JPH06508742A - 組換えトロンビンレセプターおよびそれに関連した薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２５．５７位および／または９９位および／または２０５位が野生型トロンビン ｂ鎖と異なる、組換え的に生産される変異トロンビンを生産する方法であって、 発現に好適な条件下で請求項２４に記載の細胞を培養する工程、および 該培養からトロンビンを回収する工程を包含する、方法。

２６、創傷治療に有用な薬剤組成物であって、請求項１゜に記載のペプチドの有 効量を、少な（とも１種の薬学的に受容可能な賦形剤との混合物で含有する、薬 剤組成物。

２７、望まれないトロンビン活性により仲介される状態の治療に有用な薬剤組成 物であって、請求項１３または１６に記載のペプチドまたは請求項６に記載の抗 体組成物を、少なくとも１橿の薬学的に受容可能な賦形剤との混合物で含有する 、薬剤組成物。

明細書 えトロンビンレセプターおよびそれに　した１度立丘 本発明は、循環系の制御に関連した物質に関し、特に、トロンビンおよびその細 胞レセプターによって仲介される活性に関する。より詳細には、本発明は、トロ ンビンレセプターの生産に有用な組換え物質、診断手段としてのレセプターの使 用、およびトロンビンレセプター活性化およびレセブ９−に関連した診断組成物 を刺激またはブロックする治療剤に関する。

珠メＬｉ沃 トロンビンは、循環系の状態を制御する強力な因子である。

トロンビンが、フィブリノーゲンから、たいていの凝血の必要欠くべからざるフ ィブリンへの変換を触ｍすることにょっご、血液凝固の形成を補助することは明 白である。さらに、トロンビンは、血液中および血管内壁中の細胞に直接作用し 、特に血小板を活性化して凝血を形成することが公知である。

トロンビンで誘導された血小板活性化は、心筋梗塞、ならびにある形態の不安定 な狭心症および脳卒中を引き起こすプロセスである、動脈血栓形成に特に重要で ある。さらに、トロンビンは炎症および他の細胞活性を促進する。トロンビンは 、単球に対して走化性であり、リンパ球に対して細胞分裂促進性であり、内皮細 胞に、好中球粘着性タンパク質ＧＭＰ−１４０をその表面に発現させ、これらの 細胞の増殖を阻害する。トロンビンは、血小板由来の増殖因子を内皮から誘導し 、そして間葉細胞の分裂促進因子である。

トロンビンは、細胞を直接活性化することができるので、・りなｌとも１つのト ロンビンレセプターが存在すると想定される。しかし、従来の結合研究では、ト ロンビンレセプターの存在を検出することが可能ではなか−〕た。なぜなら、ト ロンビンは、トロンビンに対する細胞応答を直接仲介しな０、細胞上に存在する 多数の物質を結合し２得、ツク、フグラウンドレベルの結合がかなり高いからで ある。

同定されているｔ・ロンピン結合性タンノでり質は、トランスダクノヨ７分子と １２で機能しないようである（Ｇｒｏｎｋｅ、　Ｒ，Ｓ。

ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８７）　２６２：３０３０−３０３６；　 Ｏｋａｍｕｒａ、Ｔ、ら、↓Ｒｉｏｔ　Ｃｈｅｍ　（１９８７）　２５３：３４ ３５）　。生理学的に不活性な改変されたトロノビンは、トロンビン自身と同様 に血小板１こ結合するようである。従って、従来の結合研究で同定される結合部 位は、機能的トロンビンレセプターと関連し得ｆ；％）。また、トロンビンはプ ロテアーゼであるため、そのレセブターカ（トロンビンとの相互作用によってり ７１＜り質分解で開裂されるなら、レセプターのトロンビンへの強力な結合能力 （ま低下し得る。上記の要素はすべて、トロンビンレセプターを発見しようとす る従来の結合研究が、最終的には非生産的であり得ることを示唆している。

トロンビンレセプターが存在し得ることが想定されている−４、トロンビンによ るタンパク質分解による開裂がそのレセプター活性化に関与しているか否かは、 これまでに行われた研究からでも明白でない。トロンビンが、トロンビンを共有 結合によって改変し、トロンビンをタンパク質分解によって不活性にする試薬で 処理されると、血小板を刺激するトロンビンの能力は破壊される（　Ｂｅｒｎｄ ｔ、　Ｍ、　Ｃら、−Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｐ ａｔｈｏｌｏｇｙ’　（１９８１）　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　Ｈｏｌｌ ａｎｄＢｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ、４３−７４：　Ｍａｒｔｉｎ 、Ｂ、Ｍ　ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｚ　（１９７５）　１４：１３０８−１ ３１４＋　Ｔｏｌｌｅｆｓｅｎ、Ｄ、Ｍ、ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｔ＊　（１ ９７４）　２４９：２６４６−２６５１＋　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、　Ｄ、Ｒ，、Ｔ 　ｒｏｍｂｉｎ　Ｄ’ａｔｈ　Ｈａｅｍｏｒｒｈ　（１９７４）　３２：２０７ −２１５；　Ｗｏｒｋｍａｎ、Ｅ、Ｆ　ら、Ｊ　ＢｉｏｌＣｈｅｍ　（１９７７ ）　２５２：　７１１８−７１２３：　Ｇｒｅｃｏ、Ｎ、Ｊ　ら、Ｂｌｏｏｄ　 （１９９０）　７５：１９８３−１９９０）。上記の報告に記載の改変された形 態のトロンビンは、活性部位を占めるかさばった（ｂｕｌｋｙ）または荷電した 部分および基質に結合するトロンビン表面の辺縁の付加領域をまた含む（Ｂｏｄ ｅ、　Ｗら、Ｅｍｂｏ　Ｊ　（１９８９＞　８：３４６７−３４７５）。

事実、化学的に改変されたトロンビンの中には、トロンビンで誘導された血小板 活性化をブ、口・ツクするものがあり、血小板活性化をブロックする１つの改変 されたタンノ＜り質分解性でないトロンビンである、Ｄ−フェニルアラニルーＬ −プロリル−し一アルギニルクロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）　トロンビンは 、基質に結合しない。従って、プロテアーゼ活性の欠乏が、血小板を活性化しな いことの原因であるとは結論できない。

本願に記載の研究中に、２つのグループは、トロンビン応答性細胞系から調製さ れるメツセンジャーＲＮＡが、アフリカッメガエル卵母細胞に微量注入されると 、卵母細胞にトロンビン応答性を供与すると報告している。ｍＲＮＡは、／％ム スターの肺の線維芽細胞系ＣＣＬ３９　（Ｖａｎ　Ｏｂｂｅｒｇｈｅｎ−３ｃｈ ｉｌｌｉｎｇ、　Ｅら、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　（１９９０）　２６２：３ ３０−３３４）またはヒト謄静脈内皮細胞（Ｐｉｐｉｌｉ−３ｙｎｅｔｏｓ、Ｅ 、ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ　（１９９０） 　１７ユ９Ｈ−９１９）から調製された。

本明細書に記載のように、トロンビンレセプターを同定し特徴づけると、循環系 における血栓症を制御し得るシステムおよび物質の設計が可能になる。さらに、 この研究によって、循環状態を評価するための新しい診断試薬が提供される。

え囲旦阻丞 本発明は、哺乳類における循環系の制御に有用な方法および物質を提供する。ト ロンビンによって活性化される細胞の表面に関連するトロンビンレセプターの単 離、組換え生産および特徴づけにより、これらの機能が有効１こ制御される。

従って、１つの局面では、本発明は、トロンビンレセプターの生産に関連する組 換え物質に関する。これら（こ（よ、ｇＡＩえば、培養されることにより、その 表面上にトロンビンレセプターを示すことが可能なトランスフェクトされｔこ細 胞力（含まれ、そしてそれ放物質と天然のトロンビンレセプターとの相互作用を アッセイするシステムを提供する。これらの李田胞またはレセプターの関連部分 を有するペプチドは、試料中のトロンビンのレベルを決定する診断薬、およびイ ンビボにおいてトロンビン活性に影響を与える候補物質をスクリーニングする手 段として使用され得る。

他の局面において、本発明は、活性化形態のレセプタータンパク質の細胞外部分 を模倣するトロンビンレセプターアゴニストに関する。これらのアゴニストは、 例えば、血有病者の内出血部位に局部付与することによって、血小板凝血形成を 促進するのに有用である。アゴニストはまた、線維芽細胞増殖を刺激するトロン ビンの能力を模倣するため、創傷治癒の促進に有用であり得る。

さらに他の局面において、本発明は、トロンビンレセプターのアンタゴニストに 関する。これらのアンタゴニストは、レセプターの活性化に必要な重要な特徴を 欠く、改変された形態のトロンビンレセプターアゴニストペプチドを含む。これ らのアンタゴニストは、レセプターに結合するが、レセプターを活性化せず、ト ロンビンによるレセプター活性化を防止する。

トロンビンの作用を拮抗する本発明の第２グループの化合物は、事実、トロンビ ン阻害剤である。このグループは、通常にはレセプターの開裂およびトロンビン 結合領域を示すであろうレセプターの模倣を含み、非開裂性ペプチドおよびトロ ンビンに対する結合が向上したペプチドを含む。これらのペプチドは、トロンビ ンに直接結合し、レセプターに結合し得るトロンビンのレベルを低下させ得る。

従って、これらのペプチドは、トロンビンで誘導された血小板凝固、フィブリノ ーゲン凝血および細胞増殖などのトロンビン仲介事象を減少または防止する。

アンタゴニストとして作用する第３グループの化合物は、トロンビンレセプター のアニオン領域に、それと入れ替わる代替アニオン領域を提供することによって 、レセプターへのトロンビンの結合をブロックする。これらのアンタゴニストは 、レセプターのトロンビン結合部分に含まれるアニオン領域の模倣である。これ らのアンタゴニストはまた、トロンビン変異体し、トロンビンと無傷のレセプタ ーとの相互作用を防止する。

逆に、トロンビンリガンドに存在するカチオン領域を模倣する代替カチオン領域 は、レセプターの結合領域を占有するアンタゴニストに含まれ、トロンビンの結 合を防止し得る。

第５グループのアンタゴニストは、レセプタータンパク質の特異的領域を結合す るように設計される抗体を含み得る。

一般に、これらのアンタゴニストは、トロンビンレセプターの任意の所望の領域 に対して高い特異性を有するモノクローナル抗体調製物である。本発明の抗体は また、レセプタータンパク質の免疫アッセイ、例えば、組換えシステムにおいて 遺伝子が首尾よく発現していることを評価するのに有用である。

第６グループのアンタゴニストは、改変された形態の、タンパク質分解活性を欠 くトロンビン変異体。

他の局面では、本発明は、組換えトロンビンレセプターを用いてアゴニストとア ンタゴニストとをスクリーニングするアッセイシステムに関する。あるシステム は、アゴニストペプチドを用いて、アゴニストの効力を阻害するアンタボニスＣ ・をスクリーニングする。

本発明の他の局面は、血栓症の尺度として活性化されたときにトロンビンレセプ ターから開裂されたペプチドを、血液または尿などの液体中で検出することによ る、循環系疾患の診断に関する。本発明に含まれる他の診断方法は、活性化レセ プターに特異的な抗体を用いて、インシトウ（ｔｎ　５ｔｔｕ）のこれらの標的 を位置付け、イメージ化することによる、活性化形態のレセプターの明視化およ び体内の凝血の検出である。

本発明の他の局面は、本発明の化合物を含む薬物組成物に関スる。トロンビンレ セプターの活性化に対してアンタゴニストとして作用する本発明の化合物は、抗 血栓症剤として有用であり、様々な臨床兆候において役立つ。臨床兆候には、血 管形成における突然の閉鎖の治療、血管形成における再狭窄の治療、不安定な狭 心症の治療、心筋梗塞の治療、および特定の形態の血栓または血小板塞栓溶解性 （ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｙｔｉｃ）発作の治療が含まれる。本発明の化合物 は、単独で用いられるか、またはウロキナーゼおよびｔＰＡなどの他の治療薬と 組み合わせて用いられ得る。

区」諺ど」隼ｈ」主咀 図１は、ヒトのトロンビンレセプターのＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を示す。

図２は、推定アミノ酸配列に基づいて提案された、トロンビンレセプター活性化 のモデルを示ス。

図３は、ヒトのトロンビンレセプターをフードするｃＤＮＡおヨヒネズミのトロ ンビンレセプターをコードするｃＤＮＡカラ推定される開裂部位および外部部位 結合ドメインのアミノ酸配列の比較を示す。図３はまた、ヒルジン配列の関連部 分も示す。

図４は、アゴニストペプチドに対する血小板応答を示す。

図５は、線維芽細胞に対する、本発明のアゴニストペプチドの細胞分裂促進効果 を示す。

図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃは、トロンビンで誘導された血小板活性化に対する、３ つのトロンビン阻害剤ペプチドの効果を示す。

図７は、トロンビンによって刺激された血小板ＡＴＰ分泌に対する、ｆＸトロン ビンの効果を示す。

図８は、変異トロンビンによる血小板ＡＴＰ分泌の阻害を克服するのに必要なト ロンビンの増加を示す。

図９は、トロンビン変異体の濃度を変化させることによる、血小板ＡＴＰ分泌に 対するトロンビンの効果を示す。

（以下余白） 発Ｂを　するための 本発明によって解明されるトロンビンレセプターの特徴ハ、図１および２に要約 される。図１は、レセプターをコードするクローンの完全なりＮＡ配列を、その 推定アミノ酸配列と共に示す。全アミノ酸配列は、４２５個のアミノ酸を含み、 これらのアミノ酸は、約４００個のアミノ酸からなる成熟レセプタータンパク質 を提供する２４個または２６個のアミノ酸シグナル配列を含む。

図１に示される配列の疎水性／親水性プロ、トは、成熟レセプターが７トラノス メンブレンドメインレセプターフアミリーのメンバーであり、アスパラギンに連 結したグリコリル化のためのいくつかのコンセンサス部位を含む比較的長い（約 ７５個のアミノ酸）細胞外のアミノ酸伸長部位を有することを示す。第１の細胞 外ループにおけるンステイン１７５と、第２の細胞外ループにおけるンステイン ２５４とを連結するジスルフィド結合は、ロドプシンおよびβ−２アドレナリン レセプターと類似し得る。イノシトウレセプターの提案されたモデルは、図２に 示される。

再び図１を参照すると、トロンビンで触媒された開裂部位は、４１位および４２ 位においてＡｒｇ−Ｓｅｔ連結によって示される。

この部位における開裂によって、成熟ペプチドの１位から開裂部位へ伸長する「 活性化ペプチド」として示されるレセプターのペプチド断片が遊離する。レセプ ターの正確なプロセノ／ング部位は知られていない。従って、成熟タンパク質の Ｎ末端は、あまり明白でない。しかし、成熟タンパク質Ｎ末端は、恐らり２８位 のアルギニン残基である。従って、「活性化、ブチド」は、配列ＲＰＥＳＫＡＴ ＮＡＴＬＤＰＲを有し得る。Ｎ末端の正確な位置は、本発明の化合物の設計には あまり重要ではない。この「活性化ペプチド」は、腎臓で大まかに濾過され、尿 中に濃縮され得、トロンビンによる血小板活性化の舟橋として使用され得る。

トロンビンによって開裂されるアミノ酸配列、すなわち、開裂部位は、伸長した 結合ポケットに含まれるトロンビンの活性部位／「オキシアニオン孔」領域に結 合する。このオキシアニオン孔は、疎水性結合、水素結合および電荷相互作用に よって大きな基質と結合する。代表的には、開裂される配列は、活性部位のアミ ノ酸と相互作用し、一方、この開裂部位に対してカルボキシル側にある配列は、 さらに伸長した「アニオン結合外部部位」と相互作用する。トロンビンレセプタ ーは、図１に示されるように、３２−６０位のアニオン配列ＹＥＰＦｌｆＥＤＥ Ｅを含む。この領域は、４１位と４２位との間の開裂部位に対してすぐカルボキ シル側にある。この配列ＹＥＰＦＷＥＤＥＥ　（、芳香族／疎水性残基およびア ニオン残基）の位置および組成は、この配列がトロンビンのアニオン結合外部部 位ヲ介シテトロンビンがレセプタ〜に結合するのを仲介する領域を含むことを強 力に示唆している。この仮定は、レセプターのこの領域の少なくとも一部を示す ペプチドがトロンビンを結合し、その作用を阻害することを示すことによって、 以下のように確認される。この見解はまた、レセプターのこの部分に結合するポ リカチオン性物質が、トロンビン結合およびレセプター活性化をブロックし得る ことを予想している。

活性化ペプチドの放出により、レセプタータンパク質が再度折りたたまれて、レ セプターを活性化する。このことは、図２に図式的に示される。図２はまた、活 性化ペプチドの遊離および再折りたたみによって生じるコンポメーシミン変化が 、レセプターの細胞内フンホメーションを変化させることも示している。この仮 定は、トロンビンレセプターが、活性化によって形成される新しいアミノ末端を 模倣するペプチドによって活性化され得ることを見いだすことによって確認され る。従って、活性化レセプター上の新しいアミノ末端であるＮ末端の模倣は、そ のアゴニストとして振舞う。レセプター活性化に対する、レセプター中に新たに 形成されたアミン末端の最初の２つのアミノ酸の重要性もまた、以下のように確 認された。アミノ末端セリンの位置とフェニルアラニンの位置とを交換すると、 上記のアゴニストペプチドのアゴニスト活性が完全に失われる。この情報に基づ いて、そしてトリブ７ノーゲンのトリプシンへの活性化に存在するメカニズムと の類似性によって、トロンビンがレセプターを開裂するときに新たに露出される セリン上の正に帯電したアミノ基が、レセプター活性化において重要な役割を果 たすようである。トロンビンレセプタ〜を結合するが、α−アミノ基を欠失する ように改変されたアゴニストペプチド配列に基づくペプチドは、トロンビンレセ プターのアンタゴニストとして機能し得る。従って、特異的な活性化相互作用能 力を欠失するアゴニストペプチドの改変体は、トロンビンレセプターアンタゴニ ストとしての役割を果たす。

杢ＩＬ盆不」し勤 本発明のペプチド化合物の記載に用いる命名法は一般的な習慣に従い、ペプチド のＮ−末端のアミ７基を各アミノ酸残基の左側に置き、カルボキシル基を右側に 置いた。本発明の選択された特別な実施態様を表す式において、アミノ−および カルボキシ−末端基が多くの場合、特に示されないにもかかわらず、特に条件を 指定しない限り生理的なｐＨ値を示す形態であることが理解される。従って、必 ずしも条件指定および表示されないが、生理的ｐＨのＮ−末６’ｌＡＨ“２およ びＣ−末端Ｏ−が特定の実施例または一般式のいずれにも存在することが理解さ れる。アミノ酸残基の側鎖上のｉ！雌の官能基もまた、アミド化、アシル化また は他の置換によって改変され得、例えばこの化合物の活性に影響することな（こ れらの溶解性を変更し得る。

示されたペプチドにおいて、それぞれの遺伝子にフードされた残基は、適切に、 次の慣用表に従って、アミノ酸の種の名称に対応する単一の文字で表記される： １文字の　３文字の アミノ酸　ａ号−一　ａ豆−− アラニン　Ａ　Ａｌａ アルギニン　ＲＡｒｇ アスパラギン　Ｎ　Ａｓｎ アスパラギン酸　Ｄ　Ａｓｐ システィン　ＣＣｙｓ グルタミン　Ｑ　Ｇｉｎ グルタミン酸　Ｅ　Ｇｌｕ グリシン　ＧＧｌｙ ヒスチジン　ＨＨｊｇ インロイシン　１１１ｅ ロイシン　Ｌ　Ｌｅｕ リジン　Ｋ　Ｌｙｓ メチオニン　Ｍ　Ｍｅｔ フェニルアラニン　Ｆ　Ｐｈｅ スレオニン　Ｔ　Ｔｈｒ トリプトファン　Ｗ　Ｔｒｐ 遺伝子的にコードされないアミノ酸は、下記の議論に示すように省略される。

本願に示す特定のペプチドにおいて、Ｄ−型が特に上付短剣符（ｔ）で表される 他は、光学異性体を有するアミノ酸残基のＬ〜型を意図する。

本発明の化合物は、指定するクラスのアミノ酸残基によって部分的に定義される ペプチドである。アミノ酸残基は、一般に、次のような４つの主要なサブクラス に下位分類され得る酸性：残基は生理的ｐＨでＨイオンを失うことによる負の荷 電を有し、そしてペプチドが生理的ｐＨで水性媒体中に存在するとき、その残基 は水性溶液によって誘引され、残基が含まれるペプチドのコンフオメーンヨン中 の表面の位置をめる。

塩基性：残基は生理的ｐＨでＨイオンに会合することによる正の荷電を宵し、そ してペプチドが生理的ｐＨで水性媒体中に存在するとき、その残基は水性溶液に よって誘引され、残基が含まれるペプチドのフンフオメー７Ｂン中の表面の位置 をめる。

中性／非極性：残基は生理的ｐＨで荷電せず、そしてペプチドが生理的ｐｉ（で 水性媒体中に存在するとき、その残基基よ水性溶液によって反発され、残基が含 まれるペプチドのコンフォノ−シコン中の内部の位置をめる。これらの残基ζよ また、本明細書では［疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉＣ）Ｊと表記される。

中性／極性：残基は生理的ｐＨで荷電せず、しかしペプチドが生理的ｐＨで水性 媒体中に存在するとき、その残基ζま水性溶液によって誘引され、残基が含まれ るペプチドのコンフオメー７＝Ｉン中の外部の位置をめる。

それぞれの残基分子の統計的な収集におしＸで、ある分子（よ荷電し、またある 分子は荷電せず、そして水性媒体による吸引または反発がより大きいかまたはよ り小さい範囲で存在することが、当然理解される。［荷電した（ｃｈａｒｇｅｄ ）Ｊの定義に適合するためには、生理的なｐＨでそれぞれの分子の有意な百分率 （少な（とも約２５％）が荷電される。極性または非極性として分類するために 必要な、誘引または反発の程度は任意であり、従って、本発明によって特に想定 されるアミノ酸は、１つまたはその他の分類に分類され得る。特に指名しないほ とんどのアミノ酸は、公知の性質に基づいて分類され得る。

アミノ酸残基はさらに、環状または非環状、および芳香族または非芳香族などの 、残基の側鎖置換基に関する自明な分類、ならびに小または大などとして下位分 類され得る。残基がカルボキシル炭素を含めて合計４個以下の炭素原子を含有す るとき、小さいと考えられる。小残基は、当然、常に非芳香族である。

天然に存在するタンパク質アミノ酸に関して、前記体系に従う下位分類は次の通 りである： １箪：アスパラギン酸およびグルタミン酸：［８ＥＪｉｌ’：アルギニン、リジ ン；１五良Ｚ１仄：ヒスチジン； Ｉｓニゲリシン、セリン、ンステイン；東１乙兆臣里Ｚ土：アラニン； 大罪族：スレオニン、アスパラギン酸 グルタミン； 大　族：チロシン； 性１−　大ｌ　族：ハリン、インロイシン、ロイノン、メチオニン： ：フェニルアラニン、およびト リプトファン。

遺伝子にコードされた二級アミノ酸であるプロリンは、技術的には中性／非極性 ／大／環状および非芳香族の群に入るが、ペプチド鎖の二次構造における公知の 作用による特別な例であり、従って、この定義の群には含まれない。

遺伝子コードによってコードされないある種の共通に見い出されるアミノ酸とし ては、例えば、ベーターアラニン（ｂｅｔａ−Ａｌａ）、または３−アミノプロ ピオン酸、４−アミノ酪酸などの他のオメガ−アミノ酸、アルファーアミンイソ 酪酸（ａ＋ｇｉｎｉｓ。

ｂｕｔｙｒｉｃ　ａｃｉｄ）（Ａｉｂ）、サルコシン（Ｓａｒ）、オルニチン（ Ｏｒｎ）、シトルリン（Ｃｉｔ）、ｔ−ブチルアラニン（ｔ−ＢｕＡ）、ｔ−ブ チルグリノン（ｔ−ＢｕＧ）、Ｎ−メチルイソロイシン（Ｎ−Ｍｅｌ　ｌｅ）、 フエニルグリシン（Ｐｈｇ）、およびノクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、ノル ロイシン（Ｎｌｅ）、システィン酸（Ｃｙａ）　２−ナフチルアラニン（２−Ｎ ａ１）；　１．２．３．４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉ ｅ）；β−２−チェニルアラニン（Ｔｈｉ）　；ならびにメチオニンスルフオキ シド（ＭＳＯ）を含む。これらはまた、便宜上特別なカテゴリーに分類される。

上記の定義に基づき、 Ｓａｒおよびｂｅｔａ−ＡｌａおよびＡｉｂは中性／非極性／小；ｔ−ＢｕＡ、 　ｔ−ＢｕＧ、　Ｎ−ＭｅｌｌｅＳＮｌｅ、　ＭｖｌおよびＣｈａは中性／非極 性／大／非芳香族； Ｏｒｎは塩基性／非環状； Ｃｙａは酸性； Ｃｉｔ、アセチルＬｙｓ、およびＭＳＯは中性／極性／大／非芳香族Ｐｈｇ、　 Ｎａｌ、　ＴｈｉおよびＴｉｅは中性／非極性／大／芳香族である。

種々のオメガ−アミノ酸が、大きさに従って、中性／非極性／小（ｂｅｔａ−Ａ ｌａ、すなわち、３−アミノプロピオン酸、４−アミノ酪酸）または大（その他 すべて）として分類される。

遺伝子中にコードされた他のアミノ酸置換基はまた、本発明の範囲のペプチド化 合物に含まれ得、そしてそれらの構造に従ってこの一般的な体系の範囲に分類さ れ得る。

本発明のすべての化合物が、アミノ酸がＣ−末端を形成するとき、薬学的に許容 可能な塩またはエステルの形態であり得る。　塩は、例えば、Ｎａ”、Ｋｏ、Ｃ ａ”、ｙ　ｇ　０２などであり得；エステルは一般に１−６０のアルコールのエ ステルであるＯＡ、　アゴニスト 本発明のアゴニストは、次式の一連のペプチドを含む：ＡＡｘ−ＡＡｙ−（ＡＡ 　１）ｎ−Ｚ　（１）ここでＡＡ、は小アミノ酸またはスレオニン、好ましくは ｓｅｒ。

ａｌａ、　ｇｌｙおよび、およびｔｈｒから選択され、モしてＡＡ、は中性、／ 非極性／芳香族アミノ酸残基であるかまたは中性／非極性／大／非芳香族アミノ 酸であり、環状部分（好ましくは中性／非極性／芳香族アミノ酸残基）を含む； ここでＡＡはアミノ酸残基を意味し、そして下付文字ｉは整数であり、式（１） のＡＡ、残基の下流（Ｎ−Ｃ）側の該当するアミノ酸残基の位置を示し、モして ｎは２−１２の整数である。ただしｎ＝２であるとき、２は必ず式ＮＲ’　Ｒｏ のアミド化されたＣ末端を含み、少なくとも１つのＲｏが少なくとも１つの極性 置換基を含むアルキルであるという条件で；そして 一般に、Ｚは干渉しない置換基である。

ＡＡ、およびＡＡ２は、従って、式ｌの化合物の中に存在しなければならｆ　； 　ＡＡ、−ＡＡ、２は任意である。ＡＡ、およびＡＡ２は比較的正確に定義され るが；　ＡＡ３−ＡＡ、２は、一般に、Ｌ−アミノ酸残基である。ＡＡ、の位置 はまた、比較的許容性がある；従って、ＡＡ、は、Ｌ−配置中に遊離のα−アミ ７基を有する中性または塩基性アミノ酸であり； ＡＡ２は中性または塩基性Ｌ−アミノ酸残基であり；ＡＡ３−ＡＡ１２は、好ま しくはＡＡ３が塩基性または中性アミノ酸残基である、Ｌ−アミノ酸残基であり ： ＡＡ、およびＡＡ、は、それぞれ独立に中性／極性／大／非芳香族アミノ酸であ るか、またはＡＡＪは塩基性アミノ酸であり得；ＡＡ５およびＡＡ、、は、それ ぞれ独立に、プロリンまたはノＪシミ／酸残基であり； ＡＡ７およびＡＡ、６は、それぞれ独立に酸性アミノ酸残基でありＡＡｓは塩基 性アミノ酸残基であり；そしてＡＡ、およびＡＡ、２は、それぞれ独立に中性／ 芳香族アミノ酸残基である。

式１のペプチドは、後続のアミノ酸配列によってＣ−末端（しかしＮ−末端では ない）で伸長されて（２に含まれるものとして示す）、非干渉置換基を含有し得 る。

式１の化合物のＣ−末端において、カルボキシル基は未誘導体化型またはアミド 化型であり得；未誘導体化型ではカルボキシルは遊離酸または塩、好ましくは薬 学的に許容可能な塩であり得る。

Ｃ−末端がアミド化される場合は、Ｃ−末端でカルボニル炭素と共有結合してい るアミド基のチッ素原子は、ＮＲ’Ｒ’であり、それぞれのＲｏが独立に水素で あるか、または１−６Ｃの直鎖または分枝鎖アルキルである。そのようなアルキ ルは、メチル、エチル、インペンチル、ｎ−ヘキシルなどのような１−６Ｃの直 鎖または分枝鎖の飽和ハイドロカルビル（ｈｙｄｒｏｃａｒｂｙｌ　）残基であ る。そのようなアミド基の典型は：特に−Ｎｌ２、−ＮＨＣＨ３、−Ｎ（ＣＨ３ ）２、−ＮＦＩＣＨ２ＣＨａ、−ＮＨＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２、および−ＮＨＣ ８２ＣＨ（ＣＨ３）Ｃ１２ＣＨ３である。さらに、いずれか１方または両方のＲ ｏは次に、例えば、それぞれのＲｏは、−〇Ｒ°、−ＮＲ’　Ｒ’、ハロ、−Ｎ Ｒ’　ＣＮＲ’　ＮＲ’　Ｒｏなどの、１つまたはそれ以上の置換基で任意に置 換され得る。

ここでＲｏはそれぞれ独立に上記定義の通りである。従って、Ｚは一〇Ｍ（もし くはエステルもしくは塩の形態）、または−ＮＲ’Ｒ°であり得、Ｒｏは上記定 義の通りである。

ＡＡ、−ＡＡ、の好ましい実施態様としては、ＧＦ、　ＡＰ、　ＳＦ、　ＴＦ、 　Ｇ（ｐｃｉＰｈｅ）、Ａ（ｐｃｌＰｈｅ＞、５（ｐｃＩＰｈｅ）、Ｔ（ｐｃＩ Ｐｈｅ）、ＧＴｈｆ、ＡＴｈｉ、ＳＴｔ＋＋、およびＴＴｈ　ｉを含む。ＡＡ、 およびＡＡ２の好ましい実施態様は大きい非極性アミノ酸である。この他の式（ １）の化合物の残基としての好ましい実施態様は、ＡＡ、およびＡＡ２がそれぞ れ独立にＬｅｕＳＶａｌＳＩｌｅ、　Ｃｈａ、　Ｐｈｅ、　２−Ｎａ１もしくは Ｔｉｅ；またはＡＡ３がＡｒｇＳＬｙｓ、　Ｏｒｎ、　ＨａｒもしくはＡｌａで ある、実施態様である。

他のアミノ酸としては、ＡＡａおよびＡＡ６がそれぞれ独立（こＧ　Ｉｎ。

ＡｓｎもしくはＬｙｓであり；またはＡＡ７およびＡＡ、＠がそれぞれ独立にＡ ｓｐもしくはＧｌｕであり；ＡＡ８がＡｒｇもしくはｌｙｓであり；またはＡＡ 、２はＰｈｅでありそしてＡＡ９がＴｙｒであり；また（よＺ力（ＯＨ５もしく はＮＲ’　Ｒ’でありＲｏは上記定義の通りである；またｉｉＺ！Ｉｆさらに下 記に定義するＡＡＩ３−ＡＡＩ７のいくつ力）もしり（マすべてを含む、実施態 様が好ましい。特に好ましくは、５ＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥ　；５ＦＬＬＲＮＰ ＮＤＫ；　ＳＦｌ、ＬＲＮＰＮ；　５ＦＬＬＲＮＰ、５ＦＬＬＲＮ；　５ＦＬＬ Ｒ，ＧＦＬＬＲ，ＴＦＬＬＲＮＰＮＤＫ；　５（ｐｃＩＰｈｅ）ＬＬＲ：　５（ Ｔｈｉ）ＬＬＲ；　５ＦＦＬＲ；　５ＦＦＬＲＮ；　ＳＦ（Ｐｈｇ）ＬＲ；　５ ＦＬ（Ｎａｌ）ＲＮ；　５ＦＬ（Ｃｈａ）Ｒ；　５Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮ ；　５Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＫ；　５Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＬＲＮＰＮＤ Ｋ；　５ＦＬＬＫＮ；　５ＦＬＬ（Ｈａｒ）Ｎ；　５ＦＬＬＫＮ　；　５ＦＦ（ Ｃｈａ）ＡＮ　、およびそれらのアミド化型力）らなる群より選択される、式（ １）の化合物である。

（以下余白） Ｂ、　アンタゴニスト トロンビンレセプターによって仲介される血小板活性化および他の細胞活性を干 渉する本発明の化合物は以下のものを含む： １）Ｎ−末端セリン残基を欠如する改変されたアゴニストペプチドを表すトロン ビンレセプターに対するアンタゴニスト；２）循環しているトロンビンに対する 誘引物として挙動する、トロンビンレセプターの細胞外部分の、開裂不能および ／または強化結合型を表すトロンビンインヒビター。

３）ＹＥＰＦＷＥＤＥＥのアニオン性−結合外部部位領域の少なくとも１部分を 模倣し、そしてやはり循環しているトロンビンに対する誘引物として挙動する、 アニオン性および疎水性／アニオン性ペプチド。

４）トロンビンそれ自身のアニオン性−結合外部部位領域を模倣し、そしてトロ ンビンと競合してレセプターに結合する、カチオン性または伸長したカチオン性 ペプチド。

５）トロンビンレセプターの種々の重要な位置と免疫反応性の抗体であり；そし て ６）レセプターに対して天然のトロンビンと競合する、タンパク質分解活性を欠 如するトロンビン変異体。

トロンビンレセプターアンタゴニスト 前記第１グル〜ブー改変されたアンタゴニスト−は以下の式で表され得る。

Ｘ−ＡＡ、−（ＡＡＩ）、−Ｚ　（２ンここで、Ｘは５ｅｔＳＡｌａ、　Ｔｈｒ 、　Ｃｙｓあるいはｃｒｙ以外のアミノ酸残基または脱アミノもしくはＮ−アン ル化アミノ酸であり；ＡＡ、は環状部分、好ましくは芳香族を含んでいる、中性 で非極性の大きなアミノ酸残基であり； ＡＡはアミノ酸残基を表し、下付文字ｉは整数で、（２）式のＡＡ、残基の下流 （Ｎ−Ｃ）側の該当するアミノ酸の位置を表し、ｎは４−１２の整数であり、モ して； ＡＡ、およびＡＡ２は、それぞれ独立に、中性または塩基性であるし一アミノ酸 残基であり、＾Ａ、は−ａＭα−７ミノ基を有し；ＡＡ３およびＡＡ８は、それ ぞれ独立に、塩基性または中性アミノ酸残基であり； ＡＡａおよびＡＡ６は、それぞれ独立に、塩基性または非芳香族アミノ酸類であ り： ＡＡ５およびＡＡ、、は、それぞれ独立に、プロリン残基または小さいアミノ酸 類であり； ＡＡ、およびＡＡ、、は、それぞれ独立に、酸性アミノ酸残基であり； ＡＡ、およびＡＡ、２は、それぞれ独立に、中性／芳香族アミノ酸残基であり、 モして： ２は非干渉性の置換基である。

好ましいＸの実施態様は、３−メルカプトプロピオン酸（Ｍｐｒ）、３−メルカ プト吉草酸（Ｍｖ　ｌ　）、２−メルカプト安息香酸（ｘｂａ＞およびＳ−メチ ル−３−メルカプトプロピオン酸（ＳＭｅＭｐｒ）の残基を包含する。

この抗トロンビン活性化合物のグループの好ましい実施態様は、ＡＡ、およびＡ Ａ２が、それぞれ独立に、Ｉ−ｅｕｓ　Ｖａｌｓ　ＩＩｅｓ　Ｐｈｅ、　Ｃｈａ 、　２−Ｎａ１またはＴｉｃであり；　ＡＡ、およびＡＡ、が、それぞれ独立に 、Ａｒｇ、　Ｌｙｓ、　ＯｒｎまたはＢａｒであり；あるいはＡＡ、およびＡＡ 、が、それぞれ独立に、ＬｙｓＳＡｒｇ、０ｒｎＳＨａｒ、　ＧｌｙＳＧｉｎま たはＡｓｎであり；あるいはＡＡ、およびＡＡＩが、それぞれ独立に、Ｐｒｏま たはＡｌａであり；あるいはＡＡ７およびＡＡ、、が、それぞれ独立に、Ａｓｐ 、　Ｇｌｕ、β−Ａｓｐまたは　β−Ｇｌｕであり；あるいはＡＡ。

２がＰｈｅおよびＡＡ、がＴｙｒであり；あるいはＺがｏｎ（またはエステルも しくは塩の形態’）　、Ｎｌ２またはＮＲ’Ｒ’でそれぞれのＲ′は独立にＨま たは上記のように任意に置換された１−６０の直鎖または分岐鎖のアルキルを包 含する。

特に好ましい実施態様はＸがＭｐｒ、　Ｓ−Ｍｅ　ＭｐｒまたはＭｂａであり、 ＡＡ、がＰｈｅであり、ＡＡ、がＣｈａであり、ＡＡ２がＣｈａであるようなペ グタイド類である。

（以下余白） 特に好ましい実施態様は、遺伝子によってコード化されているＡＡ、　−ＡＡ、 ２であるか、あるいはＡＡ、　−ＡＡ２がそれぞれ独立にＣｈａであり得る。こ のクラスのアンタコ′ニストペプチドの中でＸ−Ｆ　（Ｃｈａｌ　（Ｃｈａ）　 ＲＫＰＮＤＡ−ＮＨ２ｒの中から選ばれ、特にＸがＭｐｒであるようなものであ る。

特に好ましいのは、 Ｍｐｒ−Ｆ　（Ｃｈａ）　（Ｃｈａ）　ＲＮＰＮＤＫ。

Ｎ１（２ である。

上正二二監ヱＵ剋 グループ２）のトロンビン阻害剤は、レセプターと競合してトロンビンと結合す る化合物で、非開裂性および／または高い結合特性を示すものである。これらの 化合物は以下の式で表される： Ｊ−ＡＡメー（ＡＡＩ）。−ＡＡ９−ＡＡ、１Ｉ−ＡＡ、、−ＡＡ、２−ＡＡ、 ３−Ｚ　（３）ここで、Ｊは２−５個のアミノ酸残基のペプチド伸張またはその アシル化されたもしくは脱アミン化されたものである。

上記式（３）の化合物中、ＡＡ、は中性で非極性の大きなアミノ酸残基であり、 環状部分好ましくは芳香族を含んでおり、かつｎは８である。

上記中、ＡＡはアミノ酸残基を表し、下付文字ｉはＡＡνから下流方向に数えた 位置を表す。

上記中、ＡＡ、およびＡＡ２は、それぞれ独立に、中性または塩基性アミノ酸残 基であり； ＡＡ、およびＡＡ、は、それぞれ独立に、中性または塩基性アミノ酸残基であり ； ＡＡ、およびＡＡ６は、それぞれ独立に、塩基性または中性の、非芳香族アミノ 酸類であり； ＡＡ５およびＡＡ、、は、それぞれ独立に、プロリン残基または小さいアミノ酸 類であり； ＡＡ７およびΔＡｌ！１は、それぞれ独立に、酸性アミノ酸残基であＡＡ９およ びＡＡ、□は、それぞれ独立に、中性／芳香族アミノ酸残基であり； ＡＡ、３は芳香族または小さく非極性のアミノ酸残基であり、モして； ２は非干渉性の置換基である。

上記グループ（２）のトロンビン阻害剤ペプチドはトロンビンレセプターの細胞 外鎖を模倣しているがタンノ（り質分解部位を欠き、および／またはトロンビン に対する結合性が高０が、その特に好ましい実施態様は、下流にアニオン性アミ ノ酸残基を含有し、Ｊが４−５個のアミノ酸残基のペプチド伸張であるものであ る。特に好ましいのは、ＡＡのすぐ上流の残基がｐｒｏ−ａｒｇ−ｐｒｏ　（Ｐ ＲＰ）という配列を有し、その配列力く、大きく／非芳香族／非極性／中性アミ ノ酸残基がペプチド結合を介して下流の酸性アミノ酸残基と結合しジペプチド配 列類力）ら選ばれる残基のあとにつづくものである。このジペプチド配夕１ｊの 特に好ましい実施態様は、１ｌｅ−ａｓｐ、　ｖａｌ−ａｓｐｓ　ｉｌｅ−ｇｌ ｕおよび１ｅｕ−ａｓｐであり、特に、Ｊによって表される前記ペプチド（中張 がＬＤＰＲＰ、　ＬＥＰＲＰ、　ＩＤＰＲＰ、　ＩＥＰＲＰ、　ＶＤＰＲＰおよ びＶＥＰＲＰ力）ら選ばれるようなものである。

さらに、ペプチド伸張がすく上流の配列ｐｒｏ−ａｒｇ−ｐｒｏを含有するとき 、上流に更に追加される好まい）伸張はＤアミノ酸である。特に好ましいのは、 大きく／非極性／中性／芳香族であるＤアミノ酸、特にトリプトファンまたはフ ェニルアラニンであり、そして特にフェニルアラニンテアル。

Ｚは好ましくはＯＨ（またはエステルもしくは塩の形態）またはＮＲ’　Ｒ’で 、Ｒ゛は上記のように定義され、ＡＡ、３から下流のレセプター配列を模倣して いるペプチド伸張に任意に続き得るものである。

式（３）の化合物で特に好ましいものは、ＬＤＰＲＰＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰ ＦＷＥＤＥＥＫＮＥＳ　；ＬＤＰＲＰＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ ＮＥ　；ばＰＲＰＦＬＬ囲計ＪＤＫＹＥＰ茨ＤＥＥ謝；ＬＤＰＲＰＦＬＬＲＮＰ ＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫ；　ＬＤＰＲＰＦＬＬ訳ＰＮＤＫＹＥＰ茨ＤＥＥ　 ；ＬＤＰＲＰＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥ；　％よぴＬＤＰＲＰＦＬＬ ＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤ。

ならびにそのアミド化またはアフル化したものから選ばれる。

また好ましいものは、 およびそのアミデート化およびア／ル化したものから選ばれる。

アニオン　部。　ムアンタゴニスト レセプターの結合領域ＹＥＰＦＷを模倣したペプチドを表すアンタゴニストは、 そのグループ３のアニオン伸長（ＥＤＥＥ）を任意に含有しうるが、以下の式で 表される。

Ｂ−ＡＡ９−ＡＡ、ｌｌ−ＡＡ、、−ＡＡ、２−ＡＡ、３−Ｚ　（４）ここで、 ＡＡｇ　、ＡＡｌ２およびＡＡｌ３は、それぞれ独立（こ、中性の芳香族アミノ 酸残基または小さいアミノ酸残基であり、ＡＡＩＩＩは酸性アミノ酸残基であり 、ＡＡ、、はプロリンまた１よｔＪＸさいアミノ酸残基である。ＢおよびＺは非 干渉置換基、典型的にはペプチド伸長であるが、一般的には非干渉有機ラジカル も含有し得る。ＢはＨまたはアシルでも有り得る（該ペプチド伸長が存在すれば それを含む）；ＺはＯＨ（もしく（まそのエステルもしくは塩の形態）またはＮ ＲＴ（該ベブチドイ中長力５存在すればそれも含む）でも有り得、上記したもの である。

式（４）で示される化合物の好まし）形態（よ、ＡＡｇ　、　ＡＡｌ２およびＡ Ａ、　３のそれぞれがｐｈｅ、　ｔｒｐ、　ａｌａまｔコ（まｔｙｒであり；お よびＡＡ、ｌｌがｇｌｕ、　ａｓｐ、β−ｇｌｕまたはβ−ａｓｐである化合物 である。

特に好ましい実施態様は、ＡＡ、・ＡＡ、３がＹＥＰＦＷ、　ＦＥＰＦＷ、　Ｙ ＤＰＦＷ、ＹＥＰＹＷ、　ＹＥＰＦＹ、　ＹＥＰＷＹまたはＷＥＰＦＷである。

Ｚカくペプチド配夕ＩＥＤＥＥ、ＱＤＱＱ、ＥＤＥＱ、ＱＤＥＱ、ＱＤＥＥ、Ｅ ＤＱＥ、ＥＤＱＱまｔこ（まＱＤＱＥを含むことも有り得る。

Ｂの好ましい実施態様は、ＢがＨまたは１−４個のアミノ酸のペプチド伸長もし くはそのアクリル化された形態を含む。

これらのアンタゴニストはトロンビンに対して誘引物として作用し、それゆえト ロンビンの有効濃度を低下させる。

アニオンＦＡ　郡部 トロンビンのアニオン結合外部部位（グループ４）を模倣したカチオンペプチド は、以下の式で表される。

Ｂ−ＡＡ、−ＡＡｌ、−ＡＡｏ−ＡＡａ−ＡＡ、−Ｚ　（５）ここで、Ｂおよび Ｚは上記で定義された通りであり、ＡＡ、およびＡＡ、は、それぞれ独立に、疎 水性アミノ酸または塩基性アミノ酸であり、かつＡＡ、、ＡＡ、およびＡＡ、は 、それぞれ独立に、塩基性アミノ酸である。

式（５）で表される化合物の好ましい化合物は、ＢがアクリルまたはＨを含み； またはＺがＯＨ（もしくはエステルまたは塩）またはＮＲ’Ｒ’を含み、それぞ れのＲ゛は上記で定義され１こものであり；またはＡＡ、およびＡＡ、が、それ ぞれ独立に、ｐｈｅ、　ｔｒｐおよびａｌａから選択され；またはＡＡ、−ＡＡ 、が、それぞれ独立に、ａｒｇ、ｌｙｓおよびｇｌｎからなる群から選択される 化合物、特に、ＡＡ、−ＡＡ、がＷＫＫＫＫ、　ＫＫＫＫＷ、　ＱＫＱＱＷ、ま たはＷＱＫＱＱ配列を有する化合物である。

ＢおよびＺで表される非干渉置換基は更にペプチド伸長でアリ得、該ペプチド伸 長は、トロンビンアニオン結合外部部位の結合パターンと矛盾しない。該ペプチ ド伸長がトロンビンが基質と結合するこの能力を模倣する場合、これらのアンタ ゴニストは、トロンビンレセプタープロティンの関連領域、特に図１で示される 位置５２−６０のＹＥＰＦＷＥＤＥＥ領域、に結合する能力によって作用する。

血止 トロンビンレセプターの重要部分に対して免疫反応性の抗体であるアンタゴニス ト（グループ５）は、適切な哺乳類被験体に免疫処置を施すことによって得られ る。この免疫処置は、抗体によって標的されるように意図されたトロンビンレセ プターの部分を抗原領域として含有するペプチドを用いて行われる。重要な領域 としては、タンパク質分解性の開裂の領域、ＹＥＰＦＷＥＤＥＥボックスでの結 合部位、活性化に重要な細胞外セグメントのセグメント（これは開裂部位を含む ）、および細胞外ループを形成する配列の部分、特に、活性化されたレセプター の細胞外領域のＮ末端と相互作用を起こす領域が挙げられる。本発明のアゴニス トペプチドは、この場合の免疫原として用いられ得る。

（以下余白） 従って、所望の抗体を調製する免疫原として用いるための適切なペプチドとして は、ＹＥＰＦＷＥＤＥＥ領域のＣ末端における２８位から６８位までの細胞外領 域の成熟配列の部分を表すペプチドが包含される。この領域は以下の配列：Ｐ　 ＥＳＫＡＴＮＡＴＬＤＰＲＳＦ　ＬＬＲＮＰ　Ｎ　ＤＫ　ＹＥＰＦＷＥＤＥＥ　 ＫＮＥ　５ＧＬＴＥＹを有し、そして配列ＬＤＰＲ５ＦＬＬ　（この配列は開裂 部位を含む）およびＹＥＰＦＷＥＤＥＥ　（この配列は結合部位を含む）を含む ペプチドは特に有用である。免疫原として有用である他の領域としては、アミノ 酸の１６１−１７６位；　２４０−２６５位；オヨび３３Ｇ−３４６位を表すセ グメントが挙げられる。配列ＹＹＦＳＧＳＤＷＱＦＧＳＥＬＣＲ１ＫＥＱＴＩＱ ＶＰＧＬＮＩＴＴＣ）ＩＤＶＬＮＥＴＬＬＥＧ、およびＨＹＳＦＬＳＨＴＳＴＴ 　ノこれらのペプチドは、それぞれ、提案された細胞外ループを表す。

これらの抗体は、ペプチド性ハブテンを用いた適切な免疫処置のプロトコルに従 って、適切な哺乳類宿主に免疫処置を施すことによって調製される。ペプチド性 ハブテンは、十分な長さである場合は単独で、または免疫原性を増強することが 所望されもしくは必要とされる場合は適切な担体に結合されて用いられる。ＢＳ Ａ、　ＫＬＩ＋、または他の担体タンパク質のような担体を有する免疫原性結合 体を調製するための方法は、当該技術分野において公知である。場合によっては 、例えばカルボジイミド試薬を用いた、直接的な結合が有効であり得る。他の場 合では、結合試薬、例えば、イリノイ州、ロックフォードのＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、にょって供給される結合試薬が、ハブテンへの接近を可能 とするために望まれ得る。ハブテンのペプチドは、Ｃｙｓ残基を用いてアミン末 端またはカルボキシ末端を伸長するか、またはシスティン残基を散在させること によって、例えば、担体への結合を容易にし得る。免疫原の投与は、一般的には 、当該技術分野において一般的に知られているように、適切な時間にわたって注 射し、そして適切な７ジユバントを用いて行われる。免疫処理の期間中、抗体の 力価は、抗体形成が十分かどうかを決定するために利用される。

この方法で生産されるポリクローナル抗血清は、ある種の適用には、十分満足で きるものであり得るが、薬学的な組成物としては、モノクローナルの調製物の使 用が好ましい。所望のモノクローナル抗体を分泌する不朽化された細胞系は、一 般的に知られているように、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎの標準法、あ るいはリンパ球または＃臓細胞の不朽化をもたらす改変法を用いて調製され得る 。所望の抗体を分泌する不朽化された細胞系は、イムノアッセイによってスクリ ーニングされる。この方法では、抗原はペプチド性ノ＼ブテンであるか、または 組換え宿主細胞上に現れたトロンビンレセプターそし自身である。所望の抗体を 分泌する適切な不朽化された細胞の培養物が同定されると、これらの細胞は、イ ンビトロで、または腹水内での生産によって培養され得る。

次いで、所望のモノクローナル抗体は、培養土清液から、または腹水上清液から 回収される。モノクローナルのフラグメントまたはポリクローナル抗血清のフラ グメントは、免疫学的に重要な部分を含有するならば完全な抗体と同様にアンタ ゴニストとして用いられ得る。免疫学的に反応性であるフラグメント、例えば、 Ｆａｂ、　Ｆａｂ’の使用、Ｆ（ａｂ’）２の使用は、特に治療上の情況におい て、しばしば好ましい。なぜなら、これらのフラグメントは、一般的に、全免疫 グロブリンより免疫原性が少ないからである。

これらの抗体またはフラグメントはまた、最新の技術を用いて、組換え法によっ て生産され得る。レセプターの所望の領域に特異的に結合する領域はまた、複数 種の起源のキメラの情況において、生産され得る。

Ｌ肚ｉ良上三Ｚ旦ヱ 前記に加えて、アンタゴニストは、レセプターに対して天然のトロンビンと競合 する、タンパク質分解活性が欠如しているトロンビン変異体（グループ６）を含 む。上記のように、トロンビンのタンパク質分解性の開裂部位における関連部位 としては、Ｂ鎖の２０５位のセリン残基、５７位のヒスチジン残基、および９９ 位のアスパラギン酸残基が包含されることが知られている。トロンビン分子のタ ンパク質分解性を不活性にするこれらの残基の置換体を含有するトロンビンの変 異体は、標準的な部位特異的変異誘発法を用いて調製される。この変異遺伝子を 用い、組換え法を用いて改変トロンビンが製造される。関連する置換体は、天然 の残基を前に有する位置番号、次いで置換された残基によって示される。従って 、アラニンで置換された２０５位のセゾンを有するトロンビンは、５２０５Ａ（ ！：示される。

吐１５Ｊ０糺ｉ様 本発明のアゴニストおよびグループ（１）−（４＞のアンタゴニストの両方では 、アミノ酸配列のある種の好適な実施態様は、ペプチドにおけるアミノ酸が遺伝 子によってコードされたものである。１個、２個、３個またはそれ以上のアミノ 酸残基が遺伝学的にコードされていないアミノ酸で置換されているものも含まれ る。

さらに詳しくは、これらの好適な実施態様では、　ＡＡ、およびＡＡ２の好適な 実施態様は、Ｉｅｕ、　ｖａｌ、またはｉｌｅであり；特にＩｅｕが好ましい。

ＡＡ３およびＡＡ、の好適な実施態様は、ａｒｇまたはｌｙｓであり；特に、Ａ Ａ３がａｒｇであり、そしてＡＡｅがＩｙｓである実施態様が好ましい。ＡＡ、 およびＡＡｓの好適な実施態様は、ｇｌｎまたはａｓｎであり、特にａｓｎが好 ましい。ＡＡ７およびＡＡ、０の好適な実施態様は、ａｓｐまたはｇｌｕであり ；特に、ＡＡ７がａｓｐであり、そしてＡＡＩｏがｇｌｕである実施態様が好ま しい。ＡＡ、２の好適な実施態様はフェニルアラニンであり、モしてＡＡ９の好 適な実施態様はチロシンである。

好ましいアシル基は、式ＲＣＯ−であり、ここでＲは１〜６個の炭素を有する直 鎖または分枝鎖のアルキルを表す。アセチルが、特に好ましい。

本発明の全てのペプチドでは、１個またはそれ以上のアミド結合（、−ＣＯ−Ｎ ｌ（−）は、同配体（例えば、−ＣＨ２ＮＨ−１−ＣＨ３Ｓ−１−Ｃ１１２ＣＢ ２、−Ｃ１ｌ＝Ｃ）Ｉ−（シス型およびトランス型）、−ｃｏｃｎ２−１−ＣＨ （０１１１）　ＣＢ２−１および−ＣＦ［２ＳＯ−）である他の結合と任意に置 換され得る。この置換は、当該技術分野において公知の方法によって行われ得る 。以下の参考文献では、これらの他の結合部分を含むペプチドアナログの調製に ついて述べられている：　５ｐａｔｏｌａ、　Ａ、Ｆ、、ニ■」匿」（１９８３ 年３月）、第１巻、第３号、「ペプチド骨格の改変」　（総説）　；　５ｐａｔ ｏｌａ、　Ａ、Ｆ、、「アミノ酸ペプチドおよびタンパク質の化学および生化学 」、Ｂ、　Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ編、Ｍａｒｃｅｌ　Ｄｅｋｋｅｒ、二ニーヨーク 、２６７頁、（１９８３）　（総説）　；　Ｍｏｒｌｅｙ、　Ｊ、Ｓ、、Ｔｒｅ ｎｄｓ　Ｐｈａｒｍ　Ｓｅｔ　（１９８０）、４６３−４６８頁（総説）　；　 Ｈｕｄｓｏｎ、　Ｄ、、ら、Ｉｎｔ　Ｊ　Ｐｅ　ｔ　Ｐｒｏｔ　Ｒｅ５（１９７ ９）１４：１７７−１８５　（−ＣＦＩ２ＮＨ−１−ＣＨ２ＣＨ２−）；　５ｐ ａｔｏｌａ、＾、Ｆ、、ら、Ｌｉｆｅ　Ｓｅｔ　（１９８Ｂ）　３８：　１２４ ３−１２４９　（−ＣＨ２−Ｓ）；　Ｈａｎｎ、　Ｍ、Ｍ、、ＬＣｈｅｆｆｌＳ ｏｃ　Ｐｅｒｋｉｎ　Ｔｒａｎｓ　！　（１９８２）　３０７−３１４　（−Ｃ Ｈ−ＣＨ−、シス型およびトランス型）；　Ａｌｍｑｕｉｓｔ、　Ｒ，Ｇ、、ら 、Ｊ　Ｍｅｄ　Ｃｈｅｗ（１９８０）２３　：　１３９２−１３９８　（−ＣＯ ＣＨ２−）；　Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−４ｈｉｔｅ、Ｃ，、ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ ｏｎ　Ｌｅｔｔ　（１９８２）　２３＋２５３３　（−ＣＯＣＨ２−）；　５ｚ ｅｌｋｅ、　Ｍ、。

ら、ヨー　Ｃｆｆ　ツバ出願ＥＰ　４５６６５　（１９８２）　ＣＡ：９７：３ ９４０５　（１９８２）（−ＣＨ（ＯＲ）ＣＨ２−）　；　Ｈｏ１ｌａｄａｙ、 Ｍ、Ｗ、、ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ（１９８３）　２４：４４０ １−４４０４　（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；および）Ｉｒｕｂｙ、　Ｖ、Ｊ、。

Ｌｉｆｅ　Ｓｅｔ　（１９８２）　３１：１８９−１９９　（−ＣＨ２−３−） 。

（以下余白） ペプチド性アゴニストおよびアンタゴニストの本発明のペプチド性アゴニストお よびアンタゴニストは、当該技術分野で公知のように、標準的な固相（または液 相）ペプチド合成方法を用いて調製され得る。さらに、これらのペプチドをコー ドするＤＮＡは、市販のオリゴヌクレオチド合成器械を用いて合成され得、かつ 標準的な組換え生産システムを用いて組換え的に生産され得る。遺伝子でコード されていないアミノ酸が含まれるべき場合は、固相ペプチド合成を用いた生産が 必要とされる。

トロンビンレセブ　−の　え 本発明は、組換え細胞の表面に現れるトロンビンレセプターを生産させるための 組換え物質を提供する。これらの組換え法を用いたレセプターの生産は、有用な 診断用試薬を提供する。この試薬は、生物学的サンプル中のトロンビンのレベル を測定するために、またはさらに重要なこととしてＣマ、トロンビン活性に影響 する候補物質をスクリーニングする試薬として用いられる。

この組換え生産では、トロンビンレセプターをコードするＤＮＡ配列（図１に示 されている）、またはその縮重アナログ１よ、以下に示されるような天然配列の 読み出しによって調製されるか、または公知の天然配列の実質的な部分をプロー ブとして用いることによって調製される。ある（１はそれら↓ま標準的な方法を 用いて新たに合成され得る。このＤＮＡは、所望の升ニ質転換された宿主に適切 な発現ベクターに結合され、そして適合性の細胞に形質転換される。これらの細 胞は、トロンビンレセプターをコードする遺伝子の発現に好ましい条件下で培養 され、そして表面にレセプターが現れた細胞が採収される。

診　およびスクリーニング　の　としての　えトロンビンレセブ　−の トロンビンレセプターをコードする組換えＤＮＡの利用により、宿主細胞表面で のレセプターの発現が可能となる。従って、レセプターに結合するアゴニストま たはアンタボニストノ候補の能力を評価するための手段として有用な細胞が提供 される。

容易に行われるアッセイの１つのタイプでは、標識されたトロンビン、トロンビ ンのアゴニストまたは公知の結合アンタゴニストのいずれかとの、アンタゴニス トの候補の競合が、レセプターへの結合に関して試験され得る。レセプターに結 合する公知の標識された物質は、もちろん、合成ペプチドであり得る。種々の濃 度の候補体は、一定の濃度の４ｊＡｔａされたトロンビン、トロンビンのアゴニ ストまたはアンタゴニストと共に供給され、そしてレセプターへの標識物質の結 合の阻害が、公知の方法を用いて評価され得る。

さらに幾分か複雑なアプローチでは、トロンビンによす誘導される応答への候補 体化合物の効果が、下記のように、トロンビンレセプターを組換え的に発現させ る細胞中で、測定され得る。これらの細胞へのトロンビンの効果に関するアッセ イ系としては、カルシウムの可動化および電圧固定（これらは、以下でさらに詳 細に述べられている）が挙げられる。

他の適切なエンドポイントとしては、トロンビンにより誘導されるホスホイノシ トールのターンオーバーおよびアデニルシクラーゼの阻害が挙げられる。これら のアッセイは、アンタゴニストの候補の、単にトロンビンに結合する能力ではな く、レセプターの活性への効果の評価を可能にする。

心　の　、串の診 １つの実施態様においては、組換えトロンビンレセプタータンパク質の利用によ り、レセプターの活性化された形態に免疫特異的である抗体を生産することがで きる。次いでこの抗体は、インビボで活性化されたレセプターの診断用の造影に 用いられ得る。これらの抗体は、組換え的に生産されたレセプターの活性化され た形態に対して、または以下の実施例２に記載されている「新しいアミノ末端」 ペプチドを表すペプチドに対して生産される。生じた抗体、または免疫特異的な そのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、　Ｆａｂ’、Ｆａｂ’　２フラグメントは 、次いで、公知の方法によって検出される標識物質に結合される。これらの標識 物質としては、テクネチウム９９およびインジウム目１または当該技術分野にお いて公知の他の放射活性標識物質を包含する放射性標識物質が挙げられる。イン ビボで注射されると、これらの抗体は、活性化されたレセプターの部位へと向か う。従って、血栓症にががった問題の領域の位置づけを可能にする。

診断の他の実施態様においては、体液中における活性化ペプチドの存在を検出お よび測定することが可能となる。抗体は上記のような活性化ペプチドに対して製 造され、そして標準的なＥＬＩＳＡまたはＲＩＡアッセイに用いられて、過剰量 の活性化ペプチドを、例えば、尿中で検出し得る。

アンタゴニストの禾　および 本発明のアンタゴニストは、血管形成の情況における急激な閉塞または再狭窄の 治療；不安定なアンギナの治療；および心筋梗塞の治療において、治療学的に有 用である。アンタゴニストとして作用する本発明のペプチドは、当該技術分野に おいて公知の全身投与のための通常の処方によって投与される。典型的なこのよ うな処方は、例えば、Ｒｅ５ｉｎ　ｔｏｎ’５−Ｐｈａｒ耐ａｃｅｕｔｉｃａｌ 　５ｃｉｅｎｃｅｓ　、　Ｍａｅｋ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏ、、イースト ン、ペンシルバニア州、最新版中に見い出され得る。

ペプチドの全身投与の好ましい形態としては、注射、典型的には静脈注射が挙げ られる。他の注射の経路、例えば、皮下注射、筋肉内注射、または腹腔的注射も また用いられ得る。

さらに最近では、ペプチドの全身投与の他の手段が工夫されている。このような 手段としては、胆汁の塩またはフシジン酸のような浸透剤、または他の界面活性 剤を用いた経粘膜投与および経皮投与が挙げられる。さらに、腸剤またはカプセ ル化剤として適切に処方されれば、経口投与もまた可能であり得る。

必要とされる投与量の範囲は、アンタゴニストの選択、投与経路、処方物の性質 、患者の疾患の性質、および診察する医師の判断に依存する。しかし、適切な投 与量の範囲は、被験体１ｋｇあたり０、ｌ−１００μｇの範囲である。しかし、 入手可能なアンタゴニストの多様性および種々の投与経路の効果の違いによって 、必要とされる投与量の広範囲の変更が予期され得る。例えば、経口投与は静脈 注射による投与より多くの投与量を必要とすることが予想される。これらの投与 量のレベルにおける変化は、当該技術分野においてよく知られている最適化のた めの標準的な経験的慣用法を用いて調整され得る。

本発明のアゴニストは、創傷の治療において、および線維芽細胞の増殖が有用で ある他の情況において有用である。これらの化合物は、一般的に、軟責、ペース ト、ゲルなどの形態で局所的および／または限局的に投与される。

Ｌ二旦ヱ五 種々のアッセイ系が、トロンビンとそのレセプターとの相互作用、およびその相 互作用への種々の候補アゴニストおよびアンタゴニストの影響を測定するために 用いられ得る。血小板Ｍ集におけるトロンビンレセプターおよびトロンビンの役 割は、血小板凝集法によって直接的に測定され得、またはフィブリンを含む血液 凝固への効果が指標として用いられ得る。さらに、血小板にょるＡＴＰの取り込 みが、測定され得る。

トロンビンレセプターの活性化の測定法として有用なものには他に、トロンビン レセプターを発現することが公知の細胞におけるカルシウムの可動化または電圧 固定アッセイを利用するアッセイがある。これらの後者のアッセイは、トロンビ ンレセプターを発現する組換え細胞において、特に有用である。

ｆ：このアッセイでは、　Ｂａｅｎｚｉｎｇｅｒ、　Ｍ、Ｇ、。

Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　ｍｏｌ　（１９７４）　３）　：１４９−１５５の方法、ま たはＣｈａｒｏ、　Ｉ。

Ｆ、ら、Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　（１９７７）　６３　：１ｔ６６−８７ ３に記載の方法によって、洗浄されたヒト血小板を調製する。凝集を誘導するた めに、約１１−２０ｎのトロンビンまたはＥＣ５ｏの代わりの７ゴニストを用い て、コントロール反応における凝集を刺激する。その結果は、発光血小板凝集法 （ｌｕｍｔａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｒｙ）で観察する。

凝集を刺激するために、トロンビンの代わりに、種々の濃度の候補アゴニストを 用いることもできる。Ｈ集を妨げる能力を評価するためには、候補のインヒビタ ーをトロンビンと共に反応混合物に加える。

２■Ｍのマグネシウムおよび１ｍＭのカル／ラムを有するＴｙｒｏｄｅの修飾さ れた緩衝液（ｐＨ７，４）中に、１０８血小板／１の濃度で、洗浄された血小板 を＠濁させる。トロンビンまたは試験化合物を、６００ｍＭ（７）　ＮａＣ１、 ｌｏｎ＋ＭノＭＥｓ（ｐＨ６，０＞、０．５％）ＰＥＧ　ｆｉ０００緩衝液中に 歩容！（約２０μＬ）で加え、そして血小板懸濁液と共に３７℃で１５分間イン キュベートする。

１弘１箆遷鼓進Ｚ工困二分友：４８０μｍの懸濁液中の上記のように調製された 血小板を、最終濃度約１０ｎＭを得るのに十分な量ノドロンビンを含有する、２ ０μｍのリン酸緩衝生理食塩水に加える。あるいは、代わりのアゴニストがその ＥＣ１ｏの量で加えられる。約２０μｌのＣｈｒｏ＋ｉｏｌｕｍｅ（ｊ′試薬（ Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｆｏｎ、　Ｈａｖｅｒｔｏｖｎ、ペンシ ルバニア州）を加える。凝集を測定すると共に、ＡＴＰの分泌を評価する。これ らの結果は、ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ　ｄｕａｌ　ｃｈａｎｎｅｌ　ｌｕ＋ｔｉａｇ ｇｒｅｇｏ＋ｍｅｔｅｒ　（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉ。

ｎ）での発光および光透過率の変化を独立して測定することによって定量化され る。血小板のＡＴＰの分泌を、発光信号として、発光凝集計中で測定する。トロ ンビンと相互作用を起こすことが推定される候補アンタゴニストは、血小板に加 える前に、室温で５分間、２０μｌのＰＢＳ中でトロンビンと共に予めインキュ ベートする。予め行われるインキュベージコンは、レセプターと直接相互作用を 引き起こすアゴニストまたはアンタゴニストを試験するためには必要ではない。

マイクロタイタープレートを　いた血ハ　゛集アッセイ：９６ウエルのマイクロ タイタープレート中での、洗浄された血小板を用いて測定されるトロンビン仲介 またはアゴニスト仲介血小板凝集を、Ｆｒａｔａｎｔｏｎｉ、　Ｊ、Ｃら、Ａｍ 　Ｊ　Ｃ１１ｎ　Ｐａｔｈｏｌ　（１９９０＞　９４・６１３−６１７に記載の 方法で行った。）＼イブリドーマの上清液、精製されたモノクローナル抗体（Ｍ ｏＡｂ）、またはペプチド性アノタゴニストの、トロンビンレセプターをプロ、 りする能力を、種々の濃度の抗体またはアンタゴニストを用（１て、このアッセ イによって評価した。

フイフ’Ｊ／−ケア’　７ｙ＊（−：１５０ｍＭ（７）ＮａＣ１，２０ｍＭ（７ ）Ｔｒｉｓ（ｐＨ７，４）、１．ＯｍＭノＣａＣｌ２．０．５％のＰＥＧ　６０ ００を含む合計容量３゜０８ｍの溶液中で、３７℃で、フィブリノーゲンの最終 濃度３．３■ｇ／ｍｌで、フィブリノーゲン凝固反応を行う。標準的なＦｉｂｒ ｏｓｙｓｔｅ＋＊’Ｄｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｔｉｇｅｒ（Ｆｔｓｈｅｒ　５ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、スプリングフィールド、二ニーシャーシー州）によって測 定すると、５ｎＭのトロンビンによって、約１０秒間の凝固時間が得られる。

上記のように、フィプラント（ｆｉｂｒａｎｔ）の形成を刺激するためには、ト ロンビンの代わりに候補アゴニストを用い；血餅形成を妨げる能力を試験するた めには、アンタゴニストまたはインヒビターをトロンビンと共に加える。

カルシウムの可動ヒ：トロンビンレセブターをコードするｃＲＮＡを発現する卵 母細胞による、アゴニストにより誘導される”Ｃａ放出の増加を、刊行物に記載 された方法（ＩＮ　Ｉ　Ｉ　ｉａｍｓ。

ＪＡ、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ　（１９８８）　８ ５　：４９３９−４０４３）によって評価した。簡単にいうと、５０μｃ１の” ＣａＣｌ２を含有するカルシウムを含有しないＭＢＳＨ（１０−４０ｍＣ４／ｍ ｇ　Ｃａ；Ａｍｅｒｓｈａｍ）３００μｌ中で３０個の卵母細胞のグループをＲ Ｔで４時間インキュベートすることによって、細胞内のカルシウムブールを標識 する。標識された卵母細胞を洗浄し、次いで、抗生物質を含まないＭＢＳＨ＋Ｉ 中で９０分間インキュベートする。５個の卵母細胞のグループを選択し、それを 、抗生物質を含まない０．５ｍｌ／ウェルのＭＢＳＨＩ＋を含有する２４ウエル の組織培養プレート（Ｆａｌｃ。ｎ　３０４７）中で各ウェルにお（。この培地 は、１ｏ分ごとに除去して新鮮な培地と取り替える。採収した培地をンンチレー ションカウンティングによって分析して、それぞれ１０分間のインキュベージコ ンの間に卵母細胞によって放出されたＪＳＣａを測定する。単位時間あたりの４ ６　Ｃａ放出が安定したベースラインを示すまで、１０分間のインキュベージコ ンを継続する。さらに２回分の１０分間の採収物を得、次いでアゴニストを含む 試験培地を加え、そしてアゴニストにより誘導されるＡ　６　Ｃａの放出を測定 する。

１１１１足：　を個の電極による電圧固定法を用いたこと以外は、本質的に、以 前Ｊｕｌｉｕｓ、　Ｄ、、ら、５ｃｉｅｎｃｅ　（１９８Ｂ＞　２４１＋５５８ −５６３に記載された方法で、トロンビンレセプターをコードするｅＲＮＡを発 現する電圧固定された卵母細胞において、アゴニストにより誘導される内部方向 への塩化物電流を測定する。

以下の実施例は例示を意図するものであり、本発明を限定するものではない。

亙里！Ｌ上 トロンビンレセプターをコードするｃＤＮＡの調製要約すれば、ヒト細胞系ＨＥ Ｌ　（Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ、　Ｔら、ＬＣｌｉｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　 （１９８７）　７９：８５９−８６６）およびＤａｍｉ細胞（Ｇｒｅｅｎｂｅｒ ｇ、　Ｓ、Ｍ　ら、　Ｂｌｏｏｄ　（１９８８）　７２：１９６８−１９７７） をホルボール１２−ミリステート　１３−アセテート（ＰＭＡ）で刺激し、その 後アフリカッメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞内へのマイクロインジェクン ヨンのためにｍＲＮＡを単離した。次に、これらの＋ｅＲＮＡ試料で注入された 卵母細胞を、それらの卵を検出するために細胞性カルシウムの可動性に対してア ッセイした。それらの卵は、それらの表面のＲＮＡによりコードされるトロンビ ンレセプターを発現していた。ｍＲＮＡのサイズによる選択をした後、４０　ｋ ｂのｍＲＮＡ画分をｃＤＮＡライブラリーの調製に使用した。Ｅ、　ｃｏｌｉ内 でクローン化されたプラスミドＤＮＡをインビトロ系においてキャップ化ｃＲＮ Ａ内に変換し、キャップ化ｃＲＮＡを卵母細胞内に注入することにより、ライブ ラリーをアッセイした。陽性クローン内の挿入部分を図１に示されるｃＤＮＡお よび推定アミノ酸配列゛を得るためにシーフェンスした。

更に詳細には、アフリカンメガエル卵母細胞を雌のアフリカッメガエル（狂二二 巨１　ａ　ｅ　ｖ　ｉ　ｓ　）から集め、公知の方法を用いて処理する（Ｃｏｌ ｅｍａｎ、　Ａ、、　Ｈａｍｅｓ、　Ｂ、Ｄおよび旧ｇｇｉｎｓ、　ＳＪｏ、編 、　Ｔｒａｎｓｃｒｉ　ｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ＋　Ａ　Ｐ ｒａｃｔｉｃａｌ　ＡＬ姐吐、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、ｐｐ、２７１−３０２；　 Ｗｉｌｌｊａｍｓ、Ｊ、Ａ　ら、二Ｎａｅｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＬＩＳＡ　（ １９８８ン８５：４９３９−４９４３）　ｏ卵胞細胞を除去するために、卵母細 胞を、カルシウムを倉まない改変型Ｂａｒ　ｔｈ温溶液　ＭＢＳＨ）中１　ｍｇ ／ｍｌのングマ社製ＩＩ型コラゲナーゼを用いて室温で４時間インキュベートし 、次いで、洗浄し、ＭＢＳＩＩＩＩ　（１ｍｇ／ｍｌ　ラン血清アルブミン、ｌ 　ｍｇ／ｍｌ　フィコーノペ＋００　Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｌ／ｍｌス トレプトマイシン、および５０μｇ／＋ｎｌゲンタマイ／ンを含有するＭＢＳＩ （）中で１８°Ｃで−晩中インキコベートした。

Ｄｕ畷ｏｎｔ段階Ｖの卵母細胞を選択し、５０織１の■ＲＮＡでマイクロインジ ェクトして試験した（１０　ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ、　ｐＨ７，０中ｌμｇ／μｍ） ；分泌型アルカリ性ホスファターゼをコードするｃＤＮＡから転写されたｃＲＮ Ａ　（Ｓ、　Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ博士により実大に供与された）　５　ｎｇを 、健全な卵母細胞の選択に対する内部標準として、すべてのｍＲＮＡあるいはｃ ＲＮＡ試料と共に同時注入した（　Ｔａｔｅ。

Ｓ、Ｓ　ら、　ＦＡＳＥＢ　Ｊ　（１９９０）生＋２２７−２３１）。マイクロ インジェクトされた卵母細胞を９６−ウェル培養プレートの個々のウェルにおい てＭＢＳＨＩＩ中で１８℃で４８時間培養した；次いで、卵母細胞−調整培地を 上記（Ｔａｔｅら、（上述））のアルカリ性ホスファターゼ活性に対してアッセ イし、“最高に発現する”卵母細胞を機能性アッセイに対して選択した。

細胞質性ＲＮＡおよびポリＡ＋ＲＮＡを標準的方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ。

Ｊ、ら、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　、１９８９．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ。

ｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）によりＨＥＬ細胞およびＤａ ｍ　ｉ細胞から調製した。Ｓｕｍｉｋａｖａ、Ｋ、ら、Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　 Ｒｅｓ　（１９８２）　１０゜５８０９−５８２２に記載のように、ｔｏ−３０ ％ンヨ糖密度勾配を厳密にかけて遠心分離によりサイズごとにポリＡ＋ＲＮＡを 分画した。

各勾配画分の一定分量をグリオキサールゲル電気泳動によりサイズに対して分析 した。各画分の残渣を２回エタノール沈澱させ、ＲＮＡはｔｏ　ｍＭ　Ｈｅｐｅ ｓ、　ｐＨ７，０中にｌ　μｇ／μｌで溶解した。

各画分の一定分量を上記の卵母細胞系においてトロンビンレセプター活性に対し てアッセイした。

サイズで選択されたｃＤＮＡライブラリーをトロンビンレセプター活性の強い４ 　ｋｂ　ｍｆｉＮＡ画分からＧｕｂｌｅｒおよびＨｏｆｆｍａｎの方法（Ｇｅｎ ｅ　（１９Ｈ）　２５：２６３−２６９）を用いて合成した。ＢｓｔＸｌアダプ ター（Ａｒｕｆｆｏおよび５ｅｅｄ、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ 　ＵＳＡ　（１９８７）■：８５７３−８５７７）に連結後、約３．５　ｋｂあ るいはより大きなｃＤＮＡを、クローニングベクターｐＦＲＯＧ内に連結する前 に、アクリルアミドゲル電気泳動により選択した。ｐＦＲＯＧベクターを、Ｎｏ ｔ　１部位の隣りにまれなカッターのＭｌｕｌの制限部位を挿入するリンカ−を 加えることにより、ｌ）ＣＤＭ６ＸＬ　（Ｃ，５ｐｅｎｃｅｒ　Ｙｏｓｔ、　Ｕ ＣＳＦにより実大に供与されたｐＨ４Ｍ銹導ベクター（Ａｒｕｆｒｏおよび５ｅ ｅｄ（上述）））から誘導した。ｐＦＲＯＧは、ＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼプ ロモーターの転写制御下でｃＤＮＡを配置し、アフリカッメガエルのグロビンの ５−非翻訳領域を含有し、続いてｃＤＮＡ挿入部によりコードされた情報を有す るノ＼イブリ・ｙド■ＲＮＡの合成を指示した。

Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＭＣ１０６１株をエレクトロポレーションによりｃＤＮＡライ ブラリーを用いて形質転換し、１プール当り２０，０００クローンを有する５０ 個のプールをプレートした。モデルクローン、すなわチｐＦＲＯＧ内のセロトニ ンＩＣレセプターｃＤＮＡを運搬するＭＣ１０６１は、内部標準として２０００ 個当りｌクローンに包含された。プラスミドＤＮＡを各プールから調製し、Ｎｏ ｔｌでの消化により直鎖状にした；キャップ化ｃＲＮＡをインビトロで生成しく ＫｒｉｅｇおよびＭｅｌｔｏｎ、　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　＋ｎｏｌ　（１９８７） 　１５５：３９７−４１５）　、上記の卵母細胞系においてトロンビンレセプタ ー活性に対してアッセイした。

電圧固定法および′６Ｃａ遊離アッセイの両方を用いて、すべてのプールをスク リーニングした。最初の５つのスクリーニングされたプールのうち全部がいくら かのトロンビンレセプター活性を示した；　４６Ｃａ遊離アツセイにおいて、ト ロンビン誘導による４５Ｃａ遊離の増加は、２倍から６倍までの範囲である。最 も活性なプールを１プレート当り約２０００クローンで再びプレートし、卵母細 胞系において再スクリーニングした。

スクリーニングされた１０個のプールのうち２個は、トロンビンレセプター活性 に対して陽性であった。これらのうち最も活性なものを１プレート当り３００ク ローンで再びプレートし、そのプールを再スクリーニングした。活性プールの漸 進的選択および下位区分化により、単一クローンを同定した。

３４８０−ヌクレオチドｃＤＮＡ挿入部をｐｓｔｕｅｓｃｒｉｐｔのＸｈｏ１部 位内にサブクローン化した。挿入部の制限断片をＭ１３内１こサブクローン化し た。ｃＤＮＡ配列をジブオキシン−フェンシング法により各方向に２回（コード 領域に対しては３回）決定した。その結果を図１に示す。

図１は、トロンビンレセプター活性ノくり質のヌクレオチド配列および推定アミ ノ酸配列を共に示す。推定シグナル配夕１ｊおよび７つのトランスメンブランス 、？ンを含有する疎水性領域に上線を引いている。シグナルペブチダーゼによる シグナル配列のブロセ／ングの後、おそらくプロリン特異性アルキニル開裂によ る追加プロセシングは、図上で印を付１すた２７および２８の位置のフルキニン 間で起こる。それゆえ、成熟タンパク賀のアミノ末端はＲＰＥＳＫ、　、　、で 始まる。アスパラギン連結が可能である糖結合部位は下線を引き、コンセンサス ポリアデニル化領域は太文字にしである。Ｒａｇ／Ｓａ□での推定のトロンビン レセプター開裂部位もまた印をつけである。

上記のように、図２は、細胞膜におけるトロンビンレセプターの配置図を提供す る。図２に示されるように、無傷の、および不活性化のトロンビンレセプターの アミノ末端の細胞外の伸長は、トロンビンにより開裂され、新しいアミノ末端を さらし、本明細書中で“活性化ペプチド”と称される短いレセプター断片を遊離 する。次いで、新たにさらされたアミン末端は、アゴニストとして機能し、トロ ンビンレセプターの未だ不確定な領域に結合し、そしてそれを活性化する。それ ユニ、トロンビンレセプターは、チモーゲン−酵素の変換ニ類似のメカニズムに より活性化される。それゆえ、７つのトランスメンプラン領域を含有する他のレ セプターのようなトロンビンレセプターは、Ｓ４２／ＦＪ３の天然体Ｎ−末端を 有するそれ自身のりガントを含有する。

トロンビンレセプターをコードするヒトｃＤＮＡを利用することにより、対応す るマウス型を検索することが可能になる。

高い相同性の度合いは、開裂部位および陰イオン性外部部位の結合ドメインに示 される。これらの配列のお互いとの、およびヒルジンの陰イオン性外部部位の結 合ドメインとの相同性が図３に示される。

友と！Ｌ互 ５ｅｔ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒ−Ａｓｎ−ＮＦｔ　５ＦＬＬＲＮ−ＮＨ のムパラメチルベンズヒドリルアミン樹脂塩酸塩（０，５＋＊＋ｓｏ１合成、　 ０．７７　ｉ＋ｅｑ／ｇ、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅ ｒ　ｃｔｔｙ、ｃ＾）　は、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）中のジイソプロ ピルエチルアミノ（ＤＩＥＡ）を中和させ、続いて洗浄し、■−ヒドロキシベン ゾトリアゾールエステルと結合した要求されるアミノ酸を加え、Ａｐｐｌｉｅｄ 　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製の４３１Ａ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｊｚ ｅｒを用いて順序正しく導入した。Ｂｏａ−アミノ酸は次の側鎖の保護を有して いた：　５ｅｒ（ＯＢｚｌ）およびＡｒｇ（Ｔｏｓ）。完全ペプチド樹脂の開裂 をＦＩＦ／アニソール／メチルエチルスルフィド（５６／６／１（Ｖ／Ｖ））で 行い、粗ペプチドを与えた。その粗ペプチドを０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦ Ａ）含有の勾配をかけたアセトニトリル−水を用いてＣＩ８逆相液相クロマトグ ラフィーにより精製した。

因ＭＰ＋３− 生型およびパ　型トロンビンレセプ９−ｃＲＮＡヲる卵　上の“新しいアミノ末 　”ペプチドのアゴニスト活性 野生型トロンビンレセプターｃＲＮＡ　（ＷＴ）　５　ｎｇあるいはアミノ酸置 換Ｒ４１Ａ　（Ｒ４１Ａ）を有する変異型トロンビンレセプターヲ：Ｉ−トスる ｃＲＮＡ　５　ｎｇで卵母細胞にマイクロインジェクトした。表示は、上記のよ うにトロンビンに対するそれと同様である一−４１位でアラニンがアルギニンと 置換する。次ニ、未注入の卵母細胞あるいはトロンビンレセプターｅＲＮＡを発 現スる卵母細胞を４８時間培養し、トロンビンあるいはペプチド誘導４６　Ｃａ 遊離を上記のように測定した。候補アゴニストを飽和濃度で加えた：　２５０　 ｐＭのトロンビンおよび２５μ闇の“新シいアミン末端”ベプｆ　ｌ’　５ＦＬ ＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ　（ＳＦＬ、Ｌペプチド〉。対照ベブｆ　ｌ’　ＦＳＬ ＬＲＮＰ！ＩＤＫＹＥＰＦ　（ＦＳＬＬペプチド）をＩＯｏμＭで加え、応答を 誘起しなかった。表１に示されたデータは、３回反復測定の平均値＋／−ＳＥＭ を示す；これらの結果は、３つ、あるいは４つの別々の実験で得られたデータを 表す。

ＷＴ　”５ＦＬＬ″　へ０７°チ）”　４０　ｐ１４　３２ＷＴ　”５ＦＬＬ” 　ヘｆｊビ　２００　ｐＨ４２Ｒ４１Ａ　トロ〉ジン　０ Ｒ４１Ａ　”；ＦＬＬ”　へｏフ’ｆｊ”　２００　ｊｌＭ　５３アゴニスｌ− ５ＦＬＬペプチドは、未注入の卵母細胞に対して活性を有しない（未掲載）。ア ゴニスト誘導４　Ｓ　Ｃａ遊離よりむしろ電圧固定された卵母細胞内のアゴニス ト誘導内部電流をエンドポイントとして使用したとき、定性的に同一の結果が得 られた。

（以下余白） 寒亘皇−土 ハ　の　ノおよび　集およびマイトゲン　に・する“新しいアミノ末端”ペプチ ドのアゴニス二１皿 洗浄された血小板を調製した。これは、Ｂａｅｎｚｉｎｇｅｒ、　Ｎ、Ｇ。

、　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ　（１９７４＞　３１＋１４９−１５５；　およびＣｈａ ｒｏ、１．Ｆ　ら、ＬＣｌｔｎ　Ｉｎｖｅｓｔ　（１９７７＞　５３：８５５− ８７３に記載されている。アゴニスト誘導応答を上記のように評価した。

１．１０．２０．１００あるいは２００μＭペプチド５ＦＬＩＪＮＰＮＤＫＹＥ ＰＦ“５ＦＬＬ”ペプチド、あるいは２０　ｎＭトロンビンに応答した血小板凝 集を発光血小板凝集針（ｌｕｌｌｉａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ）で測定した。

その結果を図４Ａに示す。

表示の最終濃度の“新しいアミノ末端”ペプチドに応答した血小板ＡＴＰ分泌も 、発光血小板凝集測定法により続いて測定した。その結果を図４Ｂに示す。

図４に示されたデータは、各アゴニスト濃度に対して３回得られた凝集あるいは 分泌の応答を表す実測の軌跡であり、５つ以上の別々の実験において得られた結 果を表す。１００％凝集は、１分で飽和濃度のトロンビンに応答して起こる凝集 として任意に定義される。１００％分泌は、飽和濃度のトロンビンに応答して起 こる最大応答として任意に定義される。′新しいアミン末端”ペプチドは、図に 示されるような両アッセイにおいて、１００μＭ７ｓ度で２０μＭトロンビンと 同等に活性である。

対照ペプチドＦＳＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦおよびＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦは 、　２００μＭという高い濃度では両方とも活性が゛ながった（未掲載）。

追加の測定において、アゴニストペプチドのマイトゲン効果をＣＣ１，−３９細 胞を用いて実証した。線維芽細胞系ＣＣＬ−３９を無血清培地中で静止させ、次 いで、トリチウム標識チミジンの存在下、候補アゴニストで４８時間処理する。

次に、標準方法を用いてＤＮＡへの標識の取り込みを、図５中のｃｐ冒として示 されるＴＣＡ−不溶性活性として測定した。図に示されるデータは、６回反復測 定の平均値のプラスあるいはマイナスの９５％信頼限界を表す。

図に示されるアゴニストは以下の通す：なしく無血清）； １０％胎児ウシ血清（１０％　Ｆｅ２）　；１００　ｎＭ　ａ−トロンビン（ａ −Ｔ）　；配列５ＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ＋７）　ｌ、　１０あるいは１０ ０μＭ７ゴー１４トペプチド（ＮＴＰ）　； １００μＭ“スクランブルされた（ｓｃｒａ＋＊ｂｌｅｄ）″アゴニストペプチ ド、これは、ＦＳにスクランブルされたＮ−末端を有する前ぎ己のもの（アゴニ ストペプチド）である（　ＦＳＬＬ）。

図５に示されるように、１００μＭのＮＴＰは、生育に有意な刺激を与える。ア ゴニストの最初の２残基の位置を単に交換することは、活性の喪失を引き起こす 。それゆえ、アゴニストペプチドは、血小板凝集を刺激し、モして線維芽細胞の 増殖を刺激することに有用であり、傷の治療の応用に有用である。

皿ハ　集アゴニスト 上記の血小板凝集アッセイを用いて、５０％最大凝集を誘起するために必要な種 々のペプチドの濃度を洪１１定した。ＥＣ５＠とじて示される得られた値をマイ クロモル単位で表２１こ示す。

ペフ−＋ｐ　ＥＣｓ。　（μよ４） Ｌ　５ＦＬＬ団ＰにＫＹＥ　６　、６ ２、５ＦＬＬ圏ｐにに６．３ ３、５ＦＬＬＲＮＰＮ　７・６ ８、　Ａｃ−５ＦＬＬＲＮＰＮＤＹＫＥ　不述作９、　Ａｃ−ＦＬＬ圏ＰＮＤＫ ＹＥＰＦ　７９６１０、ＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ　ネジ占千！１４、［３− 子トラしドロアう／４ｔし　］　−ＦＬＬＲ−Ｎ）Ｉ２　１０００１５、５（Ｎ −ＭａＰｈｅｌＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥ　１秀＋ｒｈ２０、　［＋ｘ　しｑ　＋Ｖ ）−ＦＬＬＲ−ＮＨ２２０００２１［２−Ｍｅブ’４−’ｌ　い）　］　−ＦＬ ＬＲ−ＦＪ’）（２１５００２２、（ｌＬ？ｉ７　０ｒｎｌ−ＦＬｕ−ｎ２　Ｗ Ａ２３、［Ｎ−ＭｅＳｅｒｌ−ＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥ　８５０２４−　［Ｄ− ５ｅｒ］−ＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥ　１７２２５、　ＣＦＬＬＲ−ＮＨ２１９３ ，０２６、（Ｓ−ＭｅＣｙｇｌＦＬＬＲＮ−ＮＨ２１２９，２２７、［ｂ−ＡＩ ＪＩ］−ＦＬＩ、Ｒ−ＮＨ２９９２Ｂ、　ＧＦＬＬＲ−Ｎ’Ｈ２７，３ ３１５ＡＬＬ心牙ヰＤ罵　不免Ｉ穫 ３２、　５（Ｄ−ＰｈａｌＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥ　７Ｆ−５古′ｒ１３３　、５ ＬＬＬＲ−Ｎ’Ｈ２杉１を電３４、５ＹｈＬＲ−皿２２８８ ３５、５（Ｎｏ２Ｐｈｅ）ＬＬＲ−Ｎ’Ｈ２２５０３９、５（Ｃｈａ）ＬＬＲ− ＮＨ２１４０４０、Ｓ　（Ｎａ１）　ＬＬＲ−Ｎ’）（２’　２４１　Ｓ（ＯＭ ｅＴｙｒルＬＲ−Ｎ’Ｈ２４６４２、５（ｐｃｌＰｈａｌＬＬＲ−ＮＨ２８４３ 、Ｓ　（Ｔｈｉｌ　ＬＬＲ−聞２７・６４４　、　ＳＦ　（Ｄ−Ｌｅｕｌ　ＬＲ ＮＰＮＤＫＹＥ　／Ｔ　；ｔａｎ４５．５ＦＣＤ−人１ａ）ＬＲ−ＮＨ２Ｔシヨ ′１″Ｆ−４６、５Ｆ（ｂ−Ａ１ａｌＬ鮒−Ｎ１（２ネジ↓ｌｊ電４７、ＳＦ（ 入ｉｂ＋ＬＲＮ−Ｎ′Ｈ２７Ｆ−シレ１４’３−　５ＦＤＬＲ−ＮＨ２Ｔ−’　 牛ｉ４９、　ＳＦ（Ｎ−Ｍ＠ＬａｕｌＬＲ−ＮＨ２〉１ＯＯＯ５０、ＳＦ’！！ Ｉ、ＲＮ−間２４０．５５１　５ＦＡＬＲＮＰＮＤＫＹＥ　２０．７５２、５Ｆ ＷＬＲ−Ｎ’Ｈ２２４ ５３、Ｓ　ＦＦＬＲ−Ｎ′Ｈ２３，４ ５４、５ＦＦＬ升−間２１．５ ５５、　ＳＦ（ＰｈｇルＲ−Ｎ’Ｈ２６，７５６、５ＦＰＬＲ−Ｎ）（２２２ ５７、５ＦＧＬＲ−ＮＨ２９５ ５８、５ＦＲＬＲ−Ｎ）（２７，４ ５９、５ＦＹＬ闇−Ｎ）（２４，９ ６０、ＳＦＦＬＬＲＮ’Ｈ２５，９ ６１、５Ｆ（Ｃｈａ）ＬＲ−ＮＨ２１５６２、５Ｆ（Ｃｈａ）ＬＲＮ−柑２１． ３６３、５Ｆ（Ｔｉｅ）ＬＲＮ−Ｎ’Ｈ２１１３６４，５ＦＬ（Ｄ−Ｌｅｕ）Ｒ ＮＰＮＤＫＹＥ　％禿ｒｔ％６　Ｂ　−Ｓ　Ｆｊａ−■２　１４６　、４７３− 　Ｓ　ＦＬ　（Ｎａ１）　圏−■２　７　、５７４、５ＦＬ（ＣｈａｌＲ−聞２ ６．０７５、　！９Ｆ（Ｃｈａ）　ｆＣｈａｌ圏−間２１．エフロ、５Ｆ（Ｃｈ ａ）（Ｃｈａ）ＬＲＮＰＮＤＫ　５．４７７、５ＦＴ＝ＬＸ３Ｎ−Ｎ′Ｈ２屏シ 訃ｔｌｚ７８、５ＦＬＬ（Ｄ−紅ｇ　ｌ　−Ｎ’ｈ２　””　’（工・人壬牟ｆ ３〕 衷ｍ トロンビン　斉ペプチドによる トロンビン　ハ　活　の 本発明の３つのアンタゴニストペプチドである、ＬＤＰＲＰＦＬＬＲＮＰＮＤＫ ＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫＮＥＳ　（ＬＤＰＲＰペプチド）、１”ＰＲＰＦＬＬＲＮ ＰＮＤＫＹＥＰＦＷＥＤＥＥＫＮＥＳ　（Ｆ“ＰＲＰペプチド）、およびＬＤＰ ＲＰＦＬＬ　（短小化ＬＤＰＲＰペプチド）を、トロンビン誘導血小板活性化を 阻害する能力について試験した。トロンビンを候補となる阻害ペプチドと共に、 ５分間インキュベートし、次いでその混合物を洗浄した血小板に加え、血小板活 性化を発光血小板凝集法によって血小板ＡＴＰ分泌として測定した。上記混合物 は全容１１２０μｍのリン酸緩衝生理食塩水中で、上述の標題「アッセイ」の記 載に記載されるように調製されおよび懸濁された血小板４８０μｌに加えた。候 補ペプチドは、種々の濃度で用いた。この結果を図６Ａ、６Ｂ、および６ｃに示 す。ＡＴＰ分泌は、候補ペプチドの非存在下１０ｎＭ）ロンビンによって発生し た平均蛍光／グナルに対する百分率で表示した。示される図は、３回の反復実験 を行って得られた結果の代表例である。

図６Ａは、ＬＤＰＲＰペプチドに対する結果を示す。これは、約５００ｎＭのＩ ｃ５．を示す。ＬＤＰＲＰペプチドは、開裂部位および推定のトロンビン結合部 位の両方を表す配列を含む。図６Ｂは、短小化ＬＤＰＰＰペプチドに対して得ら れた結果を示す。ＩＣ３ｌｌは、約２００μＭである。

しかし、図６０に示されるように、別の形の推定の開裂部位および推定の結合部 位を含むＦ”ＰｉｌＰペプチドは、約２００ｎＭのＩＣ６＠を示す。従って、こ のペプチドは、ＬＤＰＲＰペプチドまたはその短小化形のいずれよりもより有効 なアンタゴニストである。

実ｍ トロンビンレセプターアンタゴニストペプチドの　＝Ｍ　ｒ−Ｐｈｅ−Ｃｈａ− Ｃｈａ−Ａｒ　−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ−Ａｓ　−Ｌ　５−０）１のムＮ−ａ −Ｂｏｃ−ε−（ＣＩ−ＣＢＺ）−Ｌｙｓ−０−Ｐａｗ−樹脂（０，５＋ｔ＋ｉ ｏｌ、　０．７０ｍｅｑ／ｇ、　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｆ ｏｓｔｅｒ　Ｃ１ｔｙ、　ＣＡ）を出発物質とし、ＢａＯ基をＴＦＡで除去し、 中和して、洗浄した。そして必要なアミノ酸を、ＡｐＨｉｅｄ　Ｂ！ｏｓｙｓｔ ｅｍｓ社製の４３１Ａ　ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒを用いて、１ −ヒドロキシベンゾトリアゾールエステルとして結合することにより、配列に加 えた。ペプチドを樹脂から切断し、実施例３に記載のように逆相クロマトグラフ ィーによって精製した。

類似的に合成した候補ペプチドを、上述の血小板活性化／凝集アッセイにおいて 試験し、トロンビンの存在下に種々の濃度で加えた。活性化または凝集の５０％ 阻害を生じた濃度をＩＣ５Ｂと称し、試験した種々のペプチドに対して、表３に マイクロモル単位で示す。

（以下余白） 表３に示されるように、ロイシンにＣｈａおよびＡｓｎ残基にｔ、ｙＳのような アミノ酸の置換が、アンタゴニスト活性を改良する。

支五匠工 活部トロンビン・・　の生 オリゴヌクレオチド特異的変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、　Ｔ、＾、、う、Ｍｅｔｈ 　Ｅｎｚ　ｍｏｌ　（１９８７）■＋３６７−３８３）を用いて、Ｂｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔＳＫ−プラスミドベクター系（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、　Ｌａ　Ｊｏｌ ｌａ、　ＣＡ）にクローン化すれた天然プロトロンビンｃＤＮＡ噺で、活性部位 の残基の置換５２０５ＡおよびＤ９９Ｎ／５２０５Ａを生成した。ＤＮＡシーク エンスにより確認した後に、トロンビン活性部位および天然プロトロンビンｃＤ ＮＡにおいて所望の変異（類）を有するプロトロンビンのＤＮＡコーディングを 、ｐＢＪ１発現ベクター（ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６由来）　（Ｔａｋａｂｅ、Ｙ 、、ら、Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１９８８）　８：４６６−４７２）に サブクローン化し、ｐＳＶ２ＤにおけるＤＨＦＲ選択マーカーを用いて（Ｓａｂ ｒａｍａｎｉ、　Ｓ、、ら、Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ　（１９’８１）　ｉ ：８５４−８６４）、リボフエクンｇン（１ｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）により（Ｆ ｅｌｇｎｅｒ、Ｐ、、ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　（ １９８７）　８４ニア４１３−７４１７）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦ Ｒ）−マイナスＣｌｌ０細胞に同時トランスフェクトした。安定なトランスフェ クト体を単離し、遺伝子増幅を８０ｎＭメトトレキセート中で行った。

組換えプロトロンビンの生産をＥＬＩＳＡおよびウェスタンプロットにより測定 し、最も高収量のクローンを生育させて、ＭＥＭのα−ヌクレオシド欠乏培地で ２４．０００ｃ＋＊２の表面を有する細胞ｒｒａｃｔｏｒｙＪ　（Ｎｕｎｃ、　 Ｉｎｔｅｒ　Ｍｅｄ社、　Ｎｅｐｅｒｖｉｌｌｅ、　ＩＬ）中で培養した。上記 の培地は、８０ｎＭのメトトレキセート、１００単位／ｌｌのペニシリン、１０ ０μｇ／ｉ＋１のストレプトマイシン、２５＋ｍＭのＨｅｐｅｓ緩衝液、５μｇ ／ｍｌのビタミンに、　０．２ｍｇ／ｌのプロリン、および１０％透析ウシ血清 を含有する。充分に増殖したとき、培地をすべて除去し、全増殖表面をリン酸緩 衝生理食塩水で６回洗浄して、夾雑するウシのプロトロンビンおよびトロンビン を除去し、そして細胞をＭＥＭのα−ヌクレオシド欠乏培地で３６−４８時間培 養した。この培地は、１００単位／ｍｌのペニシリン、ｔｏｏμｇ／ｍｌのスト レプトマイシン、２５ｍＭのＦｌｅｐｅｓ緩衝液、５μｇ／■１のビタミンに、 　０．２ｍｇ／ｉ＋１のプロリン、１μｇ／ｍｌのインシュリン、および５μｇ ／＋ｏｌのトランスフェリンを含有する。

調製培地から遠心分離および濾過によって細胞残渣を取り除き、水で１１に希釈 し、ｌｏｍＭのＴｒｉｓ−１１ｃＩ、　ｐＨ７，４、および２０１Ｍのクエン酸 （最終濃度）にして、１％（ｖ／ｖ）Ｓ−セファロースと４℃で一晩攪拌した。

Ｓ−セファロースビーズを遠心分離によって除去し、調製培地を再濾過し、１％ （ｖ／ｖ）Ｑ−セファロースと４℃で一晩攪拌した。次いで、Ｑ−セファロース を１０ｍ１カラムに採集し、６００＋＋ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ４Ｃ Ｉ、　ｐＨ７，４，０，５％のＰＥＧ６０００で１ｍｌの画分て溶出し、抗ヒト トロンビン抗血清を用いてウェスタンプロットにより同定される組換えトロンビ ンを含む陽性の画分を得た。

陽性の両分をプールし、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、 　ｐＨ７，４，０，５％（７）ＰＥＧ　６０００中ニ５２０５Ａ変異プロトロン ビンが１００μｇ／曽ｌの濃度になるように希釈し、そして既に記載されるよう に（Ｋｒｉｓｈａｓｖａ＋ｅｙ、Ｓ、、ら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅ＋ａ　（１９ ８７）　２６２：３２９１−３２９９）　、プロトロンビナーゼ複合体で１時間 処理した。次いで、ｐＨをＩＭノＦＩＣ１ｒ　７．０＋ｉ：変え、５２０５Ａま た１ｔＤ９９Ｎ／５２０５Ａ変異トロンビン含１ｉ１ｉ＆を約１．０００倍モル 過剰の（ｐ−７ミジノフエニル）−・メタンスルフォニルフルオライド（ＡＰＭ ＳＦ）で処理し、調製物に夾雑し得るＸａ因子および任意のウシトロンビンをＭ ｉＦした。ＡＰＭＳＦはセリン依存性の不可逆的なトロンビンアンタゴニストで あり、これはｐ）１７．０では天然のトロンビンを急速に不活性化するが、ｐＨ ８，０ではその半減期が１０−３秒でしかない。この理由のために、ＡＰＭＳＦ 処理された変異トロンビン調製物のｐＨを、次いで８．０に１５分間変えて、全 ＡＰＭＳＦを除去した。

変異トロンビン含有溶液を、次いでｌＮＨＣｌの添加によりｐＨ６，０に変え、 １％（ｖ／ｖ）Ｓ−セファロースと４℃で一晩攪拌した。このＳ−セファロース を１０ｍｌカラムに採集し、１５０ｍＭのＮａＣ１，１０ｍＭのＭＥＳ、　ｐＨ ６，０で洗浄し、続いて１ｍｉ画分に６０ｈＭのＮａＣｌ、１０■閘のＭＥＳ、 　ｐＨ６，０，０，５％のＰＥＧ　６ＱＱＯで溶出した。陽性の画分を抗ヒトト ロンビン抗血清を用いてウェスタンプロットによって同定し、組換え５２０５Ａ またはＤ９９Ｎ／５２０５Ａ　）ロンピン調製物の濃度および純度をクーマシー および銀で染色した５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって測定した。本研究で用いた変 異トロンビンの調製物は、銀染色５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で均一であった。

（以下余白） 大ｍ フィブリノーゲン　アッセイ フィブリノーゲン凝固活性を、標準のＦｉｂｒｏ　５ｙｓｔｅρ凝固タイ？　− （Ｆｉｓｈｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、　Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ、　ＮＪ ）により、種々のフィブリン濃度でフィブリン凝固を生成するのに必要な時間と して測定した。全てのフィブリノーゲン凝固反応は、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ ０ｆｆｉＭのＴｒｉｓＳｐＨ７，４、ｌｏｍＭのＣａＣｌ２．０．５％のＰＥ０ ６０００中の全容量３００μｌ中で、３７℃で行い、フィブリノーゲンの最終濃 度を３．３Ｂ／ｍｌとした。標準ＷＴおよび組換えＷＴは共に同一の曲線を示し た。例えば、５μＭでは、凝固時間は１０秒である。５２０５ＡおよびＤ９９１ Ｊ／５２０５Ａのいずれも凝固を誘導し得なかった。

太ｍ ハ　ＡＴＰ　必および岐１恋旦叉 洗浄した血小板を上述のように調製し、２！ＩＭのマグネシウムおよび１ｍＭＱ カル／ウムを有する改変したＴｙｒｏｄｅの緩衝液、ｐＨ７，４中で、１０”血 小板／＋ａｌの濃度で懸濁した。血小板の全ての研究は、２０μｍのＣｈ　ｒｏ ｌｌＩｏ　ｌ　ｕｍｅ”試薬（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社 、　Ｈａｖｅｒｔｏｖｎ、　ＰＡ）を有する全容１５００μｌ中で行った。血小 板のＡＴＰ分泌および凝集を、　Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ　ｄｕａｌ−ｃｈａｎｎｅ ｌ　ｌｕ＋ｍｉａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ　（Ｃｈｒｏｎｏｌｏｇ　Ｃｏｒｐｏ ｒａｔｉｏｎ社、　Ｈａｖｅｒｔｏｖｎ、ＰＡ）で１それぞれ蛍光と光透過とに おける変化を測定することにより、個別に定量した。血小板を３００ｒｐＩ１１ で攪拌し、アゴニストを速くかつ均一に分散させた。

５００μｌの血小板を１５分間３７℃で、所望の最終濃度を与えるヨウナ、６０ ０ｍＭ（７）ＮａＣＩ、　１０ｓ１０５Ｍ１７）、　ｐＦ［６，ｏＳＯ，Ｓ％Ｃ ＤＰＥＧ　６０００緩衝液中の希釈された３２０５Ａ貯蔵液１８μｍと、または １８μｍの緩衝液のみとインキュベートシ、次いで天然トロンビン（最終濃度１ ■Ｍ）を投与した。血小板ＡＴＰ分泌および凝集を、トロンビン添加後３０秒間 測定した。血小板ＡＴＰ分泌データは、緩衝液で前処理した血小板に１ｍＭの天 然トロンビンの添加後３０秒で得られた蛍光シグナルとして定義される、最大に 対する百分率として表示した。この結果を図７に示す。各点は３回の反復測定の 平均値を示し、３回の反復実験の典型例である。図示されるように、５２０５Ａ トロンビン濃度が上昇すると、トロンビン誘導血小板分泌の阻害が増加する。同 様の結果が、Ｄ９９Ｎ／５２０５Ａ変異トロンビンを用いて得られた。

さらに測定を行ったところ、４００ｎＭの５２０５Ａ　トロンビンにおいて、天 然トロンビンに比べて、血小板の投与反応の結果が約１１ｏｇ右にシフトするこ とが示された（図８）。この測定では、　６００ｍＭノＮａＣｌ、１０１１Ｍ（ ７）ＭＥＳ、　ｐＨ６，０，０，５％ノＰＥ０６０００緩衝液中で５２０５Ａを 最終濃度４００ｎＭＩ：した５２０５Ａ　１８μ＋、または同量の緩衝液のみ（ 固体系）を、血小板ＳＯＯμｌと、１５分間３７°Ｃでインキュベートした。次 いで、指示した最終濃度のαトロンビンで血小板を刺激し、血小板ＡＴＰ分泌お よび凝集をトロンビン添加後３０秒間行った。示されたデータは、血小板ＡＴＰ 分泌の初速度、特にアゴニスト添加後３０秒以内および凝集が検出される前に生 ずる血小板ＡＴＰ分泌の最大速度を示す。従って、報告された血小板ＡＴＰ分泌 速度によりアゴニスト誘導反応が示されるが、凝集誘導反応は示されない。３回 反復実験から得られた曲線を図５に示す。ここでの任意の１単位は、ＡＴＰ標準 を用いた検量に基づくと、１秒当り放出されるＡＴＰ量の３３ｐｍｏｌｅに相当 する。

さらに実験を重ねたところ、５２０５Ａ　ｌ−ロンピンは天然トロンビンに誘導 される血小板分泌の割合を阻害することが示された。血小板を種々の濃度のＳ　 ２０５Ａとともに予めインキュベートし、次いで天然トロンビン（最終濃度１ｎ Ｍ）で刺激した。凝集により誘導される分泌を妨害するために、本実験での血小 板を最終濃度が２Ｘ１０７血小板／＋＊ｌになるように懸濁し、天然トロンビン を加えた後に攪拌しなかった。この条件下では、血小板は凝集しないが、トロン ビンと反応してＡＴＰを分泌した。

血小板分泌速度は上述の任意の単位で表した。図９は血小板分泌曲線を示し、３ 回反復実験で得られた結果を表す。コントロール曲線（ＯｎＭ　５２０５Ａ　ト ロンビン）で見られる蛍光の減少は本アッセイに特徴的であり、ルンフェラーゼ の最終生産物阻害を表す。

しかし、５２Ｑ５Ａ　）ロンビンは、アゴニストペプチドまたはカルシウムイオ ／フォアでの刺激により血小板に誘導されたＡＴＰ分泌を阻害しない。

（以下余白） 支嵐一旦 隨庄旦且困 トロンビンレセプターアミノ末端伸長の部分を表すペプチドを免疫原として用い 、ポリクローナル抗血清およびモノクローナル抗体を調製した。

ＰＥ５ＫＡＴＮＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬＣヘプチド（開裂部位ペプチド）およびＹ ＥＰＦＷＥＤＥＥＫＮＥＳＧＬＴＥＹＣヘブチト（アニオン外部部位トメインヘ プチド）を用いて、抗体を生産した。これらの抗血清を、上述の血小板活性化７ ノセイにおいて、アンタゴニストとして作用を試験した。いずれもが活性化を阻 害するのに有効であった。アニオン外部部位ドメインペプチドであるＡｂ１０４ ７と免疫反応性のポリクローナル抗体調製物を、トロンビンを加える前に１ｎＭ の濃度で血小板とインキュベートし、血小板を加えた。Ａｂ１０４７を結合する ペプチドすなわち「ペプチド３６ｏ」の添加により、阻害が生じなくなった。ｌ ：１００希釈でのＡｂ１０４７は、血小板の凝集および活性化をほとんど完全に 阻害する。

レセプターの開裂部位および推定アニオン結合外部部位を含むＰＥ５ＫＡＴＮＡ ＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦｌｆＥＤＥＩＪＮＥＳＧＬＴＥＣヘブ チドもまた用いて、モノクローナル抗体を阻害する有効なレセプターを調製した 。この４ｏ残基のペプチドは、天然配列のカルボキシル末端にＣｙｓ残基を付加 されており、チオール特異的試薬である１−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロ キシスルホスクシニミドエステル（Ｓｕｌｆａ−Ｍｉｓ、　Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、）を用いて、Ｃｙｓｔ基によりキーホーシリ／ベットヘモ シア＝　７　（ＫＬＨ）　ニ共有結合した。ペプチド−ＫＬＨ結合体の透析の後 、この物質を用いて、３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫処理した。各マウスから 得られた肺臓細胞をＰ３Ｘ細胞と融合し、ハイブリドーマのパネルを形成した。

これらのハイブリドーマから得られる上清液を、免疫処理に用いた天然の４０残 基ペプチドおよびＥＬＩＳＡアッセイで配列の長さを４ｏ残基に拡げた１５残基 ペプチドと交叉反応する能力についてアッセイした。ＩｇＧ特異的クローンのみ をさらに研究した。ポジティブなハイブリドーマを、マイクロタイタープレート シェーカーアッセイで、トロンビン誘導血小板凝集の阻害の能力について試験し た。最終的に、ポジティブなハイブリドーマを、塩濃度を増加して洗浄した条件 下で、４０残基ペプチドを用いて、ＥＬＩＳＡアッセイで再びアッセイし、見か け上親和性が高い６つのハイブリドーマを選択した。この６つのハイブリドーマ を限界希釈によりサブクローン化し、４−２．１０−６．３Ｉ−２，３３−１， ６トＩ、および６２−５クローンを得た。

各クローンを、腹腔内にマウス当たりｌＸｌ０”細胞を注射することにより腹水 を生産した。ＩｇＧを豊富に含む腹水をプロティンＡ−セファロースを用いて精 製した。これはＩｇＧの治療可能性がＩｇＭよりも太きいからである。これらの 精製モノクローナル抗体のトロンビン誘導血小板凝集の（アゴニストとしてトロ ンビンを用いる）阻害に対する能力を洗浄した血小板で評価して、その結果を表 ５に示す。これらのＭｏＡｂについてのＩＣ５８は、２．５−２０ｕ　ｇ／ｍｌ の範囲の精製１ｇＧを示した。

紅 による　ハ　の且 ＦＩＧ、３ ＦＩＧ、４Ａ 、を宣ｔＪ　時間（Ｗ） ＦＩＧ、　４８　ＦＩＧ、　４Ｃ 聞ｄつ （ｙ、（全科−１メ％）　デ！ｔｄｆｆｉＢ−＋贋（２１転′１メ墜）　・’＃ ”Ｓｃ４工■進・トヅ）−ｏ’＞ピ゛ン ａＥ（Ｐ、’Ｉ（抄少 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，”　識別記号　庁内整理番号ＣＯ７Ｋ　７１０２ ７１０６　８３１８−４Ｈ Ｃ１２Ｎ　１／２１　７２３６−４Ｂ Ｃ１２Ｐ　２１１０２　８２１４−４Ｂ２１１０８　８２１４−４Ｂ ＧＯＩＮ　３３１５３　Ｌ　８３１０−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｎ　１／２１ Ｃ１２Ｒ１：１９） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＦ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、　ＮｉＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、 ＴＧ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、ＬＵ、Ｍ Ｇ、ＭＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、　ＳＤ、ＳＥ ＦＩ （７２）発明者　コウリン、ショーン　アール。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４１３１サンフランシスコ、レイク　フォ レストコート４１ （７２）発明者　スカポロー、ロバート　エム。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４００２ベルモント、ベルモント　キャニ オン ロード　２５４４

Claims (27)

【特許請求の範囲】
1. １．組換え宿主に形質転換された時、宿主の細胞表面でトロンビンレセプターを 生産し得る発現系を含むＤＮＡ分子であって、該発現系が、宿主中で作動可能な 黒種の調節配列に作動可能に連結されたヒトトロンビンレセプターをコードする ＤＮＡ配列を含む、ＤＮＡ分子。
2. ２．請求項１に記載の発現系で形質転換された組換え宿主細胞。
3. ３．細胞表面でヒトトロンビンレセプターを発現する細胞を生産する方法であっ て、該トロンビンレセプターをコードするＤＮＡが発現する条件下で請求項２に 記載の細胞を培養する工程を包含する、方法。
4. ４．候補物質のトロンビンアゴニスト活性を測定する方法であって、以下の工程 を包含する、方法：トロンビンレセプターをコードするＤＮＡを発現する条件下 で培養された請求項２に記載の細胞を該物質の存在下および非存在下でインキュ ベートする工程、および該物質の存在下で該細胞上で生産されたトロンビンレセ プターの活性化の存在、非存在または量を、該物質の非存在下と比較して検出す る工程。
5. ５．トロンビンアンタゴニストとして作用する候補物質の能力を評価する方法で あって、以下の工程を包含する、方法トロンビンまたはトロンビンアゴニストの 存在下、および該候補物質の存在下および非存在下で、トロンビンレセプターを コードするＤＮＡを発現する条件下で培養された請求項２に記載の細胞をインキ ュベートする工程、および該候補物質の存在下および非存在下で該細胞の表面上 でトロンビンレセプターの活性化を測定する工程であって、これによって該候補 物質の存在下の該活性の減少が該候補物質のアンタゴニスト活性を示す工程、ま たはトロンビン、トロンピンアゴニストまたは既知のトロンピンアンタゴニスト の存在下、および該候補物質の存在下および非存在下で、トロンビンレセプター をコードするＤＮＡを発現する条件下で培養された請求項２に記載の細胞をイン キユベートする工程、および 該トロンビン、トロンビンアゴニストまたは既知のトロンビンアンタゴニストの 該細胞の表面への結合を、該候補物質の存在下および非存在下で測定する工程で あって、これによって該候補物質の存在下の該活性の減少が該候補物質のアンタ ゴニスト活性を示す、工程。
6. ６．ヒトトロンピンレセプタータンパク質またはその部分と特異的に免疫反応性 の抗体組成物。
7. ７．請求項６に記載の抗体組成物であって、前記部分がトロンピン−結合部分で あるか、または前記部分がトロンビンプロテアーゼ標的部分であるか、または前 記抗体が、活性化されたトロンビンまたはレセプターと特異的に免疫反応性であ るかまたはトロンビンレセプターの少なくとも一種の細胞外ループと特異的に免 疫反応性であるか、またはトロンビンレセプターの開裂された活性化ペプチドと 特異的に反応性である、抗体組成物。
8. ８．活性化されたトロンビンレセプターをインシトゥに局在化する方法であって ： 活性化されたトロンビンレセプターを持つ被験体に、該活性化されたレセプター に特異的な抗体が、該活性化されたレセプターに結合するのに有効な量を投与す る工程、および該抗体の位置を検出する工程 を包含する方法。
9. ９．哺乳類の被験体における血栓症の診断方法であって、以下の工程を包含する 、方法： 該被験体の生物学的流体の試料をトロンビンレセプターの開裂された活性化ペプ チドの存在、非存在または量を測定する検出系と接触させる工程：および 該開裂されたペプチドの存在、非存在または量を検出する工程。
10. １０．トロンビンレセプターを活性化し得るペプチドであって、以下の式で表さ れる、ペプチド：ＡＡｘ−ＡＡｙ−（ＡＡｉ）ｎ−Ｚ（１）ここで、ＡＡｘは、 小さなアミノ酸またはトレオニンであり、そしてＡＡｙは、中性／非極性／芳香 族アミノ酸残基または中性／非極性／大きな／環状部分を含む非芳香族アミノ酸 であり；ここで、ＡＡは、アミノ酸残基を表し、そして添え字ｉは、式（１）の ＡＡｙ残基の下流（Ｎ→Ｃ）の指示するアミノ酸残基の位置を表示する整数であ り、そしてｎは２〜１２の整数であり；ただし、ｎ＝２のとき、Ｚは式ＮＲ′Ｒ ′であり、ここで少なくとも一種のＲ′は少なくとも一種の極性置換基を含むア ルキル（１−６Ｃ）であり； ＡＡ１は、レ−立体配置で遊離のα−アミノ基を持つ中性または塩基性アミノ酸 であり； ＡＡ２は、Ｌ−立体配置で中性または塩基性アミノ酸であり；ＡＡ３−ＡＡ１２ は、Ｌ−アミノ酸残基であり；そしてＺは非干渉性の置換基である。
11. １１．ＡＡｘがｓｅｒ，ａ１ａ，ｇＩｙまたはｔｈｒであるか、またはＡＡ１お よびＡＡ２が中性／非極性／大きなアミノ酸であるか、またはＡＡ３およびＡＡ ８が存在しそしてそれぞれ独立してＡｒｇ，Ｌｙｓ，ＨａｒまたはＡｌａである か、またはＺがＯＲ′またはＮＲ′Ｒ′を含有し、ここで各Ｒ′が独立してＨで あるかまたは１−６Ｃの直鎖または分枝した鎖のアルキルであって、各Ｒ′が、 −ＯＲ′、−ＮＲ′Ｒ′、および−ＮＲ′ＣＮＲ′ＮＲ′Ｒ′からなる群から選 択される一種またはそれ以上の置換基で任意に置換され得る、ここでＲ′がＨで あるかまたは１−６Ｃの直鎖または分枝した鎖のアルキルである、請求項１０に 記載のペプチド。
12. １２．ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥ；ＳＦＬＬＲＮＰＮＤＫ；ＳＦＬＬＲＮＰＮ； ＳＦＬＬＲＮＰ；ＳＦＬＬＲＮ；ＳＦＬＬＲ；ＧＦＬＬＲ；ＴＦＬＬＲＮＰＮＤ Ｋ；Ｓ（ｐＣｌＰｈｅ）ＬＬＲ；Ｓ（Ｔｈｉ）ＬＬＲ；ＳＦＦＬＲ；ＳＦＦＬＲ Ｎ；ＳＦ（Ｐｈｇ）ＬＲ；ＳＦＬ（ＮａＩ）ＲＮ；ＳＦＬ（Ｃｈａ）Ｒ；ＳＦ（ Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮ；ＳＦ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＬＲＮＰＮＤＫ；ＳＦＬＬ ＫＮ；ＳＦＬＬ（Ｈａｒ）ＮＳＦＬＬＫＮ；ＳＦＦ（Ｃｈａ）ＡＮ；ＳＦ（Ｃｈ ａ）（Ｃｈａ）ＲＫ；およびそれらのアミデート型からなる群から選択される、 請求項１０に記載のペプチド。
13. １３．インビボでトロンビンの作用を阻害し得るペプチドであって、以下の式で 表される、ペプチド：Ｘ−ＡＡｙ−（ＡＡｉ）ｎ−Ｚ（２） ここで、Ｘはｓｃｒ，２ｌａ，ｔｈｒ，ｃｙｓまたはｇｌｙ以外のアミノ酸残基 であるかまたは脱アミノ化またはアシル化アミノ酸であり、 ここで、ＡＡｙは中性、非極性、環状部分を含む大きなアミノ酸部分であり、そ して ここで、ＡＡはアミノ酸残基を表しそして添え字ｉは、式（２）のＡＡｙ残基の 下流（Ｎ→Ｃ）の指示するアミノ酸残基の位置を表示する整数であり、そしてｎ は４〜１２の整数であり；そしてここで、ＡＡ１およびＡＡ２はそれぞれ独立し て中性または塩基性Ｌ−アミノ酸残基であり、ＡＡ１は遊離のα−アミノ基を有 し； ＡＡ３は、塩基性または中性アミノ酸残基であり；ＡＡ４は、塩基性または非芳 香族中性アミノ酸であり；そして Ｚは、非干渉性の置換基である。
14. １４．ＸがＭｖｌ，Ｍｐｒ，Ｍｂａ，またはＳＭｅＭｐｒであるか、またはＡＡ ｙが芳香族であるか、またはＡＡ１およびＡＡ２がそれぞれ独立してＬｅｕ，Ｖ ａｌ，ｌｌｅ，Ｃｈａ，ＮａｌまたはＴｉｃであるか、またはＡＡ３、およびＡ Ａ８が存在するときそれぞれ独立してＡｒｇ，Ｌｙｓ，ＯｒｎまたはＨａｒであ るか、またはＡＡ４およびＡＡ６が存在するときそれぞれ独立してＬｙｓ，Ａｒ ｇ．Ｇｌｙ，Ｇｌｎ，Ａｓｎ，ＯｒｎまたはＨａｒであるか、またはＡＡ７およ びＡＡ１０が存在するときそれぞれ独立してＡｓｐ，Ｇｌｕ，β−Ａｓｐまたは β−Ｇｌｕであるか、またはＡＡ１２が存在するときはＰｈｅでありそしてＡＡ ９が存在するときはＴｙｒであり、またはＺがＯＨまたはそのエステルまたは塩 、またはＮＲ′Ｒ′を包含し、ここで各Ｒ′が独立してＨまたは１−６Ｃの直鎖 または分岐した鎖のアルキルであり、各Ｒ′が−ＯＲ′、−ＮＲ′Ｒ′、および −ＮＲ′ＣＮＲ′ＮＲ′Ｒ′からなる群から選択される一種またはそれ以上の置 換基で任意に置換され得、ここで各Ｒ′がＨであるかまたは１−６Ｃの直鎖また は分岐した鎖のアルキルであり、またはＺが１−５個のアミノ酸残基のペプチド 伸長部を含有する、請求項１３に記載のペプチド。
15. １５．ＸＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰＦ；ＸＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹＥＰ；ＸＦＬＬ ＲＮＰＮＤＫＹＥ；ＸＦＬＬＲＮＰＮＤＫＹ；ＸＦＬＬＲＮＰＮＤＫ；ＸＦＬＬ ＲＮＰＮＤ；ＸＦＬＬＲＮＰＮ；ＸＦＬＬＲＮＰ；ＸＦＬＬＲＮ；ＸＦＬＬＲ； ＸＦＬＬ；ＸＦＬ；Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮＰＮＤＫ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ ）（Ｃｈａ）ＲＮＰＮＤＫＹ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮＰＮＤＫＹＥ， Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮＰＮＤＫＹ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮ ＰＮＤＫ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮＰＮＤ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ ）ＲＮ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＡＰＮＤＫ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ ）ＲＧＰＮＤＫ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＫＰＮＤＫ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ） （Ｃｈａ）ＲＮＡＮＤＫ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮＰＡＤＫ，Ｘ−Ｆ（ Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＮＰＮＤＡ，Ｘ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＫＰＮＥＫ， およびＸ−Ｆ（Ｃｈａ）（Ｃｈａ）ＲＸＰＮＤＡ；およびそのアミデート化また はアシル化型からなる群から選択される、請求項１４に記載のペプチド。
16. １６．以下の式を有するペプチドであるトロンビンインヒビター； Ｊ−ＡＡｙ−（ＡＡｉ）ｎ−ＡＡ９−ＡＡ１０−ＡＡ１２−ＡＡ１３−Ｚ（３） ここで、Ｊは２−５個のアミノ酸残基のペプチド伸長部またはそのアシル化また は脱アミノ型であり；ＡＡｙは、環状部分を含む中性の非極性の大きなアミノ酸 であり； ｎは８であり； ＡＡは、アミノ酸残基であり、そして添え字ｉはＡＡｕからの下流の位置を示す 整数であり； ＡＡ１およびＡＡ２は、それぞれ独立して中性または塩基性のレ−アミノ酸残基 であり； ＡＡ３およびＡＡ８は、それぞれ独立して中性または塩基性のアミノ酸残基であ り； ＡＡ４およびＡＡ８は、それぞれ独立して塩基性または中性非芳香族のアミノ酸 であり； ＡＡ５およびＡＡ１１は、それぞれ独立してプロリン残基または小さなアミノ酸 であり； ＡＡ７およびＡＡ１０は、それぞれ独立して酸性アミノ酸残基であり； ＡＡ９およびＡＡ１２は、それぞれ独立して中性／芳香族アミノ酸残基であり； ＡＡ１３は、芳香族アミノ酸残基または小さな非極性のアミノ酸残基であり；そ して Ｚは非干渉性の置換基である。
17. １７．前記Ｊで表されるペプチド伸長部がそのＣ−末端部で配列ＰＲＰを包含す るか、またはＪがペプチド結合を介して酸性アミノ酸残基に結合した大きな／非 芳香族／非極性／中性アミノ酸残基を包含するＮ−末端配列を含むか、またはＡ Ａ７およびＡＡ１０がそれぞれ独立してＡｓｐ，Ｇｌｕ，β−Ａｓｐまたはβ− Ｇｌｕであるか、またはＡＡ１２がＰｈｅでありそしてＡＡ９がＴｙｒであるか 、またはＡＡ１３がＴｒｐであるか、またはＺがＯＨまたはそのエステルまたは その塩、またはＮＲ′Ｒ′を包含し、ここで各Ｒ′が独立してＨであるかまたは １−６Ｃの直鎖または分岐した鎖のアルキルであり、各Ｒ′が−ＯＲ′、−ＮＲ ′Ｒ′、および−ＮＲ′ＣＮＲ′ＮＲ′Ｒ′からなる群から選択される一種また はそれ以上の置換基で任意に置換され得、ここで各Ｒ′がＨであるかまたは１− ６Ｃの直鎖または分岐した鎖のアルキルである、請求項１６に記載のペプチド。
18. １８．インビボでトロンビンの作用を阻害し得るペプチドであって、以下の式で 表される、ペプチド：Ｂ−ＡＡ９−ＡＡ１０−ＡＡ１１−ＡＡ１２−ＡＡ１３− Ｚ（４）ここで、ＢおよびＺは非干渉性の置換基であり、そしてＡＡ９、ＡＡ１ ２およびＡＡ１３はそれぞれ独立して中性／芳香族または小さいアミノ酸残基で あり、ＡＡ１０は、酸性アミノ酸残基であり、そしてＡＡ１１はプロリンまたは 小さいアミノ酸残基である。
19. １９．請求項１８に記載のペプチドであって、ＢがＨまたはアシルであるか、ま たはＢが１−４個のアミノ酸のペプチド伸長部を包含するか、またはＺがＯＨま たはそのエステルまたは塩、またはＮＲ′Ｒ′を包含し、ここで各Ｒ′が独立し てＨであるかまたは１−６Ｃの直鎖または分岐した鎖のアルキルであり、各Ｒ′ が−ＯＲ′、−ＮＲ′Ｒ′、および−ＮＲ′ＣＮＲ′ＮＲ′Ｒ′からなる群から 選択される一種またはそれ以上の置換基で任意に置換され得、ここで各Ｒ′がＨ であるかまたは１−６Ｃの直鎖または分岐した鎖のアルキルであるかまたはＡＡ １３がＰｈｅ，ＴｒｐまたはＡｌａであるか、またはＺが配列ＢＤＥＥ，ＱＤＱ Ｑ，ＥＤＥＱ，ＱＤＥＱ，ＱＤＥＥ，ＥＤＱＥ，ＥＤＱＱまたはＱＤＱＥを含む 、ペプチド。
20. ２０．インビボでトロンビンの作用を阻害し得るペプチドであって、以下の式で 表されるペプチド：Ｂ−ＡＡａ−ＡＡｂ−ＡＡｃ−ＡＡｄ−ＡＡｅ−Ｚ（５）こ こで、ＡＡａおよびＡＡａはそれぞれ独立して疎水性アミノ酸または塩基性アミ ノ酸であり、そしてＡＡｂＡＡｏおよびＡＡｄのそれぞれは独立して塩基性アミ ノ酸または大きな／極性／非芳香族アミノ酸であり、そしてＢおよびＺは非干渉 性の置換基である。
21. ２１．請求項２０に記載のペプチドであって、ＢがアシルまたはＨであるか、ま たはＺがＯＨまたはそのエステルまたは塩、またはＮＲ′Ｒ′を包含し、ここで 各Ｒ′が独立してＨであるかまたは１−６Ｃの直鎖または分岐した鎖のアルキル であり、各Ｒ′が−ＯＲ′、−ＮＲ′Ｒ′、および−ＮＲ′ＣＮＲ′ＮＲ′Ｒ′ からなる群から選択される一種またはそれ以上の置換基で任意に置換され得、こ こで各Ｒ′がＨであるかまたは１−６Ｃの直鎖または分岐した鎖のアルキルであ るか、またはＡＡａおよびＡＡｏがそれぞれ独立してＰｈｃ，ＴｒｐおよびＡｌ ａから選択されるか、またはＡＡｂ−ＡＡｄがそれぞれ独立してＡｒｇＬｙｓお よびＧｌｎからなる群から選択されるか、またはＡＡａ−ＡＡｏが配列ＷＫＫＫ Ｋ，ＫＫＫＫＷ，ＱＫＱＱＷ，またはＷＱＫＱＱを有する、ペプチド。
22. ２２．５７位および／または９９位および／または２０５位が野生型トロンビン ｂ鎖と異なる、組換え的に生産される変異トロンビン。
23. ２３．組換え宿主に形質転換されるとき、該宿主において請求項２２に記載のト ロンビンを生産し得る発現系を含有するＤＮＡ分子であって、該発現系が該宿主 において作動可能な異質の調節配列に作動可能に連結された請求項２２に記載の トロンビンをコードするＤＮＡ配列を含有する、ＤＮＡ分子。
24. ２４．請求項２３に記載の発現系で形質転換される、組換え宿主細胞。
25. ２５．５７位および／または９９位および／または２０５位が野生型トロンビン ｂ鎖と異なる、組換え的に生産される変異トロンビンを生産する方法であって、 発現に好適な条件下で請求項２４に記載の細胞を培養する工程、および 該培養からトロンビンを回収する工程を包含する、方法。
26. ２６．創傷治療に有用な薬剤組成物であって、請求項１０に記載のペプチドの有 効量を、少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤との混合物で含有する、薬 剤組成物。
27. ２７．望まれないトロンビン活性により仲介される状態の治療に有用な薬剤組成 物であって、請求項１３または１６に記数のペプチドまたは請求項６に記載の抗 体組成物を、少なくとも１種の薬学的に受容可能な賦形剤との混合物で含有する 、薬剤組成物。