚ　ｅｔ　ａｔ、、　Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：　１６８８４−１６９９１　（＋９８８））　； 上記マサク他。タイプＩレセプタのみを発現し、ＴＧＦ−β１に阻害される細胞 系もある。こ、Ｔ１らは、造血創始細胞系（上記オータ他）および偏平カシ細胞 系（イチョ池、エクスプ・セル・レス１８７・２６３〜２６９　（］　９９０） 　（ｆｃｈｉｙｏｅｔａｌ、、　ＥＸＩＴ。

Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、　１８７：　２６３−２６９　（１９９０））　）を含む。

ミンク上皮細胞の変異細胞系がタイプＩおよび／またはタイプ■ルセ７゛夕を失 うか、その変則的発現を持つことが示されている（′＋イト他、ノエイ・パイオ ル・ケム２６４・２２７２〜２２７８　（１９８９）；レイホー他、ンエイ・ハ イオル・ケム２６５：１８５１８〜１８５２４（１９９０）　（Ｂｏｙｄ　ｅｔ 　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４：　２２７２−２２７８　 （１９８８）：　Ｌａ１ｈｏ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２６ ５．１８５１８−１８５２４　（１９９０））。

６０ｋｄ、８５〜３２０ｋｄ、および４００ｋｄ（７）分子質量を持っＴＧＦ− βに対する更に別の結合分子が、チェイフエツ他、ジェイ・パイオル・ケム２６ ３：１７２２５〜＋７２２８　（１９８８）；マツケイ他、ジエイ・パイオル・ ケム２６５　：　９３５１〜９３５６（１９９０）ニオグレーディ他、ジエイ・ パイオル・ケム２６６　：　８５８３〜８５８９　（１９９１）　（Ｃｈｅｉｆ ｅｔｚｅｔ　ａｌ、、　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３：　１７２２ ５−１７２２８　（１９８８）：Ｍａｃｋａｙ　ｅｔ　ａＬ、、　Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６５：　９３５１−９３５６　（１９９０）：０°Ｇｒａ ｄｙ　ｅｔ　ａｌ、、　、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６６：　８５８３ −８５８９　（１９９１））に報告されたように、脳下垂体腫瘍細胞系、ラット 糸球体、ウシ肝細胞夫々について報告されている。

他のレベルて、ＴＧＦ−β、特にＴＧＦ−βｌの前駆体は、潜在性ＴＧＦ結合タ ンパク質っまりｒＬＴＢＰ」として知られるタンパク質分子と相互作用する。そ の相互作用は、細胞から分泌される高分子量の不活性複合体を生成する。これは 、潜在性ＴＧＦ−βｌ複合体と呼はれることもある。ミャゾノ他、ジエイ・パイ オル・ケム２６３：６４０７〜６４１５　（１９８８）；パーチャー他、ハイオ ケム・バイオフィズ・レス・コミュン１３６゜３０〜３７　（１９８４）；ウェ イクツイールド他、ソエイ・セル・パイオル１０５　：　９６５〜９７５　（１ ９８７）（Ｍｉｙａｚｏｎｏ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、 　２６３：　６４０７−６４１６（１９８８１Ｐｉｒｃｈｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｍｕｎ１３６：　３ ０−３７　（１９８４）＋　Ｗａｋｅｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｅ １ｌ　Ｂｉｏｌ。

１０５：　９６５−９７５　（１９８７））を参照。不活性ないし潜在性の複合 体は、ＴＧＦ−ａｌの非共有結合会合、ＴＧＦ−β１前駆体のＮ末端ペプチドの 二量体のジスルフィド結合複合体、そして第３の成分としてＬＴＢＰを含む。こ の第３の成分は、１２５〜１９０ｋｄの分子質量を持つ分子として生じ得る。実 験は、結合タンパク質かＴＧＦ−β１を不活性化しないことを示している。

上記分子は、実際ＴＧＦ−βＩ前駆体に結合するので「結合タンパク質」と呼は れることかある。これらの分子と発明の分子との基本的相違は、従来の分子か「 合成」バインダーと呼はれ得るのに対し、この発明の分子は「エフェクター１バ インダーを含むと言う方かより適切である点にある。合成バインダーは、細胞中 のＴＧＦ−ａｌか解放されて活動するように、その「パッケージングＪに関与す る。従来の分子に結合すると、ＴＧＦは本質的に不活性になる。これに対して、 この発明の分子を含むタンパク質は、ＴＧＦ−β１かこれらに直接結合して応答 を行うので、「エフェクター」と見なすことかできる。この特徴を本出願との関 連で念頭に置くへきである。

この発明の目的は、ＳＤＳポリアクリルアミドケル電気泳動て１６０ｋｄ、７０ 〜８０ｋｄおよび３５〜４０ｋｄと判定される分子質量によって特徴づけられる 分子を含むこれらの実質的に純粋なレセプタ様のＴＧＦ−βｌ結合分子と、種々 のプロセスでのその使用を記載することにある。その範囲は、以下から理解され るように、還元および非還元条件下での種の作用によるものである。また、それ は、単一のペプチドに基づく単量体、二量体または三量体である分子の構造の性 質によるものでもある。

二の構造の意味合は以下で述べる。

この発明の上記および他の目的は、以下の開示から理解されよう。

図面の簡単な説明 図１は、発明の実質的に純粋なレセプタ様のトランスフォーミング成長因子βｌ 結合タンパク質を分離するために使用される精製プロトコールの概略を示す。

図２は、発明の結合タンパク質に対する代表的なＦＰＬＣ処理のタンパク質プロ フィールを示す。

図３は、”’１−ＴＧＦ−βｌとの親和架橋後の、この発明に従って調製された 種々の画分のＳＤＳゲル処理を示す。

図４は、ＦＰＬＣモノＱクロマトグラフィ後の画分のｒケル内」リガント結合を 示す。

図５は、ＴＧＦ−ａｌを用いたセファロースクロマトグラフィ後に得られた画分 のＳＤＳゲル電気泳動分析を示す。

図６は、”’Ｉ−ＴＧＦ−β１を用いたアフィニティラへリング後の、ＴＧＦ− β１セファロースクロマトグラフィのｐＨ３，５溶離画分の分析を示す。

図７は、「ケル内］　リガンド結合を用いた別のＴＧＦ−βＩセファロースクロ マトグラフィの分析を示す。

図８は、アセトン沈澱凝縮後の、ｐＨ３，５溶離画分のクロマトグラムのタンパ ク質プロフィールである。

図９は、スペロース１２クロマトグラフィから得られる種々の両分のＳＤＳゲル 分析である。

図１０は、１２５１−ＴＧＦ−βｌ親和架橋実験を用いた、分析の純粋な４０ｋ ｄ成分の分析を示す。

図１１は、４０ｋｄのレセプタ様の結合タンパク質のケル内結合を示す。

レンストランド他、ジエイ・パイオル・ケム２６２・２９２９〜２９３２　（１ ９８７）　（Ｒｏｅｎｎｓｔｒａｎｄｅｔａｌ、。

Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６２：　２９２９−２９３２　（１９８７） ）に当初記載された、ＰＤＧＦレセプタを精製するためのプロトコール（二従っ た。簡単に記すと、膜調製用の出発原料として）質をトリトンＸ−１００Ｒ中で 可溶化し、コムギ胚芽凝集素セファロースとタンパク質高速液体りロマトグラフ ィモノＱカラム上でクロマトグラフィ分析を行った。先ずタンパク質をコムギ胚 芽凝集素カラム上で精製し、濃度を漸増させたＮａＣｌを用いて精製物をＦＰＬ ＣモノＱカラムに加えた。２６の画分をカラムから取り出した。

このうち画分１６〜２０をプールしてＰＤＧＦレセプタの精製に用い、他の画分 は一２０°Ｃて保存して本発明のレセプタ様の結合タンパク質を精製するための 出発原料として使用した。図２は、各両分に使用したＮａＣ１の濃度を点線で示 している。画分１６〜２０をＰＤＧＦの精製に使用した。

例　２ 例１に従って得られた画分からレセプタ様の結合タンパク質を取り出すため、Ｔ ＧＦ−βｌセファローズカラムを調製した。ヒｌ−Ｔ　Ｇ　Ｆ−βＩｃＤＮＡか 移入されたＣＦ（○細胞の調整媒体から精製された組換えＴＧＦ−βｌを用いて 行った。ＩｍｇのＴＧＦ−β１を０．５ｇの臭化シアン活性化セファロース４Ｂ と結合させて、ＴＧＦ−β１　／　ｍ　ｇのゲルを約０．６７ｍｇ生成した。

カラムの調製後、例１から得た画分１〜１５および２１〜２６を解凍し、プール し、結合緩衝液（ｏ、２％トリトンＸ−１００′″、１２５ｍＭのＮａＣ１，５ ｍＭのＫＣＩ、５ｍＭのＭ　ｇ　Ｓ　Ｏ４，１，２ｍＭのＣａ　Ｃｌ　２．２０ ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，４）で透析した。２５ｍ１の量の透析サンプルを２ ．５．ｍｌの前もって調製したセファロースヒーズと混合し、その懸濁液を一晩 軽く振とうさせなから４°Ｃで保温した。そして、ビーズをカラムに収集し、２ ５ｍ１の結合緩衝液と、その後５００ｍＭのＮａＣ１を含む２５ｍ１の結合緩衝 液で洗った。結合した分子を、０．２９１リド：／Ｘ　−１００Ｒ，５００ｍＭ のＮａＣ１の１００ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ５５の溶液５ｍｌの後、 ５ｍｌの０．２％トリトンＸ−Ｘ−１００Ｒ１５００のＮａＣｌ５１００ｍＭの 酢酸、ｐＨ３，５、て溶離させ、以下でｒｐＨ３，５溶離液」と呼ぶものを生成 した。

例　３ 上記４〜６回のクロマトグラフィ処理から得たｐＨ３，５溶離液両分をプールし 、４量のアセトンと混合した。タンパク質部分を一２０℃で６０分間沈降させた 後、４°Ｃて２０分間１７，０００ｘｇで遠心分離した。生成されたタンパク質 ペレットを乾燥させ、５００ｕｌの７０％ギ酸中に再懸濁させた後、流量ｏ、５ ｍｌ／ｍｉｎの７０％ギ酸でプレ平衡・溶離させたＦＰｊＣスペロース１２カラ ムに加えた。両分（２５０ｕｌ）を収集し、個々の画分のアリコートを凍結乾燥 し、さらに分析した。

例４ 親和架橋および「ゲル内Ｊ結合法を用いて、例２て得たサンプルの１２５１−Ｔ ＧＦ−β１結合を調へた。

これを行うため、フロリフ他、ジェイ・ハイオル・ケム２５９　：１０９９５　 ｍｌ　１０００　（１９８４）（Ｆｒｏｌｉｋｅｔ　ａｌ、、　、Ｊ、　Ｂｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５９：　１０９９５−１１０００　（１９８４））に従っ て、個々のモノ０画分の５０ｕ１部を、１２５Ｉで標識したＩｎＭの組換えＴＧ Ｆ−βｌの存在下で、４°Ｃて３時間保温して、５　ｘ　１０’ｃ　ｐｍ／ｍ　 Ｉの生成物を得た。保温は上記結合緩衝液で透析したか溶解させた両分について 行った。

０．１４ｍＭのジスクシンイミジルスベレート（’ＤＳＳＪ　）を用いて４°Ｃ て１５分間、アフィニティーヘルされたタンパク質を架橋させた。８０ｍＭの！ ・リスを含むＳＤＳ電気泳動サンプル緩衝液を加えることによって、架橋反応を 止めた。本例および後続例では、１０ｍＭのジ千オドレイトール（ＤＴＴ）含有 または非含有のＳＤＳサンプル緩衝液中で、９０″Ｃて３分間サンプルを加熱し た。そして、ブローベル他、ジェイ・セル・パイオル６７：８３５〜８５１　（ １９７５）（Ｂｌｏｂｅｌｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　６７ ：　８３５−８５１　（１９７５））に従って、５〜１５％ＳＤＳポリアクリル アミドゲルにサンプルを加えて、還元または非還元条件下で電気泳動を行った。

そして、ケルを２５％メタノール、７．５％酢酸中で固定し、乾燥して、富士Ｘ 線フィルムを用いた１２日間のオートラジオグラフィにかけた。その結果を第３ 図に示す。

例５ また、「ゲル内」結合を調べるために、放射線標識されたＴＧＦ−β１を用いて 実験を行った。これを行うため、マーフィー他、アナル・バイオケム１８７：１ ９７〜２０１　（１９９０）　（Ｍｕｒｐｈｙ　ｅｔ　ａｌ、、　Ａｎａｌ、　 Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１８７：　１９７−２０１　（１９９０））に記載された１２５Ｉヘパリン用の 方法を少し改変して使用した。要約すると、個々の両分２５０ｕｌを凍結乾燥し 、非還元ＳＤＳゲル電気泳動を行った。ＳＤＳゲル電気泳動の後、４０％メタノ ール、７９６酢酸中で３０分間ゲルを固定し、蒸留水で数回洗った。そして、ケ ルを１０％エタノール、１０ｍＭのトリスＨＣＩ、ｐＨ７，５で４°Ｃで、軽く 振とうさせながら一晩保温した後、同じ緩衝液で１時間洗った。ウシ血清アルフ ミン（ＢＳＡ）を２ｍｇ／ｍｌ含む結合緩衝液で３０分間ケルを保温した。そし て、１ｘｌｏ”ｃｐｍの１２Ｊ−ＴＧＦ−ａｌと２ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含む１ ０ｍ１の結合緩衝液とともにゲルをプラスチックの袋に移した。これらの袋をシ ールし、４°Ｃで一晩振とうさせた。余分な＋２５Ｉ−ＴＧＦ−β１を取り除き 、５００ｍ１の結合緩衝液で３０分間洗った後、４００ｍＭのＮａＣｌを含む５ ００ｍ１の結合緩衝液で２回洗った。各洗浄は３０分てあった。その後、ゲルを 乾燥し、例４のようにオートラジオグラフィを行ったが、それは３日間であった 。図４はその結果を示す。

例４および５の両方て、１４ｃ標識された分子量マーカを次のように使用した。

ミオシン（２００ｋｄ）、ボスホリラーセＢ（９２，５ｋｄ）、ウシ血清アルブ ミン（６９ｋｄ）、オポアルフミン（４６ｋｄ）、カルポニックアンヒドラーセ （３０ｋｄ）、リゾチーム（１４，３ｋｄ）。

例４の結果は、見かけ上の分子質量が２１０，０００＋１７０．０００；および １４５，０００ｋｄの、大半の画分からの複合体と、分子質量が８０，０００お よび６５．０００（７）画分２〜ＩＯ中の複合体と、５３，０００の両分ｌＯ〜 ２０中のそれを示した。例５（図４）の結果は、両分５〜２６における９０〜２ ００ｋｄ範囲にいくつかの結合成分と、画分１１〜２６に３６ｋｄの顕著なバン ドを示した。

例　６ 例４て得られた結果は、”Ｊ−ＴＧＦ−ａｌでアフィニティラベルされたベータ グリカンに対して、セガ二二池、ジェイ・パイオル・ケム２６３：８３６６〜８ ３７０　（１９８８）およびチェイフェッ他、ジェイ・ハイオル・ケム２６３　 ：１６８８４〜１６９９１（１９８８）　（Ｓｅｇａｎｉｎｉ　ｅｔ　ａｌ、、 　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６３８３６６−８３７０　（１９８８）　 ａｎｄ　Ｃｈｅｉｆｅｔｚ　ｅｔ　ａｌ、、　、１．　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ。

２６３：　１６８８４−１６９９１　（１９８８）　）に観察されたものと同様 なパターンを示した。２１０ｋｄまたは１７０ｋｄ成分がへ一タグリカンを表す かを判定するために、サンプルを１２５１−ＴＧＦ−ａｌと再び架橋させ、ヘパ リナーセとコントロイチナーゼで消化した。上記引用例は、プロテオり゛リカン ベータグリカンかそのような処理後１００〜１４０ｋｄにシフトすることを示し た。ここで試験した２１０および１７０ｋｄの複合体はそのような移動を示さず 、ベータグリカンを表さないことを強く示唆した。

例　７ 例１〜６のタンパク質に結合活性かあることが示されてから、更なる精製工程を 行った。

再び、モノＱカラムで得られた両分について、上記のように画分１６〜２０以外 のすへてを組み合せ、透析緩衝液で透析した。ここでも、上記プロトコールに従 って、透析物に対して固定化ＴＧＦ−βｌを用いたアフィニティクロマトクラフ ィを行った。その後、カラムを上記の結合緩衝液で、そしてより高いイオン強度 の結合緩衝液、つまり０．５ＭのＮａＣｌで洗った。その後、溶離を２回、最初 はｐＨ５，５、次にｐＨ３，５の溶離緩衝液て行った。還元剤の存在下および非 存在下で銀染色を用いたＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で各両分を分析 した。これらの異なる分画の結果か図５に示され、そこで’ＦＴＪは物質を通る 流れを、ｒＷＩＪは低イオン強度の洗浄を、「Ｗ２」は高イオン強度の洗浄を、 「Ｅｌ」はｐＨ５，５での溶離を、そしてＥ２はｐＨ３，５での溶離を表してい る。ｐＨ５，５て溶離するタンパク質は非常に少な（、一方、ｐＨ３，５および 非還元条件下では、見かけ上の分子質量か１６０．７２．４６および３６キロク ルトンの物質が溶離した。この画分を還元条件下で試験すると、見かけ上の分子 質量が１６０．８ｏ、５゜および４０キロダルトンの種が認められた。これは、 分子質量か１６０ｋｄ、そして７０〜８ｏｋｄ、４５〜５０ｋｄ、および３５〜 ４０ｋｄ（７）範囲の、４つの別々の種か存在することを示唆している。

例　８ ｐＨ３，５の溶離液は興味を引く物質を含むことが明かで、それを更に分析した 。画分のアリボートを凍結乾燥し、結合緩衝液で再溶解し、上記のように調製し たＩｎＭの＋２５Ｉ−ＴＧＦ−β１で、余剰量（４００ｎＭ）の無標識ＴＧＦ− βｌと共に、またはそれ無して保温した。ここでも上記プロトコールに従って、 これら物質をＤＳＳで架橋させ、還元条件下てＳＤＳゲル電気泳動を用いて分析 した。これらの実験で得たラジオグラフィデータか図６に示され、見かけ上の分 子量か１７０および５３ｋｄの複合体を示している。これらの複合体を１２Ｊ− ＴＧＦ−ａｌと会合させた。この放射線標識された分子は還元条件下で１２．５ ｋｄの分子量を持ち、従って結合物質は例７の１６０ｋｄおよび４０ｋｄ種であ ると考えられる。分子質量か７０〜９０ｋｄおよび２５ｋｄの成分も検出された か、無標識ＴＧＦ−βｌの４００倍コールＦモル余剰量を使用しても置換は認め られなかった。また、これらのバンドは、サンプルか存在しないコントロールレ ーンて検出され、遊離した＋２Ｊ−ＴＧＦ−β１および標識された分子がＢＳＡ に非特異的に架橋することを示唆している。

例　９ 他のいくつかの両分と同様に、ｐＨ３，５の画分を「ケル内」リガンド結合に使 用した。具体的には、７０ｕ１３のＦＴ、ＥｌおよびＥ２の画分に対して、ゲル 内リガント結合の上記と同じプロトコールを用いた。図７はその結果を示す。認 められた３つの成分中２つは、例８のアフィニティラベリング実験を用いて検出 した成分と同一であった。第３の８０ｋｄバンドは、図６に示され、例８て記載 された拡散７０〜９０ｋｄバンド中に隠れていたのかも知れない。第４の成分で ある５０ｋｄバンドは、ｐ）（３，５の画分の最低量中に存在する物質であった 。

例ＩＯ 以上の例は、いくつかのレセプタ様の結合タンパク質の存在を示した。これらを 分離するため、サイズ分離法を用いた。具体的には、４〜６回のＴＧＦ−βｌセ ファロースクロマトグラフィからのｐＨ３，５の溶離液を、上記例２のようにプ ールしてアセトン沈降を行った。沈降物を乾燥し、７０％ギ酸で再溶解し、７０ ％ギ酸中で溶離したＦＰＬＣスペロース１２カラムに加えた。

このクロマトグラフィのタンパク質プロフィールか図８に示され、そこに３つの 主要タンパク質ピークか画分２８〜３１．３２〜３４および４４〜４８に見られ る。

画分３６〜４０に段部が見られる。

個々の画分３１〜４８を冷凍乾燥し、非還元条件の後銀染色するＳＤＳポリアク リルアミドゲル電気泳動を用いて、１０ｕｌのアリボートで分析した。その結果 か図９に示されている。それは、１６０ｋｄの成分か両分３２〜４２の幅広のピ ークで溶離し、７２ｋｄの成分か画分３７〜４０で、３６ｋｄの成分か画分４４ 〜４７で溶離したことを示している。この最後の物質は等質に思われ、還元条件 下での更なる分析は４０ｋｄの画分を示した。これらの結果は、この物質か恐ら く鎖内ジスルフィド結合を含む単鎖ポリペプチドであることを示している。図８ の２８０ｎｍの吸光値は、約１２ｕｇのこの４０ｋｄの分子か１０ｋｇの組織か ら精製できることを示唆している。

例１１ ４０ｋｄの分子のＴＧＦ−βｌに対する結合を試験するために、上記の親和架橋 プロトコールを用いて分析した。図１０は、この実験か非還元条件下で６２ｋｄ の複合体を、そして１０ｍＭのＤＴＴの存在下で５３ｋｄの複合体を生成したこ とを示す。非還元および還元条件下でのＴＧＦ−βｌの分子質量を差し引くと（ ２５ｄ、１２．５ｋｄ）、結果の数値は４０ｋｄになる。

同様に、非還元条件下で「ゲル内」結合を行ったところ、図１１に示すように３ ６ｋｄで標識されたバンドか認められた。これは予期された値で、結果は、３６ 〜４０ｋｄの分子質量を持つＴＧＦ−βｌに対する実質的に純粋なレセプタ様の 結合タンパク質か、均質の形のときに分子を結合することを証明している。

例１２ 例１に記載の最初の精製作業はコムギ胚芽凝集素カラムを使用したので、関心の 対象である物質か糖タンパク質である可能性を除外できない。そのため、本発明 の分子は、タンパク質成分を確実に含み、糖タンパク質かも知れないのてＶタン パク質合作Ｊとする。エントグリコシダーセＦを用い、ＳＤＳポリアクリルアミ ドゲル電気泳動、銀染色および還元条件を使用した均質の４０ｋｄの成分の分析 は、３５ｋｄの生成物をつくり、従ってその分子は糖タンパク質であるかも知れ ない。

例１３ ４０ｋｄ物質のトリプシン消化は、いくつかのアミノ酸データを明らかにした。

以下の配列か特定された。

（１）　Ｖ　（Ｄ）ＬＶ　（Ｄ）ＦＥＧＮＨＱＦＡ（ＩＩ）　ＶＶＧＬＥＧＳＤ ＫＬＳＩＬＲ（Ｉ　Ｉ　Ｉ）　ＶＦＧＳＱＬＧＥ ここでＰｏはヒドロキシプロリンであり、括弧内のアミノ酸は決定か仮のもので あることを意味する。配列ＩＩＩは、３つの糖タンパク質すべてに特異的に結合 する抗血清の調製に使用されている。

例１４ 上記タンパク質の他の実験は、他のトリプシン画分を生成した。これらは以下の ものを含んだ。

（１）ＹＬＧＧＳＨＧＳＦＡ （２）ＶＶＧＬＥＧＳＤＫＬＳ　ＩＬＲ（３）ＣＰ”ＧＬＰ”ＧＡＡＧＰ （４）ＤＷＡＡＹ 上記３つの糖タンパク質の混合物のりシンペプチダーセ画分消化から、他のペプ チドか得られた。

ＲＧＦＧＳＱＬＧＥＦＷＬＧＮＤＨＩＨＡＬＴＡＱＧＴＮＥＬＸＶＤＬＶＦＥＧ ＮＨＱＦＡ例１５ 関心の対象であるタンパク質をコード化するｃ　ＤＮＡを分離する実験を行った 。特異的プローブを調製するため、フタ子宮由来のｍＲＮＡを用いたポリメラー ゼ連鎖反応（ｒＰｃＲ」）に、例１３および１４に示されたペプチド配列に基つ いて縮重オリゴマーを使用した。具体的には、配列 ＬＧＥＦＷ と ＦＥＧＮＨＱＦ を用いて、以下のセンスおよびアンチセンス縮重オリコマ−を調製した。

５°　ＣＡＡ　ＣＭＧＧＮ　ＧＡＡ　ＴＴＴ　ＴＧＧ−３’５’　ＡＡＡ　ＴＴ Ｇ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＮＣＣＴＴＣＡＡＡ−３’これらの縮重オリゴマーをｍＲ ＮＡのポリメラーゼ連鎖反応に使用したところ、約１００塩基対両分の増幅に至 った。１００塩基対画分をブルースクリプトにサブクローン化してから配列決定 した。

例１６ 上記１００塩基対配列にもとづいて、合成オリゴヌクレオチドプローブを合成し た。

５°−ＴＴＣＴＧＧ　ＣＴＧ　ＧＧＧ　ＡＡＣＧＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＣＧＣＣ ＣＴＧ　ＡＣＧＧＣＣＣＡＧ　ＧＧＡ−３’ （センス） ５’　ＧＡＡ　ＧＴＣＣＡＣＧＡＧ　ＧＴＣＣＡＣＣＣＧ　ＧＡＧ　ＣＴＣＡＴ Ｔ　ＧＧＴ　ＴＣＣＣＴＧ　ＧＧＣＣＧＴ−３’ （アンチセンス） これらのプローブを［３２γ］Ｐで標識し、ブタ子宮から分離されたｍＲＮＡか ら調製されたｃＤＮＡライブラリのふるい分けに使用した。ｃＤＮＡをλｇｔｌ ｏに挿入してライブラリを形成した。ライブラリをニトロセルロースフィルタに 移し、ハイブリッド形成してプローブとした。フィルタを２ｘＳＳＣ１ｏ、ｉ％ ＳＤＳで、常温で１５分間、その後０．５ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳて、５０° Ｃて２０分間洗ってから、ｃＤＮＡクローンを分離した。挿入断片は短く、この クローンを用いてライブラリを再ふるい分けしたか、このとき最初の条件の組合 せより少し厳密な洗いを行った（２ｘＳＳＣ１０，１％ＳＤＳで、常温で１５分 間、その後０．２ｘＳＳＣ１０１％ＳＤＳで、６０°Ｃで２０分間）。

分離されたｃＤＮＡクローンの配列決定を行い、従って添付のＳＥＱ　ＩＤ　Ｎ Ｏ：５に表されている。

以上の実験は、ＴＧＦ−ａｌに対するいくつかのレセプタ様の結合タンパク質の 存在を示している。［レセプタ様のＪという語句は、これらの分子を、ｒＴＧＦ −βｌｌ結合タンバクＪと呼はれている他の分子から総称的に区別するために使 用されている。以前に記載された分子は、細胞内てＴＧＦ−β１分子に複合化さ れ、ＴＧＦ−β１の細胞外通過を可能にするために必要と思われる物質である。

これに対して、分離されたときにこの発明の分子かＴＧＦ−ａｌに複合化される 証拠はなかった。従って、それらはＴＧＦ−βＩに結合してそれを溶液から取り 出すという「レセプタ様の」特質を示すか、「レセプタ」、標的分子の受容にか かわる膜結合物質の意味で一般的に使用される。この発明の記載されクレームさ れた分子をそのような役割に結び付ける証拠はなく、従ってそれはレセプタでな く　［レセプタ様の］と呼ぶ。

本明細書て報告された実験から得られたデータは、本明細書に記載されたＴＧＦ −βｌ結合タンパク質が、例えはＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５に表されたアミノ酸配 列の単量体、二量体およびタイマーとして関連するという仮説を裏付けた。

その分子は、コムギ胚芽凝集素カラムに結合する能力と、エンドグリコシダーゼ 処理後の４０ｋｄ分子の縮小に基つきも、糖タンパク質と考えられる。

３つの分子はプロテオグリカン構造を持たないよってあり、従って、プロテオグ リカンであって「ベータグリカンＪと呼はれるタイプＩＩＩのＴＧＦ−βレセプ タとはっきり異なる。例えはデコリン（ヤマグチ他、ネイチャー３４６　：２８ １〜２８４　（１９９０）　（’Ｙａｍａｇｕｃｈｉｅｔ　ａｌ、、　Ｎａｔｕ ｒｅ　３４６：　２８１−２８４　（１９９０））　）　；　α２マクロクロプ リン（オコナーマッツート他、ジェイ・パイオル・ケム２６２：１４０９０〜１ ４０９９　（１９８７）（０°Ｃｏｎｎｏｒ−ＭｃＣｏｕｒｔ、ｅｔ　ａｌ、、 Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２：１４０９０−１４０９９　（１９８７））　 ）　；およびタイプＩＶコラーゲン（パラルカー他、デブ・パイオル１４３　： 　３０３〜３０８（１９９１）　（Ｐａｒａｌｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｄｅｖ 、　Ｂｉｏｌ、　１４３：　３０３−３０８　（１９９１））　）との更なる比 較は、これらすべての分子か本明細書て述へた分子と異なるサイズとサブユニッ ト組成を持ち、本明細書で記載しクレームしたものと異なり分泌される分子であ るから行わない。

しかし、配列はテナスチン（ｔｅｎａｓｃｉｎ）のものと同様な構造と、コラー ゲン様のドメインを示唆している。

これらの実質的に純粋なレセプタ様のＴＧＦ−βｌ結合糖タンパク質のＴＧＦ− β１を結合する能力は、いくつかの有用性を持つ。上記実験に示されるように、 ３つの分干すへてかカラム上でＴＧＦ−ａｌに結合した。従って、夫々かサンプ ル中のＴＧＦ−βＩを検出するプローブとして使用できる。結合分析で用いたサ ンプルの精製糖タンパク質との接触は、ＴＧＦ−ａｌの定量法を可能にする。ま た、糖タンパク質のＴＧＦ−ａｌと結合する能力は、実際のレセプタを持った細 胞とのＴＧＦ−ａｌの結合を防止するだめの治療剤として有用で、十分な量の糖 タンパク質を加えればＴＧＦ−ａｌの影響を抑止できろ。抗体生成用の免疫原等 、その物質の他の用途は当業者には明白で、ここに記載する必要はない。

本明細書に記載されたｃＤＮＡの分離は、ＤＮＡの相補的性質か周知であるから 、当業者にその相補構造を示したことになる。アミノ酸配列とｃＤＮＡ配列の解 読は、ＴＧＦ−β１結合タンパク質単量体のゲノムＤＮＡ配列コーディングを分 離する手段を当業者に示すものと理解できよう。同じ目的で、微生物学の従来技 術を用いて、コーディングＤＮＡ　（ゲノムまたは相補的）で、原核でち真核て も細胞を形質転換させることかできる。形質転換可能な細胞型の１例としてコス 細胞を挙げることかできるか、他の細胞型も当業者が容易にアクセスでき、これ 以上の記載は不要である。

この核酸配列で形質転換を受け得るいかなる細胞も、３５〜４０ｋｄの単量体を コード化する能力かあることか理解されよう。単量体を三量化および三量化する 手段を持つこれらの細胞は、本明細書に記載されたｄ−および三量体を生成でき る。

結合タンパク質を発現する細胞に対するプローブとして、核酸配列か使用できる ことは周知である。そのようなアンチセンス配列は、それが妥当な場合、結合タ ンパロ　ロ　Ｕ） 一ト寸　ｏＩ／）の Ｎ　ｗ−ｗ−Ｑ）　Ｃｏ　Ｖ＞ ＦＩＧ、　６ ｋＤａ ＥＩＥ２ １４″ ＦＩＧ、　８ ＦＩＧ、１０ ２０〇− Ｄａ ２０〇− ＦＩＧ．１２ ＣＧＴＴＡＣＴＣＣＡＧＣＡＡＣＡＴＧＴＡＴＴＣＴＣＭＴＡＡＡＧＡＣＡＣＴ ＴＧＣＴＴＡＣＣＣ触鮎品触品　１１９６補正書の写しく翻訳文）提出書 （特許法第１８４条の７第１項） 平成５年１２月１７日′−

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．レセプタ様のトランスフォーミング成長因子β１結合タンパク質分子をコー ド化する分離された核酸分子。
2. ２．請求項１の核酸分子に相補的な分離された核酸分子。
3. ３．前記分子かｃＤＮＡである請求項１の分離された核酸分子。
4. ４．前記分子がｍＲＮＡである請求項１の分離された核酸分子。
5. ５．前記分子かゲノムＤＮＡである請求項１の分離された核酸分子。
6. ６．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５に記載された配列を持つ請求項３の分離された核酸 分子。
7. ７．請求項１の核酸分子が移入された、分離された細胞。
8. ８．前記細胞がコス細胞である請求項７の細胞。
9. ９．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で決定される３５〜４０ｋｄの分子 量によって特徴づけられる実質的に純粋なレセプタ様のトランスフォーミング成 長因子β１結合タンパク質含有分子。
10. １０．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で決定される７５〜８０ｋｄの分 子量によって特徴づけられる実質的に純粋なレセプタ様のトランスフォーミング 成長因子β１結合タンパク質含有分子。
11. １１．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で決定される１６０ｋｄの分子量 によって特徴づけられる実質的に純粋なレセプタ様のトランスフォーミング成長 因子β１結合タンパク質含有分子。
12. １２．サンプル中のトランスフォーミング成長因子β１結合タンパク質を特定す る方法であって、前記サンプルを請求項９の実質的に純粋なレセプタ様の結合タ ンパク質含有分子に接触させ、前記サンプル中のトランスフォーミング成長因子 １の決定として前記結合糖タンパク質への結合を決定することからなる方法。
13. １３．サンプル中のトランスフォーミング成長因子β１結合タンパク質を特定す る方法であって、前記サンプルを請求項１０の実質的に純粋なレセプタ様の結合 タンパク質含有分子に接触させ、前記サンプル中のトランスフォーミング成長因 子１の決定として前記結合タンパク質含有分子への結合を決定することからなる 方法。
14. １４．サンプル中のトランスフォーミング成長因子β１結合タンパク質を特定す る方法であって、前記サンプルを請求項１１の実質的に純粋なレセプタ様の結合 タンパク質含有分子に接触させ、前記サンプル中のトランスフォーミング成長因 子β１の決定として前記結合タンパク質含有分子への結合を決定することからな る方法。
15. １５．細胞に対するトランスフォーミング成長因子β１の影響を阻害する方法で あって、前記トランスフォーミング成長因子β１を阻害するに十分な量の請求項 ９の実質的に純粋なレセプタ様のトランスフォーミング成長因子β１結合タンパ ク質含有分子を被験者に投与することからなる方法。
16. １６．細胞に対するトランスフォーミング成長因子β１の影響を阻害する方法で あって、前記トランスフォーミング成長因子β１を阻害するに十分な量の請求項 １０の実質的に純粋なレセプタ様のトランスフォーミング成長因子β１結合タン パク質含有分子を被験者に投与することからなる方法。
17. １７．細胞に対するトランスフォーミング成長因子β１の影響を阻害する方法で あって、前記トランスフォーミング成長因子β１を阻害するに十分な量の請求項 １１の実質的に純粋なレセプタ様のトランスフォーミング成長因子β１結合タン パク質含有分子を被験者に投与することからなる方法。
18. １８．以下の群から選択されるペプチドフラグメント：（ａ）Ｖ（Ｄ）ＬＶ（Ｄ ）ＦＥＧＮＨＱＦＡ（ｂ）ＶＶＧＬＥＧＳＤＫＬＳＩＬＲ （ｃ）ＶＦＧＳＱＬＧＥ （ｄ）ＹＬＧＧＳＨＧＳＦＡ （ｅ）ＶＶＧＬＥＧＳＤＫＬＳＩＬＲ （ｆ）ＣＰ＊ＧＬＰ＊ＧＡＡＧＰ （ｇ）ＤＷＡＡＹ および（ｈ）　ＲＧＦＧＳＱＬＧＥＦＷＬＧＮＤＨＩＨＡＬＴＡＱＧＴＮＥＬＸ ＶＤＬＶＦＥＧＮＨＱＦＡここでＰ＊はヒドロキシプロリンである。
19. １９．レセプタ様のトランスフォーミング成長因子β１結合タンパク質分子に特 異的に結合する分離された抗体。
20. ２０．前記抗体がモノクローナル抗体である請求項１９の抗体。
21. ２１．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で決定される３５〜４０ｋｄの分 子量を持つレセプタ様のトランスフォーミング成長因子β１結合タンパク質に前 記抗体が結合する請求項１９または２０の抗体。
22. ２２．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で決定される７５〜８０ｋｄの分 子量を持つレセプタ様のトランスフォーミング成長因子β１結合タンパク質に前 記抗体か結合する請求項１９または２０の抗体。
23. ２３．ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で決定される１６０ｋｄからの分 子量を持つレセプタ様のトランスフォーミンク域長因子β１結合タンパク質に前 記抗体が結合する請求項１９または２０の抗体。