JPH06509701A - ヒト結腸直腸癌において突然変異を起こしている遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト結腸直腸癌において突然変異を起こしている遺伝子技術分野 本発明は癌の診断学および治療学に関する。さらに具体的には、本発明は腫瘍組 織中の野生型ＭＣＣ遺伝子の変更の検出に関する。さらに、ＭＣＣ遺伝子産物の 機能を回復させるための治療方法に関する。

背景技術 クヌーソン（Ｋｎｕｄｓｏｎ　）の腫瘍形成モデル（Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａ ｒｃｈ、ｖｏｌ、４５．ｐ、１４８２゜１９８５）によれば、全ての正常な細胞 には癌抑制遺伝子が存在し、これらの遺伝子が突然変異により機能しなくなると 新生物発生が起こる。網膜芽腫および結腸直腸癌のケースにおいてこのモデルに 関する証拠が見出だされている。こうした腫瘍に関与する抑制遺伝子、ＲＢおよ びｐ５３およびＤＣＣは、研究された腫瘍の多くのケースで欠失あるいは変更さ れていることが見出たされた（ハンセン（Ｈａｎｓｅｎ）とカベ＝　−（Ｃａｖ ｅｎｅｅ）　、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｖｏｌ、４７．ｐｐ、５５１ ８−５５２７（１９８７）@； ベーカー（Ｂａｋｅｒ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、２４４．ｐ、２１７（１ ９８９）　；フィアソン（Ｆｅａｒｓｏｎ）　゛ら、５ｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、 ２４７．ｐ、４９（１９９０））。

腫瘍の原因を完全に理解するためには、腫瘍形成過程に機能する他の抑制遺伝子 の同定が必要であろう。これらの抑制遺伝子のうちで顕著なものは５ｑ２１に位 置すると予想される遺伝子（群）である。細胞遺伝学的研究（ヘレラ（Ｈｅｒｒ ｅｒａ）ら、Ａｍ　Ｊ、Ｍｅｄ、Ｇｅｎｅｔ、、ｖｏｌ、２５．ｐｇ、４７３（ １９８６））および遺伝子連鎖の研究（レッパート（Ｌｅｐｐｅｒｔ）ら、５ｃ ｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、２３８．ｐｇ、　１４１１（１９８７）　；ボド７−　（ Ｂｏｄｍｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ、３２８．ｐｇ、６１４（１９８７） ）によって、この染色体領域には家族性腺腫ポリポシス（ＦＡＰ）の原因となる 遺伝子が存在することが示されている。ＦＡＰは常染色体優性遺伝病で、この病 気に冒された個体には数百から数千もの腺腫ポリープができ、そのうちいくつか は悪性に進行する。さらに、ＦＡＰを有しない患者の腺腫（フォーゲルシュタイ ン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）ら、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ、Ｍｅｄ、　、ｖｏｌ、３１ ９．ｐｇ。

５２５（１９８８））および癌腫（フォーゲルシュタインら、Ｎ、Ｅｎｇｌ、Ｊ 、Ｍｅｄ、　、ｖｏｌ、３１９．ｐｇ、５２５（１９８８）　：ソロモン（Ｓｏ ｌｏｍｏｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ、３２８．ｐｇ、６１６（１９８７）　 ；ササキ（Ｓａｓａｋｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｖｏｌ、４９ ．ｐｇ、４４０２（１９８９）：デラッター（Ｄｅｌａｔｔｒｅ）ら几ａｎｃｅ ｔ、ｖｏ１．２．ｐｇ、３５３（１９８９）；およびアシュトノーリカルド（Ａ ｓｈｔｏｎ−Ｒｉｃｋａｒｄｔ）ら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、ｖｏｌ、４．ｐｇ、１ １６９（＋９８９））からも、この染色体領域がしばしば欠失している。よって 、染色体５ｑ２１上の予想される抑制遺伝子は、散発性および家族性の双方の腫 瘍の結腸直腸腫瘍形成の初期段階に機能していると考えられる。しかしながら、 抑制遺伝子の候補となるものは５ｑ２１上には同定されていない。従ってこの染 色体領域を研究してこのような遺伝子を同定し、そのような遺伝子のいづれか腫 瘍形成過程に関わっているかを決定することは、当該技術分野において必要であ る。

発明の概要 本発明の目的は、ヒトの新生物組織を診断し予知する方法を提供することである 。

本発明の別の目的は、野生型ＭＣＣ遺伝子機能を失っている細胞に該機能を付！ フする方法を提供することである。

本発明のまた別の目的は、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ　ＣＲ）によってＭＣＣ対 立遺伝子のヌクレオチド配列を決定するキットを提供することである。

本発明のさらに別の目的は、ヒトＭＣＣ遺伝子の突然変異を検出するための核酸 プローブを提供することである。

本発明の別の目的は、癌になりやすい遺伝的素因を検出する方法を提供すること である。

本発明のさらに別の目的は、ＭＣＣ遺伝子産物をコードするｃＤＮＡ分子を提供 することである。

本発明のまた別の目的は、ヒトＭＣＣ蛋白質の調製品を提供することである。

本発明のこれらおよび他の目的は、下記に記載される１つまたは複数の態様によ って達成される。本発明の一つの態様では、ヒトから組織を単離し、そして該組 織の野生型ｋｉｃｃ遺伝子またはその発現産物の変更を検出し、その変更をその 組織の新生物化の指標とする１二とから成る、ヒト新生物組織を診断または予知 するノコ法か提（Ｊ（される。

本発明の別の態様では、野生型ＭＣＣ遺伝子機能を失っている細胞に該遺伝子を 導入してその細胞内で該野生型遺伝子を発現させる：ことから成る、ＭＣＣ遺伝 子の突然変異により野生型ＭＣＣ遺伝子機能を失っている細胞に該遺伝子機能を 付与する方法が提供される。

別の態様では、野生型ＭＣＣ遺伝子機能を失っている細胞に、該遺伝子のうち、 該細胞の非新生物性増殖に必要なＭＣＣ蛋白質部分をコードする部分を導入して その細胞内で該部分を発現させる：ことから成る、細胞に野生型ＭＣＣ遺伝子機 能を付与する方法が提供される。合成ペプチド又は薬剤を用いてＭＣＣ発現が変 更した細胞内でＭＣＣの機能を模倣することもできる。

また別の態様では、ポリメラーゼ連鎖反応によりＭＣＣ遺伝子のヌクレオチド配 列を決定するための、一対の一本鎖プライマーが提供される。該一対の一本鎖Ｄ ＮＡプライマーの配列は染色体５ｑのバンド２１に由来し、該一対のプライマー はＭＣＣ遺伝子のコート配列の合成を可能とするものである。

本発明のさらに別の態様では、ヒト野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列に相補的な 核酸プローブか提供される。このプローブは突然変異ＭＣＣ遺伝子とミスマツチ を形成することができ、該ミスマツチは酵素的若しくは化学的切断または電気泳 動移動度の変化によって検出することができる。

本発明の別の態様では、ヒト新生物組織の存在を検出する方法が提供される。

本方法は、ヒトから体の組織サンプルを単離し；該サンプルの野生型ＭＣＣ遺伝 子配列または野生型ＭＣＣ発現産物の変更を検出し、該変更をヒト新生物組織の 存在の（旨標とすることから成る。

本発明のまた別の態様では、血液および胎児組織から成るグループから選択され るヒトサンプルを単離し、そのサンプルの野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列また はその発現産物の変更を検出し、該変更を癌になりやすい遺伝的素因の指標とす る。ことから成る、ヒトの癌になりやすい遺伝的素因を検出する方法が提供され る。

さらに別の態様では、ＭＣＣ遺伝子のコート配列を含むｃＤＮＡ分子が提供され る。

さらにまた別の態様では、他のヒト蛋白質を実質的に含まないヒトＭＣＣ蛋白質 の調製品か提供される。その蛋白質のアミノ酸配列はＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に 示されている。

本発明は、今まで未知の遺伝子であったＭＣＣ遺伝子が、実際に、染色体５ｑ２ １−Ｌの突然変異による変更の標的であること、およびこれらの変更が腫瘍形成 過程に関与しているという情報を当該分野に提供する。この情報によって、特定 の組織の新生物状態、または個体中の癌になりゃすい素因を評価するために行わ れる非常に特異的な分析が可能となる。

図面の簡単な説明 図１は、体細胞変化を示す腫瘍Ｔ１４のサザンブロソト分析を示す。レーン１お よび２は患者Ｔ１４の正常組織から単離されたＤＮＡ５μｇを含む；レーン３お よび４はＴ１４結腸癌から単離されたＤＮＡ５μｇを含む。レーンｌおよび３は ＥｃｏＲＩで切断し；レーン２および４はＰｓｔＴで切断した。パネルＡのサザ ンプロットはコスミド５．７１のサブクローン（５，７ｌ−３）にハイブリダイ ズさせた。パネルＢ（３時間感光）およびパネルＣ（２０時間感光）は、Ｔ１４ 腫瘍からクローン化した異常な１ｌｋｂ断片でハイブリダイズした同しサザンプ ロットを示す。短剣符はＴ１４の新規の変更を示す。右側に示されたサイズマー カーは、ＨｉｎｄｌｌＴで切断されたラムダファージＤＮＡおよびＨａｅｌｌｌ で切断されたファイＸファージＤＮＡを表す。

図２は、５．７１コスミトから予想されるエクソンの配列を示す。パネルＡは、 ５．７１−５エクソンおよびそれに対応するラットのエクソンを示す。パネルＢ は５．７１−３エクソンおよびそれに対応するラットのエクソンを示す。ラット の配列は、ヒトの配列と異なる部分のみ記しである。小文字はエクソンを挟むイ ントロンを意味する。ＰＣＲに用いるプライマーは矢印によって表されている。

プライマーＰ２およびＰ４は、反対向きで、示した配列とは相補的配列を有する 。

図３は、ＭＣＣｃＤＮＡの塩基配列および予想されるアミノ酸配列を示す。

示された配列は７つのオーバーラツプしたクローンがらの合成配列を表す。

図４は、ＰＣＲ−ＲＮａｓｅプロテクション分析を示す。この分析法はＰＣＲ産 物に対して行われ、生じた切断産物を変性ゲル電気泳動によって分離した。パネ ルＡは、ヌクレオチド２３０５−２４０５をコードするエクソンの分析結果を示 す。レーン１．２および３は、いがなる変化も示さない３つの異なる腫瘍がら単 離されたＤＮＡについて得られた結果を示す。レーンＴおよびＮは、それぞれ、 患者９１の腫瘍または正常細胞から単離されたＤＮＡについて得られた結果を示 す。パネルＢは、ヌクレオチド１６７９−１８６２をコードするエクソンの分析 結果を示す。レーンＴおよびＮは、それぞれ、患者３５の腫瘍または正常細胞か ら単離されたＤＮＡについて得られた結果を示す。

図５は、ＭＣＣと、ヒトｍ３ムス力リン性アセチルコリン受容体（ｍＡＣｈＲ） のＧ蛋白質活性化領域との比較を示す。配列を結ぶ実線は同一アミノ酸を示し； 破線は類似アミノ酸を示す。ドメインＡは、欠失するとＧ蛋白質の反応性を変え る１０アミノ酸領域を表す。ドメインＢは、ｍＡＣｈＲ−Ｇ蛋白質共役の持具性 を媒介できる９アミノ酸を表す。

発明の詳細な説明 本発明で、染色体５ｑ上の今まで未知の遺伝子（本明細書中ではＭＣＣ（Ｍｕｔ ａｔｅｄ　ｉｎ　Ｃｏ１ｏｒｅｃｔａｌ　Ｃａｎｃｅｒ）遺伝子と命名）におい て、腫瘍形成に関連する変異が生しることか発見された。あるタイプの癌で染色 体５ｑ上の対立遺伝子の欠失がよく見られることは以前から知られていたが、こ うした欠失の標的遺伝子がＭＣＣ遺伝子であることは知られていなかった。さら に、ＭＣＣ遺伝子における別のタイプの突然変異か癌と関連していることも知ら れてぃながった。ＭＣＣ遺伝子の突然変異は、挿入や欠失などの大きな再編成を 含むことがある。点突然変異も観察されている。

本発明の診断学的および予防学的方法によれば、野生型遺伝子の変更が検出され る。本発明の”野生型遺伝子の変更”とは、欠失を含めたあらゆる形の突然変異 を含んでいる。変更は、挿入、逆位および欠失などの再編成、または点突然変異 によるものでもよい。欠失は遺伝子全体または遺伝子の一部分のみであってもよ い。一方の対立遺伝子のみが変異していても、新生物化状態の初期であるとされ る。しかし、対立遺伝子の両方か変異した場合、新生物化状態の後期であるとさ れる。従ってＭＣＣ突然変異を見出だすことは、診断学的情報および予防学的情 報の両方を提供する。ＭＣＣ対立遺伝子が欠失していないもの（例えば、姉妹染 色体」二のＭＣＣ遺伝子が、ＭＣＣ欠損を持つ染色体上に転座したもの）は、挿 入、小さな欠失および点突然変異などの他の突然変異に対してスクリーニングす ることができる。腫瘍組織にみつかる突然変異の多くが、ＭＣＣ遺伝子産物の発 現を減少させるものであろうと考えられている。しかし、機能を失った遺伝子産 物を生じる変異もやはり癌状態を引き起こすであろう。点突然変異は、遺伝子の プロモーターなどの制御領域に生じることもあり、これによりｍＲＮＡの発現が 消失するか、または減少する。点突然変異はまた、適切なＲＮＡプロセッシング を阻害してＭＣＣ遺伝子産物の発現を損なわせることもある。

組織中の野生型ＭＣＣ遺伝子の変更を検出するためには、周囲の正常な組織を含 まない組織を単離することが有効である。組織調製品の腫瘍細胞を濃縮する方法 は当該技術分野において知られている。例えば、組織はパラフィンまたはクリオ スラット切片から単離でできる。癌細胞はフローサイトメトリーによっても正常 細胞から分離できる。腫瘍を他の細胞から分離する他の技術同様、これらの技術 は当該技術分野でよく知られている。腫瘍組織に正常細胞が多く混入していると 、それたけ突然変異の検出か困難となる。

点突然変異の検出は、腫瘍組織に存在する（両）対立遺伝子を分子クローン化し 、当該分野でよく知られた技術を用いてその塩基配列を決定することによって達 成できる。また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて、腫瘍組織のゲソム ＤＮＡｇ製品から直接、遺伝子配列を増幅することもてきる。それから、増幅さ れた配列のＤＮＡ配列を決定できる。ポリメラーゼ連鎖反応自体は、当該分野に おいてよく知られている。例えば、サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、 ｖｏｌ、２３９．ｐ４８７、＋９８８．米国特許第４．６８３，２０３号；およ び米国特許第４，６８３．１９５号を参照していたたきたい。遺伝子を増幅させ るために使われる具体的なプライマーについては、後でより詳しく論する。当該 分野で知られているりガーセ連鎖反応を用いても、ＭＣＣ配列を増幅することか できる。ウー（Ｗｕ）ら、　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、ｖｏｌ、４．ｐｐ、５６０−５ ６９（１９８９）を参照していたたきたい。さらに、対立遺伝子に特異的なＰＣ Ｒとして知られている技術を利用することができる。（ルアノ（Ｒｕａｎｏ）と キッド（Ｋｉｄｄ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｖｏｌ 、ｌ？、ｐ、８３９２．＋９８９．）この方法によると、３′末端で特定のＮＩ ＣＣ，突然変異にハイブリダイズするプライマーが用いられる。この特定のＭＣ Ｃ突然変異が存在しなければ、増幅産物は観察されない。遺伝子の挿入および欠 失も、クローン化、塩基配列決定および増幅によって検出できる。さらに、遺伝 子およびその周囲のマーカー遺伝子に対する制限断片長条型（ＲＦＬＰ）プロー ブを用いて、対立遺伝子の変更または多裂断片中の挿入を調べることができる。

当該分野で知られている挿入および欠失を検出する他の技術を用いることもてき る。

野生型遺伝子の変更は、その遺伝子の野生型発現産物の変更に基づいて検出する こともできる。そのような発現産物には、蛋白質産物そのものだけでなくｍＲＮ Ａも含まれる。これらの産物の配列をＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１および２に示す。

点突然変異は、ｍＲＮＡを増幅し塩基配列を決定するが、またはｍＲＮＡがら作 られるｃＤＮＡの分子クローン化によって検出することができる。クローン化し たｃＤＮＡの配列は、当該分野で知られるＤＮＡシークエンス技術を用いて決定 することができる。ｃＤＮＡはポリメラーゼ連鎖反応によっても配列決定できる が、これについては後により詳しく述べる。

本発明においてミスマツチとは、１００％相同ではないもののハイブリダイズし た核酸二重鎖のことである。そのような不完全な相同性は、欠失、挿入、逆位、 置換またはフレームシフト突然変異による。ミスマツチの検出は、遺伝子または そのｍＲＮＡ産物中の点突然変異の検出に用いることができる。これらの技術は 塩基配列決定に比べると感度が低いが、多くの腫瘍サンプルに対してより簡単に 行える。ミスマツチ切断技術の例として、ＲＮａｓｅプロテクション法があるが 、これについては、ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、１ＩＳＡＪｏ１．８２．ｐ７５７５．１９８５およびメイヤーズ （Ｍｅｙｅｒｓ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、Ｖｏｌ、２３０．ｐ、１２４２，１９８ ５に詳しく記載されている。本発明においてこの方法を実際に行う場合には、ヒ ト野生型遺伝子のコード配列に相補的なラベルしたりボブローブを用いる。リボ プローブと腫瘍組織から単離されたｍＲＮＡまたはＤＮＡとを共にアニール（ハ イブリダイズ）させ、次いて、ＲＮＡ二重鎖構造中のミスマツチを検出できる酵 素ＲＮａｓｅＡを用いて消化する。ＲＮａｓｅ　Ａによってミスマツチが検出さ れると、ミスマツチ部位か切断される。従って、アニールさせたＲＮＡ１製品を 電気泳動ゲルマトリクス−１−て分離すると、リボプローブとｍＲＮＡまたはＤ ＮＡとの二重ｌＲＮＡの全長よりも小さいＲＮＡ産物が観察される。リボプロー ブはＭＣＣｍＲＮＡまたは遺伝子の全長である必要はなく、これらの一部であっ てもよい。

リボプローブがＭＣＣｍＲＮＡまたは遺伝子の一部しか含んでいない場合は、こ うしたプローブを多数用いて、ミスマツチに関してｍＲＮＡ全体の配列を検索す ることが望ましいであろう。

同様に、酵素的または化学的切断によってミスマツチを検出するのに、ＤＮＡプ ローブを用いてもよい。例えば、コツトン（Ｃｏｔｔｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａ ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、ｖｏｌ、８５．４３９７，１９８８；および シエンク（Ｓｈｅｎｋ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、 ｖｏ１７２、ｐ、９８９．１９７５を参照していたたきたい。また、マツチした 二重鎖とミスマツチした二重鎖の電気泳動度の違いによってミスマツチを検出す ることもできる。例えば、カリニａ　（Ｃａｒｉｅｌ　ｌｏ）　、）Ｉｕｍａｎ 　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　、ｖｏｌ　、　４２　、　ｐ、　７２６　、１９８８を参 ■■■■■ だきたい。リボプローブの場合でもＤＮＡプローブの場合でも、突然変異を含ん でいるかもしれない細胞性のｍＲＮＡまたはＤＮＡをＰＣＲ（下記参照）を用い てハイブリダイゼーションの前に増幅させることができる。ＭＣＣ遺伝子のＤＮ Ａの変化は、特に欠失や挿入のような大きな再編成の場合には、サザンハイプリ ダイゼーションを用いて検出することもできる。

ポリメラーゼ連鎖反応を用いて既に増幅した腫瘍組織由来のＭＣＣ遺伝子のＤＮ Ａ配列は、対立遺伝子特異的なプローブを用いてスクリーニングすることもでき る。これらのプローブは核酸オリゴマーで、各々既知の突然変異をもつＭＣＣ遺 伝子の配列の領域を含んでいる。例えば、一つのオリゴマーは長さが３０ヌクレ オチドで、ＭＣＣ遺伝子配列の一部に相当している。このような一群の対立遺伝 子特異的なプローブを用いて、ＰＣＲ増幅産物をスクリーニングし、ＭＣＣ遺伝 子において既に同定されている突然変異の存在を同定できる。対立遺伝子特異的 なプローブと増幅したＭＣＣ配列のハイブリダイゼーションは、例えば、ナイロ ンフィルター上で行うことかできる。強いハイブリダイゼーション条件下で特定 のプローブとハイブリダイズすることは、その腫瘍組織に、用いた対立遺伝子特 異的なプローブと同し突然変異が存在することを示している。

ＭＣＣｍＲＮＡの発現の変更は、当該分野で知られているとのような技術によっ ても検出することかできる。これらには、ノザンブロソト分析、ＰＣＲ増幅およ びＲＮａｓｅプロテクション法が含まれる。】ηＲＮＡ発現の減少は野生型ＭＣ Ｃ遺伝子の変更を示している。

野生型ＭＣＣ遺伝子の変更は、野生型ＭＣＣ蛋白質の変更に関してスクリーニン グすることによっても検出することができる。例えば、ＭＣＣと免疫反応するモ ノクローナル抗体を用いて組織のスクリーニングをすることができる。用いた抗 体と反応する抗原がないことは、ＭＣＣの突然変異を示していると考えられる。

突然変異対立遺伝子の産物に特異的な抗体を用いて変異ＭＣＣ遺伝子産物を検出 することもできるだろう。このような免疫学的分析は、当該技術分野で知られて いる適当な方法で行うことができよう。これらには、ウェスタンプロット、免疫 組織化学的分析およびＥｉＳＡ分析が含まれる。変更したＭＣＣ蛋白質を検出す るいかなる方法も、野生型ＭＣＣ遺伝子の変更の検出に利用することができる。

蛋白質結合決定法などの機能的な分析法を用いることもできる。例えば、ＭＣＣ 蛋白質はＧ蛋白質に結合すると考えられている。よって、そのＧ蛋白質に結合す る相手に関する分析法を適用することもできる。さらに、ＭＣＣの生化学的機能 を検出する分析法を用いることもできる。ＭＣＣはリン脂質代謝に関与している と考えられている。よって、リン脂質代謝経路に関与する酵素的産物の分析法を 用いてＭＣＣ活性を決定することができる。変異ＭＣＣ遺伝子産物の発見は、野 生型ＭＣＣ遺伝子の変更を示す。

突然変異遺伝子またはその遺伝子産物は、血清、大便、尿および唾液などの他の 人体サンプルからも検出することができる。上記の組織中の変異ＭＣＣ遺伝子ま たは遺伝子産物の検出に用いたのと同じ技術を他の人体サンプルに適用すること ができる。癌細胞は腫瘍から剥かれ落ち、このような人体サンプル中に現れる。

さらに、ＭＣＣ遺伝子産物そのものが細胞外空間に分泌され、癌細胞がなくても これらの人体サンプル中に見出たされるかもしれない。そのような人体サンプル をスクリーニングすることによって、多くの種類の癌に対して簡単な初期診断を 行うことが可能となる。さらに、こうした人体サンプルを変異ＭＣＣ遺伝子また は遺伝子産物に関して試験することによって、化学療法または放射線治療の経過 をより簡単にモニターすることかできる。

本発明の診断方法は、ＭＣＣが腫瘍形成に関与しているあらゆる腫瘍に対して応 用することかできる。染色体アーム５ｑの欠失は、白血病およびリンパ腫の他に 肺癌、乳癌、結腸癌、直腸癌、膀胱癌、肝臓癌、肉腫、胃癌および前立腺癌にお いても観察されている。よって、これらの癌にはＭＣＣが関与していると考えら れる。本発明の診断方法は、臨床医が適切な治療方法を決定するのに有用である 。例えば、ＭＣＣ対立遺伝子の両方か変更している腫瘍に対しては、ＭＣＣ対立 遺伝子の片方のみが変更している腫瘍に対するよりも厳しい治療法を施す必要か ある。

本発明のプライマーの対は、ポリメラーゼ連鎖反応を用いたＭＣＣ遺伝子の塩基 配列決定に有用である。一対の一本鎖ＤＮＡプライマーは、染色体５ｑ上のＭＣ Ｃ遺伝子内もしくはその周囲の配列にアニールし、ＭＣＣ遺伝子そのもののＤＮ Ａ合成の増幅を引き起こすことかできる。これらのプライマーの完全なセットに よって、ＭＣＣ遺伝子のコート配列、即ち、エクソンのヌクレオチドの全てを合 成することかできる。プライマーのセットは、イントロンとエクソンの両方を合 成できるものか望ましい。対立遺伝子特異的なプライマーを用いることもできる 。このようなプライマーは特定のＭＣＣ突然変異対立遺伝子にのみアニールし、 従って、その突然変異対立遺伝子か存在するもののみを鋳型として増幅する。

増幅された配列の以降のクローン化を容易にするために、プライマーの５′末端 に制限酵素部位の配列を持たせてもよい。よって、プライマーの全てのヌクレオ チドは、制限酵素部位の形成に必要な数ヌクレオチドを除き、ＭＣＣの配列また はＭＣＣに隣接する配列に由来する。このような酵素および部位は当該分野でよ く知られている、プライマー自身は、当該技術分野でよく知られた技術を用いて 合成することかできる。一般的には、市販されている合成機を用いてプライマー を合成することができる。図３に示すＭＣＣオープンリーディングフレームの配 列に基ついて特定のプライマーを設計することは、当業者にとって十分できるこ とである。

本発明によりＬｌｊ、（１１される核酸プローブは様々な用途かある。これらの プローブは、既に記載した点突然変異を検出するための、ゲノムＤＮＡに対する サザンハイ７リダイセー／ヨンおよびＲ＼ａｓｅプロテクション法に用いること かできる。これらのプローブはＰＣＲ増幅産物の検出に用いることができる。こ れらはまた、他の技術を用いたＭＣＣ遺伝子またはｍＲＮＡに関するミスマツチ の検出にも用いることができる。ミスマツチの検出には、酵素（例えばＳ１ヌク レアーゼ）、化学物質（例えば、ヒドロキシルアミン、四酸化オスミウムおよび ピペリジン）、または全体にマツチしたハイブリッドに対するミスマツチハイブ リッドの電気泳動度の変化のいづれを用いてもよい。これらの技術は当該分野に おいて知られている。コツトン、上記、シエンク、上記、メイヤーズ、上記、ウ ィンター、上記、およびツバツク（Ｎｏｖａｃｋ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ、１ＪＳＡ、ｖｏｌ、８３．ｐ、５８６．１９８６を参照してい ただきたい。イントロンに対するプローブも企図されているが、一般的に、プロ ーブはＭＣＣ遺伝子のコード配列に相補的である。核酸プローブの完全なセット を用いて、野生型ＭＣＣ遺伝子の変更を検出するキットを構成することができる 。このキットによってＭＣＣ遺伝子全体にハイブリダイズさせることができる。

プローブは互いにオーバーラツプまたは隣接していてもよい。

ｍＲＮＡのミスマツチの検出にリボプローブを用いる場合、そのリボプローブは ヒト野生型ＭＣＣ遺伝子のｍＲＮＡに相補的である。よってリボプローブは、セ ンス鎖と反対方向なのでＭＣＣ蛋白質をコードしていないアンチセンスプローブ である。リボプローブは一般的に、当該分野で知られている方法によって、放射 活性物質、発色物質、または蛍光物質でラベルされる。ＤＮＡのミスマツチの検 出にリボプローブを用いる場合、それはセンス、アンチセンスいづれの方向でも よい。同様に、ＤＮＡプローブを用いてもミスマツチを検出することができる核 酸プローブはＭＣＣ遺伝子の突然変異対立遺伝子に相補的であってもよい。

これらのプローブは、ミスマツチよりもハイブリダイゼーションに基づいて、他 の患者に同様の突然変異が生じているかを検出するのに有用である。これらにつ いては先に論じており、対立遺伝子特異的プローブと命名しである。上述のよう に、ＭＣＣプローブを、ゲノムＤＮＡに対するサザンハイブリダイゼーションに 用いて、欠失および挿入などの大きな染色体変化を検出することもできる。この プローブは、腫瘍および正常組織からＭＣＣ遺伝子のｃＤＮΔＤＮＡプローブす るのにも用いることができる。さらに、このプローブを用いて、組織中のＭＣＣ ｍＲＮＡを検出し、野生型ＭＣＣ遺伝子の変更によって発現が低下しているがを 判断することもできる。図３に示すＭＣＣコード配列（ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ：１ ）に基づいて特定のプローブを設計することは、当業者にとって十分できること である。

本発明によれば、突然変異ＭＣＣ対立遺伝子を持つ細胞に野生型ＭＣＣの機能を 与える方法も提供される。このような機能を付与することによって、受容細胞の 新生物増殖が抑圧される。野生型ＭＣＣ遺伝子または遺伝子の一部をベクターに 繋いで染色体外に止まる形で細胞に導入することができる。そのような状態では 、この遺伝子は染色体外の位置から細胞によって発現されるであろう。突然変異 ＭＣＣ対立遺伝子を持つ細胞に遺伝子の一部を導入し発現させる場合、遺伝子の この部分はＭＣＣ蛋白質のうち細胞の非新生物的増殖に必要な部分をコードして いるべきである。野生型ＭＣＣ遺伝子またはその一部が、細胞内に存在する内在 性の突然変異ＭＣＣ遺伝子と組み換えを起こすような形で、突然変異細胞に導入 されるほうかより好適である。そのような組み換えには、ＭＣＣ遺伝子の突然変 異を修正する二重組み換え事象が必要とされる。組み換え用の遺伝子導入ベクタ ーも染色体外に維持される遺伝子導入ベクターも当該分野において知られており 、適当なベクターを用いることができる。例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウ ム共沈法およびウィルスによる形質導入などは当該分野において知られており、 どの方法を選択するかは日常的作業の範囲である。野生型ＭＣＣ遺伝子で形質る ためのモデル系として利用することができる。

ＭＣＣ活性を持つポリペプチドを、ＭＣＣ遺伝子か突然変異を起こしたか、また は失われてしまった細胞に適用することかできる。ＭＣＣ蛋白質の配列は図３（ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２）に開示されている。例えば、既知の発現ベクターを用 いて、ｃＤＮＡ配列を細菌内で発現させることによって、蛋白質を生産すること ができる。また、脳なとのＭＣＣを生産している哺乳動物細胞からＭＣＣを抽出 することかできる。さらに、合成化学の技術を適用してＭＣＣ蛋白質を合成する ことも可能である。このような技術のいづれによっても、本発明の図３に示す配 列（ＳＥＱ　Ｉ［ＮＯ：２）を有するＭＣＣ遺伝子産物を含む調製品を提供する ことができる。この調製品は他のヒト蛋白質を実質的に含まない。これは、微生 物中で、若しくはｉｎ　ｖｉｔｒｏで合成することによって最も容易に達成され る。

活性ＭＣＣ分子は、例えば、マイクロインジェクションまたはリポソームの利用 によって細胞に導入することかできる。また、このような活性分子を能動的にま たは拡散によって細胞に取り込ませることができる。ＭＣＣ遺伝子産物を細胞外 に適用するたけで、腫瘍の増殖に影響を与えるのに十分である場合もある。ＭＣ Ｃ活性を有する分子を付与すると、新生物状態が部分的に改善される。ＭＣＣ活 性を有する他の分子、例えば、ペプチド、薬剤または有機化合物などもそのよう な改善効果を与えるのに用いることができる。

ヒトＭＣＣ蛋白質と免疫反応性の抗体の調製品も本発明により提供される。この 抗体は、ポリクローナルでもモノクローナル抗体でもよく、天然ＭＣＣ蛋白質、 ＭＣＣ融合蛋白質または突然変異ＭＣＣ蛋白質に対して作製することができる。

抗体は、ＭＣＣエピトープ、好適には他のヒト蛋白質に存在しないエピトープに 免疫反応するべきである。本発明の好適な態様においては、抗体は、ポリアクリ ルアミドゲルのウェスタンまたはイムノプロットのＭＣＣ蛋白質と反応するほか に、溶液からＭＣＣ蛋白質を免疫沈降させる。別の好適な態様においては、抗体 は、免疫組織化学的技術を用いて、パラフィンまたは冷凍組織切片中のＭＣＣ蛋 白質を検出する。抗体の作製および精製に関する技術は当該技術分野においてよ く知られており、本発明の調製品を得るには、そのような技術のいづれを用い癌 になりやすい素因の確認は、ヒトの正常組織をＭＣＣ遺伝子の突然変異に関して 試験することによって行うことができる。例えば、生殖細胞にＭＣＣ突然変異を 受け継いだ人は癌になりやすいと考えられる。これはその人の体のどの組織のＤ ＮＡを試験しても判断することができる。最も簡単には、採血をして血液細胞か らＤＮＡを抽出することができる。さらに、胎児の細胞、または羊水をＭＣＣ遺 伝子の突然変異に関して試験することによって、胎児診断を行うことができる。

野生型ＭＣＣ対立遺伝子の変更は、例えば、点突然変異によるものでも欠失によ るものでも、上記のいづれの方法によっても検出することができる。

本発明のｃＤＮΔ分子はイントロンを含まない、ＭＣＣ遺伝子のコード分子であ る。これらの分子は、ＭＣＣｍＲＮＡを鋳型として用い、逆転写酵素によって作 製することかできる。これらの分子は、当該分野において知られているベクター および細胞系列において増殖させることができる。このような分子は５ＥＱＩＤ 　ＮＯ：１に示す配列を有する。このｃＤＮＡは、本明細書に開示された配列に 基づいて、合成化学の技術を用いて作製することもできる。

ＭＣＣとヒトｍ３ムス力リン性アセチルコリン受容体（ｍＡＣｈＲ）との間に短 い相同領域が同定された。この相同性は１９残基に大まかに規定され、そのうち カルボキシル末端の６アミノ酸（ＫＥＬＡＧＬ）が一致していた（図５およびＳ ＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ。１１参照）。他にも多くの蛋白質が広い領域にわたるもっと 高い相同性を有している（但し、６アミノ酸が連続して一致するものはほとんと 無い）ので、当初、この相同性か有意であるか分からなかった。しかし、突然変 異を検索していくうちに、ｍＡＣｈＲのサブタイプによるＧ蛋白質の活性化を制 御する配列要素に関する研究が公表された（レヒライター（Ｌｅｃｈｌｅｉｔｅ ｒ）ら、ＥＭＢＯＪ、、ｐ、４３８１（＋９９０））　。ｍ３　ｍＡＣｈＲの２ １アミノ酸残基の領域をｍ２ｍＡＣｈＲの対応する領域の２１アミノ酸と置換す ると、Ｇ蛋白質特異性が完全に媒介されることか示された。これらの２１残基は 、ＭＣＣとｍ３　ｍＡＣｈＲの相同性を示す１９アミノ酸とオーバーラツプして いた（図５）。Ｋ　Ｅ　Ｌ　Ａ　Ｇ　Ｌモチーフのアミノ末端の２アミノ酸を含 む１０残基（図５、ドメインＡ）を欠失させると、Ｇ蛋白質を介する反応のキネ ティクスおよび大きさが完全に変更した。

さらに、Ｋ　Ｅ　Ｌ　Ａ　Ｇ　Ｌ、モチーフのカルボキシル末端の４アミノ酸を 含む９残基サブドメイン（図５、ドメインＢ）は、ｍ２　ｍＡＣｈＲに転移させ ると、ｍ３Ｇ蛋白質経路の活性化を規定するのに十分であった。

このＭＣＣとｍＡＣｈＲのＧ蛋白質活性化領域との結び付きは、従来のＧ蛋白質 の癌との関係についての研究の観点から興味深い。例えば、結腸直腸癌において しばしば突然変異を起こしているＲＡＳ癌遺伝子（フォーゲルンユタインら、Ｎ 　Ｅｎｇｌ　Ｊ　Ｍｅｄ、、ｖｏｌ、３１９．ｐｇ　５２５（１９８８）：ボス （Ｂｏｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ　ｖｏｌ、３２７．ｐｇ、２X３（ ＋９８７’））は、Ｇ蛋白質ファミリー（ブルネ（Ｂｏｕｒｎｅ）ら、Ｎａｔｕ ｒｅ、ｖｏｌ、３４８．ｐｇ、　１２５（１９９０））ノメンハーてあり、則■ ｔｒｏ形質転換抑制因子であり（ノダ（Ｎｏｄａ）ら、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ、Ａ ｃａｄ、Ｓｃｉ　ＵＳＡ、ｖｏｌ　８６．ｐｇ、］６２（１９８９））　、ホル モンにより形成される腫瘍で突然変異の生じている遺伝子である（カンジス（Ｃ ａｎｄｉｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ、３４０、ｐｇ、６９２（１９８９）　 ；リョンズ（Ｌｙｏｎｓ）ら、５ｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、２４９．ｐｇ、６５５ （１９９０））　ｏさらに、神経繊維芽細胞腫に関与する遺伝子（おそらく癌抑 制遺伝子）は、ＲＡＳのＧＴＰ　ａ　ｓ　ｅ活性を活性化することが示されてい る（スー（Ｘｕ）ら、Ｃｅ１ｌ、ｖｏｌ、６３゜ｐｇ、８３５（１９９０）；マ ーチン（Ｍａｒｔｉｎ）ら、Ｃｅ１１．ｖｏｌ、６３．ｐｇ、８４３（１９９０ ）　：パレスター（Ｂａ１１ｅｓｔｅｒ）ら、Ｃｅ１１．ｖｏｌ、６３．ｐｇ、 ８５１（１９９０））　、　Ｇ蛋白質と直腸癌の別の興味深い結び付きは、薬剤 スリンダクに関するものである。この薬剤はＦＡＰ患者の良性結腸癌の増殖を阻 害することが示されており、これは、そのシクロオキシゲナーゼ阻害剤としての 活性によるものと思われる（ワッブル（Ｗａｄｄｅｌｌ）ら、Ｊ、Ｓｕｒｇ、Ｏ ｎｃｏｌｏｇｙ　２４（１）、８３（１９８３）：ワッブルら、Ａｍ、Ｊ　、Ｓ ｕｒｇ、　、　１５７（１）　、１７５（１９８９）　；シャ泣m −（Ｃｈａｒｎｅａｕ）ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉｅ　Ｃ１１ｎｉ ｑｕｅ　ａｔ　Ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅ　１４（２）、１５３i１９９０） ）。シクロオキシゲナーセは、アラキドン酸をプロスタグランジンおよび他の生 理活性物質に変換するのに必要とされる。Ｇ蛋白質はホスホリパーゼＡ２活性を 制御することか知られており、ホスホリパーゼＡ２はリン脂質がらアラキドン酸 を生成する（ロール（Ｒｏｌ、ｅ）ら、Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ　、　ＵＳＡ　、　ｖｏｌ　、　８４　、ｐｇ、　３６Q３　（１９８７） 　： クラチ（Ｋｕｒａｃｈｉ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、ｖｏｌ、３３７．ｐｇ、５５５（ １９８９））　。それ故、我々は、野生型ＭＣＣ蛋白質かＧ蛋白質と相互作用す ることによって機能し、リン脂質代謝に関与していると考えている。

以下に示す実施例は、単なる例示であって、上記に広く記載された本発明の範囲 を制限するものではない。

実施例１ 本実施例は、結腸直腸癌において染色体５ｑ２１に生じる体細胞遺伝子再編成の 検出を示す。

我々は、制限断片の長さにおける吊型性（ＲＦＬＰ）マーカーを用いて散発性病 の３０％以上に起こる対立遺伝子の損失をマツピングした。我々は、よく見られ る損失領域かコスミト５７１によって検出されるＲ　Ｆ　Ｌ　Ｐに集中している らしいということを見いたした。

コスミト５．７１の部分をサブクローン化し、１５０の結腸直腸癌から成るパネ ルをサザンブロノト分析によってスクリーニングする際のプローブとして使用し た。我々は、正常個体由来のＤＮＡで見られる２０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片に加え て、１ｌｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含む腫瘍を１つ（Ｔ１４）発見した。この１１ ｋｂ断片は同し患者の正常細胞から単離したＤＮＡには存在しながった（図ＩＮ パネルＡ）。

（Ｔ１４腫瘍のＥ　ｃ　ｏ　ＲＩ断片をラムダＤ　Ａ　Ｓ　Ｈベクター腕（Ｓｔ ｒａｔａｇｅｎｅ）に連結し、連結したものをパッケージングしＣ６００大腸菌 株に感染させた後、５．７１配列からのプローブを用いてハイブリダイズするク ローンを同定することにより）、新たなＥｃｏＲＩ断片をクローン化し、腫瘍Ｔ １４からの１）　Ｎ　Ａについてのサザンブロントのプローブに用いた。この１ ｉｋｂクローンは、予想通り、腫瘍中の異常な１ｌｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片及び正 常な２０ｋｂ　ＥｃｏＲＩ断片にハイブリダイズした（図１、パネルＢ）。さら に、１ｌｋｂクローンは、他の制限エンドヌクレアーゼ（Ｐｓｔｌ［図１、パネ ルＣ］；ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＶを含む）で消化しても、腫瘍Ｔ１４の新た な断片を検出した１１ｋｂクローンの制限酵素地図および部分的な塩基配列の決 定がら、その左端が５．７１の配列を含む２０ｋｂのＥｃｏＲＩ断片に由来する ことが示された。１ｌｋｂ断片の右端は、正常なゲノムＤＮＡではその左端とつ ながっていない配列に由来していた。１ｌｋｂ断片の右端の４００ｂｐプローブ を用いたところ、つながっていない配列もまた、染色体５に由来するものの、１ ｌｋｂの左端から少なくとも１００ｋｂは離れた場所からのものであることが示 された。従って、この腫瘍では再編成か起こっており、正常では遠く離れたとこ ろにある配列の並置が生している。

実施例２ 本実施例は、結腸直腸癌Ｔ１４で見いだされた再編成により影響を受ける遺伝子 の位置づけに関（、で、我々が行なった試みを記す。

発現しているヒトの遺伝子は哺乳動物種の間で保存されているという仮説に基づ き、我々は、５７１コスミドと相同性をもつ配列をラットのゲノムがら検索した 。５．７１コスミトのいくつかのサブクローンを、げっ歯頚ＤＮＡのサザンブロ ソト分析に使用した。フォーゲルシュタインら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ、ｖｏｌ、４７゜ｐｇ、４８０６（１９８７）に記載されているように５５度 で異種間ハイブリダイゼーションを行い、４５ｍＭ　塩化ナトリウム、２ｍＭ　 クエン酸ナトリウム、０．３ｍＭトリス−塩酸　ｐＨ７，５，０１％　ドデシル 硫酸ナトリウム中で５５度で４５分、洗浄した。低ストリンジェントな条件下で クロスハイブリダイズした２つのサブクローン（５，７１−５および５．７１１ ）を同定した。しがし、これらの保存された配列を用いて、ノザンブロツティン グ、および３Ｘ１０’個以上の直腸または脳のｃＤＮＡクローンのスクリーニン グによるヒトの発現遺伝子を検出しようという試みは成功しなかった。

実施例３ 本実施例は、コメミド５．フ１ＲＦＬＰマーカー近傍の発現しているヒト遺伝子 の同定を示す。

我々は、異種間ハイブリダイズしたヒトのサブクローンを部分的にシーフェンス したが、この配列情報だけてはエクソンを予想することは不可能であることがわ かった。そこで、我々は異種間ハイブリダイズしたラットの断片をクローン化し 、同様にその塩基配列を決定した。ラムダＤ　Ａ　Ｓ　Ｈベクター（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ）のラットゲノムライブラリーを３２ｐラヘルした５、７１−３およ び５．７１−５配列をプローブにスクリーニングした。これらのファージクロー ンのクロスハイブリダイズする制限断片をプラスミドベクターにサブクローン化 し、シーフェンスして、図２に示す相同性を導きだした。塩基配列決定は、Ｇ　 デルサル（Ｇ、Ｄｅｌ　５ａｌ）、Ｇ、　７ンフイオレツテイ（Ｇ、Ｍａｎｆｉ ｏｌｅｔｔｉ）およびＣ，シュナイダ−（Ｃ，５ｃｈｎｅｉｄｅｒ）、Ｂｉｏｔ ｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　７：５１４．１９８９に記載されているように、非修飾Ｔ ７ポリメラーゼを用いて行なった。

ラットとヒトの対応する領域の配列を比較したところ、サブクローン５．７１− ３から一つ、サブクローン５．７１−５から一つの推定エクソンが同定された（ 図２）。これらは、それぞれオーブンリーディングクレーム（ＯＲＦ）を含んで おり、それぞれ種を超えて保存されたスプライスアクセプタ一部位とドナ一部位 に挟まれていた。ラットおよびヒトのエクソンから予想されるＯＲＦは、アミノ 酸レベルで９６％、ヌクレオチドレヘルで８９％同一で、ヌクレオチドの違いの 大半はコドンの３文字目によるものであった。２つの推定エクソンはゲノムＤＮ Ａ上で２ｋｂ以」二、離れている。

プライマーはこの２つの推定エクソンに由来する。これらのプライマーを用いて ｃＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うと、エクソンが細胞内でＲＮＡスプライシン グによってつながっている場合、推定エクソンが検出される。ＲＮＡ調製品にゲ ノムＤＮＡが混入しても、この分析法には影響しない。なぜなら、介在イントロ ンによって、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲ産物はスプライシングを受けたＲＮＡか らの産物よりもずっと長くなるからである。

当初、我々は推定エクソンが互いにとのような向きになっているのか、わからな かった。それ故、このエクソン連結（ｅｘｏｎ−ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ）計画の ために２セツトのプライマーを設計した。一つのセット（プライマーＰ１および Ｐ４；図２）では、５．７１−５のエクソンか５．　７１．−３のエクソンの上 流にある場合に、ＰＣＲ産物が生じるようにした。もう一方のセット（プライマ ーＰ２およびＰ３：図２）では、２つのエクソンがその逆の方向にある場合に、 ＰＣＲ産物が検出されるようにした。

へ−カ−（Ｂａｋｅｒ）ら、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｖｏｌ、５０． ｐｇ、７７１７（＋９９０）に記載されているように、９５℃　０．　５分、５ ５°０２分、および７００Ｃ２分を３５サイクル用いてＩ）　ＣＲを行った。正 常なヒトの直腸からのｍＲＮＡに由来するｃ　ＤＮＡを鋳型として用いたところ 、最初の組合せ（プライマーＰ１とＰ４）によってのみ、Ｐ　ＣＲ産物か生（、 ることかわかった。Ｉ）　ＣＲ産物は、ヒトおよびラットのゲノｌ、　Ｄ　Ｎ　 Ａ配列で同定されたスプライス部位で２つの推定エクソンが直接スプライシング を受けた場合に予想されるサイズ（２２６ｂｐ）とぴったり一致した。

ｒ−）　ＣＲ産物のクローン化及び塩基配列の決定から、これか５．７１−５エ クソンと５．７１．−３エクソンの間で直接スプライシングを受けて生じたもの であることか確認された。このスプライシングを受けた産物は、各エクソンから のＯＲＦをイン−フレー１．　（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）で融合させたものを産生じ ていた。我々は、これらの配列かまさに発現している遺伝子を表わしているもの と結論し、以降、本明細書中では結腸直腸癌において変異しているものというこ とがら、Ｍ　ＣＣ（ｍｕｔａｔｅｄ　ｉｎ　ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ　ｃａｎｃｅ ｒ）遺伝子と呼ぶこととした。エクソン連結法を用いて、我々は、ＭＣＣがラッ トの正常組織の大半（例えば、直腸、脳、胃、肺、肝臓、腎臓、膀胱、心臓）で 発現していることを見いだした。

実施例４ 本実施例は、ヒトＭＣＣｃＤＮＡの脳からの単離および塩基配列の決定を示す。

ヒトｃＤＮＡを鋳型に用いて増幅したＰＣＲ産物を、次に、ラベルし、これをプ ローブとして正常なヒトの脳からのｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした 。脳を選んだのは、エクソン連結分析によって脳においてＭＣＣが高レベルで発 現していることが示唆されたからである。Ｕ、ガブラー（Ｕ、Ｇｕｂｌｅｒ）お よびＢ。

Ｊ、ホフマン（Ｂ、Ｊ、Ｈｏｆｆｍａｎ）、Ｇｅｎｅ　２５，２６３　（１９８ ３）に記載されたヒト脳ｍ　ＲＮ　ＡおよびラムダＺａｐヘクター（Ｓｔｒａｔ ａｇｅｎｅ）からｃＤＮＡライブラリーを構築した。

５．７１−３と５．７１−５のエクソンを連結させたＰＣＲ産物（図２参照）を 用いて１．５Ｘ１０’個のプラークをスクリーニングした。

−次スクリーニングで１．５Ｘ１０’個のプラークから３つのクローンが同定さ れた。次に、これら３つのクローンの両端を用いてライブラリーを再スクリーニ ングし、最終的に７つのオーバーラツプｃＤＮＡクローンのシリーズを単離し、 順序を決定した。これらのクローンの配列解析から、これらが４，１８０ｂｐの ＭＣＣｍＲＮＡを持ち、２，５１１ｂｐのＯＲＦが含まれることが示された（図 ３）。ＯＲＦの最初のメチオニン（ヌクレオチド２２０）の上流にはイン−フレ ームで終止コドンが存在し、コザソク（Ｋｏｚａｋ）（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ｖｏ１１５、ｐｇ、８１２５（１９８７））によって 定義されたコンセンサスな開始部位に非常によく一致している。このメチオニン から翻訳が開始されていれば、ヌクレオチド２２０から２７０７によってコート される８２９アミノ酸からなる産物（９３ｋ　ｄ）が配列から予想される。ＯＲ Ｆは最低２００ｂｐの５゛非翻訳配列と１４５０ｂｐの３′非翻訳配列に挟まれ ている。いっれのクローンの３゛末端にもポリアデニル化による延長の証拠は見 られなかった。ｃＤＮＡプローブはノザンプロットにおいていくつかのサイスの ＲＮＡ　（３−１０ｋｂ）を検出したが；これら他の転写産物が、ＭＣＣ遺伝子 の別のスプライシングの形によるものなのが、あるいは他の遺伝子座からの類似 遺伝子によるものなのかは不明である。

ヌクレオチドデータベース（ＥＭＢＬバージョン２５、Ｇｅｎｂａｎｋバージョ ン６６）の検索から、この配列か以前に報告されたものではないことが示された 。アミノ酸データベース（Ｐ、１．　Ｒ，バージョン２５．５ＷＩＳＳ−Ｐｒ。

ｔｅｉｎバージョン１６）を予想ＭＣＣ蛋白質（８２９アミノ酸）で検索しても 、顕著な相同蛋白質は見られなかった。しかし、我々は、Ｇ蛋白質と共役してい るヒトおよびブタのムスカリン性アセチルコリン受容体とＭＣＣとの間に１９ア ミノ酸にわたる相同性があることに気づいた。

実施例５ 本実施例は、結腸直腸癌組織のＭＣＣ遺伝子中で体細胞突然変異が生じることを 示す。

ＭＣＣの配列を腫瘍Ｔ１４のゲノムクローンの配列と比較したところ、この腫瘍 の再編成の境界がＭＣＣ遺伝子の内側、ヌクレオチド５３４がら６７６を含むエ クソンのすぐ先のイントロンにあることが判明した。さきに述べたように、新た な１ｌｋｂの制限断片は、通常では１００ｋｂ以上も離れている第５染色体上の 配列かつながったために生じた。この１００ｋｂの間にはＭＣＣ遺伝子のエクソ ンかいくつか含まれていた。従って、ＭＣＣ遺伝子は、この腫瘍では遺伝子変更 によって破壊され、再編成したＭＣＣ遺伝子からはいくっがのエクソンが取り除 かれた。

他のより微妙なＭＣＣの遺伝子変更を検索するために、我々はポリメラーゼ連鎖 反応を用いて結腸直腸癌のＭＣＣ遺伝子のエクソンを増幅した。つぎに、多くの サンプルを迅速に試験できるよう改変されたＲＮａｓｅプロテクションアッセイ によって、これらの配列に突然変異が含まれていないか分析した。簡単に述べる と、エクソンおよび周囲のイントロンの配列を決定し、それを用いてエクソンお よびそれを挟むスプライス部位を増幅するためのプライマーを設計する。ついで 、Ｐ　ＣＲを用いて腫瘍からエクソンを増幅した。

ＭＣＣｃＤＮＡプローブでヒトゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした 後、エクソンの境界部分の配列を導きだした。ポジティブにハイブリダイズした クローンを単離し、小さな断片（０，１−３ｋｂ）にサブクローン化して塩基配 列を決定した。エクソンを増幅するプライマーは、スプライス部位の外側で選択 され、その配列は以下の通りである：ヌクレオナト３９１−５３３を含むエクソ ンに対する、５°−ＧＡＡＴＴＣＡＴＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴ−３°（ＳＥＱ　Ｉ Ｄ　ＮＯ：３）　オヨび５°−ＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧＡＴＧＧＡＧＧＧ−３°（ ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４）　、ヌクレオチド１５７５−１６７８を含むエクソン に対する、５’−ＧＧＣＣＣＣＡＴＧＴＧＣＴＴＴＧＴＴ−３°（ＳＥＱ　ＩＤ 　ＮＯ：５）および５°−ＡＧＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＡ−３f　（Ｓ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６）、ヌクレオチド１６７９−１８６２を含むエクソンに対 する、５−ＡＴＧＴＴＧＡＴＴＡＡＴＣＣＧＴＴＧＧＣ−３°（ＳＥＱ　ＩＤ　 ＮＯニア）および５°−ＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＧＧＣＴ−３°（ＳＥＱ 　ＩＤ　ＮO ８）、ヌクレオチド２３０５−２４０５を含むエクソンニ対する、５−ＧＧＣＣ ＴＡＡＣＴＧＧＡＡＴＧＴＧＴ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：９）オヨヒ５− ＧＣＣＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＣＣＡＧＣ−３’　（ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１０） 。ＰＣＲは上記の通りに行った。

生じたＰＣＲ産物を、正常なＭＣＣ配列を持つ釦→＋１ｔｒｏで作製したＲＮＡ プローブにハイブリダイズさせた。このハイブリットをＲＮａｓｅ　Ａで消化す ることで、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド中の一塩基対ミスマッチの部分を切断し 、これらの切断産物を変性ゲル電気泳動後に視覚化した。各エクソンに対しＲＮ ａｓｅプロテクション分析を独立に２回（一方はセンス鎖を、もう一方はアンチ センス鎖をラヘルした転写物に用いた）行った。こうした条件下では、全ての点 突然変異の内、約５０％が検出可能である。Ｒ，Ｍ、メイヤーズとＴ、マニアテ ィス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ ｏｓｉａ　ｏｎ　Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ＢｉｏｌｏｇｙA５１．２７５（ ウィンターら、Ｐｒｏｃ　、　Ｎａｔｌ　、Ａｃａｄ　、Ｓｃｉ　、ＵＳＡ、　 ｖｏｌ　、　８２　、ｐｇ、　７５７５　（１９８５）によ驪L載に 以下に示す改変を加えて、ＲＮａｓｅプロテクションアッセイを行った：ハイブ リダイゼーションを、Ｉ　Ｉｔ　ｌの適当なＰＣＲ反応液と３２ｐラベルした転 写物（２００，０００ｄｐｍ）を含むハイブリダイゼーション溶液９μｍ中で、 ５０’Ｃで２時間行った。

９０１、ｔｌのＲＮａｓｅ溶液（０，２Ｍ　ＮａＣ１，０，１Ｍ　ＬｉＣ１，２ ０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡ、２５ｕｇ／ｍｌ　Ｒ Ｎａｓｅ　Ａ）を加えることでＲＮａｓｅ処理を開始し、３７℃で１時間インキ ュベートした。プロテネースに溶液（５ｍｇ／ｍｌプロテネースＫを含む１０％ ＳＤＳ溶液）を加えてＲＮａｓｅ処理を停止させ、３７°Ｃで１時間インキュベ ートした。

次に、溶液をＰＣ９（フェノールとクロロホルムの３：４の混合液に、０．５Ｍ 　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、ｐＨ９，０，１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　ＮａＣ１を ２の割合だけ加えて平衡化したもの）で−回抽出し、２０μｍの水層を回収し、 ２０μＩのローディングバッファー（０３％Ｗ／Ｖキシレンシアツール、０３％ Ｗ／Ｖブロモフェノールブルーのホルムアミド溶液）と混合した。次にこの試料 を９４℃で４分間加熱し、変性ポリアクリルアミドゲルに乗せた。各エクソンに つき、６鎖を標識転写物として用いて２回のアッセイを独立に行った。

試験した４つのエクソンの内、最初のエクソン（ヌクレオチド３９１−５３３を 含む）に関しては、試験した１００の結腸直腸癌の中には変異が見られなかった 。ヌクレオチｌ’　１５７５−１６７８を含むエクソンの解析から、ＲＮａｓｅ プロテクションパターンに関して同一の変異を持つ腫瘍が５つ同定された。この ５つの腫瘍のうちの２つの変異ＰＣＲ産物をクローン化し塩基配列を決定したと ころ、プロリンからロイシンへのコート変化をもたらすＣからＴへの変異かヌク レオチド１６７６で起きていることが、この変異の原因であることが示された。

この変異か５つの個体で見られたこと、この変異を示す腫瘍を持つ５人の患者の ２人から！１１離した正常組織のＤＮＡにもこの変異が存在した（他の３人につ いては試験していない）ことから、この変異はおそらく冬型によるものと考えら れる。

３つめのエクソン（ヌクレオチド２３０５−２４０５）の解析から、独特なＲＮ ａｓｅプロテクションパターンを示す腫瘍か１つ（Ｔ９１）同定された。この異 常なＲＮａｓｅブロテクンヨンパターンは、同じ個体の正常組織から単離された ＤＮＡには見られたかった（図４）。このことは、変更したＲＮａｓｅブロテク ンヨンパターンが体細胞性突然変異によって生じたものであることを示している 。Ｔ９１腫瘍のＰ　ＣＲ産物をクローン化し塩基配列を決定したところ、アラニ ンからバリンへのコート変化をもたらすＣからＴへの変異がヌクレオチド２３１ ２で起きていることか示された。これは比較的保存性の高いアミノ酸置換である が、回しアミノ酸変化かｐ５３癌抑制遺伝子を不活化することか示されている。

Ｓ、Ｊ、ベーカーら、５ｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、２４４．ｐｇ、２１７（１９８ ９）；Ｓ、Ｊ、ベーカーら、５ｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、２４９．ｐｇ、９１２（ １９９０）　。

４つめのエクソン（ヌクレオチド１６７９−１８６２）の解析から、独特なＲＮ ａｓｅプロテクションパターンを示す腫瘍が１つ（Ｔａ２）同定された。同じ個 体の正常組織から単離されたＤＮＡの検定から、この変更したＲＮａｓｅプロテ クションパターンも体細胞性突然変異によって生じたものであることが示された （図４）。Ｔａ２のＰＣＲ産物をクローン化し塩基配列を決定したところ、アル ギニンからグルタミンへのコード変化をもたらすＧからＡへの変異がヌクレオチ ド１７３６で起きていることが示された。

配列表 （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１（７）情報（ｉ）　配列の特定： （Ａ）配列の長さ：　４１８１塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、二本鎖 （Ｄ）トポロン−・直線状 （ｉｉ）　配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）ハイポセティカル　Ｎｏ （ｉｖ）　アンチセンス、Ｎ０ （ｖｌ）起源・ （Ａ）生物名・ホモサピエンス （ｖｉｉｉ）ゲノム中の位置 （Ａ）染色体／セグメント　５ｑ２１ （ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＩ）　ＮＯ：１：ＣＣＴＣＣＴＧＣＡＧ　ＣＡＡ ＴＧＧＣＴＣＧ　ＴＣＣＧＴＧＡＡＡＣＧＣＧＡＧＣＣＡＣＧ　ＧＣＴＧＣＴＣ ＴＴＴ　ＴＴＡＡＧＡＧＴＧb６０ ＣＴＧＣＡＴＣＣＴＣＣＧＴＴＴＧＣＧＣＴ　ＴＣＧＣＡＡＣＴＧＴ　ＣＣＴＧ ＧＧＴＧＡＡ　ＡＡＴＧＧＣＴＧＴＣＴＡＧＡＣＴＡＡＡＡ@１２０ ＴＧＴＧＧＣＡＧＡＡ　ＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＡＧＴＧＧＡＴＡＴＴ　ＧＡＧＣ ＣＴＧＴＧＡ　ＡＧＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴＡＡＧＣＴＣＣＧ@１８０ ＡＧＡＣＣＴＧＧＧＧ　ＧＡＣＴＧＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＣＴＧＡ　ＡＡＡＧ ＴＧＣＡＴＣＡＴＧＡＡＴＴＣＣＧ　ＧＡＧＴＴＧＣＣＡＴ@２４０ ＧＡＡＡＴＡＴＧＧＡ　ＡＡＣＧＡＣＴＣＣＴ　ＣＧＧＣＣＧＡＧＣＴ　ＧＡＧ ＴＧＡＧＣＴＣＣＡＴＴＣＡＧＣＡＧ　ＣＣＣＴＧＧＣＡＴb３００ ＡＣＴＡＡＡＧＧＧＡ　ＧＡＴＡＴＡＧＴＧＧ　ＡＡＣＴＴＡＡＴＡＡ　ＡＣＧ ＴＣＴＣＣＡＧ　ＣＡＡＡＣＡＧＡＧＡ　ＧＧＧＡＡＣＧＧfＡ　３６０ ＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡ　ＡＡＧＡＡＡＴＴＧＧ　ＣＣＡＡＧＧＣＡＣＡ　ＧＴＧ ＣＧＡＧＣＡＧ　ＴＣＣＣＡＣＣＴＣＡ　ＴＧＡＧＡＧＡＧbＡ　４２０ ＴＧＡＧＧＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＣＧＡＡ　ＣＧＡＣＧＣＴＴＣＧ　ＣＴＡＴ ＧＡＧＧＡＡ　ＣＧＣＡＴＣＡＣＡＧ　ＡＧＣＴＣＣＡＣＡf　４８０ ＣＧＴＣＡＴＴＧＣＧ　ＧＡＧＣＴＣＡＡＣＡ　ＡＧＡＡＧＡＴＡＧＡ　ＣＣＧ ＴＣＴＧＣＡＡ　ＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡ　ＴＣＡＧＧＧＡＧfＡ　５４０ ＡＧＡＴＧＡＧＴＡＣＴＣＡＧＡＡＣＴＧＣＧＡＴＣＡＧＡＡＣＴ　ＣＡＧＣＣ ＡＧＡＧＣＣＡＡＣＡＣＧＡＧＧ　ＴＣＡＡＣＧＡＧＧＡ　U００ ＣＴＣＴＣＧＡＡＧＣＡＴＧＧＡＣＣＡＡＧ　ＡＣＣＡＧＡＣＣＴＣＴＧＴＣＴ ＣＴＡＴＣＣＣＣＧＡＡＡＡＣＣＡＧＴＣＴＡＣＣＡＴ　６U０ ＧＧＴＴＡＣＴＧＣＴ　ＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡ　ＡＣＴＧＣＡＧＴＧＡ　ＣＣＴ ＧＡＡＣＴＣＡ　ＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡ　ＧＧＧＴＧＣＴＧ`Ｃ７２０ ＡＧＧＧＣＴＧＧＡＧ　ＡＡＴＧＴＴＧＴＣＴ　ＧＣＧＧＣＡＧＧＡＡ　ＧＡＡ ＧＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴ　ＣＣＧＴＧＧＣＣＧ`　７８０ ＧＧＴＧＧＡＣＡＧＧ　ＣＡＣＡＴＴＧＡＧＣＡＧＣＴＣＡＣＣＡＣＡＧＣＣＡ ＧＣＧＡＧ　ＣＡＣＴＧＴＧＡＣＣＴＧＧＣＴＡＴＴＡＡ　W４０ ＣＡＴＧＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＡＡＧＡＧＧ　ＡＡＧＡＡＣＴＧＡＡ　ＣＣＧＧ ＡＣＴＡＡＧ　ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡ　ＡＴＧＣＣＡＴＣＣf　１０２０ ＧＧＧＣＴＣＡＧＡＡ　ＡＴＣＡＧＴＡＧＣＡ　ＴＡＧＧＧＧＴＡＴＣＣＡＧＣ ＡＧＴＧＴＧ　ＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＴＣP３２０ ＡＣＴＴＣＡＧＧＡＣＴＧＣＴＣＣＡＡＴＡ　ＴＣＣＡＡＧＡＧＡＴ　ＴＴＴＣ ＣＡＡＡＣＡ　ＣＴＣＴＡＣＴＣＡＣＡＣＧＧＡＴＣＴＧＣP３８０ ＣＡＴＣＴＣＡＧＡＡ　ＡＧＣＡＡＧＡＴＴＡ　ＧＡＧＡＧＴＴＴＧＡ　ＧＧＴ ＧＧＡＡＡＣＡ　ＧＡＡＣＧＧＣＴＧＡ　ＡＴＡＧＣＣＧＧ`Ｔ　１４４０ ＴＧＡＧＣＡＣＣＴＣＡＡＡＴＣＣＣＡＡＡ　ＡＴＧＡＣＣＴＣＣＴ　ＧＡＣＣ ＡＴＡＡＣＣＴＴＧＧＡＧＧＡＡＴ　ＧＴＡＡＡＡＧＣＡＡ@１５００ ＴＧＣＴＧＡＧＡＧＧ　ＡＴＧＡＧＣＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡ　ＡＴＡＣ ＧＡＡＴＣＣＡＡＴＧＣＣＡＣＡＧ　ＣＧＣＴＧＡＧＧＣＴ@１５６０ ＧＧＣＣＴＴＧＣＡＧ　ＴＡＣＡＧＣＧＡＧＣＡＧＴＧＣＡＴＣＧＡ　ＡＧＣＣ ＴＡＣＧＡＡ　ＣＴＣＣＴＣＣＴＧＧ　ＣＧＣＴＧＧＣＡＧ`　１６２０ ＧＡＧＴＧＡＧＣＡＧ　ＡＧＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＧＧＧＣＡＧＴＴ　ＣＣＧＡ ＧＣＧＧＣＧ　ＧＧＣＧＴＧＧＧＧＴ　ＣＣＴＣＣＣＣＴＧf　１６８０ ＡＧＡＣＣＡＧＴＣＧ　ＧＧＧＧＡＴＧＡＡＡ　ＡＣＡＴＣＡＣＴＣＡ　ＧＡＴ ＧＣＴＣＡＡＧ　ＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧ　ＡＣＴＧＣＣＧＧ`Ａ　１７４０ ＧＡＣＡＧＣＴＧＡＧ　ＡＡＣＧＣＴＧＣＣＡ　ＡＧＧＣＣＣＴＧＣＴ　ＣＡＴ ＧＡＡＧＣＴＧ　ＧＡＣＧＧＣＡＧＣＴ　ＧＴＧＧＧＧＧＡfＣ１８００ ＣＴＴＴＧＣＣＧＴＧ　ＧＣＣＧＧＣＴＧＣＡ　ＧＣＧＴＧＣＡＧＣＣＣＴＧＧ ＧＡＧＡＧＣＣＴＴＴＣＣＴＣＣＡ　ＡＣＡＧＣＣＡＣＡＣP８６０ ＣＡＧＣＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＡＧ　ＣＣＡＧＴＡＧＴＴＧ　ＣＧＡＣ ＡＣ（ＧＡＧ　ＴＴＣＡＣＴＡＡＡＧ　ＡＡＧＡＣＧＡＧＣ`　１９２０ ＧＡＧＧＣＴＧＡＡＧ　ＧＡＴＴＡＴＡＴＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＡＡ　ＧＡＡＴ ＧＡＣＡＧＧ　ＧＣＴＧＣＧＧＴＣＡ　ＡＧＣＴＧＡＣＣＡs　１９８０ ＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧ　ＧＡＡＡＧＣＡＴＣＣＡＣＡＴＣＧＡＴＣＣＴＣＴＣＡ ＧＣＴＡＴ　ＧＡＣＧＴＣＡＡＧＣＣＴＣＧＧＧＧＡＧＡ　Q０４０ ＣＡＧＣＣＡＧＡＧＧ　ＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧ　ＡＡＡＡＣＧＣＡＧＴ　ＧＣＴ ＴＡＴＧＣＡＧ　ＧＡＧＣＴＣＡＴＧＧ　ＣＣＡＴＧＡＡＧfＡ　２１００ ＧＧＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＴＴＧＡＡＧＧ　ＣＣＣＡＧＣＴＣＴＡ　ＣＣＴＡ ＣＴＧＧＡＧ　ＡＡＡＧＡＧＡＡＧＡ　ＡＧＧＣＣＣＴＧＧ`　２１６０ ＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧ　ＡＧＣＡＣＧＣＧＧＧ　ＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡ　ＧＣＡ ＧＧＣＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡ　ＴＴＧＡＧＣＡＣＣs　２２２０ ＧＡＡＧＴＣＣＧＡＧ　ＧＴＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＧＡＧＣＡ　ＧＣＧＧ ＡＴＧＣＧＡ　ＴＣＣＣＴＣＡＧＣＴ　ＣＣＡＣＣＡＧＣＡf　２２８０ ＣＧＧＣＡＧＣＡＡＡ　ＧＡＴＡＡＡＣＣＴＧ　ＧＣＡＡＧＧＡＧＴＧ　ＴＧＣ ＴＧＡＴＧＣＴ　ＧＣＣＴＣＣＣＣＡＧ　ＣＴＣＴＧＴＣＣbＴ　２３４０ ＡＧＣＴＧＡＡＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＣＧＴ　ＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡ　ＴＧＡＧ ＣＴＧＧＣＴ　ＧＣＧＧＡＧＴＴＣＡ　ＣＣＡＡＣＧＣＣＡs　２４００ ＴＣＧＴＣＧＡＧＡＡ　ＡＡＧＡＡＧＴＴＧＡ　ＡＧＧＣＣＡＧＡＧＴ　ＴＣＡ ＡＧＡＧＣＴＧ　ＧＴＧＡＧＴＧＣＣＴ　ＴＧＧＡＧＡＧＡbＴ　２４６０ ＣＡＣＣＡＡＧＡＧＣＡＧＴＧＡＡＡＴＣＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＡ　ＡＴＣＴＧ ＣＡＧＡＧ　ＴＴＣＧＴＧＡＡＴＧ　ＡＴＣＴＡＡＡＧＣＧ@２５２０ ＧＧＣＣＡＡＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧ　ＣＴＧＣＣＴＡＴＧＡ　ＧＡＡＡ ＧＣＡＡＡＧ　ＡＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＴ@２５８０ ＧＡＡＧＡＡＧＴＴＡ　ＧＡＧＴＣＧＣＡＧＡ　ＴＧＡＴＧＧＣＣＡＴ　ＧＧＴ ＧＧＡＧＡＧＡ　ＣＡＴＧＡＧＡＣＣＣＡＡＧＴＧＡＧＧＡs　２６４０ ＧＣＴＣＡＡＧＣＡＡ　ＡＧＡＡＴＡＧＣＴＣＴＧＣＴＡＧＡＧＧＡ　ＧＧＡＧ ＡＡＣＴＣＣＡＧＧＣＣＡＣＡＣＡ　ＣＣＡＡＴＧＡＡＡＣQ７００ ＴＴＣＧＣＴＴＴＡＡ　ＴＣＡＧＣＡＣＴＣＡ　ＣＧＣＡＣＣＧＧＡＧ　ＴＴＣ ＴＧＣＣＣＡＴ　ＧＧＧＡＡＧＴＡＡＡ　ＣＴＧＣＡＧＣＡfＧ　２７６０ ＣＣＡＣＴＧＧＧＧＡ　ＣＡＧＡＡＧＧＧＣＣＣＡＴＧＴＡＣＴＴＧ　ＴＴＧＧ ＧＡＧＧＡＧ　ＧＡＧＧＡＡＡＧＧＧ　ＡＡＧＧＣＴＧＧＣ`　２８２０ ＧＧＴＡＧＧＴＣＧＧ　ＣＡＣＴＴＧＧＡＣＡ　ＡＴＧＧＡＧＴＧＣＣＣＣＡＡ ＣＴＣＡＡＣＣＣＴＴＧＧＧＧＴＧ　ＡＣＴＧＧＣＣＡＴＧ@２８８０ ＧＴＧＡＣＡＴＴＧＴ　ＧＧＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＧＡＧＧＴＧＣＣＣＧＣＴＣ ＴＴＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＣＣＣＡＣＡＡＣＡＧＣＧＴ　２X４０ ＧＴＡＡＡＣＡＣＡＴ　ＧＴＴＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＣＡＧＣＡＧ　ＡＧＣＣ ＴＣＧＴＴＴ　ＣＴＧＣＴＴＴＣＡＧ　ＣＡＣＴＣＡＣＴＣs　３０００ ＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＴＧ　ＧＣＧＧＣＴＧＴＧＣＡＴＣＡＧ ＴＧＧＧＡ　ＴＣＣＣＡＧＡＣＡＴ　ＴＴＧＴＴＴＣＴＧＴ@３０６０ ＡＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＣＣＴ　ＣＴＴＴＴＴＧＧＴＡ　ＧＡＴＧ ＣＴＧＧＧＣＴＣＡＴＣＴＴＣＴＡ　ＧＡＡＴＣＴＣＧＴＴ@３１２０ ＴＣＴＣＣＴＣＴＴＴ　ＣＣＴＣＣＴＧＣＴＴ　ＣＡＴＧＧＧＡＡＡＡ　ＣＡＧ ＡＣＣＴＧＴＧ　ＴＧＴＧＣＣＴＣＣＡ　ＧＣＡＴＴＴＡＡ`Ａ　３１８０ ＧＧＡＣＴＧＣＴＧＡ　ＴＴＴＧＴＴＴＡＣＴ　ＡＣＡＧＣＡＡＧＧＣＴＴＴＧ ＧＴＴＴＣＣＡＡＧＴＣ（ＣＧＧＧ　ＴＣＴＣＡＡＣＴＴＴ@３２４０ ＡＡＧＡＴＡＧＡＧＧ　ＣＧＧＣＣＡＴＡＡＧ　ＡＧＧＴＧＡＴＣＴＣＴＧＧＧ ＡＧＴＴＡＴ　ＡＧＧＴＣＡＴＧＧＧ　ＡＡＧＡＧＣＧＴＡf　３３００ ＡＣＡＧＧＴＧＴＴＡ　ＣＴＴＡＣＡＧＴＣＣＣＡＧＡＴＡＣＡＣＴ　ＡＡＡＧ ＴＴＡＣＡＡ　ＡＣＡＧＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＧＧＡＣＴＧ@３３６０ ＴＧＣＣＴＧＡＡＣＡ　ＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴ　ＧＡＧＡＧＡＡＴＡＡ　ＡＡＡ ＣＴＴＣＣＴＴ　ＣＡＡＴＣＴＴＣＡＴ　ＴＴＴＧＧＡＧＧbＡ　３４２０ ＧＧＧＣＴＧＧＧＡＡ　ＧＧＧＡＧＣＧＣＴＣＴＣＴＴＧＡＴＴＣＴ　ＧＧＧＡ ＴＴＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＡＧＴＧ　ＧＡＧＣＣＴＴＡＴＴ@３４８０ ＡＡＴＡＴＣＣＡＡＧ　ＡＣＴＴＡＧＡＧＣＴ　ＧＧＧＡＡＴＣＴＴＴ　ＴＴＧ ＡＴＡＣＣＴＧ　ＴＡＧＴＧＧＡＡＣＴ　ＡＡＡＡＴＴＣＴfＴ　３５４０ ＣＡＧＧＧＧＴＴＴＣＴＴＣＡＡＧＡＧＣＴ　ＧＡＧＡＡＡＣＡＴＴ　ＡＴＴＡ ＧＣＡＣＴＴ　ＣＣＣＧＣＣＣＣＡＧ　ＧＧＣＡＣＴＡＣＡs　３６００ ＡＡＴＴＧＣＴＧＴＴ　ＣＴＧＣＴＧＡＡＴＣＡＡＡＴＣＴＣＴＴＣＣＡＣＡＴ ＧＧＧＴＧ　ＣＡＴＴＴＧＴＡＧＣＴＣＴＧＧＡＣＣＴＧ　R６６０ ＴＣＴＣＴＡＣＣＴＡ　ＡＧＧＡＣＡＡＧＡＣＡＣＴＧＡＧＧＡＧＡ　ＴＡＣＴ ＧＡＡＣＡＴ　ＴＴＴＧＣＡＡＡＡＣＴＴＡＴＣＡＣＧＣＣR７２０ ＴＡＣＴＴＡＡＧＡＧ　ＴＧＣＴＧＴＧＴＡＡ　ＣＣＣＣＣＡＧＴＴＣＡＡＧＡ ＣＴＴＡＧＣＴＣＣＴＧＴＴＧＴＣＡＴＧＡＣＧＧＧＧＡ　R７８０ ＣＡＧＡＧＴＧＡＧＧ　ＧＡＡＴＧＧＴＡＧＴ　ＴＡＡＧＧＣＴＴＣＴ　ＴＴＴ ＴＴＧＣＣＣＣＣＡＧＡＴＡＣＡＴＧ　ＧＴＧＡＴＧＧＴＴ`　３８４０ ＧＣＡＴＡＴＧＧＴＧ　ＣＴＴＡＡＡＡＧＧＴ　ＴＡＡＡＴＴＴＣＡＡ　ＧＣＡ ＡＡＡＴＧＣＴ　ＴＡＣＡＧＧＧＣＴＡ　ＧＧＣＡＧＴＡＣbＡ　３９００ ＡＡＧＴＡＡＣＴＧＡ　ＡＴＴＡＴＴＴＣＡＧ　ＧＡＡＧＧＴＣＴＴＣＡＡＴＣ ＴＴＡＡＡＡ　ＣＡＡＡＴＴＣＡＴＴ　ＡＴＴＣＴＴＴＴＴb３９６０ ＡＧＴＴＴＴＡＣＣＴ　ＣＴＴＣＴＣＴＣＴＣＡＧＴＴＣＴＡＣＡＣＴＧＡＴＡ ＣＡＣＴＴ　ＧＡＡＧＧＡＣＣＡＴ　ＴＴＡＣＴＧＴＴＴＴ@４０２０ ＴＴＴＣＴＧＴＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＡＴ　ＣＣＡＴＣＣＡＡＡＧ　ＴＴＣＣ ＣＴＡＴＧＡ　ＡＡＡＡＴＧＴＧＴＴ　ＣＣＡＴＴＧＣＣＡs　４０８０ ＡＧＣＴＧＡＣＴＡＣＡＡＡＴＴＡＡＡＧＴ　ＴＧＡＧＧＡＧＧＴＴ　ＴＣＴＧ ＣＡＴＡＧＡ　ＧＴＣＴＴＴＡＴＧＴ　ＣＣＡＴＡＡＧＣＴ`　４１４０ ＣＧＧＧＴＡＧＧＴＣＴＡＴＴＴＴＣＡＧＡ　ＧＣＡＴＧＡＴＡＣＡ　ＡＡＴＴ ＣＣＡＣＡＧ　Ｇ　４１８１（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２のｉｉ報（ｉ）　配 列の特定： （Ａ）配列の長さ、８２９アミノ酸 （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （１１１）　ハイポセティヵル：ＹＥＳ（ｉｖ）　アンチセンス、Ｎ。

（ｖｉ）　起源・ （Δ）生物名：ホモサピエンス （ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２：Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ 　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ 　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕｌ　５　１０　１５ Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　 Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　１ｉｅｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｌ ｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａ ｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅ ｕ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｈｉ ｓ　Ｌｅｕ　ＭｅｔＡｒｇ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ 　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｔ　ｌｉｅ　 Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　１ｉｅＡｓｐ　Ａｒｇ　Ｌ ｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａ ｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕｌｏｏ　１０５　１１０ Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　 Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　５ｅｒＡｒｇ　Ｓｅｒ　Ｍ ｅｔ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ｌ ｉｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇ１ｎＳｅｒ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ、　Ｖａｌ　Ｔ ｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｌ ｅｕ　Ａｓｎ　５ｅ■ Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　 Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　ＡｒｇＬｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓ ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｖ ａｌ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｈｉｓ　１ｉｅＧｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｔｈ ｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　ｌｉ ｅ　Ｌｙｓ　ＴｈｒＶａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ｒｌｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ 　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　 Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　ＧｌｕＧｌｕ　Ａｓｎ　Ｇ ｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌ ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　ＬｅｕＡｓｎ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｌ ａ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ａｓｎ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒ ｇ　Ａｓｐ　ＡｒｇＬｅｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ 　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇ１ｎ Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　 Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｐｒ。

１ｉｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　 Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｓｎ１ｉｅ　Ｐｒｏ　Ｉ ｌｅ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌ ｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＡｒｇＳｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅ ｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌ ｕ　ｌｉｅ　５ｅｒＳｅｒ　ｌｉｅ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ 　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　ｌｉｅ　 Ｐｈｅ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　ＨｉｓＧｌｙ　Ｓｅｒ　Ａ ｌａ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｐ ｈｅ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　ＴｈｒＧｌｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｓｅ ｒ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ａｓ ｎ　Ａｓｐ　ＬｅｕＬｅｕ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ 　Ｃｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　５ｅｒ Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　 Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　ＡｌａＬｅｕ　Ｇｉｎ　Ｔ ｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇ ｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＡｌａＬｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌ ｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ　Ａｒ ｇ　Ａｌａ　ＡｌａＧｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ 　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　 Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　ＡｌａＡｌａ　Ｌｙｓ　Ａ ｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｃ ｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　ＰｈｅＡｌａ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｃｙ ｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅ ｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ５３０　５３５、　５４０ Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　 Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　ＧｌｕＰｈｅ　Ｔｈｒ　Ｌ ｙｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔ ｙｒ　ｌｉｅ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　ＬｅｕＬｙｓ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｌ ａ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅ ｕ　Ｇｌｕ　５ｅｒ１１ｅ　ｔ（ｉｓ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓｅ ｒ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　５ｅ ■ Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｖａｌ　 Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　ＡｌａＭｅｔ　Ｌｙｓ　Ｇ ｌｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｌ ｅｕ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＬｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ａｌ ａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｇｌ ｕ　Ａｌａ　Ｇ１ｎＧｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｈｉｓ 　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　 Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＳｅｒ　Ｌｙｓ　Ａ ｓｐ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ａ ｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　ＡｌａＬｅｕ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｇｌ ｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｌ ｕ　Ｌｅｕ　ＡｌａＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｌａ　ｌｉｅ 　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ａｒｇ Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　 Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ１ｉｅ　Ａｒｇ　Ｈ ｉｓ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｐｈｅ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａ ｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　ＡｌａＡｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｖａ ｌ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｌｙ ｓ　Ｈｉｓ　Ｇ１ｎＡｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　１．ｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌ ｕ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｍｅｔ　Ｍｅｔ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｒ ■ Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　 Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＧｌｕＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ａ ｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｓ ｅｒ　Ｌｅｕ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３（７）情報（ｉ）　配列の特定： （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニー木鎖 （Ｄ）トポロン−・直線状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｉｆｆ）ハイボセティヵル二Ｎ 。

（ｉｖ）　アンチセンス二Ｎ。

（ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （ｖｉｉｉ）ゲノム中の位置 （Ａ）染色体／セグメント：５ｑ２１ （ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３：ＧＡＪＴＴＣＡＴＣＡ　ＧＣＡＣ ＴＴＣ丁　１８（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４の情報 （ｉ）　配列の特定： （Ａ）配列の長さ：１８塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 ＣＣ）Ｍの数・−木鎖 （Ｄ）トポロジー・直線状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ’（ゲノミック）（ｆｉｔ）ハイボセティヵル： Ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス二Ｎ０ （ｖｉ）　起源 （Δ）生物名　ホモサピエンス （ｖｉｉｉ）ゲノム中の位置 （Ａ）染色体／セグメント：５ｑ２１ （ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４：ＣＡＧＣＴＣＣＡＡＧ　ＡＴＧＧ ＡＧＧＧ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・５の情報 （ｉ）　配列の特定： （Ａ）配列の長さ・１８塩基対 ＣＢ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数、−木鎖 （Ｄ）トポロン−・直線状 （ｉｉ）　配列の種類・ＤＮＡ　（ゲノミック）（ｉｉｉ）ハイポセティカル二 Ｎ０ （ｉｖ）　アンチセンス・Ｎｏ （ｖｌ）起源 （Ａ）生物名：ホモサピエンス （ｖｉｉｉ）ゲノム中の位置 （Ａ）染色体／セグメント：５ｑ２１ （ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：５：ＧＧＣＣＣＣＡＴＧＴ　ＧＣＴＴ ＴＧＴＴ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：６の情報 （１）　配列の特定： （Ａ）配列の長さ　１８塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数　一本鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｉ）　配列の種類　ＤＮＡ（ゲノミック）（ｉｉｉ）ハイポセティカル、Ｎ ０ （ｉｖ）　アンチセンス・Ｎｏ （ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス １８　（ｖｉｉｉ）ゲノム中の位置 （Ａ）染色体／セグメント：　５ｑ２１（ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ ：６：ＡＧＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＡＣＡ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニアの 情報 （ｉ）　配列の特定： （Ａ）配列の長さ：２０塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数ニ一本鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｉｉｉ）ハイポセティカル・Ｎ 。

（ｉｖ）　アンチセンス：Ｎｏ （ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス １８　（ｖｉｉｉ）ゲノム中の位置 （Ａ）染色体／セグメント：５ｑ２１ （ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯニア：ＡＴＧＴＴＧＡＴＴＡ　ＡＴＣＣ ＧＴＴＧＧＣ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：８の情報 （ｉ）　配列の特定。

（ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１１：Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｔｒｐ　Ａｒ ｇ　ｌｉｅ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｔｈ ｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕｌ　５　１０　１５ Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ（２）ＳＥ Ｑ　ＩＩ）　ＮＯ：１２の情報（ｉ）　配列の特定・ （Δ）配列の長さ：２０６塩基対 （Ｂ）配列の型　核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｉ）　配列の種類　ＤＮＡ（ゲノミック）（ｉｉｉ）ハイポセティカル二Ｎ ０ （ｊｖ）　アンチセンス・Ｎ。

（ｖｉ）　起源・ （Ａ）生物名、ホモサピエンス （ｉｘ）　配列の特徴・ （Ａ）特徴を表す記号　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置　３２．．１７２ （ｉｘ）　配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号・　ｅｘｏｎ （Ｂ）存在位置：３２．．１７４ （ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１２：ＣＡＧＣＡＣＴＴＣＴ　ＧＴＣ ＣＴＴＴＴＣＣＣＴＴＡＴＴＣＣＣＡ　Ｇ　ＴＧＣＧＡＧ　ＣＡＧ　ＴＣＣＣＡ ＣＣＴＣＡＴＧ　５２Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｍｅ ｔＡＧＡ　ＧＡＧ　ＣＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＧＴＣＣＡＧ　ＧＡＧ　ＣＧＡ　 ＡＣＧ　ＡＣＧ　ＣＴＴ　ＣＧＣＴＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　１P０ ０Ａｒ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕｌｏ　１５　２０ ＣＧＣＡＴＣＡＣＡ　ＧＡＧ　ＣＴＣＣＡＣＡＧＣＧＴＣＡＴＴ　ＧＣＧ　ＧＡ Ｇ　ＣＴＣＡＡＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＴＡ　１４８Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｇ ｌｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａ ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　１ｉｅＧＡＣＣＧＴ　ＣＴＧ　ＣＡＡ　ＧＧＣＡＣＣＡ ＣＣＡＴＣＡＧＧＴＡＣＧＣＧＧ　ＣＴＣＣＡＴＴＣＧＧ　ＣＴＴＴＴＡＣＴＣ Ｔ　２０２Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　１ｉｅ （２）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３の情報（ｉ）　配列の特定： （Ａ）配列の長さ：４７アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）トポロジー・直線状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１３：Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅ ｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａ ｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇｌ　５　１０　１５ Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　 Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　１ｉｅＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｌ ｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇ ｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅ（２）ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１４の情報（ｉ）　 配列の特定； （Ａ）配列の長さ：２０６塩基対 （Ｂ）配列の型・核酸 （Ｃ）鎖の数二二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｉｉｉ）ハイポセティカル：Ｎ ０ （ｉｖ）　アンチセンス：Ｎｏ （ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：Ｒａｔｔｕｓ　ｒａｔｔｕｓ（ｉｘ）　配列の特徴。

（Ａ）特徴を表す記号：ｅｘｏｎ （Ｂ）存在位置・３２．．１７４ （ｉｘ）　配列の特徴・ （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置、３２８．１７２ （ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　Ｎｏ・１４：ＴＣＣＧＴＣＴＴＣＴ　ＣＣＴ ＣＴＴＴＧＴＴ　ＣＴＴＧＧＣＣＣＴＡ　Ｇ　ＴＧＴ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＴＣＡ 　ＣＡＣＣＴＣＡＴＧ　５２Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ 　ＭｅｔＡＧＡ　ＧＡＧ　ＣＡＴ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　ＧＴＴ　ＣＡＧ　ＧＡＡ　 ＣＧＣＡＣＧ　ＡＣＡ　ＣＴＣＣＧＣＴＡＴ　ＧＡＧ　ＧＡＧ　１１O ０Ａｒ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　 Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕｌｏ　１５　２０ ＣＧＣＡＴＣＡＣＡ　ＧＡＧ　ＣＴＣＣＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＴ　ＧＣＡ　ＧＡ Ａ　ＣＴＣＡＡＣＡＡＧ　ＡＡＧ　ＡＴＡ　１４８Ａｒｇ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ｇ ｌｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａ ｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　１ｉｅＧＡＣＣＧＣＴＴＧ　ＣＡＡ　ＧＧＴ　ＡＣＣＡ ＣＣＡＴＣＡＧＧＴＡＴＧＧＣＴ　ＧＣＴＡＴＴＴＡＡＣＣＴＧＴＧＣＴＧＧＴ 　２０２Ａｓｐ　ＡｒｇＬｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　１ｉｅ（２ ）ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５の情報（ｉ）　配列の特定 （Ａ）配列の長さ　４７アミノ酸 （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１５：Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｓｅ ｒ　Ｈｉｓ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｖａ ｌ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇｌ　５　１０　１５ Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　 Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　ｌ１ｅＡｌａ　Ｇｌｕ　Ｌ ｅｕ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｇｉｎ　Ｇ ｌｙ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　ｌ１ｅ（２）ＳＥＱ　［Ｄ　ＮＯ：１６の情報（ｉ）　 配列の特定： （Ａ）配列の長さ：２０８塩基対 “（Ｂ）配列の型：核酸 （Ｃ）鎖の数：二本鎖 （Ｄ）トポロジー二直線状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）（ｉｎ）ハイポセティカル、Ｎ０ （ｉｖ）　アンチセンス二Ｎ０ （ｖｉ）　起源： （Ａ）生物名：ホモサピエンス （ｖｉｉｉ）ゲノ１１中の位置 （Ａ）染色体／セグメント：　５ｑ２１（ｉｘ）　配列の特徴： （Δ）特徴を表す記号　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置・３５．．１７５ （ｉｘ）　配列の特徴。

（Ａ）特徴を表す記号：　ｅｘｏｎ （Ｂ）存在位置・３４．．１７６ （ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１６：ＴＧＴＴＡＧＴＧＧＴ　ＴＧＣ ＣＡＡＴＴＣＴ　ＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴ　ＣＡＧＧ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　 ＧＡＧ　ＴＡＣＴＣＡＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　ＳｅｒＧＡＡ 　ＣＴＧ　ＣＧＡ　ＴＣＡ　ＧＡＡ　ＣＴＣＡＧＣＣＡＧ　ＡＧＣＣＡＡ　ＣＡ ＣＧＡＧ　ＧＴＣＡＡＣＧＡＧ　ＧＡＣＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌ ｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓ ｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐｌｏ　１５　２０ ＴＣＴ　ＣＧＡ　ＡＧＣＡＴＧ　ＧＡＣＣＡＡ　ＧＡＣＣＡＧ　ＡＣＣＴＣＴ　 ＧＴＣＴＣＴ　ＡＴＣＣＣＣＧＡＡ　ＡＡＣ３ｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｍｅｔ　 Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＡｓｎＣＡＧ　ＴＣＴ　ＡＣＣＡＴＧ　ＧＴＴ　ＡＣＴ　ＧＣ Ｔ　ＧＡＣＡＴＧ　ＧＧＴＧＡＧＴＣＴＧ　ＣＣＴＧＣＣＣＴＴＧＧｉｎ　Ｓｅ ｒ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｍｅｔ（２）ＳＥＱ　 ［Ｄ　ＮＯ：１７の情報（ｉ）　配列の特定・ （Ａ）配列の長さ：４７アミノ酸 （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｄ）ｌ−ボロジー・直線状 （ｉｉ）　配列の種類：タンパク質 （ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１７：Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇ］ 、ｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓ ｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇ１■ Ｈｉｓ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　 Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　５ｅｒＶａｌ　Ｓｅｒ　ｌ ｉｅ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｔ ｈｒ　Ａｌａ　Ａｓｐ　ＭｅｔＣＡＧ　ＴＣＴ　ＡＣＴ　ＡＴＧ　ＧＴＣＡＣＴ 　ＧＣＴ　ＧＡＣＡＴＧ　ＧＧＴＧＡＧＴＣＴＴ　ＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣ（２） ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８の情報５２　〜　（ｉ）　配列の特定： （Ａ）配列の長さ＝２０８塩基対 （Ｂ）配列の型：核酸 １００　（Ｃ）鎖の数二本鎖 （Ｄ）トポロジー：直線状 （ｉｉ）　配列の種類：ＤＮＡ（ゲノミック）１４８（ｉｉｉ）ハイホセティカ ル：Ｎ。

（ｉｖ）　アンチセンス二Ｎ０ （ｖｉ）　起源： １９５　（Ａ）生物名：Ｒａｔｔｕｓ　ｒａｔｔｕｓ（Ｌｘ）　配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：ｅｘｏｎ ２０Ｂ　（Ｂ　）存在位置：３４．．１７６（ｉｘ）　配列の特徴： （Ａ）特徴を表す記号：　ＣＤ５ （Ｂ）存在位置：３５．．１７５ （ｘｉ）　配列：　ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１８：ＣＡＣＴＣＡＡＴＧＧ　ＴＧＡ ＧＴＧＧＣＴＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＧ　ＣＡＧＧ　ＧＡＧ　ＧＡＡ　ＧＡＴ　Ｇ ＡＧ　ＴＡＣＴＣＡＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　ＳｅｒＧＡＡ　 ＣＴＴ　ＣＧＧ　ＴＣＡ　ＧＡＧ　ＣＴＣＡＧＣＣＡＧ　ＡＧＴ　ＣＡＡ　ＣＡ Ａ　ＧＡＧ　ＧＴＣＡＡＴ　ＧＡＡ　ＧＡＣＧｌｕ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　 Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　 Ａｓｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｐｌｏ　、　１５　２０ ＴＣＣＡＧＡ　ＡＧＴ　ＧＴＧ　ＧＡＣＣＡＡ　ＧＡＣＣＡＧ　ＡＣＣＴＣＴ　 ＧＴＧ　ＴＣＣＡＴＣＣＣＴ　ＧＡＧ　ＡＡＣ３ｅｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ 　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ 　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　ＡｓｎＧｉｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｍｅｔ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　 Ａｌａ　Ａｓｐ　ＭｅｔＣｊｌ−ロコ し　Ｊ：ｌ　＋＋　Φｔ く　←　リ←− ＋　１−　１Ｊ　ｕ　ｌ：ＬＬＪ　φＱ　ひＯコＱ　コく　α（Ｊ　０１（４Ｊ ｌｊ　−←−く　ロ　０　Ｉ／＋（＞＜　１−ロ　Φ−−く　い（ＬＬ）　■− 勺←＋　（＜（（Φ　−（（ＩＪ　−（Ｊ　Φ０　くロ　（Ｑ　Σく　〉ΦＬＪ 　ｗ　ｗ　Ｌ）　ｓ−ＬＬＩ　＞＜　ｃｚＪ　ｍｌｊ　（ｈＬＪ　ｅＲｈ−Ｌ４ 　ｃｚｗｓ−＜　ｌｊ　）−ｔＪ　■ＩＪ　−Ｌ）　φく　Φ←　ｍｌｊ　Ｌ− １ｊ　Φυ　φべＵ　く　■　Ｕ　←　Ｌ／１←　ロＬｊ　（Ｉｌｌｊ　Σ（ｔ ｔｕ　＜ＩＪ　φト　くΦＣＡＬ）　Ｌｌ−コＱ　にＬＪ　ｒ＜　ＣＯＬＬＩ　 αＬＪ　ＩＡＬＩ　＞Ｌｌ　コＬ）　Ｌｌ−一く　■ｔ＋Ｉａ１１−　二ＬＪ　 ）（−（ΦＣいく　−Φ　−ｏ　−（υＱ口ＬＩ　Ｌ／’ｌＩ＋−−ｃＪ　←＜ −り　ΦＵ　ψく　くΦ　ｕト　ロＱ　ＱＱ　ψくＬ（Ｊ　ＱＬＪ　ｍ（Ｊ　（ １−フロ　１−４Ｊ　ｖ＋Ｑ　コＬＩ　Ｃ：ｌｊ　ｅＬ）　ＬＬＪ　ＬＬＪΦＱ 　Ｉ／Ｉ＜　＋ＬＪ　−く　Φ←　島く　島ロ　Φ←　−く　μロ　ＱＯΦ０１ ／’ｌ憾　くロ　くＱ　くく　−←　＋Ｉ−ＩＪＩ−−Ｌｌ　１ｊ（Ｊ　（ＬＪ 　ψく　ψく＋、ｎＰ−＋ｘ〜ｃｏｘ　Ｏ〜　ｔ’ＪｃＤ　ｒｆｆｉｌ’ｆｆｉ 　ｕ’ｌ（Ｄ　Ｐ＋−Ｑ）（ｆ）　Ｃ１ｌ”ｌ　〜ＣＤ　マｍＬＩＪ　：５０ζ （ｔ　０１（ｊ　ｌ−１−１，５ｈ　ＣＪ　（＜口＜ト＜ＱａＪｃｐ　ａ＋＋　 −＜　Ｌ、（り　（Ｊ　ｔｐ　）−（（ｊ　ＣＪ　ｕ　（（Ｊ　１−　Ｃり　（ いく　−００（Ｊ　（（＋−Ｉ＋ｌ−ＩＪ　＜　−〇　−−←　く　Ｑ＋−（＜ 　ＬＪ−υくく口（（１−１−（（１−Φ（Ｊ　Ｃｊ　ｕ　ｕ　＜　１−　（１ −１−Ｃｊ　（ｌｊ　（Ｊ　ｌ−ＬＪ　ｅ　Ｌ）υロー（Ｕ　（←Ｑくくくロー １ｊｌＪ←く（ｊ　＋−（Ｊ　＋　（（ｕ　ｔＪ　ＣＪ　（Ｊりくり＋−ｔり　 （＋Ｊ口ｌ−Ｓ＋−リド−←ＩＪ　１−　ｊ−←（＋−１−（（−ｔ（Ｊ　ｌ− ＬＪ　ＣＤ←Φ←（Ｊ　ｌ−（＋−１−）　（５ΦくＣＪ　Ｉ＋Ｗ　１−　（０ １−ＩＪ　ｉ−＋　（（＋−Ｌ？　１−　（ＣＪくく口く←ＬＩ　Ｃｊ　（（口 ０口（＋　Ｌ）　（Ｌｌｊ−Ｃｊローく一ロＱトロくＱくく←←くり）＋Φ（（ ＋ｊ←Ｑ口く←（（Ｊ　Ｃｊ　（←←（１−（＜　（Ｌｌ　＜　（）−ロＩ−← く−Ｑ（Φ（Ｊ　＜　（←＜　ＬＪ　（Ｊ　！口←０　ＣＪ　＜　ｕ　ＬＪ　（ 口〈Ｉ−ロＩ−＋−ＬＪ　（＋−１−０１ｌ口く〈←く■Ｉ−Φ（ｊ　＜　ＬＪ 　ｌ−（Ｊ　（Ｊ　（Ｊ　（１−Ｃｊ　（ｕ　（（Ｊ　ｕ（＋−Ｌ）　ｌ−（ｈ −Ｌｌ　（口Φく口←＜＜＜＜Ｌ）　ｌ−１−１−（ｔＪ　ｌ−（Ｊ　１−　（ （ｊ　（＋−＋　ｌｊ　＋　＋（１−ＬＩ　ＣＪ■く←く口ＣＪ　ｌ−ＣＪ　（ Ｊ　Ｑ＜　ＣＪ　ＬＪＱｌ−ローロ（Ｊ（Ｊ口（（！　（１−一ロくφｕ　（ｌ ｊ　Ｌ）　１−■←（Ｃｊ　（ｊ　ｃｊ　＋−＜　ｗ　＜口く（Ｊ　（Ｃｊ　（ Ｌｌ　（ＣＪ　（（口←←くΦリドくＩ−（Ｊ　（Ｌ）　（１−１−ＣＪ　（Ｃ ｊ　（ＬＪ　ｕ　＜　（Ｊ　（Ｊ　＋Ｃ！＋　（ＣＪ　ロ）−１−＜　＜　１− ロｕｃｊ←Ｕ　（！　＜＝ 手　続　補　正　書（方式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳＱ２１００３７７ 平成　４年特許願第５０４７５７号 β３発明の名称 ヒ１〜結腸的腸癌において突然変異を起こ［、ている遺伝ｒ−゛３．補１１をす る者 １（件との関係　特８′ｌ出願人 住所 名　称　サ・ンヨーンス・ホブキンス・ユニバーシティ　（外２名）４代理人 住　所　東京都千−代［ＩＩ区大手町二Ｊ十１２番１号新大手町ビル　２０６区 電話３２７（１−６６４１〜６６４６ 氏名（２７７０）弁理士湯浅恭王 ５、捕ＩＩ−命令の１１付　・１′成　６年　４月１２１１　（定速１１）６　 補ｉＩｌの対象 （１）出願人の名称、代表者名を＋ｒＥ確に記載した国内書面（２）委ｆＴ’状 及び翻訳史 ＰＣＴ／ＩＩＳ　９２／［＋０３７７ 国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号ＧＯＩＮ　３３１５３　 Ｄ　８３１０−２Ｊ３３１５７４　Ａ　８３１０−２Ｊ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ（ＢＰ 、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ ）、ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　ＣＨ，Ｃ３，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＩ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，ＬＫ、　ＬＵ、 　ＭＧ、〜ｉＮ、ＭＷ、ＮＬ、Ｎｏ、’ＰＬ、ＲＯ、ＲＵ、ＳＤ、５Ｅ （７２）発明者　ヴオーゲルスタイン、パートアメリカ合衆国メリーランド州２ １２０８．ポルティモア、ブレトン・ウェイ　３７００Ｉ （７２）発明者　キンズラー、ケネス・ダブり二−アメリカ合衆国メリーランド 州２１２３４．ポルティモア、ハルステイード・ロード （７２）発明者　ホワイト、レイモンド・エルアメリカ合衆国ユタ州８４１０３ ．ソルト・レイク・シティ、エイティーンス・アベニュ（７２）発明者　中村　 祐輔 東京都清瀬市松山１−４３−３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヒトから単離された腫瘍組織において、野生型ＭＣＣ遺伝子をコードする配 列またはその発現産物の変更を検出し、該変更をその組織の新生物化の指標とす る； ことから成る、ヒトの新生物性組織の診断または予後診断方法。 ２．発現産物がｍＲＮＡ分子である請求項１に記載の方法。 ３．野生型ＭＣＣｍＲＮＡの変更が、組織由来のｍＲＮＡとＭＣＣ遺伝子プロー ブとのハイブリダイゼーションによって検出される請求項２に記載の方法。 ４．野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列の変更が、ＭＣＣ遺伝子のコード配列プロ ーブと組織から単離されたゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって検 出される請求項１に記載の方法。 ５．ヒトの非新生物組織から単離されたゲノムＤＮＡに対して、ＭＣＣ遺伝子の コード配列プローブを用いてサザンハイブリダイゼーションを行い；そしてＭＣ Ｃ遺伝子プローブの該腫瘍組織と非新生物組織に対するハイブリダイゼーション を比較する； ことをさらに含む請求項４に記載の方法。 ６．ＭＣＣ遺伝子プローブが制限断片の長さにおける多型性（ｒｅｓｔｒｉｃｔ ｉｏｎ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を検出 する請求項４に記載の方法。 ７．野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列の変更が、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌ ｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）を用いて組織中のＭＣＣ遺伝 子の全体若しくは一部の配列を決定することによって検出され、決定されたＭＣ Ｃ配列がＳＥＱ　ＩＤＮＯ：１に示された配列から変異していることを新生物化 の指標とする請求項１に記載の方法。 ８．分子（１）組織から単離されたＭＣＣ遺伝子またはＭＣＣ　ｍＲＮＡと、分 子（２）ヒト野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列に相補的な核酸プローブとを互い にハイブリダイズさせて二本鎖を形成させたときの分子間ミスマッチを同定する ことによって、野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列の変更を検出する請求項１に記 載の方法。 ９．ＭＣＣ遺伝子プローブが、（１）ヌクレオチド２３０５−２４０５；および （２）ヌクレオチド１６７９−１８６２から成るグループから選択されるエクソ ンとハイブリダイズする請求項４に記載の方法。 １０．組織中のＭＣＣ遺伝子配列を増幅し、増幅されたＭＣＣ配列をＭＣＣ配列 を含む核酸プローブに対してハイブリダイズさせることによって、野生型ＭＣＣ 遺伝子のコード配列の変更を検出する請求項１に記載の方法。 １１．組織中のＭＣＣ遺伝子の分子クローン化を行い、クローン化したＭＣＣ遺 伝子の全体または一部の塩基配列を決定することによって、野生型ＭＣＣ遺伝子 のコード配列の変更を検出する請求項１に記載の方法。 １２．野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列の変更の検出が、欠失突然変異のスクリ ーニングを含む請求項１に記載の方法。 １３．野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列の変更の検出が、点突然変異のスクリー ニングを含む請求項１に記載の方法。 １４．野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列の変更の検出が、挿入突然変異のスクリ ーニングを含む請求項１に記載の方法。 １５．ヒトから単離される組織が結腸粘膜に由来する請求項１に記載の方法。 １６．発現産物が蛋白質分子である請求項１に記載の方法。 １７．野生型ＭＣＣ蛋白質の変更がイムノプロッティングによって検出される請 求項１６に記載の方法。 １８．野生型ＭＣＣ蛋白質の変更が免疫細胞化学によって検出される請求項１６ に記載の方法。 １９．野生型ＭＣＣ蛋白質の変更が、該ＭＣＣ蛋白質と第二の細胞蛋白質との結 合相互作用の分析によって検出される請求項１６に記載の方法。 ２０．第二の細胞蛋白質がＧ蛋白質である請求項１９に記載の方法。 ２１．野生型ＭＣＣ蛋白質の変更が、リン脂質代謝物の分析によって検出される 請求項１６に記載の方法。 ２２．野生型ＭＣＣ遺伝子の機能を失っている細胞に野也型ＭＣＣ遺伝子を導入 して、該野生型ＭＣＣ遺伝子を細胞内で発現させる；ことから成る、ＭＣＣ遺伝 子の突然変異によって野生型ＭＣＣ遺伝子の機能を失っている細胞に、該機能を 付与する方法。 ２３．ＭＣＣ遺伝子突然変異を修復するための二重組み換え事象によって、導入 された野生型ＭＣＣ遺伝子が細胞内に存在する内在性突然変異ＭＣＣ遺伝子と組 み換えを起こす請求項２２に記載の方法。 ２４．野生型ＭＣＣ遺伝子の機能を失っている細胞に、野生型ＭＣＣ遺伝子のう ち該細胞の非新生物性増殖に必要なＭＣＣ蛋白質の部分をコードする部分を導入 して、該部分を細胞内で発現させる；ことから成る、ＭＣＣ遺伝子の突然変異に よって野生型ＭＣＣ遺伝子の機能が変更されている細胞に、該機能を付与する方 法。 ２５．野生型ＭＣＣの機能を模倣する分子を細胞に導入する；ことから成る、Ｍ ＣＣ遺伝子の突然変異によって野生型ＭＣＣ遺伝子の機能が変更されている細胞 に、該機能を付与する方法。 ２６．ポリメラーゼ連鎖反応によってＭＣＣ遺伝子のヌクレオチド配列の決定に 用いるための、染色体５ｑのバンド２１に由来する配列を有する一対の一本鎖Ｄ ＮＡプライマーであって、該プライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応によりＳ ＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に示される配列を有するＤＮＡが合成される上記プライマ ー。 ２７．各５′末端に制限酵素部位を有する請求項２６に記載のプライマー。 ２８．ＭＣＣイントロンに対応する配列を有する請求項２６に記載の一対のプラ イマー。 ２９．ヒト野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列に相補的な核酸プローブ。 ３０．ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１に示される（１）ヌクレオチド２３０５−２４０ ５；および（２）ヌクレオチド１６７９−１８６２から成るグループから選択さ れるエクソンにハイブリダイズする核酸プローブ。 ３１．ＭＣＣ遺伝子のコード配列の全てのヌクレオチドと全体としてハイブリダ イズする一群の核酸プローブから構成される、野生型ＭＣＣ遺伝子の変更を検出 するためのキット。 ３２．ヒトの体からのサンプルにおける、野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列また は野生型ＭＣＣ発現産物の変更を検出し、該変更をそのヒトの新生物組織の存在 の指標とする； ことから成る、ヒトにおける新生物組織の存在を検出する方法。 ３３．ヒトの体からのサンプルが、血清、大便、尿および唾液から成るグループ から選択される請求項３２に記載の方法。 ３４．血液および胎児組織から成るグループから選択されるヒトのサンプル中の 野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列またはその発現産物の変更で、癌に成りやすい 素因を示唆するような変更を検出する；ことから成る、ヒトの癌に対する遺伝的 素因を検出する方法。 ３５．発現産物がｍＲＮＡ分子である請求項３４に記載の方法。 ３６．野生型ＭＣＣ　ｍＲＮＡの変更が、組織由来のｍＲＮＡとＭＣＣ遺伝子プ ローブとのハイブリダイゼーションによって検出される請求項３５に記載の方法 。 ３７．野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列の変更が、ＭＣＣ遺伝子のコード配列プ ローブと組織から単離されたゲノムＤＮＡとのハイブリダイゼーションによって 検出される請求項３４に記載の方法。 ３８．ＭＣＣ遺伝子のコード配列プローブが制限断片の長さにおける多型性を検 出する請求項３７に記載の方法。 ３９．ポリメラーゼ連鎖反応によって組織中のＭＣＣ遺伝子の全体または一部の 塩基配列を決定して野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列の変更を検出し、決定され たＭＣＣ配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：１から変異していることを癌になりやすい 素因の指標とする請求項３４に記載の方法。 ４０．分子（１）該組織から単離されたＭＣＣ遺伝子またはＭＣＣ　ｍＲＮＡと 分子（２）ヒト野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列に相補的な核酸プローブとを互 いにハイブリダイズさせ二本鎖を形成させたときの分子間ミスマッチを同定する ことによって、野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列の変更を検出する請求項３４に 記載の方法。 ４１．ＭＣＣ遺伝子プローブが、（１）ヌクレオチド２３０５−２４０５；およ び（２）ヌクレオチド１６７９−１８６２から成るグループから選択されるエク ソンにハイブリダイズする請求項３７に記載の方法。 ４２．組織中のＭＣＣ遺伝子配列を増幅し、増幅したＭＣＣ配列とＭＣＣ遺伝子 のコード配列から成る核酸プローブとをハイブリダイズさせることによって、野 生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列の変更を検出する請求項３４に記載の方法。 ４３．組織中のＭＣＣ遺伝子の分子クローン化を行い、クローン化したＭＣＣ遺 伝子の全体または一部の塩基配列を決定することによって、野生型ＭＣＣ遺伝子 のコード配列の変更を検出する請求項３４に記載の方法。 ４４．野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列の変更の検出が、欠失突然変異のスクリ ーニングを含む請求項３４に記載の方法。 ４５．野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列の変更の検出が、点突然変異のスクリー ニングを含む請求項３４に記載の方法。 ４６．野生型ＭＣＣ遺伝子のコード配列の変更の検出が、挿入突然変異のスクリ ーニングを含む請求項３４に記載の方法。 ４７．発現産物が蛋白質分子である請求項３４に記載の方法。 ４８．野生型ＭＣＣ蛋白質の変更がイムノプロッティングによって検出される請 求項４７に記載の方法。 ４９．野生型ＭＣＣ蛋白質の変更が免疫細胞化学によって検出される請求項４７ に記載の方法。 ５０．野生型ＭＣＣ蛋白質の変更が、該ＭＣＣ蛋白質と第二の細胞蛋白質との結 合相互作用の分析によって検出される請求項４７に記載の方法。 ５１．第二の細胞蛋白質がＧ蛋白質である請求項５０に記載の方法。 ５２．ＭＣＣ遺伝子のコード配列を含むｃＤＮＡ分子。 ５３．アミノ酸配列がＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：２に示すものに対応する、他のヒト 蛋白質を実質的に含まないヒトＭＣＣ蛋白質の調製品。 ５４．ヒトＭＣＣ蛋白質に対して免疫反応性だが、他のヒト蛋白質には実質的に 免疫反応性でない抗体の調製品。