JPH06509474A - 蛋白質のトランスジェニック生産 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

溝ヨロー質のトランスジェニック生産 本発明の分野 本発明は、Ｉ　Ｓ　ＡをコードするＤＮＡ分子、該ＤＮＡ分子を含むベクターお よびＩ　Ｓ　Ａを生産するトランスジェニック動物ヒト血清アルブミン（ＩＳＡ ）は、肝臓で合成されるグリコジル化されていない球状の蛋白質（ＭＷ＝６５． ０００）である。ＩＳＡは血液中を４２ｇ　／　ｌのレベルで循環しており、最 も多い血清蛋白質である。ＩＳＡは、多数の不可欠な機能、例えば正常な血流浸 透性の維持、血圧の調節ならびに脂肪酸、アミノ酸、胆汁色素および多くの小さ い分子の運搬に関与する。 臨床的には、外傷および重度のやけどまたは外科的処置などの急性段階の状態に おける血液の補充のために大量のＩＳＡが使用される。現在、医療用のＩ　Ｓ　 Ａは供血者の血液の分別に依存している。現在のところ、Ｉ　Ｓ　Ａは他の血液 製剤とともに同−源から同時に精製することができるので、血液からＩ　Ｓ　Ａ を精製するコストは比較的低い。しかし、凝固因子などの他の血液製剤がヒトの 血液から精製する代わりにバイオテクノロジーによって生産されると、市場力学 により、１１　Ｓ　Ａを血液から精製するコストは相対的に増加する。献血によ る血液の供給は減少する兆しであり、ＩＳＡの血液からの精製コストは上昇し、 肝炎、ＡＩＤＳおよび他の病気を棺来する感染ウィルスによって汚染される危険 性があるため、大量のＩＳＡの別の生産源が望まれ、大量のＩ　Ｓ　Ａを生産す るための別の方法が必要である。 過去１０年にわたり、商業的に重要な生物学的物質の生産に対して組換えＤＮＡ 技術の使用が増大している。このために、薬学的に重要な種々のヒト蛋白質をコ ードするＤＮＡ塩基配列をクローン化してきた。これらには、インシュリン、プ ラスミノーゲン活性化因子、α−抗トリプシンならびに血液凝固因子ｖ１１１お よび１ｘが含まれる。 これらの蛋白質および他の蛋白質をコードするＤＮＡ塩基配列の発現が、大量の 哺乳類蛋白質の生産の理想的な源として示唆されている。薬学的に重要な蛋白質 を生産するために、バクトリ？、酵母、培養細胞および動物などの種々の宿主が 利用されている。実際には、バクテリアおよび酵母は宿主として不−１−分であ ることが多い。というのは、外来蛋白質が不安定であることが多く、正しく処理 されないからである。バクテリアの場合、ＩＳＡは不溶性の凝固物として生産さ れ、これは、成熟した可溶性蛋白質を得るための処理を要する。また、サツカロ ミセス属の酵母でもＩ　Ｓ　Ａは生産されるが、低レベルであり、細胞と会合し ているか不溶性であるフラグメントの割合が高い（Ｓｌｅｅｐ　ｅｌ　＊１．、 　１９９Ｇ、ロｉｏ／Ｔｓｅｈ＋１ｏｌｏＢ　８：４２−４６、　Ｅｌｃｈｅｖ ｅ＋Ｂｃｌ　１１．、１９１１６．８ｉｏ／Ｔｅｃｌ＋ｌ１ｏｌｏ（７４ニア２ ９−７３０＋　Ｑｕｉｃｋ　ｅｌ　ｓｌ、。 １９８９、８ｉｏｌｅｃｈ、＾ｐｐｌ　Ｂｉｏｃｈｅｓ、ｌｌ：２７３−２８７ 　）。 この問題に鑑みて、哺乳類の組織培養においてクローン化遺伝子の発現を試み、 いくつかの場合は実行可能であることがわかった。しかし、動物細胞のバッチ式 醗酵は高価で、技術的に過酷な方法である。また、蛋白質製剤の生産源としてト ランスジェニック動物が提案されている。トランスジェニック家畜を作ると多く の応用が可能であり、例えば、薬学または商業１−重要な蛋白質を乳腺で高レベ ルに発現・生産した後、そのような遺伝子処理した動物の乳汁に分泌させること が目標である「分子飼養」　（遺伝飼養とも言う。）が挙げられる。この方法の 成否をまずトランスジェニックマウスで試した。 ＷＯ−Ａ−８８００２３９は、有益な薬剤蛋白質（この場合は、凝固因子Ｉりを トランスジェニック羊の乳に分泌させるトランスジェニック動物を開示している 。ＥＰ−Ａ−０２６４１６６も、薬剤蛋白質をその乳に分泌させるトランスジェ ニック動物の一般的アイデアを開示している。 ＷＯ−Ａ、−８８００，２３９で示されているように、トランスジェニック動物 を用いた初期の研究では、関与する蛋白質をコードするｃ　ＤＮＡをベースとす る遺伝子構造を使用している。 ｃＤＮＡは、天然遺伝子がイントロンを有すると仮定すると、天然の遺伝子より も小さく、その理由により、操作が容易である。商業的目的のためには、トラン スジェニック動物の乳に生産される蛋白質の収量を改善することが望ましい。 ８＋ｉｎ＋ｔｅ＋　ｅｆ　ｓｌ、（ＰＮＡＳ　８５８３６−８４０　（１９８８ １）は、トランスジェニックマウスでのイントロンを有する導入遺伝子の転写効 率がｃＤＮＡ以上に増加することを示している。Ｂ＋ｉｎ＋ｌｅ＋ｅｌ　ｍｌ　 は、天然遺伝子のエキソンおよびイントロンの全てが発現の効率および信頼性の 両方（すなわち、発現レベルおよび発現する動物の割合の両方）に重要であるこ とを示しており、これは、該遺伝子に天然のイントロンが存在することによる。 いくつかの場合、これが、イントロン中の組織に特異的な調節塩基配列の有無に 帰因しないことがわかっている。なぜならば、その現象は、遺伝子の発現が異種 プロモータによって普通そこでは発現しない組織に対して再指示される場合に、 認められるからである。Ｂ＋ｉｎ＋ｔｅ＋　ｃｌ　ｔｌ　は、その効果はトラン スジェニック動物に固有のものであって、細胞系では見られないことを示唆した 。しかし、Ｉｌｏｓｏｇ　Ｉｎｄ　Ｇｏｒｌｎ　（１９９０，Ｎｅｅｌｅｉｃ　 Ａｃ１ｄｓＲｅ＋ｅｚ＋ｃｈ　１８：　９３７−９４７１　は、組織培養細胞で の遺伝子の発現レベルがリポータ−遺伝子と結合した異種イントロンにより高め られることを示している。 発現の収量および信頼性の問題は、単にＢ＋ｉｎ＋Ｉｅ＋　ｅｌ　１１　の開示 に従い、外来ｃＤＮＡとは対照的に天然の外来遺伝子をベースとする導入遺伝子 を哺乳類ゲノムに挿入するだけでは解決できない。第一に、上記のように、イン トロンを有する天然遺伝子は、ｍＲＮＡとして核から出る前にイントロンが第一 転写産物から除去されるので、その遺伝子の産物をコードするｃＤＮＡよりも大 きい。大きいゲノム遺伝子の取扱は技術的に困難である。 第二に、操作されるＤＮＡの長さが長いほど、制限部位が１回より多く生しる機 会が多く、その結果、操作がより困難になる。このことは、はとんどの遺伝子導 入技術において、哺乳類のゲノムに挿入すべきＤＮＡは原核生物ベクターの塩基 配列から単離されることが多い（ＤＮＡの操作は原核生物ベクターで好んで行わ れる。）という事実を仮定すると、特にそうである。 原核生物ベクターの塩基配列は発現を妨げる傾向にあるので、通常は除かなけれ ばならない。従って、ＤＮＡ断片が長いほど、そのＤＮＡ断片を内部で切断しな い制限酵素を見出すことが困難になる。 遺伝ｆの全長を使用する代わりに蛋白質をコードするｃＤＮＡを使用して蛋白質 の発現を行うという試みは、一般に蛋白質の収量が低いという結果に終オ）って いる。トランスジェニック技術による収量および信頼性の所望する改善はｃＤＮ Ａをベースとする構造を使用すると得られることが多くの研究者によって認めら れた。 ＾＋＋ｈｉｂ麿１ｄ　ｅｌ　１＋、　（ＷＯ９０／　０５１８８）は、ある種の 蛋白質の場合、天然に存在するイントロンの少なくともいくつかを使用すると（ ｃＤＮＡを使用１７て得られるよりも）収量をより高くする二吉ができると記載 している。また、ｌ’ａ１ｍｉｌｅ＋　ｃｌｓｌ　（１９９１，？ｏｃ、Ｎ＋１ １．　Ａｃ＊ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＳａＯ２４７８−４８２１も、導入遺伝子にいく つかのイントロンを含めると、その導入遺伝子の発現レベルが、ｃ　ＤＮＡから 成る導入遺伝子の場合と比較して高いことを見出した。しかし、天然のイントロ ンが全部より少ない場合の発現レベルは、全部のイントロンを有する遺伝子全体 によって得られる発現レベルと比較すると減少した。 本発明の要約 本発明は、プロモータＤＮＡ塩基配列およびヒト血清アルブミンをコードするＤ ＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ構造を提供する。 −態様では、ヒト血清アルブミンの塩基配列がＩ　Ｓ　Ａ蛋白質をコードする天 然の遺伝子にある少な（とも１個（ただし全部ではない）のイントロンを含む。 別の態様では、ＤＮＡ構造が、トランスジェニック動物の乳でのＩＳＡの発現お よび分泌を指示する５′調節塩基配列を含む。プロモータ遺伝子は、好ましくは β−ラクトグロブリン、乳漿酸性蛋白質またはβ−カゼインなどの乳蛋白質プロ モータ塩基配列である。本発明はまた、本発明の構造を含むベクターを提供する 。 Ｉ　Ｓ　Ａをコードする本発明のＤＮＡ構造は、Ｉ　Ｓ　Ａをコードする２個の 連続したエキソンおよびＩ　Ｓ　Ａイントロンを含む。 好ましい態様では、本発明のＤＮＡ構造が、哺乳類の細胞および乳において、天 然に存在するＩ　Ｓ　Ａ遺伝子またはＨ３ＡｃＤＮＡよりも高レベルてＩＩ　Ｓ 　Ａを発現させる。最も好ましい態様では、本発明のＤＮＡ構造がＩ　Ｓ　Ａエ クソンならびに１〜６．７〜１４　、　１　ト　７〜１　４　、　１　＋　２　 ＋　１２〜１４　、　２　＋　１２〜１４．２＋７〜１４および１＋２　＋７〜 １４のイントロンから成る群から選択されるイントロンを含む。 別の態様では、ＩＩ　Ｓ　Ａをコードする本発明のＤＮＡ構造が、Ｉ　Ｓ　Ａ遺 伝子の最初の７個のイントロンの１個（全部ではない）およびＩ　Ｓ　Ａ遺伝子 の最後の７個のイントロンの１個を含む。 別の態様では、乳腺組織に特異的なプロモータの調節の下でヒト血清アルブミン をコードするＤＮＡ塩基配列を含み、授乳期の雌のトランスジェニック哺乳類の 乳腺で発現されるＤＮＡ構造を提供する。 本発明はまた、乳腺組織に特異的なプロモータと操作可能に連結したヒト血清ア ルブミンをコードするＤＮＡ塩基配列を含むＤＮＡ構造をそのゲノムに挿入した トランスジェニック哺乳類であって、該ＤＮＡ構造が授乳期の雌のトランスジェ ニック哺乳類の乳腺で発現されるトランスジェニック哺乳類を提供する。好まし くは、プロモータがβ−ラクトグロブリン蛋白質プロモータである。 本発明はまた、ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡ構造および哺乳類の組織 に特異的なプロモータをゲノムに挿入したトランスジェニック哺乳類を作る方法 であって、該ＤＮＡ構造が授乳期の雌のトランスジェニック哺乳類の乳腺で発現 され、ヒト血清アルブミンをコードするヌクレオチド配列と操作可能に連結した β−ラクトグロブリンプロモータを含む方法を提供する。 また、本発明は授乳期の雌の乳にＩ　Ｓ　Ａを分泌させるトランスジェニック哺 乳類を提供する。 さらに他の特徴および利点は、添付した図面と共に本発明の好ましい態様につい ての下記の記載により明らかにする。 本発明は、下記の説明およびその一部を構成する添付図面を参照することにより 、より容易に理解される。 図面の簡単な説明 図１は、ヒト血清アルブミンの地図（ＩＡ）およびＩＳＡ遺伝子の塩基配列（Ｉ Ｂ）を示す図である。 図２は、ＤＮＡ構造を図式的に描いた図である。 図３は、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現分析で得たＳＤＳ　ＰＡＧＥのＸ線写真を示す図 である。 図４は、Ｉ　Ｓ　Ａ構造を伝達するトランスジェニックマウスのサザンブロソト 分析を示す図である。 図５は、トランスジェニック動物の乳におけるＢＬＧ発現のドツトプロット分析 （５Ａ）およびつ℃スタンプロット分析（５Ｂ）を示す図である。 図６は、トランスジェニック動物の乳におけるＨ　Ｓ　Ａ発現のドツトプロット 分析（６Ａ・検出；６Ｂ、定量）およびウェスタンプ１プフト分析（６Ｃ）を示 す図である。 図７は、ケ・−マン−染色によるトランスジエニ・ツク動物の乳中のタンパク質 の非変性ゲル分析（７Ａ）およびトランスジェニック動物の乳におけるＩ　Ｓ　 Ａ発現のウェスタンプロット分析（７Ｂ）を示す図である。 図８は、トう〉ス：ｊエニ・・−り動物の組織のＩｉ　Ｓ　Ａ　ＲＮ　Ａ分析（ ノーサン法）を示す図である。 図９は、ＨＳ　Ａ　ＲＮ　Ａの１ｎｓｉｔｕ検出を示す図であ５゜ 図１０は、トランス：ジェニック動物の乳腺移植片によるＩＳＡ発現のウェスタ ン分析を示す図である。 図１１は、菌株＃２３の処女および授乳期のトランスジエニ、クマウスの乳腺に おけるＩ　Ｓ　Ａおよびβ−カゼインの免疫組織化学的検出を示す図である。 図１２は、菌株＃６９の処女および授乳期のトランスジェニックマウスの乳腺に おけるＨＳＡおよびβ−カゼインの免疫組織化学的検出を示す図である。 図１３は、対照としての処女および授乳期の非トランスジェニックマウスの乳腺 におけるＩ　Ｓ　Ａおよびβ−カゼインの免疫組織化学的検出を示す図である。 図１４は、処女、妊娠期および授乳期のトランスジェニックマウスおよび非トラ ンスジェニックマウス（対照）の乳腺において発現させたＩＳＡ、ＢＬＧおよび β−カゼインＲＮＡのノーザン分析を示す図である。 図１５は、ＨＳ　ＡおよびＢＬＧを処女、妊娠期および授乳期のトランスジェニ ックマウスの乳腺移植片から合成・分泌させたものを（代謝標識および免疫析出 により）示す図である。 図１６は、処女のトランスジェニックマウスから時間を超過１７て培養した乳腺 移植片から合成・分泌させた対照ホルモンのＨＳ　ＡおよびＢＬＧを（代謝標識 および免疫析出により）示す図である。 図１７は、い＜−〕かのトランスジェニックマウス菌株の乳で分泌させた［（Ｓ 　Ａのつｙスタン免疫分析を示す図である。 図１８は、乳腺移植片から発現・分泌させｊ二［Ｉ　Ｓ　Ａをいく一つかの条件 Ｆ’で（代謝標識および免疫析出により）評価ｊ２て示１図である。 図１９は、ｌ・ランスンエニｒクマウス菌株の乳におけるＩ　ＳＡの発情、１ノ ベル１に、同！−１ｉＷ株の処女の雌の乳腺移植片からの

【Ｉ（−１Ａ　、、、 、”’：泌レしル占の相関関係を示す図である。 図２０は、発育不全トランスジェニックヤギの乳腺移植片による、Ｉ　Ｓ　Ａ分 泌のつ１スタン免疫分析（子図）およびクーマー−染色によるＢ［、Ｇ分泌（１ 図）を示す図である。 吐−考暇□−冒ｑＩＩＩの詳岬−象尺−導定義 ［（然１．（Ｓ　Ａ遺伝子」は、ＩＴ　Ｓ　Ａ蛋白質をコードするＤＮＡ塩犠配 列を意味Ｌ、本末の位置関係にあるエキソンおよびイントロンを含む。天然ＩＴ 　Ｓ　Ａ遺伝子は連続して配列しており、その配列はＭｉｎｇｈｅｌｔｉ　ｅｆ 　＊１．、　１．　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｓ、２６１：　６７４７−６７５７Ｆ＋ ９１１６１で報告されている。本明細書ではＩＩ　Ｓ　Ａ塩基対（ｂ　ｐ）の位 置をこの公開された配列と符合させ、図ＩＢにも示す。 本明細書で使用するナンバリングは、Ｈ８ＡＩＩ訳開始コドン（ＡＴＧ）の最初 のｂｐ（Ａ）をｂｐ１７７６とし、図ＩＢで示す塩基配列ではｂｐ４０となるよ うに定義する。本来の状態のＨＳ　Ａ遺伝子は、転写の開始および調節を行う５ ′フランキング配列（プロモータ配列を含む）および３′フランキング配列を含 むが、本明細書で使用する「天然Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝子」はこれらのフランキング配 列を含む必要はない。本発明の構造では、本来のフランキング配列が存在しなく ても、また異種の配列で置き換わっていてもよい。 本明細書で使用する「イントロン」　（介在配列とも３う）は天然遺伝子のイン トロン配列であり、遺伝子の転写単位には含まれるが、本来の遺伝子産物である 蛋白質をコードするものではない。イントロンは前駆体ＲＮＡに転写されるが、 そのＲＮＡ前駆体が成熟してメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）になる過程で 除かれる（スプライシング）。イントロンは隣接するエクソンの間に位置する。 本明細書で使用する「イントロン」は、本来のイントロン全体またはその一部を 含む。 本明細書で使用する「エクソン」は、遺伝子の転写単位には含まｔｌ、処理の後 も成熟型のｍＲＮＡに保存され、遺伝子産物である蛋白質をＸｌ−ドするＤＮＡ 塩基配列を意味する。イントロンが天然遺伝子から除かれると、本来はそのイン トロンに隣接り、−？Ｔいる２個のエクソンが連続したエクソンとして連結され る。 本発明のＤＮＡ構造は一般に、哺乳類の細胞、好ましくはトランスジェニック動 物の乳腺でＩ　Ｓ　Ａ蛋白質を発現させ、それに続いて乳中にＩＩ　Ｓ　Ａを分 泌させるのに適する。本発明のＤＮＡ構造は、Ｉ　Ｓ　Ａ蛋白質をコードするＤ ＮＡ塩基配列とともにプロモータ配列を含む５′フランキング調節因子を含む。 乳腺組織での発現を所望する場合は、トランスジェニック動物の乳中でのＩＩ　 Ｓ　Ａ蛋白質の発現・分泌を指示する５′調節塩基配列が選択される。好ましく は、プロモータがβ−ラクトグロブリン、乳漿酸性蛋白質またはβ−カゼインな どの乳蛋白質プロモータ塩基配列である。Ｉ（Ｓ　Ａをコードする本発明の構造 を組織培賛中で発現させる場合は、その構造にエンハンサ−塩基配列を含め”Ｃ もよい。エンハンサ−はＳＶ４０．ヒトサイトメガロウィルスまたは他の源から （謬ることができる。エンハンサ−の選択は当業者には公知である。本発明の構 造はまた、ポリアデニル酸（′ｆ！すＡ）のシグナルおよび部位を含む。ポリア デニル酸のシグナルは本来のｉ（Ｓ　Ａ遺伝子によってコードされる同種のシグ ナルてあってもよく、または異種（例えばＢＬＧまたはＳＶ４０ポリ八部位）の ものであってもよい。プロモータ、ポリＡまたは他の調節因子の選択は当業者に は公知である。 発現のために選択する動物の種類は特に隈定されず、要求に適するように当業者 が選択する。明確には、本発明の好ましい態様の場合のように乳腺での分泌が第 一目標である場合は、哺乳類を使用することが必須である。実験操作が容易な実 験用哺乳類としてはマウスおよびラットが挙げられる。ウサギ、牛、豚、山羊お よび羊などの家畜を使用すると他の哺乳類より高い収量が得られる。好ましくは 、−世代に対する１年間の相対的な乳の生産量、実験による生産時間およびコス トにより、羊および山羊を使用する。 本発明の別の発明によれば、少なくとも１個のＩ　Ｓ　Ａイントロンおよび全部 より少ないＩ　Ｓ　Ａイントロンを含む構造遺伝子を含むベクター（またはＤＮ Ａ構造）を提供し、該ベクターは、哺乳類の細胞のトランスフェクションに使用 すると、天然の）ＩＳＡ遺伝子より高レベルでＬＴ　Ｓ　Ａを発現する。 本発明の別の発明によ第１ば、上記構造を含む哺乳類または他の動物の細胞を提 供する。４：発明の第６の発明によれば、−上記Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｉ造をそのゲ２ツ ムに導入１．て含むトランスジェニック哺乳類または他の動物を提供する。特に 好才Ｉ−＜は、そのトランス：；　ニー、　、、り動物がその子孫にそのＤＮＡ ｍ造を伝達し、その結嬰、生産動物の少なくとも次の１世代での生産が可能にな る。 天然＋Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝ＦのＤＮＡ塩基配列は決定されている。図１は、Ｉ　Ｓ　 Ａ遺伝子の地図およびその塩基配列を示す。 本発明のＤＮＡ構造の作製には、いくつかの異なった方法が必要である。ヒラ） ＴＩ　Ｌ　Ｇ遺伝子を、肝臓の高分子量ＤＮＡから、λｇ　ｔ　ｉ　Ｏベクター のＥｅｏＲ１部位中に２個のＥｅｏＲ■サブゲノム断片（約４．３ｋｂの５′ハ ーフおよび約４．４ｋＦ）の３′ハーフ）としてクローン化した。その２個のノ ＼−フを、該遺伝子の５′　−および３′　−末端にあるＥｃｏＲ１部位を壊し 、これらの位置に５ａ１１部位を導入するアダプターであるオリゴヌクレオチド を使用することにより、転写領域内のＥｃｏＲ１部位で共に結合し、ｐＧＥＭ− １巾に入れてサブクローン化した。単独の５ｎａ８１部位を、エクソン１の５′ −未翻訳領域内のｒ’ｖｕ１１部位に導入した。この結果、β−ラクトグロブリ ンを発現するためのベクターｐ５８５が（）られた。 このベクターは約３ｋｂの５′−フランキングプロモータ配列を八む。構造を図 ２Ａおよび２Ｂに示す。Ｂ　Ｌ　Ｇ　５　’　−フランキング配列内鑷ツジの肝 １ＩＩＤＮＡからのり０−：、／化により伸長したが、Ｈ４ｎｄｌｌｌサブゲノ ム断ｌｔを転写領域内の］ｌ　ｉ　ｎ　ｄＩ＋１部位から約３ｋｂＪ−流の５’ 　−）１　ｉ　ｎ　ｄ　Ｉ１１部位に伸長しくｐ　６４４およびｐ６４３）、ま たは５ａｅｌサブゲノム断片を最初の５′　−フランキング配列内の５ａｅ１部 位から約８゜６ｋｂｌ流の別の５ａｃ１部位に伸長した（ｐ　６４６およびｐ６ ４７）。前者の構造は約５．５ｋｂの５′−フランキングプロモータ配列を含み 、後者の構造の該配列は約１０．８ｋｂである。 ＨＳ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａは、λｇｔＬ１−ヒト肝臓ｃ　ＤＮＡライブラリーか ら単離した。ｃＤＮＡは完全な塩基配列を含み、プレプロペプチド塩基配列なら びに２０ｂｐの５′　−未翻訳配列および１４１ｂｐの３′　−未翻訳配列を含 む。ＨＳ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを、Ｂ　Ｌ　Ｇをコードする配列と同じ方向でＢ ＬＧエクソン１の未翻訳領域内のＰ　ｖ　ｕ　１１部位に挿入してベクターｐ５ ７５を得た。 エクソン１、イントロン１、エクソン２、イントロン２およびエクソン３の部分 を含むＨＳ　Ａゲノム配列を含むＤＮＡ断片を、Ｈ３Ａエクソン１の本来のＢｓ ｔＥ１１部位と重なる５′−オリゴヌクレオチドブライマーおよびＨ８Ａエクソ ン３の本来のＰＶＩＪ１１部位と重なる３′−オリゴヌクレオチドブライマーを 使用し、鋳型としてヒトリンパ球から精製した高分子量ＤＮＡを使用してＰＣＲ により作製した。エクソン１をコードする領域のＢｓｔＥＩＩ部位とエクソン３ をコードする領域のＰ　ｖ　ｕ　１１部位との間のｃ　ＤＮＡ領域をＰＣＲ産物 からの対応するゲノム断片（２４０１ｂｐ）で置き換えた。この結果、ベクター ｐ６０７に含まれているように、イントロン１および２を本来の位置で有するＩ 　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子を得た。Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝子の最初のイントロンをＨＳ　Ａ 　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに導入するために、まず、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ突然変異により、 プレプロペプチドを含むＩ　Ｓ　Ａ蛋白質の３４番目のアミノ酸コドンの第３塩 基位置のＧをＡで置き換える。二とによりｌＩ　Ｓ　Ａエクソン２から得られる Ｈ　Ｓ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの領域にＣｌａｌ部位を導入した。変更したコドン は最初と同樟にアルギニンをコードする。フランキングエクソン配列を有するＩ Ｉ　Ｓ　Ａイントロンｌ　Ｄ　Ｎ　Ａを、エクソン１の本来のＢｓｔＥ１１部位 と重なる５′　−オリゴヌクレオチドブライマーおよびエクソン２をコードする ＤＮＡに導入したＣｌａｌ部位と重複して含む３′−オリゴヌクレオチドブライ マーを使用し、ＰＣＲにより作製した。エクソン１〜３の塩基配列を含むゲノム ＰＣＲ産物のクローンをイントロン１およびフランキング配列のＰＣＲ作製用鋳 型として使用した。エクソン１をコードする領域のＢｓｔＥＩＩ部位とエクソン ２をコードする領域の導入したＣｌａｌ部位との間のｃＤＮＡ領域をＰＣＲ産物 からの対応するゲノム断片で置き換えた。この結果得られたＩＳＡミニ遺伝子は 、ベクターｐ５９９、ｐ６００、ｐ５９８、ｐ６４３およびｐ６４７に含まれて いるように、イントロン１を本来の位置で有する。 Ｂ　Ｌ　Ｇをコードする塩基配列の削除は、Ｂｌ−Ｇエクソン１の５′　−未翻 訳領域内に導入した５ｎａＢＩ部位とＢＬＧエクソン７の３′　−未翻訳領域内 にある本来のＸｍａ１部位との間の塩基配列を削除することにより行い、次いで ベクターｐ６００およびｐ６０７に見られるようにＩ　Ｓ　Ａ塩基配列の導入を 行った。このベクターは、ポリアデニル酸のノブナルおよび部位を含む未翻訳Ｂ ＬＧエクソン７のほとんどならびにＢＩ、Ｇ転写ユニットの３′配列を保存して いる。ベクターｐ５９８、ｐ６４３およびｐ６４７ならびに他のベクターの１１ 　Ｓ　Ａ塩基配列の下流にあるＳ　Ｖ　４０初期遺伝了（Ｔおよびｔ）ポリアデ ニル酸の１．ノブナルおよび部位は、５Ｖ４０ＤＮＡの５’　−末端（ＳＶ４０ マ戸ブの位Ｒ：　２７７０　）’ｙ　Ｂ　ｒ　ｌ　Ｉ　−Ｃ制ＲＵ　Ｌ、３′− 末端（ＳＶ４（１７Ｉブの位１１［：２５３３）をＲａ　ｍ　ＨＩで制限するこ とにより得た。ニオｌらのベクターでは、５’−未翻訳ＢＬＧＬクツ　１に導べ した５ｎａＢＩの下流にある全てのＢ　１．　Ｇ塩基配列（ゴー　トする塩基配 列、ポリアデニル酸のＳ／ノブナルよび部位ならびに３’−’１７ランキング配 列を含む）が削除された。 １（ＳΔイントロン３〜］・１を得るために、Ｈ３Ａ遺伝子をヒト胎盤ＤＮＡか らクローン化した。Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝子配列内に３個のＮｃｏ１部位を確認した。 第１のＮｅｏ１部位は、ＨＳ　Ａエクソン１の約２７５　ｂ　ｐ　、に流にある 。第２の部位はエクソン７の中にあり、第３の部位はエクソン１５の約２２７　 ｂ　ｐ　下流にある。ヒトの部分「量ＤＮＡをＮｅｏ　Ｉで消化すると、８０７ ９および９３７４塩基対の２個の断片が得られ、これらは共にＩ（Ｓ　Ａ遺伝ｆ 全体を含んでいた。８０７９塩基対の断片はＩ　ＳＡ遺伝ｆの５′　−ハーフを 表し、９３７４塩基対の断片はＩ　ＳＡ遺伝子の３′−ハーフを表す。これらの 断片を使用して２個の別々のサブゲノムＤＮＡライブラリーを作った。これらの ライブラリーから得られるＨ　Ｓ　ＡクローンをＨ３ＡｃＤＮＡプローブを使用 して同定した。Ｈ３Ａ遺伝子の５′　−ハーフをエクソン７まで含むクローンは ｌ）　、６５０　吉指定した。ＩＩ　Ｓ　Ａ遺伝子の３′　−ハーフの塩基配列 を含むと同定されたクローン（ｐ６５１）は、ＩＩ　Ｓ　Ａ塩基配列の内部削除 があることがわかった。 しか；２、クローンｐ６５１は、ＩＴ　Ｓ　Ａ　エクソ゛ノ１２内のＡｓｐ１部 位から）Ｉ　Ｓ　Ａエクソン１５の下流にあるＮｃｏ１部位までのＨ８Ａ塩基配 列を含んでいた。 イントロン７〜１１を含む領域が得られるようにエクソン７およびエクソン１２ の間のＩ　Ｓ　Ａ遺伝子配列をクローン化するために、ＰＣＲ技術を利用した。 有用な制限部位を含む１１　Ｓ　Ａ遺伝子の所望領域と一致する合成のオリゴヌ クレオチドブライマーを使用して４個のＰＣＲ反応をセットした。ＰＣＲ反応は 、反応＃１の上流端がエクソン７内のＮｃｏ１部位と重なるように計画した。反 応＃１の下流端はイントロン８内のＡｖｒ１１部位−二重複した。この同しＡｖ ｒ１１部位をＰＣＲ反応＃２の１．流端と重複させた。ＰＣＲ反応＃２の下流端 はイントロン８内のＨｉｎｄｌ１１部位と重複させた。このＨｉｎｄｌ１１部位 は、ＰＣＲ反応＃３の上流端とも重複させた。ＰＣＲ反応＃３の下流端はイント ロン１０内のＸｈｏ１部位と重複させ、これはＰＣＲ反応＃４の上流端とも重複 させた。ＰＣＲ反応＃４の下流端はエクソン１２のＡｓｐ１部位と重複させた。 このＰＣＲ計画により所望する全領域が得られ、隣接するＰＣＲ産物は重複した 制隈部位を使用して共に連結した。ＰＣＲ＃１および＃２反応の産物は共に、Ｉ 　Ｓ　Ａインドロン８内の共通のＡｖｒｌ１部位で連結し、プラスミドｐＧＥＭ −１に入れてクローン化して構造ｐ６７９を得た。この構造はエクソン７のＮｃ ｏ１部位からイントロン８の下流端にあるＨｉｎｄｌｌ１部位まで伸びたＩ　Ｓ Ａ塩基配列を含む。ＰＣＲ＃３および＃４反応の産物は共に、Ｉ　Ｓ　Ａイント ロン１０内の共通のＸｈｏ１部位で連結し、プラスミドｐＧＥＭ−２に入れてク ローン化して構造ｐ６７６を得た。この構造はイントロン８の下流端にあるＨｉ ｎｄｌｌ１部位からエクソン１２のＡｓｐ１部位まで伸びたＩ　Ｓ　Ａ塩基配列 を含む。 これらの構造ｐ６７９およびｐ６７６を、Ｉ　Ｓ　Ａエクソン１の上流にあるＮ ｃｏ１部位（Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝子塩基対の位１１：１４６２）からエクソン７のＮ ｃｏ１部位（１１Ｓ　Ａ遺伝子塩基対の位ＩＩ：９５４１）までのＩ　Ｓ　Ａ遺 伝子配列を含む構造ｐ６５０およびエクソン】２のＡｓｐ１部位のに流（Ｈ３Ａ 遺伝子塩基対の位ｆｌ：１５５９２）からエクソン１５の下流にあるＮｃ。 ■部位（Ｈ，ＳＡ遺伝子塩基対の位置：１８９１５）まで伸びたＨ３Ａ遺伝子配 列を含む構造ｐ６５１と一緒にすると金ＩＳＡ遺伝子のクローン化が完了する。 トランスジェニック動物の乳におけるＩＳＡの発現レベルに対するイントロンの 寄与を評価するために、Ｈ３Ａエクソンおよび種々の組み合わせのイントロンを 含むＤＮＡ構造を作った。 種々のＤＮＡ構造の詳細は下記実施例で示す。 本発明のＤＮＡ構造のＨ３Ａ蛋白質の発現維持能力を、組織培養細胞でのｉｎ　 ＶｉｔｒＯ試験およびトランスジェニック動物でのｉｎ　ｖｉｖｏ試験でテスト した。本発明の構造遺伝子によるＩＳＡのｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現は、実施例１５ で詳細に記載する。天然プロモータ（例えば、ＢＬＧ）の調節による乳蛋白質発 現のｉｎ　ｖｉｖｏ天然調節は複雑であり、ホルモンおよび特定の細胞−細胞間 相互作用の影響を受ける。ＢＬＧプロモータは通常、組織培養細胞中で活性では ない。これらのｉｎ　ｖｉｔｒｏ試験で選択したＣ０Ｉ−７細胞での発現を行う ために、５ｖ４０エンハンサ−をＢ　Ｔ−Ｇプロモータ内に導入した。ＳＶ４０ エンハンサ−を有する本発明のＤＮＡ構造の構成の詳細は実施例１５で示す。Ｃ Ｏ３−７細胞での［Ｉ　Ｓ　Ａ発現の過渡分析を使用してＤＮＡＩＩＩ造のテス トを行った。簡単に言うと、本発明のＤＮＡ構造をＣＯ３−７細胞にトランスフ ェクションし、４８〜７２時間インキュベートシた。Ｉ　Ｓ　Ａの発現は、ｄｅ 　ｎｏｖｏ合成した蛋白質を３５８−メチオニンで代謝的に標識化し、培地の上 澄液中に分泌させた標識化ＩＩ　Ｓ　Ａ蛋白質をＩＩ　Ｓ　Ａに特異的な抗体で 免疫沈降させるさせることにより測定した。沈降したＩＩ　Ｓ　Ａを５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥにより分析し、１（Ｓ　ＡバントをＸ線写真により検出した。 イントロンに欠けた［Ｉ　Ｓ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含む構造遺伝子（ｐ６５８ ）をトランスフェクションしたＣＯ３−７細胞はＩ　Ｓ　Ａを低レベルで発現し た。また、Ｉ　Ｓ　Ａ蛋白質の発現は、構造遺伝子にいくつかのイントロンを含 めても比較的低かった。しかし、ある組み合わせのイントロンを選択すると（ｐ ６５６（イントロン１〜６）　、ｐ６８４　（イントロン７〜１４）　、ｐ６９ ５（イントロン２＋１２〜１４）　、ｐ６９７　（イントロン１＋２＋１２〜１ ４）　、ｐ６９３　（イントロン１千７〜１４）、ｐ６９２（インドロン２千７ 〜１４）およびｐ６９８　（イントロン１４−２＋７〜１４）ＩＩ、全長のＩ　 Ｓ　Ａ遺伝子［Ｐ２Ｓ５（イントロン１〜１４・全長）］と等レしルか、それよ り高いレベルでＩ　Ｓ　Ａ蛋白質の発現を維持した。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ分析を図 ３Ａおよび３Ｂに示し、表１にまとめる。 （＊）の印をつけたｉｎ　ｖｉｔｒｏ構造遺伝子は、Ｉ（Ｓ　Ａイントロンの存 在のみが変わる。（ＢＬＧ５’　−配列、５ｖ４０エンハンサ−および３’　− ３Ｖ４０ポリＡは同じである。）指示した構造遺伝子以外はＢＬＧをコードする 塩基配列およびポリＡを含むＢＬＧ３’　−配列に欠ける。指示していない場合 は、ＳＶ４０ポリ八部位へ使用した。指示していない場合は、３ｋｂのＢＬＧ５ ’−フランキング配列（プロモータ）を使用した。 ｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現レベル範囲１（低発現）〜８（高発現）は半定量的な比較 であり、各増加量は、発現レベルに数倍へ何倍もの差があることを表す。 ｒ未ｍ定Ｊは、ｌ・ランスジェニック動物の乳中におけるＩＩ　ＳＡの有無をま だ測定していないことを意味する。「未定量」は、トランスジェニック動物の乳 中でＩ　Ｓ　Ａの発現が認められたが、その量はまだ測定していないことを意味 する。 これらのＩ）　Ｎ　Ａ構造による組織培讐細胞でのＩＩ　Ｓ　Ａの発現は、ＩＴ 　Ｓ　Ａの発現

【ノベルがＩＩ　Ｓ　Ａイントロンの特定の必要量、すなわち１ ｌＩａ遺伝１″−１−存在するＩ　Ｓ　Ａイントロンの数、挿入した特定のイン トロン、イントロンの相対的位置および特定イントロン間の相乗作用により調節 される。全部のイントロンを有する全Ｈ８Ａ遺伝子と比較して数倍高い発現レベ ルは、特定のサブセットのイントロンを有するＩＳＡミニ遺伝子を含むＤＮＡ構 造の場合に得られる。ＨＳ　Ａの発現レベルは、ＩＳＡ遺伝子の最初の７個のイ ントロンの１個（全部ではない）およびＨ３Ａ遺伝子の最後の７個のイントロン の１個を含むＩ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子により支持すると特に高い。Ｉ　Ｓ　Ａイ ントロン内には５個のＡｌｕ配列（反復ＤＮＡ配列群）がある。これらのＡｌｕ 配列のうち３個は最初の７個のイントロン内に位置し、２個は最後の７個のイン トロン内に位置する。イントロン２は２個のＡＩＵ配列を有し、イントロン７． ８および１１は各々１個のＡＩＵ配列を有する。イントロン内のＡｌｕ配列の有 無およびＩ（ＳＡミニ遺伝子によって得られる発現レベルに対するイントロンの 正の効果の間には関係があると考えられる。 本発明のＤＮＡ構造によるトランスジェニック動物での異種蛋白質のｉｎ　ｖｉ ｖｏ発現を、本発明のＤＮＡ構造をマウスの卵母細胞に注入してトランスジェニ ックマウスを作ることにより評価した。トランスジェニックマウスは、ｆｌｏｗ ｎ　ｔｌ　ｇｌ、。 −Ｍ＊ｎｉｐｏ１ｇｌｉｎ　ｔｈｅ　ｍｏＩＩｓ！ｅｍｂｒｙｏ：　ｌ　１１ｂ ｏ＋ｒｌｏ＋７　ｍｘｎｗｉｌ　”Ｃ３ＨＬ　（＋９８６１に記載の一般的方法 により作った。その詳細にっいＣは、実施例１６でさらに記載する。２種類の異 種蛋白質であるＢＬＧおよびＨＳ　Ａをトランスジェニックマウスの乳中で発現 させた。本発明の［３１，ＧまたはＢ　Ｌ　Ｇ　／　Ｉ　Ｓ　ＡのＤＡＮ構造を Ｈするマウスを、Ｂ　ｔ、　ＧおよびＩ　Ｓ　Ａの両方のＤ　Ｎ　Ａ配列を１１ １！認する３２Ｐ−、ＤＮＡを使用ｊ７て、新しく生まれたマウスの尾の体細胞 ＤＮＡを分析することにより検出した。分析の詳細は実施例１Ｇに記載する。ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏ分析とは反対に、ＢＬＧＪロモータの指示のＦ、蛋白質をトラン スジェニックマウス中で発現させるためのエンハンサ−は必要としなかった。 本発明のＤ　Ｎ　Ａ　ｍ造を有することが測定されｊ−雌のマウスを、成長した ときに雄の非トラレスンエニツクマウスと交配させた。 出ｌｆ後、授乳オ乙雌のトランス５ブエニノクマウスから乳を採取！−１その乳 中の異種蛋白質（ｒ３ＬＧまたはＩＩ　Ｓ　Ａ　）の有無および量を分析した。 始祖である雄のトランスジェニックマウスを雌の非トランスノエニノクマウスと 交配させて雌の子孫を作り、乳中のＷ種蛋白質の発現のテストを行った。乳中で 発現した異種蛋白Ｔｆ　’ｆＢｉ−ＧまたはＩ　Ｓ　Ａ蛋白質に対する抗体を使 用してド！トプロ、ｌ−法により検出した。乳中でのＩ３　Ｌ　Ｇ発現を、乳の 試料を二１−口セルロースフィルターＬに固定することにより検出した。次いで 、抗Ｂ　Ｌ　Ｇ抗体をそのフィルターと接触させた。次いで　＋２５１−蛋白質 入をそのフィルターと接触させて結合抗体に定量的に結合させた。乳中のＩＳＡ 発現を、乳の試料をニトロセルロースフィルター上に固定することにより検出し た。次いで、ヨウ素化抗Ｉ　Ｓ　Ａモノクローナル抗体をそのフィルターと接触 させた。放射能をオートラジオグラフィーにより測定し、オートラジオグラフの 密度測定により標準と相関させて、トランスジェニックマウスの乳中で発現した 異種蛋白質の量を定量１．た。 Ｂ　Ｌ　ＧプロモータがＢＬＧおよびＩ　Ｓ　Ａの発現を促進する能力をｉｎ　 ｖｉｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの両方で試験した。 ＢＬＧ転写ユニットの−に流にある３ｋｂのＤＮＡ断片（すなわち、５′　−フ ランキング領域）を本発明のＤＮＡ構造のほとんどで使用した。この３ｋｂのプ ロモータの効力を、３ｋｂのＢＬ　Ｇプロモータの指示のＦでＢ　１．　Ｇ遺伝 子を含む構造ｐ５８５を使用してトランスジェニックマウスを作ることにより試 験した。 作った全てのトランスジェニックマウス菌株は天然ヒツジＢＬＧ遺伝子（構造ｐ 　５８５）を有し、乳腺および乳においてＢＬＧを高レベルで発現した（ドツト プロット法で測定）。−例を図４に示す。レベル範囲は１〜８．５ｍｇ／ｍ　Ｉ 　ＢＬＧであった（表２参照）。これは、４．３ｋｂのＢＬＧ５’　−フランキ ング配列を使用して実験した５ｉｓｏｎ　ｅｌ　ｚｌ、（１９ｇ？、Ｎｔｌｉ＋ ｅ３２８：　５３０−５３２１　の範囲（３〜２３ｍｇ／ｍｌ）より若干低い。 しかし、５．５ｋｂ（構造ｐ　６４４）または１０．８ｋｂ　（ｐ６４６）の５ ′−フランキング配列を使用した場合は、ＢＬＧ発現の増加が見られなかった。 これらの結果は、本発明の遺伝子構造の３ｋｂのＢＬＧ５’　−フランキング配 列が、乳腺に対して高レベルの発現を指示するのに必要な全ての５′−調節因子 を含むことを示す。 また、３ｋｂ（７）ＢＬＧブＣ７モータ断片を、Ｉ　Ｓ　Ａ　Ｄ　Ｎ　Ａ　ノ全 てまたは一部を含むＤＮＡ構造でも使用した。この３ｋｂの断片は、ｉｎ　ｖｉ ｔｒｏおよびｉｎ　ｖｉｖｏの両方でＢＬＧおよびＩ　Ｓ　Ａ発現を促進するの に充分であることがわかった。 ｒ３　Ｌ　Ｇ　／　［Ｉ　Ｓ　ＡのＤＮＡ構造により作ったトランスジェニック 菌株の授乳期の雌の乳を、ヨウ素化抗ＨＳΔモノクローナル抗体を使用する免疫 ドツトプロット法により分析してＩ　Ｓ　Ａの有無を調べた。−例を図５八に示 す。ＩＴ　Ｓ　Ａを乳中に発現するトランスジェニックマウスを作るために、本 発明者らは最初、Ｈ８ＡｃＤＮＡをベクターｐ５８５のＢＬＧ遺伝子の第１エク ソンの５′−未翻訳領域に導入することを試み、ベクターｐ５７５を得た。８菌 株はどれも検出可能なレベルのヒト蛋白質を分泌しなかった（表２）。これらの ＢＬＧベクターは、それ自体のＢＬＧ遺伝子の発現は行うことができるが、挿入 したＨ　Ｓ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの発現を支持することはできないと考えられる 。 一方、種々の５′　−調節因子（プロモータ）の調節下での異種遺伝子の発現レ ベルは、異種転写領域にイントロンを挿入することにより増加することがわかっ ている。従って、本発明者らは、ヒツジＢＬＧプロモータを、種々の組み合わせ のイントロンを含むＩ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子に接合させた一連のベクターをテス トした。 １１　Ｓ　Ａイントロン１を含む１個のＨＳ　Ａ　ミニ遺伝子による発現を３種 類の構造（ｐ　５９９、ｐ６００、ｐ　５９　Ｂ）において分析すると、作った １６個のトランスジェニック菌株のうち１個のみ（＃２３）が検出可能なレベル のＩＳＡをその乳中に発現することがわかった。本発明のそれらの構造にＩ　Ｓ 　Ａイントロン１のみを含めるのは、発現するトランスジェニック菌株の割合を 高くするのには充分でない。図５Ｂに示すように、菌株２３の雌のマウスは２　 ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉよりも高いレベルのＩ　Ｓ　Ａを乳中に分泌し、その能力を ２年以上にわたってその子孫に安定して伝達した。 マウスの乳は、５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル中でヒト血清アルブミノと共移動する内在 マウス血清アルブミンを充分に含む（データは示していない）。免疫−検出法に よれば、抗ＨＳ　Ａモノクローナル抗体がヒト蛋白質を明確に検出し、マウス蛋 白質は検出しないことがわかった。ヒトおよびマウスの蛋白質はまた、未変性ア クリルアミドゲル上での電気泳動移動度が別個であることによっても区別された 。発現した菌株＃２３の乳は、−膜化されたクーマン−による蛋白質染色により 示されるように、明らかにヒト（低移動度）およびマウス（高移動度）の両方の アルブミンを含む（図６）。低移動度のバンドは、未変性ゲルおよび免疫プロッ ト分析によりＩＳＡであることが確認された（図６）。 分泌されたＨ　Ｓ　Ａ蛋白質は、未変性ゲルおよび変性ゲルでの電気泳動移動度 において、精製Ｉ　Ｓ　Ａまたはヒトの乳にあるＩ　Ｓ　Ａとは異なる挙動を示 す。未変性ゲルでは、ヒト蛋白質は内在マウス血清アルブミンとは異なる移動度 で移動する。 トランスジェニックマウスの乳における■Ｉ　Ｓ　Ａの再現可能な発現は、ＩＳ Ａの最初の２個のイントロンを遺伝子構造に含めたとき（ｐ　６０７）にのみ最 初に達成され、調べた６個のトランスジェニック菌株のうち４個が乳中にＩＳＡ を発現した。 発現するトランスジェニックマウスの頻度（浸透度）は改善されたが、発現レベ ルは残念ながら低かった（１〜３５μｇ／ｍｌ）。 ＋１３　Ａが乳中で発現するトランスジェニックマウスの数（浸透度）および発 現レベルの両方における意味のある改善は、トランスジェニックベクターにさら にＩＳＡイントロンまたはイントロンの組み合わせを含めることにより得られた 。ベクターｐ６５２（ＩＳＡイントロン１〜６）から作った１２個のトランスジ ェニック菌株のうち４個が乳中でＩＳＡを発現し、２個の菌株が１　ｍ　ｇ／ｍ 　１以上のＩＳＡを発現した（その内１個は約１０ｍｇ／ｍｌで発現）。ベクタ ーｐ６８７　（Ｈ３Ａイントロン７〜１４）から作った７個の菌株は、そのうち ３個がＩＳＡを発現し、１個の菌株は約４〜５　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉで発現した 。 ベクターｐ６９６　（Ｈ３Ａイントロン２千７〜１４）から作りた４個の菌株は 、そのうち３個がＩ　Ｓ　Ａを発現し、１個の菌株は約２．５ｇ／ｍｌで発現し た。ベクターｐ８１２　（Ｈ３Ａイントロン１−４−２　＋　１２〜１４）から は、今までのところ４個のトランスジェニック菌株を作った。これらの菌株のう ち１個のみは充分古く、既に乳中でのＩ　Ｓ　Ａの発現テストを行った。この１ 個の菌株は、Ｉ　Ｓ　Ａを約０．８−１．０ｍｇ／ｍｌの高レベルで発現する。 ｐ６８６（ＩＳＡ遺伝子：すなわち全イントロンｌ−〜１４）からは２個だけ菌 株を作った。２個のうち１個はｔＴ　Ｓ　Ａを発現したが、低レベルであった。 １ｎｖｉｖｏの全結果はｉｎ　ｖｉｔｒｏの発現結果と関連する。ずなわち、ｉ ｎ　ｖｉｔｒｏのｃＤＮＡ構造がらは極めて低レベルのＩＴ　Ｓ　Ａを発現し、 トランスジェニックマウスでのｉｎ　ｖｉｖｏのｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａ構造からは検 出できるＩＩ　Ｓ　Ａの発現はない。１ｎｖｉｊｒｏの構造にイントロン】を含 めると、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｗ４造乏比較して、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ発現のレベルが わずかに高くなる。同様に、ＩＩ　Ｓ　Ａイントロン１を有するトランスノエニ ’ｔ　４７　ｆｆ４造から得た１個のトランスジェニック菌株は発現！−た。ま た、イノトロン１および２を含めると、ｃ　ＤＮＡよりも高レベルの発現が得ら 第１だ。これら２個のイントロンをトランスジェニック構造に含めると、イント ロン１またはｃ　ＤＮＡのいずれよりも浸透度がかなり良好であった。最初の６ 個のイントロン（１〜６）または最後の８個のイントロン（７〜１４）または全 部のイントロン（１〜１４）を１ｎｖｉｔｒｏの構造に含めると、発現レベルが 顕著に高くなった。 これらのｉｎ　ｖｉｔｒｏ結果はｉｎ　ｖｉｖｏ結果と関連し、指示したＩ　Ｓ 　Ａイントロンを有するベクターから作った各々のトランスジェニック菌株の約 ３３９６（ＩＩＳＡイントロン１〜６）、４３９６（ＩＳＡイントロン７〜１４ ）および５０％（［ＴＳＡイントロン１〜１４）が乳中てＩ　Ｓ　Ａを発現し、 イントロン１〜６または７〜】４を有するベクターから作った各々２個または１ 個の菌株はｌ　ｍ　ｇ　／　ｍ　！より高いレベルで発現した。また、ＨＳ　Ａ イントロン２＋７〜１４または１→−２４１２〜１４を膏するｉｎ　ｖｉｔｒｏ ベクターは、前記のベクタ一群よりもかなり高レベルのＨＳ　Ａ発現（ｉｎ　ｖ ｉｔｒｏ）を支持する。 同様に、ＩＳＡイントロン２」−７〜１４を有するトランスジェニックベクター から作ったトランスジェニック菌株の７５％（４個のうち３個）およびイントロ ン１＋２＋１２〜１４を有するベクターから作った菌株の１００％（これまでテ ストした１個のうちの１個）がＩＩ　Ｓ　Ａを発現し、各々の１個の菌株は、約 １ｍｇ／ｍｌまたは１ｍｇ／′ｍｌ以１−の高レベルで発現する。これまで分析 しｔニドランスジェニック菌株の数は限られているが、全部のイントロンを有す る全Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝子に対して、ＩＩ　Ｓ　Ａ遺伝子のサブセントのイントロン を含むベクターを使用したトラ〉スジエニノク菌株では、より高い浸透度および ／′または発現レベルを得ることができると青えられる。トランスジエニ、・Ｉ クマウスの乳中でのｔｌ　Ｓ　Ａ発現レベルが高いことが示された遺伝子構造ま たは非常に高レベルのＩＩ　ＳＡ発現を支持するｉｎ　ｖｉｔｒｏ構造の１−ラ ンスジェニック対応物構造により）・ランスノエニソクヒツジを生産（実施例２ ４）すれば、これらの搾乳動物の乳中ての発現レベルは非常に高くなるはずであ る。 ＩＩ　Ｓ　Ａ　ＲＮ　Ａの発現の組織特異性を調べるために、授乳１０〜１２８ 　［ｌの雌のトランスジェニックマウスの種々の組織から全ＲＮＡを単離した。 ＲＮＡは、実施例１６に記載したように、電気泳動により分別上ナイロン膜に移 し、３２ＰでラベルしたＩＴ　Ｓ　Ａアン千センスＲＮＡでプローブした。 高レベルのＩｆ　Ｓ　Ａ　ｍ　ＲＮΔは、ｌ（Ｓ　Ａを乳中に分泌する授乳期の 雌の乳腺において検出された（菌株＃２３）（図７）。また、転写因子は、骨格 筋、腎臓、肝臓および皮膚で認められるが、他の組織（胛臓、心臓、唾液線、肺 および脳）では認められない。肝臓での発現は内在マウス血清アルブミンである と考えられる。このトランスジェニック転写因子の異所性発現は、明らかな生理 学的異常性とは関係ない。乳に特異的な蛋白質の遺伝子の５′　−フランキング 配列に他の遺伝子を融合したものから得られるトランスジェニック転写因子は、 唾液線、腎臓および脳などの非乳腺組織に蓄積されることがわがっている。 また、トランスジェニック菌株＃２３の乳腺組織におけるＲＮＡでのＬＩ　Ｓ　 Ａの発現は、実施例１６に記載し、図９に示すように、１ｎｓｉｔｕハイブリツ ド形成により示された。 乳中でＩ　Ｓ　Ａを発現するトランスジェニックマウスのスクリーニングは、出 産後の授乳期の雌の乳に対して標準的に行った。 処女および授乳期のトランスジェニック菌株＃２３の乳腺の組織片培養によるＩ 　Ｓ　Ａの発現も示した（実施例１７および図９）。さらに、トランスジェニッ クマウスの種々の菌株間で、乳中てのＨＳ　Ａの発現レベルと処女の雌の乳腺組 織片にょるＨ３Ａの発現および分泌レベルとの関係を示した。若いトランスジェ ニックヒツジの乳腺組織の組織片培養または搾乳動物の他の形態を分析すれば、 最終的に授乳時の乳中にＨ３Ａを発現するトランスジェニック動物の同定がかな り容易になるであろう。 以上、本発明を一般的に記載したが、下記実施例を参照すればより完全な理解が 得られる。これらの実施例は説明のためだけのものであり、特に断らない限り、 本発明を限定するものではない。 実施例１ Ａ、５′　−および３′　−フランキング領域を有するヒツジβ−ラクトグロブ リン遺伝子のクローン化（λ２２−１．　λ１Ｏ−ヒツジβ−ラクトグロブリン （ＢＬＧ）遺伝子の制限酵素地図（Ｓｉｍｏｎ＋　ｅｌ　＋１．、１９８Ｂ、　 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｔ　６：　１７９−ｊ８３）によれば、転写Ｂ　Ｌ 　Ｇ配列がただ１個のＥｃｏＲ１部位を有し、５′−フランキング配列内の転写 領域の上流的３ｋｂおよび３′　−フランキング配列内の転写ユニットの上流的 １ｋｂのと二ろにＥｃｏＲ１部位が存在することが示された。従って、ＢＬＧ遺 伝遺伝コランキング領域を制限酵素で処理すると２個のＢ　Ｌ　Ｇ遺伝子断片　 （１）ＢＬＧプロモータを含む５′−フランキング配列およびｎ　Ｌ　Ｇ転写ユ ニットの最初の部分から成る断片（約４．１〜４．３ｋｂ）（５’　−領域とす る）および（２）ポリアデニル酸部位を含む残りの転写ユニットおよび３′−フ ランキング配列から成る断片（約４．４ｋｂ）（３’　−領域とする）が得られ る。従って、ＢＬＧ遺伝子およびフランキング領域は、これら２個のＥｃｏＲＩ サブゲノム断片から成る２個の遺伝子ハーフとしてクローン化した。 高分子量のヒツジ肝臓ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩでかなり消化した。切断断片 をサイズマーカーの基準ＤＮＡとともに０．６’Ｘのアガロースゲル上で分離し た。ゲル上のＢＬＧ断片の位１１を確認するために、サイズマーカーおよび切断 した約５％のヒツジＤＮＡから成る分析用のゲル垂直片を残りのゲルから切り取 り、臭化エチジウム（Ｅ　ｔ　Ｂ　ｒ）で染色して、紫外線下で写真を撮った。 残りのゲル（調整物）は、プラスチックのラップで覆い、使用するまで４℃に置 いた。分析用のゲルは、鋳型として牛のＢＬＧｃＤＮＡを用いてランダムプライ マー法により作った３２Ｐ−標識プローブを使用してサザン分析にかけた。プロ ーブとして使用した牛のｃ　ＤＮＡクローンは、Ｄｒ。 Ｃｇ＋Ｉ＾、Ｂ１１．　Ｃｏ＋＋＋ｆｆ１ｌｌ　Ｕｎｉｖｃ＋＋ｉ１７から提供 してもらった。分子量約４．３ｋｂの単一バンドのみが検出された。この単一バ ントは、このゲル系で共移動した４、３および４．４の両方のＥｃｏＲＩサブゲ ノム断片を表す。この共移動は、４．３および４．４ｋｂ特異プローブを使用し て別のサザン分析により確認した。ＢＬＧ断片を含む予備のゲルの対応する領域 をアガロースゲルから切り出した。ＤＮＡをこのゲル片から電気溶離し、Ｅ　ｌ 　ｕ　ｐ　ｔ　ｉ　ｐ−ｄ　（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ＋　ｅｎｄ　５ｅｈｎｅｌｌ ）により精製しくすなわち、ゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製）、エタノールで析出 させた。 Ｂ　Ｌ　Ｇ断片を単離してクローン化するために、ゲルから溶離して精製したサ ブゲノムＤＮＡを、あらかじめＥｃｏＲＩで処理して脱リン酸化した　Ｓｌ＋ｔ ｌＢｅｎ＋　λｇｔｌｏベクターに連結した。連結産物をＧｉｇｘｐ＊ｃｋ　Ｐ Ｉａ＋　抽出物　（Ｓｌ＋＊１Ｂｓｎｅ）でパッケージングし、得られるサブゲ ノムライブラリーの約５００．０００個のプラークを０６００細胞　（Ｓｌ＋ｔ ｌＢｅｎｅｌ上で平板培養し、プラーク形成のためにインキュベートした。平板 を２部、ニトロセルロースフィルターに置き、標準方法で処理した。続いて、フ ィルターを焼付けし、前１１イブリツド形成させ（５ｘＳＳＰＥ、ｌ／２５ＢＩ ｏｔｔｏ、０．２％５ＤＳ）、３２Ｐ−牛ＢＬＧｃＤＮＡプローブを含む同じ緩 衝液により６２℃で一夜ハイブリッド形成させた。フィルターを洗浄し、最後の 最も厳しい洗浄は、６２℃で１ｘｓｓｃ、０．２９６　Ｓ　Ｄ　Ｓにより行った 。次いで、フィルターをオートラジオグラフィーにかけた。いくつかの重複した 陽性のプラークが確認され、Ｙ１０ＢＢ細胞での精製のためにサブプラーク形成 させた。ＢＬＧの５′　−領域または３′　−領域のいずれかを含むクローンを 、各々、ＢＬＧエクソン２および５′−プローブまたはエクソン５および３′− プローブのいずれかを用いて示差的ハイブリッド形成させることにより同定した 。５′　−領域を有するクローン（５′−クローン）（λ２２−１とする）およ び３′　−傾城を有するクローン（３′−クローン）（λ１０−１とする）を使 用して次のサブクローン化を行った。 Ｂ、λ２２−１およびλ１０−１ファージ由来のＢＬＧ５’　−および３′　− 領域のｐＧＥＭ−１プラスミドでのサブクローン化（ｐ　５７０．　ｐ　５６８ ） 組換えファージ（λ２２−１およびλ１Ｏ−１）およびＤＮＡを、Ｌｍｓｂｄ＊ Ｓｏ＋ｂ　（Ｐ＋ｏｍｅ（１）を使用し、それらのプロトコルに従って精製した 。クローン化したＢＬＧ　ＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化することにより組換えファ ージＤＮＡからはずす。λ２２−　Ｉ　ＤＮＡから切り離したＢＬＧ５’　−領 域（約４．３に、ｂ）およびλ１（ＩＩＤＮＡから切り離したＢＬＧ３′−領域 （約４．１〜４．４ｋｂ）をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールにより 析出させた。 Ｂ　Ｌ　Ｇ　５　’　−領域をサブクローン化するためにプラスミドベクターｐ 　Ｇ　Ｅ　Ｍ　１をＰＶＩＪＩ＋およびＥｃｏＲＩで処理して準備し２、大きい ベクター断片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールにより析出させた。 クローニングアダプターを下記に示す２個の合成オリゴヌクレオチドのアニーリ ングにより作製した。 Ｓａｌ工　（ＥｃｏＲＩ） ３　’　ＣＡＧＣＴＧＣＧＣＣＧＧＣＧＴＴＡＡ　５　’（注　括弧内の部位は 切断できない。）アダプターは、そのアダプター配列が、５’　−ＡＡＴＴの後 に真正のＥｃｏＲＩ配列に見られるＣの代わりにＧを挿入するこにより真正のＥ ｃｏＲＩ配列とは異なっており、アダプターのＥＣ０ＲＩ適合端を、挿入するＢ 　Ｉ−、Ｇ　５’　−領域のいずれかのＥｃｏＲＩ末端に連結させ、そうするこ とによりＥｃｏＲＩ部位をその連結箇所で壊すように設計した。さらに、そのア ダプターは、隣接したＢＬＧ５’　−領域を、平滑Ｐ　ｖ　ｕ　Ｉｆ部位とアダ プターの平滑末端との連結により、作製したｐＧＥＭ−１ベクターのＰ　ｖ　ｕ 　１１部位に連結させる。アダプターに連結しなかったＢＬＧＥｃｏＲＩ末端は 、作製したｐＧＥＭ−１ベクターのＥｃｏＲ１部位に自由に連結した。作製した ｐＧＥＭ−１ベクター、ＢＬＧ５’　−領域挿入フラグメントおよびアダプター は一工程で連結した。Ｂｌ、Ｇ　ＤＮＡは、いずれかの方向でアダプターとプラ スミドＥｃｏＲ１部位との間に連結することができた。連結産物は、大腸菌Ｄ１ １５細胞に入れて形質転換し、アンビンリン耐性とした。耐性細菌コロニーを、 Ｗｈ＊１１ｎ　５４１フイルターリフトおよび３２Ｐで標識化したＢＬＧエクソ ン２および５′プローブによるハイブリッド形成により、挿入ＢＬＧを含むプラ スミドの有無を分析した。陽性のコロニーを選択してＬＢ−ａｍｐ培地で生育さ 七た。これらの単離物からプラスミドＤＮＡを作製した。クローンをＢ　ａ　ｍ 　ＨＩにより制限酵素分析すると、所望の方向で挿入されたＢ　Ｌ　Ｇを含むク ローンを選択することができた。所望の方向で挿入されたＢ　Ｌ　Ｇを含むプラ スミドをＢ　ａ　ｍ　ＨＴで処理すると約４２００および２８００ｂｐのＤＮＡ 廖Ｔ　）４が得ら第１、・方、所望しない方向で挿入されたＴ３　Ｌ　Ｇから得 たＤＮＡ断片は、約５８００および１３８０ｂｐであった。制限酵素分析により 、所望のクローンはｐＣ，Ｅ　Ｍ　１のＰ　ｖ　ｕ　ＩＩおよびＥｃｏＲ１部位 の間にＢ　Ｌ　Ｇ５′　領域を含むこ古がＢ１認された。アダプターの平滑末端 はｐＧＥＭ−１のＰｖｕ１１部位に隣接する。ｐｖｕｌ１部位は、最終り

【］− ンでは切断できない。Ｂ　Ｌ　Ｇ　５　’　−領域′の５′−末端は、アダプタ ーのＥｃｏＲＩ適合領域に連結する。このＥ　ＣＯＲ１部位は連結により破壊さ れる。アダプターにより、５ａｉ１部（１γがＢ１、Ｇ領域の５′−末端のすぐ −Ｆ流に導入されＣいた。二の部位は、ＢＬＧ５’　−または３′　−領域のい ずれにも存在しない。ｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　−１のＥｃｏＲ［部位に連結したＢｌ、 Ｇ　５　’　−領域の３′　−末端のＥｃｏＲ１部位は再生され、後の制限酵素 分析およびＢＬＧ３’−領域の５′　−末端への連結に利用される。所望の正（ 、い方向にあるＩ’３ＬＧ５’　−領域槽ａ（りｔ］−ン）はｐ５７０と命名し 、さらに研究するために使用した。所望の方向にないＩ’３ＬＧ配列を有するク ローンはｐ５７１、ｌ！：命名（２、後の構成に利用した。 ＥｃｏＲＩで処理し、精製した４、４ｋｂのｒ３ＬＧ３’−Ｉｆｆ域ＤＮＡをプ ラスミドｐＧＥＭ−１のプラスミドＢａｍＨＴおよびＥｃｏＲＩ切断部位の間に 入れてサブクローン化した。 Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩおよびＥｃｏＲＩ処理したｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　、−１は、ゲルお よびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールにより析出させた。アニーリングした２個 の合成オリコゴヌクレオチドから作ったクローニングアダプターの配列は以下の 通りだった。 （ＥｃｏＲＩ）　ＢａｍＨＩ 先のアダプターと同様に、そのＥｃｏＲＴ適合端はＢ　Ｌ　Ｇ３′　−領域のい ずれかのＥｃｏＲＩ末端に連結するこきができたが、その結果そのＥｃｏＲ１部 位は消失した。この場合、アダプターのＥｃｏＲＩ適合部位の次は、真正のＥｃ ｏＲ１配列に見られるＧ　／　Ｃｂ　ｐとは反対にＴ　／　Ａ　ｂ　ｐであった 。作製したｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　１　（Ｂ　ａ　ｍ　Ｌ（ＩおよびＥｃｏＲＩ末端） 、アダプター（Ｂ　ａ　ｍ　Ｂ１１およびＥｃｏＲ＋適合端）および挿入するＢ ＬＧ３’　−領域（ＥｃｏＲＩ両末端）による３か所の連結を行った。アダプタ ーのＢ　ａ　ｍ　Ｈ１部位は、ｐＧＥＭ−１のＢ　ａ　ｍ　８１部位に連結する はずである。ＢＬＧ３’　−領域は、アダプターのＥｃｏＲＩ適合部位とｐ　Ｇ 　Ｅ　Ｍ　−１のＥｃｏＲ１部位との間にいずれかの方向で連結する。連結産物 を、形質転換によりアンビンリン耐性にして大腸菌Ｄ　Ｈ５細胞に導入した。所 望の方向にあるＢ　Ｌ　Ｇ　３　’　−領域を有するクローンは、Ｂａｍ１ｌ＋ により約４５００．２０００および８００ｂｐの断片を生しることを特徴とした 。所望のクローンの制限酵素分析により、Ｂ　Ｌ　Ｇ　３　’　−領域の５′− 末端にあるＥｃｏＲ１部位がｐＧＥＭ−１のＥｃｏＲ１部位に連結してＥｃｏＲ Ｔ部位を再生し、ＢＬＧ３’　−領域の３′−末端にあるＥｃｏＲ１部位がアダ プターのＥｃｏＲＴ適合部位に連結して、その結果このＥｃｏＲ１部位は破壊さ れニアダブターおよびｐＧＥＭ−１の連結したＢａｍＨｒ部位はＢａｍｌｌＴ部 位を再生し、ｐＧＥＭ−１ポリリンカーの５ａｌ１部位はＢＬＧ３’　−領域（ およびアダプター）のちょうどＦ流であることを確認した。ＢＬＧ３′　−領域 の５′　−末端にあるＥｃｏＲ１部位は、後に、２個のＩ’３ＬＧ遺伝子ハーフ を連結するために使用する。所望のクローンをｐ５６８と命名し、さらに研究す るために使用した。 Ｃ，ＢＬＧエクソノ１のＰＶ＋Ｊｌｌを５ｎａＢＩ部位で置き換えた完全ＢＬＧ ベクターの構成（ｐ５８５ベクター）ＢＬＧベクターの真のＰ　ｖ　ｕ　ＩＩ部 位（ＢＬＧエクソン１の未翻訳部分内）に外来遺伝子（Ｉ　Ｓ　Ａなど）を入れ てクローン化するのを容易にするために、このＰ　ｖ　ｕ　Ｉｆ部位に５ｎａＢ Ｉ部位を導入した。天然のＢＬＧ配列またはＢＬＧ配列をクローン化するｐＧＥ Ｍ細菌プラスミド配列には５ｎａＢＩ部位は存在しない。従って、導入される５ ｎａＢＩ部位は独自のもので、ＢＬＧ配列の適切な位置に外来遺伝子を導入する のを単純化する。 ｐＧＥＭ−１に入れてクローン化したＢＬＧ遺伝子（Ｅｃ。 Ｒ１サブゲノム）の５′一部分（すなわち、プラスミドｐ５７０）は、３個のＰ 　ｖ　ｕ　Ｉｆ部位を有し、ＢＬＧエクソン１内の適切な部位も含まれる。他の ２個のｐ　ｖ　ｕ　Ｉｔ部位は各々、エクソン１内のＰ　ｖ　ｕ　１１部位の上 流的２１００ｂｐおよび２６００ｂｐの位置にマツピングされた。プラスミドｐ ５７０をｐ　ｖ　ｕ　Ｉｔで部分的に消化し、線状プラスミド（約７２００ｂｐ ）をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製した。配列が５’−ＧＴＡＣＧＴＡＣ−３′で ある合成した５ｎａＢＴリンカ−オリゴヌクレオチドを自己アニーリングした。 アニーリングされたリンカ−を精製した線状プラスミドｐ５７０と連結した。連 結産物を大腸菌Ｄ１１５細胞に導入して形質転換し、アンピシリン耐性とした。 所望の組換え体を、５ｎａＢＩが存在すること、エクソン１のｐ　ｖ　ｕ　ＩＩ 部位がないこと、および上流に２個のＰ　ｖ　ｕ　Ｉｆ部位が存在することによ り同定した。正しいプラスミドをｐ５８３と命名した。 エクソン】のＰ　ｖ　ｕ　Ｉｔを５ｎａＩ３１部位で置き換えたＢＬＧ遺伝その ５′　−ハーフとＢＬＧ遺伝子の３′−ハーフとの組換えを次のように行った。 構造ｐ５８３（５’　−領域を含む）をＰｖｕ　Ｉ　（ｐＧＥＭ−１内）および ＥｃｏＲＩ　（５’　−ＢＬＧ領域の３′−末端と隣接するｐＧＥＭとの接合箇 所）で処理した。プラスミドＡｍｐ耐性遺伝子の３′　一部分、元のプラスミド およびＢ　Ｌ　Ｇ遺伝子の５′　一部分を含むＤＮＡ断片（約５８００ｂｐ）を ゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールで析出させた。 Ｂ　Ｌ　Ｇ遺伝子の３′　−ハーフを含むプラスミドｐ５６８を同様にｐｖｕ　 ＴおよびＥｃｏＲＩで処理した。Ａｍｐ耐性遺伝子のＰｖｕ　１部位までの５′ 　一部分を含み、上記断片のその部分と相捕的であるｐＧＥＭ−１配列およびＢ ＬＧ遺伝子のｐＧＥＭとの５’　ＥｃｏＲＩ接合箇所までの３′　−ハーフを含 む約５８００ｂｐのＤＮＡ断片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールで 析出させた。２個の精製した断片を連結し、大腸菌Ｄ　ｔ（５細胞に導入して形 質転換し、アンピシリン耐性とした。正しく組換えられた断片のみが完全なアン ピシリン耐性遺伝子を再生する。完全ＢＬＧ遺伝子の正しい組換えは、制限酵素 ５ａｉｌで約８８００ｂｐのＢＬＧ全長領域を切断することによる制限酵素分析 により確認した。このｐ５８５と命名した新しいプラスミドは、ｐＧＥＭ−１細 菌プラスミドおよび記載した完全＋３ＬＧ遺伝子（ＢＬＧのエクソン１のＰ　ｖ 　ｕ　Ｉｆ部位が５ｎａＢＩ部位で置き換わっている）から成る。 Ｄ、前述の１３ＬＧベクターの５’　−ＢＬＧ配列の上流を伸長した羊ゲノム配 列のクローン化（ｐ　６３９．　Ｉ）　６４２）前述したＢＬＧベクター内のＢ ＬＧをコードする配列の上流にある５′−配列は、約３ｋｂのゲノムＤＮＡ断片 を含む。この３ｋｂの領域はＢＬＧプロモータ配列を含む。この３ｋｂの断片の 上流にある配列がＢＬＧプロモータによる発現のコンシスチンシーおよび／また はレベルを上げるような因子を含むかどうかを調べるために、上流のゲノム配列 をクローン化した。 高分子量のヒツジ肝臓ＤＮＡを種々の制限酵素を使用してすザン分析にかけた。 すでに得たＢＬＧ配列の５′　一端、すなわち、５ａｌｌからＰｖｕｌｌの断片 （約４５０ｂｐ）をサザンゲノムの反復配列とハイブリッド形成した。従って、 ５ａｌｌ−Ｐ　ｖ　ｕ　Ｉｆ断片の下流にあるｐ　ｖ　ｕ　Ｉｆ−Ｐ　ｖ　ｕ　 Ｉｆ断片（約５００１）ｐ）およびＰｖｕｌｌ−Ｐｖｕｌｌ断片の下流にあるＰ ｖｕｌｌ−Ｂ　ａ　ｍ　Ｈ１断片（約６００ｂｐ）をプローブとして使用した。 これらのプローブ断片は、ｐ５７０をＢａｍＨＩおよびＰｖｕｌｌで消化するこ とにより生じ、５００およびｅｏｏｂｐの適切な断片をゲルおよびｅ１ｕｔｉｐ 精製してエタノールで析出させた。プローブＩ）　Ｎ　Ａは、ランダムプライマ ー法により３２Ｐで標識化した。 号ザン分析により、プローブ陽性の１ｌｉｎｄｌｌｌ断片（約８ｋｂ）およびプ ローブ陽性のＳａｃ［断片（約８．６ｋｂ）が示された。この結果、＋Ｉ　ｉ　 ｎ　ｄ　ＩＩＩおよびＳａｃ［の部位が各々、先に得た［３　Ｌ　Ｇ配列の５′ 一端の上流約２．５ｋｂおよび７．８ｋｂであるマッシを得ることができた。 篩分「量のヒツジｌ）　ＮΔを５ａｃｌまたは■１曹１ｄｌｌｌのいずｔｌかで かなり消化しｊ、−０切断断片を０．６％のアガロースゲル−■、で分離しｔ− ｏサイズマーカーおよび切断された約５％のヒツジＤＮＡから成る分析用の各ゲ ル片を残りのゲルから切り取り、臭化エチジウムで染色して、紫外線下で写真を 撮った。残りのゲルは予備としてプラスチックのラップで覆い、使用するまで４ ℃に置いた。分析用のゲルは、上記の３２Ｐ−標識プローブを使用してサザン分 析にかけた。プローブ陽性のＨｉ　ｎ　ｄｌｌｌ（約８ｋｂ）および５ａｃｌ（ 約８．６ｋｂ）断片を確認した。対応する領域を調製ゲルから切り出した。ＤＮ Ａを電気溶離し、Ｅｌｕｐｔ　ｉｐ単離し、エタノールで析出させた。 Ｈｉｎｄｌｌｌおよび５ａｃｌにより得られた断片のサブゲノムライブラリーを 構成するために、ベクターλＺ　ａ　ｐ　ＩＩ　（Ｓｌｕｒｌｌｇｅｎｅ）を使 用した。５ａｃｌサブゲノムライブラリーに対しては、ベクターλＺ　ａ　ｐ　 ＩＩをＳａｃ　Ｉで処理してＣＩＰにより税すン駿化した。Ｈｉｎｄｌｌｌサブ ゲノムライブラリーに対しては、λＺａｐＨをまず自己連結して付着末端を共に 連結させた。次いで、５ｐｅｌで処理し、タレノウポリメラーゼおよびｄＣＴＰ およびｄＴＴＰで一部を充填した。 精製したＨｉｎｄｌｌｌサブゲノムＤＮＡは、タレノウポリメラーゼおよびｄＧ ＴＰおよびｄＡＴＰで一部を充填した。これらの部分的に充填したＨｉｎｄｌｌ ｌ末端は、部分的に充填したλＺａｐＨ５ｐｅｌ末端と適合した。ｔｌｉｎｄｌ ｌｌサブゲノムＤＮＡはＳｐｅ　Ｉで消化したスベクターに連結し、Ｓａｃ１号 ブゲノムＩ）　Ｎ　Ａは５ａｃｌで消化したλベクターに連結した。 古々をＧｉｇｍｐｇｅｋ　ｌ’ｌａ＋　ＩＩ抽出物（５ＩｚｌＢｅｎｅ）でパッ ケージングし５、Ｐ　Ｌ　Ｋ　−Ａ　ＩＩＩ胞（５ｌｚｌＢｅｎｅ）　１−で甲 板培養した。平板を２部、ニトロセルロースフィルター上に置いた。フィルター は、λ２２−１およびλ１０−１のライブラリースクリーンで説明したように処 理した。フィルターを、この章の初めで説明したように３２Ｐ−標識プローブと ともに・・イブリッド形成させた。フィルターを洗浄した。重複した陽性のプラ ークはサブプラーク形成させて精製Ｌ１最後の最も厳しい洗浄は、６２℃で０． ５ｘＳＳＣ，０，２％ＳＤＳにより行った。ＢＬＧ配列を含むｐＢｌｕｅｓｃｒ ｉｐｔ　ＳＫファージミドを、Ｒ４０８ヘルパーファージ（Ｓｔ＋ｘ１ｍｇ＋ｎ ｅ）を使用し、供給者が勧める方法により、λＺａｐＨ陽性クローンからｉｎ　 ｖｉｖ。 て切り出した。そのファージミドをＸ　Ｌ　１−ブルー細胞（ＳｌｚＮｇ＋ｎｅ ）に集め、ｉ、　Ｂ−アンビンリン平板で選択した。 選択したコロニーをＬ　Ｂ−アンピシリン培地で培養し、これらの培地から得た プラスミドを制限酵素分析にかけた。 Ｈｉｎｄｌｌｌサブゲノムクローン化の適切なりローンは、最初に、約４．４ｋ ｂのＥｃｏＲＩ断片ならびに約１９００および１０７５ｂｐＡｓｐ７１８　（Ｋ ｐｎｌのアイソンゾマー）断片（これらは全て、すでにクローン化したＢ　Ｌ　 Ｇ領域のマツピングですでに線描写されている）の有無により同定した。 そのベクターのＳｐｅ　１部位に入れてクローン化したＢＬＧＨｉｎｄｌｌｌサ ブゲノム断片は、両方向が存在した。Ｓｐｅ１部位に入れてクローン化したＢＬ Ｇ　Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ断片の５′一端がプラスミドの多重クローン化５ａ１１部 位の方向にある所望の断片は、ＥｅｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌにより消化する と約２５００ｂｐの断片が得られることを特徴とした。この所望のＨｉｎｄｌｌ ！サブゲノムＤＮＡクローンをｐ６３９と命名した。Ｂ　Ｌ　Ｇ領域の５′　一 端は、元のＢＬＧクローン（例えば、ｐ５８５）の５′一端からさらに上流に約 ２．５ｋｂ伸長した。 Ｓａｃ　ｒサブゲノムクローン化の適切なりローンは、最初に、ＥｃｏＲＩおよ びＨｉｎｄｌｌｌによる消化により約２５００ｂｐの断片が得られ、５ａｃｌお よびＨｉｎｄｌｌｌによる消化により３８００ｂｐの断片が得られることにより 同定した。 ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫプラスミド内で所望の方向のＢ　Ｌ　Ｇ配列を有 するクローンは次のように同定した。５ａｃＴサブゲノムクローンをＥｃｏＲＩ で消化し、ｐ５７０ＢＬＧ配列の５′一端に相同的で、従って上述した５ａｃＴ サブゲノム断片内のＢＬＧ配列の３′　一端と相同的な３２Ｐ−標識ｐ５７０Ｂ ａｍＨＩ／Ｐｖｕｌｌプローブを使用してサザン分析にかけた。 約４．２ｋｂのプローブ陽性ＥｃｏＲｒ断片によりプラスミドを同定したが、Ｓ ａｃ　Ｉ断片の最も上流端がプラスミドの多重クローン化部位（Ｓａｌ１部位な ど）の隣になるものを所望の方向とした。この適切な所望のクローンをｐ６４２ と命名した。 ｐ６３９　（Ｈｉｎｄ　ＩＩＩサブゲノム）およびＩ）６４２（ＳａｃＴサブゲ ノム）が元のＢＬＧクローン（例えば、ｐ５７１）と重複するＢＬＧの上流の塩 基配列を含むことを塩基配列により確認した。ｐ５７１でクローン化した元のＢ ＬＧ５’　一部分の５′　−配列を５’　ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡ ３’の配列を有するＳｐ６ブロモータプライマーを使用して決定した。その配列 を、Ｓｐ６プロモータブライマーを使用して得た塩基配列に由来するプライマー ・５’　ＴＧＴＴＴＧＧＧＧＡＣＴＴＣＣＣＴＧＧＴＧＡ３’　を使用すること によりｐ５７１の８１、Ｇ配列中でさらに伸長した。 第２のプライマーを使用して得た配列は、ｐ５７１、ｐ６３９およびｐ６４２構 造で同一であり、後者２個のクローンがＢＬＧの上流の配列を含むことを確認し た。さらに、Ｓｐ６ブロモータプライマーから得た配列に由来する３’　ＡＧＴ ＣＣＣＡＣＴＡＣＧＡＣＣＧＧＡＧ５’の第３プライマーを使用して、元のＢＬ Ｇクローンの５’　−ＥｃｏＲ１部位の上流の配列を得た。予想した通り、ｐ６ ３９およびｐ６４２の両方から得た配列は同一であり、最も近似した２５塩基は ｐ５７１の最も５′−側の塩基と同一で、天然のＥｃｏＲ１部位を含んでいた。 Ｅ、ＢＬＧをコードする領域を有し、５′−配列を伸長した完全ＢＬＧベクター の構成（ｐ　６４４．　ｐ　６４６）プラスミドｐ６３９およびｐ６４２で各々 Ｈｉｎｄｌｌｌおよび５ａｃｌヒツジＤＮＡサブゲノムとしてクローン化した５ ′−伸長ＢＬＧ配列を、次のように、ＢＬＧを発現することができる全長ベクタ ーに導入した。 Ｈｉｎｄｌｌｌ断片に含まれる配列を導入するために、まず、５′　−伸長部分 をプラスミドｐ５９０の５’　−ＢＬＧ領域と組換えた。ｐ５９０はＡｓＰ７１ ８で完全に、５ａ１１で部分的に消化した。Ａｓｐ７１８部位の下流から５ａｌ ｌ部位までのＲＬ　Ｇ配列および隣接するｐＧＥＭ配列を含む約４９４０ｂｐの ＤＮＡ断片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールで析出させた。ＢＬＧ 　ｌ１ｉｎｄ　ＩＩＩ断片（約４６００ｂｐ）の５′一端は、ｐ６３９から、５ ａｌｌ（ポリリンカーにおいて、＋１ｉｎｄｌｌｌ断片の５′一端のすぐ上流） による消化およびＡｓｐ７１８　（元のＩ’３ＬＧ５’−ＥｃｏＲｒ部位の下流 ）による消化によって切離し、ゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製してエタノールで析 出させた。作製したｐ５９０およびｐ６３９断片を共に連結した。連結産物を大 腸菌Ｄ　Ｈ５細胞に導入して形質転換し、アンピンリン耐性とした。正しい組換 え体は、ＥｃｏＲＴによる切断で２個の断片（約７０９０および２５００　ｂ　 ｐ）が生し、５ａｌｌにより２個の断片（約６７５８および２８３５ｂｐ）が生 し、Ｂｇｌｌ＋によりプラスミドが約９５９０ｂｐの大きさに線状化されること により分析した。正しいクローンはｐ６４０と命名した。プラスミドｐ６４０は 、上流のＨ４ｎｄ１１１部位から５ｎａＢＩクロ一ニング部位のすぐ上流の転写 開始部位までの約５．５ｋｂのＢＬＧ５’−領域を含む。この５゜５ｋｂの５′ 　−領域を完全ＢＬＧコードおよび３′　−領域と組換えた。プラスミドｐ６４ ０をＰｖｕ　Ｉ　（ｐＧＥＭ内）および５ｎａＢＩで消化すると、ｐＧＥＭベク ターの一部および５．５ｋｂのＢＬＧ５’　−領域から成る約７０４３ｂｐのＤ ＮＡ断片が得られた。プラスミドｐ５８５もＰｖｕ　Ｉおよび５ｎａＢＩで消化 すると、ｐＧＥＭベクターの残りの部分ならびにＢＬＧコードおよび３′−領域 から成るＤＮＡ断片（約７０４１ｂｐ）が得られた。これらの断片をゲルおよび ｅｌｕｔｉｐ精製してエタノールで析出させた後、共に連結した。連結産物を使 用してＤ　Ｈ５細胞を形質転換し、陽性の形質転換細胞をＬＢ−アンピシリン平 板上に選択した。５′−ＢＬＧ配列（約５．５ｋｂ）　、ＢＬＧをコードする配 列および３’−ＢＬＧ配列から成る正しい組換えクローンは、ｌ１ｉｎｄ１１１ 消化により３個のＤＮＡ断片（約７８４０．３４１０および２８３０ｂｐ）が得 られることにより同定した。正しいクローンをｐ６４４と命名した。 ヒツジＤＮＡ　５ａｃｌクローンに含まれる５’　−ＢＬＧ配列を全長のＢＬＧ ベクターに導入したが、まず、これらの配列を、Ｈ４ｎｄｌｌｌクローンｐ６４ ２に由来する５’　−ＢＬＧ配列を含むプラスミドｐ６４０に含まれる５’　− ＢＬＧ配列に連結した。プラスミドｐ６４０はＥｃｏＲＶで消化して、２個の部 位で切断した。１個のＥｃｏＲＶ部位は、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　ＢＬＧ配列の５′ 　一端のすぐ上流にあるｐＧＥＭポリリンカー内にあった。第２のＥｃｏＲＶ部 位は、元の５’　−ＢＴ−Ｇ　ＥｃｏＲ１部位のすぐ上流にあった。得られた約 ７１５０ｂｐのＤＮＡ断片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製してエタノールで析出 させた。次いで、この断片の両端を牛の腸にあるアルカリ性ホスファターゼ（Ｃ ＩＰ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）により脱リン酸化した。この脱リン酸化したＥｃｏＲ Ｖ部位に、元の５’　−ＥｃｏＲ１部位のすぐ−Ｌ流にある共通のＥｃｏＲＶ部 位からそのＥｃｏＲＶ部位まで伸長したＢ　Ｌ　Ｇ配列を連結した。後者のＤＮ Ａ断片（約７７００ｂｐ）は、ｐ６４２をＥｃｏＲＶで消化した後、ゲルおよび ｅｌｕｔｉｐ精製してエタノールで析出させることにより得た。連結産物をＤＨ ５細胞に組み入れて形質転換し、陽性の形質転換細胞をｒ、　ｒ＋−アンピシリ ン平板上に選択した。ｐ６４２が正しい所望の方向でｐ６４０に挿入されたクロ ーンは、２個のＢｇｌｌｌ　ＤＮＡ断片（約１０，１４０および４７１０　ｂ　 ｐ　）があることを特徴とｊ５た。Ｂｇ１１１部位は、ヒツジＤＮＡのサザン分 析により、５’　−３ａｃＴ部位の上流約６００１）　ｐにマツピングされてい た。正しいクローンをｐ６４５と命名した。ｐ６４５クローンは、ＢＬＧ転写開 始部位の上流約１０．８ｋｂの５’−ＢＬＧ配列、続いて５ｎａＢＩ部位、天然 ＢＬＧのポリアデニル酸シグナルおよび部位を含む３’−ＢＬＧ領域、ならびに ｐＧＥＭ細菌プラスミドを含む。 ｐ６４５はＢＬＧをコードする配列を含まない。ｐ６４５を使用して１０．８ｋ ｂの５’　−ＢＬＧ配列を有するＢＬＧ全長ベクターを作った。ｐ６４５は、５ ｎａＢＩおよびＰｖｕｌ（＋）ＧＥＭ内）で消化した。細菌プラスミド配列およ び５ｎａＢＩ部位の上流１０．８ｋｂの全５′−配列から成る約１２，２９０ｂ ｐのＤＮＡ断片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製してエタノールで析出させた。Ｂ ＬＧをコードする配列およびＢＬＧ３’−配列ならびに細菌プラスミドが、同様 にゲル精製して作製したｐ５８５から５ｎａＢＩ、ＰｖｕｌＤＮＡ断片（約７０ ４０ｂｐ）として得られた。これら２個のＤＮＡを共に連結し、大腸菌ＤＨ５細 胞に導入して形質転換し、アンピシリン耐性とした。正しい組換え体は、Ｘｂａ ｌで消化すると約１４，０４０．２８６０および２４３０ｂｐのＤＮＡ断片を生 し、ｐ６４６と命名した。 実施例２ ヒト血清アルブミン（ＨＳ　Ａ）遺伝子のクローン化（ｐ　６５０゜ｐ６５１） Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝子のＤＮＡ塩基配列はＭｉｎｇｈｅｌｉｉ　ｅｌ　麿１．．　（ １，Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｓｉ＋ｌ＋ｙ　２６１：　６７１７−６７５７．　１９８ ６）によって決定され、ＮＩ　Ｈ核酸塩基配列データバンク　ＧｅｎＢａｎｋ６ ７に登録された。この塩基配列内の３個のＮｅｏ　Ｔ部位を、Ｓ　Ｅ　Ｑ−５ｅ ｑ＠ｒｎＣｅ　Ａｎ＊ｌＢｉ＋　Ｓｙ＋ｌｐｍ＋　ｐ＋ｏｇ＋＋ｓ　ｏｆ　１ｎ ｌｅｌｌｉ　Ｇｓｎｅｌｉｃ＋、Ｉｎｃにより確認した。第１のＮｃｏ１部位は ＩＴ　Ｓ　Ａエクソン１の上流約２７５ｂｐにある。第２の部位はエクソン７内 にあり、第３部位はエクソン１５のド流約２２７ｂｐにある。従って、ヒト高分 子量ＤＮＡをＮｃｏＹで消化すると８０７９および９３７４１）　ｐの２個の断 片が得られるはずであり、その２個を合わせるとＩ　Ｓ　Ａ遺伝子全体を含む。 ８０７９ｂｐ断片はＨＳ　Ａ遺ｆｉ　Ｆの５′−ハーフを表し、９３７４ｂｐ断 片はその遺伝子の３′　−ハーフを表す。遺伝ｆ−をクローン化して取り出す方 法は、ヒトＤＮＡをＮｃｏｌで消化し、大きさの近似した、予想される２個のＩ 　Ｓ　Ａ断片のＩ）　Ｎ　Ａから２個の別々のサブゲノムライブラリーを作り、 これらのライブラリーから得たＨ　Ｓ　Ａクローンを同定することたった。 高分子量のヒト胎盤ＤＮＡをＮｃｏｌでがなり消化した。切断した断片を、サイ ズマーカーの基準ＤＮＡと共に０．６％のアガロースゲル上で分離した。サイズ マーカーおよび切断した約５％のヒツジＤＮＡから成る分析用のゲル垂直片を残 りのゲルから切り取り、臭化エチジウムで染色して、紫外線下で写真を撮った。 残りのゲル（ｒＡ製部分）は、プラスチックのラップで覆い、使用するまで４℃ に置いた。分析用のゲルは、ランダムプライマー法によって作るジゴキシゲニン ーｄＵＴＰでラベルしたＨ３ＡｃＤＮＡプローブを使用し、ｔｈｅ　Ｇｅｎ１ｕ ｓ　ＳｙｓｔｅｍＤＮＡ　Ｌ＊ｂ＠ｌｉｎｇ　Ｋｉｔ　（８ｏｅｈ＋ｉＢｅ＋　 Ｍｔｎｎｈｅｉｍｌのプロトコルに従ってサザン分析にかけた。プローブを作る ための基質ＤＮＡは、プラスミドｐＨ３Ａ−Ｆｉ　（下記参照）から５ａｌｌお よびＥｃｏＲＩて消化することにより切り離したＨ　Ｓ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配 列であった。サザン分析による正しい大きさく約８０７９および９３７４ｂｐ） のプローブ陽性バンドの検出は、Ｇｅｎ１ｕｓＮａｅｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｄｅ ｆｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　ｆＢｏｅｈ＋ｉｎｇｅ＋　Ｍｔｎｎｈｅｉｍｌ　、Ｌ ｕｍ１−Ｐｈｏｓ　５３Ｇ　（Ｂｏｅｈ＋ｉｎｇ＋＋　Ｍｔｎｎｈｓｉ＊ｌ　お よびオートラジオグラフィーを使用し、製造者の指示に従って同定した。これら のＨ８Ａ断片の個々の対応する領域は、アガーロースゲルの調製部分から切り出 した。ＤＮＡを電気溶離し、ｅｌｕｔｉｐ精製してエタノールで析出させた。 ２個の精製したＮｃｏｒサブゲノム画分を、ＥｃｏＲＩで消化し、アルカリ性ホ スファターゼ（Ｓ１ロｔＢｅｎｅ、Ｉｎｃ、）で脱リン酸化したλＺ　ａ　ｐ　 ＩＩベクターに、２個の合成オリゴヌクレオチドを使用して個々に連結した。２ 個の合成オリゴヌクレオチドは、アニーリングすると、下記構造のアダプターを 形成する。 茄；Ｌユニ　凡ムａ−旦α）Ｌユ やノコメクレ不テト　Ａ：　５’　ＣＡＴＧＧＣＡＡＣＧＡＴＣＧＣＧＡＧＴＣ ＧＡＣＧ　３’オリゴヌクレオチドＢの５′　一端は、アニーリングする前に、 Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用し、標準的方法によりリン酸化して、アダ プターのＥｃｏＲ１部位をλベクターの脱リン酸化ＥｃｏＲＴ部位に連結するの に必要な５′　−リン酸基を付加した。サブゲノムヒトＤＮＡ断片のＮｃｏ１部 位の５′−リン酸基は、アダプターのリン酸化されていないＮｃｏＴ部位へ連結 することができる。連結産物は、Ｇｉｇ＊ｐ畠ｃｋ　ＩＩ　Ｐｌｏｔ　ｄッケー ジング抽出物　（Ｓｌ＋＊ｌ暑ｇ＋ｎｅ、Ｉｎｃ、ｌ　を使用し、供給者の特表 千６−５０９４７４　（１８） プロトコルに従ってファージ中にパッケージングした。 ライブラリーは、パッケージングしたファージをＰＬＫ−Ａ細抱　（Ｓ１ロｔＢ ｅｎｅ、Ｉｎｃ、）に吸着させ、平板培養することにより作った。Ｈ８Ａ３０７ ９ｂｐ断片を含むＮｃｏｌサブゲノム画分から約ｔｏｏ、ｏｏｏ個のプラークの ライブラリーが得られ、Ｈ３Ａ９３７４ｂｐ断片を含むＮｅｏ　Ｉサブゲノム画 分から５０．０００個のプラークのライブラリーが得られた。上述したように、 平板を２部、ニトロセルロースフィルター上に置き、フィルターを標準方法で処 理して前ハイブリッド形成させ（５ｘＳＳＰＥ、１／２５Ｂｌｏｔｔｏ、０．２ ％５ＤＳ）、３２Ｐ−標識ＨＳ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａプローブを含む同じ緩衝液 とともに６２℃で一夜ハイブリッド形成させた。フィルターを洗浄し、オートラ ジオグラフィーにかけた。重複した陽性のプラークが確認され、サブプラーク形 成させて精製した。挿入したＩＳＡ遺伝子を含むλＺ　ａ　ｐ　ＩＩベクターの ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫプラスミド成分を、Ｒ４０８へルバーファージ　（ Ｓ１口ｔＢｅｎｅ、Ｉｎｅ、ｌ　を使用し、そのプロトコルに従ってそのベクタ ーからｉｎ　ｖｉｖｏで切り出した。Ｈ９Ａ遺伝子の５′−ハーフを含むプラス ミドをｐ６５１と命名した。Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝子の３′−ハーフを含むプラスミド をｐ６５０と命名した。 ｐ６５０の制限酵素分析により、ＩＩ　Ｓ　Ａ遺伝子のＮｃｏ１５’−ハーフが ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫのＥｃｏＲＴ部位に挿入されていることをこのク ローンが本当に示すことを確認した。ｐ６５０を下記の制限酵素で消化すると、 予想したＤＮＡ断片が得られた。 制限酵素　予想し、確認したＤＮＡ断片（ｂ　ｐ）Ｂｇｌ＋＋　５３６３；４９ ２１；７５４；４７ＢｓｔＥＩＩ　１１０８５ ＥｃｏＲＩ　３５４１　；２９５８　；２００８　；１６０３．７０９　；　２ ６６ Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　６５６４；４２８１；２４ＯＮｃｏＴ　８０７９；３００６ Ｎｃｏｒ＋ＢｓｔＥ１１　７７５６；３００６；３２３Ｓｅａｌ　２５１１；２ ４４９；２４０５；２３６８　；　１３５２ Ｘｂａ　Ｉ　６９２６　；　１８８２　：　１２９６　；切断部位の予想位置は 、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＳＫ　ｆＳｔＳ１ロｔＢｅｎｅ　Ｉｎｃ、）の制限 酵素地図およびＭｉｎｇｈｅ目ｉ　ｃｌ　＠１．。 （１９８６，１，ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２１６＋　６７４７−６７５７１が 公開したＩ　Ｓ　Ａ遺伝子の適切な領域の配列のＳＥＱ制限酵素分析プログラム （Ｉｎｌｅｔ１ｉＨｅｎ＋１ｉｃｔ、Ｉｎｃ、）からめた。ｐ６５０の制限酵素 分析によっても、Ｈ３Ａ遺伝子領域がｐＢｌｕｅｓｃｒ　ｉｐｔベクター中で、 その５′一端がベクター多重クローニング部位のＫｐｎ■部位の方向に向いてク ローン化されたことが測定された。 ｐ６５１をＮｃｏｌで切断すると、９３７４および３００６ｂｐの２個の断片が 得られ、前者が）（ＳＡ遺伝子のＮｃｏ１３′　−ハーフを表し、後者はＨ８Ａ 配列をクローン化したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ配列を表すと予想していた。しか し、３００６ｂｐ　（ｐＢＩｕｅｓｃｒｉｐｔ）のバンドは認められたが、９３ ７４ｂｐのバンドは認められなかった。その代わりに、４０００ｂｐのバンドが 存在した。このバンドがＨ３Ａ配列を表すかどうかを分析するために、ｐ６５１ を、いくつかの配列決定プライマー（自ら合成）を使用し、５ｅｑａｅｎｓｓｅ 　５ｅｑｓｅｎｃｉＢＷｉｔ（Ｉｌｎｉｌｅｄ　Ｓｌ＊ｌｔ＠Ｂｉｏｃｈｅｓｉ ｅｔｌ　Ｃｏ「ｐ、）またはＴ７５ｅｑａｅｎｃｉＢＫｉｔ　（ｐｈｒ＋１ｅ目 ）のいずれかを製造者のプロトコルに従って使用して、配列決定を行った。クロ ーン化した配列を導入したｐ　Ｂ　Ｉ　ｕ　ｅ　Ｓ　ｃ　ｒ　ｉ　ｐ　を内のＥ ｃｏＲｒ部位は、一方の側ｆ）＜Ｔ７プロモータにより、他方の側がＴ３プロモ ータによりフランキング配列である。従って、クローン化した配列の末端の配列 決定をするために、Ｔ７（センス）およびＴ３（アンチセンス）配列決定プライ マーを使用した。ＨＳ　Ａエクソン７．８．９および１１に特異的なプライマー （センス）ならびにエクソン１２に特異的な２＠のプライマー（センス）および エクソン１５に特異的なプライマー（アンチセンス）も使用した。プライマーの 塩基配列は以下の通りだった。 ＨＳ　Ａエクソン８．９および１１に特異的なプライマーを除く全てのプライマ ーから特定の配列情報が得られ、これらの後者の領域はｐ６５１に欠けているこ とを示唆した。Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝子配列に対応するプライマーを使用した配列決定 反応から得た配列を下記に示す。 Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝子に対応するプライ マーから得た プライマー　塩基配列のｂｐ位置および領域Ｔ７　９５４０〜９７３７　（エク ソン７の一部およびイントロン７） Ｔ３　１８９１９〜１８６６９　（エクソン１５の３′　−フランキング領域 およびエクソン１５） ）Ｉ　Ｓ　Ａエクソン７　９６０５〜９６１６　（イントロンＩ　Ｓ　Ａエクソ ン１２（Ａ）　１５６８１〜１５６９０　Ｃエクソン１２） Ｉ　Ｓ　Ａエクソン１２　（Ｂ）　１５７９６〜１５８０７　（イントロン１２ ） Ｈ３Ａエクソン１５　１８４９７〜１．８１５６（イントロン１４） 明らかに、ＩＩ　Ｓ　Ａ遺伝Ｔ−の３′−ハーフの５′−および３′一端であり 、両端のＮｃｏ１部位、５′　一端のエクソン７およびイントロン７の少なくと も一部ならびに３′一端の３′−配列フランキングエクソン１５とエクソン１５ からエクソン１２を含む。これらの結果は、Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝子の３′−ハーフが ｐ６５１に存在するが、Ｉ　Ｓ　Ａ配列の内部削除が生じていることを示す。そ の削除は、親のλファージでも見られた。従って、構造ｐ６５１は、エクソン１ ２からエクソン１５のＩ　Ｓ　Ａ遺伝子および３′　−フランキング配列のＮｅ ｏＩ部位まで含み、イントロン１２．１３および１４を含む。ｐ６５１を制限酵 素分析すると、エクソン１２内にＡｓｐ＋が存在することがわかった。 イントロン７〜１１を含む領域が得られるようにエクソン７とエクソン１２との 間のＩ　Ｓ　Ａ遺伝子配列をクローン化するために、ＰＣＲ法を利用した。有用 な制限部位を含む）ｉ　Ｓ　Ａ遺伝ｒの所望領域に相同する合成オリゴヌクレオ チドブライマーを使用して４個のＩ’ＣＲ反応をセントした。ＰＣＲ反応は、反 応＃１の１−原端がエクソン７内のＮｃｏ１部位と重複するように設計した。反 応＃１のＦ原端は、イントロン８内のＡｖｒｌ１部位と重複させた。この同じＡ ｖｒ１１部位をＰＣＲ反応＃２の上流端と重複させた。ＰＣＲ反応＃２の下流端 はイントロン８内のＨｉｎｄｌ１１部位と重複させた。このＨ４ｎｄｌ１１部位 は、ＰＣＲ反応＃３の上流端とも重複させた。ＰＣＲ反応＃３の下流端はイント ロン１０のＸｈｏ１部位と重複させ、これはＰＣＲ反応＃４の上流端とも重複さ せた。ＰＣＲ反応＃４の下流端はイントロン１２のＡｓｐ１部位と重複させた。 このＰＣＲ法により、所望する領域全体が得られ、隣接するＰＣＲ産物は、重複 する制限部位を使用してともに連結する。ＰＣＲプライマーおよび反応は次の通 りだった。 兄コＬｊよ り５４０　９５６４ ！ｆｉｎｄ　！！！ 足口ＬＬ４ 特表十６−５０９４７４　（２０） 注・太字の制限部位はＨ８Ａ配列内に存在する。非ＩＳＡ配列は小文字で示す。 星印および付随する数は、ＩＳＡ遺伝子の対応するｂｐ位置を示す。 ＰＣＲ反応は、高分子量ヒト胎盤ＤＮＡを基質として行った〔４０サイクル；９ ４℃（１’　、３０’　）、６０℃（２”）。 ７２℃（４’　））。各反応の試料を１％アガロースゲルで分析した。予想した 大きさのＤＮＡバンド（ＰＣＲ＃１・１６２８ｂｐ　；　ＰＣＲ＃２・１２２８ ｂｐ；ＰＣＲ＃３：２１３６ｂｐ；ＰＣＲ＃４　：　１１４２ｂｐ）が認められ た。反応の残りはクロロホルムで２回、フェノール／クロロホルムで２回、クロ ロポルムで２回抽出した後、エタノールから析出させた。反応＃１および＃２の 産物をＡｖｒｌｌで消化した。反応＃３および＃４の産物はＸｈｏｌで消化した 。ＤＮＡをアガロースゲル電気泳動にかけ、ＤＮＡバンドをゲルから切り出し、 電気溶離してｅｌｕｔｉｐ精製した。精製した反応＃１および＃２の産物を共に 連結し、反応＃３および＃４の産物を共に連結した。各ＰＣＲ産物は、その消化 端（ＡｖｒｌｌまたはＸｈｏｌ）にのみ利用可能な５′〜リン酸基を有したので 、これらの末端のみが連結に利用でき、各ＤＮＡの他端は連結に利用できなかっ た。 次に、反応＃１および＃２の連結産物および反応＃３および＃４の連結産物を各 々、ＢａｍＨＪおよびＨｉｎｄｌｌｌで消化した。得られた２８１４ｂ、のＤＮ Ａは、反応＃１および＃２が共通するＡ　ｖ　ｒ　１１部位で連結し、消化され たＢ　ａ　ｍ　Ｈ１部位をその上流端に有し、消化された）Ｉｉｎｄｌ１１部位 をその下流端に有するものであり、これをゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製した。 このＤＮＡを、プラスミドベクターｐＧＥＭ−１のＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌ １１部位に連結した。３２４３ｂｐのＤＮＡは、反応＃３および＃４が共通する ＸｈｏＴ部位で連結し、Ｈｉｎｄ　１１１部位で消化された上流端およびＢ　ａ 　ｍ　ＨＩで消化された下流端を有するものであり、これも同様に精製して、プ ラスミドベクターｐＧＥＭ−２のＨｉｎｄｌｌｌおよびＢ　ａ　ｍ　Ｈ１部位に 連結した。連結産物を、電気穿孔法（ＢＴＸ　Ｅｌ＋ｅｌ＋ｏｐｏ目１ｉｏｎＳ ７ｔｌｔｍ　６Ｈ１により、製造者のプロトコルに従ってＭＣ１０６１細菌宿主 細胞に導入した。陽性の形質転換細胞をアンピシリン平板上に選択した。選択し た形質転換細胞のＤＮＡを制限酵素分析することにより所望のクローンを同定し た。ｐＧＥＭ−１でクローン化したＴｆ　Ｓ　Ａ　Ｐ　ＣＲ＃　１および＃２の 産物を構造ｐ６７９と命名した。それは、エクソン７のＮｅｏ　Ｔ部位（Ｉ　Ｓ 　Ａ遺伝子のｂｐ位置：９５４１）がらイントロン８の下流端にあるＨｉｎｄｌ １１部位（ＩＩＳＡ遺伝子のｂｐ位置＝１２３５５）までのＩＩ　Ｓ　Ａ配列を 含む。ＨＳ　Ａ　Ｐ　ＣＲ＃　３および＃４の産物を含むｐＧＥＭ−２構造をｐ ６７６と命名した。 それは、イントロン８の下流端にある同じＨｉｎｄｌｌ１部位（Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝 子のｂｐ位置：１２３５５）からエクソン１２のＡｓｐ１部位（）ＩＳＡ遺伝子 のｂｐ位置＋１５５９２）までの）（ＳＡＡ配列含む。 Ｈ８Ａエクソン１の上流のＮｃｏ　１部位（Ｉ　Ｓ　Ａ遺伝子のｂｐ位置：１４ ６２）からエクソン７のＮｃｏ１部位（ＩＳＡ遺伝子のｂｐ位１１：９５４１） までのＨ３Ａ遺伝子配列を含む構造ｐ６５０およびエクソン１２のＡｓｐ１部位 （ＩＩＳＡ遺伝子のｂｐ位置＋１５５９２）り上流からエクソン１５の下流にあ るＮｃｏ１部位（Ｈ３Ａ遺伝子のｂｐ位置：１８９１５）までのＩ　Ｓ　Ａ遺伝 子配列を含む構造ｐ６５１と共にこれらの構造ｐ６７９およびｐ６７６を合わせ ると、Ｈ８Ａ遺伝子全体のクローン化が完了する。 実施例３ ＢＬＧプロモータの調節下でＨＳ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを有する完全Ｂ　Ｌ　Ｇ ベクター（ｐ　５７５） Ｂ　Ｌ　Ｇプロモータおよび遺伝子系の使用をベースとするベクターは、発現さ せる外来遺伝子（ＩＩＳＡ）を、ＢＬＧ翻訳開始ＡＴＧコドンのすぐ上流のＢＬ Ｇ遺伝子のエクソン１内のＰ　ｖ　ｕ　Ｉｆ部位に導入させる。ＢＬＧ配列には 多数のＰ　ｖ　ｕ　ＩＩ部位がある。ｐＧＥＭ−１でクローン化したＢＬＧ５’ 　−領域（すなわち、プラスミドｐ５７０）は、ＢＬＧエクソン１内の適切な部 位を含む３個のＰ　ｖ　ｕ　Ｉｔ部位を有する。他の２個のｐ　ｖ　ｕ　Ｉｆ部 位は、各々、エクソン１内のｒ’ｖｕｌ１部位の」二流約２１００および２６０ ０ｂｐに位置した。完全Ｂ　Ｉ−Ｇベクターの適切なＰＶＬ１１１部位にＩＩ　 Ｓ　Ａ　ｅ　Ｄ　Ｎ　Ａを導入するために、ｃ　ＤＮＡをまず、［３１，Ｇ　５ 　′−クローン（ｐ　５７０）内の正しい部位でクローン化１１次いでそのＩＩ 　Ｓ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを何するＢ　Ｌ　Ｇ　５　′　−クローンをＢ　ｌ− Ｇ　３　’−クローンに結合した。プラスミドｐ５７０をＰ　ｖ　ｕ　ＩＩで部 分的に消化し、線状プラスミド（約７２００ｂｐ）を、ゲルおよびｅｌｕｔｉｐ 精製し、エタノールから析出させることにより回収した。 ＋（ＳＡｃ　ＤＮＡをλｇｔｌＬ−ヒト肝臓ｃ　ＤＮＡライブラリーから単離し た。完全なｃ　Ｄ　Ｎ　Ａクローンは長さが１，９８３ｂｐであり、Ｉ　Ｓ　Ａ をコードする完全な配列（１８個のアミノ酸ブリペプチド、６個のアミノ酸プロ ペプチドおよび成熟蛋白質の５８５個のアミノ酸を含む。）を含む。また、ｃＤ ＮＡクローンは、２０ｂｐの５′−未翻訳配列および１４１ｂｐの３′−未翻訳 配列を含む。そのｃ　ＤＮＡクローンをプラスミドベクターｐＢ　Ｓ　（−）　 （Ｓｌ＋ｔｌＢ＠ｆｉｅｌのベクターＢ　ａ　ｍ　ｆ（ＩおよびＥｃｏＲＩポリ リンカー制限部位の間でサブクローン化した（５′　一端にＢ　ａ　ｍ　Ｈ１部 位を、３′一端にＥｃｏＲ１部位を有する。）。このプラスミドをｐ　Ｉ（Ｓ　 Ａ　−Ｆ　１−とじた。 Ｈ３ＡｃＤＮＡ配列は、その細菌ベクターをＢ　ａ　ｍ　ＨＩおよびＥｃｏＲＩ で切断することにより得た。これらの付着末端を、過剰のｄＮＴＰの存在下でフ レノウポリメラーゼにより平滑端にした。平滑端にしたＨ　Ｓ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ 　Ａを先述のＰ　ｖ　ｕ　ＩＩで線状にして精製したプラスミドｐ５７０に連結 した。連結産物をアンビンリン耐性に形質転換することによりＤ　Ｈ５細胞に導 入した。所望の組換え体は、２個のｌ１ｉｎｄｌｌｌ切断断片（約７８０７およ び１２９３ｂｐ）および３個のＢａｍＨＩ切断断片（約４２８０．３１７０およ び１７００ｂｐ）の存在により分析した。これにより、Ｈ３ＡｃＤＮＡがＢＬＧ のエクソン１中の所望のＰ　ｖ　ｕ　１１部位にＢＬＧをコードする配列と同じ 方向で導入され、ＢＬＧ　Ｐｖｕｌ１部位とフレノウ酵素で平滑端にした５’− Ｉ（ＳＡのＢａｍ０１部位との間の結合で機能性Ｂａｍ１１１部位が再生された ことを確認した。別の分析により、フレノウポリメラーゼにより平滑端にした３ ’　−ｔｌｓＡＥｃｏＲ■部位吉ＢＬＧ　ＰＶＩＩ＋１部位との開の結合で機能 性ＥｃｏＲ１部位が再生されたことを確認した。この正しいプラスミドクローン をｐ５７２と命名した。 エクソン１のＰ　ｖ　ｕ　１１部位にクローン化したＩＩ　Ｓ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ 　ＡをａするＢ　１．、　Ｇ遺伝子の５′　−領域を［３１、Ｇ遺伝子の３′　 −領域と共に次のように組換えた。構造ｐ５７２をｐｖｕｌ（ｐＧＥＭ内）で完 全に、ＥｃｏＲＩで部分的に消化した。ｐＧＥＭ配列およびＢＬＧ遺伝子の５′ 　−領域のｐＧＥＭ−１と結合した３′一端（ＥｃｏＲＩ）までを含む約７８０ ０ｂｐの所望する断片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールから析出さ せた。これをＢ　Ｌ　Ｇ遺伝子の３′　−領域に連結し、プラスミドｐ５６８か ら約５ｓｏｏｂｐのＰｖｕ　Ｉ／ＥｃｏＲＩ断片として得た。この後者の断片は 、ｐＧＥＭ−１配列のＰｖｕ１部位までおよびＦ３　Ｌ　Ｇ遺伝子のｐＧＥＭと 結合した５′一端（ＥｃｏＲｒ）までを含む。連結産物を使用してＤ　１１５細 胞を形質転換し、アンピシリン耐性とした。 正しい所望の組換え体は、約７８４０．３５００および２２００ｂｐの＋ｌ１ｎ ｄ１１１断片ならびに約４７６０．４２４４．２０００．１７００および８７０ ｂｐのＢａｍ１ｌｌ断片を特徴とした。正しい組換え体はｐ５７５と命名した。 これらは、５′および３′領域を含むベクターに使用される完全なりＬＧ配列を 表し、ＨＳ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａが、ｐＧＥＭプラスミド内で、ＢＬ　ＧのＡＴ Ｇ翻訳開始コドンのすぐ上流にあるＢＬＧ　Ｐｖｕ１１部位にＢＬＧをコードす る配列と同じ方向で導入されている。 Ｂ　Ｌ　Ｇ　／　Ｉ　Ｓ　ＡおよびＩ　Ｓ　Ａ　／　Ｂ　Ｌ　Ｇ結合は配列分析 により確認した。ＢＬＧ／Ｈ３Ａ配列は５ａｌｌ部位によりフランキングされる 。 ５ａｌｌ部位はＢＬＧ／ＩＳＡ配列の他のどこにも存在しないので、ｐ５７５を ５ａｌｌで消化すると、Ｂ　Ｌ　Ｇ　／　Ｉ　Ｓ　Ａ　トランスジェニック動物 を得るために哺乳類の卵母細胞に注入するのに適したＢＬＧ／Ｈ３Ａ断片がｐＧ ＥＭから得られる。 実施例４ 第１　ＨＳ　Ａイントロンを含むＩ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子の完全Ｂ　Ｌ　Ｇべフ ターへの導入（ｐ　５９９） トランスジェニック動物の乳中にＩＳＡを高レベルで発現する）（ＳＡイントロ ンパターンを解明するために、種々の組み合わせのイントロンを有するＨ　Ｓ　 Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａから成る）（ＳＡミニ遺伝子を構成した。そのようなミニ遺 伝子の一つは、ＩＳＡの第１イントロンをＨ３ＡｃＤＮＡに導入したものである 。該構造を作るために、Ｈ８Ａエクソン２に由来するＨ３ＡｃＤＮＡの領域に、 そのコード配列を変えることなくＣ１ａｌ制限部位を導入した。これは、ｐＨ３ Ａ−Ｆｌ−由来の１本鎖ＤＮＡの鋳型および下記配列の合成オリゴヌクレオチド を使用した１ｎｖｉｔｒｏ突然変異誘発（Ａｍｅｚｈｓｍ　ｋｉｌｌ　により行 った。 この突然変異誘発では、Ｈ３Ａ蛋白質の３４番目のアミノ酸（プリプロ配列を含 む）であるアルギニンのコードの第３塩基において、Ｈ３ＡｃＤＮＡのＧを八で 置き換えることによりＣｌａｌ部位を導入した。ＣＧＡおよびＣＧＧコドンは共 にアルギニンをコードする。その結果得られた、ｐＢｓベクターのエクソン２由 来の領域にＣｌａｒ部位を導入して含むＨ３ＡｃＤＮＡから成るクローンは、ｐ ５９５と命名した。 ＩＳＡのイントロン１ならびにエクソン１およびエクソン２のフランキング部分 から成るＤＮＡ断片を、下記に示すように、エクソン１およびエクソン２と相捕 的である配列を含む合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用したＰＣＲ法によ り作製した。 、二冨＝：、りＶ＞１１２７噛１ 工７ソン　２　−もシ１ ＊は、この部分にＣではなくＴを挿入することによりＣｌａｌ部位を導入した。 上述したように、コーディングに変わりはない。 このＰＣＲ反応用の鋳型は、Ｈ３Ａ遺伝子のエクソン１からエクソン３までで、 イントロン１および２を含む［（Ｓ　Ａ遺伝子のクローンであった。このクロー ンをｐ５９４と命名し、後述する。エタノールから析出させた後、８４４ｂｌ） のＰＣＲ産物をＢｓｔＥＩＩおよびＣｏａｌで消化した。その結果得られる７９ ９ｂｐのＤＮＡ断片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールから析出させ た。 プラスミドｐ５９５をＢｓｔＥＩＩおよびＣ１ａｌで消化した。 ＢｓｔＥｌｌおよびＣｌａＴ部位の間のＢ　Ｔ−Ｇ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ領域に欠け る大きい断片をゲル精製し、電気溶離し、ｅｌｕｔｉｐ単離し、エタノールから 析出させた。 ＢｓｔＥＩＩおよびＣ１ａｌ端を有する精製したＰＣＲ産物ならびにＢｓｔＥｌ ｌおよびＣ１ａｌ端を有する精製したｐ５９５断片をともに連結した。連結産物 をＤ　）Ｔ　５細胞に入れて形質転換し、陽性の形質転換細胞をＬＢ−アンピシ リン平板上に選択した。 ＰＣＲｉ物を挿入して含むプラスミドを含んだ形質転換細胞を、先に記載したよ うに、Ｗｈ１１１１＊ｎ　５４１　フィルターを使用して平板のコロニーを取り 出すことにより同定した。プローブは、連結で使用したＰＣＲ産物のランダムプ ライマー法による３２Ｐ−標識産物であった。フィルターをオートラジオグラフ ィーにかけ、プローブ陽性コロニーを取り上げてＬ　Ｂ−アンピシリン培地で生 育した。こうして作製したプラスミドをＣ１ａｌおよびＸｂａｌにより個々に分 析した。Ｃｌａｌ部位を有し、４０１０および１８７４ｂｐのＸｂａｌ断片を生 成するプラスミドを正しいものとして同定した。ｐＢＳベクター内にＨＳＡｃ　 ＤＮＡおよびＨ３Ａイントロン１を含むＩＳＡ　ミニ遺伝子から成る正しい組換 え体をｐ５９６と命名した。 ＩＳＡ　（イントロン１）ミニ遺伝子を次のようにＢＬＧベクターｐ５８５に導 入した。ｐＢＳベクターをＢａｍＨＩで完全に、ＥｃｏＲＩで部分的に消化する ことによりＩＳＡ　（イントロン１）ミニ遺伝子をｐＢＳベクターから切り離し た。２７０１ｂｐのミニ遺伝子をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールか ら析出させた。ミニ遺伝子のＢａｍＨｆおよびＥｃｏＲＩ端をフレノウポリメラ ーゼおよび過剰のｄＮＴＰを使用して平滑にした。この平滑化した断片を、５ｎ ａＢＩで消化し、Ｃ１Ｐで脱リン酸化したＢＬＧベクターｐ５８５に連結した。 連結産物をＤＨ５細胞に入れて形質転換し、アンピシリン耐性とした。陽性のコ ロニーを、Ｗｈｌｅｇｎ　５４１　フィルターによりコロニーリフトを取り出し 、上述したＨ　Ｓ　ＡイントロンＩＰＣＲプローブとハイブリッド形成させるこ とにより同定した。プローブ陽性コロニーをオートラジオグラフィーにより同定 し、プラスミドを作製した■、Ｂ−アンピシリン培地で生育した。所望の方向に あるｌｌ５Ａ（イントロン１）ミニ遺伝子を含むクローン、すなわちＢ　Ｌ　Ｇ と同じ方向でＨＳ　Ａ　Ｅ二遺伝子を有するクローンは、ＥｃｏＲＩ消化により 約１０６７６および３６００ｂｐの切断断片が得られ、ＥｃｏＲＩ／５ａｌｌ二 重消化により約４４９０．３６００．３４００および２８６０ｂｐの切断断片が 得られることにより同定した。Ｂ　Ｌ　Ｇベクターｐ５８５の５ｎａＲ１部位内 でｌ５Ａ（イントロン１）ミニ遺伝子が正しい方向にあるこの所望のクローンを ｐ５９９と命名した。 実施例５ Ａ　コード配列に欠けるＢＬＧベクターの構成（ｐ　５９０）全長ＢＬＧベクタ ーを、プロモータを含む５’　−ＢＬＧ配列、Ｂ　Ｌ　Ｇをコ・−ドする配列の −Ｌ流ならびにｒ３１．、　Ｇをコードする配列のトー流にあるｎ　Ｌ　Ｇポリ アデニル酸のシグナルおよび部位を含む３’−ＢＬＧ配列は含んだままで、全Ｒ Ｌ　Ｇコード配列が削除されるように変えた。ＢＬＧエクソン１のＰ　ｖ　ｕ　 Ｉｆ部位の代わりに５ｎａＢＩ部位を有するＢＬＧの５′　−領域を含むプラス ミドｐ５８３を５ｎａＢＩおよびＰｖｕ　Ｉ　（ｐＧＥＭ内）で消化した。ｐＧ ＥＭ配列およびＢＬＧ遺伝子の５ｎａＲ１部位までの５′　一部分を含むＤＮＡ 断片（約４４９０ｂｐ）をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールから析出 させた。 ｐＧＥＭ−１のＢＬＧ３’　一部分であるプラスミドｐ５６８の制限酵素地図か ら、ＢＬＧ遺伝子のエクソン７内のＸｍａｌ（Ｓｍａ　Ｉのイソジゾマー）部位 は、その遺伝子の３′　一部分の最も３′　−側のＸｍａ１部位であることがわ かった。プラスミドｐ５６８をＸｍａＴおよびＰｖｕ　Ｉ　（ｐＧＥＭ内）で消 化した。ｐＧＥＭ配列およびＢＬＧ遺伝子の３′　一部分の３′一端（エクソン ７内のＸｍａ１部位まで）を含む約２６６０ｂｐのＤＮＡ断片をゲルおよびｅｌ ｕｔｉｐ精製し、エタノールから析出させた。 ２個の合成オリゴヌクレオチドを、アニーリングにより下記配列の５ｎａＢＩ／ Ｘｍａｌアダプターが形成されるように作った。 精製したｐ５８３断片、ｐ５６８断片およびアニーリングしたオリゴヌクレオチ ドの間で連結を行った。連結産物をＤ　Ｈ５細胞に入れて形質転換し、アンピン リン耐性とした。正しい組換え体は、１ｇｌ１１消化によりプラスミドが線状化 され、ＢａｍＨ１消化により３個の断片（約４２００．２０５０および９００ｂ ｐ）が生し、５ｎａＲＩおよびＩＴｉｎｄｌｌｌ消化により約５９５０および１ ２００ｂｐの断片が得られることにより同定した。Ｂ　Ｌ　Ｇ遺伝子の５′−お よび３′　一端が５ｎａＲ１部位によって結合し、ＢＬＧコード配列は含まない これらの正しい絹換え体をｐ５９０と命名した。 Ｂ、ｌｌ５Ａイントロン１を含むＨＳΔミニ遺伝子を有するＩＩＩＬＧベクター （Ｂ　Ｌ　Ｇ　５　’　−および３′−配列であってＢＬＧコート配列は含まな い）の構成（ｐ　６００）構造ｐ５９０を５ｎａＢＩで消化し、得られた制限末 端をＣＩＰで悦リン酸化した。ｐ５９６をＢａｍ１ｌｌて完全に、ＥｃｏＲＩで 部分的に消化することにより、イントロン１を含む■］ＳＡミニ遺伝了遺伝５９ ６から切り離した。ミニ遺伝子全体から成る２７０１ｂｐの断片をゲルおよびｅ ｌｕｔｉｐ精製し、エタノールから析出させた。この断片のＢａｍ１ｌｌおよび ＥｃｏＲＩ端をクレノウボリメラーゼおよび過剰のｄＮＴＰを使用して平滑にし た。 作製したミニ遺伝子を作製したｐ５９０ベクターに連結した。 連結産物を形質転換により大腸菌Ｄ［１５細胞に導入してアンピンリン耐性とし た。選択したコロニーを含む平板をＷｈｔ１ｍｔｎ５４１　フィルター上に員き 、前述と同様に処理した。３２Ｐ−標識プローブ（プラスミド５９９の構成を記 載した章で説明したＰＣＲにより得たＩ　Ｓ　Ａイントロン１）をランダムプラ イマー法により作製した。ｐ５９９陽性を同定するためにコロニーを取り出した のと同様に、ハイブリッド形成した後、フィルターを洗浄した。オートラジオグ ラフィーにかけた後、プローブ陽性コロニーを取り出してＬＢ−アンピンリン培 地で生育させた。 こうして作製したプラスミドを制限酵素分析にかけた。Ｂ　Ｌ　Ｇプロモータと 同じ方向に５ｎａＲ１部位でクローン化されたＩＳＡミニ遺伝子を有する正しい 組換え体は、１個のＥｃｏＲ［断片（約９８００ｂｐ）およびＥｃｏＲＩ／５ａ ｌｌ二重消化断片（約３５１１．３４１９および２８５ｏｂｐ）を生しることに より同定し、ｐ６００と命名した。 実権例６ ＾、Ｈ３Ａイントロン１および２を含むＩ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子を有するＢＬＧ ベクターの構成（ｐ　６０７）この構造の作製では、ＩＩ　Ｓ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ 　ＡをｐＧＥＭ−１でサブクローン化した。ｐＧＥＭ−１をＰｖｕｌｌ（ポリリ ンカーのすぐ外側）およびＥｃｏＲｌ（ポリリンカー内）で消化した。２８１９ ｂｐのベクター断片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールから析出させ た。ｐ５７５の構成の章で記載したように、プラスミドベクターｐＢＳ−（ｐＦ ｓＡ−Ｆｌ　）でサブクローン化したＩ（Ｓ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを、ｐＦｓＡ −Ｆｌ−から５ａｌｌ消化により切り離し、クレノウボリメラーゼおよび過剰の ｄＮＴＰを使用して平滑にした後、ＥｃｏＲＴで消化した。 ＨＳ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの２００４ｂｐ断片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し 、エタノールから析出させた。このｃＤＮＡ断片を、Ｐｖｕｌｌ（平滑）および ＥｃｏＲＩ消化して精製したｐＧＥＭ−１プラスミド断片に連結した。連結産物 をＤ　１１５細胞に入れて形質転換し、陽性の形質転換細胞をＬＢ−アンピシリ ン平板上に選択した。選択したコロニーを、前述したように、Ｗｈ＊１ｍ＊ｎ５ ４１　フィルター」−に取り出した。３２Ｐ−標識＋１３　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ プローブを、鋳型としてｐ　）Ｉ　Ｓ　Ａ　−Ｆ　１−の［Ｔｉｎｄｌｌｌ断片 （１９４１ｂｐ）を使用し、ランダムプライマー法により作製した。ハイブリッ ド形成は、６５℃の標準緩衝液中で行った。 洗浄条件は、最後の最も過酷な洗浄が６５℃で０．５ｘＳＳＣ。 ０．２９６ＳＤＳてあった。プローブ陽性コロニーを取り出してＬＢ−アンピシ リン培地で生育させた。これらの培地から作製したプラスミドを制限酵素分析に かけた。正しい組換え体は、２８１８および２０１１ｂｐのＢ　ａ　ｍ　ＨＴ断 片ならびに２８０６．１１６５および８５８ｂｐのＸｂａ　１断片が存在するこ とを特徴とした。正しいクローンをｐ５９７と命名した。 エクソン１の一部、イントロン１、エクソン２、イントロン２およびエクソン３ の一部を含むＨ８Ａ遺伝子配列を包含するＤＮＡ断片を、下記の合成オリゴヌク レオチドプライマーを使用するＰＣＲ法により作製した。 ヒトリンパ球から精製した高分子量ＤＮＡを鋳型として使用した。このＰＣＲ産 物を＋ｌ１ｎｄｌｌｌおよびＰ　ｖ　ｕ　Ｉｆで消化し、得られた２４２２ｂｐ の断片をゲルおよび６１ｕｔｉｐ精製し、エタノールから析出させた。この断片 を、１ＴｉｎｄｌｌｌおよびＰ　ｖ　ｕ　Ｉｆで消化して作製したｐＧＥＭ−１ ベクターに連結し、得られた２７７４ｂｐの断片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製 し、エタノールから析出させた。次いで、ｐＧＥＭ断片をＣＩＰで税リン酸化し た。連結産物を使用してＤ　Ｈ５細胞を形質転換し、アンピンリン耐性とした。 正しい組換えクローンは、プラスミド（５１９６ｂｐ）を線状化するＢｓｔＥＩ １部位が存在し、ＨｉｎｄｌｌｌおよびＰ　ｖ　ｕ　ＩＩにより消化すると２７ ７４および２４２２ｂｐの断片が生しることにより同定した。正しい組換え体を ｐ５９４と命名した。 Ｉ　Ｓ　Ａイントロン１および２をＩ（Ｓ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａに次のように導 入した。イントロン１および２を含むエクソン１からエクソン３のＩ（Ｓ　Ａ配 列を、ＲｓｔＥｌｌ（エクソン１内）およびＰｖｕｌｌ（エクソン３内）で消化 して２４０１ｂｐの断片としてｐ５９４から切り離した。この断片をゲルおよび ｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールから析出させた。同様に、プラスミドｐ５９７ をＢｓｔＥＩＩおよびＰ　ｖ　ｕ　Ｉｆで消化した。４５９６ｂｐの断片（ｃ　 ＤＮＡのこれらの部位間のｃＤＮＡ配列に欠ける）をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精 製し、エタノールから析出させた。作製したこれら２個の断片を連結し、ＤＨ５ 細胞に入れて形質転換し、アンピシリン耐性とした。Ｉ（Ｓ　Ａイントロンを含 む形質転換細胞を、Ｗｈ＊ｔｍ＊ｎ　５４１　フィルターによる取り出しおよび ５′　一端を（Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを使用して）３２Ｐ−標識した合 成オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成により同定した。使用した 合成オリゴヌクレオチドは、Ｈ３Ａイントロン２に特異的な配列、すなわち、５ ’　ＧＴＣＡＣＡＴＧＴＧＧＣＴＡＡＴＧＧＣＴＡＣＴＧ３’　を有する。 ハイブリッド形成は、６０℃の標準緩衝液中で行った。フィルターを洗浄し、最 後の洗浄は、０．２ｘＳＳＣ，０，５％ＳＤＳ、６０℃で行った。陽性のコロニ ーを制限酵素分析にかけた。正しい組換え体は、２個のＢ　ａ　ｍ　ｆ（Ｉ断片 （約４１７４および２８１８ｂｐ）および２個のＥｃｏＲＩ断片（約３７６５お よび３２２７ｂｐ）により同定した。これらの正しいクローンはＩＩ　Ｓ　Ａイ ントロン１および２を有するＩＩ　Ｓ　Ａミニ遺伝子を含み、ｐ６０３と命名し た。 イントロン１および２を有するＩ（Ｓ　Ａ　Ｅ二遺伝子を、次のようにしてＢ　 Ｌ　Ｇベクターｐ５９０に導入した。ベクターｐ５９０を５ｎａｎｌで消化し、 ＣＥＰで脱リン酸化した。Ｈ３Ａミニ遺伝子が、ｐ６０３から４１７４ｂｐのＢ 　ａ　ｍ　ＨＴ断片として得られ、これをゲルおよびｃｌｕｔｉｐ精製し、エタ ノールから析出させた。この断片のＢａｍ［Ｔ［末端をフレノウポリメラーゼお よび過剰のｄＮＴＰを使用して平滑にした。ｐ６０３から作製したミニ遺伝子お よび作製したベクターｐ５９０を共に連結した。連結産物をＤ　Ｈ５細胞に入れ て形質転換し、アンピノリン耐性とした。正しいクローンは、２個のＥｃｏＲＩ 断ｇ（約７４８５および３７６５ｂｐ）および２個のＸｂａｌ断片（約９１９６ および２０５４ｂｐ）の存在により同定した。 正しいクローンはＩＩ　Ｓ　Ａミニ遺伝子がＢＬＧベクターｐ５９０の５ｎａＢ Ｉ部位にｎ　Ｌ　Ｇプロモータと同し方向で挿入されており、Ｂｅ０ｌと命名し た。 Ｂ、下流にＳＶ４０ポリアデニル酸ポリへのシグナルを有するＢ　Ｌ　Ｇベクタ ーの構成（ｐ　５８９）ポリアデニル酸のシグナル源がＩＩ　Ｓ　Ａ蛋白質の発 現に影響を及ぼすかどうかを調べるために、Ｂ　Ｌ　Ｇをコードする配列が［（ ＳＡをコードする配列で置き換わったＢＬＧベクターを、ＢＬＧポリＡシグナル の代わりにＳＶ４０ポリアデニル酸シグナルを有するように構成した。ここで作 製した構造内に含まれるＢＬ　Ｇ配列は、ＢＬＧコード配列のプロモータ領域を 含む上流のみである。Ｂ　Ｌ　Ｇコード配列および下流の配列は削除された。 その構造は、外来遺伝子（この場合はＩ　Ｓ　Ａ　）を挿入するためのＢＬＧエ クソン１の５ｎａＢＩ部位を保存している。ＳＶ４０ポリアデニル酸シグナルは ３ｎａＢＩ部位の下流に位置し、この３’　−ＲＮＡ処理シグナルとなる。 エクソン１に導入された５ｎａＢＩ部位を有するＢＬＧ遺伝子の５’−ＥｃｏＲ ／Ｉサブゲノム部分を含むプラスミドＰ５８３を５ｎａＢＩで消化し、Ｓａｉ＋ で部分的に消化した。ポリリンカー内の天然５ｎａｒ３１部位で消化したｐＯＥ Ｍ−１プラスミドのほぼ全体およびＢＬＧ遺伝子の５′一部分の５′一端の導入 した５ｎａＴ３１部位から成る約５８００ｂｐのＤＮＡ断片をゲルおよびｅ　Ｉ 　Ｌｌ　ｔ　ｉ　ｐ精製し、エタノールから析出させた。 ＳＶ４０初期遺伝子（Ｔおよびｔ）ポリアデニル酸シグナルポリＡを、５Ｖ４０ ＤＮＡから、その５′　一端（ＳＶ４０制限酵素地図の位ｆｌ：２７７０）をＢ ｅ１ｌで、３′　一端（Ｓ　Ｖ　４０制限酵素地図の位１１：２５３３）をＢａ ｍ）ＩＴで切断することにより切り離した。２３７ｂｐのポリへのシグナルおよ び部位断片をゲルおよびｅ　ｌ　１１　ｔ　ｉ　ｐ精製し、エタノールから析出 させた。その断片をｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　２のＢａｍ１１１部位（ＣＩＰで脱リン酸 化）に連結した。連結産物をＩＩ　１１１０１細胞に入れて形質転換し、アンピ シリン耐性とした。ＳＶ４０ポリＡシグナルの断片はｐＧＥＭのＴ３ａｍ）１１ 部位にどちらの方向でも連結することができるが、所望の方向は、選択したコロ ニーから得たプラスミドＤ　Ｎ　ＡをＤｒａ　＋で消化することにより分析して 決定した。所望の方向のクローン（ＳＶ４０ポリＡシグナルの断片５′一端（Ｔ ３ｃｌｌ末端）がポリリンカーＸｂａｌおよび５ａｌＩ部位の上流）は、１２０ ３．１１９２．６９２および１９ｂｐのＩ）ｒ　ａ　Ｉ断片を特徴とした。所望 の組換え体をｐ２９０と命名ｉ５た。５ｎａＢＴを含む他の制限部位を次のよう にポリＡシグナルの上流に導入した。プラスミドｐ２９０を５ａｃｌおよびＡｖ ａ　ｌ　（ｐＧＥＭ２ポリリンカー内）で消化し、大きい断片をゲルおよびｅｌ ｕｔｉｐ精製し、エタノールから析出させた。得られた断片に合成オリゴヌクレ オチドを連結した。 このオリゴヌクレオチドは、アニーリングすると下記配列になる。 Ｘｈｏ　工　Ｂｇｌ　ＩＩ　八ｖａ　Ｉ連結産物を大腸菌ＦＩ　ＩＩ　ｔ　ｏ　 ｉ細胞に入れて形質転換し、アンピシリン耐性とした。得られた適切な組換え体 は、これら多数の他のクローニング部位をポリＡシグナル配列の」１流に含み、 ｐ２９９と命名した。 ＳＶ４０ポリＡシグナルおよび部位の配列を、ｐ２９９から、上流の５ｎａｎｌ および下流の５ａｉ１部位で消化することにより切り離した。この２７０ｂｐ断 片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールから析出させた。連結産物をＤ 　Ｉ（５細胞に入れて形質転換し、アンピシリン耐性とした。正しい組換え体は 、５ｎａＢＩによる線状化（約６２００ｂｐ）およびＳａ１■消化による２個の 断片の生成（約３４００および２８００ｂｐ）により同定した。正しい組換え体 はｐ５８９と命名した。 Ｃ，ＩＴｓＡイントロン１を含む）Ｉ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子を有する１３ＬＧべ ’）９−　（ｎＬＧ５’　−配列、ＳＶ４０　３’　−ポリＡシグナル、ＢＬＧ コード配列は含まない）の構成（ｐ　５９　Ｂ）構造ｐ５８９を５ｎａＢＩで消 化し、得られた制限末端をＣＩＰで脱リン酸化した。このＤＮＡを、イントロン １を有し、ｐ５９９の構成の章で述べたように平滑端にして作製したＨ８Ａミニ 遺伝子と連結した。５ｎａＢＩ部位でＢＬＧプロモータと同じ方向にクローン化 したＨ９Ａミニ遺伝子との適切な組換え体は、１個のＥｃｏＲＩ線状断片（約８ ８００ｂｐ）ならびに約３４５０．２８５０および２５００ＭのＥ　ｃ　ｏ　Ｒ Ｉ　／　５ａｌｌ断片の生成により同定した。これらの正しいクローンをｐ５９ ８と命名した。 Ｄ、ｌｌ５Ａ第１イントロンを含むＨＳ　Ａ　ミニ遺伝子の５′−配列を伸長し ｆニー　Ｂ　Ｌ　Ｇベクターヘノ導入（ｐ　６４３．　ｐ　６４７）５’ＢＬＧ を長くするとＩ　Ｓ　Ａの発現が増加するかどうかを確かめるために、イントロ ン１を有するＩ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子を、伸長した５’−ＢＬＧ配列（５，５ｋ ｂまたは１０．８ｋｂ）を有するＢ　Ｌ　Ｇ構造に導入した。ＢＬＧコード配列 および３′−配列はこれらのベクターに含まれない。ポリアデニル酸のシグナル および部位を含むＳＶ４０配列は含まれる。 ５．５ｋｂのＢＬＧ５’　−配列を有するクローンを作製するために、構造ｐ６ ４０をＡｓｐ７１８　（元のＢＬＧ５’　−ＥｃｏＲ１部位と転写開始部位との 間）およびＰｖｕ　Ｉ　（ｐＧＥＭ内）で消化した。ｐＧＥＭ配列およびＡｓｐ ７１８の上流のＢＬＧ配列を含む断片（約６１４３ｂｐ）をゲルおよびｅｌｕｔ ｉｐ精製し、エタノールから析出させた。同様に、ベクターｐ５９８をＡｓｐ７ １８およびＰｖｕ　Ｉで消化した。上記と相補的なｐＧＥＭ配列ならびにＡｓｐ ７１８部位の下流のＢＬＧ５′−配列、第１イントロンを有するＨ８Ａミニ遺伝 子およびＳＶ４０ポリＡポリを含む断片（約５１８４ｂｐ）をゲルおよびｅｌｕ ｔｉｐ精製し、エタノールから析出させた。これら２個の断片を共に連結し、連 結産物をＤ　ＩＩ　５細胞に入れて形質転換し、アンピンリン耐性とした。正し い組換え体は、Ｈｉｎｄ１１１消化により３個の断片（約８１６４．２８３１お よび３２０ｂｐ）が生成することにより同定し、ｐ６４３と命名した。 １０．８ｋｂのＢＬＧ５’　−配列構造をｐ６４３と同様の方法で作製した。プ ラスミドｐ６４５をＡｓｐ７１８およびＰｖｕｌて消化した。得られた断片（約 １１．　３８４　ｂ　ｐ）をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールから析 出させた。この断片を、ｐ５９８を上述したＡ９＋）７１８およびＰｖｕ　Ｉで 消化して得た精製断片（約５１８４ｂｐ）と連結した。連結産物をＤＩ＋５細胞 に入れて形質転換し、アンピシリン耐性とした。 適切な組換え体は、Ｈｉｎｄｌｌｌ消化により５個のＤＮＡ断片（約８１５９． ３４６０．２８２９．１８００および３２０ｂｐ）が生成することにより同定し た。正しい組換え体をｐ６４７と命名したが、１０．８ｋｂの５’　−ＢＬＧ配 列がイントロン１を有するＩＴ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子と結合している。 実施例７ ＩＴ　Ｓ　Ａイントロン１〜６を含むＩ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子を有するＢＬＧベ クターの構成（ｐ　６５２．　ｐ　６６１）Ｉ　Ｓ　Ａイントロン１〜６を含む ＩＩ　Ｓ　Ａ　Ｅ二遺伝子を有するトランスジェニックＢＬＧ構造を、ｎ　Ｓ　 Ａ遺伝子内の唯一のＢｓｔＥＩＩ（エクソン１内）およびＮｅａｒ（エクソン７ 内）を利用して作製した。 １（Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子がイントロン１のみを有すること以外は所望のベクター と等価である構造ｐ５９８をＢｓｔＥＩｌおよびＮｃａｌて消化した。これら２ 個の部位間のＩＩ　Ｓ　Ａ配列に欠けるＤＮＡ断片（約７３０４ｂｐ）をゲルお よびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールから析出させた。プラスミドｐ６５０も同 様にＢｓｔＥＩＩおよびＮｃｏｌで消化した。得られた７、７５６ｂｐ断片はこ れらの部位間にイントロン１〜６を含むＩ　Ｓ　Ａ遺伝子領域を含み、これもゲ ルおよびｅｌｕｔｉｐ精製し、エタノールから析出させた。精製した２個の断片 を共に連結し、ＴＧ１細胞に入れて形質転換し、アンピシリン耐性とした。正し い組換え体は、ｌ１ｉｎｄｌｌｌ消化による４個のＤＮＡ断片（約９８１９．４ ６８２．３２０および２４０ｂｐ）およびＸｂａｌ消化による５個の断片（約９ ５５２．１８８２．１２９６．１２５８および１０７３ｂｐ）より同定した。こ れらをｐ６５２（ＡＴＣＣＮｏ、６８６５３）と命名した。構造ｐ６５２はＳＶ ４０ポリＡポリを有する。 ポリアデニル酸シグナルおよび部位を含む３′　−配列が［３ＬＧ３’　−配列 によること以外はｐ６５２と同様の第２のＢＬＧベクターを同様の方法で構成し た。構造ｐ６００をＢｓｔＥＩＩおよびＮｃｏｌで消化した。これらの部位間の Ｈ３Ａ配列に欠ける約８２６６ｂｐのＤＮＡ断片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製 し、エタノールから析出させた。それを、上述した７７５６ｂｐの精製したｐ６ ５０Ｂｓ　ｔＥＩＩ−Ｎｅｏ　Ｉ断片（これら２側の部位の間はＩ　Ｓ　Ａ遺伝 子配列で構成される）と連結した。 連結産物をＤＨ５細胞に入れて形質転換し、アンピシリン耐性とした。正しい組 換え体は、単独のＢｓｔＥＩＩおよびＮｃｏ１部位を有し、その結果、各々の制 限酵素で消化すると、単一のＤＮＡ断片（約１６０２１ｂｐ）が生成することに より同定した。さらに、正しいクローンは、Ｂａｍｆｌｌ消化により３個のＤＮ Ａ断片（１０９４５，４１７１および９０５　ｂ　ｐ）が生成することにより同 定した。適切なりローンは、はｐ６６１と命名した。 実施例８ １１　Ｓ　Ａイントロン７〜１４を含むＩＩ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子を有するＢＬ Ｇベクターの構成（ｐ　６８７） Ｂ　Ｔ、、　Ｇプロモータの調節下、イントロン７〜１４を有するとともにＳＶ ４０ポリ八ポリへ有するＩＩ　Ｓ　Ａミニ遺伝子から成るこのトランスジェニッ クベクターは、いくつかの工程で構成した。イントロン１２〜１４を有する下流 ＩＴ　Ｓ　Ａ遺伝子領域（ｐ６５１内）をＩＩ　Ｓ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ配列の イントロン１２までと結合し、そうすることによりイントロン１２〜１４を有す るＩＩ　Ｓ　Ａミニ遺伝子を作った。次いで、ＳＶ４０ポリＡポリをこの遺伝子 の３′一端と結合した。次いで、イントロン７〜１１を含むようにこれを操作し て、イントロン７〜１４およびＳＶ４０ポリＡポリを有するＩＳＡミニ遺伝子を 作製した。最後に、そのミニ遺伝子を５’　−ＢＬＧプロモータ配列と共に組換 えて構造ｐ６８７を得た。 第１段階では、構造ｐ６５１をＡｓｐｌ（Ｈ３Ａエクソン１２内）およびＨｉ　 ｎｄ　ＩＩＩ　（Ｈ３Ａイントロン１５内）で消化した。その結果、エクソン１ ２からエクソン１５まで伸長した所望の断片（２９７２ｂ　ｐ）が得られ、これ をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製した。ＨＳ　Ａ　ＲＮ　Ａの翻訳末端はエクソン １４由来の配列内で生し、Ｈ８Ａ転写のポリアゾニレ−シコンはＨｉｎｄｌｌｌ の下流に生しる。従って、単離した断片はＩ　Ｓ　ＡポリＡシグナルおよび部位 から分離されたが、コード配列はどれも削除されなかった。構造ｐ５９７　（ｐ ＧＥＭ−１内にＩＴ　Ｓ　ＡｃＤＮＡ）を同様にＡｓｐｌおよび１ｌｉｎｄｌｌ ｌで消化した。 得られた断片（約４２６３　ｂ　ｐ）は、Ａｓｐｌ（エクソン１２由来配列内） およびＨｉｎｄｌｌｌ（エクソン１５由来配列内）の間のＨＳ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ 　Ａ配列を有し、これをゲルおよびｅｌｕｔ−ｐ精製した。２個の断片を共に連 結し、連結産物を電気穿孔法により大腸菌ＭＣ１０６１細胞に導入してアンピシ リン耐性とした。適切な組換え体は、単一のＡ！ＩＩ）ＩおよびＨｉｎｄ１１１ 部位が存在すると共にＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化すると２（！ｌｌの断 片（約４２７５および２８００ｂｐ）が得られることを特徴とする。これをｐ６ ６８と命名した。構造ｐ６６８は、ｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍ　ｌ内にイントロン１２〜１ ４を育するＩ　Ｓ　Ａ遺伝子を含む。 ＳＶ４０ポリＡシグナルおよび部位の配列をｐ６６８のＩ（ＳＡＥ二遺伝子の下 流に導入した。構造ｐ６６８をｌ１ｉｎｄｌｌｌ（ＩＴ　Ｓ　Ａ配列の下流端） および平滑端カッターＮａｅｌ（Ｈｉｎｄｌｌ１部位から約３００ｂｐのｐ　Ｇ 　Ｅ　Ｍ配列内）で消化した。 その２個の部位間の３００ｂｐが削除された断片（約６８００ｂｐ）をゲルおよ びｅｌｕｔｉｐ精製した。ＳＶ４０ポリ八ポリへ列を、まず、Ｐｓｔｌ（ポリ八 部位配列の下流端に隣接した多重クローニング部位内）による消化によりｐ２９ ９から切り離した。ポリ八部位配列およびＰｓｔ１部位の間の５ａｌｌ部位は、 ポリＡ部位配列の下流端に隣接して残る。消化されたｐｐ＋ｔ１部位は、過剰の ｄＮＴＰの存在下、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼを用いて充填することにより平滑化 した。次いで、そのＤＮＡをＨｉｎｄｌｌｌ（ポリ八部位配列の」二液端に隣接 した多重クローニング部位内）で消化し、切り離したＳＶ４０配列断片（約２０ ０ｂｐ）をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製した。精製した２個のＤＮＡを共に連結 し、大腸菌Ｄ　Ｈ５細胞に入れて形質転換し、アンピシリン耐性とした。Ｈ３Ａ Ｅ二遺伝子の下流端で同じ方向に連結したＳＶ４０ポリ八ポリへ有する正しいク ローンは、５ａｌｌ消化により２個の断片（約４７００および２３００ｂｐ）が 生成し、５ａｌｌおよびＥｃｏＲＩ消化により３個の断片（約４２００．２３０ ０および５００　ｂ　ｐ）が生成することを特徴とした。これらの正しい構造を ｐ６７４と命名した。 イントロン１２〜１４を有するＨ３Ａミニ遺伝子を含むｐ６７４へのＨ８Ａイン トロン７〜１１の導入は、３分節連結により行った。ｐ６７９内に含まれるＨ３ Ａ遺伝子配列をＮｃｏｌ（エクソン７内）およびＨｉｎｄｌｌｌ（イントロン８ の下流端内）により２８１４ｂｐの断片として切離し、ゲルおよびｅ１ｕｔｉｐ 精製した。ｐ６７６内に含まれるＨ３Ａ配列をＨｉ　ｎｄ　ＩＩＩ（ｐ６７９で 記載したイントロン８の下流端内の同じ部位）で消化し、Ａｓｐｌ（エクソン１ ２内；第２のＡｓｐ１部位はイントロン１１内に存在する）で部分消化すること により３２３７ｂｐの断片として切離し、ゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製した。構 造ｐ６７４　（イントロン１２〜１４を有するＨ３Ａミニ遺伝子を含む）をＮｃ ｏｌ（エクソン７内）およびＡｓｐ＋（エクソン１２内）で消化した。Ｎｃｏｒ およびＡｓｐ１部位の間のＨ３ＡｃＤＮＡ配列が削除されたＤＮＡ　（約６４０ ０ｂｐ）が得られ、これをゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製した。精製した３個のＤ ＮＡを共に連結し、連結産物を電気穿孔法により大Ｓ菌ＭＣ１０６１細胞に導入 してアンピシリン耐性とした。 正しい組換え体は、２個のＡｓｐｌ断片（約１２４０６および２７３ｂｐ）およ び５個のＸｂａｌ断片（約３５３７．２７１９．２６２３．２５６６および１２ ３４ｂｐ）が生じることを特徴とした。これらの正しい構造は、イントロン７〜 １４を含むＨＳ　Ａ　Ｅ二遺伝子であり、下流に隣接してｐＧＥＭ−１内にＳＶ ４０ポリ八ポリへ有し、ｐ６８３と命名した。 最後に、イントロン７〜１４を有するＩ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子を、ＢＬＧ５’　 −フランキングプロモータ配列の下流のトランスジェニック構造に導入した。構 造ｐ６８３をＮｃｏｌ（Ｈ８Ａエクソン７内）およびＰｖｕ　Ｔ　（ｐＧＥＭ内 ）で消化した。ＮｃＯ■部位（イントロン７〜１４を含む）の下流のＨ３Ａ遺伝 子配列内ＳＶ４０ポリＡポリおよび隣接したｐＧＥＭ配列から成るＤＮＡ断片（ 約１０４００ｂｐ）をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製した。同様に、構造ｐ５７２ 　（ＢＬＧエクソン１のＰｖｕ１１部位内１：　ＨＳ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを含 む）をＮｃｏｌ（エクソン７由来配列内）およびＰｖｕ　Ｉ　（ｐＧＥＭ内）で 消化した。上述した断片のｐＧＥＭ配列と相補的なｐＧＥＭ配列、ＢＬＧ５’　 −フランキングプロモータ配列およびエクソン７内のＮｃｏ１部位までのＨ３Ａ ｃＤＮＡから成るＤＮＡ断片（約５５７０ｂｐ）をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製 した。精製した２個の断片を共に連結し、連結産物を電気穿孔法により大腸菌Ｄ ＨＩＯＢ細胞に導入してアンピシリン耐性とした。 正しい組換え体は、ＢａｍＨＩ消化により３個の断片（約１００９８．４１８３ および１６９９ｂｐ）が生じることを特徴とした。これらの正しい構造（ｐ　６ ８７と命名）は、イントロン７〜１４を有するＩ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子、下流の ＳＶ４０ポリ八部位および上流のＢＬＧプロモータを含み、トランスジェニック 動物に導入するための最終的なり　Ｌ　Ｇ／ＨＳ　Ａ構造を表す。 実施例９ イントロン２および７〜１４を含むＨＳ　Ａ　ミニ遺伝子を有するＢＬＧベクタ ーの構成（ｐ　６９６） イントロン２および７〜１４を有するＨ８Ａミニ遺伝子を含むこのトランスジェ ニックベクターの構成は、数工程で行った。 プラスミドｐ　Ｂ　Ｓ−（ｐ　５９５）のＨ３ＡｃＤＮＡのＨ３Ａエクソン２由 来配列（コードされるアミノ酸の変更は無い）に予め導入したＣｏａ１部位をｐ ＧＥＭプラスミド内のＨ３ＡｃＤＮＡに転移させた。Ｉ　Ｓ　Ａエクソン２から イントロン２を通過してエクソン３に伸長するＰＣＲ産物を、このＣｌａＩ部位 を使用して、ｐＧＥＭ内のＨ３ＡｃＤＮＡの相同領域に導入した。 最後に、イントロン２を、イントロン７〜１４を有スるＩＳＡミニ遺伝子を含む トランスジェニック構造（ｐ　６８７）に転移させた。 Ｉ　Ｓ　Ａエクソン２に導入したＣｌａｌ部位を構造ｐ５９５（ｐＢＳ−プラス ミド）のＨ３ＡｃＤＮＡからｐＧＥＭプラスミド（ｐ　５９７）のＨ８ＡｃＤＮ Ａに転移させた。なぜならば、ｐ５９５には、その後の組換え法を妨げる多重ｐ 　ｖ　ｕ　Ｉｆ部位があるからである（ｐ５９７は単独のｐ　ｖ　ｕ　１１部位 を有する。）。 構造ｐ５９７をＢ　ｓ　ｔ　Ｅｌｆ　（Ｈ３Ａエクソン１由釆配列内）およびＮ ｃｏｒ（Ｈ３Ａエクソン７由来由来内）で消化した。ＢｓｔＥＩＩおよびＮｃｏ １部位の間のＨ３ＡｃＤＮＡ配列が削除された大きいＤＮＡ断片をゲルおよびｅ ｌｕｔｉｐ精製した。 同様に、構造ｐ５９５をＢｓｔＥＩＩおよびＮｃｏｌで消化し、これらの部位の 間のＨ３ＡｃＤＮＡ配列のＤＮＡ断片（８ｏ１ｂｐ）（予め導入したＣｌａｒ部 位を含む）をゲルおよびｅ１ｕｔｉｐ精製した。精製したこれら２個のＤＮＡを 共に連結し、連結産物を電気穿孔法により大腸菌ＤＨＩＯＢ細胞に導入してアン ピシリン耐性とした。正しい組換え体はＣｌａｌ部位が存在することを特徴とし 、ｐ６８９と命名した。 エクソン２に導入したＣｌａｌ部位を含むフランキングエクソン領域を有するＨ ３Ａイントロン２をＰＣＲ法により得た。 下記に示すＨ３Ａエクソン２センス合成オリゴヌクレオチドブライマー（導入し たＣｌａｌ部位を有する）およびＩＳＡエクソン３アンチセンスプライマー（導 入したＰ　ｖ　ｕ　１１部位を有する）を、鋳型として構造ｐ５９４　（Ｈ８Ａ イントロン２およびフランキングエクソンを含む）を用いるＰＣＲ法に使用した 。 Ｈ５Ａエクンン２　５’　ＧＧＴＴＣＣＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＡＭＧＡＴＴＴＧ ＧＧ　３電七−入プライマー　Ｃ１ａ　工 反応は、９４℃（１’　３０’　）　、５５℃（２′）および７２’Ｃ（１’） で２８サイクルであった。クロロホルムで２回抽出し、エタノールから析出させ た後、ＰＣＲ産物をＣ１ａｌおよびＰＶＩＪＩ＋で消化した。得られた１６０２ ｂｐのＤＮＡをゲルおよびｅ　ｌ　ＩＪ　ｔ　ｉ　ｐ精製した。構造ｐ６８９を Ｃ１ａｌ（）ＩＳＡエクソン２内）およびＰｖｕｌｌ（）（ＳＡエクソン３内） で消化し、Ｃ１ａｌおよびＰｖｕ１１部位の間のＩＩ　Ｓ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ 配列が削除された大きいＤＮＡ断片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製した。精製し た２個のＤＮＡを共に連結し、連結産物を大腸菌ＤＨ５細胞に入れて形質転換し 、アンピシリン耐性とした。Ｃ１ａｌおよびＰ　ｖ　ｕ　Ｉｔで個々に消化する と約６５００ｂｐの線状１）　Ｎ　Ａが生成することで正しい組換え体を同定し た。これらはｐ６９０と命名したが、ｐ　Ｇ　Ｅ　Ｍプラスミド内でイントロン ２を有する＋１３　Ａ　Ｅ二遺伝子から成る。 最後に、ＨＳ　Ａイントロン２を、イントロン７〜１４を有するＨ３Ａミニ遺伝 子を含むトランスジェニックベクターｐ６８７に転移させた。構造ｐ６８７をＢ 　ｓ　ｔ　Ｅｌｆ　（Ｈ３Ａｘクソン１内）およびＮｃｏｌ（ＩＳＡエクソン７ 内）で消化した。ＢｓｔＥＩＩおよびＮｃｏ１部位の間のＨ３ＡｃＤＮＡ配列が 削除された大きいＤＮＡ断片をゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製した。 同様に、構造ｐ６９０をＢｓｔＥＩＩおよびＮｃｏｌで消化した。 ＢｓｔＥ１１部位からＮｃｏ１部位までのＨ３ＡｃＤＮＡから成り、イントロン ２を含む２２５５ｂｐの断片を切離し、ゲルおよびｅｌｕｔｉｐ精製した。精製 した２個のＤＮＡを共に連結し、連結産物を大腸菌ＤＨ５細胞に入れて形質転換 した。正しい組換え体は、ＢｓｔＥＩＩおよびＮｅｏ　Ｉで消化すると２２５５ ｂｐの断片が切り離されることを特徴とした。ｐ６９６（ＡＴＣＣＮｏ、６８６ ５４）と命名したこれらの構造は、ＢＬＧプロモータの調節下、イントロン２お よび７〜１４を有するＨ３Ａミニ遺伝子および下流のフランキングＳＶ４０ポリ 八部位から成り、トランスジェニック動物の生産に適する。 実施例１０ 全イントロン■−１４を含む完全１（Ｓ＾遺伝子を持っＢＬＧベクターの構築（ ｐ６８６１ イントロンを全部で１４個含む完全ＩＳＡ遺伝子を用いるトランスジェニックベ クターの構築は、イントロン１−６を持つＩＳＡ　ミニ遺伝子を含む構築物ｐ６ ５２及びインドロン７−１４を持つＩＳＡ　ミニ遺伝子を含む構築物ｐ６８３を 組換えることにより実施した。構築物ｐ６５２をＮｅｏ　Ｉ　ｆ’ｓ＾エキソン ７内）及び？ｕ　Ｉ　ｆｐＧＥＭ内）で消化した。、ＧＥＭ配列で作成した［ｌ Ｎ＾フラグメント（約１２５３０ｂｐ）、ＢＬＧ　５″−フランキングプロモー ター及びエキソン７のＮｅｏ　１部位までのｌｌ５Ａ　ミニ遺伝子（イントロン ｌ−６を含む）をゲル及びエルチップ（ｅｌａｌｉｐｌ精製した。構築物ｐ６８ ３を同様にＮｅｏ　Ｉ　ｆＨ５＾エキソン７内）及びＰマｕ　Ｉ　（ｐＧＥＭ内 ）で消化した。（イントロン７−１４を含む）エキソン７のＮｅｏ　１部位の下 流の１（ＳＡ　ミニ遺伝子で作成したＤＮＡフラグメント（約ＩＱ４００ｂｐｌ 　、隣接する下流のＳＶ４０　ポリ八部位及び上記フラグメントの、ＯＥＭ配列 と相補的なその隣接ｐＧＥＭ配列をゲル及びエルチップ精製した。２個の精製フ ラグメントを一緒に連結して、連結生成物をアンピシリン耐性とするためにエレ クトロポレーションによりε、ｅｏｌｉ　ＤＨＩｏＢに導入した。正しい組換体 をＢＪＩＨｌで消化する際に２個のフラグメント（約１８７２８及び４１８６ｂ ｐｌ　が生成することにより特徴付けし、このベクターをｐ６８６と名付けた。 全てのエキソンをこのベクター内で配列決定し、これらが正しいことを知見し、 これによりＨ８＾遺伝子のクローニングが正しかったことを確認した。 実施例１１ Ａ、　ｔｅａアミノ酸の代わりにＨ５＾タンパク質位置＃４０３でＰｈｅアミノ 酸をコードする変異体１１ｓＡ　ｃＤＮＡの構築ｆｐ８２２１上記の構築物で使 用した１（ＳＡ　ｃＤＮ＾ＤＮＡ、ＭｉｎＨｂｅｌｔｉ　ら（１９８６）に記載 のＨ３＾配列とアミノ酸が１個異なるＨ８＾タンパク質配列内コードした。Ｍ口 ｇｈｅｌｌｉ配列は（位置＃１で表した成熟Ｉｔｓ＾タンパク質の第１のアミノ 酸からアミノ酸に番号付けしていくことに基づいて）位置＃４０３のＰｈｅアミ ノ酸（ＴＴＣコドン）をコードするが、実施例に記載のものはＬｅｅアミノ酸（ コドンＣＴＣ）をコードする。本発明のベクターがＩＳＡの変異体形を高レベル で発現し得たことを示すためにＭｉＢｈｅ目１配列を調整した。 １１マ自１０突然変異（特定部位の突然変異誘発）を市販のキット（Ａｗｅ口ｈ ｌＳＤＩキット）を用いて、ｐｌ（ＳＡ−Ｆｌ−から誘導した一本−ＧＧＡＧＡ ＧＴＡＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＴＧＣＧＣＴ＾−３゛の合成オリゴヌクレオチ ド及び第２のストランド合成用のプライマーとして配列５′−＾ＧＣＧＣ＾ＴＴ ＣＴＧＧ＾＾ＴＴＴＧＴＡＣＴＣＴ−３’の合成オリゴヌクレオチドを合成用い て実施した。ｐＨｓ−ベクター内のＩＩｓ＾アミノ酸位置＃４０３でＰｈｔをｐ ８２２と名付けた。所望の変化がＤＮＡ配列決定により証明された。 Ｂ、　ｐＨ２２からのｉＨｖｉｌ１分析ベクターの構築（ｐ８２３）Ｈ３＾アミ ノ酸＃４０３に関して１ＪｉＢｈＣｌｌｉ　コドン配列を持つＨ５Ａ　ｃＤＮＡ を含むｉｎ　ｙｉｌ＋ｏ分析ベクターを構築した。構築物ｐ８２２をＮｃｏ　１ 及び＾マＴ］］（アミノ酸＃４０３に関するコドンをフランクする部位）で消化 した。アミノ酸＃４０３に関するコドンを含む、得られた５４９ｂｐ　ＤＮＡフ ラグメントをゲル及びエルチップ精製した。ｉｎ　ｗｉｌ＋ｏ分析ベクターｐ６ ５８　（ＨＳＡ　ｃＤＮＡを含む）をＮｅｏ　１及び＾マ＋ｌｌで同様に消化し た。２つの部位の間のｌｌ５Ａ配列を欠失する大きなりＮＡフラグメントをゲル 及びエルチップ精製した。 ２個の精製フラグメントを一緒に連結して、アンピシリン耐性を与えるためにＥ 、ｃｏｌｉ　ＤＨ５細胞内に導入した。正しい組換体を、Ｎｅｏ　ｌ及び＾マ＋ ＩＩで消化する際に５４９ｂｐフラグメントが生成することにより識別した。配 列決定により、アミノ酸＃４０３に関するＭｉｎｇｈｅｌｔｉ　コドンが存在し ていたことが確認された。この新しい１ｎマ自ｔｏ分析ベクターをｐ８２３と名 付けた。 既に記載の如＜１０マ１１０分析は、トランスフェクトした哺乳類細胞系ＣＯ３ −７細胞から免疫沈降可能なｌｌ５Ａの発現及び分泌をサポートすることを示し た。 実施例１２ Ａ、Ｈ３＾アミノ酸＃４０３に関するＰｋｓコドンを持つイントロン１Ｇを含む Ｈ３Ａ　ミニ遺伝子を保有するＢＬＧベクターの構築（ｐ８２５）イントロン１ −６を持つＩＩｓ＾ミニ遺伝子を含み且つ位置＃４０３でＭｉＢｈｅｌｌｉアミ ノ酸配列をコードするトランスジェニックベクターを構築した。ベクターｐ６５ ２をｆＩＩｓＡエキソン７内で）Ｎｅｏ　１及び（ＤＧＥＭ内で）Ｐマ１■で消 化した。Ｈ８＾イントロン１−６を含むＮｃｏ　１部位の上流のＨ８＾配列及び ＢＬＧプロモーターを含む大きなりＮＡフラグメントをゲル及びエルチップ精製 した。構築物１２３をＮｅｏ　！及びＰｖｗ　Ｉで同様に消化した。ＳＶ４０ポ リアデニル化部位及びＮｅｏ　１部位（アミノ酸＃４０３に関してＭｉＢｈｅｌ ｌｉ　コドン配列を含む）の下流のＨ３Ａ　ｃＤＮＡ配列を含む小さな方の［ｌ ＮＡフラグメント（約２５４８ｂｐｌ　をゲル及びエルチップ精製した。２個の 精製フラグメントを一緒に連結し、アンピシリン耐性を与えるためにＥ、ｃｏｌ ｉ　ＤＨ５細胞に導入した。正しい構築物をＸｂＩＩで消化する際に５個のＤＮ Ａフラグメント（約９３０８．１８８２．１２９６、Ｉ２５７及び１０９１ｂｐ ）が生成すること及び＾＋ｐ　＋で消化する際に６個のＤＮＡフラグメント（約 ５９１６．３３３ｇ、２１３７．１７６８．１０３９及び６３６ｂｐｌが生成す ることにより識別した。 この新しいトランスジェニックベクターをｐ８２５と名付けた。 Ｂ、　ｐ８２５からのｊｌ　ｙｉｔ＋ｏ分析ベクターの構築（ｐＨ２９）１ｎマ 自ＩＱ分析ベクターを、トランスジェニックベクターｐ６５２から１ｎマｉｌ＋ ｏベクターｐ６５６の構築に関して既に記載の如（ＢＬＧプロモーター内の＾＋ ｐ７１８部位にＳＶ４０エンハンサーを導入することにより、トランスジェニッ クベクターｐ８２５１イントロン１−６、アミノ酸＃４０３に関するＭｉＢｈｅ ｌｔｉ　コドンを持つＨ５＾ミニ遺伝子を保有する）から作成した。この新しい ベクターをｐＨ２９を名付けた。 既に記載の如く、１ｎマ自ｒＯ分析は、ベクターｐ８２９がトランスフェクトし た哺乳類細胞系ＣＯ５−７細胞から免疫沈降可能１１ｓＡの発現及び分泌をサポ ートすることを示した。 実施例１３ Ｈ５＾アミノ酸＃４０３に関するＬｅｌまたはＰｈｔコドンのいずれかを持つイ ントロン１２−１４を含むＨ８＾ミニ遺伝子を保有するＢＬＧベクターの構築（ ｐ６１１１１．　ｐＨ４１イントロン１２−１４を持つＨ３＾ミニ遺伝子を含む トランスジェニック構築物を以下の如く構築した。構築物ｐ６７４を（Ｒ３Ａエ キソン７内で）ＮｃＯｌ及び（ｐＧＥＭ内で）Ｐマ１■で消化した。ｌｌ５Ａイ ントロン１２−目を含むＭｅＯ１部位の下流のＨ８＾配列及び５Ｖ４Ｇポリアデ ニル化部位を含む、作製された大きなりＮＡフラグメントをゲル及びエルチップ 精製した。構築物ｐ５７２をＮｃｏ　Ｉ及びＰマ１　■で同様に消化し、Ｎｅｏ 　１の上流のＩｔｓ＾配列（ｃＤＮＡ）及びＩＩＬＧプロモーターを含む、作製 された大きなフラグメントをゲル及びエルチップ精製した。２個の精製したフラ グメントを一緒に連結し、アンピシリン耐性を与えるためにＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ ＩＯＢ細胞に導入した。 正しい組換体をＢｓ＊ｌＩＩで消化する際に３個のＤＮＡフラグメント（約４７ ６７．４１７７及ヒ１７００ｂｐｌ　カ生成ｔ　ルコ、！：　及びＸｂｓｌテ消 化する際に３個のＤＮＡフラグメント（約７０２８．２７５７及び８Ｓ９ｂｐｌ が生成することにより識別した。イントロン＋２−１４を持つ■Ｓ＾ミニ遺伝子 を保有するこの新しいトランスジェニックベクターをｐ６８８と名付けた。 イントロン１２−１４を持つ）ＩＳＡ　ミニ遺伝子を含むトランスジェニックベ クターｐ６８８を位置＃４０３でＭｉＩＩｈｔ目ｉアミノ目配アミノ酸配列るよ うに変性した。構築物ｐ８２２から得られた５４９ｂｐのＮＣ６１〜＾マ＋ＩＩ 　ＤＮＡフラグメントを使用して、ベクターｐ８２３の構築物に関して上記した 如く、（Ｎｃｏｌ及び＾マ「１］で同様に消化した）構築物ｐ６８８中の対応す るフラグメントと置き換えた。この新しいトランスジェニック構築物をｐ８２４ と名付けた。 実施例１４ Ａ、）Ｉｓ＾アミノ酸＃４０３に関するＬｓｓまたはＰｈｅコドンを持つイント ロン１及び２及び１２−１４を含むＩＳＡ　ミニ遺伝子を保有するＢＬＧベクタ ーの構築（ｐＨ１２，ｐ８２６）イントロン１４２＋１２−１４を持つＨ８＾ミ ニ遺伝子を含むトランスジェニック構築物を以下の如く作製した。構築物ｐ６７ ４を（Ｏ５＾エキソン７内で）Ｎｅｏ　Ｉ及び（ｐＧＥＭ内で）ＰマＩＩで消化 した。１（ＳＡイントロン＋２−１４を含むＮｅｏ　１部位の下流のＨ３Ａ配列 及び５Ｙ４０ポリアデニル化部位を含む、作製された大きなりＮＡフラグメント をゲル及びエルチップ精製した。構築物ｐ６０７をＮｅｏ　Ｉ及びＰｖｗ■で同 様に消化し、Ｉｓ＾イントロンｌ及び２を含むＮｅｏ　１部位の」１流のＩＩｓ ＾配列及びＢＬＧプロモーターからなる作製された大きなフラグメントをゲル及 びエルチップ精製した。２個の精製フラグメントを一緒に連結し、アンピシリン 耐性を与えるためにＥ、ｃｏｌｉ　［１８５細胞に導入した。正しい組換体をＸ ｂｓ　Ｉで消化する際に３個のＤＮＡフラグメント（約８９００．２７１８及び ８Ｓ４ｂｐ）が生成することにより識別した。イントロン＋４２４１２−１４を 持−）　Ｈ５Ａミニ遺伝子を保有するこの新しいトランスジェニックベクターを 、　８１．２と名付けた。 Ｈ５＾アミノ酸＃４０３に関してＭｉＢｌ＋ｅ口１コドンを持つイントロンｌ＋ ２＋１２−１４を持つ８３＾ミニ遺伝子を含むトランスジェニック構築物を作製 した。構築物ｐ８２４をＮｅｏ　Ｉ　（Ｒ３Ａエキソン７内）及びＰｙｗ　Ｉ　 （ｐＧＥＭ内）で消化した。（＃４０３に関してＭｉＩｌ（ｈｅｌ１１コドン及 びＩｓ＾イントロン！２−１４を含む１Ｎｃｏ　１部位の下流のＩｔｓ＾配列及 び５Ｖ４Ｇポリアデニル化部位を含む、作製された大きなりＮＡフラグメントを ゲル及びエルチップ消化した。構築物ｐ６２を含むＮｅｏ　１部位の上流のＨ３ ＾配列及びＢＬＧプロモーターを含む、作製された大きなフラグメントをゲル及 びエルチップ精製した。２個の精製したフラグメントを一緒に連結し、アンピシ リン耐性を与えるためにＥ、ｃｏｌｉ　Ｄｆ１５細胞に導入した。正しい組換体 をＸｂｓ　Ｔで消化する際に３個の［ｌＮ＾フラグメント（約８９Ｇｏ、　２７ ＋１１及び８５４ｂｐｌが生成することにより識別した。この新しいトランスジ ェニックベクターをｐ８２６と名付けた。 Ｂ、　ｐ８１２及びｐ８２６からのｉｎ　ｗｉｌ＋ｏ分析ベクターの構築［ｐＨ １３゜ｐｇ３Ｇ）　ｉｎ　？自ｔｏ分析ベクターを、（イントロン１４２目２− １４を持つＨＳ＾ミニ遺伝子を保有する）トランスジェニックベクターｐ８１２ から、トランスジェニックベクターｐ６５２から１ｎ　マｉｌ＋ｏベクター９６ ５６の構築に関して既に記載の如（ＢＬＧプロモーター内の＾＋ｐ７１８部位に ５Ｖ４１１エンハンサ−を導入することにより作製した。 この新しいベクターをｐＨ１３と名付けた。 既に記載の如＜、１ｎｖｉｌｌａ分析は、ベクターｐ８１３がトランスフェクト した哺乳類細胞系ＣＯ３−７細胞から免疫沈降可能なＨ８＾の発現及び分泌をサ ポートすることを示した。 ｉｎマ１（「０分析ベクターを、トランスジェニックベクターｐ６５２から１ｎ マｉｌ＋ｏベクターｐ６５６の構築に関して既に記載されたように、ＩＩＬＧプ ロモーター内のＡ＋ｐ７１８部位に５Ｖ４Ｇエンハンサ−を導入することにより 、（アミノ酸＃４０３に関してイントロン１＋２＋１２−１４　、Ｍｉｎ（ｈｅ ｌｔｉ　コドンを持ツＨ３Ａ　ミニ遺伝子を保有する）トランスジェニックベク ターｐ８２６から作製した。この新しいｉｎマ！１「Ｏ分析ベクターを９８３０ と名付けた。 既に記載の如く、１ｎマ１１ｒＯ分析は、ベクターｐ８３Ｇがトランスフェクト した哺乳類細胞系ＣＯ３−７細胞から免疫沈降可能なＩＳＡの発現及び分泌をサ ポートすることを示した。 実施例１５ Ｂ　Ｌ　Ｇ／ＨＳ　Ａベクターのｉｎ　ｖｉｌｌａ　（組織培養）分析トランス ジェニック動物に導入されたＢ　Ｌ　Ｇ／ＨＳ　Ａベクターの全部がこのような 動物の乳汁中でのＩＳＡの発現をブポートする潜在的能力を有しているかを調べ るために、組織培養細胞中でのＨ３Ａ発現支持能について最初にテストした。生 来（ｎＩｔｉマｅ）のプロモーター（例えばＢＬＧ）の制御下で天然に見られる 乳汁蛋白質の発現の１ｎマ１マ０での調節は複雑であり、ホルモンと特別な細胞 −細胞相互作用を必要とする。ＢＬＧ５’−フランキングプロモーター配列は通 常、組織培養細胞で不活性であり、天然の１ｎｖ目Ｏの条件を正確に漢倣してい る組織培養系は存在しなかった。 これらの配列を刺激して活性にするために、ＳＶ４０エンハンサ−をプロモータ ーに導入した。その結果、ＩＳＡ遺伝子構成（ｃＤＮＡ、　ミニ遺伝子（ｍｉｎ ｉｌｅｎｅ）　、遺伝子）が異なるＢＬＧ／Ｈ９Ａ構築物がサポートする組織培 養中でのＨ３Ａ発現レベルが調べられた。これらのｉＩｌマｉｌ＋ｏ分析用構築 物中で遺伝子パックグランドを同じに維持するために、Ｈ８Ａ遺伝子成分のみが 異なる一連の構築物を作製した。最初に、５ｖ４０工ンハンサーをトランスジェ ニック構築物ｐ　６５２　（３ｋ　ｂＢＬＧ５’　−フランキングプロモーター 配列；イントロン１−６を持っＨ８Ａ　Ｅ二遺伝子；ＳＶ４０ポリ八ポリへに導 入した。 次に、）（ＳＡ配列は変化するが、ＳＶ４０エンハンサ−を導入したＢＬＧプロ モーターは全てで同一になるように、得られたｉｎ月１＋ｏ構築物を使用して、 この一連の他のすべての構築物を作製した。さらに、全ての構築物がＩＳＡ配列 の下流に同じＳＶ４０ポリ八ポリへ有した。 構築物ｐ６５２をＡｓｐ７１Ｂ　（ＢＬＧブ０％−ター内、ＢＬＧ転写開始部位 の約９ｏｏｂｐ上流）で消化した。線状化した構築物をフェノール／クロロホル ムで２回抽出し、エタノールで沈澱させた。過剰のｄＮＴＰｓの存在下で、フレ ノウ酵素（Ｂｏ＋ｈ＋ｉＢｅ＋　Ｍｔｎｎｈ！ｉｍ　）で充填して、Ａｓｐ７１ ８消化末端を平滑末端化とした。充填反応後、１０ｍＭのＥＤＴＡの存在下で酵 素を加熱不活化（６５℃、１５’）させた。再度、サンプルを２回抽出し、エタ ノール沈澱させた。線状化し、平滑末端化ｌしたＤＮＡをゲルとエル−チップ（ ｅｌｗｌｉｐ）で精製し、仔牛腸アルカリ性ホスファターゼ（Ｐ！ｏｍｅＨ１で その５′末端を脱燐酸化した。２０ｍＭのＥＤＴＡの存在下で、酵素を加熱によ り不活化（６５℃、１５′）させた。再度、サンプルを２回抽出し、エタノール 沈澱させた。ＳＶ４０エンハンサ−が１７９ｂｐのＦｏｋｌ　（ＳＶ４０の塩基 対位置９４で切断）からＰｖｕ　Ｉ　Ｉ　（ＳＶ４０の塩基対位置２７３で切断 ）断片として構築物ｐ　５Ｖ２ＣＡＴ　（Ｇｏ＋ｍｓｎ　ｓｌ　ｔｌ、、１９１ １２．　Ｍｏ１．　Ｃ＠ｌｌ。 Ｂｉｏｌ、２．　１０４４１０５１）から遊離された。Ｆｏｋ　１部位をフレノ ウポリメラーゼ及び過剰のｄＮＴＰｓで平滑末端化した。断片をゲル及びエル− チップで精製し、次に、調製したｐ６５２断片に連結した。連結生成物を大腸菌 （Ｅ、ｃｏ　ｌ　１）ＴＧＩ細胞に形質転換し、アンピシリン耐性とした。ｐ６ ５２のＡｓｐ７１８部位の隣の部位を消化するＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩでの消 化により正確な組換え体を同定した。約２０８３ｂｐの断片から約２２６７ｂｐ への変換により、ｐ６５２のＡｓｐ７１８部位にＳＶ４０エンハンサ−が導入さ れた正確な組換え体を同定した。これらをｐ６５６と名付けた（第２Ｃ図）。 ｉｎ　ｙｉｌ＋ｏ分析用構築物ｐ６５６は組織培養細胞中でイントロン１−６を 有するＨ３Ａミニ遺伝子を発現できる。 ｉｎマｉｌ＋ｏ分析用構築物ｐ６５６を直接使用していくつかの新しい１ｎマｉ ｌ＋ｏ分析用構築物を作製した。構築物ｐ６５６をＢｓ　ｔ　Ｅ　Ｉ　Ｉ　（Ｈ ３Ａエキソン１内）及びＮｃｏ　Ｉ　（Ｈ９Ａｘキソン７内）で消化した。これ らの２つの部位の間のＨ３Ａ配列を欠いた大きなりＮＡ断片をゲル及びエル−チ ップで精製した。ｃＤＮＡから構成された、エキソン１のＢｓｔＥ１１部位とエ キソン７のＮｃｏ１部位の間のＨ３Ａ配列のＤＮＡ断片（８０１ｂｐ）、または イントロン１　（１５１０ｂｐ）またはイントロン２　（２２５５ｂ　ｐ）また はイントロン１及び２（２９６４ｂ　ｐ）を含むＤＮＡ断片は、ＢｓｔＥｌｌ及 びＮｃｏｌ消化により、各々、ｐ５８２　（Ｈ３ＡｃＤＮＡ含有、下記）　、ｐ ６００　（イトロン１を有するＩ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子含有）、ｐ６９０　（イ ントロン２を有するＨ３Ａミニ遺伝子含有）子 り含有）から得た。断片をゲル及びエル−チップで精製し、各　１々これらの２ つの部位の間の配列を欠く精製したｐ６５６断片に連結した。連結生成物を形質 転換により大腸菌ＤＨ５に導入、または電気穿孔により大腸菌ＤＨＩＯＢに導入 して、アンピシリン耐性とした。正確な組換え体は、各々、ＢｓｔＥＩＩ及びＮ ｃｏｌで消化して、８０１、または１５１０、または２２５５、または２９６４ ｂｐのＤＮＡ断片の生成により同定した。Ｈ３ＡｃＤＮＡを含有する新しいｉｎ 　ｗｉｌ＋ｏ分析用構築物をｐ６５８と名付けた。イントロン１、イントロン２ 、及びイントロン１及び２を有するＨ８Ａミニ遺伝子を含有する構築物を各々ｐ ６５９、ｐ６９１及びｐ６６０とした。 Ｈ３ＡｃＤＮＡを有するＢＬＧ／Ｈ３Ａｉｎｗ口ｔｏ分析用構築物を作製する他 に、非常に活性の高いアデノウィルスの主要な後期プロモーター及びＳＶ４０エ ンハンサ−との組合せの制御下にある、Ｈ３ＡｃＤＮＡを含むｉＩｌマ自１６分 析用構築物を作製した。その結果、ＢＬＧ構築物以外の構築物でのｃＤＮＡから のＨ８Ａ発現の評価が可能となった。この構築物は２つのステップで作製した。 第一ステップでは、ＳＶ４０初期領域スモールｔスプライシングシグナル及びポ リ八部位を、主要な後期プロモーターの下流にあるポリリンカーの下流に置いた 。 ＥｃｏＲＶ部位にＳＶ４０エンハンサ−を導入した主要な後期プロモーターから なり、次にポリリンカーを持つｉｎｖ口ｊＯ分析用構築物（本明細書中、ｐ５５ ０と呼ぶ）をＢａｍＨＩで消化した（ポリリンカー内）　（Ｉ１ｗ＋ｖｉｌ＋　 ｅｌ　＊１．、　１９Ｂ？、Ｎｗｃｌ。 Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｚ、　１５．７Ｎ？−７１５３１、線状化したＤＮＡ（２８１ ８ｂｐ）をゲル及びエリュチツプで精製した。５′末端を子牛アルカリ性ホスフ ァターゼで脱燐酸化した。前記のように、酵素を加熱により不活化し、フェノー ル／クロロホルムで２回抽出し、エタノールで沈澱させた。この断片をＳＶ４０ スモールｔスプライシングシグナル及び下流のポリ八部位からなる約８５０ｂｐ の断片（上流末端にＢｇｌｌＴ及び下流末端にＢ　ａ　ｍ　Ｈ１）　（Ｍｗｌｌ ｉＨｓｎ　＆　ＢｓＢ、　５ｃｉｅｎｃｅ　２０９＋１４２３−１４２７゜１９ ８０）に連結した。連結生成物を形質転換により大腸菌ＤＨ５細胞に導入し、ア ンピシリン耐性とした。主要な後期プロモーターと同じ配向でｐ５５０のＢａｍ Ｈ１部位内にスプライシングシグナルとポリ八部位を持つ正確な組換え体は、Ｂ ａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩでの消化による２つの断片（約２８０９及び８５６　ｂ 　ｐ）の生成により特性化した。これらをｐ５６６と名付けた。次に、ＨＳ　Ａ 　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａをｐ５６６に導入した。構築物ｐ５６６をＮａｅｌのすぐ下流 でプラントカッター（ｂ　ｌ　ａ　ｎ　ＩＣ１口ｅ＋１Ｎａｅｌ及びＥｃｏＲＴ で切断した（両部位は主要後期プロモーターと下流のＳＶ４０スプライシングシ グナル及びポリ八部位との間のポリリンカー内にある）。ＨＳ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ 　Ａは下記のように得た。構築物ｐ　ＨＳ　Ａ、　−Ｆ　１−を（ＨＳ　Ａ　ｃ 　ＤＮＡの５′末端で）ＢａｍＨＴで消化し、エタノール沈澱させた。過剰のｄ ＮＴＰｓの存在下で、消化したＢａｍＨ１部位をフレノウ酵素で平滑末端化した 。ＤＮＡをエタノールで沈澱させ、（Ｈ３ＡｃＤＮＡの３′末端で）ＥｃｏＲＩ で消化した。 得られたｃＤＮＡ断片（１９８３ｂｐ）をゲル及びエル−チップで精製した。次 に、調製した１）５６６ＤＮＡに連結し、連結生成物を形質転換によりＤＨ５細 胞に導入して、アンピシリン耐性とした。正確な組換え体は、Ｂｇｌｌｌでの消 化による、非反復ＥｃｏＲ１部位の回復と断片（約４２０８．１３９９及び３６ ｂｐ）の生成で特性化した。主要後期プロモーターの制御下にあり且っＨ３Ａｃ ＤＮＡをもっこの１１マｉｌ＋ｏ分析用構築物をｐ５８２と称した。 次のようにＨ３Ａイントロン１２−１４をｐ６５８に導入した。構築物ｐ６５８ を（Ｈ３Ａエキソン７内で）Ｎｃｏｌで消化し、（ＳＶ４０ポリＡポリの下流末 端のところで；第二の５ａｉｌ部位はＢＬＧプロモーターの上流末端に見られる ）Ｓａｌｌで部分的に消化した。エキソン７内のＮｃｏ１部位の下流にあるＨ　 Ｓ　Ａ配列及びＳＶ４０ポリＡポリを欠く約６０００ｂｐのＤＮＡ断片をゲル及 びエル−チップで精製した。構築物ｐ６７４をＮｃｏｌ（Ｈ３Ａエキソン７内） 及び５ａｉｌ（隣接したＳＶ４０ポリ八部位の下流末端）で消化した。エキソン １２−１４を含む、エキソン７内のＮｃｏ１部位及びポリ八部位の下流にあるＨ ３Ａ配列からなる約４０００ｂｐのＤＮＡ断片をゲル及びエル−チップで精製し た。これらの２つの断片を連結し、生成物を電気穿孔法で大腸菌ＭＣ１０６１細 胞に導入して、アンピシリン耐性とした。正確な組換え体は、５ａｌｌ消化によ る２つのＤＮＡ断片（約８０２１及び２８２４　ｂ　ｐ）及びＸｂａｌ消化によ る３つの断片（約７２２９．２７５７及び８５９ｂｐ）で特性化した。この新規 の１１マ白ｒＯ分析用構築物はｐ６８２と表わし、イントロン１２−１４を含む Ｈ３Ａミニ遺伝子を含有する。 最初にｐ６５８　（Ｈ３ＡｃＤＮＡを含有する）をＮｃｏｌ（ＨＳ　Ａ　ｘキソ ン７内）及びＰｖｕ　Ｉ　（ｐＧＥＭ内）で消化して、イントロン７−１４を含 むＩ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子を含有する構築物を作製した。エキソン７内のＮｃｏ １部位にＳＶ４０エンハンサ−及びＨ３ＡｃＤＮＡと、ＢＬＧ配列に隣接したＰ ｖｕ　１部位にｐＧＥＭ配列を導入したＢＬＧプロモーターからなる大きなりＮ Ａ断片（約５５６９ｂｐ）をゲル及びエル−チップで精製した。構築物ｐ６８３ もＮｃｏｌ　（Ｈ３Ａエキソン７内）及びＰｖｕ　Ｉ　（ｐＧＥＭ内）で消化し た。イントロン７−１４を含むＮｃｏ１部位の下流にあるＨ８Ａ配列、ＳＶ４０ ポリ八部位及び（上記断片に認められるものに相補的である）隣接ｐＧＥＭ配列 からなるＤＮＡ断片（約１０４００ｂｐ）をゲル及びエル−チップで精製した。 ２つの精製した断片を連結し、連結生成物を電気穿孔により大腸菌ＤＨ５α細胞 に導入しアンピシリン耐性を得た。正確な組換え体は、Ｂａｍｔ（１（約１１９ ９８及び４１８５ｂｐ）またはＨｉ　ｎ　ｄＩＴ（約９９７３及び６２１０ｂｐ ）で各々消化して２つの断片を生成して同定した。インドロン７−１４を持つＨ ３Ａミニ遺伝子を有するこの新規のｉｎマ１１ｒＯ分析用構築物をｐ６８４と称 した。 Ｈ３Ａイントロン１Ｍは２または１及び２を、イントロン１２−１４　（ｐ　６ ８２）もしくはイントロン７−１４（ｐ６８４）のいずれかを有するＨ３Ａミニ 遺伝子を既に含有する新規の１０マ自ｔｏ分析用構築物に導入した。構築物ｐ６ ８２及びｐ６８４を各々Ｂｓ　ｔＥＩ　Ｉ　（ｔ（ＳＡエキソン１内）及びＮｃ ｏｌ　（Ｈ３Ａエキソン７内）で消化し、これらの２つの部位の間のＩＳＡ配列 を欠く得られた大きなりＮＡ断片をゲル及びエル−チップで精製した。各々に、 イントロン１もしくはイントロン２またはイントロン１及び２を含むＢｓｔＥＩ Ｉ及びＮｃｏＴ部位の間のＨ３Ａ配列の上記の精製ＤＮＡ断片（１５１０、また は２２５５または２９６４ｂｐ）を連結した。 連結生成物を形質転換により大腸菌ＤＨ５細胞に導入するか、電気穿孔法で大腸 菌ＤＨＩＯＢ細胞に導入した。正確な組換え体は、ＢｓｔＥＩ＋及びＮｃａｌで 消化して１５１０ｂｐ　（イントロン１導入のため）、２２５５ｂｐ　（イント ロン２導入のため）または２９６４ｂｐ　（イントロン１及び２導入のため）の ＤＮＡ断片を生成することにより、各組の親クローン、ｐ６８２及びｐ６８４に ついて同定した。新規のｉｎマ自Ｔｏ分析用構築物の表示及びその特異）ＩＳＡ ミニ遺伝子構造を下記に示す。 ｐ６９４　インドｌ］：／１＋１２−１４を持つＨ８Ａミニ遺伝子ｐ６９５　イ ンド０ン２−１４２−１４を持っＨ３Ａミニ遺伝子ｐ６９７　インド０ン１＋２ ＋１２−１４を持つＩＳＡミニ遺伝子 ｐ６９３　イントロンｌ＋７−１４を持っＨ３Ａミニ遺伝子ｐ６９２　イントロ ン２＋７−１４を持っｆ（ＳＡミニ遺伝子ｐ６９８　イン）ｏン１＋２＋７−１ ４を持っＨ８Ａミニ遺伝子 １４個のイントロンをすべて有する完全Ｈ３Ａ遺伝子を含有する１ｎマｉｌ＋ｏ 分析用構築物は次のように作製した。構築物ｐ６５６をＮｅｏ　Ｉ　（Ｈ３Ａエ キソン７内）及びＰｖｕ　１（ｐＧＥＭ内）で消化した。ｐＧＥＭ配列（Ｐｖｕ １部位がら）、ＳＶ４０エンハンサ−を導入した隣接ＢＬＧプロモーター及びイ ンドロン１−６を含むエキソン７内のＮｃｏ１部位までのＨ３Ａ配列からなるＤ ＮＡ断片（約１２３２６ｂｐ）をゲル及びエル−チップで精製した。この断片に 、上記の、インドロン７−１４を含むエキソン７内のＮｃｏ１部位の下流にある ＩＳＡ配列、５Ｖ４ＱポリＡポリ及びＰｖｕ１部位に隣接するｐＧＥＭ配列から なる精製した１）６８３Ｎｃｏ　ＩからＰｖｕ　１断片（約ＬＯ４００ｂｐ）を 連結した。連結生成物を電気穿孔法で大腸菌Ｄ）ＩＩＯＢ細胞に導入してアンピ シリン耐性とした。正確な組換え体は、ＢａｍＨＩ消化により２つの断片（約１ ８９２９及び４１８６ｂｐ）を生成して特性化した。イントロン１−１４を持つ 全Ｈ３Ａ遺伝子を含有するこのｉｎマｉｌ＋ｏ分析用構築物をｐ６８５と表わし た。 １ｎマ１ｌｒｏの組織培養発現は一過性のトランスフェクションにより実施した 。組織培養用哺乳類細胞系ＣＯ５−７細胞を、１０％ウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ） を含有するＤＭＥＭ培地中で１００ｍｍ組織培養皿に等しく分け、約５０−７５ ％の集密度（約５×１０　細胞）となるようにした。ＣＯ２イン牛ユベータ内、 ３７℃で、−晩インキユベートした。翌朝、培地を新しい培地５ｍｌと交換し、 細胞を１−２時間インキュベートした。 次に、供給業者のプロトコールに従って、燐酸カルシウム手法（Ｓ　Ｐ＋ｉ＋＋ ｅ　−＞　３　？ｉｍｅ、Ｉｎｅから供給された試薬）を使用して、Ｂ　Ｌ　Ｇ ／ＨＳ　Ａ構築物（ＳＶ４０エンハンサ−を含有）でトランスフェクトした。各 実験内で、その実験についてプレート内の細胞にトランスフェクトした最大構築 物（ｋ　ｂ）の全量は２５μｇであった。等モル量のより小さな構築物をトラン スフェクトするために、これらの構築物の各々の量を最大の構築物との大きさの 差に比例して減少させ、各構築物についてのＤＮＡの総量は高分子量（ＨＭＷ） のサケ精子（ｓ　５）ＤＮＡを使用して２５μｇまでとした。４−５時間、細胞 をトランスフェクトした後、細胞にグリセロールシタツク（３ｍｌ、２分）を与 え、供給業者の支持に従って洗浄し、次に１０％ＦＣ３を含有するＤＭＥＭ培地 １０または１５ｍ１中で３日間インキュベートした。 Ｈ３Ａの一過性の発現及び分泌を検出するために、トランスフェクトした細胞を 、最初に、Ｃｙｓ及びＭｅｔを含まず、５％透析ＦＣ３（ｄＦｃｓ）を含むＤＭ ＥＭ培地（グルタミン含有）で洗い、次にその培地中で１−３時間、インキュベ ートして、アミノ酸、すなわちシスティン（Ｃｙｓ）及びメチオニン（Ｍｅｔ） の飢餓状態にした。細胞から培地を除去した後、細胞（及び−ｅ　ｌｌｏｙａ合 成した蛋白質）を約２００ｕＣｉ／ｍｌの３５Ｓ−Ｃｙｓ及び３５Ｓ−Ｍｅｔを 含むＤＭＥＭ　＜グルタミンを含むが、ＣｙｓまたはＭｅｔを含まず、１０％透 析ＦＣ３を含む）（Ｅｘｐｒｅ　Ｓ　Ｓ　Ｓ−蛋白質標識ミック７、　；　ｌｌ ｅｖＥｅｇｌ■ｄ　Ｎ＋＋ｃｌｅｔｒ、１Ｉｌｅ）　３ｍ　ｌで４−５時間代謝 標識した。 代謝標識後、上演を皿から取り、遠心分離して全ての混在する細胞を除去した。 上清中で発現され、分泌された代謝標識したＨ９Ａは、ウサギ抗Ｈ５Ａ抗体（Ｄ ＡＸＯ−免疫グロブリンＣｓ＋、１ＡＯＯ１）を使用する免疫沈澱により検出し た。上清を先ず、免疫沈澱（ＩＰＰ）バッフｙ（２０ｍＭトリス、ｐＨ８，１５ ０ｍＭ　ＮａＣｌ、１％ＮＰ−４０，０．１９６９ＤＳ、２ｕｇ／ｍ＋アプロチ ニン）中の蛋白質Ａ−セファロースビーズの５０％スラリー２００ｕ　Ｉで、４ ℃で３０−８０分間、振とうして、予め清澄にした。清澄にした上清を遠心分離 によりビ・−ズから分離し、４℃で３−４時間、蛋白質Ａ−セファロースビーズ に予め結合させたウサギ抗Ｈ３Ａ　Ｉ　ｇＧで処理した。ビーズを冷たいＩＰＰ バッファで６回洗い、２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥＬｚｅｍ■１１サンプルバッファに 再懸濁し、９５℃に５分間加熱し、８％５ＤＳ−ＰＡＧＥゲルにかけた。電気泳 動後、ゲルを固定しく１０％酢酸、２５％イソプロパツール）、フルオログラフ ィー試薬＾１１ｉ１７　（Ａｍｅ＋ｔｋ＊ｓ、ｌ＊ｃ、）で処理し、’ｌｌｈｓ ｆｆｓａ３ＭＭ濾紙上で乾燥させ、Ｘ線フィルムに霧光するために使用した。現 像したフィルム（オートラジオグラフ）により、分析したＢ　Ｌ　Ｇ／ＨＳ　Ａ 構築物の各々が支持した組織培養一過性アッセイプレートの各々からの代謝標識 したＩＳＡの発現及び分泌の相対レベルが可視化された。 最初の目マｉｌ＋ｏ分析により、ＢＬＧコーディング及びＢＬＧ３′配列とポリ アデニレーシ建ンポリへ部位とを有するＢＬＧ構築物内にＨＳ　Ａ　ｃ　Ｄ　Ｎ 　Ａを含有する構築物（ｐ　６１５）、ＢＬＧコーディング配列を欠くがＢＬＧ ポリポリへ（ｐ　６０６）またはＳＶ４０ポリ八部位（ｐ　６０８）を持つ構築 物内にイントロン１を含有するＩ　Ｓ　Ａ　ミニ遺伝子を含有する構築物、また はＢＬＧポリポリ位を持つ構築物内にイトロン１及び２を持っＨ３Ａミニ遺伝子 を含有する構築物（ｐ　６１０）からＩＳＡを発現できることが示された。これ らのベクターから産生されたＩ　Ｓ　Ａは、ＳＶ４０エンハンサ−／アデノウィ ルス主要後期プロモーターの制御下にあり且つＨ３ＡｃＤＮＡを持つ非ＢＬＧ− 過性のベクター（ｐ　５８２）から産生されたＩ　Ｓ　Ａと共に移動する。予想 通りに、ＳＶ４０エンハンサ−を欠＜ＢＬＧ構築物（ｐ　６００）はｉａマ目【 ０でＩＳＡを発現しない。この１１月１＋ｏ分析で認められるバンドの免疫沈降 は抗Ｈ３Ａ血清に特異的で、非特異的抗血清では沈降せず、バンドが実際にＩＳ Ａであることを示している。重要なことには、発現のレベルは、この群では最も 高レベルに発現されイントロン１及び２を持つイントロンの数の増加と共に増加 する。ｐ６０６及びｐ６０８（イントロン１を持っＨ３Ａミニ遺伝子）からの発 現のレベルは同じであり、これは３′ポリ八部位の起源（ＳＶ４０またはＢＬＧ ）がこのアッセイの発現レベルに影響しないことを示している。 この前記の分析を、Ｈ８Ａイントロンを変化させ、または成分を変化させた構築 物について実施した。このｉｎマ１ｎｔｏアッセイでの発現レベルに対するＨ３ Ａイントロンの数及び位置の影響を特異的に分析するために、Ｈ３Ａイントロン のみを変化させた構築物（第３Ａ図）を分析した。これらの構築物はすべて、Ｓ Ｖ４０エンハンサ−を導入したＢＬＧ５’　−フランキング配列（プロモーター ）及び同じ３′−配列（ＳＶ４０ポリ八ポリへを含有する。広範囲の発現レベル が種々のＨ３Ａミニ遺伝子を持つ構築物から得られる。前記と同様に、ＨＳ　Ａ 　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡにょるＨ　Ｓ　Ａの非常に低い発現レベル（レーン１）はイン トロン１を持つＩ　Ｓ　Ａミニジーンで上昇しくレーン２）、さらにイントロン １及び２で上昇する（レーン３）。イントロン２のみを含む場合（レーン９）、 イントロン１及び２の両方を持つ場合（レーン３）と同様の効果があり、明かに イントロン２はイントロン１のみ（レーン２）に比べてより効果的である。この 知見は特定のイントロンがＩＳＡの発現に際し、他のものより効果的であること を示している。さらに、最後の３個のＨ３Ａイントロン、１２−１４　（レーン ６）が存在すると、イントロン２のみ（レーン９）に比べて発現のレベルが低い が、イントロン１のみ（レーン２）と同様のレベルとなるという事実から分かる ように、イントロンの数を単に増やすだけで発現が必ずしもさらに増加するわけ ではない。このことは、特定のイントロンの性質及び／または５′末端ではなく ３′末端にイントロン１２−１４を持つ、遺伝子内の相対的な位置によるもので あろう。重要なことに、最初の６個のイントロン（インドロン１−６、レーン４ ）、最後の８個のイントロン（イントロン７−１４、レーン７）を含有するＨ３ Ａミニ遺伝子またはすべてのインドロン１−１４を持つ完全ＩＳＡ遺伝子（レー ン８）を含有する構築物では同等またはそれ以上のレベルの発現が得られる。イ ンドロン１−６または７−１４を使用したときに同レベル以上の発現が得られる 具体的な理由は明かではないが、これらのサブセットのいずれかを含むと全Ｉ　 Ｓ　Ａイントロンを含む場合と同じくらい高い発現が得られることは明らかであ る。イントロン２及び７−１４　（レーン１０）を含むＨ３Ａミニ遺伝子で非常 に高レベルの発現が得られ、このことは発現レベルに対する特定のイントロンの 組合せの相乗効果を示しており、またイントロンをすべて持つ完全遺伝子を含む 場合とは反対に、これらの特定のイントロンの組合せを含むことによりＩＳＡの 発現を数倍上昇させうろことを示している。　特定のＨ３Ａイントロンの組合せ がＨ３Ａ３Ａレベルに対し与える相乗作用を調べた（第３Ｂ図）。発現が非常に 高く、イントロン２（レーン３）及びインドロン７−１４　（レーン１２）を加 えた時の発現より非常に高いイントロン２及び？−１４（レーン１４）の相乗作 用を含め、構築物からの同じ相対レベルの発現をこれまで述べてきた。イントロ ン１及び７−１４　（レーン３）の組合せは相乗的ではなかった。何故ならば、 この構築物が支持する発現のレベルはインドロン７−１４のみを持つ構築物（レ ーン１２）の支持するレベルとほぼ同様であったからである。別の相乗的な組合 せも示された。Ｈ３Ａイントロン１（レーン２）またはイントロン１２−１４　 （レーン８）を持つ構築物からの発現レベルは非常に低いが、イントロン１及び １２−１４　（レーン９）ではこれらの一方または両方を合わせたときの相加作 用に比べて顕著に高いレベルが得られる。イントロン２と１２−１４（レーン１ ０）の間の相乗作用による発現レベルはさらに高かった。イントロン１及び２及 び１２−１４　（レーン１１）を含むさらに大きな３つの部分の相乗作用では、 ３つを個別に加えたときの相加作用または１と１２−１４及び２、または２と１ ２−１４及び１の相加作用から予期したものより高い発現レベルを示している。 イントロン１及び２及び１２−１４で得られる発現レベルはインドロン１−６（ レーン６）またはインドロン７−１４　（レーン１２）またはインドロン１−１ ４を持つ完全遺伝子（レーン５）で得られる発現レベルより高かった。 これらの実験での最も高い発現レベルは、イントロン１及び２及び７−１４　（ レーン１５）と同様に、Ｈ３Ａイントロン２及び７−１４を持つ構築物（レーン １４）で支持された。これは、１４個のイントロンすべてを持つ完全Ｈ３Ａ遺伝 子を持つものを含め、調べた他の構築物が支持するものより数倍高かった。 これらの結果は、生存している細胞では、ＩＳＡの発現レベルは特定の）（ＳＡ イントロンの相補性、すなわち、構築物中に存在するＩＳＡイントロンの数、取 り込まれた特定のイントロン、イントロンの相対位置、特定のイントロン間の相 乗作用で変化することを示している。全イントロンを持つ完全Ｈ３Ａ遺伝子また は）ＩＳＡｃＤＮＡと比較し、特定のイントロンのサブセットを有するＨ３Ａミ ニ遺伝子を含有する構築物で数倍高い発現レベルが得られる。 実施例１６ トランスジェニックマウスの生成と同定Ａ、受精卵の収集 受精卵収集に使用するマウスはＮＩＨで樹立された同系交配種Ｆ　Ｂ　Ｖ／Ｎで ある（Ｐ＋ｏｃ、　Ｎｔｌｌ、＾ｃｓｄ、Ｓｅｉ、　ＵＳＡ　ＩＩＬ２０６Ｓ− ２０ｆｉ９．　［９９１）　ＯコｔＬラノｖつＸハＮｔｌｉａａｓｌ　Ｉｆｉｌ ｌｉｌｌｌｅ　ｏｌ）１ｓ暑１１ｂ　Ａ＋＋ｉ＋ｕｌ　Ｇｅ＋＋ｃｌｉｃ　Ｒｅ ５ｏｕｒｃｅがう入手シタ。超排卵（ｔ＊ｐｅｒｅｒ＠１ｓｌｉｏａ）を誘発す るために、５−６週齢の雌にＰＭＳＧ　（Ｉｅｌｅ＋ｔｅｌ）　５　ｔ、ｕ、を 注射し、４４−４８時間後にヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）　（Ｓｉ１ｍ ＊　Ｃｈｅｍｉｃｓｌ　Ｃａｍｐｓｎ７）５ｉ、ｕ、　を注射した。次に、成熟 した雄性のＦＢＶ／Ｎと交尾させる。翌朝、膣栓の存在により交尾した雌を識別 する。卵管からの受精卵の洗い出し、ヒアルロニダーゼによる処理、Ｎ１６また はＭ２培地中での培養条件はＨａ（ｔｎ、　Ｃｏｔｌｓｎｌｉｎｉ　＆Ｌ＋ｃ７ 　”Ｍｔｎｉｐｕｌｔｌｉｎｇ　１ｎｄ　Ｍ＋ａ＋ｅ　Ｅｖｒｂｒｌｏ、　Ａ　 ｌ５ｂｏｒｓｌｏｒ７　＋＋５ｎａｔビＣｏ１ｄ　Ｓｐ＋ｉＢ　Ｈｔ＋ｂｏ＋　 Ｌｒｂｏ＋＋ｌｏ＋７　（１９８６）に記載のように実施する。 Ｂ、マイクロインジェクション用ＤＮＡの調製マイクロインジェクション用にＤ ＮＡ配列を精製するために、ＢＬＧまたはＢＬＧ／Ｈ３Ａ遺伝子を持つプラスミ ドをＳａｌ■で消化した。１．５％アガロースゲルでの分離、電気溶出及びエル −チップカラム（５ｃｈｌｅｉｃｈｅ＋　＆　Ｓｃｈｍｅｌｌ）　ｌ：より精製 して、ＢＬＧ及びＢ　Ｌ　Ｇ／ＨＳ　Ａ配列をｐＧＥＭ配列から分離した。ＤＮ Ａを、０．５ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭトリス（ｐＨ７，５）にａ　ｕ　ｇ ／ｍ　ｌの濃度で懸濁し、Ｆ　Ｂ　Ｖ／Ｎ卵の前核にマイクロインジェクション し、この卵を次に、５ｌｌＩＩｌｉの記載するように（Ｓｈｔｎｉ、１９８５． 　Ｎｔ１ｗ＋ｚ　３１４：２１１３−２１Ｈ；　５ｉａｉ。 １９８６、　Ｍｏｆ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　６：　２Ｈ４−２６３１）　Ｃ Ｄ　Ｉ偽妊娠レシピエントラットの卵管に移植した。 Ｃ，マイクロインジェクション 注ン用ピペットはフィラメントを持つ長さｉｏａｍ、外径１．０ｍｍの壁の薄い ホウ珪酸塩ガラスのキャピラリーで作製ｔＸ＋　（Ｃｔｌ、Ｎｏ、ＴＶｌｏｏＦ −４；　Ｗｏｒｌｄ　Ｐｒｒｃｉｓｉｏａ　Ｉｎ＊ｌｒｗｍｅａｌｓ。 Ｉｎｃ、３７５　ＱＩＩＩＩ＋１ｐｌｓｃ＾？！、、　Ｎｅｗ　Ｈｔｖｅｅ　Ｃ ｏｎｅ、０６５Ｈ，ＵＳＡ）。 保持ピペット（ｂｏｌｄｉＢ　ｐｉｐｓｌｌｅｔ）は、Ｈｏｒｓｌ、Ｃｏ５１＊ ＋＋１ｉＩｌｉ　＆Ｌｔｃ７　’Ｍ■ｉｐｗｌｓｊｉＢ　ｔｈｅ　ｍｅｗｓｅ　 ｔａｂｏｏ：＾Ｉｒｂｏ＋＊ｌｏＢ　ｉｓｎｗ＊ｌ’Ｃ５ＨＬ　（１９８６１に 記載のように、長さ９．０ｃｍ、外径１．　０ｍｍのガラスキャピラリーで作製 する（Ｃ１１Ｎｏ、１０５Ｇ；Ｄ＋ｗｍｓｏｎｄ　！１ｃｉｅｌｉｌｉｃ　Ｃｏ 、５００　Ｐｋｖｙ、、　Ｉｔｒｏｏ＊ｘｌｌ、　ＰＡ　１９００１ＵＳＡ　） 　。 マイクロインジェクションは、ガラスの顕微鏡スライドチャンバー中、Ｅ／　Ｉ Ｊ　コ−ン油（Ｃｇｌ、　Ｎｏ、６４Ｈ−Ｒ２Ｌ　Ｔ＆ｏｓ＊ｔ　Ｓｃｉ！ｍｌ 百ｉｃ、Ｐ、Ｏ，Ｂｏｘ　９９．５ｖｅｄｓ＠ｂｏ＋ｅ、　Ｎｌ　０８００−０ ０９９．　ＵＳＡ）を重層した１滴のＭ４２培地中で実施する。チャンバーはｘ ２０及びｘ４０の示差干渉コントラスト（ｄｉｌｌｅｔｅｎ目畠１１ｍ１ｅ百ｅ ｌｌｌｅｅｌｃｏａｌｒ＊ｔｌ　：　Ｄ　Ｉ　Ｃ）＃）対物レンズとＸＩＯの接 眼レンズを備えた顕微鏡（Ｄｉ＊ｐｂｏ１．　Ｎ１ｋｏｎ）上に固定する。３Ｄ 油圧式マイクロマニピュレータ（ＣＮ、　Ｎｏ、　ＭＷ−１８１Ｎ１ｋｏ１１） を顕微鏡の台に固定する。 内側のフィラメントに沿った毛管現象により先端まで運ぶ。注入用キャピラリー にＦ１ｗ＋ｉセｃｌＦｃＨ（Ｃｓ１．　Ｎｏ、Ｆ４７５８；　５ｉ（ｓ＊Ｃｈｅ ｍｉｃＩＩ　Ｃａ＊ｐ＊ａりを充填し、機器の縁（ｃｏｌｌａｒ）　（Ｃｓ１． 　Ｎ。 ０７０　３２１１８ｍ！１１１１　１＋＋ｌ＋ｉｍ＠口Ｉ　Ｃｏ、ｌｔｃ、Ｒｏ ｃｋｔｉｌｌｅ、ｉｌＤ　２Ｇｇ５０゜ＵＳＡ）を介してマイクロマニュピレー タ上に固定する。これはｉｆ　（ＰＥ−１００：　Ｂｅａｔｅｎ　ｌｍ５ｌ＋＊ ｍｅａｌ　Ｃｏ、　Ｉｎｃ、；　Ｒｏｃｋｔｉｌｌｔ、ＭＯ２０８５０、ＵＳＡ ）ニヨり油圧ドライブユニット（ＨＤＩＩ；　Ｂｓａｌｏｍｌｓｇｌ＋ｗｓｅ＊ ｌ　Ｃｏ、Ｉｎｃ、；　Ｒｏｃｋｙｉｌｌｔ、　ＭＤ　２Ｇ８５０．　ＵＳＡ　 ）に接続されている。保持キャピラリーを同様に固定する。機器全体にＮｍ＋１ ｎｅｌ　ＦＣ？？　（ＳｉｇｌＭ）を充填する。 ２０−３０個の前核段階の卵のバッチ（ｂ易１ｃｈｅｓｌ　を注入用チャンバー に入れる。保持ピペット及び注入ピペットをチャンノく−のところにもっていく 。保持ピペットで卵を取り上げて（する間に、注入ピペットを前核に挿入し、約 ２ｐｌのＤＮＡ溶液を注入する。チャンバー内の卵の全てに注入したときに、卵 を採取し、移植前少なくとも１時間培養する。 Ｄ、胚の移動 通常の胚の移動には、精管切除したＣＤ１の雄と交尾した異系交配ＣＤＩの雌を 使用する。本質的に、Ｈｏ（ｇ口、　Ｃｏ＋１ｉｎｌｉｎｉ＆　ｌ＋Ｂ″Ｌａｉ ｐｗｌ＊ｌｉＢ　ｔｈｅ　ｍｏｌｓｅ　ｅ＊ｂＢａ：　Ａ　ＩＩｂｏ日１ｏＢ− ■■ピＣ５ＨＬ　（１９８６１ニ記載のように、各卵管１：　１０−１５個のマ イクロインジェクトした卵を移す。 Ｅ、Ｉ−ランスジェニックマウスの同定生後３週間で採取した尾の生検（２ｃｍ ）でトランスジェニック動物を同定した。生検を０．５％ＳＤＳ、Ｏ，ＬＭ　Ｅ ＤＴＡ及び２００μｇプロテイナーゼＫを含有する５０ｍＭトリス（ＰＨ８，０ ）１ｍｌ中、５５℃で一晩、インキュベートした。ゲノムＤＮＡを、フェノール ／クロロホルム抽出によりホモジエネートから精製した。各サンプルから約１０ ｍｇのＤＮＡをＢａｍＨＩで消化し、０，８％アガロースゲルで分画し、ラド形 成は、５０％ホルムアミド中、４２℃で、ランダムプライマー処理の（＋＊ｅｄ ｏｍ　ｐ＋ｉｍｔｄ）　Ｄ　Ｎ　Ａ標識キット（ｌｌＢＩＢｉＢｅ＋Ｍ■ｂｅｉ ｍ　）を使用して、３２Ｐ−ＣＴＰ標識したプラスミドｐ５９８の挿入物から作 製したプローブを使用して実施した。濾紙を６０℃で、１％ＳＤＳを含有する０ 、２ｘＳＳＣで洗い、＝８０℃でＫｏｄｔｋ　ＷＡＲ−５フイルムに露光した（ 第４図）。レーンはトランスジェニック動物＃９から＃２３のＤＮＡの分析であ り、ブランク（１つ）＃２５及び＃２６に続く。 実施例１７ 乳腺での発現の分析 Ａ、乳汁の収集と分画 乳汁は分娩後１０−１２日目の授乳中のトランスジェニックマウスから収集した 。子供から離した３時間後に、母親に０゜３１Ｕのオキシトシン（Ｓｉ（１）を 腹腔内注入した。１０分後に乳腺を穏やかにマツサージして乳汁を収集し、キャ ピラリーに取った（Ｃ１ｅｒｋ　ｅｌ　ｔｌ、、１９８７．　Ｔ「ｅａｄｓ　Ｂ ｉｏｌｔｃｈｎｏｌｏｇ！　５：２Ｇ−２４）。乳汁のサンプルを２ｍＭのＰＭ Ｓ　Ｆ及びＡｐｒｏｌｉｎ口（ＳｉＨ＋＋＊　）を含む水で１：５に希釈し、遠 心分離して脱脂した。 乳漿を調製するために、先ず、ＩＭＨＣＩをｐＨ４，５となるまで加えて、カゼ インを沈澱させた。次に、乳漿蛋白質を１０％トリクロロ酢酸（Ｔ　ＣＡ）で沈 澱させ、アセトンで洗い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ） サンプルバッファに溶かした。 Ｂ、乳汁蛋白質の分析 乳汁蛋白質をヒツジＢＬＧまたはＨ３Ａの存在について分析／（トランスジェニ ック株＃３０．３５．３７．３８．３９．４０及び４１）からの乳汁分泌中のＧ ｏまたはＧ、の雌から乳汁を収集し、１：５に希釈し、脱脂した。この乳汁を、 ウサギ抗つシＢＬＧ抗体及び沃素化したブロムンＡを使用するイムノドツトプロ ットにより、ヒツジＢＬＧの存在について分析した（第５図）。乳汁のサンプル を得たトランスジェニック株の番号と、ニトロセルロースフィルターにスポット した物質の量が示されている。Ｃは対照マウスの乳汁を示す。Ｓはヒツジの乳汁 ｌのサンプルを示す。ＢＬＧは精製したＢＬＧ蛋白質を示す。７つのトランスジ ェニック系は全て、乳汁中にヒツジＢＬＧを発現した（第５Ａ図及び第１表）。 約１．０ｍｇ／ｍｌ　（系＃３７及び＃４１）から約８．５ｍｇ／ｍ＋　（系＃ ３０．３５及び３９）の発現レベルは、ＢＬＧ標準と比較し、希釈率について補 正したイムノドツトプロット信号の強度から算定した。予期したように、通常Ｂ ＬＧを含まない対照マウスの乳汁では信号は認められなかった。ＢＬＧ転写単位 に隣接する５′配列を長くすることによりＢＬＧの発現のレベルが上昇するかを 測定するために、約５．５ｋｂのこの領域を持つベクターｐ６４４からトランス ジェニックマウスを作製した。得られた２っのトランスジェニック系４６及び４ ８からの乳汁サンプルを分析し、ベクターｐ５８５から作製したトランスジェニ ック動物から得たものと同じ範囲内のレベルでＢＬＧを発現することが判った。 従って、調節配列を含む５′フランキング領域を３ｋｂ　（ｐ５８５）から５． ５ｋｂ　（ｐ６４４）または１０．８ｋ　ｂ　（ｐ　６４６）に長くしてもＢＬ Ｇ発現のレベルは上昇しないようであった。 ＢＬＧを検出するために、乳漿サンプルを１５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル で分画した。蛋白質はクマシーブリリアントブルーで染色するか、Ｂｉｏ　Ｒｚ ’ｄ　トランスプロットセル（Ｂｉ。 Ｒｅｄ　）中のニトロセルロースフィルターに移した。フィルターを２％牛血清 アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ、　５ｉｌｓ＊　）を含有するＴＢＳ（２０ｍＭトリス ／１００ｍＭ　ＮａＣ１）でブロックし、次にウサギ抗ＢＬＧ抗血清（Ｎｏ＋ｄ ｉｅ　ｌｓｓ＊ａｏｌｏｆｉｃｔｌ　Ｌｌｂｏｒｓｌｏｒｉｅｒ、　Ｃｓｐ口１ ＋＊ａｏｊｅｇｅｈ、　Ｃ＾）と２時間反応させた。複合体をヤギ抗ウサギＩ　 ｇ　Ｇ　（Ｂｉｏ　Ｍａｋｅ「、Ｎｅｔ　２ｉｏｎｔ　ｌｓ＋ｔｅｌ　）　、次 にウサギペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ（ＰＡＰＳＢｉ。 ＭＩｋｏ＋　）と共にインキュベートした。基質としてジアミノベンチジンを使 用してペルオキシダーゼ活性を明らかにした。あるいは、ヒツジＢＬＧは１２５ 　Ｉ−プロテ；ンＡを使用し、次に抗ＢＬＧ抗血清と共にインキュベートして検 出した。 ２つの最も高い発現を示す系（３０及び３５）から得た乳汁の乳漿画分をさらに ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）及び抗ＢＬＧ抗血 清を使用するイムノプロットで分析した。約１８ｋｄの免疫反応性バンドは、精 製したウシＢＬＧ及びヒツジ乳汁中の生来のＢＬＧと共に移動することが明らか となり（第５Ｂ図）、トランスジェニック系の乳汁中で真正ＢＬＧが発現される ことが判った。５Ｂ図に示すゲルに載せた物質の量（ｍｇまたはｍｌ）を、乳汁 サンプルを得た株番号と共に示す。Ｃは対照マウスの乳汁を示している。Ｓはヒ ツジの乳汁のサンプルを示している。ＢＬＧは精製したＢＬＧ蛋白質を示してい る。これらの結果は、３ｋｂの５′フランキング配列を持つ基本的なトランスジ ェニックベクターはトランスジェニクマウスの乳腺で蛋白質を高レベルに発現さ せるのに十分な情報を含んでいることを示した。結果のまとめを第２表に示す。 第２表 、　＄零 ”ｍｇ／ｍｌ、Ｏ，００１ｍｇ／ｍ１未満；”ＵＤ”は０．００１ｍｇ／ｍｌ未 滴を意味する。 “測定せず”は、トランスジェニック動物が得られたが、乳汁中のＨ３Ａの存在 は測定していないことを意味する。 “低レベル“は、ドツトプロットによる予備評価がトランスジェニック動物の乳 汁中にＨ８Ａが存在することを示唆したことを意味する。次の乳汁中のＨ３Ａの レベルの定量は０．００１ｍ　ｇ　／　ｍ　１以上のレベルで検出可能と考える ことによる。 ＩＳＡは７．５％ＳＤＳまたは生来のポリアクリルアミドゲルで分画した乳汁サ ンプルで検出された。蛋白質はクーマシーブルーで染色、またはニトロセル−ス フイルターに移した。フィルターは３７℃で３％ゼラチンでブロックし、次に室 温で一晩、沃素化した抗ｔ（ＳＡモノクローナル抗体と反応させた。 ０．５％のツウィーン（Ｔｖｅ＊＠ｌ　を含有するＴＢＳでよく洗った後、フィ ルターを一８０℃でＫｏｄｓｋ　ｌＡｌｌ−５フイルムに露光した。 乳汁中にＩＳＡを発現するトランスジェニックマウスを作製しようとする最初の 試みは、ベクターｐ５８５のＢＬＧ遺伝子の最初のエキソンの５゛　−非翻訳領 域にＨ３ＡｃＤＮＡを導入してベクターｐ５７５を得ることにより実施した（第 ２Ａ図）。 ベクターｐ５７５から得た８つのトランスジェニック系からの乳汁分泌中の雌の 乳汁を、沃素化した抗Ｈ３Ａモノクローナル抗体を使用するイムノドツトプロッ トにより、ＩＳＡの存在について分析した。８つの系のいずれも検出可能なレベ ルのヒト蛋白質を分泌しなかった（第１表及び第２表）。ＢＬＧベクターはそれ 自身のＢＬＧ遺伝子の発現を起すことはできるが、挿入されたＨ３ＡｃＤＮＡの 発現はサポートできないように思われた。従って、Ｈ３ＡｃＤＮＡの本来の部位 内に第一イントロンまたは第−及び第二イントロンを有するＨ３Ａミニ遺伝子に した（第２Ａ図）。ベクターｐ５９９はベクターｐ５７５と、Ｈ３Ａイントロン １の存在に関してのみ異なる。ベクターｐ６００もイントロン１を持つＩ（ＳＡ ミニ遺伝子を含むが、ＢＬＧ３’　−フランキング配列と共にポリアデニル化シ グナル及び部位を持つ非翻訳ＢＬＧエキソン７を維持しているにも関わらず、Ｂ ＬＧコーディング配列を欠いていた。イントロン１を含有するＨ３Ａミニ遺伝子 を有するベクターｐ５９８では、ＢＬＧコーディング配列、エキソン７及び３′ −フランキング配列が欠けており、５ｖ４０ポリアデニル化シグナル及び部位で 置換されていた。ベクターｐ６０７はＨ３Ａイントロン１及び２の両方を含むこ と以外ｐ６００と同様である。 イントロン１を持つＩＳＡ　ミニ遺伝子を有するベクター（ｐ５９９、ｐ６００ 、ｐ５９８）から得た全１６個のトランスジェニック系の内、１つ（ｐ　５９８ からの＃２３）だけが乳汁中に検出可能なレベルのＩＳＡを発現した（第６Ａ図 及び第２表）。最上列は、指示した量（ｎｇ）の工業的に精製されたＩ　Ｓ　Ａ 　（Ｓｉｇｎｌ）のスポットを表わしている。中間及び最下列は指示したトラン スジェニックマウス株、対照マウス（Ｃ）、ヒト乳汁（Ｈ）及びヒツジ乳汁（Ｓ ）からの乳汁サンプルのスポットを示す。イムノドツトプロットでＩＳＡ標準と その信号を比べて測定すると、系２３からの乳汁は約２．０００−３．０００μ ｇ／ｍｌのＩＳＡを含むと算定された（第６Ｂ図）。最上列は指示した量（ｎ　 ｇ）の精製Ｈ３Ａのスポットを示している。中間及び最下列は指示したトランス ジェニックマウス、対照マウスの乳汁（Ｃ）及びヒト乳汁（ＨＭ）からの指示し た量の乳汁サンプルのスポットを示す。明らかに、最初の２つのイントロンを持 つＨＳ　Ａ　Ｅ二遺伝子を含有する、ベクターｐｓｏ７から得た６つのトランス ジエｔツク’に＝の内４つは、１−３５μｇ／ｍｌの検出可能なレベルで、乳汁 中でＩＳＡを発現した（第１表）。インドロン１−６を有するＩ（ＳＡミニ遺伝 子を含有するベクターｐ６５２から得たいくつかのトランスジェニック株は乳汁 中でＴ（ＳＡを発現した。これらの株の１つは１．５ｍｇ／ｍ１発現し、別なも のでは６−７　ｍ　ｇ　／　ｍ　Ｉの発現が認められた。 ＳＶ４０またはＢＬＧポリポリ位を有する、同じＨ３Ａミニ遺伝子を含有する構 築物では同レベルのＨ３Ａ発現が支持された。 イムノドツトアッセイで同定した５つの発現ラインからの乳汁サンプルを５ＤＳ −ＰＡＧＥ及びイムノプロットにかけた（第６Ｃ図）。図中、ＨＳ　Ａは市販の ＩＳＡの分析を示している。ＨＭはヒトの乳汁を表わす。Ｈ３Ａ２３はトランス ジェニック株＃２３からの乳汁サンプルの分析を表わす。精製Ｈ８Ａ（６５ｋ　 ｄ）と共に移動する免疫活性なバンドがすべてのイムノドブト陽性ラインの乳汁 で検出された。オートラジオグラムのデンシオメトリーでは、イムノドツトプロ ットに基づくＩＳＡの定量算定値が確認された。マウスの乳汁は５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅゲルでヒト血清アルブミンと一緒に移動する内因性マウス血清アルブミンを大 量に含有している。しかし、免疫検出アッセイで示す（第７Ａ図及び第７Ｂ図） ように、抗Ｈ３Ａモノクローナル抗体はヒト蛋白質を特異的に検出するが、マウ スの蛋白質は検出しなかった。第７Ａ図及び第７Ｂ図では、ＨＭはヒトの乳汁を 、ＩＳＡは市販の精製Ｈ８Ａ（Ｓｉ＜■１）を、Ｃは対照のマウス乳汁を表わす 。ヒト及びマウスの蛋白質も生来別された。クーマシーブルーによる一般的な蛋 白質染色から判るように、発現ライン２３からの乳汁は明らかに、ヒト（低移動 産）及びマウス（高移動度）アルブミンを含んでいる（第７Ａ図）。生来のゲル 及びイムノプロット分析により、移動度の低いバンドはＩＳＡであると確認され た（第７Ｂ図）。発現のまとめは第２表に示す。 Ｃ，トランスジェニックマウスの種々の組織でのＨ８ＡＲＮＡの発現 Ｈ３ＡＲＮＡの発現の組織特異性を調べるために、乳汁分泌１０−１２日口のト ランスジェニックな雌のマウスの種々の組織から全ＲＮＡを単離した。トランス ジェニックな乳汁分泌中のマウスの種々の組織からの全ＲＮＡはＬｉＣ１／尿素 法で単離した。ＲＮＡ　（１０−１５ｍｇ）をＭＯＰＳ／ホルムアルデヒドアガ ロースゲルで分画し、ナイロンフィルター上にプロットし、供給業者のプロトコ ールに従って、ｐ　Ｓ　Ｋ　（Ｓｌ＋＠１Ｂｅｎｓ）プラスミドのＨＳ　Ａ　ｃ 　Ｄ　Ｎ　Ａを使用して、ＲＮＡ標識キット（ＢｅＣｈ＋ｉｎＢ＋　１１ｒｎｎ ｈ＊ｉｓ　）で合成した３２Ｐ−標識アンチセンスＲＮＡプローブとハブリッド 形成させた。Ｈ３Ａプローブは肝臓の内因性マウス血清アルブミンｍＲＮＡと交 差ハイブリッド形成する。 ベクターｐ５９８から得た、乳汁に大量のＩＳＡを含有するライン２３と、ベク ターｐ５９９から得た、乳汁には検出可能なＩＳＡは含まないライン１９で表わ されるようにＨ３ＡＲＮ八発現のへターンは２つ認められた（第８図）。Ｂは脳 を表わし；Ｈは心臓を表わし−には腎臓を表わし；Ｌは肝臓を表わし；Ｌｕは肺 を表わし；Ｍは乳腺を表わし；Ｓは肺臓を表わし；ＳＫは骨格筋を表わす。ライ ン２３では、トランスジーンの転写体が乳腺で明らかに検出され、骨格筋でもわ ずかに検出された。 オートラジオグラムに長時間霧光した後でも、調べた他の組織では検出可能な信 号は認められなかった。ＩＳＡ　Ｉ−ランスジー：／ＲＮＡは内因性のマウス血 清アルブミンｍＲＮＡ　（２０７０リボヌクレオチド）と比べややゆっくりと移 動した。このことは、ＩＳＡミニ遺伝子のキャップ部位から導入部位までのＢＬ Ｇエキソン１の非翻訳部分、スプライシングによりイントロン１配列を除去した ＩＳＡ転写ユニット、及びポリアデニル化部位の上流のＳＫ４０配列からなる約 ２２３０リボヌクレオチドという予測されたトランスジェニックｍＲＮＡの大き さと一致する。 ベクターｐ５７５を持つトランスジェニックラインの内の６つ（どの乳汁にもＩ ＳＡは含まれない）と同様にマウスライン１９ては、トランスジーン転写体は乳 腺で検出されなかった。 しかし、大量の転写体が腎臓で認められ、内因性のマウスアルブミンｍＲＮＡに 比べ高い移動性を持つことは、ＲＮＡがベクターｐ５９９及びｐ５７５から得ら れるようなＩＳＡ及びＢＬＧの両方からなるポリンストロン性（ｐｏ１７ｃｉ＋ ｌ＋ｏｎｉｃ）　ｍ　ＲＮ　Ａの予期された大きさく２７８３リボヌクレオチド ）より小さいことを示している。内因性のマウス血清アルブミンｍＲＮＡは対照 マウスの腎臓からも検出された。 Ｄ、ｉｎ　＋ｉｌ＊ハイブリッド形成 Ｓ＋＋＋ｏｏｎ、Ｄ、、ＬＴＯＩＩＩ、Ｇ、Ｌｉｇｈｔ、Ｌ、Ｌｉｎ、Ｖ、、Ｌ ＊ｓ■＋。 ＾、　Ｗｓｉｎｌ＋ｔｗｂ、Ｈ，＆　Ｂａｃｋｉｎｇｈ８ｓ、Ｍ、、１９８９． 　Ｎ＞ｆａｒｅ　３４１：３０３−３０７に記載のように、処女及び乳分秘中の トランスジェニックマウスと対照マウスの乳腺のパラフィン切片を使用して１ｎ ＋ｉ１ｍハイブリッド形成を実施した。使用したプローブは、Ｔ７ボリメラーゼ を使用してＨ３ＡｃＤＮＡから合成した３５Ｓ−ＵＴＰ標識アンチセンスＲＮＡ であった（第９図）。パネルＡはトランスジェニック株Ｈ３Ａ＃２３からの乳分 秘中の乳腺の切片を示している。腺胞（ｔｌマｃｏｌｉ）はｒＡＬＪと示す。パ ネルＢは暗視野照明下で見たＡと同じ切片を示す。パネルＣはトランスジェニッ クマウス株＃２３の処女の乳腺の切片を示す。パネルＤは同じ切片の暗視野での 観察である。管（ｄｗｃｌ）はｒＤｕＪで示す。パネルＥは対照の非トランスジ ェニックマウスの乳腺の切片である。パネルＦは暗視野照明下での同じ切片を示 す。 Ｅ、移植片研究 Ｐｉｌｌｉ■、ＣＷ、Ｓ＊＊１ｔｓｎ、　Ｌ、、　Ｔｏｐｐｔ＋、　Ｔ１．、　 ＆　Ｈｓｎａｉ！ｂ１ｓｓｅｎ、Ｌ　１９８８　Ｍｏ１．　Ｅａｄｏｃ＋１ｎｏ ｌ　２：　１０２７−１０３２に記載のように、処女及び乳分秘中のマウスの乳 腺の移植片培養（ｅｘｐｈｎｔ　ｅａｌｔａ＋ｓ＋）を実施した。簡単に述べる と、細かく切りきざんだ後、約１ｍｍ片を、血清を含まないＭ１９９培地中に浮 かべたレンズ紙上で培養した。ホルモン刺激するために、ウシのインシュリン（ ０，１または５μｇ／ｍ＋）、ハイドロコーチシン（０，１または５μｇ／ｍｌ ）及びヒツジラクチン（１または５μｇ／ｍｌ）を培地に加えた。ホルモンはす べてＳｉ（ｍｓ　（ＳＴ、Ｌｏｗｉ３ＭＯ）から購入した。培地を数日間集め、 次にＩＳＡまたは他の乳汁蛋白質の存在についてスクリーニングした（第１０図 ）。 ＩＳＡは工業的に精製したＩＳＡの信号を示す。Ｃは対照マウスの移植片を示す 。■はインスリンを示し、Ｐはプロラクチンを示し、Ｆはハイドロコーチシンを 示す。第一組のＩＰ、ＩＦＰ、ＩＦ及び■は低濃度でのホルモン処理を示し、第 二組は高濃度でのホルモン処理を示す。 実施例１８ トランスジェニックマウス及び対照マウスの乳腺中のＩＳＡ及びβ−カゼインの 免疫組織化学的検出 免疫組織化学的染色のために、乳腺を４℃で１６時間、４％バラホルムアルデヒ ドで固定した。固定した材料を７０−１００％のエタノール系列で脱水し、クロ ロホルム中で洗浄し、パラフィンに埋め込んだ。パラフィンミクロトームで切片 （５μＭ）を切り、３−アミノプロピルトリエトキシシラン処理したスライドに 固定した。固定した切片をキシレン中で脱パラフィし、ＰＢＳで洗い（５分）、 ０．３％Ｈ２Ｏ２を含む無水メタノール中で１０分間インキュベートして、内因 性ペルオキシダーゼ活性を阻害した。次に、切片をＰＢＳに５分間漬け、３％正 常ヤギ血清を含むＰＢＳ中で３０分間インキュベートした。 切片を順次、次の試薬と共にインキュベートした：　（１）１０００倍希釈した ウサギ抗ＨＳ　Ａ抗血清または１０００倍希釈したウサギ抗マウスβ−カゼイン 抗血清、または１０００倍希釈した正常ウサギ血清；　（２）１００倍希釈した ヤギ抗つサギＩｇＱ抗血清；　（３）５００倍希釈したウサギベルオキシダー　 −ｈ’　−抗ヘルオキシダーゼ（ＰＡＰ）複合体。各インキュベーション（４５ 分）及び全ての希釈物の調製は３％正常ヤギ血清及び３９石正常マウス血清中で 実施した。処理と処理の間にスライドをＰＢＳで３回（各５分間）洗った。最終 洗浄の後、ペルオキシダーゼ活性は、０．０５Ｍイミダゾール、０．０５％ジア ミノベンジジン−ＨＣｌ及び０．０１％１１２ｏ２を含む０、　０５Ｍ　ｈ　’ ）　７．−ＨＣｌ　（ｐＨ’ｙ、４）　ｔｌＮＩｉ食塩’Ｉｌｌ中ティンキュベ ートして明らかにした。切片を蒸留水で簡単に洗い、ヘマトキシリンで弱く逆染 色し、段々濃くなるエタノールで脱水し、キシレン中で清浄化し、カバーを載せ た。 第１１図１！、処女（Ａｌｃ）及び乳分秘中（ＢｌＤ）の（乳汁中にＩＳＡを発 現する）株＃２３トランスジェニックマウスの切片のＩＳＡ　（ＡＳＢ）及びカ ゼイン（Ｃ，Ｄ）免疫染色パターンを示している。処女のトランスジェニックマ ウスの乳腺カゼイン染色は管（ｄｗｃｌ＋ｌ　の内側の上皮細胞の管腔表面に集 まっており、対照の非トランスジェニック動物で認められるパターンと同じであ った（第１３図）が、Ｉ　Ｓ　Ａ染色は上皮細胞の先端部分に集中するだけでは なく、上皮細胞の細胞質にも見られる。乳分秘中の乳腺では、Ｉｆ　Ｓ　Ａとカ ゼインは上皮細胞の先端部分に共に局在する。 第１２図は、処女（Ａ％Ｃ）及び乳分秘中（ＢＳＤ）の（乳汁中にＩＳＡを発現 する）株＃６９トランスジェニックマウスの切片のＩＳＡ　（Ａ、Ｂ）及びカゼ イン（Ｃ，Ｄ）免疫染色パターンを示している。処女の乳腺では、ＩＳＡ及びカ ゼイン染色の両方とも上皮細胞の管腔表面で確認され、一方、乳分秘中の乳腺で は、この２つのパターンに大きな違いがある。一部の管では、細胞のほんの一部 のみがＩ　Ｓ　Ａ陽性であるが、カゼイン染色は均一で、全ての上皮細胞が染色 される。 第１３図は、処女（ＡＳＣ）及び乳分秘中（Ｂ、Ｄ）の対照マウスの切片のＩＳ Ａ　（Ａ、Ｂ）及びカゼイン（Ｃ，Ｄ）免疫染色パターンを示している。予期し た通り、抗Ｈ３Ａ抗血清では検出できない。カゼイン染色のパターンはトランス ジェニック株で認められるものと同様であった。 実施例１９ 乳汁にＩＳＡを発現するトランスジェニック株の交配によりいずれの親株よりも 高レベルにＩＳＡを発現するダブルトランスジェニック動物が得られる （ベクターｐ５９８から得られ、乳汁中でＩＳＡを２，５ｍ’ｇ／ｍ１発現する ）トランスジェニック株＃２３及び（ベクターｐ６５２から得られ、乳汁中でＩ 　Ｓ　Ａを１．５ｍｇ／ｍｌを発現する）トランスジェニック株＃６９を交配さ せると、両方のトランスジーンを持つダブルトランスジェニック株＃１０００が 得られた。上記のように実施したドツトプロット免疫分析による定量では、株＃ １０００の雌は４−５ｍｇ／ｍ！の濃度でＩＳＡを含む乳汁を産生することが示 された。 実施例２０ 乳腺移植片の培養及び分析 移植片は、本質的にはＴｏｐｐｓｔら（Ｍｓｌｈ、　Ｅｎ＋ｙｓｏ１．　３９． 　４４３−４５４、　１９７５）に記載のように、また以下の変更を行なって、 腹部及び胸部の乳腺から調製した。移植片は２５ｍＭのＨＥＰＥＳ。 Ｎ　ａ　ＨＣＯ３２、２ｇ　／リットル、ベニシリ：／２００，０００ＩＵ／リ ツトル、ストレプトマイシン２００ｍｇ／リットル及びネオマイシン１０ｍｇ／ リットルを含む培地１９９（ｐＨ７，２）に維持した。１−２ｍｍ　の１６−２ ０個の移植片を、指示した時間、種々の組合せの指示した濃度のインシュリン、 ハイドロコーチシン及びプロラクチンを含む培地２ｍｌを含む３５ｍｍの培養皿 に浮かした含浸レンズペーパー上でインキュベートした。培地は毎日交換した。 蛋白質をウェスタンイムノプロット分析または代謝標識で分析した。ウェスタン イムノプロット分析用には、集めた培地のアリコートを１０％ＴＣＡで沈澱させ 、エタノールとアセトンで洗った。ペレットを５ＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッフ ァに溶解し、７．５％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで分画した。蛋白質をクー マシーブルーで染色する、またはＢｉｏ−Ｒ＠ｄ　トランスプロットセル（Ｂｉ ｏ−Ｒｓｄ　）中のニトロセルロースフィルターに移した。フィルターを、３７ ℃で３時間、３％のゼラチンを含むＴＢＳ　（２０ｍＭトリス、ｐＨ７，５，５ ００ｍＭのＮａＣ１）でブロックし、次に、室温で一晩、沃素化した抗Ｈ３Ａモ ノクローナル抗体と反応させた。Ｑ　、５　Ｔｖｅｓｎを含有するＴＢＳでよく 洗った後、フィルターを一８０℃でＫｏｄｌＸ＾ト５フィルムに露光した。ＢＬ Ｇ検出のために、膜を抗ＢＬＧ抗体と反応させ、次に抗ウサギＩ　ｇ　Ｇ、　Ｉ ＩＩＩ＾マ１ｄｉｎ−アルカリ性ホスファターゼ接合体と反応させた。供給者の 指示に従って、複合体をＮ　Ｂ　Ｔ／　Ｂ　ＣＩ　Ｐ　（ＢｉＯ−ＭＩｋｏ＋　 Ｎｅ＋　Ｘｉｏ■Ｉｔ＋５ｅｌ）で染色した。ｄｓ　ａｓマＯ合成した蛋白質を 次のように代謝標識した。標識する３０分前に、培地をメチオニンを含まないＤ ＭＥ培地に交換した。次に、移植片を、１５０　ｕ　Ｃｉ　／　ｍ　１の３５［ Ｓ］−メチオニンを含むメチオニン不含有培地１ｍｌ中で４時間率インキュベー トした。集めた移植片を５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８，０）、５ｍＭＮａＣ＋、 ０．５％ＮｏｅｉｄｅｌＰ−４０（ＮＰ−４０１，３μｇ　／　ｍ　ＩのＰＭＳ 　Ｆ及び１％アプロチニンで抽出した。抽出後、溶解物（ｌｙ■ｌ＠ｔｌ　を１ ０．０００ｘｇで１０分間清澄にし、全蛋白質合成をＴＣＡ不溶性の放射能とし て測定した。各々０．５Ｘ１０　及び０．２５Ｘ１０’　ｃｐｍを含む移植片溶 解物または培地の両分（３００−５００μｌ）を）プロティンＡ−セフ７０−ス ＣＬ−４Ｂビーズ（Ｐｂ＊＋ｍ５ｃｉ＊　ＦｉｔｓＣｈ！ｍ１ｃｓｌ＋、　Ｕｐ ｐ＋＊ｌ暑、　Ｓ曹ｅｄｅ口）に３０分間、予め吸着させた。 免疫沈降は、ウサギ抗ヒト血清アルブミンポリクローナル抗体またはウサギ抗Ｂ ＬＧ抗血清（Ｎｏ＋ｄｉｃ　ｌｓｓｗａｏｌｏＨ，ＴｉＮｗｒＩ。 Ｔｈｅ　Ｎｅ１ｈｅ＋ｌ■＋ｌ＋　）を使用し、０℃で１−２時間実施し、次に ０℃で３０分間プロティンＡ−セファロースＣＬ−４Ｂビーズと結合させた。５ ０ｍＭ）リス塩酸（ｐＨ７，４）　、５００ｍＭ　ＮａＣ＋、５ｍＭ　ＥＤＴＡ 、０．５％ＮＰ−４０及び５％蔗糖でよく洗った後、ペレットをＮＰ−４０及び 蔗糖を含ッファに墾濁し、７．５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、に ｏｌｋ　ＷＡＲ−５フイルムに露光し、次にフルオログラフィーにかけた。 実施例２１ 処女、妊娠及び乳分秘中のマウスの乳腺でのＨ３ＡＳＢＬＧ及びβ−カゼインＲ ＮＡ及び蛋白質の発現乳腺でのＩＳＡ、ＢＬＧ及びβ−カゼインの各ＲＮＡの発 現を、処女（Ｖ）（８−１２週齢）、種々の妊娠口の妊娠（Ｐ）及び乳分秘中（ Ｌ）の動物からその発達を通して測定した。全ＲＮＡをＨ５Ａトランスジーンと 持つトランスジェニックマウス（株＃２３）、ヒツジの生来の全長ＢＬＧＩ−ラ ンスジーンを持つトランスジェニックマウス（株＃３５）及び対照の非トランス ジェニックマウスの乳腺から抽出した。ＲＮＡ（１０μｇ）を、対応の放射性標 識プローブを使用するノーザンプロット分析で分析した（第１４図）。株＃２３ の処女マウスは顕著な量のＨ３ＡｍＲＮＡを発現した。妊娠５日目ではやや高い レベルが認められた。しかし、１２日目には顕著な増加があり、この上昇は妊娠 １８日目まで続いた。この後者のレベルは乳分秘中に認められるより高かった。 対照的に、株＃３５では、ＢＬＧトランスジーンＲＮＡは妊娠１２日目にのみ蓄 積し始め、妊娠及び乳分秘中、この上昇は続いた。（株＃２３の乳分秘中のマウ スではβ−カゼインＲＮＡレベルの低下が認められたが、）トランスジェニック マウス及び対照マウスでの内因性β−カゼイン遺伝子からのＲＮＡの発現につい てＢＬＧトランスジーンと同様なパターンが認められた。株＃２３及び＃６９の 乳腺移植片からのＩＳＡ及び株＃３５の移植片からのＢＬＧの合成及び分泌は一 般にＲＮＡ発現のパターンと同じである（第１５図）。上記のように、ｄｅ　ｎ ｏｗｏで合成した蛋白質を移植の直後４時間率、代謝標識し、抗Ｈ８Ａ抗体で免 疫沈澱させ、分析した。しかし、株＃２３では、処女の移植片で合成されたＩＳ Ａのレベルは妊娠１８日目のマウスの移植片で認められたものと同様であり、処 女の移植片と妊娠５日目の移植片の間ではＩＳＡ合成及び分泌の劇的な減少が認 められた。乳分秘中のマウスからの移植片は妊娠１８日目のトランスジェニック マウスからのものと比べてＩＳＡの合成が少なく、ＲＮＡの発現に見られるパタ ーンと同じであった。処女のトランスジェニック動物の移植片ではＢＬＧ合成は 検出されなかった。妊娠１２日目に蓄積されたＢＬＧはＢ　ＬＧＲＮＡと同様で あった。 実施例２２ 処女のトランスジェニック動物の乳腺移植片（＠＊ｍ＋ｕＢ　ｅｔｐｌ暑ｎ＋ｓ ｌからのＨＳＡ及びＢＬＧの発現及び分泌のホルモンによる調節 長時間培養した処女マウスの乳腺移植片からのＨＳＡ及びＢＬＧの合成及び分泌 に対する種々の組合せのホルモンの作用を測定するために、ｄｅ　ｆｉｏｖｅ合 成した蛋白質を移植直後（ｄＯ）及び培１１５乳中（ｄ５）に代謝標識した。代 謝標識後、各サンプルから移植片の約半分を集め、残りの移植片に約１０００倍 過剰の冷たいメチオニンチェース（ｃｂｓ＋ｅ　）を含有する新しい培地１９９ を２ｍｌ加えた。集めた移植片及び培地は上記のように処理し、免疫沈降させた 。チェース２４時間後に残りの移植片を同様に処理した（各々、ｄｌ及びｄｅ） 。培地及び同じ組織重量となる溶解物のアリコートを５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びフル オログラフィーで分析した。結果を第１６図に示す。上部はトランスジェニック 株＃２３、下部はトランスジェニック株＃３５からの移植片の分析を示す。図の 記号は、−ホルモンなし、■　インシュリン；Ｐ　プロラクチン；Ｆ　ハイドロ コーチゾンである。 ホルモンの存在下または不在下で、第０日にＨＳＡは乳腺移植片から産生され、 分泌されたが、ＢＬＧは移植直後、いずれの条件下でも産生されなかった。イン シュリン及びプロラクチンが存在すると、５日間培養した移植片はＨＳＡを産生 じ、分泌し続けた。ハイドロコーチシンの作用は弱かった。インシュリンとプロ ラクチンを組み合わせると、ハイドロコーチシンがあってもなくても、冷チェー スの２４時間後では１日目より６日目でより高率となることから、発現されたＨ ＳＡに対して安定化作用を持つように思われた。ＢＬＧの産生と分泌は培養５日 目にのみ、インシュリン及びプロラクチンの存在下でのみ見られた。ハイドロコ ーチシンの作用は弱かった。本発明者らは、ＢＬＧ　ｌ−ランスジェニック及び 対照マウスでのβ−及びα１−カゼインの産生はＢＬＧＩ−ランスジェニック株 ＃３５におけるＢＬＧのホルモン調節パターンに従うことを発見した（データは 示さず）。これらの乳汁蛋白質はインシュリンとプロラクチンを組合せても誘導 された。しかし、第０８目に、ＨＳ　Ａ　ｈランスジェニック株＃２３の移植片 からカゼインの産生を認めた。 実施例２３ 種々の株のトランスジェニックマウス間での処女の雌の乳汁中でのＩ　Ｓ　Ａの 発現レベルと乳腺移植片（ｓｕ＋５ｓｒｙ　ｅｘｐｌｎｌｓ）からのＩ　Ｓ　Ａ の発現及び分泌のレベルとの相関関係特定のトランスジェニック動物が究極的に 乳汁中にＨＳＡを発現するかを予測するために処女のトランスジェニックマウス の雌の乳腺移植片からのＨ３Ａ発現レベルを使用できるかを決定するために、い くつかの移植培養パラメータを研究した。一連の実験で、いくつかのトランスジ ェニック株の乳汁中へのＨＳＡの１０マ１マ０分泌を最もよく反映する、移植片 からのＨ３Ａ産生を評価するための最適時点、培養条件及び手段を決定した。 第１７図は、多数のＢ　Ｌ　Ｇ／ＨＳ　Ａハイブリッド遺伝子トランスジェニッ クマウス間の乳汁に分泌されたＨＳＡのウェスタン免疫分析を示している。脱脂 し、（５倍）希釈した乳汁サンプル３μｍをＳＤＳ　ＰＡＧＥで分析した。上記 のように、蛋白質をニトロセルロース膜上にプロットし、沃素化した抗Ｈ３Ａモ ノクローナル抗体と反応させた。各乳汁中のＨＳＡの相対レベルを相対デンシト メトリースキャンユニットで評価した。第片を、移植直後またはインシュリン（ ５μｇ　／　ｍ　Ｉ　）及びプロラクチン（５μｇ　／　ｍ　Ｉ　）を含むＭ１ ９９培地で５日間培養したときに、代謝標識した移植実験の結果を示している。 移植片の溶解物及び培地を、３−４匹の処女動物からの移植片を含む２組のプレ ートから集めた。培地または溶解物からの等量の全ＴＣＡ沈澱可能な蛋白質（ｃ ｐｍ）（Ａ）、または等しい組織重量を表わす量の培地または溶解物（Ｂ）を、 前記のような抗Ｈ３Ａ抗体による免疫沈降、５ＤＳ−ＰＡＧＥ、フルオログラフ ィ及びオートラジオグラフのデンシトメトリーによるスキャンニングで分析した 。ＨＳＡのレベルは相対的なデンシトメトリースキャンユニットで表わした。 乳汁中のＨ３Ａ分泌と移植片からの発現レベルの相関（ｒ値）を第３表にまとめ る。この表から、培養０日目または５日目には、乳汁へのＩＳＡ分泌と移植片中 でのＨ３Ａ合成及び分泌の間には比較的高い相関関係があることが判る。乳汁中 にＨＳＡを分泌しないマウス株からの乳腺移植片も移植片からＨＳＡを産生ぜず 、分泌しない。乳汁中に高レベルでＨＳＡを分泌する移植片は培養中にＨＳＡを 産生ずる。テストした条件のいずれも高い相関関係を生み出すように思われるが 、この研究の最良のパラメータはインシュリン及びプロラクチン（各５μｇ／ｍ ｌ）の存在下で、５日間、トランスジェニック動物からの移植片を培養し、等量 のＴＣＡ沈澱可能な蛋白質を基に培地に分泌された３５Ｓ−標識したＨ３Ａレベ ルを測定し、比較することである。第１９図はこれらの条件下での発現のレベル を比較するグラフを示している。 これらのデータは、この種の移植片発現分析を処女のトラン・スジェニックな家 畜の乳腺の生検に使用して、その動物がトランスジーン蛋白質を発現する力を予 測し、またその後、乳分泌に際して乳汁中に発現するレベルを評価することがで きることを示唆している。 第３表 処女動物１の乳腺移植片（１…Ｂ　ｅｘ山ｎｌ＋ｌｌこよる乳汁へのＨ８Ａ発現 と合成及び分泌との間の相関（ｒ値）１　トランスジェニック株＃７６．８１． ８６．９２．６９．８３．２３及び１０００を評価した。 ２培地または溶解物中で測定した移植片によるＨ３Ａ発現。 ３分析のときの移植片の培養日数。 ４相関（ｒ値）はＳｉ１ｍＩｐｌｅｌソフトウェアを使用して測定した。 実施例２４ トランスジェニックヤギの製造 Ａ、超排卵（＋ａｐｅ＋ｏｖｕｌｔｌｉｏｎｌの誘導フルオロジェストンアセテ ート（Ｃｈｒｏｏｏ−Ｇｅ＋ｆ、Ｉｌ！＋ｙｔｌ　Ｉｎ１＋＋ｎｔｌｉｏｎｔｌ 　Ｂ、　’ｉ、−Ｂｏｘｍｅｓ＋−Ｌ１１ｎｄ）　３０　ｍ　ｇを含浸した膣内 スポンジで１２日間処理することにより超排卵を誘導した５ｓｓｎｌヤギから胚 を回収した。スポンジ挿入後９ロ目の夕方から、卵胞刺激ホルモ＞　（ＦＳＨ− Ｐ、５ｅｈｅ＋ｉ＋Ｂ　ＣａＩｐ、　）を１２時間毎に５回筋肉内注射して投与 した（ＦＳＨ−Ｐは５．４．３．３、及び２ｍｇ）。１１日目の夕方、最後のＦ ＳＨ注射を投与したときに、スポンジを取り出した。スポンジを取り出した後１ ２時間後から４−１２時間毎に発情を調べた。スポンジを取り出した２０及び３ ６時間後に２匹の雄と交尾させた。スポンジを取り出した約６２時間後に１−２ 細胞卵を集めた。レシピエンドは膣内スポンジで同様に同調させる。１１日目の 夕方、スポンジを取り出し、レシピエンドにＰＭＳＧ　［１ｎｌｔｒマｅｌ）５ ００単位を注射する。 Ｂ１手術 手術の３６時間前に食事を、１２時間前には水を止める。麻酔はナトリウムチオ ベントンの静注で導入し、酸素（１−２リットル／分）とハロセン（１−２％） 　（Ｈ＊ｌｏｃ＊＋ｂｏｎ　Ｌ畠ｂｏｎｊｏｔｉ＠＋、　Ｎ、＾−１ｓｌＩ、　 ＳＣ）の混合物で維持する。生殖管を正中線切開で露出し、ガラスのカテーテル を卵巣采を通して卵管に挿入する。５％ＦＣ８含有のＰＢＳ５ｍｌを先の平滑な １８ゲージの針を通して子宮内腔に導入し、子宮卵管接合部を介して、卵管に沿 って入れる。 Ｃ，マイクロインジェクション ２０％ＦＣ３含有卵培養培地（Ｆｌｏｗ　Ｌ＊ｔ＋ｓｄ、Ｉ＋ｔｉｓＨ，５ｃｏ ｕ１ｆｉｄ）を満たし、Ｆｌａ＋１ｎｅｌ　Ｔｏ　（Ｓｉｄｍｓ　）で覆った容 器内に入れた１または２細胞卵の前核にＤＮＡ　（１−４ｕ　ｇ／ｍ　ｌ）を、 注射する。４００倍のＮｏ＊ｓｒ＋ｋｉレンズを装備したＮｉｋｏＩＩＤｉｍｐ ｌｅｓｔ逆位顕微鏡（ｉｎｖＣ目！ｄ　ｓｉｃ＋ｏｓｅｏＨ）を使用して前核を 可視化する。本質的にＨｏＨｎら（Ｍ＊ｏｉｐ＊Ｉｓ口ｎ（ｔｈｅ　ｓｏｗｔ＠ ｅｍｂ「ｙｏ−ｔｌｔｂｏｒｔｌｏｒ７　ｍｗｗｔｌ、　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉＢ 　Ｈａｒｂｏｒ　ＬＩｂｏ口１ｏＢ、　１９８６　）に記載のように卵にマイク ロインジェクションする。５ｏｅｏ＋ｅｘ１−５μｍマイクロピペットを使用し て、生存する胚を外科的にレシピエンドの卵管に移す。各レシピエンドにつき、 １０個までの胚を移す。 実施例２５ 流産したトランスジェニックヤギの嬰児と死亡したトランスジェニックヤギ新生 児の乳腺の移植片からのＨ３Ａ３Ａ２匹の雌のトランスジェニックヤギを作製し た、しかし、１匹（ヤギ＃１）は出産予定日の約１−２週間前に、自発的に、未 熟な状態で流産され、その約２４時間後に発見された。発見後、４℃に保存した 。臨床試験から、母胎がＱ熱（胎盤に損傷を与えるが、胎児には影響せず、自然 流産を起すリケッチャによる疾患）にかかっていたことが判った。ヤギ＃２も出 産予定日の約１週間前に自然に、未熟な状態で流産されたが、約２４時間生存し 、その後に判らない理由で死亡した。これも４℃で保存した。その母胎は病気で はないようである。ヤギ＃１が発見された及びヤギ＃２が死亡した２−３時間後 、乳腺組織のサンプルをＭ１９９培地を満たした小さな容器に取り出した。サン プルを小さな片（移植片）に切断し、これを、各５μｇ／ｍ１のインシュリン（ ■）、ハイドロコーチシン（Ｆ）及びプロラクチン（Ｐ）の不在下及び存在下で 、培地２ｍｌを含む３５ｍｍの組織培養フラスコ内の含浸レンズペーパー上でイ ンキュベートした。培地は２４時間毎に交換し、収集し、−７０℃で保存した。 アリコート（３００μｌ）を凍結乾燥し、サンプルバッファに溶かし、５ＤＳ− ＰＡＧＥゲルで分析した。蛋白質をウェスタンイムノアッセイ用ニトロセルロー ス膜にプロット（第２０Ａ図）、またはクーマシーブリリアントブルーで染色し た（第２０Ｂ図）。ニトロセルロース膜をＴＢＳバッファ（１０ｍＭ　トリス、 ５００ｍＭ　ＮａＣ１）中の３％ゼラチンでブロックし、ゼラチン１％とＴｗｅ ＊烏２０　０．　２％を含むＴＢＳ／（ソファ中で沃素化した抗Ｈ３Ａモノクロ ーナル抗体と一晩ハイブリッド形成させた。膜を同じバッファで洗い、−７０℃ でＫＡＩＩフィルムに霧光した。 第２０図は、ＩＦＰの存在下で、培養の最初の２４時間の間に、同じ大きさの精 製ＩＳＡの免疫反応性蛋白質がヤギ＃１の移植片から分泌されたことを示してい る。インキュイー９３２３日目までに、Ｈ３Ａは検出レベルまたはそれ以下に低 下した。 ＢＬＧ／ＩＳＡトランスジェニックマウスの乳腺移植片も培養の最初の２４時間 に高レベルのＨ３Ａを発現するが、これは培養時間と共に非常に低下することも 発見した。β−ラクトグロブリンはＩＦＰの存在下で培養の初日から移植片の培 地中に発現されるようであるが、ヤギ＃１の移植片からのカゼインの分泌は検出 できなかった（第２０Ｂ図）。 ヤギ＃２からの乳腺移植片は培養初日または翌日に検出可能な！ノベルのＨ３Ａ は分泌しなかった（第２０Ｂ図）。２つの別な乳汁蛋白質の痕跡は検出されなか ったが、蛋白質を載せ過ぎたための非特異的７％イブリッド形成を表わしている 可能性がある。β−ラクトグロブリンが培養初日からヤギ＃１の移植片の培地中 に検出されたが、ヤギ＃２の移植片では、培養６乳中ま本発明の実施に有用な株 の寄託 ブダペスト条約に従って、以下の株の生物学的に純粋な培養物は＾−＊＋ｉｃｇ ｎ　Ｔ７ｐｅ　Ｃａｌｔｗ＋ｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、１２３Ｇ＋、Ｐ＊＋ｋ ｌｓｖｒｌＤ「ｉｙｅ、　Ｒｏｃｋｙｉｌｌｅ、　ＭＩＢｌｔｎｄに寄託した。 生存性試験に合格した後、表示の受託番号がつけられ、必要な費用を支払った。 特許出願の係属期間内に、３７Ｃ，Ｆ、Ｒ，６１゜１４及び３５Ｕ、Ｓ、Ｃ，＠ １２２の下に米国特許商標庁長官が認めたもの、またはブダペスト条約下に基づ いて要求された場合に、この培養物を利用することができる。前記培養物を公衆 が使用できることに関する制約はすべて、出願に基づく特許の取得に際して取り 除かれ、これは変更不能であり、前記培養物は最も最近のサンプル供給要求後少 なくとも５年間、いずれの場合にも寄託日の少なくとも３０年後まで永続的に利 用できる。培養物が生存不能になったり、不注意にも破壊された場合には、同じ 系統の生存可能な培養物と交換されるだろう。 株／プラスミド　ＡＴＣＣ番号　寄託日ｐ６５２．２　６８６５３　１９９１年 ７月２５日ｐ６９６．９　６８６５４　１９９１年７月２５日当業者は、本発明 がその目的を実施し、上記及び固有の目的と利点を達成するためによく適用でき ることを容易に理解するであろう。本明細書に示したペプチド、抗体、方法、手 順及び手法は好適実施態様の代表例として例示のために示したものであり、本発 明の範囲を限定する意図のものではない。本発明の慶便・ −１１１４または添付の請求の範囲に含まれる変更及び他の用途は当業者には判 るであろう。 配列表 （１）一般情報１ （１）出願人：　Ｈａ＋ｖｉｌ＋、　Ｄｔｖｉｄ　Ｒ％゛Ｎ５ｌｈｔｎ、　Ｍ＊ ｔｌｔｅｌ：　Ｓｈ＊＊ｉ。 Ｍｏ＋ｈｅ （１、発明の名所・蛋白質のトランスジェニック生産（ｉｉｉ　）配列の数：１ （ｉｔ）連絡先 （Ａ）宛名：　Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｗｌｅｎｃ　Ｒｏ＋ｅ＋、Ｉｎｃ（Ｂ）ストリ ート名：　５００　ＹｉＢｉｎ目＾ｗｅ、、Ｂｌｄｌ、３Ａ（Ｃ）車名：　Ｆｌ 、　Ｗ１＋ｈｉＢｆｏ韮（Ｄ）州名　Ｐ＋ｎｎ＋７１ｗｔｎ日 （Ｅ）国名・ＵＳＡ （Ｆ）郵便番号＋　１９ｆ１３４ （Ｖ）コンピュータ読取り可能形式 （Ａ）媒体の型２フロツピーデイスク （Ｂ）コンピュータ、ＩＢＭ　ＰＣ互換性（Ｃ）　操作システム：　ＰＣ−ＤＯ ８／ＭＳ−ＤＯ３（Ｄ）　ソ７　トウエフ　：　Ｐ＊１ｅｉｌＮ　Ｒｅ田■＃１ ．Ｏ，ｗｅ＋５ｉｏｉ＃　１．２５ （マ１）現出願データ： （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （Ｖｉ）弁護士／弁理士の情報： （Ａ）氏名：　Ｇ＋＋ｏｄｍ■、Ｒｏ■ｅａｅ（Ｂ）登録番号：５２，５３４ （Ｃ）＃照／事件番号ｒ　Ａｌ１８５６−１１５（Ａ）　ｌ１話：　（２１５１ ９６２−４１３０（Ｂ）　テＬ／７７ツクス：　（２１５１９６２−４１０７（ ２）配列番号：１ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・１９５５７塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー、直鎖状 （１１）配列の種類　ＤＮＡ　（ゲノム）（ｉｉｉ　）ハイボセティカル：ＮＯ （ロ）アンチセンス６ＮＯ （Ｘ）文献の情報 （Ａ）著者：　Ｍｉｎｇｈｅ口ｉ、ＰＰＲｗｌ１１１２＋、　Ｄ　Ｅ Ｋｉ＊Ｂ、　Ｗ、−１゜ Ｄｅｎｎ目ｏｎｌＯＥ Ｈｓｗｋｉｎ＋、　Ｉ　１ Ｂｓｔｔｌｉｅ、　Ｎ　Ｇ ＤＢＩｉ＋Ｂｋ、＾ （Ｂ）表題・ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ５ＴＲＩＩＣＴＵＲＥ　ＯＦ　Ｔ）ＩＥ　Ｈｔ ｌＭＡＮ　ＡＬＢ［１ＭＩＮＧＥｌｉＥ　Ｉｓ　ＲＥＶＥＡＬＥＩＩ　Ｎ　１ｌ ＵｃＬＥＯＴｌ［ｌＥ　５ＥＱｔｌＥｌｌＣＥＷＩＴ）ＩＩＮ　Ｑｌｌ−２２０ Ｆ　Ｃ）ＩＲＯＭＯ３ＯＭＥ　４（Ｃ）雑誌名：　Ｉ、　１ｉ６１．　Ｃｈｔｔ （Ｄ）巻：２６１ （Ｇ）日付：　１９’８６ （Ｋ）配列番号１の関連残基：１から１９００２（！１）配列： ＴｃＡＧＴＡＧＡＡＡ　ＭＡＴＡＡＴＡＣＴ　−ｍＡ７１’ＣＴ　ｅｃＴｃＴ　 Ａ簡ｔＣＡ’ｌｌＧ　ＡＧＧＡＡＡ’ｌ？１１Ｇ　１０８０ＡＣＴＡｅ　ＴＫ； ＡＣＴ１１？、入ＣＴ　ＧＡＧ’ＩＴＡＴＴｒＡ　ＡＴ！！ＡＷＴＡＡＡ　ＡＴ ＡＡＣＴ３ＧＣＴ　ＴＡにＴＡＣ？’Ａ`Ｔ　１１４０ ’ｒｃ’＋−τλυｆｆ　ＣＡＧＡＡＧＡＡＡＴ　ＡＡＴＩ℃ＭＣＡＴ　ＣＡ” １ｌＣＣｊｌ’ＧＡＧＴ　’ｒＴｒＴＣ％ＴＡＧ　ＧＡＡ’■mＡＧＣ３０００ ＣＴＣ２λ、Ｕλｆｆ　ＴＣＨＡＣＡλλＴＣＡ　ＣＴＴＣＴＡＡＧＴＡ　ＣＡ ＴｒＣＴＡＡＴＴ　ＧＴＧＧＡＧＷｍ：　ＴＴｆＺ’ｆ’ＸbＴＧＴ　４８００ ＣｆｆｌＡ　ＧＡＣＡＡＡＴＴＡＴ　ＧＣＡＣＡＧ’Ｆｌ’ＣＣＡＡＣＴＣＴ１ １’ＣにＴ　ＣＡ１１ｔＣＣＴＡ’ｌＹ；　にＴＧＡＡＡｅ@６６６０ ７Ｔ０１１１ＧＣｋＴ　ＧＧＴｋλλτ入ＣＴ　Ｔ７ｒＡλＡＣλＴＡ　ＧＷ入 ＴＣＴ　ＴＴＡＴ入ＡＣＧＡＴ　ＧＴＡｊａＴＧＡＴλ　８S６０ ２ＡＴＡにＣＴＣＡＣＡＧＴＧＧＧ　ＴＴＣＡＧＡＴＴＧ’ｒ　ＣＴＴＣｅ　” ｒＴｃＧＴｃＴｃ：ＴＣＣＴＡＴＣ？ｒＣＡＡ　１０２６０ＴＣ’ｌＴ！’ＣＣ Ｃ’ｌｌＯＣＣＴＡ’１ＮＩＪπｃ７ズ１ＴＡｃｃＴＴｒ　！ＡＡ　ＣＣ’ｆＧ ！ＡＴＡＡ　ＡＴｒＡＣ（！ＡＴ　１０R２０ ＴＣＴｋｋＴＣＤＡ　ＴＣＴＡＧＴＣＴＡＴ　ＣＴＡＴＣＴＡＡ！ＴＣＴＡＴＧ ＣＡＡＴＧＡ　ＴＡＧＣＡλλＧＡＡ　ＧＴＡＴＡλＡＡＡf　１２０６ｉ０ 入入ＡＴＡＴＡＣＡに　ＴＣＴＣＡＣＡＣＡＧ　ＧＴＣＣＴＴｒＡＴＡ　Ｔ’ｒ ’ｒｌＸ；ＴＧλＡ入ＡＧＡＣＣ入ＧＡＡＧ　ＴＴＣＡＧＴ`ＴＡ入　１２１２ ０ 刊τＡＴＴＡＴＡＴ　ＧＣＡＡＧＧＣＡＣＴＧＴＴＴｋｋＴＴＩ℃Ａ−１ＧＣＴ ｒＡＣＣπ；ＧＴＩＩＴＡＣλＧＡ（χＭπ■テ　１３９２O 入ＴＣＡＧＡＴＣＡＧ　ＴＧＣＣＡ’ｌｌ’ＣＴＩ’！’　ＧＣＣＣＣ？ＡＴＴ Ｉ’　ＴＡＧＧＧ八ＴＡＡへ　ＧＡ？Ｉｌ’ＣＣＣ１；ＡＡ■sｃＴＧＧＡＧ入 ＴＧ　１３９８０ ＡＧＡＡＧＡＣＴＡ？　ＧＴＧＡＧＴｃ？！Ｔ　ＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴ　）ＡＴ ＪＩＡＡＴＴｋ）ｈ　ＴＡＡＴＧＡＡＡＡＡ　ＡＴｆｆｌＴ`ＣＣ！’Ｚ’　１ ５７２０ ’！ＭＡＴＡｆｆＡ　ＴＡＡＴＣＣＴＡＣｉＣ’ｆｆ１ＮｕＴＡＡＧｃ　ＡＧＡ ＡＧＧＡん；ＴＡＡ’１ｎＴＧＴＧ丁ｃ　ｅＴＧＴで　１５V８０ ン（℃ＣＣＡＡＧＧ　ＣＡＡＣＡＡＡＡＧＡα：ＡＡＣ”ＩＮＩ；ＡＡＡ　５Ａ ＴＧＧ　Ａ”ｌｌＯにｍズＸ：ｅＡ　１７５８０ＧλＧｋＡＣｍＣＴ　ＧＣλｅ 入ｃｃＡＴＡＡＧＧ入Ｇ　入Ｃｅ　ＣＣｅ入ＬＸＷ　入ｃＴ入Ｃ入０ＴＴｃ　、 １７ｇｔ。 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Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．類乳類遺伝子からの５′フランキング配列とヒト血清アルブミンをコードす る配列からなるＤＮＡ構築物であって、ヒト血清アルブミン配列がＨＳＡ蛋白質 をコードする天然の遺伝子中のイントロンの全部ではなく、少なくとも１つを含 むＤＮＡ構薬物。
2. ２．前記遺伝子がミルク蛋白質遺伝子である請求項１の構築物。
3. ３．天然のＨＳＡ遺伝子と同等以上のレベルで哺乳類細胞中でＨＳＡを発現する ように前記イントロンを選択した請求項１の構築物。
4. ４．イントロンを１−６、７−１４、１＋７−１４、１＋２＋１２−１４、２＋ ７−１４及び１＋２＋７−１４からなる群から選択する請求項３の遺伝構築物。
5. ５．ＨＳＡ遺伝子の最初の７個のイントロンのすべてではなく１つ及びＨＳＡ遺 伝子の最後の７個のイントロンの１つからなる、ＨＳＡをコードするＤＮＡ構築 物。
6. ６．ＨＳＡをコードする２つの隣接したエキソンとＨＳＡイントロンからなるＨ ＳＡをコードするＤＮＡ構築物。
7. ７．哺乳類組織特異性プロモーターに操作的に連結したヒト血清アルブミンをコ ードするＤＮＡ配列からなるＤＮＡ構薬物であって、前足ＤＮＡ構築物が乳分泌 中の雌のトランスジェニックの哺乳類の乳腺で発現されるＤＮＡ構築物。
8. ８．ゲノムに請求項７のＤＮＡを導入したトランスジェニックな哺乳類。
9. ９．哺乳類をマウス、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、プタ及びウシからなる群から選択 する請求項８のトランスジェニックな哺乳類。
10. １０．プロモーターがβ−ラクトグロブリン蛋白質プロモーターである請求項８ のトランスジェニックな哺乳類。
11. １１．哺乳類が、乳分泌中のマウスのミルク内で約１００μｇ／ｍｌミルク以上 のレベルで産生されるヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡ構築物をゲノムに 導入したマウスである請求項８のトランスジェニックな哺乳類。
12. １２．ヒト血清アルブミン及び哺乳組織特異性プロモーターをコードするＤＮＡ 構築物をゲノムに導入したトランスジェニックマウスを製造する方法であって、 乳分泌中の雌のトランスジェニックな哺乳類の乳腺で発現される前記ＤＮＡ構築 物がヒト血清アルブミンをコードするヌクレオチド配列に操作的に連結したβ− ラクトグロブリンプロモーターを含むＤＮＡ構築物を提供する方法。
13. １３．さらに、マウス、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、プタ及びウシからなる群から選 択した哺乳類の胚にＤＮＡ構築物をマイクロインジェクションすることからなる 請求項１２の方法。
14. １４．さらに、乳分泌中の雌のミルク中でのヒト血清アルブミンの産生について 動物を調べ、ミルク中にヒト血清アルブミンを最も多く含む動物を交配させるこ とからなる請求項１３の方法。