JPH10500003A - トランスジェニックフィブリノーゲン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒトもしくは他の組換えフィブリノーゲンタンパク質又はそのサブユニット鎖ポリペプチド又は改変フィブリノーゲンの異種遺伝子を動物の乳腺内に発現させ、発現産物を体液中に分泌させることができるトランスジェニック非ヒト動物、並びに該動物での組換えフィブリノーゲン、そのサブユニット鎖ポリペプチド、改変フィブリノーゲン及びフィブリノーゲン融合タンパク質の製造方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 トランスジェニックフィブリノーゲン 発明の背景 発明の分野 本発明は一般に、臨床学的に重要なタンパク質を治療有効量産生するためのト ランスジェニック動物の使用に関する。本発明は特に、臨床有効量の血液凝固タ ンパク質フィブリノーゲン（「ＦＩＢ」）のトランスジェニック動物での産生に 関する。従来技術の説明 血液凝固プロセスの最後の段階はトロンビン触媒によるＦＩＢ（Ｍｒ＝３４０ ，０００）からフィブリン（Ｍｒ＝３２９，０００）への変換であり、後者はフ ィブリン血餅を形成する。ＦＩＢの欠如は一般に常染色体性劣性特徴として遺伝 し、血漿に由来するＦＩＢの完全な又は部分的な欠如となって現れ得る。臨床学 的には、この疾病は中程度又は軽度の血友病に類似している。先天性フィブリノ ーゲン異常は、Ｖｌｉｓｓｉｎｇｅｎ、Ｉｊｍｕｉｄｅｎ及びＮｉｊｍｅｇｅｎ フィブリノーゲンでのように構造的又は機能的異常分子の遺伝性の合成によるも のであり得る。このタンパク質の後天性欠如は、例えば肝炎もしくは肝性壊 死でのようにタンパク質の肝合成の低下の結果として、又は例えば血液タンパク 分解活性の増加によってタンパク質の分解が加速されるために生じ得る。 このような患者での出血の抑制は現在、凍結したばかりのヒト血漿又はドナー 血液から単離したタンパク質の濃縮物中に含まれるＦＩＢを輸血することによっ て行われている。これらの置換治療は一般に効果的であるが、患者はウイルス伝 播性の疾病（例えば肝炎又はＡＩＤ）にかかる危険性がある。このようなウイル スを熱又は有機溶媒で不活化することによって上記の危険性は大幅に減少したが 、このような薬剤によって治療費は大幅に上昇した上、危険性がなくなったわけ ではない。従って、ヒト血漿にとって代わる該タンパク質源が絶対に必要である 。 臨床学的なＦＩＢ代替源の入手における重大な前進は、３種の異なるフィブリ ノーゲン鎖をコードするｃＤＮＡがクローニングされ、ｃＤＮＡ配列が公表され たことである。Ｒｉｘｏｎ等， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２２： ３２３７ （１９８３）；Ｃｈｕｎｇ等，同書３２４４；Ｃｈｕｎｇ等，同書３２５０。Ｆ ＩＢ分子の構造は非常に複雑である。各ＦＩＢ分子は、２組の、分子量がそれぞ れ６６ ｋＤａ、５２ｋＤａ及び４６．５ｋＤａの３種の異なるポリペプチド鎖Ａα、Ｂ β、Ｇγからなる。各組の鎖を含む半分子２つが３つのジスルフィド結合によっ て結合されている。更には、複雑な一連の鎖内及び鎖間ジスルフィド結合（計２ ９のジスルフィド結合があり、遊離スルフヒドリル基はない）が適切な官能構造 維持に関与する。その上、ＦＩＢは非常に特異的なグリコシル化を示す糖タンパ ク質である。この分子は、Ｂ、β、Ｇ及びγ鎖上に１つずつの４つの糖鎖を含み 、α及びＡ鎖は糖質を含んでいない。ＦＩＢの総分子量（３４０ｋＤａ）のうち 約１１ｋＤａは、翻訳後に分子に加えられたこの糖質によるものである。更には 、糖タンパク質のイソ型が糖鎖上のシアル酸の相違に対応することは公知である 。ＦＩＢの機能的活性のためには、適切な糖質改変が必要である。 機能的ＦＩＢ分子の特徴はこのように非常に複雑であるため、完全に形成され た機能的組換え分子の発現、アセンブリー及び分泌は予測がつかず、困難であっ た。ヒトＦＩＢ Ａα鎖をコードするｃＤＮＡが細菌中に発現されたが（Ｌｏｒ ｄ， ＤＮＡ ４：３３（１９８５））、糖質を担持する他のフィブリノーゲン 鎖を原核生物中で産生する ことはできないので、この有用性は限定される。 個々のＦＩＢ鎖がＣＯＳ１（形質転換したサル腎線維芽細胞）細胞内に発現さ れた。Ｄａｎｉｓｈｅｖｓｋｙ等，Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ａｃ ｔａ １０４８：２０２（１９９０）。更には、ＣＯＳ１細胞を、個々のヒトフ ィブリノーゲンサブユニット鎖をコードするｃＤＮＡの組み合わせでトランスフ ェクトしてホロタンパク質を産生することが報告されているが、産生量は少なく 、後述するトランスジェニック動物系で得られる産生量よりも実質的に少ない。 Ｒｏｙ等， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，２６６：４７５８（１９９１）。 天然組織又は遺伝子工学で作製された組織については、部分的に連結された（ａ ｓｓｅｍｂｌｅｄ）又は完全には連結されていない別個のヒトＦＩＢ(「ｈＦＩ Ｂ」)又は組換えヒトＦＩＢ(「ｒｈＦＩＢ」)鎖の分泌は報告されていない。Ｃ ｈｕｎｇ等，（１９８３）， Ｄａｎｉｓｈｅｖｓｋｙ等（１９９０）。更には 、ＦＩＢ産生のための哺乳動物細胞組織培養系の使用には重大な欠点がある。そ れには、増殖培地のコストが高く、上記系が労働集約的で、生産能力が限定され ることが含まれる。 臨床有効量の、感染性粒子非含有ｒｈＦＩＢタンパク質の効果的で比較的安価 な産生手段が現在でも強く必要とされている。本発明はこの必要性に適っている 。驚くべきことに、治療有効量のｒｈＦＩＢを産生して容易に採取できる体液中 に分泌することができる様なトランスジェニック動物を遺伝子工学的につくりだ せることが知見された。本発明のＦＩＢは、置換又は付加治療を含む治療用途の 他に、外科処置での「膠」、創傷への薬剤（例えば抗生物質又は駆虫薬）の送達 系、食品代用物及び乳の組成変化のような種々の用途に適用される。これらのト ランスジェニック系を以下で説明する。 発明の要約 本発明では、ヒトＦＩＢのＡα、Ｂβ、Ｇγポリペプチド鎖をコードし、かつ 新たに合成されたフィブリノーゲンが動物の体液区（特に乳）内に分泌されるよ うに乳腺細胞での生物学的に活性なｒｈＦＩＢの発現を調節配列及びシグナル配 列によって指令する、異種性、即ち外因性ポリヌクレオチドをゲノム内に安定的 に組み込んだ非ヒト哺乳動物を提供する。３種全ての異種ポリヌクレオチドより も少ない組み込みによって個々のフィブリノーゲン鎖を産生し て、分泌させることができる。宿主動物に投与する前に改変させた異種ポリヌク レオチドを組み込むことによって、改変ＦＩＢ及びその産物を生成することがで きる。 従って、ｒｈＦＩＢ、ＦＩＢのポリペプチドサブユニット鎖、及びＦＩＢ由来 のタンパク質やタンパク質産物を産生し得るトランスジェニック動物を提供する ことが本発明の目的である。 トランスジェニック動物で、ｒｈＦＩＢ、そのポリペプチドサブユニット、及 びＦＩＢ由来のタンパク質やタンパク質産物を産生する手段を提供することも本 発明の目的である。 本発明のこの特徴の好ましい実施態様によれば、泌乳するトランスジェニック 動物は、その乳腺内にｒｈＦＩＢ、ＦＩＢサブユニット、及びＦＩＢ由来のタン パク質を産生し、これらの産物を乳内に分泌する。 他の好ましい実施態様では、トランスジェニック動物は産生したｒｈＦＩＢ、 ＦＩＢサブユニット、及びＦＩＢ由来のタンパク質を血液及び／又は尿中に分泌 する。 図面の簡単な説明 図１はマウスＷＡＰ遺伝子の図である。 図２は〜２．６ｋｂｐのＷＡＰ ５’プロモーター領域と〜１.３ｋｂｐのＷ ＡＰ ３’ＵＴＲとフランキング３’領域とを含むプラスミドｐＵＣＷＡＰ４カ セットベクターの図である。 図３はｐＵＣＷＡＰ４のＷＡＰ断片を含み、Ｎｏｔ Ｉリンカーを加えたプラ スミドｐＵＣＷＡＰ５カセットベクターの図である。 図４はＦＩＢ Ａα １鎖をコードするポリヌクレオチドを組み込んだプラス ミドｐＵＣＷＡＰ５の図である。 図５はＦＩＢ Ｂβ １鎖をコードするポリヌクレオチドを組み込んだプラス ミドｐＵＣＷＡＰ５の図である。 図６はＦＩＢ Ｇγ １鎖をコードするポリヌクレオチドを組み込んだプラス ミドｐＵＣＷＡＰ５の図である。 図７はＦＩＢ遺伝子をコードするＤＮＡをゲノム内に組み込んだトランスジェ ニックマウスの系図を示す。 発明の詳細な説明 本出願人らは、遺伝子工学により、組換えヒトＦＩＢ(「ｒｈＦＩＢ」)、個々の サブユニット鎖ポリペプチド及び改変ＦＩＢサブユニット鎖を、正常タンパク質 の遺伝的又は後天的欠如を示すヒトの治療に適した量及び形態で、容易 に採取できる体液（例えば乳、血液及び尿）中に分泌する非ヒトトランスジェニ ック哺乳動物の産生手段を発見した。 本明細書の「動物」という用語はヒトを除く全ての哺乳動物を指す。この動物 は更に、胎芽期及び胎児期を含む全ての発達段階の個々の動物を含む。「トラン スジェニック」動物は、細胞下レベルでの慎重な遺伝子操作（例えばマイクロイ ンジェクション又は組み換えウイルス感染）によって直接的に又は間接的に受け 取った遺伝情報を保有する細胞を含んでいる全ての動物である。 本明細書中の「トランスジェニック」とは従来の交雑育種もｉｎ ｖｉｔｒｏ 受精も含まず、むしろ１個以上の細胞が組み換えＤＮＡ分子を受け取っている動 物を指す。この分子が動物の染色体内に組み込まれることが非常に好ましいが、 本発明では更に、酵母人工染色体内に作製され得るような染色体外で複製するＤ ＮＡ配列の使用をも企図する。 「生殖細胞系トランスジェニック動物」という用語は、遺伝情報を受け取り、 生殖系列細胞に導入され、従って情報伝達能力を子孫に付与するトランスジェニ ック動物を指す。このような子孫が実際にこの情報を幾らか又は全て保 有するならば、彼らもトランスジェニック動物である。 動物内に導入されるべき情報は、受容体が属する動物種とは異なる（即ち「異 種」である）ことが好ましいが、情報は特定の個々の受容体とだけ異なってもよ いし、既に受容体が保有する遺伝情報であってもよい。後者の場合、導入された 遺伝子は天然遺伝子とは発現が異なり得る。 本発明のトランスジェニック動物は、乳、血清及び尿を産生するヒト以外の全 ての動物であり得る。農場動物（ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ウサギ等） 、齧歯動物（例えばマウス）並びに飼育ペット（例えばネコ及びイヌ）が本発明 の範囲に包含される。 ポリヌクレオチドが成熟動物の生殖系列細胞のＤＮＡ内に安定的に組み込まれ て通常のメンデル様式で遺伝するように、ヒトＦＩＢ又はサブユニット鎖ポリペ プチド又はその改変産物をコードする適切なポリヌクレオチドを単細胞胚内に導 入することによって本発明のトランスジェニック動物を産生することが非常に好 ましい。 胚の顕微操作技術の進歩により、受精した哺乳動物卵子内に異種ＤＮＡを導入 することができる。例えば、マイクロインジェクション、リン酸カルシウムに媒 介された沈殿、 リポソーム融合、レトロウイルス感染又は他の手段により全能性又は多能性幹細 胞を形質転換させることができる。次いで、形質転換した細胞を胚内に導入し、 次いで胚を発生させてトランスジェニック動物とする。好ましい方法では、発生 中の胚に、所望のＤＮＡを含んでいるレトロウイルスを感染させ、この感染した 胚からトランスジェニック動物を産生する。しかしながら、最も好ましい方法で は、好ましくは単細胞期に、適切なＤＮＡを胚の前核又は細胞質内に一緒に注入 し、胚を発生させて成熟トランスジェニック動物とする。これらの技術はよく知 られている。例えば、異種ＤＮＡの哺乳動物受精卵内へのマイクロインジェクシ ョンのための標準的な実験室手順の文献には、Ｈｏｇａｎ等，Ｍａｎｉｐｕｌａ ｔｉｎｇ ｔｈｅ ＭｏｕｓｅＥｍｂｒｙｏ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａ ｒｂｏｒＰｒｅｓｓ， １９８６；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ等， Ｂｉｏ／Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ ９：（１９９１）；Ｐａｌｍｉｔｅｒ等， Ｃｅｌｌ， ４１： ３４３（１９８５）；Ｋｒａｅｍｅｒ等， Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａ ｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅａｒｌｙ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｅｍｂｒｙｏ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， １９８５；Ｈａｍｍｅｒ等， Ｎ ａｔｕｒｅ ， ３１５：６８０（１９８５）；Ｗａｇｎｅｒ等，Ｕ．Ｓ．５，１ ７５，３８５号；Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ等，Ｕ．Ｓ．５，１７５，３８４号が 含まれる。上記文献は全て、参考として本明細書の一部を構成するものとする。 ヒトＦＩＢ又はＦＩＢサブユニット遺伝子は、代替法（単離したｍＲＮＡ鋳型か らのｃＤＮＡの調製、直接合成又はこれらのある組み合わせを含む）によって、 適切なゲノム源（即ちこのタンパク質の産生のための天然器官であるヒト肝）か ら単離することによって得ることができる。個々のＦＩＢ鎖をコードするＣＤＮ Ａを適切な読み取り枠で、以下で詳述する適切な調節シグナルと融合させて遺伝 構築物を製造し、次いでこれを例えば慣用的な方法（参考として本明細書の一部 を構成するものとする、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎ ｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９８９を参照されたい）に基づく細菌ベク ター内での調製により増幅させる。その後、増幅した構築物をベクターから切り 出し、精製してトランスジェニック 動物の産生で使用する。精製は、１サイクル以上のアニオンＨＰＬＣで行うこと ができる。代替技術には、スクロース又はＮａＣｌ勾配での超遠心、ゲルエレク トロリューション（ｅｌｅｃｔｒｏｌｕｔｉｏｎ）に続くアガロース処理及びエ タノール沈殿、又は低圧クロマトグラフィーが含まれる。数サイクルのＨＰＬＣ で精製すると、マウス及びブタの両方で、形質転換頻度が約２０％以上と顕著に 高くなる。 本発明が、好ましくは、所望される又は天然のヒトＦＩＢを産生するＤＮＡ構 築物の使用を必要とするが、所望されるタンパク質を他のタンパク質を含む融合 タンパク質として産生してもよい。例えば、本発明の所望される組換えタンパク 質をより大きな組換えタンパク質の一部分として産生して所望されるタンパク質 を安定化させるか又は乳からの精製をより速くより簡単にすることができる。次 いで、融合パートナーを化学的又は酵素的に分離し、所望されるＦＩＢを分離す る。ＦＩＢとβ−ラクトグロブリン（ＢＬＧ）との融合産物の製造は以下で詳し く説明する。 天然分子と同一の配列を有するｒｈＦＩＢを産生してもよいし、ｒｈＦＩＢを 断片又は誘導体として産生してもよ い。クローン化したＤＮＡを上記参考文献に記載されているようなよく知られた ｉｎ ｖｉｔｒｏ突然変異誘発技術を用いて改変することにより、種々の改変ｒ ｈＦＩＢ又はそのサブユニットを産生することができる。 ヒトＦＩＢの遺伝子を含むトランスジェニック動物の産生は、ｈＦＩＢのα、 β及びγ鎖をコードするｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを使用することからなる（Ｒ ｉｘｏｎ等，１９８３，上掲；Ｃｈｕｎｇ等， １９８３，上掲）。各鎖の全長 塩基配列は、参考として本明細書の一部を構成するものとする上記文献に記載さ れている。 本発明で有用なＤＮＡ構築物は、当該タンパク質の乳腺特異的発現、３組のＦ ＩＢ鎖のうち２つ（Ｂβ及びＧγ）の翻訳後グリコシル化、乳又は他の体液中へ のＦＩＢの分泌、並びに全生物学的活性の発現に必要な全てのシス作用シグナル に作動可能に（ｏｐｅｒａｂｌｙ）結合したＦＩＢをコードする二本鎖ＤＮＡ配 列を提供する。上述のように、本発明で使用するのに適したＦＩＢ又はＦＩＢサ ブユニット鎖をコードするポリヌクレオチドは、既知のポリヌクレオチド配列を 始めとして標準的な技術によって単離され得る。 本発明では改変ＦＩＢ ＤＮＡ配列を使用することもできる。この状況で有用 な改変には、非制限的ではあるが、ＦＩＢの翻訳後改変（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓ ｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）、寸法もしくは活性部位を変 えるもの、又はこのタンパク質もしくはその一部を他のタンパク質に融合させる ものが含まれる。このような改変は、当業界でよく知られた技術により、例えば 重複オリゴヌクレオチドの連結により改変遺伝子を合成するか又は例えばオリゴ ヌクレオチドによって媒介された突然変異誘発によりクローン化遺伝子内に突然 変異を導入することによってタンパク質内に導入することができる。 本発明で有用なシス作用調節領域には、ＦＩＢ又はＦＩＢサブユニット鎖遺伝 子の発現を駆動するプロモーターが含まれる。乳腺細胞で特異的に活性を示し、 乳タンパク質に関与するプロモーターが非常に好ましい。このようなプロモータ ーの中では、ホエー酸性タンパク質(ｗｈｅｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ； ＷＡＰ)、短長α、β、κカゼイン、α−ラクトアルブミン並びにβ−ラク トグロブリン（「ＢＬＧ」）プロモーターが非常に好ましい。プロモーターは各 種乳のタンパク質組成に基づいて選択され 得る。 例えば、ＷＡＰ及びＢＬＧプロモーターはトランスジェニック齧歯動物、ブタ 及びヒツジで特に有用である。齧歯動物ＷＡＰ短長プロモーターを使用してラッ トＷＡＰ遺伝子、ヒトｔＰＡ遺伝子及びＣＤ４遺伝子を発現し、ヒツジＢＬＧプ ロモーターを使用してヒツジＢＬＧ遺伝子、ヒトα−１−抗トリプシン遺伝子及 びヒト因子IX遺伝子を発現した。文献としては、参考として本明細書の一部を構 成するものとする、Ｐａｌｅｙａｎｄａ等， Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｔｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ ， Ｈｏｙｅｒ等編， Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ， ＮＹ １９９１， １９ ７ページ；Ｃｌａｒｋ等， ＴＩＢＴＥＣＨ， ５：２０（１９８７）を参照さ れたい。本発明を実施するためのプロモーターの中では、齧歯動物カゼイン及び ＷＡＰプロモーター、並びにブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ（ブタ、ヒツジ、ヤギ、 ウシ、ウマ）、ウサギ、齧歯動物及び飼育ペット（イヌ及びネコ）に由来するカ ゼイン、α−ラクトアルブミン及びＢＬＧプロモーターが好ましい。これらのプ ロモーターの遺伝子は単離されて、その特徴は公表されてい る。文献としては、参考として本明細書の一部を構成するものとする、Ｃｌａｒ ｋ等， （１９８７），上掲及びＨｅｎｎｉｎｇｈａｕｓｅｎ， Ｐｒｏｔｅｉ ｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ，１：３（１９ ９０）を参照されたい。 プロモーターは、慣用の制限エンドヌクレアーゼ及びサブクローニングステッ プを実施することにより単離することができる。ＷＡＰシグナル配列のすぐ５’ の２．６ｋｂ ＥｃｏＲ１−Ｋｐｎ１断片(２.６ｋｂ ＥｃｏＲ１−Ｋｐｎ１ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙ５’ ｔｏ ｔｈｅ ＷＡＰ ｓｉ ｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ)として単離されたマウスＷＡＰプロモーターが好 ましいが、「長い」ＷＡＰプロモーター（マウスＷＡＰ遺伝子の５’ ４．２ｋ ｂ Ｓａｕ ３Ａ−Ｋｐｎ１プロモーター又はその断片）も本発明を実施するの に適している。 トランスジェニック動物の乳及び／又は他の体液中へのタンパク質の分泌を指 令する調節配列が本発明では重要である。この点に関しては、本発明では同種調 節配列及び異種調節配列の両方が有用である。一般に、乳タンパク質の分泌を指 令することが知られている調節配列（例えば乳由 来のシグナルペプチド又は新生標的（ｎａｓｃｅｎｔ ｔａｒｇｅｔ）ポリペプ チド）を使用することができるが、発現タンパク質の他の体液（特に血液及び尿 ）中への分泌を指令するシグナル配列（例えばタンパク質Ｃ及び因子VIIIのよう な凝固タンパク質のシグナル配列）を本発明に従って使用することもできる。Ｗ ＡＰタンパク質の調節配列がトランスジェニックマウスで最も好ましい。 転写を調節する有用な配列には、上述のプロモーターの他に、エンハンサー、 スプライスシグナル、転写終結シグナル及びポリアデニル化部位がある。この点 で特に有用なのは、上述のトランスジェニック動物の乳腺細胞でのフィブリノー ゲン用遺伝子の転写効率を高めるものである。乳腺細胞で強く発現されるタンパ ク質の転写調節配列が好ましい（上記参照）。 本発明の発現系又は構築物が更に、所望の組換えタンパク質又は調節に使用さ れる乳タンパク質遺伝子をコードするＤＮＡ配列の下流に３’未翻訳領域を含ん でいることが好ましい。この領域は明らかに発現系のＲＮＡ転写を安定化させ、 所望のタンパク質の収率を高める。この点で有用な３’未翻訳領域には、ポリＡ シグナルを提供する配列が ある。このような配列は、例えば小さなＳＶ４０ ｔ抗原、カゼイン３’未翻訳 領域又は当業界でよく知られた他の３’未翻訳配列に由来し得る。３’未翻訳領 域が乳特異的タンパク質に由来することが好ましい。発現配列のｍＲＮＡを安定 化させるには、この領域のポリＡ転写体の安定化作用が重要である。リボソーム 結合部位もＦＩＢの発現効率を増すのに重要である。同様に、本発明ではＦＩＢ サブユニットの翻訳後改変を調節する配列が有用である。 従って本発明では、乳及び／又は他の体液中での遺伝子の効果的な発現を促進 するシス作用調節配列に作動可能に結合したＦＩＢサブユニット鎖をコードする 遺伝子を含む二本鎖キメラＤＮＡを胚内に導入すると、ＤＮＡは胚ゲノム内に組 み込まれ、胚から成熟する成体の全動物細胞（生殖系列細胞を含む）の受け継が れる遺伝的資質の一部となる。このように乳内で発現、分泌されたＦＩＢを後述 するＥＬＩＳＡアッセイで測定すると、免疫反応性を示す。 ＦＩＢサブユニット鎖の合成がホロタンパク質（ｈｏｌｏｐｒｏｔｅｉｎ）の 産生に限定され得る場合、この鎖の発現は遺伝子を異なった遺伝子座内に置くこ とにより増加し得る。この異なった座は他の２つのＦＩＢ配列と同一又 は異なる調節配列下のＤＮＡ配列を含み得る。 特に好ましい実施態様では、本発明のトランスジーン(ｔｒａｎｓｇｅｎｅｓ) は一般に、３つのＦＩＢサブユニット鎖を示すｃＤＮＡ配列の３つの翻訳部分の 各々と別個に組み合わさった乳タンパク質の上流、下流及びフランキング配列か らなる。ＡＴＧコドン／ＡＴＧコドン直前のアクセス可能な制限部位で終了する 天然５’−ＷＡＰ調節配列を、ヒトＦＩＢ鎖に由来するリンカー配列をもたない 翻訳可能配列のＡＴＧに存在する各制限部位の各々に連結することができる。３ つのＦＩＢ ｃＤＮＡの各３’−翻訳不能配列に位置する３つの塩基の部位突然 変異誘発（ｓｉｔｅ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によって制限部位を作製しても よい。これはＦＩＢ ｃＤＮＡの各翻訳可能配列の直後に制限部位を付加しつつ 、終結配列を保持する。次いで、特定の制限部位で終了する組み合わさった５’ −調節及びＦＩＢ翻訳可能配列の各々を、ＷＡＰの３’−非翻訳領域及び隣接す るＷＡＰ３’フランキング領域の最初に存在する対応する制限部位に連結するこ とができる。この構築モチーフによって、配列を介在させずに、乳タンパク質遺 伝子の天然５’−調節及び３’−ＵＴＲを隣接して並置する ことができる（しかしながら、異なる座でのＢβ遺伝子の挿入に関しては上記参 照）。全ての構築物の末端の特定の制限部位を選択して、動物ゲノム内の単一ド メイン内へのＡα、Ｂβ、Ｇγ構築物の連結を容易にすることができる。 ＷＡＰプロモーターに関して本発明のＤＮＡ構築物の上記の一般的な説明を行 ったが、他の適切なプロモーター（上記参照）をフィブリノーゲンをコードする ポリヌクレオチドに同様に連結してもよいことを協調しよう。例えば、乳腺での ＦＩＢ及びＦＩＢ−ＢＬＧ融合タンパク質の発現効率を増すためのウシラクトグ ロブリン（「ＢＬＧ」）プロモーターの使用を以下で説明する。 上述の技術を用いて、フィブリノーゲンをコードするｃＤＮＡをヒツジＢＬＧ 遺伝子内に挿入することができる。例えば、このような構築物を調製するために 、ベクターｐＵＣＸＳＲＶ内のイニシエーターＡＴＧコドンの上流に単一のＥｃ ｏＲＶ部位を有するように１１．２ＫｂｐヒツジＢＬＧ遺伝子を改変させてもよ い。この領域周辺の配列を以下のように変更する： これにより、ＢＬＧ遺伝子の上流でブラント末端断片をクローニングすること ができる。ヒトフィブリノーゲンをコードするｃＤＮＡを含むプラスミド（例え ばｐＷＡＰ ＦＩＢ）に由来する1.5ｋｂｐ断片を単離し、Ｔ４ ＤＮＡポリマ ーでブラント末端を生成し、生成物をＥｃｏＲＶ−切断ｐＵＣＸＳＲＶに連結す る。Ｅ．ｃｏｌｉをこのプラスミドで形質転換した後に、ミニプレップ法（ｍｉ ｎｉ−ｐｒｅｐ ｍｅｔｈｏｄ）で調製したプラスミドＤＮＡの制限分析及びＤ ＮＡの５’及び３’クローニング接合部周辺のヌクレオチド配列の決定により、 産生されるクローンを特性分析することができる。所望の構造を有するクローン を使用して、ＦＩＢ−ＢＬＧ融合生成物を生物学的液体内に分泌するトランスジ ェニック齧歯動物、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマや他の農場動物、及び飼育ペット （ネコ、イヌ）を後述するように産生することができる。 ヒトフィブリノーゲンゲノム配列を以下で説明するヒツジＢＬＧプロモーター に融合することもできる。プラスミドｐＵＣＸＳＲＶ中のヒツジＢＬＧをコード するＤＮＡ配 列を欠失させて、ヒツジＢＬＧプロモータ配列だけを含むベクター（ｐＵＣＳＶ ）を作製する。ｐＵＣＳＲＶと同様に、単一ＥｃｏＲＶ部位に連結して、ブラン ト末端断片を上記プロモーター領域に融合させてもよい。両プラスミドの５’か らこの部位までの配列は同一である。 約１５ｋｂｐ以上のゲノムＦＩＢ配列をその長さにもかかわらず、重複するＦ ＩＢ配列を含むコスミドを用いて、トランスジェニック動物内に導入することが でき、そのためｈＦＩＢをコードする全ゲノムポリヌクレオチドの必要な連結は 、胚細胞内へのマイクロインジェクションの後にｉｎ ｖｉｖｏな相同的組換え によって達成される。上記例で有用な構築物では、プラスミドのＦＩＢゲノム配 列をフィブリノーゲン翻訳終結コドン直後のヒツジＢＬＧ３’フランキング配列 に融合して、適切な転写、終結及びポリアデニル化を実現する。ヒツジＢＬＧ３ ’フランキング配列に融合したｈＦＩＢ遺伝子をプラスミドから切り出し、３’ 突出部をクレノー酵素を用いて修復し、生成物をＥｃｏＲＶ−切断ｐＵＣＳＲに 連結する。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換後、制限ＤＮＡ分析や５’及び３’クローニ ング接合部周辺のヌクレオチド配列の決定により、得られたクロー ンを特性分析する。所望の構造を有するクローンをトランスジェニック動物の産 生のために受精動物卵子内に導入することができる。 ＢＬＧ遺伝子に基づく種々のベクターを構築することができる。このアプロー チに基づく構築物では、ヒツジＢＬＧタンパク質をコードする配列を欠失させる が、５’プロモータ配列は保持する。各々は、ヒツジ遺伝子に由来するイントロ ンの異なる補体、及び遺伝子のプロモーターと３’フランキング領域との間のブ ラント末端断片のクローニングを可能とする単一ＥｃｏＲＶ部位を有し得る。し かしながら、各々はＢＬＧプロモーター，ＥｃｏＲＶ部位及びＢＬＧ３’−フラ ンキング配列を含んでいる。各組換え体について、ｐＷＡＰ ＦＩＢ由来の１． ５ｋｂｐ ＫｐｎＩ断片を単離し、上述のようにブラント末端を生成し、生成物 をＥｃｏＲＶで切断したベクター配列に連結する。（上述の方法で決定された） 適切な構造を有するこれらの構築物を使用して、トランスジェニック動物の生物 学的液体内にフィブリノーゲンを発現させることができる。 ＢＬＧ標的ｃＤＮＡ構築物（例えばＢＬＧプロモーター−イントロンＩ−Ｅｃ ｏ ＲＶ−イントロンVI−ＢＬＧ３’ フランク（ｆｌａｎｋ）プラス ＢＬＧ）への付加的なフランキング配列とし てｉｎ ｖｉｖｏで連結されるべき別個の構築物として注入される天然ＢＬＧゲ ノム配列を有する様に産生した二重にトランスジェニックな（ｄｏｕｂｌｙ−ｔ ｒａｎｓｇｅｎｉｃ）マウスで、ＢＬＧプロモーター−ＦＩＢ ｃＤＮＡ−ＢＬ Ｇ遺伝子又はＢＬＧプロモーター−ＦＩＢゲノム（±ＢＬＧ３’末端）の構築物 を使用して観察される場合よりも頻繁でより高い発現が得られることが観察され た。ＢＬＧ−ｃＤＮＡ標的に予め連結させるインタクトな又は天然のＢＬＧゲノ ム配列で同じ利点を得ることができる。この同じ原理をＷＡＰゲノム配列に適用 することができる。 本発明のトランスジェニック動物の乳は慣用の手段によって入手する。例えば 参考として本明細書の一部を構成するものとする、ＭｃＢｕｒｎｅｙ等， Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ ． ６４：４８５（１９６４）；Ｖｅｌａｎｄ ｅｒ等， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， ＵＳＡ ８９：１ ２００３（１９９２）を参照されたい。活性に悪影響を及ぼさずに、慣用の手段 によりフィブリノーゲン又はそのサブユニット鎖もしくはタンパ ク質産物を乳又は尿から単離して精製することができる。非常に好ましい方法は 、アニオン交換とイムノクロマトグラフィーとの組み合わせ、低温沈殿、全乳又 はホエー（脱脂乳）タンパク質の亜鉛イオン誘導沈殿からなる。これらの技術に ついては、参考として本明細書の一部を構成するものとする、Ｂｒｉｎｇｅ等， Ｊ． Ｄａｉｒｙ Ｒｅｓ． ５６：５４３（１９８９）を参照されたい。 乳が、外来タンパク質を分解し得る数種のプロテアーゼを含んでいることは公 知である。これらには主に、トリプシン及びキモトリプシン活性を有するアルカ リ性プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、キモトリプシン様酵素、アミノペプチ ダーゼ及び酸プロテアーゼが含まれる。Ｃｌａｒｋ等， （１９８７）上掲。従 って、新たに分泌されたＦＩＢ又はそのサブユニット鎖をタンパク分解させない ことが所望され得る。このための予防措置としては、採乳後の乳を速やかに加工 し、この乳に、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ． Ｃａｔａｌｏｇ， １ ９９３年版， ８５０ページ（参考として本明細書の一部を構成するものとする ）に記載されているようなよく知られたタンパク分解阻害剤を添加することが挙 げられる。 本発明者らは２種のサンドイッチＥＬＩＳＡ方式を使用して、ホエー中のＦＩ Ｂを検出し定量した。一方の技術はポリクローナル抗体捕捉／ＦＩＢ／モノクロ ーナル抗体検出系（「Ｐ／Ｍ」）であり、他方は捕捉及び検出の両方にポリクロ ーナル抗体を使用している（「Ｐ／Ｐ」）。この２つの方法を以下で説明する。 Ｐ／Ｍ系はｈＦＩＢに特異な長さで約６〜２０アミノ酸のエピトープを１個だけ 認識するので、ｈＦＩＢに対してより大きな特異性を有するという利点があるが 、Ｐ／Ｍ系はエピトープを１個しか認識しないので、検出感度は低下する。対照 的に、Ｐ／Ｐ系は多数のエピトープを認識するために特異性は低下するが、同時 に検出感度は増す。これらの多数のエピトープにはマウスとヒトＦＩＢとの間に 保持されたエピトープが含まれるので、Ｐ／Ｐ系でマウス乳内のｒｈＦＩＢを測 定すると、バックグラウンド「ＦＩＢ」シグナルが増加する。サンドイッチＥＬ ＴＳＡ手順の詳細は以下の実施例７に示す。 以下の実施例を参考にして本発明を更に詳しく説明する。 実施例１フィブリノーゲンをトランスジェニック動物で発現するためのＷＡＰ−フィブリ ノーゲンｃＤＮＡ構築物 カセットベクターの構築 フィブリノーゲンサブユニット鎖ＤＮＡ、組織特異的プロモーター及び分泌シ グナルを上述のソースから入手した。フィブリノーゲンサブユニット鎖ｃＤＮＡ を改変ｐＵＣ１８ベクター内にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９内で 増殖させた。 ｐＵＣ１８ベクター（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）をＨｉｎｄIII＋ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼで消化し、１００ｍ Ｍ ｄＮＴＰの存在下にてＴ４ ＤＮＡポリメラーゼでブラント末端とし、Ｎｏ ｔ Ｉリンカーを上記のＨｉｎｄIII−ＥｃｏＲＩ多重クローニング部位内に連結 した。この改変ｐＵＣ断片を更にＮｏｔＩ＋酵素で消化して、連結によって生じ る余分（多数のコピー）のＮｏｔＩリンカー配列を除去し、次いで再連結して、 Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９内で増殖させた。ｐＵＣ１８（ＫｐｎＩ部位を含む） の全多重クローニング領域を除去し、これをＮｏｔＩ制限部位に置換するこの手 順により、ｐＵＣ１８ベクターを改変させた。新たなベクターをｐＵＣＮｏｔ１ ＋と名付けた。 〜２．６ｋｂｐのＷＡＰ ５’プロモーター領域、〜１．３ｋｂｐのＷＡＰ３ ’ＵＴＲ及びフランキング３’を含んでいるが、ＷＡＰコード領域もイントロン 領域も含まないｐＵＣベクターを構築した（カセットベクターｐＵＣＷＡＰ４と 称する（図２）；ＷＡＰ遺伝子（図１）及びカセットベクターｐＵＣＷＡＰ５（ 図３）を参照されたい）。２．６ｋｂの５’未翻訳領域及び３’未翻訳領域を含 む全マウスＷＡＰ遺伝子を、Ｄｒ． Ｉ． Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ， Ｎａ ｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ， Ｂｅｔｈｅｓｄ ａ， Ｍａｒｙｌａｎｄから入手することができる。Ｃａｍｂｅｌｌ等， Ｎｕ ｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， １２：８６８５（１９８４）を参照され たい。ＷＡＰ４ベクター内に含まれるＷＡＰ断片は、ＥｃｏＲＩ＃１で開始し、 単一ＫｐｎＩエンドヌクレアーゼ制限部位のすぐ下流にあるＷＡＰの翻訳開始部 位で終了する〜２．６ｋｂｐのＷＡＰプロモーター５’領域を含んでいる（図１ 参照）。このＫｐｎＩ部位に、〜１．３ｋｂｐのＷＡＰ ＵＴＲ及びフランキン グ３’配列の断片を連結した。このＷＡＰ３’ＤＮＡは、ＷＡＰ停止コドンのす ぐ下流から下流へＥｃｏＲＩ＃２部位までの 領域を含んでいた。ＷＡＰ４内に含まれるＷＡＰ断片をＥｃｏＲＩを用いてｐＵ Ｃベクターから切り出し、次いでブラント末端とし（ｂｌｕｎｔｅｄ）、Ｎｏｔ Ｉリンカーを加え、ＮｏｔＩ消化で更に平滑断端とし(ｔｒｉｍｍｅｄ)、Ｎｏｔ Ｉ制限エンドヌクレアーゼで線状化したｐＵＣＮｏｔＩ＋プラスミド内に連結し た。得られたプラスミドをｐＵＣＷＡＰ５と名付けた（図３参照）。フィブリノーゲンサブユニット鎖ｃＤＮＡのＰＣＲによる増幅 ヒトフィブリノーゲンのＡα、Ｂβ、Ｇγ鎖の各ｃＤＮＡを個々に改変し、ポ リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で増幅させて、５’末端及び３’末端上にＫｐｎ Ｉエンドヌクレアーゼ制限部位を得た。ｈＦＩＢのＡα、Ｂβ、Ｇγ鎖のｃＤＮ ＡのＡＴＧ開始コドンにすぐに隣接するプライマー［６塩基配列を含む（ＧＧＴ ＡＣＣを表１に下線で示す）］を用いてＰＣＲにより５’ＫｐｎＩ部位を作製し た。増幅後、ＰＣＲ産物を用いる拡張部の末端を（デオキシヌクレオシドトリホ スフェートの存在下で）Ｔ４−ポリメラーゼによりブラント末端にして前進型エ キソヌクレアーゼ活性を阻害した。同様に、ｈＦＩＢのＡα、Ｂβ、Ｇγ鎖 の各ｃＤＮＡの３’ＵＴＲ内の停止コドンにすぐに隣接する、表１の下線で示す ６塩基配列ＧＧＴＡＣＣへの部位改変によってＫｐｎＩ部位を作製した。停止配 列の補体は表１の３’プライマーに太字で示す。 フィブリノーゲンサブユニット鎖ｃＤＮＡを含むｐＵＣプ ラスミドの構築 ヒトフィブリノーゲンのＢβ鎖及びＧγ鎖のｃＤＮＡのブラント末端ＰＣＲ産 物をＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼで消化した。Ａα鎖の場合、ＫｐｎＩで部 分消化する前に、ＰＣＲ産物を、（ＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ポリメラーゼでブラ ント末端とした）ｐＵＣＮｏｔＩ＋内にブラント末端でクローニングした。Ａα 鎖ｃＤＮＡ内に内部ＫｐｎＩ部位が存在するために、インタクトなコード断片を 調製するにはこの中間のクローニング及び部分消化ステップが必要であった。イ ンタクトなＡα鎖ｃＤＮＡ断片をゲル電気泳動で選択し、ｐＵＣＷＡＰ５プラス ミド内のＷＡＰ５’プロモーターとＷＡＰ ３’ＵＴＲ／フランキング配列との 接合部にあるＫｐｎＩ部位内にクローニングした。ヒトフィブリノーゲンのＢβ 鎖及びＧγ鎖に由来するＫｐｎＩで消化したＰＣＲ産物をそれぞれ直接、ｐＵＣ ＷＡＰ５プラスミド内のＫｐｎＩ部位にクローニングした。３つのｐＵＣＷＡＰ ５／フィブリノーゲンｃＤＮＡ調製物の各々を用いてＥ．ｃｏｌｉ上で別個のエ レクトロポレーション形質転換反応を実施し、コロニーを採取し、ＴＢアンピシ リンブロス内で増殖させた。これらのコロニーのプラ スミド調製物を制限酵素消化及びゲル電気泳動で分析した。正確な寸法及び配向 を選択し、各ＷＡＰ−フィブリノーゲンｃＤＮＡ構築物につき１個のクローンの 配列を、ＷＡＰプロモーター５’：フィブリノーゲンｃＤＮＡ及びフィブリノー ゲンｃＤＮＡ：ＷＡＰ３’ＵＴＲ及び隣接接合部で決定した。ヒトフィブリノー ゲンのＷＡＰ−Ａα（約５．８ｋｂｐ）、−Ｂβ（約５．４ｋｂｐ）及び−Ｇγ （約５．２ｋｂｐ）ｃＤＮＡプラスミド並びに線状化トランスジーンの構築の概 略図をそれぞれ図４、図５及び図６に示す。 実施例２ マイクロインジェクション用ＤＮＡの調製 インタクトで線状化したＷＡＰ５’プロモーター／フィブリノーゲンｃＤＮＡ ／ＷＡＰ３’ＵＴＲ及びフランキング断片を、ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼ 消化によって各ｐＵＣＷＡＰ５プラスミドから切り出し、低融点アガロース電気 泳動で精製した。ゲルスラブからＤＮＡ：アガロースバンドを切断した。次いで 、アガロースバンドをアガラーゼで処理して、アガロース汚染物を分解し除去し た。 消化後、ｃＤＮＡ含有溶液を１０ｍＭ Ｍｇ²⁺、２０ｍＭ ＥＤＴＡ及び０． １％ＳＤＳに添加し、次いでフェノ ール／クロロホルムで抽出した。０．３Ｍ酢酸ナトリウムの存在下、２．５容量 のエタノールで水性層からＤＮＡを−２０℃で一晩沈殿させた。遠心分離の後、 ペレットを７０％エタノールで洗浄し、乾燥し、各構築物をＢｒｉｎｓｔｅｒマ イクロインジェクション緩衝液に再度懸濁させ、溶解させて、全濃度（α、β、 プラス γ）を約１．２〜５μｇ／ｍｌとした。Ｂｒｉｎｓｔｅｒ等， Ｐｒ ｏｃＮａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２：４４３８（１９８５） 、参考として本明細書の一部を構成するものとする。 実施例３ トランスジェニックマウス 本質的にＨｏｇａｎ等， Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ Ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， １９ ８６（参考として本明細書の一部を構成するものとする）に記載の方法でトラン スジェニックマウスを産生した。使用した手順を以下に記載する。 微量ピペットピューラー(ｐｕｌｌｅｒ)及び小型炉(ｍｉｃｒｏｆｏｒｇｅ)を 用いて、マイクロインジェクショ ン用ガラス針を製造した。注入は、Ｈｏｆｆｍａｎ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｃ ｏｎｔｒａｓｔレンズ（ｏｐｔｉｃｓ）を有し、Ｎａｒａｓｈｉｇｉマイクロマ ニピュレータ及びＮ₂によって駆動されるピコインジェクタ（Ｎａｒａｓｈｉｇ ｉ）を備えたＮｉｋｏｎ顕微鏡を用いて実施した。 受精マウス胚を過剰排卵メスＣＤ−１マウスの卵管から外科的に取り出し、Ｍ ２培地内に置いた。小丘細胞を３００μｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼで胚から取 り出した。次いで、胚を新しいＭ２培地で濯ぎ、Ｍ１６培地に移し、注入の前に ３７℃で貯蔵した。 約１．２μｇ／ｍｌ含んでいる（ヒトフィブリノーゲンのＡα、Ｂβ、Ｇγ鎖 ｃＤＮＡを含んでいる線状化構築物をそれぞれ約０．４μｇ／ｍｌ、又は各構築 物を約６０〜７０コピー／ｐｌ有する）ストック溶液を調製し、マウスの１細胞 胚（１ ｃｅｌｌ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ）の前核にマイクロインジェク トした。更には、約５μｇ／ｍｌの全ＤＮＡを含む（ヒトフィブリノーゲンのＡ α、Ｂβ、Ｇγ鎖ｃＤＮＡの各々を含んでいる線状化構築物を約１．７μｇ／ｍ ｌ、又は各構築物を約２００コピー／ｐｌ有する）ストック溶液を調製し、マウ スの１細胞胚の前 核にマイクロインジェクトした。 ＤＮＡ溶液を雄前核内に注入した後に、精管切除したオスと交配して偽妊娠さ せたＣＤ−１受容体メスにアベルチンで麻酔をかけて、胚を移植した。マイクロ インジェクトしたマウス胚を受容体当たり約２５〜３０個、偽妊娠メスに移した 。胚を妊娠期間満了まで維持し、新生マウスでトランスジーンの存在を後述する マウスＷＡＰ及びＦＩＢ特異的プライマーを用いてＰＣＲによって分析した。 表２に、フィブリノーゲンを産生するトランスジェニックマウスをつくり出し た実験での胚移行データ（ｅｍｂｒｙｏ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｄａｔａ）を示す 。生検に付した尾組織から精製したＤＮＡで、フィブリノーゲンの各ｃＤＮＡの 検出のための別個のＰＣＲ分析を以下の実施例４に示す方法で実施した。表３に 示すオリゴヌクレオチドプライマーを使用して、各ＦＩＢ ｃＤＮＡを検出した 。各鎖の検出には、ＷＡＰオリゴヌクレオチド（表３のＮｏ．１）及び他のオリ ゴヌクレオチド（Ｎｏ．２、３又は４）の一つが必要であった。 初代マウス及び初代マウスの子孫で検出されたフィブリノーゲントランスジェ ニックマウスの型をまとめて表４に示す。陽性ＦＩＢ三重構築物初代（Ｆ０）の リスト及びβ鎖陽性トランスジェニックマウスのリストも表４に示す。 陽性フィブリノーゲン三重構築物Ｆ１ １−２、１−５、１−６、１−１１、１−１２、１−１４、１−１６、１−１７ 、１−２０、２３−３、２３−４、２３−１２、１０９−３、１０９−４、１０ ９−５、１０９−１０、１０９−１１、１１２−３、１１２−６、１１２−７、 １１２−８。 β鎖陽性マウス ２３−２、２３−７、２３−１１、８５−２ 全ての胚に３種のＦＩＢ構築物を５μｇ／ｍｌ又は各構築物の約２００〜３０ ０コピー／ｐｌの総ＤＮＡ濃度で注入した。 Ｆ０〜Ｆ１メスのトランスジーン継代の系図を図７に示す。オスは保持しなか った。 実施例４ トランスジェニック動物ＤＮＡ マウスについて以下に例示されている方法（Ｍａｒｍｕｒ， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ ． ３：２０８（１９６１）、参考として本明細書の一部を構成する ものとする）により、任意の種のトランスジェニック動物の組織からＤ ＮＡを調製することができる。 離乳期（３週齢）の若く潜在的にトランスジェニックなマウスから５ｍｍ片の マウス尾を取り出し、液体窒素中で凍結させた。凍結組織に８４０μｌの溶解溶 液（Ｌｙｓｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（４０ｍＭＴＲＩＳ緩衝液（ｐＨ８．０ ）及び１２０ｍＭ ＮａＣｌ中の８ｍＭ ＥＤＴＡ−０．８％ ＳＤＳ−０．８ ％ ２−メルカプトエタノール−８０μｇ／ｍｌプロテイナーゼ Ｋ−１Ｍ塩素 酸ナトリウム）を添加し、この混合物を５０℃でインキュベートした。次いで、 この混合物を２５０μｌのフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（ ２５：２４：１）で１０〜１５秒間抽出し、次いで１０分間遠心分離にかけた。 上清液体（約８３０μｌ）を新しい管に取り出し、この溶液を０．６容量のイソ プロパノールと共に攪拌するとＤＮＡ凝塊が生成した。母液をデカントし、ＤＮ Ａ凝塊を８０％エタノールで２度濯いだ。５分間遠心分離にかけ、上清液体を吸 出し、凝塊を空気流で１０分間空気乾燥して、ＤＮＡ凝塊を単離した。 ＤＮＡ凝塊を２５０μｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭＴｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７． ０）−１ｍＭ ＥＤＴＡ）に溶解し、 この溶液を１０μｌのＲＮａｓｅ混合物（１ｍｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ Ａ及び４ ，０００単位／ｍｌのＲＮＡｓｅ Ｔ１）で３７℃にて１時間処理したこの混合 物をクロロホルム−イソアミルアルコールの２４：１（ｖ／ｖ）溶液５０μｌと 共に５〜１０秒間振盪させ、遠心分離にかけ、上清液体を新しい管に移した。 上記の回収した上清液体を２５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム及び０．５ｍｌの９ ５％エタノールと順次混合した。上清液体を沈殿ＤＮＡからデカントし、沈殿物 を８０％エタノールで洗浄した。精製ＤＮＡを遠心分離により単離し、空気乾燥 し、次いで１５０μｌのＴＥに溶解した。 本質的に同じ技術を使用して、ブタからＤＮＡを調製し、同一又は類似技術を 使用して他の動物からＤＮＡを調製できる。 上述したように、トランスジェニック動物組織試料から単離したＤＮＡ試料で 慣用的にＰＣＲ反応を生起させた。希釈度が１：２０の上記ＴＥ溶液の吸光度を ２６０ｎｍで測定して、ＤＮＡ単離物の濃度を調べた。次いで、試料の一部を１ ００μｌのＴＥ中に希釈して、濃度を３０ｎｇ／μｌとした。ＰＣＲ反応混合物 （容量２０μｌ） 手順 各ＰＣＲ管に、１μｌの調製ＤＮＡ溶液と共に胚溶解緩衝液（５μｌ、２０ｍ Ｍ ＴＲＩＳ緩衝液中０．９％Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０及び０．９％Ｔｗｅｅ ｎ ２０）を添加し、この混合物上に２５μｌの鉱油を載せた。管を自動温度循 環器（例えばＮ．Ｊ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ製）中に置き、９８℃に２分間加熱し、 次いで温度を８５℃に下げた。 各管にＰＣＲ反応混合物（２０μｌ）を添加し、以下の手順を４０サイクル実 施した： ９６℃で２０秒間変性 ５５℃で１分間アニーリング ７５℃で３０秒間延長。 反応混合産物の２０％をアガロースゲル上で泳動させ、断片寸法をマーカーＤ ＮＡ断片との比較により同定してＰＣＲ反応生成物を分析した。 図７は、Ａ＋及び／又はＢ＋及び／又はＧ＋構築物を有する種々の初代動物が Ａ＋、Ｂ＋、Ｇ＋トランスジーンの３種全て又はその幾つかを伝達し得ることを 示している。Ａ＋、Ｂ＋、Ｇ＋構築物の全てを含んでいる同一のＤＮＡ溶液を同 時に注入した胚から全ての動物を産生した。Ａ＋、Ｂ＋、Ｇ＋ＤＮＡを上述した ようにＰＣＲで検出した。初代動物１、２３、１０９、１１２は３種全てのトラ ンスジーンを有していた。初代動物８５はＡ＋、Ｂ＋のみを有していた。これら の初代動物を対照（非トランスジェニック）マウスと異系交配させた。動物１及 び１０９ではそれぞれ１３匹中５匹及び１１匹中５匹の子孫に３種全てのトラン スジーンが受け継がれた。これは単一対立遺伝子のメンデルゲノム伝達の特徴を よく表している。初代動物２３及び１１２はそれぞれ１２匹中６匹及び８匹中７ 匹の動物に数 種のトランスジーンを伝えた。動物２３の幾匹かの子孫はＢ＋のみを有し、動物 １１２の１匹の子孫はＡ＋のみを有し、他はＡ＋及びＧ＋を有していた。従って 、初代動物２３、１１２は、動物２３の場合は確定された別個のＢ＋対立遺伝子 を有する、動物１１２の場合は別個のＡ＋及びＢ＋対立遺伝子を有する三重トラ ンスジェニック動物の例である。初代動物８５もＢ＋のみの対立遺伝子を有する マウスの例である。従って、別個の対立遺伝子、従って各遺伝子の座を有する動 物を交雑育種して、発現を増すことができる（比率の制限されたＢ＋鎖に対する 抑制は、より誘導性の座を備えたＢ＋対立遺伝子を有することにより克服され得 る）。更には、同一遺伝子の二重及び三重異型接合体（Ａ＋及び／又はＢ＋及び ／又はＧ＋）を製造して、発生レベルを高める（即ちＢ＋動物を交雑育種してＡ ＋Ｂ＋Ｇ＋、Ｂ＋動物を産生し、更にはこのＡ＋Ｂ＋Ｇ＋、Ｂ＋動物を異なるＢ ＋系と交雑育種してＡ＋Ｂ＋Ｇ＋、Ｂ＋Ｂ＋を得る）ことができる。 実施例５ トランスジェニックブタ 胚を卵管から回収した。胚を、約０．５ｍｌの胚移行培 地（リン酸緩衝食塩水＋１０％ウシ胎児血清、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を含む１．５ ｍｌの小型遠心管（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ｔｕｂｅ）内に置いた。次いで、これ らを小型遠心分離機（Ａｌｌｉｅｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，モデル２３５Ｃ ）内にて、１６，０００×ｇ ＲＣＦ（１３，４５０ＲＰＭ）で１２分間遠心分 離した。引抜きして（ｄｒａｗｎ）艶出ししたＰａｓｔｅｕｒピペットで胚を小 型遠心管から取り出し、検査のため３５ｍｍのペトリ皿内に置いた。細胞質が尚 脂質によって不透明であり前核が見えなければ、胚を再度１５分間遠心分離する 。マイクロインジェクトすべき胚を１００ｍｍのペトリ皿の蓋の中央にある培地 の微量液滴（ｍｉｃｒｏｄｒｏｐ）（約１００μｌ）内に置いた。シリコーン油 を使用して微量液滴を被覆し、培地が蒸発しないように蓋を塞いだ。胚を含むペ トリ皿の蓋を、加熱ステージ及びＨｏｆｆｍａｎ Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ Ｃｏ ｎｔｒａｓｔレンズ（最終倍率２００×）の両方を備えた倒立型（ｉｎｖｅｒｔ ｅｄ）顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）上に設置した。細く引抜きし（Ｋｏｐｆ Ｖｅｒｔｉｃａｌ Ｐｉｐｅｔｔｅ Ｐｕｌｌｅｒ、モデル７２０）及び艶出し した（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ小型炉、 モデルＭＦ−３５）小型ピペットを使用して胚を安定化させる一方で、約２００ 〜５００のＤＮＡ構築物コピーを含むＨＰＬＣ精製ＤＮＡ溶液約１〜２ｐｌを、 細く引抜きした他の小型ピペットで雄前核内に送達した。形態観察によってマイ クロインジェクション過程で生存したと判定された胚を、受容体ブタへの移行の ためにポリプロピレン管(２ｍｍ ＩＤ)内に導入した。ブタ胚の外科的移行を７ 回行った。これらの胚を、上述のトランスジェニックフィブリノーゲンマウスで 使用したＷＡＰ−フィブリノーゲンｃＤＮＡ構築物と一緒に注入した。これらの 受容体メスブタの１頭だけが超音波により妊娠していると確認された。（一見） 妊娠していない動物で（存在すると考えられ得る）同腹子の大きさは小さすぎて 超音波分析では検出できないので、これらの動物を仮の出産予定日まで保持した 。（これまでに、４匹以下のコブタ同腹子に３度遭遇したが、これらは超音波で は検出されなかった。これらの同腹子の中にはトランスジェニック動物を産生す るものがいた。） 全ての胚に３種のフィブリノーゲン構築物を５μｇ／ｍｌ又は各構築物の約２ ００〜３００コピー／ｐｌの総ＤＮＡ濃度で注入した。 実施例６ トランスジェニック動物由来の乳及びホエーの製造 授乳期の約１２日目に一度泌乳マウスから搾乳した。このマウスを最初約５時 間子供と離した。次いで、これらのマウスに０.４ｍｌの２.５％アベルチンで麻 酔をかけ(筋肉内：ｉｍ．)、次いで０．２ｍｌのオキシトシンを２．５ＩＵ／ｍ ｌで（腹腔内：ｉｐ．）投与して、乳を放出させた。真空ポンプ（２．５ｐｓｉ ）及びＥｐｐｅｎｄｏｒｆチップを備えたシリンジからなる搾乳装置を使用して 、乳をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管に取った。上述したように、フィブリノーゲンは低 温沈殿するので、乳を氷上に置くべきではない。 ホエーを製造するために、乳をＴＲＩＳ緩衝液（０．０３ＭＴｒｉｓ ｐＨ７ .４；０.０６Ｍ ＮａＣｌ）で１：１に希釈し、Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＬ−１００ テーブルトップ超遠心分離機のＴＬＡ−１００ローターにて、５１，０００ｒｐ ｍ（８９，０００×ｇ）で３０分間室温で遠心分離にかけた。遠心分離の後、ホ エー（下層液：ｉｎｆｒａｎａｔａｎｔ）を１８ゲージ針で収集すると、管内に はカゼインペレット及びクリーム上層が残った。最初の回収中 に一緒に移行した固体又はクリームを除去するために、最初の遠心分離で得られ たホエーを、Ｔｏｍｙ ＭＴＸ−１５０遠心分離機内のＴＭＡ−４ローターで１ ２，０００ｒｐｍで３０分間の第２の遠心分離にかけた。第２の遠心分離の後に 、前と同じようにホエーを回収した。 実施例７サンドイッチＥＬＩＳＡによる乳中のフィブリノーゲンの測定 サンドイッチＥＬＩＳＡを使用して、希薄脱脂乳（本明細書では「ホエー」と 称する）中に初代及び子孫トランスジェニック動物によって産生されたＦＩＢタ ンパク質の量を測定した。ホエー値を使用して、全乳中のＦＩＢ濃度を椎定する 。 一般に、Ｐ／Ｍ ＥＬＩＳＡ系の第１のステップでは、フィブリノーゲン又は フィブリノーゲン鎖被分析物質（ａｎａｌｙｔｅ）を含有する試料（例えばホエ ー）を、フィブリノーゲンのα鎖と反応性のマウス抗ヒトフィブリノーゲンｍＡ ｂ（クローン番号３１１、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）と共に インキュベートして、ｍＡｂ−フィブリノーゲン（又は鎖）の第１複合体を形成 する。 次いで、この第１複合体をマイクロリッタープレートウェルに固定化したウサギ ポリクローナル抗ヒトフィブリノーゲン抗体と共にインキュベートして「捕捉」 する。検出ステップでは、捕捉したフィブリノーゲン（又はα鎖）を標識（西洋 ワサビペルオキシダーゼ）抗マウスＩｇＧと接触させ、Ｏ−フェニレンジアミン との反応及び４９０ｎｍでの吸光度の測定によりラベル量を定量する。これは存 在する被分析物質の量の尺度となる。対照（非トランスジェニック）動物のホエ ーに純粋な基準ヒトＦＩＢ材料を加えて（ｓｐｉｋｉｎｇ）標準曲線を得た。従 って、標準曲線により、ＦＩＢのバックグラウンド量の存在を規格化する。この サンドイッチＥＬＩＳＡでは、ヒトＦＩＢを含まないマウスホエーのみで非常に 低いバックグラウンド値（４９０ｎｍで約０．０６吸光度単位）が得られる。表 ６に示す通常のシグナルの上記波長での吸光度単位は約０．２５以上であること を指摘しておく。 Ｐ／Ｐ系では、Ｉｍｍｕｌｏｎ II９６−ウェルマイクロリッタープレートを 、０．１Ｍ ＮａＨＣＯ₃−０．１Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ９．６）中の１００μｌ ／ウェルのウサギ抗ヒトＦＩＢ（希釈度１：５００）（Ｃｅｌｓｕｓ ｃ ａｔ． ｎｏ． ６０９６０）により冷蔵庫温度で２４時間被覆した。被覆した ウェルを洗浄緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−５０ｍＭ ＮａＣｌ−０． ５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ｐＨ７．０））で３度洗浄し、希釈緩衝液(２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ−５０ｍＭ ＮａＣｌ(ｐＨ７．０)中１ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ) にて室温で２０分間阻害(ｂｌｏｃｋ)した。標準ヒトＦＩＢ（１００ｎｇ／ｍｌ 〜１．９ｎｇ／ｍｌ範囲）１００μｌ及び／又は希薄乳試料１００μｌを各ウェ ルに添加し、この混合物を３７℃で４５分間インキュベートした。ウェルを洗浄 し、室温で１０分間上記のように阻害した。１：１０００に希釈した西洋ワサビ ペルオキシダーゼ接合ウサギ抗ヒトＦＩＢ １００μｌを各ウェルに添加し、こ の混合物を３７℃で４５分間インキュベートした。ウェルを上述のように洗浄し た後、１００μｌのＯ−フェニレンジアミン溶液（１錠／５ｍｌ希釈液）を各ウ ェルに添加した。発色のために約２〜３分待った後、各ウェルに１００μｌの３ Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄を添加して反応を停止させた。次いで、プレートを４９０ｎｍで読 み取った。 ゲノムにヒトフィブリノーゲンのＡα、Ｂβ、Ｇγ鎖ｃ ＤＮＡの各々を含んでいる３匹の初代（Ｆ０）トランスジェニックマウスの第１ 泌乳ホエー（及び全乳（計算による））での上記Ｐ／Ｍ ＥＬＩＳＡ系によるｒ ｈＦＩＢの分析結果を表６に示す。この実験では、「ホエー」とはカゼインを可 溶化させるためにＥＤＴＡで１．７倍に希釈した脱脂乳を指す。３匹の試験動物 での各ホエー試料の４つの希釈度の平均はそれぞれ約１６．３、３．８６及び７ ．５５μｇ／ｍｌであった。全乳での対応値は２７．６、６．５６及び１２．８ であった。第２泌乳でのｒｈＦＩＢの産生も同様であった。 同一動物を用いた他の実験では、第１泌乳ホエーのフィブリノーゲン濃度の平 均は約２２±４（動物１）、９±２（動物２２）及び１１±３（動物２３）μｇ ／ｍｌであった。第２泌乳では動物１が１７±３μｇ／ｍｌのホエーを産生した 。 Ｐ／Ｍ ＥＬＩＳＡ系を使用して、マウスｎｏ．１／Ｆ０の第３泌乳及びマウ スｎｏ．１メス子孫（１−１１／Ｆ１）の第１泌乳でｒｈＦＩＢを分析した。表 ７のデータに示すように、マウスｎｏ．１／Ｆ０は約７１μｇ／ｍｌの総ＦＩＢ シグナルを示し、その子孫（１−１１／Ｆ１）は 約５３μｇ／ｍｌの総ＦＩＢシグナルを示した。従って、バックグラウンドを引 いた後のｒＦＩＢの量を計算するとそれぞれマウスｎｏ．１／Ｆ０で約５０μｇ ／ｍｌ、子孫１−１１／Ｆ１で約３２μｇ／ｍｌであり、血清から乳に通過して （ｐａｓｓｏｖｅｒ）存在する内因性ＦＩＢの量を上回っている。マウスｎｏ． １／Ｆ０の先の泌乳のＰ／Ｍアッセイの値の方が僅かに低い（２８μｇ／ｍｌ） が、Ｐ／Ｍ法の検出感度の方が低いことを考慮すれば、Ｐ／Ｐ値と大した違いは ない。マウス乳の採乳が本来外傷性であり、内因性ｍＦＩＢの血清通過につなが ることが指摘される。 要するに、マウスｎｏ．１／Ｆ０（初代）は、Ｐ／Ｍ又はＰ／Ｐ ＥＬＩＳＡ 法で検出されるように、３回の泌乳で乳内に約３０μｇ／ｍｌ以上のｒＦＩＢを 生成し、この特徴はＦ１世代にも受け継がれ、マウスｎｏ．１−１１／Ｆ１では ３２μｇ／ｍｌのｒＦＩＢが生成された。 これらの生成物は、Ｒｏｙ等（１９９１，上掲）が記載するＣＯＳ１系で産生 された２μｇ／ｍｌよりも実質的に多い。 ポリクローナル抗ヒトフィブリノーゲン抗体を用いた対照マウス乳のウエスタ ン分析によれば、バックグラウンドフィブリノーゲンシグナルが約２１μｇ／ｍ ｌであることが判明した（表７参照）。クローン番号３１１又はＹ１８のモノク ローナル抗体を使用するウエスタン分析では、１００μｇ／ｍｌフィブリノーゲ ンの約１μｌ試料（Ｐｈａｓｔｇｅｌ ｓｙｓｔｅｍ）又は３”×４”ＳＤＳ− ＰＡＧＥゲルでは２５μｇ／ｍｌフィブリノーゲンの２０μｌ試料の感度下方限 界を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (71)出願人 ユニバーシテイ・オブ・ノースカロライナ アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27599、チヤペル・ヒル、キヤンパス・ボ ツクス・4100、オフイス・オブ・リサー チ・サービシズ（番地なし) (72)発明者 ベランダー，ウイリアム・エイチ アメリカ合衆国、バージニア・24060、ブ ラツクスバーグ、ランカスター・ドライ ブ・3014 (72)発明者 ロード，スーザン・テイー アメリカ合衆国、ノース・カロライナ・ 27599、チヤペル・ヒル、ノースウツド・ ドライブ・108 (72)発明者 ドローアン，ウイリアム・エヌ アメリカ合衆国、バージニア・22152、ス プリングフイールド、オークフオード・ド ライブ・8417 (72)発明者 ルボン，ヘンリク アメリカ合衆国、メリイランド・20855、 ロツクビル、モノーナ・テラス・7416 (72)発明者 ジヨンソン，ジヨン・エル アメリカ合衆国、バージニア・24060、ブ ラツクスバーグ、サウス・イースト、クレ ストウツド・ドライブ・805 (72)発明者 ラツセル，クリストフアー・ジー アメリカ合衆国、バージニア・24060、ブ ラツクスバーグ、コヒー・ロード・403

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．異種組換えフィブリノーゲンタンパク質を発現し、該フィブリノーゲンタン パク質を体液中に分泌させるトランスジェニック非ヒト動物。 ２．前記動物が、前記フィブリノーゲンの３種のサブユニット鎖ポリペプチドを コードするＡα、Ｂβ、ＧγＤＮＡからなる群の中から選択された異種フィブリ ノーゲンサブユニット鎖をコードするＤＮＡ配列をゲノム内に安定的に組み込ん でおり、各前記異種ＤＮＡ配列が、シス作用発現プロモーターを含む調節配列及 び前記フィブリノーゲンを体液中に分泌させるためのトランスメンブラン分泌シ グナルペプチドをコードする配列に作動可能に結合している請求項１に記載の動 物。 ３．プロモーターがホエー酸性タンパク質プロモーターである請求項２に記載の 動物。 ４．プロモーターがカゼインプロモーターである請求項２に記載の動物。 ５．プロモーターがβ−ラクトグロブリンプロモーターである請求項２に記載の 動物。 ６．プロモーターがα−ラクトアルブミンプロモーターで ある請求項２に記載の動物。 ７．フィブリノーゲンがヒトフィブリノーゲンである請求項１に記載の動物。 ８．フィブリノーゲンが非ヒト動物フィブリノーゲンである請求項１に記載の動 物。 ９．フィブリノーゲンタンパク質がフィブリノーゲンサブユニット鎖ポリペプチ ドを含んでいる請求項１に記載の動物。 １０．フィブリノーゲンタンパク質が改変フィブリノーゲン分子を含んでいる請 求項１に記載の動物。 １１．動物が齧歯動物、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ又はウ マである請求項１に記載の動物。 １２．フィブリノーゲンタンパク質を非フィブリノーゲンタンパク質との融合タ ンパク質として合成する請求項１に記載の動物。 １３．非フィブリノーゲンタンパク質が、ホエー酸性タンパク質、カゼイン、α −ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンからなる群の中から選択された乳 タンパク質である請求項１２に記載の動物。 １４．ａ）Ａα、Ｂβ及びＧγからなる群の中から選択さ れたフィブリノーゲンサブユニット鎖をコードする異種ＤＮＡ配列がゲノム内に 安定的に組み込まれたトランスジェニック非ヒト動物であって、各前記異種ＤＮ Ａが異なるフィブリノーゲンサブユニット鎖ポリペプチドをコードし、この各異 種ＤＮＡ配列が更に、該異種ＤＮＡ配列に作動可能に結合したシス作用発現プロ モーター含有調節配列及びトランスメンブラン分泌シグナルペプチドを含み、該 調節配列が該動物の乳腺で特異的に活性を示し、該シグナルペプチドが該動物の 体液中への発現フィブリノーゲンの分泌を指令し得るトランスジェニック非ヒト 動物を提供し、 ｂ）該体液を採取し、 ｃ）該発現フィブリノーゲンタンパク質を体液から単離するステップを含む、異 種組換えフィブリノーゲンタンパク質の製造方法。 １５．プロモーターがホエー酸性タンパク質プロモーターである請求項１４に記 載の方法。 １６．プロモーターがカゼインプロモーターである請求項１４に記載の方法。 １７．プロモーターがβ−ラクトグロブリンプロモーターである請求項１４に記 載の方法。 １８．プロモーターがα−ラクトグロブリンプロモーターである請求項１４に記 載の方法。 １９．フィブリノーゲンタンパク質を非フィブリノーゲンタンパク質との融合タ ンパク質として合成する請求項１４に記載の方法。 ２０．非フィブリノーゲンタンパク質が、ホエー酸性タンパク質、カゼイン、γ −ラクトアルブミン及びβ−ラクトグロブリンからなる群の中から選択された乳 タンパク質である請求項１９に記載の方法。 ２１．トランスジェニック動物が齧歯動物、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒツジ 、ヤギ、ウシ又はウマである請求項１４に記載の方法。 ２２．フィブリノーゲンタンパク質がヒトフィブリノーゲンである請求項１４に 記載の方法。 ２３．フィブリノーゲンタンパク質が齧歯動物、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタ、ヒ ツジ、ヤギ、ウシ又はウマフィブリノーゲンタンパク質である請求項１４に記載 の動物。 ２４．体液が乳である請求項１４に記載の方法。 ２５．体液が血液である請求項１４に記載の方法。 ２６．体液が尿である請求項１４に記載の方法。 ２７．産生したフィブリノーゲンタンパク質がフィブリノーゲンサブユニット鎖 ポリペプチドである請求項１４に記載の方法。 ２８．フィブリノーゲンタンパク質が改変フィブリノーゲン分子を含んでいる請 求項１４に記載の方法。 ２９．Ａα、Ｂβ、Ｇγサブユニット鎖タンパク質からなる群の中から選択され たフィブリノーゲンサブユニット鎖タンパク質をコードする異種ＤＮＡ配列をゲ ノム内に安定的に組み込んだトランスジェニック非ヒト動物に由来する体液。 ３０．プラスミドｐＵＣＷＡＰ４（ＡＴＣＣ受託番号 ）。 ３１．プラスミドｐＵＣＷＡＰ５（ＡＴＣＣ受託番号 ）。 ３２．プラスミドｐＵＣＷＡＰ５／ＦＩＢ Ａα（ＡＴＣＣ受託番号 ）。 ３３．プラスミドｐＵＣＷＡＰ５／ＦＩＢ Ｂβ１（ＡＴＣＣ受託番号 ） 。 ３４．プラスミドｐＵＣＷＡＰ５／ＦＩＢ Ｇγ１（ＡＴＣＣ受託番号 ） 。 ３５．請求項３２から３４のいずれか一項に記載のプラスミドの中から選択され たプラスミドによって形質転換された原核細胞。