JPH06509472A - 核酸の新規の塩基配列決定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸の新規の塩基配列決定方法 技術分野 本発明は、核酸の非放射能塩基配列決定法に関する背景技術 ＤＮＡの塩基配列決定に関しては、一般に２つの方法が知られている。すなわち マクサム（Ｍａｘａｍ）及びギルバート（Ｇ１１ｂｅｒｔ）による化学的分解法 （Ａ］］ａｘａａ＋及びＷ、Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ ａｄ、　Ａｃｉ、　ＵＳＡ　７４　（１９７７）　、５６０及びＡ、　Ｍ、Ｍａ ｘａｍ及び１１．　Ｇ１１ｂｅｒｔ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ 、６５　（１９８０）　、４９９）及び酵素的鎖切断法（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒ　 ｅｔ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４　（ １９７７）　、５４６３−５４６７）である。

マクサム・ギルバート法の場合には、標識したＤＮＡ分子を塩基特異的に化学修 飾し、部分的な鎖の切断を行い、このようにして得られた断片を長さに応じて分 離し、標識により塩基配列を決定する。

サンが−（Ｓａｎｇｅｒ）による方法の場合には、ＤＮＡの鋳型から出発して、 ポリメラーゼ及びデオキシリポヌクレオシド三燐酸及び鎖切断分子の混合物、特 にジデオキシリボヌクレオシド三燐酸を用いて合成オリゴヌクレオチドブライマ ーを酵素的に伸長（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）又は延長（Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）す ることによって多数の異なる長さの標識核酸断片を調製する。この場合通常は４ 種の被検液においてそれぞれ、特定のデオキシリボヌクレオシド三燐酸（ｄＮＴ Ｐ）と相応のジデオキシリボヌクレオシド三燐酸（ｄｄＮＴＰ）との混合物を、 他の３種のデオキシリボヌクレオシド三燐酸と一緒に使用する。このようにして 成長する核酸鎖中への端切断分子の統計的挿入が達成され、端切断分子の挿入後 は遊離３’　−ＯＨ基の欠如のためにＤＮＡ鎖はもはや成長することができない 。従って、統計的に見ると、少なくともすべての可能な挿入部位に端切断分子を 有し、そこに末端を有する種々の長さのＤＮＡ断片が多数束じる。端切断分子の 挿入によりそれぞれ特異的に一つの塩基で終うている断片を含むこれら４種の被 検液は、それらの断片の長さに応じて、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動 によって通常４つの異なるバンドに分離され、これらの核酸断片の標識により塩 基配列が確定される。

１９８６年頃まではＤＮＡの塩基配列決定は、放射能（ｓｇｐ−又は３５Ｓ−） 標識を用いて行つた。断片のゲル電気泳動による分離及びヌクレオチド配列のオ ートラジオグラフィーは、用手的又は半自動的に行った。今日、ＤＮＡの塩基配 列決定は、非放射性標識、特に蛍光標識を使用する自動装置を用いて行う（Ｌ、 Ｍ、　Ｓｍ１ｔｈｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕｒｐ　３２１　（１９８６）　、　６ ７４　−６７９　：　１．　Ａｎｓｏｒｇｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｊ、　Ｂｉｏｃｈ ｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、　菖ｅｔｈ、１３　（１９８６）　、３１５−３２３） 、このような自動装置の場合には、ヌクレオチド配列は標識断片の分離の間に直 接読みとられ、コンピューターにインプットされる。

現在、鎖切断法によるＤＮＡの塩基配列決定のためには、２種類の非放射性標識 系が使用されている。核酸断片の標識の手段は、伸長反応のために標識オリゴヌ クレオチドブライマーを使用することであり、その結果核酸鎖はその５′末端に 標識を有する。他の手段は、標識されたターミネータ−１すなわち端切断分子を 使用することであり、この場合には従って核酸鎖はその３′末端に標識を有して いる。プローバー（Ｐｒｏｂｅｒ）等の論文（Ｓｃｉｅｎｃｅ　２３８　（１９ ８７）　３３６−３４１）には、４種の鎖終結ｄｄＮＴＰがそれぞれ異なる蛍光 色素に結合されていて、その結果すべての４種の塩基配列決定被検液が単一のゲ ルレーン（Ｇｅ１ｓｐｕｒ）上で分離されつる方式の塩基配列決定法が記載され ている。４種類の標識プライマーを用いる類似方法は、英国特許出願公開第２１ ５５１７６号明細書に記載されている。

しかし、上記の２種の方法の場合には、単一の標識しか測定すべき核酸鎖中に導 入されず、そのために感度に難点の生じるおそれがある。色素標識オリゴヌクレ オチドブライマーを使用する場合、特に“ウオーキング・プライマー（ｔａｌｋ ｉｎｇ　Ｐｒｉｍｅｒ）　”戦略の場合の他の欠点は、塩基配列決定反応ごとに 異なるプライマーを使用しなければならないが、この際標識プライマーの調製は 極めてコスト高であり又は／かつ費用がかかることである。さらに標識プライマ ーを使用することによってプライマーと核酸鋳型とのハイブリッド形成が幾度も 阻害され、その結果不正確な塩基配列決定が行われる可能性がある。

また、色素標識ターミネータ−１特にジデオキシリボヌクレオシド三燐酸の使用 も、満足すべきものではないことが判明した。このような標識ターミネータ−は ポリメラーゼによって基質としては不利にしか受容されないので、該ターミネー タ−を高濃度（１１ｍｏｌの範囲）でかつ高精製の形（未標識分子からの定量的 分離）で反応液に加えなければならない。このために、標識ターミネータ−の使 用は極めてコスト高であるという結果になる。さらに例えば標識プライマーを使 用する場合に得られる成績よりも一層不良な成績が得られる。

発明の開示 従って本発明の課題は、従来技術の欠点が少な（とも部分的に除去されている、 核酸の塩基配列決定法を提供することであった。

本発明の課題は、 （ａ）異なる鎖長を有する標識核酸断片の混合物を調製し、 （ｂ）　ａｌｌ識核酸断片を大きさにより分離し、（Ｃ）　核酸の塩基配列を個 々の断片の標識により決定する ことによって核酸の塩基配列を決定するに当り、非放射性標識系を有するデオキ シリボヌクレオシド三燐酸の挿入によって標識されている核酸断片を測定するこ とを特徴とする、核酸の塩基配列決定方法によりて解決される。

本発明方法による塩基配列決定は、マクサム及びギルバートによる化学的切断法 でも、サンガーによる酵素釣鐘切断法によっても行うことができる。両方の場合 とも、“内部”標識として、１種の放射性標識系を有する少なくとも１個のデオ キシリボヌクレオシド三燐酸を含有する、異なる鎖長を有する非放射性標識核酸 断片の混合物が得られる。一般に、本発明方法はＤＮＡの塩基配列決定のすべて の公知の実験計画案において（例えば固相塩基配列決定の場合にも）適用されう ることが確認される。

非放射性標識系としては、例えば金属、核共鳴又は超電気伝導量子干渉測定検出 器［５ｕｐｒａｌｅｉｔｅｎｄｅｒ　ｑｕａ−ｎｔｅｎ　−ｉｎｔｅｒｆｅｒｏ ｍｅｔｒｉｓｃｈｅｒ　Ｄｅｔｅｋｔｏｒ　（Ｓ　Ｑ　Ｕ　Ｉ　Ｄ）］によって 検出可能の磁気標識系、燐光色素又は蛍光色素が適当である。特に、蛍光色素、 例えばローダミン、チクサスロート、フィコエリトリン又はフルオレセイン及び その誘導体が好ましい。特に、６００〜８００ｎｍの範囲で吸収を示すような蛍 光色素が好ましい。多数の適当な色素の例は、モレキュラー・ブローベス社（Ｆ ｉｒｉａ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｐｒｏｂｅｓ）のカタログ中に見出すことがで きる。

標識されたデオキシリボヌクレオシド三燐酸の場合には、標識は好ましくはリン カ−を介して、ピリミジン塩基（ウラシル、チミン又はシトシン）の０５位又は プリン塩基（アデニン、チミン又はシトシン）のＮ７位又はＣ８位又はプリン塩 基（７−ジアザグアニジン）の０７位に結合されている。リンカ−鎖中の原子数 は、一般には１〜５０、好ましくは４〜２４、特に好ましくは１０〜１８である 。

標識ｄＮＴＰの使用は、すでにドイツ国特許出願公開第３８４１５６５号明細書 において望ましいとして提案された。しかしこの時点では、適当な化学物質も使 用できなかったし、またこれらの物質が塩基配列決定反応、特に自動塩基配列決 定反応で適当な基質として有利であるかどうかも知られていなかった。

意外にも、ベーリンガー・マンハイム（カタログＮ０１３７３２４２）から商業 的に得られるフルオレセイン標識ｄＵＴＰ　（フルオレセイン−１２−２’　− デオキシウリジン−５′−三燐酸又はフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰが好適で あることが判明した。フルオレセイン−１２−ｄＴＴＰは本発明方法ではｄＴＴ Ｐの代りに又はｄＴＴＰと一緒に使用することができる。

さらに、フルオレセイン−１２−２’−ｄＣＴＰ、フルオレセイン−１５−２’ 　−ｄＧＴＰ及び特にフルオレセイン−１５−２’　−ｄＡＴＰも好適な標識ｄ ＮＴＰであることが判明した。

本発明方法の場合には、−被検液当り唯一種の標識ｄＮＴＰを使用してもよいし 又は数種の標識ｄＮＴＰを同時に使用することもできる。数種の標識ｄＮＴＰの 同時的使用によって一鎖中の標識ヌクレオチドの数が著しく増大されうる。その ために例えば、塩基配列を決定すべき出発試料が極めて低濃度でしか使用されな い場合に有利である。

本発明方法をマクサム及びギルバートの化学的分解法により行う場合には、塩基 配列を決定すべき核酸中に標識を導入する種々の手段がある。

一つには例えば標識は、ポリメラーゼ、塩基配列を決定すべき鋳型としての核酸 及びその少なくとも１種が標識系を有する４種のすべてのデオキシリボヌクレオ シド三燐酸の存在でオリゴヌクレオチドブライマーを酵素により伸長することに よって導入することができる。この場合にはプライマーの伸長によって、標識系 を有する相補釣鐘の、塩基配列を決定すべき核酸が生じ、この鎖を次に常法で、 すなわち化学的方法によって部分的に塩基特異的に切断し、生じる断片混合物を 次に分離することによって、塩基配列を決定することができる。

核酸を標識するための他の好のましい方法の場合には、少なくとも１種の標識デ オキシリボヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド部分を、突出する５′又は ３′末端を有する、塩基配列を決定すべき核酸の制限断片中に連結する。

また核酸を標識するための他の好のましい実施態様では、突出する５′末端を有 する塩基配列を決定すべき核酸の制限断片中にポリメラーゼ又は逆転写酵素を少 なくとも１種の標識デオキシリボヌクレオシド三燐酸の存在で充填する。

マクサム・ギルバート法の他の好のましい実施態様の例は、ドイツ国特許出願公 開第３８３９３９７号明細書に記載されており、その内容をここで参照する。

本発明による塩基配列決定は、好ましくはサンガーによる酵素釣鐘切断法によっ て行われる。好ましくは（ａ）　１つ以上の被検液でオリゴヌクレオチドブライ マーを、ポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三燐酸、鎖切断分子及び塩基 配列を決定すべき鋳型としての核酸の存在で酵素的に伸長し、異なる鎖長を有す る標識核酸断片の混合物を調製し、（ｂ）　標識核酸断片を大きさにより分離し かつ（Ｃ）　個々の断片の標識により核酸の塩基配列を決定する ことによる核酸の非放射能塩基配列決定法であって、その特徴とするところは、 オリゴヌクレオチドブライマーの伸長を非放射性標識系を有する少な（とも１種 のデオキシリボヌクレオシド三燐酸の存在で行うことである。

意外にも、非放射性標識デオキシリボヌクレオシド三燐酸、特に蛍光色素で標識 されたデオキシリポヌクレオシド三燐酸が、塩基配列決定反応でポリメラーゼに よって基質として受容されることが確認された。自動ＤＮＡ配列分析装置（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ　−Ｌ　Ｋ　ＢのＡ、Ｌ。

Ｆ、ＤＮＡシークエンサー）で、非放射性標識デオキシリボヌクレオシド三燐酸 としてのフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＣＴＰ。

フルオレセイン−１５−ｄＡＴＰ及びフルオレセイン−１５−ｄＧＴＰ及びその 都度他の非標識デオキシリボヌクレオシド三燐酸を使用すると、優れた成績が得 られた。

従来技術による方法に対して本発明方法の場合にも同様に数種のヌクレオチドを 、単一のＤＮＡ断片中に挿入することができ、これによってシグナル強度、従っ て測定感度が１オ一ダー以上高められる。

また高いシグナル強度は、自動配列分析装置における蛍光バンドが検出器として 使用されるレーザー光によって極めて急速に変動する場合ですら、前記蛍光バン ドの鋭敏な検出を可能にし、その結果１クローンにつき毎時数千側の塩基までの 極めて高速で進むＤＮＡ塩基配列決定反応を、例えば超薄平板ゲル又は超薄毛管 で高電圧を用いて行うことができる。

本発明方法の利点はその簡素さである、それというのも標識プライマー及び標識 切断分子が不要になるからである。これは特に、ヒトのゲノム又は他のゲノムプ ロジェクトの塩基配列決定のような大規模の塩基配列決定プロジェクトの場合に 重要である。塩基配列決定反応で標識ｄＮＴＰを使用する場合には標識プライマ ーを使用することができるので、標識されたオリゴヌクレオチドブライマーの時 間浪費的又は／及びコスト高の調製を回避することができる。他面において所望 の場合には、もちろんまた標識プライマーを使用してもよい。

本発明方法の他の利点は、配列リーダーの溶解が特に比較的長いリーダーの場合 には、意外にも従来技術から公知の標識プライマーの使用よりも改善されること である。これは特に、標識及び伸長が２つの別個の段階で行われる（例２及び例 ３参照）方法実施の場合及び標識としてフルオレセイン−ｄＡＴＰ又はフルオレ セイン−ｄＵＴＰを使用する場合にいえる。

本発明方法は、標識系を有しないオリゴヌクレオチドブライマー、特に５′末端 で標識されていないオリゴヌクレオチドブライマーを使用することができること によって優れている。しかしまた他面において、標識ｄＮＴＰと組合せて、５′ 末端で色素又は／及び親和性結合能力のある系で修飾されているオリゴヌクレオ チドブライマーを使用することもできる。すなわち二重標識が可能である、つま り相応の被検液で使用される標識ｄＮＴＰとは異なる蛍光波長を有する、色素標 識オリゴヌクレオチドプライマーを使用する。さらに、オリゴヌクレオチドブラ イマーはその５′末端でビオチニル化されていてもよ（、それによって例えばス トレプトアビジンで被覆された固相への結合が可能である。親和性結合能力のあ る系の他の例は、相応のハブテンに対して特異的な抗体と結合能力のあるハプテ ン（例えばジゴキシゲニン又はジゴキシン）である本発明方法の鎖切断分子とし ては、有利には、デオキシリポースの３′位で修飾されているデオキシリポヌク レオシド三燐酸を使用し、この際該デオキシリボヌクレオシド三燐酸は遊離ＯＨ 基を有さず、しかもポリメラーゼによって基質として受容されるように修飾され ている。このような鎖切断分子の例は３′−フルオル−１３−ｏ−アルキル−又 は３′−Ｈ−修飾デオキシリボヌクレオチドである。好ましくは鎖切断分子とし ては３’　−Ｈ−修飾デオキシリボヌクレオチド、すなわちデオキシリポヌクレ オシド三燐酸（ｄｄＮＴＰ）を使用する。本発明方法の場合好ましくは未標識鎖 切断分子で作業する。しかしまた、当業者に周知のような標識切断分子を使用し てもよい。

本発明によれば、オリゴヌクレオチドブライマーの酵素的伸長及び制限断片の充 填のためには、好ましくはＥ、　ｃｏｌｉ−ＤＮＡポリメラーゼのフレノウフラ グメント（Ｋｌｅｎｏｖ−Ｆｒａｇｍｅｎｔ）　、修飾又は未修飾Ｔ７−ＤＮＡ ポリメラーゼ、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓ ｔ−ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素を使用する。これらのポリメラーゼのう ち、Ｔ７−ＤＮＡポリメラーゼ及び熱安定性Ｔａｑ−及びＢｓｔ−ＤＮＡポリメ ラーゼが特に好ましい。意外にもこれらの酵素によって非放射性標識ｄＮＴＰは 、塩基配列決定反応で基質として受容される。

標識核酸断片の分離は、本発明方法の場合には技術上公知のすべての方法により 、例えば種々の電気泳動法（例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動法）又はク ロマトグラフィー法（例ＨＰＬＣ）によって行うことができる。好ましいのはゲ ル電気泳動法である。また標識核酸の分離はそれ自体任意の方法で、すなわち用 手的に、半自動的又は自動的に行うことができるが、一般には自動配列分析装置 の使用が好ましい。この場合には標識核酸の分離は、２０〜２００μ真、好まし くは１００μ富の厚さの超薄平板ゲル（例えばＳｔｅｇｅｍ−ａｎｎ　ｅｔ　ａ ｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１．　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ。

２　（１９９１）、１８２−１８４参照）又は毛管で行うことができる。

蛍光色素で標識されているデオキシリポヌクレオシド三燐酸を使用する場合には 、標識の測定は、個々の核酸断片をそれらの大きさにより分離した後、蛍光色素 をレーザー又は他の適当な光源（例えばＬＥＤ、蛍光ランプ又はダイオードレー ザ−）によって励起することによって行うことができる。このような方法は、当 業者には周知であり、商業的に使用されるＤＮＡ配列分析装置（例えばＰｈａｒ Ｉｌａｃｉａ社製Ａ、Ｌ、Ｆ、シークエンサー）ですでに使用されている。

本発明方法による塩基配列決定のために塩基配列を決定すべき核酸の微量しか使 用できない場合には、増幅方法を行ってもよい。増幅方法の本質は、実際の塩基 配列決定前に２個のプライマーを用いて１回以上の複製連鎖反応（ＰＣＲ）を反 復する点にある。ＰＣＲは通常は標識ｄＮＴＰを用いないで行う。すなわち塩基 配列を決定すべき核酸は、実際の塩基配列決定を行う前に増幅することができる 。

他面において増幅方法はまた、“サーモサイクリング（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｉ ｎｇ）”反応を用いて行ってもよい。サーモサイクリング反応は“標準”塩基配 列決定反応に相当するが、この反応はＰＣＲと同様に数回の反復で行われる。反 応液は核酸鋳型、プライマー、ｄＮＴＰ及びその都度適当な鎖切断分子ならびに 好ましくは熱安定性のポリメラーゼを含有する。このようにして１反復当り常に 特定量の標識断片が合成され、数回の反復では多量の標識断片が調製されつる。

その結果ＤＮＡは線状に増幅され、ＰＣＲの場合のようにべき乗的には増幅され なや。

塩基配列を決定すべき核酸は、−木端の形又は二本鎖の形で存在していてよい。

塩基配列を決定すべき核酸が二本鎖ＤＮＡベクター、例えばプラスミド、コスミ ド、バクテリオファージ（λ又はＰｌ）、ウィルスベクター又は人工クロモソー ム（人工酵素クロモソーム）上に存在する場合に良好な結果が得られる。

本発明方法の第一の好ましい実施態様では、酵素的伸長反応を常法で、つまりい くつかの別個の被検液で行い、各被検液では異なる鎖切断分子塩基、すなわち異 なるヌクレオチド塩基を有するターミネータ−を使用する。饋切断分子は反応開 始時に同時に加えてもよいし、また反応を、２段階で、つまり鎖切断分子の不在 における伸長段階及びその都度の鎖切断分子の存在での終結段階で行ってもよい 。

この実施態様の場合好ましくは４種の類似被検液で行い、各被検液中には鎖切断 分子とは異なるｄｄＮＴＰが存在している。これらの４種の被検液において同一 の標識（１種以上の標識ｄＮＴＰ）を使用する場合には、個々の被検液を別々に 分離する必要がある。この実施態様の好ましい変法の場合には、２つ（又はそれ 以上の）塩基配列決定反応を異なる標識を有するｄＮＴＰを用いて行うことがで き、この際同時に検出できるような標識系を使用する。すなわち例えば第１反応 （すなわちこの反応の４種のすべての被検液）においてはフルオレセインｄＮＴ Ｐを使用し、第２反応ではローダミンｄＮＴＰを使用する。これらの両反応の評 価は一緒に行うことができ、この際それぞれ異なる標識（すなわちフルオレセイ ン−及びローダミン標識）を有する２つの被検液を単一のゲルレーン（Ｇｅ１ｓ ｐｕｒ）上に施しかつ（異なる蛍光波長で測定することによって）測定する。

他面において、異なる被検液における１つの反応（例えば異なる吸収波長を有す る蛍光色素を使用することによって）それぞれ異なる標識を使用すると、１つの 反応のいくつかの被検液又はすべての被検液も一緒に、例えば１つのゲルレーン で分離することができる本発明方法の他の好ましい実施態様は、１つの被検液に おいて少な（とも２種類の鎖切断分子を異なる量で一緒に使用することであり、 この場合には断片の識別はそれらの標識シグナルの強度により行うことができる 。このような方法は例えばドイツ国特許出願公開第３８４１５６５号明細書の対 象である。

本発明の他の対象は、マクサム及びギルバートによる分解法又はサンガーによる 鎖切断法による核酸の塩基配列決定法で非放射性標識デオキシリボヌクレオシド 三燐酸を使用することである。この場合標識は好ましくは蛍光色素であり、特に フルオレセイン又はその。

誘導体が好ましい。標識は好ましくはリンカ−を介してｄＮＴＰに結合されてい る。リンカ−鎖中の原子数は一般には１〜５０、好ましくは４〜２４、特に好ま しくは８〜１８である。自動塩基配列法に関しては、フルオレセイン−１２−ｄ ＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＣＴＰ、フルオレセイン−１５−ｄＧＴＰ又 は／及びフルオレセイン−１５−ｄＡＴＰが有利であった。

さらに本発明の他の対象は、非放射性標識系で標識されている、少なくとも１種 のデオキシリボヌクレオシド三燐酸を含有する、核酸の塩基配列を決定するため の試薬である。該試薬は、例えば溶液、懸濁液又は凍結乾燥物の形であってよい 。該試薬はまた核酸の塩基配列を決定するための試薬キットの成分であってもよ く、同キットは他の試薬（例えば酵素、プライマー、緩衝液、非標識ＮＴＰ、タ ーミネータ−）も含有していてよい。

次の実施例により、第１図〜第３図との関連において本発明をさらに説明するこ とにする。

図面の簡単な説明 第１図は、標識としてフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰを用いるプラスミドの塩 基配列決定の結果を示す。第２図は標識としてフルオレセイン−１２−ｄＣＴＰ を用いるプラスミドの塩基配列決定の結果を示し、第３図は標識としてフルオレ セイン−１５−ｄＡＴＰを用いるプラスミドの塩基配列決定の結果を示す。

例　１ フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ標識を用いるＤＮＡ塩基配列決定 塩基配列決定を自動ＤＮＡ配列分析装置（ＰｈａｒｔｒｒａｃｉａＬＫＢ社製Ａ 、Ｌ、Ｆ、シークエンサー）で行った。実験は、−木端及び二本鎖ＤＮＡ鋳型の 使用下にＴ７−ＤＮＡポリメラーゼ及びマンガン−又はマグネシウム緩衝液を用 いて行った。ヌクレオチド及び酵素はファルマシア（Ｐｈａｒ＋＋ａｃｉａ）　 Ｐ　Ｌ社から人手した。フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰはベーリンガー・マン ハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　ｌｌａｎｎｈｅｉｍ）から入手した。良好な結 果は、次の反応実験計画案の使用下で得られた：１、　変性及びアニーリング 再蒸留Ｈ２０６μｌ中のプラスミドＤＮＡ　［キアゲン力ラム（Ｑｉａｇｅｎ　 −５ａｅｕｌｅ）により精製することによって製造］５μツを塩基配列決定プラ イマー（１μｍｏｌ／１）２ｔｔｌと混合し、７０℃で３分間ＬＭ　ＮａＯＨ１ μｌを加えて変性しかつＬＭ　ＨＣＩＩμ！で中和した。新しく調製した１０Ｘ 反応緩衝液（トリスＨＣＩ３００ｍｍｏ１／１ＳｐＨ７，５、ＤＴＴ１５０ｉｍ ｏｌ／（、ＭｎＣｌ２６０　菖曽ｏ１／（、ＤＬ　−イ　ソ　シ　ト　レー　ト 　４　６　０　ｇ＋＊ｏｌ／ｌ）２μｔを加えかつ３７℃で１５分間インキュベ ートした。

２．　伸長及び標識 上記被検液に標識混合物（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びフルオレセイン− １２−ｄＵＴＰそれぞれ１　、５　ｕ　ｍｏｌ／　ｆ）をＴ７−ＤＮＡポリメラ ーゼ３．５Ｕと一緒に加え、室温で１０分間インキュベートした。

３、　終結 反応生成物のアリコート４μｌを４種の終結混合物（ｄＡＴＰ　１ｍｍｏｌ／Ｍ 、　ｄＧＴＰ　１ｍｍｏｌ／ｌ、　７−デアザ（Ｄｅａｚａ）　−ｄ　Ｇ　Ｔ　 Ｐ　ｌ　ｇａｏｌ／　１、ｄＴＴＰ１ｍｍｏ１／Ｌ　ｄｄＮＴＰ　５μｍｏｌ／ ｌ）　３ｔｔｌに加え、３７℃で５分間インキュベートした。反応をデキストラ ンブルー（ｉ）ｅｘｔｒａｎｂｌａｕ）　５　富ｔ／　鳳１を含む脱イオン化ホ ルムアミド４μ！で停止し、加熱して変性しかつ配列ゲル上に施した。

第１図は、フルオレセイン−１２−ｄＣＴＰの使用下における代表的プラスミド 塩基配列決定の結果を示す。シグナルは可視的プライマーピークのない開始位置 の後の初めの標識Ｔ−基の直後から始まる。多重ピークでの強度は最終標識を用 いるプライマー実験の場合と同じである。Ｔ７−ＤＮＡポリメラーゼに対するマ グネシウム緩衝液もマンガン緩衝液も適当であることが判明した。

蛍光標識ｄＮＴＰを用いる自動ＤＮＡ塩基配列決定は、他の標識法と比べて種々 の利点を有する。

１、標識強度は公知の実験記録の場合よりも明らかに強い。この場合塩基配列決 定のためには５ｓ−Ｄ　Ｎ　Ａ　２００ｒｚで十分である。公知法の場合には通 常約１μツの５ｓ−Ｄ　Ｎ　Ａを使用する。

２、任意の非標識オリゴヌクレオチドブライマー（例えば発現ベクターのプライ マー）はどれも直接使用することができる。“ウオーキング・プライマー（ｔａ ｌｋｉｎｇ　−Ｐｒｉｍｅｒ）”法が容易になる。それというのもプライマーの 標識又は標識産物の精製が不要だからである。プライマーの５′末端における色 素との相互作用が起こり得ないので、比較的短いオリゴヌクレオチド（１２〜１ ５塩基）が使用に適している３、蛍光標識ｄｄＮＴＴと比べて標識の値段を無視 することができる（１反応につき０．０５ＵＭ未満）。

さらに未挿入標識の除去も不要である。

４、　蛍光標識ｄＵＴＰは多くのＤＮＡポリメラーゼ（Ｔ４’、Ｔ７、フレノウ 、Ｔａｑ、Ｂｓｔ、ＡＭＶ−逆転写酵素）によって基質として受容される。

例　２ ファルマシア・オートリード（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ａｕｔｏｒｅａｄ）キット の使用下でフルオレセイン−ｄＮＴＰを用いる一本鎖ＤＮＡの塩基配列決定 １、　変性及びアニーリング（容器中で）−木端鋳型ＤＮＡ　（２００ｒｚＭ１ ３）１．０ｔｔＬ非標識非標識塩基窓プライマー（５μｍｏｌ／／）２μ！及び アニーリング緩衝液を混合し、３分間６５℃に加熱しかつ３７℃に冷却させた。

２、　標識 上記被検液に、標識混合物（標識ｄＮＴＰ　１０μｍｏｌ／ｌ及び非標識ｄＮＴ Ｐ　１μｍｏｌ／ｌ）　１ｔｔｌを、Ｔ７−ＤＮＡポリメラーゼ（３，５Ｕ）０ ．５μｌと一緒に加え、混合しかつ３７℃で１０分間インキュベートした。

３、　終結 上記被検液を、伸長緩衝液１μｌと混合した。次にこの混合物の４μ！アリコー トを、Ａ−１Ｃ−１Ｇ−及びＴ−混合物（それぞれの終結混合物３μ！及びＤＭ Ｓ０１μｌ）それぞれ４μｌに加え、３７℃で５分間インキュベートした。反応 を停止溶液それぞれ４μｌで停止させた。次に被検液を加熱して変性し、配列ゲ ル上に施ファルマシア・オートリード・キットの使用下でフルオレセイン−ｄＮ ＴＰを用いる二本鎖ＤＮＡの塩基配列決定 １、　変性及びアニーリング（容器中）プラスミドＤ　Ｎ　Ａ　［キアゲン力ラ ム（Ｑｕｉａｇｅｎ　５ａｅｕｌｅ）による１／３微小調製］１０μ！、非標識 塩基配列決定プライマー（５μｍｏｌ／Ｉ）　２　Ｉｌ！及び１　ｍｏｌ／　ｌ 　Ｎ　ａＯＨ１μｌを混合し、６５℃で３分間加熱し、３７°Ｃでインキュベー トした。

２、　標識 上記被検液に、１ｍｏｌ／ｌ　Ｈｃ　１　１　μ＋、アニーリング緩衝液２μ！ 、標識混合物（標識ｄＮＴＰ　１０μｍｏｌ／ｌ及び非標識ｄＮＴＰ　Ｉμｍｏ ｌ／Ｄ　１１ｔｌを、Ｔ７−ＤＮＡポリメラーゼ（３，５Ｕ）０．５μｌと一緒 に加え、３７℃で１０分間インキュベートした。

３、　終結 上記被検液を、伸長緩衝液１μｌと混合した。この混合物のアリコート４μｌを 、Ａ−１Ｃ−１Ｇ−及びＴ−混合物（それぞれの終結混合物３μｌ及びＤＭＳｏ 　１μりそれぞれ４μｌに加え、３７℃で５分間インキュベートした。反応を停 止溶液４μｌで停止させた。次に被検液を加熱して変性しかつシグナルゲル上に 施した第２図及び第３図は、上記の実験計画案及び標識としてのフルオレセイン −１２−ｄＣＴＰ　（第２図）及びフルオレセイン−１５−ｄＡＴＰ　（第３図 ）を使用したプラスミドの塩基配列決定の結果を示す。

配列ゲルの評価は自動ＥＭＢＬ蛍光シークエンサーで行った。標識としてフルオ レセイン−１５−ｄＡＴＰを使用する場合には、１０００塩基まで読み取ること ができる。

０’） Ｕ− ヘ Ｃつ 」コ Ｃ） フロントページの続き （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、ＪＰ 、　ＵＳ （７２）発明者　フォス、ハルトムードドイツ連邦共和国　Ｄ−６９０１がイベ ルク／ハイデルベルク　ハウプトシュトラーセ商　べ一

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）異なる鎖長を有する標識核酸断片の混合物を調製し、 （ｂ）標識核酸断片を大きさにより分離しかつ（ｃ）個々の断片の標識により核 酸の塩基配列を決定する ことによって核酸の塩基配列を決定するに当り、非放射性標識系を有する少なく とも１種のデオキシリボヌクレオシド三燐酸を挿入することによって標識されて いる核酸断片を測定することを特徴とする、核酸の塩基配列決定方法。 ２．標識核酸断片の混合物を化学的分解方法によって調製する、請求項１記載の 方法。 ３．ポリメラーゼ、塩基配列を決定すべき鋳型としての核酸及び少なくとも１種 の標識デオキシリボヌクレオチドの存在でオリゴヌクレオチドプライマーを酵素 的に伸長することによって標識を導入し、次に化学的方法によって標識核酸の部 分的な塩基特異的切断を行う、請求項２記載の方法。 ４．突出する５′末端又は３′末端を有する、塩基配列を決定すべき核酸の制限 断片中に、標識デオキシリボヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド部分を連結 することによって標識を導入し、次に化学的方法によって標識核酸の部分的な塩 基特異的切断を行う、請求項２記載の方法。 ５．少なくとも１種の標識デオキシリボヌクレオチドの存在で、突出する５′末 端を有する塩基配列を決定すべき核酸の制限断片を酵素的に充填することによっ て標識を導入し、次に化学的方法によって標識核酸の部分的な塩基特異的切断を 行う、請求項２記載の方法。 ６．標識核酸断片の混合物を酵素的鎖切断法によって調製する、請求項１記載の 方法。 ７．（ａ）１つ以上の被検液中でポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三燐 酸、鎖切断分子及び塩基配列を決定すべき鋳型としての核酸の存在でオリゴヌク レオチドプライマーを酵素的に伸長し、異なる鎖長を有する標識核酸断片の混合 物を調製し、 （ｂ）標識核酸断片を大きさにより分離しかつ（ｃ）個々の断片の標識により核 酸の塩基配列を決定する ことによって核酸の塩基配列を決定するための請求項６記載の方法において、非 放射性標識系を有する少なくとも１種のデオキシリボヌクレオシド三燐酸の存在 でオリゴヌクレオチドプライマーを伸長することを特徴とする、核酸の塩基配列 決定方法。 ８．リンカーを介して標識系に結合されているデオキシリボヌクレオシド三燐酸 を使用する、請求項１から請求項７までのいずれか１項記載の方法。 ９．リンカーの鎖中の原子数が１０〜１８である、請求項８記載の方法。 １０．蛍光色素で標識されたデオキシリボヌクレオシド三燐酸を使用する、請求 項１から請求項９までのいずれか１項記載の方法。 １１．蛍光色素としてフルオレセイン又はその誘導体を使用する、請求項１０記 載の方法。 １２．標識デオキシリボヌクレオチドとしてフルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、 フルオレセイン−１２−ｄＣＴＰ、フルオレセイン−１５−ｄＧＴＰ又は／及び フルオレセイン−１５−ｄＡＴＰを使用する、請求項１から請求項１１までのい ずれか１項記載の方法。 １３．酵素的伸長の際に５′−非標識オリゴヌクレオチドプライマーを使用する 、請求項３又は７記載の方法。 １４．５′末端で色素又は／及び親和性結合能力のある系で標識されているオリ ゴヌクレオチドプライマーを使用する、請求項３又は７記載の方法。 １５．５′−ビオチニル化オリゴヌクレオチドプライマーを使用する、請求項１ ４記載の方法。 １６．鎖切断分子として、糖の３′位にＦ基、０−アルキル基又はＨ基を有する ３′−標識デオキシリボヌクレオシド三燐酸を使用する、請求項６から請求項１ ５までのいずれか１項記載の方法。 １７．鎖切断分子として、ジデオキシリボヌクレオシド三燐酸を使用する、請求 項１６記載の方法。 １８．非標識鎖切断分子を使用する、請求項６から請求項１７までのいずれか１ 項記載の方法。 １９．酵素的伸長又は充填のためのポリメラーゼとして、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポ リメラーゼＩのクレノウフラグメント、標識又は非標識Ｔ７−ＤＮＡポリメラー ゼ、Ｔ４−ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ−ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ−ＤＮＡ ポリメラーゼ又は逆転写酸素を使用する、請求項３、５又は７記載の方法。 ２０．標識核酸断片の分離をゲル電気泳動によって行う、請求項１から請求項９ までのいずれか１項記載の方法。 ２１．標識核酸断片の分離を自動配列分析装置で行う、請求項１から請求項２０ までのいずれか１項記載の方法。 ２２．分離を超薄平板ゲル又は毛管で行う、請求項２０又は２１記載の方法。 ２３．蛍光色素で標識されたデオキシリボヌクレオシド三燐酸を使用する場合、 核酸断片の分離後に標識を測定するために蛍光色素をレーザーによって励起する 、請求項１から請求項２２までのいずれか１項記載の方法。 ２４．塩基配列決定反応前に、塩基配列を決定すべき核酸の量を増幅するために ＰＣＲ反応を１回以上反復する、請求項１から請求項２３までのいずれか１項記 載の方法。 ２５．標識核酸断片の量を場合するために塩基配列決定反応を“サーモサイクリ ング”反応として数段階で行う、請求項６から請求項２４までのいずれか１項記 載の方法。 ２６．塩基配列を決定すべき核酸が二本鎖ＤＮＡベクター上に存在する、請求項 １から請求項２５までのいずれか１項記載の方法。 ２７．二本鎖ＤＮＡベクターがプラスミド、コスミド、バクテリオファージ、ウ イルスベクター又は人工クロモソームである、請求項２６記載の方法。 ２８．鎖切断法での酵素的伸長をいくつかの別個の被検液で行い、各被検波では 異なる鎖切断分子を使用する、請求項６から請求項２７までのいずれか１項記載 の方法。 ２９．すべての被検波において１種以上の標識デオキシリボヌクレオシド三燐酸 から成る同一標識を使用し、その結果個々の被検液の別々の分離が必要である、 請求項２８記載の方法。 ３０．異なる被検液においてそれぞれ異なる標識を使用し、それによりこれらの 異なる標識の被検液の共通の分離を行うことができる、請求項２８記載の方法３ １．１つの被検波において異なる量の少なくとも２種の鎖切断分子を使用し、断 片の識別をそれらの標識シグナルの強度により行う、請求項６から請求項２７ま でのいずれか１項記載の方法。 ３２．核酸の塩基配列決定方法で非放射性デオキシリボヌクレオシド三燐酸を使 用すること。 ３３．標識が蛍光色素である、請求項３２記載の使用。 ３４．標識がフルオレセイン又はその誘導体である、請求項３３記載の使用。 ３５．標識系がリンカーを介してデオキシリボヌクレオシド三燐酸に椿合されて いる、請求項３２から請求項３４までのいずれか１項記載の使用。 ３６．リンカーの鎖中の原子数が１０〜１８である、請求項３５記載の使用。 ３７．標識デオキシリボヌクレオシド三燐酸としてフルオレセイン−１２−ｄＵ ＴＰ、フルオレセイン−１２−ｄＣＴＰ、フルオレセイン−１５−ｄＡＴＰ又は ／及びフルオレセイン−１５−ｄＧＴＰを使用する、請求項３２から請求項３６ までのいずれか１項記載の使用。 ３８．非放射性標識系で標識されている、少なくとも１種のデオキシリボヌクレ オシド三燐酸を含有することを特徴とする、核酸の塩基配列決定のための試薬。 ３９．標識が蛍光色素である、請求項３８記載の試薬。 ４０．標識がフルオレセイン又はその誘導体である、請求項３９試薬。 ４１．フルオレセイン−ｎ−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−ｎ−ｄＣＴＰ、フルオ レセイン−ｎ−ｄＡＴＰ又は／及びフルオレセイン−ｎ−ｄＧＴＰを含有し、こ の際ｎが１０〜１８である、請求項４０記載の試薬。 ４２．請求項３８から請求項４１までのいずれか１項記載の試薬を含有すること を特徴とする、核酸の塩基配列決定のための試薬キット。