JPH0650966B2 - 組識培養によるメロン苗の増殖方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はメロンの茎頂部から不定胚を作出せしめること
によって、クローン苗を増殖する方法に関する。

（従来の技術） メロンの形質遺伝は複雑であり、育種の目標とする形質
には遺伝的に劣性あるいは量的遺伝の形質が多く、これ
らの形質を複合して固定することは、従来から行われて
いる交配育種では極めて困難と言われている。従って、
雑種や突然変異によって得られる優れた特性を持った品
種を育成することが望まれている。

しかし、突然変異等により得られた植物固体は、栄養増
殖以外に増殖法がなく、栽培を目的とする場合には、迅
速かつ効率的に幼苗を栄養増殖しなければならない。そ
の最も効率的な方法は、組織培養の応用である。

既に、メロンについてはカルスから不定芽に由来する植
物体の再生が報告されている（豊田秀吉，1987：植物組
織培養4(1),8、Suematsu,N.,H.Otsuka,1986：Japan J.Br
eed.,36(suppl.1),22、Bouabdallah,L.,M.Branchard,198
6：Z.Pflanzenzucht 96,82、Naito,T.,M.Sato,1985：Jap
an J.Breed.,35(suppl.2),30）。しかし、上記の方法
は、カルスからシュートを誘導した後、そのシュートを
発根させ植物体を得るという二段階のステップが必要な
ために、大量増殖を行うには効率が悪い。

また、別の方法としては、完熟種子中の子葉と無菌播種
して育成した幼苗の胚軸から不定胚の作出を行う方法が
報告されている(Oridate,T.,K.Oosawa,1986：Japan J.B
reed.,36,424)。しかし、この方法では、通常、優良な
形質或いは目的とする形質を有するクローンの大量増殖
には、突然変異株、優良雑種などの植物体の組織を材料
としなければならないので、種子由来の子葉からの不定
胚の形成が認められたところで、クローン苗の大量増殖
を期待することはできない。

また、特開昭６３−２４８３２０号公報には、茎頂組織
や子葉から液体培養によって体細胞胚を作出する方法が
提案されているが、材料とする茎頂組織から直接作出さ
れる体細胞胚の数は限定されているので、この方法で多
量の植物体を得るのは困難である。

（発明が解決しようとする課題） 上記の如く、従来の方法には、種子から誘導される不定
胚のような材料上の制約、茎頂組織から直接誘導される
体細胞胚のような量的な制限、またカルスからの不定胚
の再分化のような大量増殖の適性の不十分等の欠点が見
られる。従って、本発明は、不定胚を作出しメロンの種
苗を効率良く大量に増殖することのできる新規な増殖法
を提案するものである。

（課題を解決するための手段） 本発明は、メロン栄養体の一部を外植体とし、高濃度に
シュークロースを含有する植物組織培養用培地に置床
し、これを培養することにより不定胚形成カルス(somat
ic embryogenic callus)が見られること、この様にして
得られた不定胚形成カルスは不定胚形成能力を失うこと
なく、遺伝的に安定した状態で継代培養が可能であるこ
と、更にこのカルスをシュークロースの濃度を低下させ
た固体培地で培養することにより多数の不定胚が形成さ
れ、不定胚から簡単に幼苗が得られること等の知見に基
くものである。

即ち、本発明に係るメロン苗の増殖方法は、メロンの茎
頂部を５〜１２％のシュークロース、無機塩類、ビタミ
ン類、及び植物ホルモン類を含有する培地で培養して不
定胚形成能を持つカルスを誘導した後、更に、このカル
ス或いはこのカルスを継代培養して得られたカルスを、
１〜４％のシュークロース、無機塩類、及びビタミン類
を含有する培地に移植して不定胚の発達を促し、メロン
苗を得ることを請求項１の特徴とし、前記カルスから不
定胚を形成させるに際し、培地としてジェランガム固体
培地を用いることを請求項２の特徴とする。

以下、本発明による不定胚の作出、メロンの増殖法につ
き詳細に説明する。

不定胚形成カルスの誘導： メロンの茎頂を適当な濃度の次亞塩素酸ソーダーで殺菌
し、減菌水で洗浄後、実体顕微鏡下で無菌的に茎頂部を
摘出する。また、無菌的に育成したメロンの場合は殺菌
は行わずに茎頂部を同様に摘出する。この茎頂部をシュ
ークロース、無機塩類組成物、ビタミン類および植物ホ
ルモンを含む人工寒天固体培地に置床する。この寒天固
体培地は、シュークロースの濃度を５〜１２％と高濃度
に設定されており、pHは通常５〜６に調整される。ま
た、無機塩類組成物としてはムラシゲ・スクーグ培地、
リンスマイヤー・スクーグ培地などの組成物を規定の濃
度に準じて或いは適宜稀釈する等して用いることができ
る。

本発明の特徴は、このシュークロースの濃度にあるので
あり、通常１〜４％とされている濃度を、本発明におい
ては５〜１２％、更に好ましくは６〜９％に調整する。
４％以下及び１３％以上では、不定胚及び幼植物体の収
率が低い。また、シュークロースに加えて、グルコー
ス、フラクトース、マントース、ガラクトース等の炭水
化物を併用しても良い。

シュークロース以外の培地の成分は、通常の濃度でよ
く、ビタミン類としてはチアミン、ピリドキシン、ニコ
チン酸、ビオチンなどを用い、また植物ホルモンとして
は、インドール酢酸（ＩＡＡ）、インドール酪酸（ＩＢ
Ａ）、２，４−ジクロルフェノキシ酢酸（２，４−
Ｄ）、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸（２，
４，５−Ｔ）、ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）などのオーキ
シン類およびベンジルアデニン（ＢＡ）、カイネチン、
ゼアチンなどのサイトカイニン類を使用することができ
る。これらの植物ホルモンは適宜併用することができ、
特に、２，４−Ｄとベンジルアデニンの併用は好まし
い。

なお、茎頂部の培養を行う温度は、良好な増殖を図るた
めに、20〜30℃とすることが望ましい。

茎頂部は１〜２ヶ月培養すると、淡黄色の柔らかいカル
スとして増殖する。このカルスを実体顕微鏡下で観察す
ると多数の初期不定胚が観察され、通常の完全に脱分化
したカルスとは明らかに異なっている。このようにして
高濃度にシュークロースを含有させた培地から誘導され
た不定胚形成カルスは、上述の組成からなるジェランガ
ムまたは寒天固体培地でその性質を変化させることなく
継代培養することが可能であり、また同組成の液体培地
に接種し20〜200rpmのゆるやかな振盪培養を行うことに
よっても、継代培養および増殖が可能である。

不定胚の形成と個体の再生、苗化： 本発明においては、上記のようにして増殖させた不定胚
形成能を持つカルスを、このカルスを誘導した培地とは
異なる培地に移植して、不定胚を形成せしめる。不定胚
形成のために使用される培地は、シュークロースの濃度
が１〜４％と少ないのが特徴である。

その他の組成は、基本的にカルスを誘導した培地と同じ
であって良い。但し、植物ホルモンについては、既にメ
ロン以外の多くの植物の組織培養で行われているよう
に、不定胚を形成する培地中には、この植物ホルモンを
添加しない方が好ましく、添加する場合にも極めて微量
とし、不定胚形成の後は、やはり植物ホルモンを除いた
培地で培養を継続することが望ましい。この培地は、寒
天培地でも液体培地でも良いが、幼植物の効率的な培養
の面からは、ジェランガム固体培地が最適であって、形
成される不定胚の表面に軟弱さがなく、健全な幼植物が
得られる。

移植されたカルスは、通常の温度条件、照度条件で培養
すると、多数の不定胚が生じ、それに続いて微小な茎葉
体を生じる。適当な条件は、20〜30℃の温度、2,000〜
5,000ルクスの照度である。この状態のままで培養を続
けると、茎葉体が高密度のため生育が悪くなるので、個
々に分割し同様な条件で固体培地上で培養を継続する
と、発根し完全なメロンの植物体となる。液体培地の場
合は、20〜100rpmで振盪培養し不定胚とそれに続く微小
な茎葉体が形成された後、液体培地より取り出し個々に
分割し固体培地上で培養することにより完全な植物体と
することが出来る。この様にして得られた植物体をバー
ミキュライトあるいは育苗用土壌に移植し一般的な方法
で馴化することにより、温室、圃場に植栽可能なメロン
苗を得ることができる。

本発明で増殖可能なメロンは、Cucumis melo Lに属する
ものであって、アールス系、カンタループ系、ハネデュ
ー系を例示することができるが、それに限定されない。

（実施例） 以下、本発明を実施例により具体的に説明する。

［実施例１］ 無菌的に発芽させた温室メロン「南勝アールス」から摘
出した0.2〜0.5mmの茎頂組織10個をシュークロースを７
％と高濃度に含有させ、２，４−Ｄを１ppmと、ベンジ
ルアデニンを０．１ppm含むムラシゲ・スクーグ培地に
置床し、温度２５℃、照度３０００ルクスの連続照射を
２か月間行ったところ、茎頂組織から平均０．６ｇの黄
白色のカルスが誘導された。誘導されたカルスを顕微鏡
下で観察すると多数の初期不定胚が認められた。次に、
このカルスをシュークロースを３％と低濃度に含有さ
せ、且つ植物ホルモンを含まないムラシゲ・スクーグの
ジェランガム固体培地に移植し、２５℃、３０００ルク
スの条件で２０日間培養すると多数の不定胚が生じた。
３０日間培養後、不定胚及び幼植物を組織から分離し、
同組成の培地に移し更に３０〜６０日間培養することに
より２〜４枚の本葉を有する３cm程度の健全な苗を得る
ことが出来た。一茎頂から得られた不定胚数は平均３２
５個、幼植物体数は平均１１１個体であった。

［比較例１］ 比較のために、実施例１において、カルスの誘導培地を
一般に使用されているシュークロース３％とした以外
は、実施例１と全く同様の条件でメロン苗を得た。不定
胚数は１茎頂当たり平均２４個、幼植物体数は平均５個
体であり、シュークロース７％で誘導されたカルスに比
較し著しく低かった。

［実施例２及び３］ 実施例１において、カルスを誘導する培地のシュークロ
ースの濃度を５％及び９％とした以外は全く同様にし
て、メロン苗を得た。シュークロース５％のときは不定
胚数が１茎頂当たり平均１６２個、幼植物体数は平均３
６個体であり、シュークロース９％のときは不定胚数が
平均１８２個、及び幼植物体数が平均４８個体であっ
た。

［比較例２］ 実施例２において、カルスを誘導する培地のシュークロ
ースを１５％とした以外は全く同様にして培養を行った
ところ、誘導されたカルスは極めて微量で実験に適さな
かった。

［実施例４］ 実施例１において、カルスを誘導する培地の組成とし
て、シュークロースを１１％、２，４−Ｄを０．２pp
m、ベンジルアデニンを０．１ppm含むムラシゲ・スクー
グ培地を使用した以外は全く同様にして、メロン苗を得
た。不定胚数は１茎頂当たり平均８５個、幼植物体数は
平均３６個体であった。

［実施例５］ 実施例１と同様に、シュークロース濃度７％の培地で誘
導した不定胚形成カルスを、継代培養した。同一培地に
２か月ごとに、増殖したカルスから0.3gをとって植え継
ぐことにより継代培養を行った。カルスの増殖率は生鮮
重量比で10.4倍であった。継代培養を５回行った不定胚
形成カルスを、植物ホルモンを含まずシュークロース濃
度３％のムラシゲ・スクーグのジェランガム固体培地で
６０日間培養した結果、カルス１ｇ当たり２２００個の
不定胚と５４０個体の幼植物が得られた。この実施例か
ら、シュークロースを７％と高濃度に調整した培地で誘
導したカルスは、不定胚形成能を消失することなく継代
培養が可能であることが分る。

［実施例６］ 実施例５において、シュークロース７％の培地でカルス
の継代培養を４回行った後、５回目の継代培養をシュー
クロース３％の培地で行った以外は、同様にした。結果
は、カルス１ｇ当たり２０８０個の不定胚、９２０個体
の幼植物が得られ、極めて優秀であった。

［比較例３］ 比較のために、実施例５においてシュークロース７％の
培地に代えて、シュークロース３％の培地を使用して、
実施例５と同様にして継代培養を試みたところ、２回の
継代培養で不定胚形成能は消失してしまった。

［実施例７］ 実施例１と同様にシュークロース７％の培地で誘導した
不定胚形成カルスを、液体培養により継代培養した。方
法としては、先ずシュークロースを７％、２，４−Ｄを
２ppm、ベンジルアデニンを０．１ppm含むムラシゲ・ス
クーグ液体培地で、不定胚形成カルスの細胞懸濁液を調
製した。この細胞懸濁液を篩分することにより125〜100
0μｍの大きさのカルス塊を集め、その0.4gを細胞懸濁
液を調製した培地と同組成の培地20mlに接種し暗黒下、
25℃、60rpmで３０日間振盪培養した。増殖した細胞を
同様に篩分、125〜1000μｍの細胞1gを得、その0.6gを1
00mlの同組成の培地に接種し培養を繰り返した。３０日
間培養後篩分し、250〜1000μｍの大きさの細胞塊1.72g
を得た。

次に、得られた細胞塊0.1gをとり、シュークロース１．
５％で植物ホルモンを含まない１／２稀釈ムラシゲ・ス
クーグの寒天培地に置床し、２５℃、３０００ルクスの
条件で６０日間培養することによりカルス１ｇ当たり不
定胚３２０個と５０個体の幼植物を得ることができ、液
体培養によっても不定胚形成能を消失することなく継代
培養が可能であることが確認された。

［実施例８］ 実施例７において、液体培養によって得られた細胞塊の
培養に際して、寒天の固体培地の代わりにジェランガム
の固体培地を用いて同様な条件で不定胚を発生させたと
ころ、６０日間の培養でカルス１ｇ当たり不定胚２８６
０個と８７０個体の幼植物体が得られた。不定胚の発生
には、ジェランガムの固体培地の使用が効果的であるこ
とが明らかになった。

（発明の効果） 本発明の方法によれば、培地のシュークロースの濃度を
調整するのみで、極めて効率良くメロンのクローン苗を
増殖することができる。特に、本発明は、メロンの茎頂
部由来の不定胚形成カルスについて、簡単な操作で継代
培養することを可能にしたので、クローン苗の大量増殖
が実行可能になった。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】メロンの茎頂部を、シュークロースが５〜
   １２％であって、無機塩類、ビタミン類、及び植物ホル
   モン類を含有する培地で培養して不定胚形成能を持つカ
   ルスを誘導した後、このカルス或いはこのカルスを継代
   培養して得られたカルスを、シュークロースが１〜４％
   であって、無機塩類、及びビタミン類を含有する培地に
   移植して不定胚の発達を促し、苗を得ることを特徴とす
   る組織培養によるメロン苗の増殖方法。
2. 【請求項２】前記カルスから不定胚を形成させるに際
   し、培地としてジェランガム固体培地を用いることを特
   徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法。