JPH06509717A - ヒトカルシウムチャンネル組成物および方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ｎ、異種ＤＮＡにより少なくとも２つのサブユニットかコードされ、異種ＤＮＡ によりコートされるサブユニットはα１サブユニツトに加えて、βサブユニット へまたはα２サブユニットである、請求の範囲第２１項に記載の真核細胞。

２３、カルシウムチャンネルは異種ＤＮＡにコートされる少なくとも３つのサブ ユニットを特徴する請求の範囲第２２項に記載の真核細胞。

２４、カルシウムチャンネルは異種ＤＮＡにコートされる少なくとも４つのサブ ユニットを特徴する請求の範囲第２３項に記載の真核細胞。

２５、８ＥＫ　２９３細胞、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓ ｔｅｒ）卵巣細胞、アフリカングリーン猿（Ａｆｒｉｃａｎｇｒｅｅｎ　ｍｏｎ ｋｅｙ）細胞およびマウスＬ細胞よりなる群から選択される、請求の範囲第１３ 項に記載の真核細胞。

２６、８ＥＫ　２９３細胞、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓ ｔｅｒ）卵巣細胞、アフリカングリーン猿（Ａｆｒｉｃａｎｇｒｅｅｎ　ｍｏｎ ｋｅｙ）細胞およびマウスＬ細胞よりなる群から選択される、請求の範囲第２０ 項に記載の真核細胞。

２７、機能的異種カルシウムチヤンネルを有する真核細胞であって、該細胞中で ヒトのカルシウムチヤンネルのα、サブユニットへ翻訳可能な最初のＲＮＡ、該 細胞中でヒトのカルシウムチャンネルのβサブユニットへ翻訳可能な２番目のＲ ＮＡ、該細胞中でヒトのカルシウムチヤンネルのα２サブユニツトへ翻訳可能な ３番目のＲＮＡ、該細胞中てヒトのカルシウムチャンネルのγサブユニットへ翻 訳可能な４番口のＲＮＡよりなる群から選択される、少なくとも１つのＲＮＡ転 写体を導入することよりなる方法により産生される、上記細胞。

２８、両生類の卵母細胞である、請求の範囲第２７項に記載の真核細胞。

２９、異種カルシウムチャン不ルは、該細胞に対して異種であるＤＮＡまたはＲ ＮＡによりコートされる少なくとも１つのヒトのカルシウムチャンネルサブユニ ットを介在し、 機能的、異種カルシウムチャン不ルを有する真核細胞を、上記化合物とカルシウ ムチャシフ、ル選択性イ才、を介在する溶液中に懸濁し、該細胞の細胞膜を脱分 極して、 該細胞中を流れる電流を検出することよりなるカルシウムチャンネルの活性を調 節する化合物を同定するための方法であって、検出される電流は、同しカルシウ ムチャンネル選択性イオンは存在するか上記化合物の非存在下で、上記細胞また は実質的に同じ細胞を脱分極することにより産生される電流とは区別されること を特徴とする、上記方法。

３０、脱分極の前に、細胞に対して内因性であるカルシウムチャンネルを実質的 に不活性化する保持電位に細胞を特徴する請求の範囲第２９項に記載の方法。

３１、請求の範囲第３０項に記載の方法であって、細胞は両生類の卵母細胞であ り、 異種サブユニットは卵母細胞に注入されたＲＮＡによりコードされ、異種サブユ ニットはα１サブユニットとβサブユニットを含有する、上記方法。

３２、ＲＮＡにコートされるサブユニットは、α２ザブユニツト、γサブユニッ トまたはα２サブユニツトおよびγサブユニットをさらに含む、請求の範囲第３ １項に記載の方法。

３３、細胞はＨＥＫ２９３細胞てあり、異種サブユニットは異種ＤＮＡにコート される、請求の範囲第２９項に記載の方法。

３４、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡにコードされる、ヒトのカルシウムチャ ンネルの実質的に純粋なα１サブユニット。

３５、請求の範囲第」項に記載のＤＮＡにコートされる、ヒトのカルシウムチャ ンネルの実質的に純粋なα２サブユニツト。

３６、請求の範囲第８項に記載のＤＮＡにコードされる、ヒ１−のカルシウムチ ャンネルの実質的に純粋なβサブユニット。

３７、請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡにコードされる、ヒトのカルシウムチ ャンネルの実質的に純粋なγサブユニット。

３８、ヒトのカルシウムチャンネルはヒト神経カルシウムチャンネル、ヒト骨格 筋カルシウムチャンネルまたはヒト大動脈カルシウムチャンネルである、請求の 範囲第１項に記載のＤＮＡ断片。

明　細　書 ヒトカルシウムチャンネル組成物および方法本出願は、１９９２年４月１０日に 提出された米国出願下０７／８６８，３５４号の一部継続出願であり、これは１ ９９１年８月１５日に提出された米国出願下０７／７４５，２０６号の一部継続 出願であり、これは１９９０年１１月３０Ｅｌｉ：提出された米国出願下０７／ ６２０，２５０号の一部継続出願であり、これは現在は放棄されている１９８８ 年４月４日に提出された米国出願下０７／１７６．８９９号の一部継続出願てあ り、また１９９０年２月２０日こ提出された米国出願下０７／４８２，３８４号 の一部継続出願でもある。本出願はまた、１９９２年７　Ｊｌ　１３日に提出さ れた米国出願下０７／９４１．２３１号の一部継続出願でもあり、これは現在は 放棄されている１９８９年４月４日に提出された米国出願下０７／６０３，７５ １号の継続出願である。

技術分野 本発明は分子生物学と薬理学に関する。さらに詳しくは本発明はカルシウムチャ ンネル組成物とその作製法および使用法に関する。

発明の背景 カルシウムチヤンネルは、細胞外液から細胞へのカルシウムイオンの調節された 侵入を可能にする、膜を介する複数のサブユニット蛋白である。動物界の細胞、 そして少なくとも細菌細胞、菌類細胞および植物細胞は、１つまたはそれ以上の カルシウムチヤンネルを有する。

最も一般的なタイプのカルシウムチャンネルは、電位依存型である。細胞内ヘカ ルシウムイオンか流入するために電位依ｒｒ性のチャンネルか「開く」には、両 分Ｆｉ（ｄｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）Ｌ／て、チャンネルを有する細胞の内 側と細胞を浸している細胞外媒体との間の電位差をあるレベルにする必要かある 。細胞内へのカルシウムイオンの流入速度はこの電位差に依存する。動物のすへ ての［励起０工能なＪ細胞（例えは中枢神経系（ＣＮＳ）のニューロン、末梢神 経細胞、および筋肉細胞（骨格筋、ＩＬＮ筋、そして静脈および動脈の平滑筋を 含む））は、電位依存性のカルシウムチャンネルをイ１′する。

骨格筋、心筋、肺、平滑筋および脳を含む種々の組織の哺乳動物細胞で、種々の 型のカルシウムチャンネルか同定されている（ヒーン（Ｂｅａｎ　Ｂ、Ｐ、　） ら（１９８９）　、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｐｈｙｓｉｏｌ　、５１　：３６７−３８ ４、およびヘス（Ｈｅｓｓ、Ｐ）（１９９０）、Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｎｅｕｒｏｓ ｃｉ、、５６　：　３３７を参照）。これらの異なる型のカルシウムチャンネル は、電流動力学、電位感受性およびカルシウムチヤンネルアゴニストやアンタゴ ニストに対する感受性により、４つのクラス（Ｌ−１Ｔ−１Ｎ−およびＰ−型） に分類される。

カルシウムチャンネルは複数のサブユニットの蛋白である。例えばウサギの骨格 筋のカルシウムチャンネルは２つの大きなサブユニット（α１とα２）（これら の分子量は約１３０と約２００キロダルトン（ｒｋＤ」）の間である）と、分子 量か約６０ｋＤ未満の１つから３つの異なる小さいサブユニットを有する。大き いサブユニットの少なくとも１つと、おそらくは小さいサブユニットのいくつか はグリコジル化されている。サブユニットのいくつかはリン酸化されることかで きる。哺乳動物の筋組織から単離した後Ｆデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリ アクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により分析する時、α１サブユニツト の分子量は約１５０から約１７０ｋＤであり、種々の１，４−ジヒドロピリジン （ＤＨＰｓ）やフェニルアルキルアミンに対して特異的結合部位を有する。非還 元条件下（Ｎ−エチルマレイミドの存在下）では、α、サブユニットは５ＤＳ− ＰＡＧＥで、分子量か約１６０−１９０ｋＤに対応するバントとして泳動する。

還元すると大きい断片と小さい断片か離れる。ウサギの骨格筋のカルシウムチャ ンネルのβサブユニットは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析で分子量か５２−６５ｋＤの 、リン酸化された蛋白である。このサブユニッ１−は還元条件下に対して感受性 かない。カルシウムチャンネルのγサブユニット（これは必ずしもすへての精製 された調製物に観察されるわけてはない）は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析では見かけ の分子量か３Ｏ−３３ｋＤの糖蛋白として現れる。

カルシウムチャンネルの構造と機能を研究するためには、大量の純粋なチャンネ ル蛋白か必要である。これらの複数サブユニット蛋白の性質は複雑であり、蛋白 の供給源組織中のカルシウムチャンネルの濃度に変動があり、組織中に異なった 集団のカルシウムチヤンネルカイγ在し、目的の組織を得ることか困難であり、 そして単離操作中に本来の蛋白の構造か修飾を受けるため、高度に精製された、 完全にインタクトのカルノウｌ、チャンネル蛋白を大量に得ることは極めて困難 である。

大多数の細胞中には異なる型のカルシウムチャンネルの集団か混合して存在する ことにより、細胞全体の分析による特定の型のカルシウムチャンネルの性状解析 は大幅に限定されている。個々のカルシウムチャンネルを調へるために使用され るノングルチャンネル記録法は、チャンネルの分子構造や生化学的組成に関して まったく知見を提供しない。さらにこの型の分析を実施するためには、チャンネ ルは本来の機能や薬理学的相互作用に重要かも知れない他の細胞成分から単離さ れる。

カルシウムチヤンネルをコー１へする１つまたは複数の遺伝子の性状解析は、異 なる型のカルシウムチャンネルを性状解析するための別の手段を与える。カルシ ウムチャンネル蛋白をコートする遺伝子のコート領域の完全なヌクレオチド配列 から決定されるアミノ酸配列は、蛋白の一次構造である。さらにカルシウムチャ ンネル蛋白の二次構造とこの蛋白の膜との関係は、−次構造の解析に基づいて決 められる。例えはウサギの骨格筋のカルシウムチャンネルのα１サブユニ・ノド 蛋白のハイｌ”　ａバシープロソトは、この蛋白は、それぞれか推定の６つの膜 通過領域Ｎｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｒｅｇｉｏｎｓ）よりなる４つの内部リ ピートを含Ｙ丁することを示している（タナへ（Ｔａｎａｂｅ、Ｔ）ら、１９８ ７、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：３１３）。

ウサギの骨格筋カッじラムチャン不ルのα１、α２、βおよびγサブユニット（ タナへ（Ｔａｎａｂｅ、Ｔ’）ら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：３１３− ３１８、国際特許出願下ＷＯ８９１０９８３４、これは米国出願下０７／６０３ ゜７５１号であり、これは米国出願下０７／１７６．８９９号の一部継続出願で ある。ルーズ（Ｒｕｔｈ）ら、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ、２４５：１１１５− １１１８、および１９９０年２ＪＪ２０Ｂ＋こ提出された米国特許出願下４８２ ．３８４号を参照）、および１ｌＩｔｉ（ヒエル（Ｂ　ｉ　ｅ　ｌ、Ｎ１．）、 １９９０、ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、２６９：　１０９−４１２）のカルシウム イオンマ、ルのｃ　ＤＮＡとアミノ酸配列か決定されている。

さらにウサギの脳のカルシウムチャンネルをコートするｃＤＮＡクローン（ＢＩ チャンネルと呼ばれている））か単離されている（モリ（Ｍｏｒｉ、Ｙ）ら、１ ９９ＬＮａｔｕｒｅ、３５０：３９８−４０２）、カルシウムチャンネルα１サ ブユニツトのいくつかの異なるサブタイプ（う・ソトの脳のクラスＡ、　Ｂ、Ｃ およびＤ）の部分をコートする部分的ｃＤＮＡクローンか、ラットの脳のｃＤＮ Ａライブラ１ニーから単離されている（スタツチ（Ｓｎｕｔ　Ｃｈ、Ｔ、）ら、 １９９０、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　］、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、ＵＳＡ、８７：３３ ９１−３３９５）。さらに最近は、ラットの脳の全長クラスＡｃＤＮＡクローン （スター（Ｓｔａｒｒ、Ｔ、）、１９９１、Ｐｒｏｃ、　Ｎａ　ｔ　１．Δｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、８８：５６２１−５６２５）、およびクラス（Ｊ：ｃＤＮ Ａクローン（スタ・ソチ（Ｓｎｕｔｃｈ、Ｔ、）ら、１９９Ｌ　Ｎｅｕｒｏｎ、 ７：４５−５７）か単離されている。クツ１−脳のクラスＣのＤＮＡによりコー ドされるアミノ酸配列は、ウサギ心筋のカルシウムチャンネルのα１サブユニツ トをコートするＤＮＡと約９５％同一であるか、ラット脳のクラスＡのＤＮＡに よりコートされるアミノ酸配列は、ウサギの骨格筋または心筋のα１サブユニツ トをコードするＤＮＡとわずかに３３％の配列か同一である。別のラット脳のカ ルシウムチャンネルα１サブユニツトをコートするｃＤＮＡクローンも得られて いる（ヒューイ（：Ｉｕｉ。

Ａ、）ら、１９９１ＳＮｅｕｒｏｎ、７：３５−４４）ａこのクローンによりコ ートされるアミノ酸配列は、ウサギの骨格筋またはｒＬ藁のカルシウムチャンネ ルＤＮＡによりコードされる蛋白と約７０％の相同性を有する。う・ソト脳のク ラスＣα１サブユニツトをコートするｃＤＮＡに密接に関連するｃＤＮＡ、およ び明らかに異なるカルシウムチヤンネルのα、サブユニットをコートする他の部 分的ｃＤＮＡクローンに密接に関連する部分的ｃＤＮＡＤＮＡクローンも単離さ れている（スタッチ（Ｓｎｕ　ｔ　ｃｈ、　Ｔ、）ら、１９９１、Ｎｅｕｒｏｎ 、７４５−５７、ペレズーレイエス（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅｓ、Ｅ、）ら、１９ ９０、Ｊ。

Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　、２６５：２０４３０；およびヒューイ（Ｈｕ　ｉ、　 Ａ、　）ら、１９９１．Ｎｅｕｒｏｎ、７：３５−４４を参照）。池のノＪルシ ウムチャンネルをコートするＤＮＡクローンも同定され、単離されている。

前記のものとは異なるウサギまたはラットのα１サブユニツトｃＤＮＡクローン のいくつか・を用いて、カルシウムチヤンネルサブユニットをコードするｃＤＮ Ａか発現されている。ウサギの骨格筋カルシウムチャンネルα１サブユニツトを コートするＤＮＡでトランスフェクションされた薩歯類のし細胞で、電圧依存性 のカルシウム電流か検出されている（ペレズーレイエス（Ｐｅｒｅｚ−Ｒｅｙｅ ｓ、Ｅ、）　ら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４０：２３３−２３６．１９８９ ）。これらの電流はカルシウムチャンネルアゴニストであるＢａｙ　Ｋ８６４４ の存在下で上昇する。Ｂａｙ　Ｋ８６４４感受性Ｂ　ａ　”ｉｔ流は、ウサギの 心筋カルシウムチヤンネルα１サブユニツトｃＤＮＡのインビトロ転写体を注入 した卵母細胞中て検出されている（ミカミ（Ｍｉｋａｍｉ、Ａ、）ら、１９８９ 、Ｎａｔｕｒｅ、３４０：２３０−２３３）。これらの電流は、カルシウムチャ ンネルアンタゴニストであるニフェジピン（ｎ　ｉ　ｆ　ｅｄ　ｊｐ　１ｎｅ） の存在下で大きく低下した。ウサギの心筋カルシウムチヤンネルα１サブユニソ Ｉ・をコートするＲＮＡとウサギの骨格筋カルシウムチヤンネルα２サブユニツ トをコードするＲＮＡを同時に注入した卵母細胞のバリウム電流は、ウサギの心 筋カルシウムチャンネルα１サブユニツトをコートするｃＤＮＡの転写体を注入 した卵母細胞のそれより、２倍以上大きかった。ウサギの肺カルシウムチャンネ ルα１サブユニノ十とウサギの骨格筋カルシウムチャンネルα２サブユニツトを コートするＲＮＡを卵母細胞に同時に注入した時、同様の結果か得られた。この ／＜リウム電流は、ウサギの肺カルシウムチヤンネルα１ザブユニットをコート するＲＮＡのみを注入した卵母細胞中で検出されたバリウム電流より大きかった （ビニル（Ｂｉｅｌ、Ｍ　）ら、１９９０、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２６９ ：４０９−４１２）。

１勺１ｉ−ギの脳ＢｌチャンネルをコートするインヒドロのＲＮＡ転写体を注入 した卵ｆ１細胞で、内部バリウム電流か検出されている（モリ（Ｍｏｒｉ）ら、 １９９１、Ｎａｔｕｒｅ、３５０　：３９８−４０２）。ウサギの骨格筋カルシ ウムチャンネルα２、βまたはα２、βそしてγサブユニットのインヒドロの転 写体をＢＴをコーｉ〜するｃＤＮＡの転写体と同ｎキに注入した時、これらの電 流は２オーダー上胃した。Ｂ１チャンネルとウサギの骨格筋カルシウムチャンネ ルα２およびβをコー！・する転写体を同時注入した卵母細胞中のバリウム電流 は、カルシウムチャンネルアンタゴニストであるニフェジピンまたはω−ＣｇＴ ｘにより影響を受けず−Ｂａｙ　Ｋ８６４４とアゲレノブノスアベルタ（Ａｇｅ 　ｌ　ｅｎｏｐｓ　ｉ　５ａｐｅｒｔａ）からの精製していない毒により阻害さ れた。

ウサギのカルシウムチャンネルα１サブユニツトをコートするｃＤＮΔＤＮＡク ローンｃＤＮＡクローンの転写体の組換え発現の研究の結果は、α１サブユニツ トはカルシウムか細胞内へ入るために通過する孔を形成することを示している。

１つの成分として各α、サブユニットを含有するカルシウムチャンネルによりイ ンビボにより実際に発生される電流に対する、これらの絹換え細胞中で発生する バリウム電流の関係は、不明である。異なる型のカルシウムチャンネルを完全に かつ正確に性状解析し評価するために、インビボで見いだされるすへてのサブユ ニットを含有する組換えチャンネルの機能的性質を調へることか必須である。ウ サギやラットのカルシウムチヤンネルサブユニットをコートするＤＮＡの発現は あまりうまく行っていないか、ヒトのカルシウムチャンネルについてはさらにう まく行っていない。ヒ）へのカルシウムチャンネルの構造や機能および遺伝子発 現についてはほとんど知られていない。ヒトのカルシウムチャンネルの構造と機 能か理解されれば、何らかの方法でカルシウムチャンネルを調節する物質か同定 されるであろうし、これはそのような疾患の治療に使用できる可能性がある。

カルシウムチヤンネルは種々の組織中に存在し、細胞内のカルシウムチヤンネル の調節に中心的な役割を果たすため、神経伝達物質の放出、筋肉の収縮、ベース マーカー活性、およびホルモンや他の物質の分泌なとの、動物中のいくつかの基 本的な過程でカルシウムチャンネルか関与すると考えられている。これらの過程 は多くのヒトの疾患（例えは中枢神経系疾患および心血管系の疾患）に関係かあ るよってある。カルシウムチャンネルはまた多くの疾患で関与すると考えられて いる。動物（ヒトを含む）の種々の心血管系の疾患の治療に仔効な多くの化合物 は、心臓および／または血管の平滑筋中に存在する電位依存性のカルシウムチャ ンネルの機能を調節することにより、有用な作用を示すと考えられている。これ らの化合物の多くはカルシウムチヤンネルに結合し、細胞膜の脱分極に応じて細 胞中へのかルシウムの流入を阻止、またはその速度を低下させる。

他のｌＩ！１器系（例えは中枢神経系）のカルシウムチャンネルと相互作用する 化合物の薬理作用の理解は、目的の治療作用（例えば神経萎縮性疾患および心血 管系疾患の治療）を有するように、ヒトのカルシウムチャンネルのサブタイプと 特異的に相互作用する化合物の合理的な設計に役立つかも知れない。しかしその ような理解と治療上有効な化合物を合理的に設計てきる能力は、特に中枢神経系 におけるヒトのカルシウムチヤンネルのタイプや個々のサブタイプの分子的性質 を個々にめることかてきないこと、カルシウムチャンネル作用のある化合物の特 異性を評価するのに使用するための特異的なチャンネルのサブタイプの純粋な調 製物か人手できないことにより制限されている。ヒトのカルシウムチャンネルは ブユニットをコートするＤＮＡの同定とカルシウムチャンネルサブユニットと機 能的カルシウムチャンネルの発現のためのそのようなりＮＡの使用は、治療上有 効な化合物のスクリーニングと設計に役にたってあろう。

従って本発明の目的は、特異的カルシウムチャンネルはブユニツトをコートする ＤＮＡを与えること、および組織特異的またはサブタイプ特異的組換え力ルシウ ｌ、チャンネルを存する真核細胞を与えることである。本発明の別の目的は、カ ルノウムチヤンネルアンタゴニストおよびアゴニストとして作用する治療薬とし ての可能性のある化合物の同定のための測定法を与えることである。

発明の要Ｖ］ 、１つまたはそれ以トのカルシウムチヤンネルサブユニット（特にヒトのカルシ ウムチャン不ルサブユニッｌ〜）をコー１〜する異種ＤＮＡを含有する真核細胞 、または１つまたはそれ以上のサブユニットをコートするＤＮＡクローンのＲＮ Ａ転写体を含有する真核細胞か、与えられる。好適な実施態様において、細胞は ヒトα１サブユニット（好ましくは少なくともα、ＤまたはαＩ８サブユニ・ソ １へ）をコートするＤＮＡまたはＲＮＡを含有する。さらに好適な実施態様にお いて、細胞は追加の異種ＤＮＡ　（少なくとも１つのβ、α２またはγサブユニ ｙ　ｔ□か含まれる）をコートするＤＮＡまたはＲＮＡを含有する。そのような 実施態様において、サブユニットをコートするｃＤＮＡクローン（例えばα１、 α、十β、α１＋β↓α２）の１つ、２つ、３つまたは４つの任意の組合せて、 安定にまたは一過性にトランスフエクソヨンされた真核細胞か与えられる。さら に好適な実施態様において、異ｆｌＤＮＡによりコートされるサブユニソ１−は ヒトのサブユニ・ノドである。

好適な実施態様において、細胞はそのような異種カルシウムチャンネルサブユニ ットを発現し、膜通過性異種カルシウムチャンネル中に１つまたはそれ以上のサ ブユニットを含有する。さらに好適な実施態様において真核細胞は、カルシウム チャンネル選択性イオンの通過のための門になることかでき、および／または生 理的濃度で異種カルシウムチャンネルの活性を調節する化合物に結合することか できる、機能的異種カルシウムチャンネルを発現する。ある実施態様において異 種カルシウムチヤンネルは、少なくとも１つの異種カルシウムチャンネルサブユ ニットを含む。最も好適な実施態様において、真核細胞の表面に発現されるカル シウムチャンネルは、実質的にまたは完全に異種ＤＮＡまたはＲＮＡによりコー ドされるサブユニットよりなる。好適な実施態様において、そのような細胞の異 種カルシウムチヤンネルは、宿主細胞の任意の内因性カルシウムチャンネルから 区別することかできる。

ある実施態様において、カルシウムチヤンネルサブユニットをコードする異種Ｄ ＮＡを含有する組換え真核細胞は、１つまたはそれ以上のサブユニットをコート するＤＮＡで１ヘランスフエクソヨンして産生されるか、または１つまたはそれ 以上のカル７′ウムチヤンネルサブユニツトをコードするｃＤＮＡのＲＮＡ転写 体か注入される。サブユニットをコードするＤＮＡの安定なまたは一過性の発現 のために、ＤＮＡは線状ＤＮＡ断片として導入されるか、または発現ベクター中 に含まれる。ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡを含有 するへフタ−し与えられる。

異種カルシウムチャン不ルを発現する真核細胞は、カルシウムチヤンネル機能の 測定法で使用されるか、または機能性組換えヒトカルシウムチャンネルを構成す るのに必要なものより少ない、サブユニットをコートする核酸で形質転換した細 胞の場合は、そのような細胞はカルシウムチャンネル活性に対する追加のサブユ ニッ）・の影響を評価するのに使用される。追加のサブユニットは、そのような 細胞を、ヒトカルシウムチャンネルサブユニットをコートする１つまたはそれ以 上のＤＮＡクローンまたはＲＮＡ転写体でそのような細胞を引き続いてトランス フェクションすることにより与えられる。

膜にまたがる異種カルシウムチャンネルを発現する組換え真核細胞は、カルシラ ムチャン不ル活性を調節する化合物を同定するのに使用される。特にこの細胞は 、ヒトでのカルシウムチヤンネル活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定 するための測定法、および／または種々のカルシウムチャンネルサブユニノ１− の、カルシウムイ才二の透過ど透過の制御への寄与を評価するのに使用される。

カルシウムチヤンネル活性を調節する化合物の同定に真核細胞を使用する測定法 か与えられる。

ヒトのカルシウムチャン不ルサブユニットをコートする単離され精製されたＤＮ Ａ断片か惇えられる。ヒトカルシウムチャンネルのα１サフ゛ユニツトをコード するＤＮＡ、およびそのようなりＮＡの転写により作成されたそのようなサブユ ニットをコートするＲＮＡか与えられる。特に電位依存性のヒトカルシウムチャ ンネル（ＶＤＣＣｓ）タイプＡ、タイプＢ（ＶＤＣＣＩＶとも呼ばれる）、タイ プＣ（ＶＤＣＣｎとｔ、呼ばれる）およびタイプＤ（ＶＤＣＣＩＩＩとも呼ばれ る）の飽サブユニットをコートするＤＮＡ断片か与えられる。

特に、基本的に配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌの残基１０−２１６１として示されるアミノ 酸を含有するα１ＤサブユニットをコートするＤＮＡか与えられる。また、配列 ＩＤ　Ｎｏ、ｌのアミノ酸３７３−４０６の代わりに配列ＩＤ　Ｎｏ、２のアミ ノ酸１−３４として示されるアミノ酸を実質的に含有するα１ｏサブユニツトを コー、１〜するＤＮＡも与えられる。実質的に配列ＩＤ　Ｎｏ、３または配列Ｉ ＤＮｏ、６に示されるアミノ酸を含むα１ｏサブユニソ１〜をコートするＤＮＡ 、および実質的に配列ＩＤ　Ｎｏ、７または配列ＩＤ　Ｎｏ、８に示されるアミ ノ酸を３むα１．サブユニットをコートするＤＮＡも与えられる。ブダペスト条 約（Ｂｕｄａｐｅｓｔ　Ｔｒｅａｔｙ）に従い、αｌＡをコートするＤＮＡを含 有する大腸菌（■５．ｃｏｌｉ）宿主のファージ溶解物は、アメリカンタイプカ ルチャールクシ９ン（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏｌｌｅ ｃｔｉｏｎ）（米国２０８５２メリーラント州ロツクビル、バークローンドライ ブ＋２３０１）に、整理番号　で寄託されている。そのようなファージ中のＤＮ Ａは配列ＩＤ　Ｎｏ、２１に示される配列を存するＤＮＡ断片を含有する。この 断片はα１ＡをコートするＤＮＡにハイブリダイズするか、αＩＢをコートする ＤＮＡにはハイブリダイズしない。

ヒＩ・のカルシウムチャンネルのα、サブユニットをコードするＤＮＡと、その ようなりＮＡの転写により作成される、そのようなサブユニットをコードするＲ ＮＡか与えられる。また、組織特異的スプライス変種を含む、α２サブユニツト のスプライス変種をコーｉ・するＤＮＡも与えられる。特にα２．−α２ｏサブ ユニツトサブタイプをコートするＤＮＡか与えられる。特に好適な実施態様にお いて、α２サブユニツトをコートするＤＮＡは、配列ＩＤ　Ｎｏ、１１に示され るアミノ酸をコー１〜するＤＮＡと、配列ＩＤ　Ｎｏ、１１のヌクレオチド１６ ２４と１６２５の間に挿入された配列ＩＤ　Ｎｏ、１３のＤＮＡを含む−・広軌 写体の別処理により産生される。

ヒトのカルシウムチャンネルβサブユニットをコートする単離され精製されたＤ ＮＡ断片（β、サブユニットスプライス変種とβ２サブユニットをコートするＤ ＮＡを含む）か与えられる。特にβ１サブユニットとβ２サブユニツトをコート するＤＮＡ　（β、サブユニットスプライス変種β、−１−β１−、を含む）か 与えられる。また、ＤＮＡの転写により作成されるβサブユニットをコートする ＲＮＡも与えられる。β、をコートするＤＮＡを含有するプラスミツドを含有す る大腸菌は、ブダペスト条約に従い、整理番号６９０４８でアメリカンタイプ力 ルチャーコレクンヨンに寄託されている。寄託されたクローンの部分的配列は、 配列ＩＤ　Ｎｏ、Ｉ　９　（５’末端からの配列）と配列ＩＤ　Ｎｏ、２０　（ ３’末端からの配列）に示される。

配列ＩＤ　Ｎｏ、９に示されるアミノ酸をコードするＤＮＡを含むか、またはＡ ＴＣＣ整理番号６９０４８で寄託されたβ、をコートする一次転写体を含むが、 別のエクソンを欠如するおよび含む、βサブユニットをコードする一次転写体の 別処理により産生されるβサブユニットをコードするＤＮＡか与えられるか、ま たはここで与えられるＤＮＡから作成される。例えは配列ＩＤ　Ｎｏ、９に示さ れるアミノ酸をコートするＤＮＡを含む一次転写体の別処理により産生されるβ サブユニットをコードするか、配列ＩＤ　Ｎｏ、　のヌクレオチド６１５−７８ １の代わりに配列ＩＤ　Ｎｏ、１２に示されるＤＮＡか挿入されて含むＤＮＡも 与えられる。配列ＩＤ　Ｎｏ、９のヌクレオチド６１５−７８１の代わりに配列 ＩＤ　Ｎｏ、１２に示されるＤＮＡを含む配列ＩＤ　Ｎｏ、９に示される配列を 含むか、以下のヌクレオチド配列の１つまたはそれ以上を欠如する転写体により コートされるβサブユニット・をコートするＤＮＡもまた与えられる　配列ＩＤ Ｎｏ、１２のヌクレオチｌ’　ｌ　４−３４、配列ＩＤ　Ｎｏ、１２のヌクレオ チ１’ｌ：３−３４、配列ＩＤ　Ｎｏ、１２のヌクレオチド３５−５５、配列Ｉ Ｄ　Ｎｏ、Ｉ２のヌクレオチド５６−１９０、および配列ＩＤ　Ｎｏ、１２のヌ クレオチＦ１９１−２７１゜ ヒトのカルシウムチヤンネルのγサブユニットをコートするＤＮＡもまた与えら れる。また、このＤＮＡの転写により作成される、γサブユニットをコードする ＲＮＡも与えられる。特に配列ＩＤ　Ｎｏ、１４に示されるヌクレオチドの配列 を含有するＤＮＡか与えられる。

ヒ１−のカルシウムチャンネルのα１サフ′ユニツト（α１９、α＋ｅを含む） 、α２サブユニノ１−およびβザブユニット（β１−１−β、−６を含む）をコ ートする、全長ＤＮＡクローンと対応するＲＮＡ転写体か与えられる。また、全 長α１Ａサブユニツト、αＩｃサブユニット、β、サブユニットおよびγサブユ ニットをコー１−する全長ＤＮＡクロー〉の調製のための、電位依存性のヒトの カルシウムチャンネルのαＩＡサブコーニノト、α、Ｃサブユニット、β、サブ ユニットおよびγサブユニットの実質的部分をコートするＤＮＡクローンか与え られる。

少なくとも約１４個の隣接するヌクレオチドのα１．サブユニソ１〜、α１ｃサ ブユニソｔ−１α、　、ｌ＋Ｊ−’　フユニノｌ−１α、Ａサーｊユニット、α ２サブユニツト、βサブユニット（β１スプライス変種およびβ３サブユニット を含む）、そしてγサブユニー！・をコートするＩ）ＮＡを含有する核酸プロー ブか与えられる。また、カルシラＩ、チャシ不ルザブユニ７件をコートするｃＤ ＮＡ（組織内のスプライス変種および組織間変種を含む）の甲部とクローニング のためのプローブを用いる方法も与えられる。

精製されたヒＩ・のカルシウムチャンネルサブユニットおよび精製されたヒトの ｆ））じラムチャンネルか与えられる。このサブユニットとチャンネル（ま、→ ナフ′ユニノ１−をコートするＤＮＡでｌ−ランスフエクションした真核細胞か ら単離することかできる。

別の実施態様において、ヒトのカルシウムチヤンネル、ヒトのカルシウムチヤン ネルサブユニットまたはヒ１−のカルシウムサブユニットのエピトープ含有断片 の実質的に純粋な調製物で免疫した動物の血清から得られる免疫グロブリンまた は抗体か与えられる。また、免疫原としてヒＩ・のカルシウムチャンネル、ヒト のカルシウムチャンネルサブユニットまたはそのエピトープ含有断片を用いて産 生されるモノクローナル抗体も与えられる。ヒトのカルシウムチャンネルサブユ ニットを含む大腸菌の融合蛋白はまた、免疫原として用いることかできる。その ような融合蛋白は細菌蛋白またはその部分（例えばカルシウムチャンネルサブユ ニットペブチトに融合した大腸菌のＴｒｐＥ蛋白）を含有してもよい。免疫原と してカルシウムチャンネルサブユニットまたは精製されたカルシウムチャンネル を用いて産生される免疫グロブリンは、特に、生物試料またはそのような生物試 料から得られる溶液中に存在するかも知れないヒトのカルシウムチャンネルまた はそのサブユニットに、特異的に結合するか、および／または免疫沈降させる能 力を育する。

また、ヒトのカルシウムチャンネルサブユニット、またはヒトの組換えカルシウ ムチャンネルまたはそのサブユニットを発現する真核細胞との、ＬＥＳ免疫グロ ブリンＧ（ＩｇＧ）の免疫学的反応に基づき、ヒトのランバートイートン症候群 （Ｌａｍｂｅｒｔ　Ｅａｔｏｎ　Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）（ＬＥＳ）の存在を検出す ・るための診断法も与えられる。特に、ヒトの血清またはＩｇＧ画分（試験血清 ）を、カルシウムチャンネル蛋白（αサブユニットおよびβサブユニットを含む ）と組合せて、試験血清中の抗体か１つまたはそれ以上のサブユニットと、また は１つまたはそれ以上のサブユニットを発現する組換え細胞と、対照血清（ラン ハートイートン症候群のないことか明らかなヒトまたはヒトの集団から得られる ）中の抗体よりも強く反応するか否かを確認することにより、ヒトのランバート イートン症候群を診断するための免疫測定法か与えられる。血清中のある抗原に 対する抗体を検出するための当該分野において公知の任意の免疫測定法を、本方 法中で使用することかできる。

発明の詳細な説明 定義− 特に明記していない場合は、本発明中で使用されるすへての技術用語および科常 用語は、本発明の関係する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同 し意味を有する。本発明中で言及されるすべての特許および文献は、参考のため 本発明中に引用されている。

各カルシウムチャンネルサブユニットには、本発明中に特異的に開示されるサブ ユニット、およびプローブとして開示されるＤＮＡを用いて単離されるＤＮＡお よび少なくとも低い緊縮性（ｓ　ｔ　ｒ　ｉｎｇｅｎｃｙ）て適当なヒトｃＤＮ Ａまたはゲノムライブラリーをスクリーニングすることにより単離されるＤＮＡ によりコートされるヒトのカルシウムチャンネルサブユニットか含まれる。また そのようなりＮＡには、本発明中に記載する任意のサブユニット蛋白に対して約 ４０％の相同性を有する蛋白をコートするＤＮＡ、および少なくとも低い緊縮性 条件で本発明に記載するＤＮＡとハイブリダイズＤＮＡか含まれ、そのようなり ＮＡにコードされる蛋白は追加の同定可能な特質（例えは機能または分子量）を 有する。

開示されたサブユニットのスプライス変種またはそのようなサブユニットである 転写体によりコートされるサブユニットは、任意の単一のサブユニットに対する 全体的な相同性は４０％未満のことらあるか、１つまたはそれ以上のサブユニッ トに対するそのような相同性の領域も含まれると考えられる。また４０９６の相 同性とは、約４０％のアミノ酸か共通である蛋白、またはもう少し相同性か少な いか保存性アミノ酸の置換を含み、こうして蛋白の活性か大きく変更していない １　ものを意味することも考えられる。

本発明において、異なる遺伝子によりコートされろα１サブユニツトタイプは、 α０、α１８、α、０、およびα１Ｄと呼はれる。これらのタイプはまた、αＩ ＩＩのＶＤＣＣＩＶ、α、ＣのＶＤＣＣＩＩそαｌゎのＶＤＣＣＩＩＩとも呼ば れる。スプライス変種てしあるサブユニットのサブタイプは、例えばα０．−１ 、α１８−２、αＩｃ−１などと呼ばれる。

本発明においてα１サブユニットをコードするＤＮＡとは、少なくとも低緊縮条 件下で本発明に記載するＤＮＡにハイブリダイズするＤＮＡ、またはヒトのカル ノウ１９のα１サブユニットをコートする本発明に開示するＤＮＡにコードされ る蛋白に対して約４０％の相同性を有するサブユニットをコートするＤＮＡを意 味する。α１サブユニットはカルシウムチャンネルを形成する能力により同定さ れる。典型的にはα１サブユニットの分子量は少なくとも１２０ｋＤより大きい 。

カルシウムチヤンネルの活性は、電気生理学的方法および本発明中の他の方法な との当業者に公知のインビトロの方法により評価される。典型的にはα１サブユ 、二ソトは、カルシウムチャンネル活性の１つまたはそれ以上の活性調節因子（ 例えばｌ、４ＤＨＰまたはω−ＣｇＴｘ）か直接または間接に相互作用する領域 を含む。α、サブユニットのタイプは、結合特異性に基づくものを含む当業者に 公知の任意の方法により区別される。例えばα１サブユニツトはＮ−タイプのチ ャンネルの形成に参加すること、α１サブユニツトはＬ−タイプのチャンネルの 形成に参加すること、そしてα、サブユニットはＰ−タイプのチャンネルに典型 的な特質を示すらしいことか、本発明中で見いだされている。例えばα、サブユ ニットを含有するチャンネルの活性は、ｌ、４ＤＨＰに対して感受性はない、一 方α１１１＋サブユニットを含有するチャンネルの活性は１．４ＤＨＰにより活 性調節または変更される。α、サブユニットのタイプおよびサブタイプは、サブ ユニットまたはサブユニットを含有するチャンネルに対するそのような活性調節 因子の作用を基礎にして、および電流の差およびサブユニットを含有するカルシ ウムチャンネルにより発生される電流の差を基礎にして性状解析される。

本発明においてα２サブユニットは、本発明に記載のＤＮＡと低緊縮条件下でハ イブリダイズするＤＮＡ、または本発明に開示される蛋白と約４０％の相同性を 有する蛋白をコードするＤＮＡによりコードされる。そのようなりＮＡは、典型 的には分子量か約１２０ｋｄより大きいが、α１サブユニツトの存在しないとこ ろではカルシウムチャンネルを形成せず、α１サブユニットを含有するカルシウ ムチャンネルの活性を変更させることもある蛋白をコートする。スプライス変種 となるα２サブユニツトのサブタイプは、下添え字により呼ばれる（例えばα２ ｍ、　、　、　α２ｏ）。さらにα２サブユニッ１−および還元条件下で産生さ れる大きい断片は、少なくともＮ−結合糖でグリコジル化されているよってあり 、α１サブユニツトに特異的に結合する１、４−ＤＨＰやフェニルアルキルアミ ンに特異的に結合はしない。小さい断片（Ｃ−末端）はβサブユニットと呼ばれ 、約９４６のアミノ酸（配列ＩＤ　Ｎｏ、ＩＩ）から大体Ｃ−末端までのアミノ 酸を含む。

α、サブユニットを還元条件に暴露すると、この断片はα２の残りの部分から解 離する。

本発明中で使用されるβザブユニットは、低緊縮条件下で本発明に記載するＤＮ ＡにハイブリダイズするＤＮＡ、または本発明に開示する蛋白と約４０％の相同 性を任し、αサブユニットより分子量か小さく、約５Ｏ−８０ｋＤのオーダーて α１サブユニツトの存在しない条件で検出可能なカルシウムチャンネルを形成し ないか、α１サブユニツトおよびα１サブユニツトとα２サブユニツトを含むカ ルシウムチャンネルの活性を変更することもある蛋白をコードするＤＮＡにより コートされる。

異なる遺伝子にコードされろβサブユニットのタイプは、下添え字により呼ばれ る（例えばβ、およびβ、）。特定のタイプのスプライス変種としてのβサブユ ニットのサブタイプは、サブタイプと変種に関して添え数字で呼ばれる。そのよ うなサブタイプにはβ１スプライス変種（β１−３−β１−５を含む）を含有す るか、これらに限定されるものではない。

本発明においてγサブユニット−は、γサブユニットをコートするものとして本 発明に開示されるＤＮＡによりコードされ、ハイブリダイゼーシヨンまたは当業 者に公知の他のそのような方法（こうしてγサブユニットをコートする全長クロ ー、ンか単離されるかまたは作成される）によりプローブとして開示されるＤＮ Ａを用いて単離さｔ１同定される。γサブユニットは、本発明に記載のＤＮＡと 低緊縮条件下てハイブリダイズするＤＮＡ、または本発明に開示されるγサブユ ニットと約４０％の相同性を存する蛋白をコートする充分な配列相同性を示すＤ ＮＡによりコーＩ・される。

従って上記を嶌慮して当業者は、α１、α７、β、δおよびカルシウムチャンネ ルサブコニツ１へ（異なる遺伝子によりコートされるタイプ、およびスプライス 変種であるサブタイプを含む）をコートするＤＮＡを同定することかできる。例 えは本発明で開示されるＤＮＡに基づ＜ＤＮＡプローブは、適当なライブラリー （ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを含む）とスクリーニングし たり、全蛋白をコートする読み取り断片（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇｆｒｇｍｅ ｎｔ）を含有する１つまたはそれ以上のクローン中のＤＮＡを得るのに使用され る。適当なライブラリーを本発明で開示されるＤＮＡでスクリーニングした後、 そこからコードされる蛋白の配列が推定される読み取り枠（ｏｐｅｎｒｅａｄｉ ｎｇ　ｆｒａｍｅ）の有無について単離されたＤＮＡを試験する。分子量の測定 と本発明の配列との比較により、サブユニットの正体（例えばα３、α２なと） か明らかになる。必要な場合は、サブユニットかα、サブユニット、α２ザブユ ニットまたはβサブユニットであるか否かをめるのに、機能的測定法か使用され る。

例えはαＩＡをコー１”するＤＮＡは、整理番号　で寄託されたファージから単 離された、ヒトα、サブユニｙｌ・のすへてまたは一部をコートするＤＮＡで適 当なライブラリーをスクリーニングすることにより単離される（配列ＩＤＮｏ、 ２１に示される配列を有するオリゴヌクレオチドによるスクリーニングを含む） 。同様にβ２をコートするＤＮＡは、ＡＴＣＣ整理番号６９０４８で寄託された プラスミツトβ１４２から調製されるＤＮＡプローブ、または配列ＩＤＮｏ、Ｉ ９および２０に示される配列に従い調製された配列を有するプローブで、ヒｈｃ ＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより単離される。ＤＮＡの単離 と同定および全長ゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンの調製のための当業者 に公知の任意の方法（本発明に例示する方法を含む）を使用することができ、る 。

単離されたＤＮＡによりコートされるサブユニットは、本発明に記載のサブユニ ソｔ・のＤＮＡおよびアミノ酸配列と比較することにより同定される。スプライ ス変種は広範な領域の相同性を有するが、非相同領域も含有し、異なる遺伝子に コートされるサブユニットは非相同配列の均一な分布を共存する。

本発明において、ゲノムＤＮＡの一次転写体の差動的処理により産生されて２つ 以上のタイプのｍＲＮＡになる変種を意味する。スプライス変種は単一の組織タ イプ内または組織間に存在する（組織特異的変種）。すなわち同一のアミノ酸の 領域および異なるアミノ酸配列の領域を有するカルシウムチャンネルサブユニノ １−のサブタイプをコー１へするｃＤＮＡクローンは、ここでは「スプライス変 種」と呼ぶ。

本発明において、　「カルシウムチャンネル選択性イオン」とは、カルシウムイ すンの流れを実質的に同様に許容するかまたは妨害する条件下で、細胞膜にまた がるカルシウムチヤンネルを通過して流れるかまたはこの流れを妨害することが できるイオンである。バリウムイオンはカルシウムチャンネル選択性イオンの例 である。

本発明において、カルシウムチャンネル活性を調節する化合物は、カルシウムチ ャンネル選択性イオンを通過させるかまたは他の検出可能なカルシ“’−１．ｆ ヤン老ルの性ｗ（例えは電流特異性）に影響するカルシウムチャンネルの能力に 影響する化合物である。そのような化合物にはカルシウムチャンネルアンタゴニ ストおよびアゴニストか含まれ、および直接または間接にカルシウムチャンネル 活性に影響を及ぼす化合物か含まれる。

本発明において、「実質的に純粋な」サブユニットまたは蛋白とは、実質的に他 のポリペプチド不純物か存在せず、５ＤＳ−ＰＡＧＥで均一に現れ、正確に配列 決定されるサブユニットまたは蛋白を言う。

本発明において、異種または外来のＤＮＡおよびＲＮＡは互換的に使用され、存 在するＤＮＡまたはＲＮＡの天然の一部としては存在せず、天然に存在するゲノ ムの場所とは異なる場所で見いたされるＤＮＡまたはＲＮＡを言う。それは細胞 に内因性ではなく、人工的に細胞に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡである。異種 ＤＮＡの例としては、ノＪルノウｌ、チャンネルサブユニットをコードするＤＮ Ａ、および転写、翻訳または他の調節可能な生化学的工程に作用して内因性のＤ ＮＡの発現を仲介または変更するＲＮＡまたは蛋白をコートするＤＮＡがあるが 、こ第１らに限定されるものではない。異ｆｌＤＮＡ　（例えばカルシウムチャ ンネルサブユニノ１〜をコートするＤＮＡ）を発現する細胞は、同しかまたは異 なるカルシラＩ、チャンネルサブユニッ１−をコー１−すてＤＮＡを含有してい てもよい。異種ＤＮＡは発現される必要はなく、宿主細胞ゲノムに取り込まれる かまたはエビソームとして維持される方法で導入されてもよい。

本発明において、異ｆｉＤＮＡのヌクレオチドの制御配列またはエフェクター（ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）配列（例えばプロモーター、エンハンサ−（ｅｎｈａｎｃｅ ｒＬ転写停止部位および翻訳停止部位および他のシグナル配列）への機能的結合 は、そのようなりＮＡとヌクレオチドのそのような配列との間の機能的関係を意 味する。例えばプロモーターへの異ｆｌＤＮＡの機能的結合は、読み取り枠中の ＤＮＡを特異的に認識し、そこに結合しそして転写するＲＮＡボリメラーセによ り、プロモーターからそのようなりＮＡの転写か開始されるような、ＤＮＡとプ ロモーターの間の機能的関係を言う。

、本発明において、単離され実質的に純粋なりＮＡとは、当業者に公知の標準的 方法により精製されたＤＮＡ断片を言う（例えはマニアチス（Ｍａｎ　ｉａ　ｔ 　ｉｓ）ら、１９８２、分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールドス プリングハーバ−ラボラトリ−プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）、コールドスプリングハーバ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、＝ニーヨーク）を参照）。

本発明において発現とは、核酸かｍＲＮＡに転写され、ペプチド、ポリペプチド または蛋白に翻訳される工程を言う。もし適当な真核宿主細胞または生成物か選 択されるなら、核酸かゲノムＤＮＡ由来の時は、ｍＲＮＡのスプライシングを含 む。

本発明において、ベクターまたはプラスミツトとは、異種ＤＮＡの発現またはク ローン化した異種ＤＮＡの複製のための、細胞への異種ＤＮＡの導入に使用され る別個の要素を言う。そのようなベクターやプラスミツトの選択と利用は当業者 のレベルの範囲内にある。

本発明において発現ベクターは、ＤＮＡ断片の発現を可能にすることかできる制 御配列（例えばプロモーター領域）と機能的に結合しているＤＮＡ断片を発現す ることがてきるベクターを含む。すなわち発現ベクターは、適当な細胞へ導入さ れるとクローン化ＤＮＡか発現されるような組換えＤＮＡまたはＲＮＡ作成体（ 例えばプラスミツト、ファージ、組換えウィルスまたは他のベクター）を言う。

適当な発現ベクターは当業者に公知てあり、真核細胞および／または原核細胞中 で複製可能であり、エビソームとして維持されるかまたは宿主細胞ゲノム中に取 り込まれるものを含む。

本発明においてプロモーター領域は、そこに機能的に結合しているＤＮＡの転写 を調節する遺伝子のＤＮＡの部分を言う。プロモーター領域にはＲＮＡボリメ→ −ゼの認識、結合および転写開始に充分なＲＮＡの特異的配列を含む。さらに、 プロモーター領域は、ＤＮＡポリメラーゼのこの認識、結合および転写開始活性 を調節する配列を含む。これらの配列はｃｉｓ作用性であるか、またはｔ　ｒａ ｎｓ作用性因子に対して応答する。制御の性質に依存して、プロモーターは構成 性（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ）であるかまたは調節性である。

本発明において組換え真核細胞は、異ｆｌＤＮＡまたはＲＮＡを含む真核細胞で ある。

本発明において、組換えカルシウムチャンネルまたは異種カルシウムチャンネル は、組換えカルシウムチヤンネルを発現する真核細胞中へ導入およびその中で発 現される異種ＤＮＡによりコードされる、１つまたはぞれ以上のサブユニットを 含１ｆするカルシウムチヤンネルを言う。組換えカルシウムチヤンネルはまた、 細胞に内因性のＤＮＡにより産生されるサブユニットを含有してもよい。ある実 施態様において、組換えカルシウムチャンネルまたは異種カルシウムチャンネル は、異ｆｌＤＮＡにのみコードされるサブユニットを含有してもよい。

本発明において、組換えまたは異種カルシウムチャンネルに関して「機能的」で あるとは、チャンネルか刺激に応答してカルシウムチャンネル選択性イオン（カ ルシウムイオンまたはバリウムイオンかあるか、これらに限定されるものではな い）の流入を可能にし調節することかできるか、および／またはチャンネルに対 してアフィニティを有するリガンドに結合することかできることを意味する。

ぞのようなカルシウムチヤンネル活性は、例えは電気生理学的方法、薬理学的方 法および当業者に公知の他の方法により、宿主細胞中の内因性のカルシウムチャ 、・ネルから区別することか可能であることか好ましい。

本発明において、実質的に配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌに示されるアミノ酸配列を有する ペプチドは、同し機能を有するか配列に小さい変更（例えは保存的アミノ酸の変 化、またはペプチドの活性を変更しない欠失や挿入）のあるペブチ１−を含む。

カルシウムチャン不ルリセブクーのサフ゛ユニットペプチドの活性は、そのよう な池のサブユニソ１へど機能的カルシウムチャン７、ルを形成する能力を言う。

本発明において、化合物の生理学的濃度とは、生理学的工程か起きるのに必要か つ光分な濃度を訝う。例えはカルシウムチャンネル選択性イオンの生理学的濃度 とは、チャンネルか開いた時内部の電流を与えるのに必要かつ充分なカルシウム チャンネル選択性イオンの濃度である。

本発明において「機能的測定法」とは、機能的カルシウムチャンネルを同定する 測定法を言う。すなわち機能的測定法は機能を評価するための測定法である。

当業者に理解されているように、カルシウムチャンネル活性を調節する化合物（ 例えはアンタゴニストやアゴニスト）を同定するだめの測定法には、一般的に対 照に対して比較することが必要である。１つのタイプの「対照」細胞または「対 照Ｊ培養物は、対照培養物は試験化合物に暴露されないことを除いては、試験化 合物に暴露された細胞または培養物と実質的に同じように処理される細胞または 培養物である。他のタイプの「対照」細胞または［対照Ｊ培養物は、対照培養物 で使用される細胞は機能的カルシウムチャンネルを発現しないことを除いては、 トランスフェクションされる細胞と同一の細胞または細胞の培養物である。

この場合、測定される化合物の存在下で細胞または各タイプの細胞の培養物か実 質的に同じ反応条件に暴露された時、試験化合物に対する試験細胞の応答は、試 験化合物に対するリセブター陰性の細胞の応答（または応答の欠如）に匹敵した 。

例えはパンチクランプ（ｐａｔｃｈ　ｃｌａｍｐ）電気生理学的方法を用いる方 法においては、当業者に公知のように細胞を浸している外部の溶液を変更するこ と！こより、試験化合物の存在下または非存在下で、同し細胞を処理することが てきる。

測定法 カルシウムチャンネル活性を調節する化合物の同定のための測定法異種のヒ］・ のカルシウムチヤンネルを発現する真核細胞を用いる、カルシウムチャンネルの 活性を調節する化合物（例えばカルシウムチャンネルアゴニストおよびアンタゴ ニスト）を同定するためのインビトロの方法か与えられる。

ヒトのカルシウムチャンネルに特異的なカルシウムチャンネルのアゴニストおよ びアンタゴニストになる可能性のあるものをスクリーニングするため、そして特 に特定のヒトのカルシウムチャンネルのサブタイプに特異的な化合物をスクリー ニングするために、この測定法は特に、本発明で与えられる異種ＤＮＡによりコ ー）・される異種のしＩ〜のカルシウムチヤンネルサブユニットを発現する真咳 細胞を用いる。そのような測定法は、構造かわずかに異なるアゴニストやアンタ ゴニストからヒトのカルシウムチャンネルの活性を調節するのに特に有用なもの を選択し、サブタイプ特異的または組織特異的なカルシウムチャンネルアンタゴ ニストおよびアゴニスト活性を示す化合物を設計または選択するために、合理的 な薬剤デザインの方法とともに使用される。

これらの測定法は、ヒトにおけるある種の疾患の治療のための化合物の治療上の 相対的有効性を正確に予測することかできる。さらにサブタイプ特異的および組 織特異的カルシウムチヤンネルサブユニットが与えられるため、組織特異的また はサブタイプ特異的組換えカルシウムチヤンネルか調製され、ヒトのカルシウム チヤンネル組織特異的またはサブタイプ特異的薬剤の同定法で使用することかて きる。

この測定法は、ヒトのカルシウムチャンネルの少なくとも１つのサブユニット（ 好ましくはヒトのカルシウムチャンネルの少なくとも１つのα、サブユニット） を発現する組換え真核細胞の細胞膜を、試験化合物と接触させて、膜に特異的に 結合する試験化合物の能力および膜上の異種カルシウムチャンネルの活性を変更 または調節する試験化合物の能力を測定することよりなる。

ある実施態様において、カルシウムチャンネル産生を調節する化合物の同定は、 異種の機能的カルシウムチャンネルを有する真核細胞か試験化合物とカルシウム チャンネル選択性イオンを含有する溶液に暴露される時、そのような真核細胞の カルシウムチヤンネル活性を測定し、測定されたカルシウムチャンネル活性を試 験化合物を含まない溶液中の同し細胞または実質的に同じ対照細胞のカルシウム チャンネル活性と比較することにより行われる。細胞はチャンネルか開いた時内 部電流を与えるのに充分な濃度のカルシウムチヤンネル選択性イオンを存する溶 液中で維持される。使用に特に好適なものは、ヒトの各α１サブユニツト、βサ ブユニットおよびα２サブユニツトを有し、随時ヒトのカルシウムチャンネルの γサブユニットを有する、カルシウムチヤンネルを発現する組換え細胞である。

そのような測定法を実施する方法は当業者に公知である。例えばゼノブスラエビ ス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）卵母細胞とアセチルコリンリセプターに適 用される類似の方法については、ミシナ（Ｍｉｓｈｉｎａ）ら（＋９８５、ネー チャー、３１３：３６４）を、そしてそのような卵母細胞とナトリウムチャンネ ルに適用される類の方法については、ノダ（Ｎｏｄａ）ら（１９８６、Ｎａｔｕ ｒｅ、３２２　：　８２６−８２８）を参照。アセチルコリンリセブターについ て実施されている同様の方法については、クララジオ（Ｃ１ａｕｄｉｏ）ら（＋ ９８７．５ｃｉｅｎｃｅ、２３８：１６８８−１６９４）を参照。

従って本発明で与えられる方法は、異種の機能的カルシウムチャンネルを発現す る細胞を使用し、カルシウムチャンネル選択性イオン（例えばカルシウムイオン またはバリウムイオン）か異種の機能的チャンネルを通って流れることができる 強さと長さを増強または拮抗または調節できる試験化合物の能力を、機能的（例 えは電気生理学的）に測定する。細胞の組換えカルシウムチャンネルを通って流 れる電流量は、直接（例えは電気生理学的に）、または細胞内で発生しカルシウ ムイオン（または他のイオン）依存性に直接影響される独立の反応を追跡するこ とによりめられる。

カルシウムチャンネルの活性を評価する方法は、本発明中で与えられる細胞とと もに使用される。例えばカルシウムチャンネル活性を調節する能力について化合 物を試験する方法の１つの実施態様において、電流の量は、カルシウムチャンネ ル選択性イオンに感受性かある反応であって、異種カルシウムチャンネルを発現 ・し、指示蛋白をコートする構造遺伝子に発現のために機能的に結合している転 写調節要素も含有する真核細胞を用いる反応の調節により測定される。指示遺伝 子の転写に使用される転写調節要素は、細胞内でカルシウムチャンネル選択性イ オン（例えはカルシウムイオンとバリウムイオン）に対して応答性である。その ような転写に基づく測定法の詳細は、１９９１年８月７日提出の共有のＰＣＴ国 際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ　９１１５６２５号に記載されており、これは１９９０ 年８月７日出願の共有の同時継続出願第０７１５６３，７５１号に優先権を主張 している（この出願の内容は参考のため本発明中に引用されている）。

ＬＥＳの診断のための測定法 ＬＥＳは、神経末端に対して通常は応答する運動神経からのアセチルコリンの不 完全な放出か特徴的な自己免疫疾患である。ＬＥＳ患者の免疫グロブリン（Ｉｇ Ｇ）は、各電位依存性のカルシウムチャンネルを阻止し、従ってカルシウムチャ ンネル活性を阻害する（キムとネヘル（Ｋｉｍ　ａｎｄ　Ｎｅｈｅｒ）、５ｃｉ ｅｎｃｅ、２３９：４０５−４０８．１９８８）、ランバートイートン症候群（ ＬＥＳ）の診断法は本発明で与えられる。ＬＥＳの診断法は、ＬＥＳＩｇＧのヒ トのカルシウムチャンネル単独または特定のサブユニット単独とのまたは組合せ ての免疫学的反応性、または組換え細胞の表面に発現されているヒトのカルシウ ムチヤンネルとの免疫学的反応性に依存する。例えばそのような測定法は、ヒト のカルシウムチャンネルサブユニットおよび本発明で与えられるそのようなサブ ユニソ］・を発現する細胞による、ＬＥＳのＩｇＧの免疫沈降に基づく。

ヒトのカルシウムチヤンネルサブユニットをコードするＤＮＡの同定と単離ヒト のカルシウムチャンネルのα１サブユニツト、βサブユニットおよびγサブユニ ットをコードするＤＮＡを同定し単離する方法か与えられる。

そのようなりＮＡの同定と単離は、適当な条件下（目的のサブユニ・ｙトをコー トするそのようなりＮＡか単離される少なくとも低緊縮条件下）で、制限酵素で 消化したヒトＤＮＡを、少なくとも１４個のヌクレオチドを有し、配列同定番号 で本発明中に示されるヌクレオチ１〜配列ををするＤＮＡの任意の隣接する部分 に由来する標識プローブとハイブリダイズさせることにより達成される。ハイブ リダイズする断片かハイブリダイゼーション反応て同定されれば、当業者に公知 の標準的なりローン化技術を用いてクローン化される。完全な読み取り枠の存在 により全長クローンか同定され、本発明で与えられるサブユニットとの配列比較 により、そしてカルシウムチャンネル形成能力または他の機能を評価するための 機能的測定法により、コードされる蛋白の正体は証明される。この方法はサブユ ニットをコートするゲノムＤＮＡの同定、またはゲノムサブユニットＤＮＡの一 次転写体の別のスプライシングにより産生されるし１・のカルシウムチャンネル サブユニノ１−のスプライス変種をコートするｃＤＮＡを同定するのに使用され る。例えばカルシウムイオンネノはフ゛二二ソ１〜をコードするＤＮＡ、ｃＤＮ ＡまたはゲノムＤＮＡは、ＤＮＡプローブへのハイブリダイセーノヨンにより同 定され、当業者に公知の方法（例えは制限マツピングおよびＤＮＡ配列決定法） により性状解析さｔｌ、ＤＮＡ配列中の不均一性または多様性を証明するために 本発明で与えられるＤＮＡと比較さ第１る。そのような配列の差は、もし非相同 的な領域と相同的な領域か集まっている場合、ｃＤＮＡが産生される転写体は一 次転写体の別のスプライシング由来てあり、もし非相同的な領域がクローン化Ｄ ＮＡ中に分散している場合は、転写体は異なる遺伝子に由来することを示す。

本発明て与えられるＤＮＡを用いる遺伝子を単離する適当な方法か使用される。

例えは配列の差の領域に対応するオリゴヌクレオチドは、全長スプライス変種を コートするＤＮＡをハイブリダイゼーションにより単離するのに使用されており 、ゲノムクローンを単離するのに使用することができる。ヒトのカルシウムチャ ンネルのサブユニットの少なくとも一部分（例えは組織特異的エクソン）をコー ドする、本発明で与えられるヌクレオチド配列に基づくプローブは、関連するＤ ＮＡのクローン化、そしてヒトのカルシウムチャンネルサブユニットをコードす る全長ｃＤＮＡクローンまたはゲノムクローンのクローン化に使用される。

少なくとも１４個の実質的に隣接する塩基（その核酸配列は、配列ＩＤ　Ｎｏ。

に関して本発明で与えられる核酸配列の一部に対応する、好ましくはヒトのカル シウムチャンネルサプユニソ１−の少なくとも一部をコートする核酸の少なくと も３０個の隣接する塩基）の標識した（放射能標識または酵素標識があるが、こ れらに限定されない）ＲＮＡまたは１本ｊＪＩＤＮＡか与えられる。そのような 核酸部分は、カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡをクローン 化す、るための本発明で与えられる方法において、プローブとして使用される。

一般的には、サムブルーフ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、分子クローニン グ：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａ ｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ− プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅ ｓｓ）を参照。

さらに、ヒｌ−ＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを増幅するための異なる配列プライマ ーを取り囲むＤＮＡ配列に基つくオリゴヌクレオチドを用いることにより、カル シウムチャンネルサブユニットのスプライス変種を見つけるために、当業者に公 知の核酸増幅技術を使用することかできる。増幅生成物のサイズ測定および配列 決定により、スプライス変種か証明される。さらにハイブリダイゼーシヨンによ るヒトゲノムＤＮＡ配列の単離は、ヒトのカルシウムチヤンネルサブユニットを コートする転写体の異なるスプライス変種に対応する、インド１コンからは分離 された複数のエクソンを含有するＤＮＡを与える。

電位依存性のヒトのカルシウムチヤンネルのα１、α２、βおよびγサブユニッ トのタイプおよびサブタイプをコードするＤＮＡは、そのようなカルシウムチャ ンネルを有するヒト由来の細胞株または組織から単離されたポリＡ＋ｍＲＮＡか ら調製されるヒトｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることにより、本宅 明中てクローン化さねている。ｍＲＮＡを得るためのそのような細胞または組織 の供給源としては、ヒトの脳の組織または神経起源のヒトの細胞株（例えば神経 芽細胞腫細胞株）、ヒトの骨格筋または平滑筋細胞なとかある。ｃＤＮＡライブ ラリーを調製法は当業者に公知である（一般的にはアラスペル（Ａｕｓｕｂｅｌ ）　ら、　１９８７、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕ ｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ウィリーインターサイエンス（Ｗｉ　Ｉｅｙ−Ｔｎｔ ｅｒｓｃｉｅｎｅｅＬニューヨーク；およびデービス（Ｄａｖｉｓ）　ら、１９ ８６、Ｂａ５ｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ 、エルセピアサイエンス出版（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ　５ｃｉｅｎｃｅ　Ｐｕｂｌｉ ｃｈｉｎｇ　Ｃｏ、）、＝ニーヨークを参照）。

、ヒトのカルシウムチヤンネルの各サブユニット（αＩ、α７、βおよびγ）に 関して、核酸スクリーニング法によりチャンネルサブユニットをコードするＤＮ Ａか同定されれば、単離されたクローンは重複するクローンを同定するためのさ らなるスクリーニングに使用された。クローン化ＤＮＡ断片のいくつかは、ｐＩ ＢＩ２４／２５　（ＩＢＩ、ニューヘーブン（Ｎｅｗ　Ｈａｖｅｎ）　、：７ネ チ力ツト州ＬＭ１３ｍｐ１８／１９、ｐＧＥＭ４、ｐＧＥＭ３、ｐＧＥＭ７Ｚ、 ｐＳＰ７２および当業者に公知の池のへフタ−のような適当なベクター中にサブ クローン化か可能であり、ザブクローン化され、ＤＮＡ配列決定法と制限酵素マ ッピシグ法により性状解析されている。当業者に公知の方法（翻訳開始コドンと 翻訳停止コドンの同定を含む）により全長クローンか調製されるまで、サブクロ ーンサブユニｙｌ・につき重複するクローンの連続のシリーズかこうして産生さ れる。

クローン化ＤＮＡの発現のためには、そのようなりローンの５′非コード領域や 他の転写および翻訳調節領域か、効率的なりポゾーム結合部位や当業者に公知の 他の制圓領域で置換されてもよい。以下の実施例２−６は、ヒトのカルシウムチ ャンネルの種々の各サブユニットおよびサブタイプやスプライス変種（それらの 組織特異的変種を含む）を詳述する。サブユニットの部分配列か開示されるこれ らの例において、サブユニット、そのサブタイプまたはスプライス変種をコード する対応する全長ヌクレオチド配列を得ることは、本明細書中の情報からは、充 分当該分野の技術範囲にある。

α、サブユニットをコートするＤＮＡの同定と単離ヒト中枢神経系中て発現され る、いくつかの電位依存性のカルシウムチャンネルα１サブユニット遺伝子力洞 定されており、α４、α１８（またはＶＤＣＣＩＶ）、α、、（ＶＤＣＣＩＩ） 　、およびα、ｏ（ＶＤＣＣＩ［［）と呼ばれている。各サブユニットタイプを コートする、ヒトの神経のｃＤＮＡライブラリーからＤＮＡか単離されている。

また、スプライス変種としての各タイプのＤＮＡをコードするサブタイプも与え られる。本発明においてサブタイプは、例えばα１Ｂ−１、α１．−１と呼ばれ ている。

電位依存性のカルシウムチャンネルのα１サブユニツトタイプのＡＳＢ、Ｃおよ びＤ、およびそのサブタイプは、公知のクラスのカルシウムチャンネルアゴニス 士およびアンタゴニスト（例えはＤＨＰ、フェニルアルキルアミン、オメガコノ トキシン（ω−ＣｇＴｘ）およびビラジノイルグアニジン）に対する感受性に関 して異なる。これらはまた、保持電位（ｈｏｌｄｉｎｇ　ｐｏｔｅｎｔ　１ａｌ ）や、異なるタイプのα１サブユニツトを含有するカルシウムチャンネルを含む 細胞膜の脱分極により発生する電流の動力学において異なるよってある。

ジヒドロピリジン、フェニルアルキルアミン、ω−ＣｇＴｘ、ファネルウェブク モのトキシン（ｆｕｎｎｅｌ　ｗｅｂ　５ｐｉｄｅｒ　ｔｏｘｉｎ）の成分およ びビラジノイルグアニジンの中から選択される少なくとも１つの化合物に結合す るα１サブユニットをコートするＤＮＡか与えられる。例えば本発明のα、サブ ユニットは、Ｎ−型チャンネルのω−ＣｇＴｘと特異的に相互作用し、本発明の α１．サブユニットはＬ−型チャンネルのＤＨＰと特異的に相互作用するよって ある。

ヒトのα１．カルシウムチヤンネルサブユニットをコートするＤＮＡの同定と単 離ヒ１〜の神経芽細胞腫細胞株の１ＭＲ３２のｃＤＮＡライブラリーをスクリー ニ〕・グしてクローンα１．３６を得るために、ウサギの骨格筋カルシウムチャ ンネルα１サブユニツトｃＤＮＡの断片をプローブとして用いて、α１．サブユ ニットｃＤＮＡか単離されている。このクローンを用いて、さらに１ＭＲ３２細 胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして重複するクローンを得て、次にヒ トα、Ｄクローンをコートするヌクレオチド配列の長さにまたがる充分なシリー ズのクローンか得られるまで、これらをスクリーニングに用いた。実施例２に記 載の部分的α１．クローンの一部を結合させて、α１Ｄをコートする全長クロー ンを作成した。

配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌは、α１．ザブユニットをコートするｃＤＮＡの７，６３５ 個のヌクレオチド配列を示す。２，１６１アミノ酸の配列をコートする６、４８ ３個のヌクレオチド配列読み取り枠かある（配列ＩＤ　Ｎｏ、Ｉに記載）。

配列ＩＤ　Ｎｏ、２は、α１．サブユニットのＩＳ６膜通過ドメイン（膜通過ド メインの命名法については、タナへ（Ｔａｎａｂｅ、Ｔ、）ら、１９８７、Ｎａ ｔｕｒｅ、３２８：３１３−３１８を参照）をコードする別のエクソンの配列を 与える。

配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌはまた、ヒトの神経のカルシウムチャンネルα１Ｄサブユニ ソ半ＤＮＡから推定される２、１６１個のアミノ酸配列を示す。このアミノ酸配 列に基づき、α１．蛋白の計算される分子量は２４５，１６３である。カルシウ ムイオンネルのα１０サブユニットは４つの推定の内部繰り返し配列領域（ｉｎ ｔｅｒｎａｌ　ｒｅｐｅａｔｅｄ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｒｅｇｉｏｎｓ）を（− ｉする。４つの内部繰り返し配列領域は、２４個の推定膜通過部分と、細胞内に 伸長しているアミノ末端およびカルボキシ木端を有する。

（ｒＩＤザブユニットは、Ｉ）ＨＰ感受性て、高電位活性化の、長期持続性のカ ルシウムチヤンネル活性を媒介することか証明されている。このカルシウムチャ ンネル活性は、卵母細胞にα１．とβ１またはαＩＤ、α２とβＩサブユニット をコー１−するＲＮＡ転写体を同時注入した時、検出された。卵母細胞にβ１± α２サブユニツトをコートするＲＮＡ転写体を注入した時、この活性は、検出さ れた／＜リウトイオ７．電流から区別さ第１た。これらの電流は薬理学的および 生理学的に、末注人の卵母細胞て報告されたカルシウムイオンに類似していた。

ヒトのαＩＡカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡの同定と単 離ブダペスト条約で公布された特許手続きと規制のための微生物の寄託の国際的 認識に関するブダペスト条約の条件に従い、α１ＤサブユニツトをコートするＤ ＮＡを含有する生物試料は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（米国２０８ ５２メリーラント州ロツクビル、バークローンドライブ１２３０１）に寄託され ている。ブダペス１−条約の条件および規則、そしてアメリカ合衆国および本出 願または本出願の優先権を主張する出願か提出されるか、またはそのような出願 に対して特許か認可される他のすべての国または国際組織の特許法および規則に 従い、これらを受け取る資格のある工業所有権事務所や他の人々は、寄託された 物質の試料を入手できる。

α１Ａサブユニッ１−は、大腸菌宿主株ＮＭ５１４中てα１．２５４と呼ばれる λｇｔｌＯファージ中の３ｋｂの挿入体によりコードされる。この物質のファー ジ溶解物は、前述のようにＡＴＣＣ整理番号　でアメリカンタイプカルチャーコ レクションに寄託されている。α１ＡサブユニツトをコートするＤＮＡは、配列 ＩＤ　Ｎｏ、２１を有するＤＮＡ 、５°　ＣＴＣＡＧＴＡＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡ３’から 調製されるプローブてスクリーニングすることにより同定される。

α１．サブユニットヒトのカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮ Ａの同定と単離 α、サブユニットをコートするＤＮＡは、ヒトの脳底神経節ｃＤＮＡライブラリ ーを、ウサギの骨格筋カルシウムチャンネルのα１サブユニツトをコートするｃ ＤＮＡてスクリーニングすることにより単離された。陽性クローンの１つの一部 を用いて１ＭＲ３２細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。脳底神経 節ＤＮＡプローブにハイブリダイズするクローンを用いて１ＭＲ３２細胞ｃＤＮ Ａライブラリーをさらにスクリーニングして重複するクローンを同定し、次にこ れを用いてヒトの海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。こうしてヒ トのα１Ｂサブユニツトをコートするマクレオチト配列のほとんと全長にまたか る充分なフリーズのクローンか得られた。１ＭＲ３２細胞のβ１８サブユニツト ｍＲＮＡの特異的領域のＰＣＲ増幅により、α１８サブユニツトのコード配列の 追加の部分か得られた。

実施例２　Ｃに記載の部分的ｃＤＮＡクローンの一部を結合させて、全長α、。

ＤＮＡクローンを作成した。配列［）Ｎｏ、７と８は、β１．サブユニットをコ ートするＤＮＡクローンのヌクレオチド配列と推定されるアミノ酸配列を示す。

β１．サブユニットの転写体の別のスプライシングにより得られる配列ＩＤ　Ｎ ｏ。

８に示すヌクレオチド配列によりコードされる他のα１８サブユニツト（αｌ１ ｌ−Ｊから区別するために、配列ＩＤ　Ｎｏ、７のコードするβ１．サブユニッ トはβ１．−、サブユニットと呼ばれる。

αＩｌ＋−１をコートするＤＮＡ内のヌクレオチド配列に従い設計されたオリゴ ヌクレオチｉ・プライマーを用いるＩＭＲ３２細胞ｍＲＮＡのＰＣＲ増幅により 、異なるコート配列を存するためスプライス変種と思われるβ１．転写体の変種 か同定された。

ヒトのα１ｃカルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡの同定と単 離無数のβ１．サブユニットに特異的なりＮＡクローンか単離された。配列の性 状解析により、β１Ｃコート配列、α、Ｃ翻訳開始配列およびαＩＣサブユニソ １への別にスプライソングされた領域か証明された。α、Ｃサブユニットの別の スプライス変種は同定された。配列ＩＤ　Ｎｏ、３はα１ｏサブユニツトをコー トするＤＮＡを示す。配列ＩＤ　Ｎｏ、４と５に示すＤＮＡ配列は、α１ｃ蛋白 の２つの可能なアミノ末端をコートする。配列ＩＤ　Ｎｏ、６はＩＶ　β３膜通 過ドメインの別のエクソンをコートする。

β１、サブユニットの部分をコートするＤＮＡクローンの同定と単離は実施例２ て詳述される。

他のα１サブユニツト（α、Ａを含む）をコードするＤＮＡもまた単離されてい る。また、追加のそのようなサブユニットも、α１８、α１ｏ、およびβ１．大 腸菌体について本発明で与えられるＤＮＡを用いて、または当業者に公知の他の 方法を用いる、単離・同定されている。

ヒトのβカルシウムチヤンネルサブユニット−をコートするＤＮＡの同定と単離 β、サブユニットをター１−するＤＮＡを単離するために、ヒトの海馬ｃＤＮＡ ライブラリーを、ウサギの骨格筋カルシウムチャンネルのβサブユニットをコー ト・するＤＮＡ断片にハイブリダイズさせることにより、スクリーニングした。

ハイブリダイズするクローンを選択し、次にこれを用いて、全ヒトカルシウムチ ャンネルβサブユニットをコートするＤＮＡにまたがる重複するクローンが単離 され配列決定されるまで、重複するクローンを単離した。

５つの別にスプライシングされた型のヒトのカルシウムチャンネルβ、サブユニ ットか同定され、いくつか堅をコードするＤＮＡか単離されている。これらの型 は、骨格筋で発現されるβｌ−１、中枢神経系で発現されるβ１−２、さらに中 枢神経系で発現されるβｌ−３、大動脈組織とＨＥＫ２９３細胞で発現されるβ １−４、ＨＥＫ２９３細胞で発現されるβ１−６と呼ばれる。βｌ−２サブユニ ツ］・をコードする全長ＤＮＡクローンか作成された。サブユニツトβ１−１、 β１−２、β１−４およびβ１−６は、βサブユニットの別にスプライシングさ れた型として、ＰＣＲ解析により同定された。

別のスプライス変種は、ヒトの神経またはウサギの骨格筋カルシウムチャンネル βサブ口−ニノ１−をコートするＤＮＡによりコートされるアミノ酸配列を比較 することにより同定された。この比較によりウサギのβサブユニットに比較して ヒトのβサブユニットは４５個のアミノ酸力次失していることか明らかになった 。

この領域のＤＮＡをＤＮＡクローニング、ＰＣＲ解析およびこの領域の配列分岐 のＤＮＡ配列決定法のためのプローブとして用いて、別にスプライシングされた 型のヒトカルシウムチャンネルβサブユニット転写体を同定した。例えば１つの スプライス変種βｌ−２をターｉ−するＤＮＡの配列か、配列ＩＤ　Ｎｏ、９に 示されている。配列ＩＤ　Ｎｏ、１０は、βサブユニット−広軌写体の別のスプ ライス変種であるβ３．サブユニット（ｎｔ　＋−１８５１，３゛未翻訳領域　 ｎｔ＋７９５−１８５１を含む）の配列を示す。ヒトの大動脈のカルシウムチヤ ンネルおよびヒトの胎児腎（ｈｕｍａｎ　ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｋｉｄｎｅｙ） （ＨＥＫ）細胞のβサブユニット（β１−４）の一部に特徴的なりＮＡは、配列 ＩＤＮｏ、］２に示されている（ｎｔ　ｌ−１３および１９＋−２７１）。骨格 筋で発現されるヒ１−のカルシウムチャンネルのβサブユニット（β１−１）の 一部をコートするＤＮＡの配列は、配列ＩＤ　Ｎｏ、１２に示されている（ｎｔ ｌ−！３および３５−２７１）。

β、をコートするＤＮＡ β、サブユニットをコートするＤＮＡおよびその任意のスプライス変種は、β１ サブユニノ１へて前述したように、配列ＩＤ　Ｎｏ、１９と２０に従い調製され たＤＮＡプローブを用いて、または寄託されたβ、クローンプラスミツトβＩ。

４２　（ＡＴＣＣ整理番号６９０４８）の一部を用いて、ライブラリーをスクリ ーニングすることにより単離される。

ブダペスト条約で公布された特許手続きと規制のための微生物の寄託の国際的認 識に関するブダペスト条約の条件に従い、β３サブユニッ１−をコードするＤＮ Ａを含有するプラスミツトβ１．４２を含有する大腸菌宿主は、アメリカンタイ プカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏ ｌｌｅｃｔｉｏｎ）（米国２０８５２メリーラント州ロックビル、パークロー１ ．ドライブ！２３０１）に寄託されている。ブダペスト条約の条件および規則、 そしてアメリカ合衆国および本出願または本出願の優先権を主張する出願か提出 されるか、またはそのような出願に対して特許か認可される他のすへての国また は国際組織の特許法および規則に従い、これらを受け取る資格のある工業所付置 事務所や他の人々は、寄託された物質の試料を入手できる。

β３をター１−するプラスミツドはβ１．４２と呼はれる。このプラスミツｌ〜 はヘゲターｐＧｅｍ７２Ｆ　（＋）中にβ３を挿入されてコードする２、５ｋｂ の大腸菌断片を含有し、大腸菌宿主株ＤＮＳα中に寄託されている。β３の５′ 末端末端および３′末端の部分的ＤＮＡ配列は配列ＩＤ　Ｎｏ、１９と２０にそ れぞれ記載されている。

ヒトのα２カルシウムチヤンネルサブユニ・肩−をコートするＤＮＡの同定ど単 離ヒ］・の神経のカルン白ムチヤンネルα２サブユニノ］・をコードするＤＮＡ は、α１サブユニツトをコートするＤＮＡを単離するのに使用された方法と実質 的に同し方法て単離さオ］たか、ヒトゲノムＤＮΔライブラリーは、ウサギの骨 格筋カルシウムチヤンネルα、サブユニソ］・をコートするＤＮＡの断片と低緊 縮条件および高緊縮条件下でプローブさせた。この断片は、ウサギの骨格筋カル ソウｌ、チャンネルα、サブユニソ１−ｃＤＮＡのヌクレオチド４３から２７２ の間のヌクレオチド配列に対応する配列を有するヌクレオチドを含有していた。

これはＰＣＴ国際特許出願第ＷＯ３９１０９８３４号に開示されており、これは 米国出願第０７／６２０．５２０に対応し、これは１９８８年４月４日に提出さ れた米国第１７６．８９９号の一部継続出願であり、この出願は参考のため本明 細書に引用されている。

実施例４は、プローブとしてのゲノムＤＮＡへの７ゾブリダイセーシヨンにより 同定された、ゲノムＤＮＡとｃＤＮＡクローンを用いる、ヒトのＤＮＡライブラ リーからのヒトのカルシウムチャンネルのα２サブユニットをコートするＤＮＡ クローンの単離を示す。

配列ＩＤ　Ｎｏ、］ｌはα２サブユニツトをコートするＤＮＡの配列を示す。

実施例５に記載されるように、ウサギの骨格筋カルシウムチヤンネルα２サブユ ニツｈｃＤＮＡから分岐する、ヒトの神経α２サブユニツトｃＤＮＡの領域に特 異的なオリゴヌクレオチドブライマーを用いる、ヒトの骨格筋、脳組織および大 動脈からのＲＮＡのＰＣＲ解析により、ヒトのカルシウムチャンネルα２サブユ ニツト転写体のスプライス変種か同定された。

ヒトのγカルシウムチヤンネルサブユニット−をコートするＤＮＡの同定と単離 、ヒトの神経のカルシウムチヤンネルサブユニットをコートするＤＮＡは、実施 例６に詳述するように単離された。配列［）Ｎｏ、１４は、４３個のアミノ酸残 基の配列をター１−する読み取り枠を含有するＤＮＡの３”末端でのヌクレオチ ド配列を示している。

異種カルシウムチャン不ルサフ゛ユニットをター１へするＤＮＡを含Ｙ丁する絹 換え真核細胞の調製 １つまたはそれ以上のカルシウムチャン不ルサブユニツ１〜またはカルシウムチ ヤンネルサブユニットの一部をコートするＤＮＡは、ＤＮＡの発現と複製のため に宿主細胞に導入される。そのようなりＮＡは下記の例または当業者に公知の他 の方法を用いることにより導入される。適当な発現ベクターへのクローン化ＤＮ Ａの取り込み、（それぞれか１つまたはそれ以」二の異なる遺伝子をコートする ）ブラスミットヘクターまたはプラスミソｔ”’＼クターの組合せまたは線状Ｄ ＮＡによる真核細胞のトランスフエクシヨン、そしてトランスフェクションされ た細胞の選択は、当該分野て公知である（例えば、サムブルーフ（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋ）ら、１９８９、分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ（］ｏｎｉｎｇ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コー ルド、スプリングハーハーラホラトリープレス（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒ ｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ）を参照）。

ヒトのカルシウムチヤンネルの任意のサブユニットをコートするクローン化全長 ＤＮＡは、真核細胞の発現のためにプラスミツトベクター中に導入される。その ようなりＮＡはゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡてもよい。宿主細胞は−Ｆ記プラス ミツトの１つまたは組合せてトランスフェクションされ、その各々は少なくとも １＝〕のカル、／ウムチャンネルザブユニットをコードする。あるいは当業者に 公知の方法を用いて、宿主細胞を線状ＤＮＡでトランスフェクションしてもよい 。

本発明のＤＮＡは任意の真核細胞中（例えばフレラグ（Ｃｒｅｇｇ）ら、１９８ ７、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５：４７９）て発現されるか、本発明のし １〜のカルソウＩ、チャンネルサブユニットをコートするＤＮＡの発現のために は哺乳動物発現系か好ましい。

異種ＤＮＡは当業者に公知の任意の方法（異種ＤＮＡをコートするベクターによ るトランスフエクシヨン）で導入される。哺乳動物細胞のトランスフ−Ｌクショ 冒こ特に好ましいベクターはｐＳＶ２ｄｈｆｒ発現ヘクターてあり、これは５ｖ ４０プロモーター、マウスのｄｈｆｒ遺伝子、ＳＶ４ポリアデニル化部位、スプ ライソング部位、および細菌中でベクターを維持するために必要な配列、サイト メガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーターを基礎にしだベクター（例えばｐＣＭＶ 、圭たはｐｃＤＮＡｌ）、　およびＭＭＴＶプロモーターを基礎にしたベクター を含有する。ヒ１−のカルシウムチャン不ルサフ”ユニットをコートするＤＮＡ は、ＣＭＶプロモーターのすぐ後ろに続く位置のへクターｐｃＤＮＡｌ中に挿入 されている。

安定にまたは一過性にトランスフェクションされた哺乳動物の細胞は、当業者に 公知の方法により、チミンンキナーゼ遺伝子、ジヒドロフオレート還元酵素遺伝 子、ネオマイシン耐性遺伝子なとの選択性マーカーを有する発現ベクターて細胞 を１〜ランスフエクシヨンし、一過性トランスフェクションには、マーカー遺伝 子を発現する細胞に選択的な条件下でトランスフェクションした細胞を増幅させ ることにより、調製される。機能性電位依存性カルシウムチヤンネルは、ヒトの カルシウムチャンネルサブユニ・ノドをコートするＤＮＡを含有するベクターｐ ｃＤＮＡ１の誘導体でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞中で産生され ている。

異種ＤＮＡは細胞中てエピソーム因子として維持されるか、または細胞の染色体 ＤＮＡ中に取り込まれる。得られる組換え細胞は次に、培養されるかまたはその ような培養物から副次培養（哺乳動物の場合は継代培養）される。トランスフェ クションの方法、注入および組換え細胞の培養法は、当業者に公知である。ＤＮ ＡまたはＲＮＡか導入される真核細胞は、そのようなりＮＡまたはＲＮＡにより トランスフェクションされ得る任意の細胞、またはそのようなりＮＡまたはＲＮ Ａか導入される任意の細胞を含む。実質的にすべての真核細胞は、異種ＤＮＡの 運搬体（ｖｅｈｉｃｌｅ）となる。好適な細胞は、ＤＮＡまたはＲＮＡを発現す ることができる細胞であり、最も好ましい細胞は、異種ＤＮＡにコートされる１ つまたはそれ以上のサブユニットを含む組換えまたは異種カルシウムチャンネル を形成することかできる細胞である。そのような細胞は経験的に同定されるか、 または容易にトランスフェクションされるかまたは注入されることか知られてい るものの中から選択される。ＤＮＡの導入に好適な細胞は、一過性にまたは安定 にトランスフェクションされるものであり、哺乳動物起源の細胞、例えばＣＯ８ 細胞、マウスＬ細胞、ＣＨＯ細胞、ヒトの胎児腎細胞、アフリカングリーンマン キー（Ａｆｒｉｃａｎ　ｇｒｅｅｎ　ｍｏｎｋｅｙ）細胞および当業者に公知の そのような細胞、両生類細胞（例えはゼノブスラエビス（ＸｅｎｏｐｕｓＩａｅ ｖｉｓ）卵母細胞）、またはサソ力ロミセスセレビッシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍ ｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）またはピキアバストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐ ａｓｔｏｒｉｓ）のような酵母かある。注入されたＲＮＡ転写体の発現に好適な 細胞はゼノブスラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）卵母細胞である。Ｄ ＮＡのトランスフェクションに好適の細胞は、容易にかつ効率的にトランスフェ クションされるものである。そのような細胞は当業者に公知であるか、または経 験的に同定される。好適な細胞にはＤＧ４４細胞およびＨＥＫ２９３細胞かあり 、特に懸濁培養での増幅に適応し、液体窒素中で凍結され次に溶解され再増幅さ れるＨＥＫ２９３細胞である。そのようなＨＥＫ２９３細胞は、例えばゴーマン （Ｇｏｒｍａｎ）の米国特許第５．０２４，９３９号に記載されている（またス チルマン（Ｓ　ｔ　ｉ　ｌ　１ｍａｎ）ら、１９８５、Ｍｏ１Ｃｅ１１．Ｂｉｏ ｌ、　、５：２０５１−２０６０を参照）。

細胞はそこに導入された異種ＤＮＡの複製、またはそこの導入された異種ＤＮＡ の発現のための運搬体として使用される。ある実施態様においては、細胞は、実 質的に純粋なヒトのカルシウムチャンネルサブユニットまたは異種カルシウムチ ャンネルを産生ずるための手段として、異種ＤＮＡを発現するために運搬体とし て使用される。異種ＤＮＡを含有する宿主細胞は、カルシウムチヤンネルか発現 される条件下で培養される。カルシウムチャンネルサブユニットは当業者に公知 の蛋白精製法を用いて精製される。例えば、１つまたはそれ以上のサブユニ・ソ ｌ−に特異的に結合する本発明で与えられる抗体は、サブユニットまたはサブユ ニットを含むカルシウムチャンネルのアフイニテイ精製に使用される。

ヒトのカルシウムチヤンネルα１サブユニツト、ヒトのカルシウムチャンネルの α、サフ゛ユニット、ヒトのカルシウムチャンネルのβサブユニットおよびヒト のカルシウムチヤンネルのγサブユニット・の、ヒトのカルシウムチャンネルの 実質的に純粋なサブユニットか与えられる。また、少なくとも１つのヒトのカル ノウ１、ヂャシ不ルサブユニソ１−を含有する実質的に純粋な単離されたカルシ ウムチャ：、ネルち与えられる。また、宿主細胞にコートされる１つまたはそれ 以−にのすニア’−にノド・、および細胞に導入された異１ＩＤＮＡまたはＲＮ Ａにコードされる１つまたはそれ以」−のサブユニットの混合物を含有する実質 的に純粋なカルシウムチーヤンネルも与えられる。実質的に純粋なサブタイプ特 異的カルシウムチャンネルまたは組織タイプ特異的カルノウＩ、チャンネルもま た与えられる。

池の実施態様において、ヒ１〜のカルシウムチャンネルα１サブユニツト、ヒト のカルノウＩ、チャンネルのα２サフ゛ユニット、ヒトのカルシウムチヤシネル のβザフ゛ユニ、川−そしてヒ］・のカッじノウムチヤンネルのγサブユニット の少なくとも１−７）をター件する異種ＤＮＡを含有する真核細胞か与えられる 。ある好適な実施態様において、異種ＤＮＡは真核細胞中で発現され、好ましく はヒトのカルシウムチャンネルα１サブユニツトをコートする。

特に好適な面において、異種ＤＮＡを含有する真核細胞はそれを発現し、組換え 機能的カルシウムチャンネル活性を形成する。さらに好適な面において、組換え カルシウムチャンネル活性はトランスフェクションされていない宿主細胞か存在 せず、トランスフェクションされていない細胞中ては現れない強さであるため、 組換えカルシウムチヤンネル活性は容易に検出可能であるそのような細胞の中で 好適なものは、機能的異種カルシウムチヤンネルを存する組換え真核細胞である 。組換え細胞は、ヒトのカルシウムチャンネルのα１サブユニツトをコードする 、そしてさらに好ましくはヒトのカルシウムチャンネルのβサブユニットをコー トする異種ＤＮＡおよび／またはヒトのカルシウムチャンネルのα、サブユニッ トをコードする異種ＤＮＡを発現する、異種ＤＮＡまたはＲＮＡ転写体の導入そ して発現により産生される。特に好適なものは、そのような異種ＤＮＡまたはＲ ＮＡ転写体にコードされるα１、βおよびα２サブユニツトのそれぞれのそのよ うな組換え細胞中での発現、および随時ヒトのカルシウムチヤンネルのγサブユ ニットをコードする異種ＤＮＡまたはＲＮＡ転写体の発現である。

ある実施態様において異種カルシウムチャンネルを有する真核細胞は、細胞中で 翻訳されてヒトのカルシウムチャンネルのサブユニットになる少なくとも１つの ＲＮＡ転写体を含有する最初の組成物を、細胞に導入することにより産生される 。好適な実施態様において、翻訳されるサブユニットはヒトのカルシウムチヤン ネルのα１サブユニツトを含有する。さらに好ましくは導入される組成物は、ヒ トのカルシウムチャンネルのα１サブユニットをコートするＲＮＡ転写体を含有 し、また（１）ヒトのカルシウムチャンネルのβサブユニットをコートするＲＮ Ａ転写体、および／または（２）ヒトのカルシウムチャンネルのα２サブユニッ トをコートするＲＮＡ転写体を含有する。特に好適なものは、ヒトのα１、αβ およびα２カルシウムチヤンネルサブユニツト、および随時ヒトのカルシウムチ ャンネルのγサブユニットをコートするＲＮＡの導入である。

クローン化ＤＮＡのインヒドロの転写法と得られるＲＮＡの真核細胞への注入法 は当業考に公知である。ヒトのカルシウムチャンネルに任意のサブユニットをコ ートする全長ＤＮＡの任意の転写体は、細胞中ての発現のために単独でまたは他 の転写体とともに真核細胞中に注入される。本発明のし）−のカルシウムチヤン ネルサブユニｙ　ｈ　ｃ　ＤＮＡクローンのインビトロの転写体の発現には、両 生項の卵母細胞か特に好ましい。

機能的カルシウムチヤンネルは好ましくは、ヒトのカルシウムチャンネルの少な くとも１つのα１サブユニツトおよびβサブユニッ）・を含有する。これらの２ つのサブユニットを発現する真核細胞および追加のサブユニットを発現する細胞 は、ＤＮＡのトランスフェクションおよびＲＮＡ転写体の注入により調製される 。

そのような細胞は、１つまたはそれ以上の異種のヒトのカルシウムチヤンネルサ ブユニノｌ−を含有するカルシウムチヤンネルに起因する電位依存性カルシウム チャンネル活性を示した。例えば、α１サブユニツトとβサブユニット以外にα ２サブユニツトを含有する異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞では、 脱分極に応して細胞膜を介するカルシウム選択性イオンの流れが上昇することか 証明さ第１ており、これはα２サブユニツトかカルシウムチヤンネル機能を増強 することを示している。

少なくともヒトβサブユニツト、ヒトβサブユニットおよびヒトα２サブユニ・ ノドを含有する異種カルシウムチャンネルを発現する真核細胞か好ましい。

α１サブユニツト単独またはβサブユニットおよび／またはα２サブユニツトと ともにター１−するｃＤＮＡまたはＲＮＡ転写体を含有する組成物で形質転換し た真核細胞は、機能的カルシウムチヤンネルを発現する細胞の産生に使用される 。

異ｆｌｃＤＮＡまたはＲＮＡにコートされるすへてのヒトサブユニットを含有す るヒトのカルシウムチヤンネルを発現するＲ１換え細胞か特に好ましいため、異 種ＤＮＡまたはＲＮＡにコートされるヒトサブユニットを含有するそのような宿 主細胞を注入またはトランスフェクションすることか好ましい。サブユニソＩ・ をコートするＤＮＡまたはＲＮＡの正確な量および比率は経験的に決定され、特 定の組合せのサブユニッ］・、細胞および測定条件について最適化される。

機能的異種力ルシウｌ、チャンネルの活性の測定に関して、好ましくは宿主細胞 の内因性のイオンチャンネル活性そして、必要な場合は目的のサブユニットを含 有しないチャンネルの異種チャンネル活性は化学的、薬理学的および電気生理学 的記録（差動性の保持電位（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｈｏｌｄｉｎｇｐｏｔ ｅｎｔｉｏａｌ）を含む）により、大幅に阻害され、測定される異種カルシウム チャンネル活性のＳ／Ｎ比は上昇する。

１つまたはそれ以上のサブユニットを組換え的に発現する真核細胞の用途の１つ は、試験化合物かカルシウムチャンネルのアゴニストまたはアンタゴニスト活性 を有するか否かを調へることである。カルシウムチャンネルサブユニットの発現 のための宿主細胞は、リガンド結合測定法での異種カルシウムチャンネルサブユ ニットの検出、または機能的測定法での異種カルシウムチヤンネル機能（例えば カルシウム電流の発生）の検出を実質的に妨害する量では、内因性のカルシウム チャンネルサブユニットのタイプを産生しないことが好ましい。

リガンＩ・結合測定法では、宿主細胞は、生理的濃度（一般的にナノモルまたは ピコモルの濃度）で、本発明のヒトのカルシウムチャンネルサブユニットの１つ またはすべてを含有するカルシウムチヤンネルに対するアフィニティを存する化 合物と検出てきる程の相互作用をする内因性のカルシウムチャンネルを産生じな いことか好ましい。

カルシウムチャンネルに対してアフィニティを存する化合物を同定するためのり 、ガント結合測定法では、好ましくは少なくとも１つの異種αＩサブユニットを 発現する細胞か使用される。少なくともα１サブユニッ１−を発現するトランス フェクションされた真核細胞は、カルシウムチヤンネルの活性を特異的に変更す る試験化合物の能力を測定するのに使用される。そのようなリガンド結合測定法 は、インタフ１−のトランスフェクションされた細胞またはそこから調製される 股上で実施される。

異種カルシウムチヤンネルまたはそのサブユニットを含有する膜に結合するがま たはその膜と相互作用する試験化合物の能力は、任意の適当な方法（例えばスキ ャチャートプロソｌ□　（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ　ｐｌｏｔ）のような競合的結合 解析）を用いて測定される。スキャチャードブロットでは、カルシウムチャンネ ルに対して既知のアフィニティを存する１つまたはそれ以上の濃度の化合物の存 在下または非存在下で、そのような膜の結合能力が測定される。必要な場合はこ の結果を、当業各に公知の方法で設計された対照実験と比較する。例えば結果を 、陰性対照として、１つまたはそれ以上のサブユニットを含有する核酸でトラン スフｓＪノヨンしていない宿主細胞から、同じように処理した膜調製生物の測定 結果と比較する。

叫・のカルシウムチャンネルの１つまたはそれ以上のサブユニットを含有する電 位依存性ヒトのカルシウムチャンネルを発現する、安定にまたは一過性にトラン スフェクションされた細胞または注入された細胞は、好ましくはカルシウムチャ ンネル活性を調節するカルシウムチャンネルアゴニストやアンタゴニストなとの 薬剤を同定するための測定法で使用される。カルシウムチャンネルアゴニストま たはアンタボニス１−に対する活性か未知の化合物を含む試験化合物の活性を機 能的に試験して、試験化合物はヒトのカルシウムチャンネルを介するカルシウム の流れを増強、阻害または変更させるか否かをめるには、（ａ）細胞にカルシウ ムチャンネル選択性イオンの流れを制御することかできる異種機能的カルシウム チャンネルを発現するように、トランスフェクションまたは注入された真核細胞 をカルシウムチャンネル選択性イオンを含有する媒体中で維持し、（ｂ）異種カ ルシウムチヤンネルか実質的に閉じられ、細胞の内因性カルシウムチャンネルか 阻害される条件下で細胞を維持し、（Ｃ）工程（ｂ）で維持された細胞の膜を、 ある程度かつ異種カル：ノウムチヤンネル（好ましくは実質的にはこれのみ）を カルシウムチャンネル選択性イオンに対して透過的にするのに充分な時間脱分極 させて、（ｄ）試験化合物の存在下での細胞内へ電流の流れる量と時間を、試験 化合物の存在しない条件下で同し細胞または実質的に同し細胞への電流の流れと 比較する。

機能的組換えカルシウムチヤンネルまたは異種カルシウムチャンネルは、当業各 に公知のｆｆ：意の方法で同定される。例えば、細胞のイオン選択膜を介する電 流を測定する公知の電気生理学的方法か使用される。本発明の１つまたはそれ以 上のサブユニットをコートするＤＮＡを含有する組換え細胞の異種カルシウムチ ャンネルを介するカルシウム選択性イオンの流れの量と時間は、２つの電極と全 細胞パｙｆ−クランプ法を用いる電気生理学的記録を用いて測定される。組換え チャンネルを介してカルノウ１４を流を測定する場合、測定法の感度を」１昇さ せるために、公知の方法を用いて非カルシウム電流および内因性のカルシウムチ ャンネルに起因するカルシウム電流を除去または低下させる。例えばＤＨＰ　Ｂ ａｙ　Ｋ８６４４はチャンネルの開いた状態の時間を増加させて、特異的にＬ− 型カルシウムチャンネル機能を増強する（例えばハース（Ｈａａｓ　Ｊ、Ｂ、　 ）ら、１９８４、Ｎａａｕｒｅ、３１１：５３Ｂ−５４４を参照）。チャンネル か長い時間開いていると、カルシウム電流の強度と時間か上昇する。電圧コマン ド（ｖｏｌｔａｇｅ　ｃｏｍｍａｎｄ）を脱分極することによるイオンチャンネ ルの活性化の後に、細胞膜の再分極によりテール電流（ｔａｉｌ　ｃｕｒｒｅｎ ｔ）か観察される。開かれたチャンネルは再分極により閉しるまたは「脱活性化 」をするのに一定の時間か必要であり、この時間内にチャンネルを流れる電流を テール電流と呼ぶ。Ｂａｙ　Ｋ８６４４はカルシウムチヤンネル内の開いている 時間を延長させるため、これはテール電流を延長させ、さらに顕著にする。

実施例 以下の例は本発明を例示するのみてあり、決して本発明の範囲を限定するもので はない。

実施例１・ヒトの神経電位依存性カルシウムチャンネルサブユニットをコートす るＤＮＡのｍ離に使用されるライブラリーの調製Ａ：　ＲＮＡ単離 １．１ＭＲ３２細胞 １ＭＲ３２細胞はアメリカンタイプ力ルチャーコレクンヨン（Ａｍｅｒｉｃａｎ 　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ整理番号ＣＣ Ｌ　Ｉ　２７、メリーラント州ロックビル）から入手し、ＤＭＥＭ、１０％牛脂 児血清、１％ベニンジン／ストレブ１〜マイシン（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）、ニュ ーヨーク州グランドアイランｌ”（Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ））＋１．０酬の ジブチリルｃＡＭＰ　（ｄｂｃＡＭＰ）中てＩＯ日間増幅させた。ヒルンホイム （Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）の記載する方法（１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１６　：　１４８７−１４９７）に従い、総ＲＮ Ａを細胞から単離した。ポリ（△”）ＲＮＡを標準的方法に従い選択した（サム ブルーフ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、分子クローニング、実験室マニュ アル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ ｕａｌ）、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−ブレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）：　７．２６−７． ２９頁を参照）。

２　ヒト視床組織 ナショナルニュ−ＩＪ　Ｏソカルリサーチバンク（ＮａｔｉｏｎａｌＮｅｕｒｏ ｌｏｇｉｃａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｂａｎｋ）（カリホルニア州ロサンゼルス ）から得た、−７０℃で凍結されていたｌ−トの視床組織（２，３４ｇ）≦−１ 液体窒素のｒγ在下て乳鉢と乳棒で粉砕し、細胞を１２ｍ１の溶解緩衝液（５Ｍ のゲアニノウＩ、イソチオシアネート、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７，４，１０ｍ ＭのＥＤＴＡ、５９６のβ−メルカプトエタノール）に溶解した。溶解物に溶解 緩衝液を加え、最終容量を１７ｍ１とした。Ｎ−ラウリルサルコシンとＣｓＣｌ を混合物に加えて、最終容量１８ｍ１中の最終濃度をそれぞれ４％と０．０１ｇ ／ｍｌにした。

ソーハル（Ｓｏｒｖａ　ｌ　１）ＳＳ３４０−ター中て９，００Ｏｒｐｍで室温 で１０分間試料を遠心分離して、不溶性物質をペレソ１−とじて除去した。上澄 液を２等分して、それぞれを別々の遠心分離管中の５．７ＭのＣｓＣｌ、０．１ ＭのＥＤＴＡの溶液の２ｍｌのクノノヨン状のものの上に重層して、前当たり約 ９ｍｌにした。試料をＳＷ４１０−々−中で３７．０００ｒｐｍで２０°Ｃて２ ４時間遠心分離し、プこ。

遠心分離ｉ組各ＲＮ△ベレットを３ｍｌのＥＴＳ（１０蘭のトリス、ｐＨ７，４ ，０２９６の５ＤＳ）に再懸濁し、１つの管に集めた。このＲＮＡを０．２５Ｍ の塩化ナトリウｌ、と２倍量の９５９６エタノールで沈澱させた。

沈澱物を遠心分離して集め、４ｍｌの円く緩衝液（０，０５Ｍのトリス、ｐＨ８ ，４，０、＋４Ｍの塩化ナトリウム、０．０量ＭのＥＤＴＡ、１％の５ＤＳ）に 再懸濁した。プロディナーセＩ〈を較終濃度か２００μｇ／ｍｌになるように加 えた。試料を２２°Ｃて１時間インキコヘートした後、等量のフェノール−クロ ロホルム　イソアミルアルコール（５０：４８・２）で２回抽出し、次に等量の クロロホルム　イソアミルアルコール（２４：ｌ）で１回抽出した。ＲＮＡをエ タノールと塩化すｌ−リウムで沈澱させた。沈澱物を４００μｍのＥＴＳ緩衝液 に再懸濁した。

総ＲＮＡの収率は約１．０ｍｇであった。実施例１．Ａ、１．に記載の標準的方 法に従い、総ＲＮＡからポリＡ”　ｍＲＮＡ　（３０Ｍｇ）を単離した。

Ｂ　ライブラリー作成 標準的方法（例えば、サムブルーフ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、分子ク ローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ− プレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅ ｓｓ）、第８章を参照）に従い、２本鎖ＣＤＮＡを合成した。実質的に同し方法 で各ライブラリーを調製したか、その差は・１）ｉ＆初の鎖のｃＤＮＡ合成を開 始（ｐｒｉｍｅ）するために使用されるオリゴヌクレオチド、２）２本鎖ＣＤＮ Ａに結合されるアダプター、３）遊離のアダプターまたは未使用のアダプター、 そして４）λファージヘクターに結合された分画されたｃＤＮＡＯサイズである 。

１、　１ＭＲ３２ｃＤＮＡライブラリー＃２１Ｒ３２ポリＡ”　ＲＮＡ　（実施 例１．Ａ、！、）を鋳型として用いて１本鎖ＣＤＮＡを合成し、オリゴ（ｄＴ） 、！−，，（コラボラティブリサーチインク（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒ ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、）、マサチュセッツ州ベットフォード）を用いて反応 を開始させた。１本＆１ｃＤＮＡを２本鎖ＣＤＮＡに変換し、収率は約２μｇで あった。次に以下の方法に従い２本鎖ＣＤＮＡに、５ｎａＢＩとＸｈｏｌ制限部 位も含有するＥｃｏＲＩアダプター：５’　−ＡＡＴＴＣＧＧＴＡＣＧＴＡＣＡ ＣＴＣＧＡＧＣ−３’　＝　２２量体（配列ＩＤ　Ｎｏ、１５）３’　−ＧＣＣ ＡＴＧＣＡＴＧＴＧＡＧＣＴＣＧ−５’　＝　１８量体（配列ＩＤ　Ｎｏ、１６ ）を加えた。

８．１８量体のリン酸化 標準的方法（例えば、サムブルーフ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、分子ク ローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋ＡＬａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、：ｌ−ルドスブリングハーバーラボラトリ ープレス（Ｃｏｌｄ　５ｐｒｉｎ’ｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰ ｒｅｓｓ）、第８章を参照）に従い、総量１８μｌ中で１８量体（２２５ピコモ ル）を［”ＰＩ　γ−ＡＴＰ　（７０００Ｃｉ／ミリモル）とキナーゼ（２Ｕ） と−緒にして、３７°Ｃて１５分間インキュベートして、１８量体をリン酸化し た。

仁ノキュベートの後、ｌμｌのｌ０ｍＭのＡＴＰと追加の２Ｕのキナーゼを加え 、３７°Ｃて１５分間インキコヘートした。次にキナーゼを１０分間煮沸して不 活性化した。

ｂ、２２℃１体のハイブリダイゼータ９ン２２５ピコモルの２２量体（ここに水 を加えて１５μｍとする）を添加し、次に６５°Ｃて５分間インキュベートして 、２２量体をリン酸化された１８量体とハイブリダイズさせた。次に室温に冷却 して反応を遅くした。

アダプターは１５ピコモル／μｌの濃度で存在し、ｃＤＮＡ−アダプター結合の 容易はてきていた。

ｃ、ｃＤＮＡへのアダプターの結合 標準的方法（例えば、サムブルーフ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、分子ク ローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａ ｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、コールトスプリングツ１−ノく一ラボラト リープレス（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰ ｒｅｓｓ）、第８章を参照）に従い、ＥｃｏＲｌ、５ｎａＢＩ　ＸｈｏＩアダブ ４−を２本鎖ＣＤＮＡに結合させた後、混合物を７２°Ｃて１５分間加熱してリ ガー七を不活性化させた。このｃＤＮＡ結合反応物に以下の試薬を加え、３７° Ｃ−Ｃ５０分間加熱した　ｃＤＮＡ結合反ＬＤ物（２０μＩ）、水（２４μｌ） 、１０Ｘ１ナーｔ？　（３ｔｔ　Ｉ　）、ｌＯ閘のＡＴＰ（ｌμｌ）およびキナ ーゼ（２Ｕ／ｍｌを２μｍ）。２μｍの０．５ＭのＥＤＴＡを加えて反応を停止 させ、次（こフェノール／クロロホルムで１回そしてクロロホルムて１回抽出し た。

ｄ、ｃＤＮＡのサイズの選ＩＲとパッケージング５ｍｌのセフγロースＣＬ−４ Ｂカラム（シグマ（Ｓｉｇｍａ）　、セントルイス、ミズーリ州）を用いて、遊 離または結合していないアダプターから、ＥｃｏＲＩ、５ｎａＢＩ、ＸｈｏＩア ダプターを有する２本鎖ＣＤＮＡを精製した。＋００ｔｔ　ｌの両分を集め、放 射能を追跡して測定したｃＤＮＡを含有する両分をブール１＝、エク′−ルで沈 澱させ、ＴＥ緩衝液に再懸濁し、ｌｑ石アガロースゲノ叶にのせた。電気泳動の 後、ゲルをエチジウムブロマイドで染色し、ゲルから１から３ｋｂの両分を切り とった。アガロース中に埋まっているｃＤＮＡを、　「ゲネルター電気溶出シス テムＪ　（”Ｇｅｎｅｌｕｔｅｒ　ＥｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ ”）（アーヒトロゲンン（Ｉｒｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリホルニア州、サンジエ ゴ）を用いて溶出した。溶出したｃＤＮＡをエタノール沈澱して集め、０．ｌＯ ピコモル／ｍｌてＴＥ）１衝液に再懸濁した。ｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩて消化し た１Ｕｇの脱リン酸化λｇｔ１１と、５μｍの反応容量で、λｇｔ１１ベクター に対するｃＤＮＡの比か２から４倍モル過剰になるようにして結合させた。ｃＤ ＮＡ挿入体を含有する結合されたλｇｔｌ＋を、ギガパック（Ｇ　ｉ　ｇ　ａ　 ｐ　ａ　ｃ　ｋ）　（ス１−ラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリホルニ ア州、ラホイヤ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ））キットを用いてインビトロで、γファー ジにパッケージングした。スクリーニングの準備のため、パッケージングしたフ ァージを大腸菌ＹＩ０８８細菌ローン（ｌａｗｎ）の上に広げた。

２．１ＭＲ３２ｃＤＮΔライブラリー＃２このライブラリーは前述（実施例１． 　Ｂ、ｌ）　したように調製したか、ｌ−３ｋｂの断片てはなく３−９ｋｂのｃ ＤＮＡ断片をλｇｔｌ＋に結合させた。

３．１ＭＲ３２ｃＤＮＡライブラリー＃３、Ｉ　ＭＲ３２細胞ポリ（Ａ“’）Ｒ ＮＡ　（実施例１．Ａ、１．）を鋳型として用いて１本鎖ＣＤＮＡを合成した。

最初のｃＤＮＡ鎖合成のプライマーはランダムプライマーである（ヘキサデオキ シーヌクレオチド［ｐｄ　（Ｎ）　ｓ　］　、カタログ番号５０２０−１、クロ ンチック（ＣＩｏｎｔｅｃｈＬ力リホルニア州パロすル）（Ｐａｌｏ　Ａｌｔｏ ））。２本鎖ＣＤＮＡを合成しく実施例１．　Ｂ、１．　’）、このｃＤＮＡに ＥｃｏＲＩ、５ｎａＢＩ、Ｘｈｏｌアダプターを結合させ（実施例１．　Ｂ、１ ．　）、未結合のアダプターを除去しく実施例１．　Ｂ、！、　）、アダプター の結合した２本ｊｌｃＤＮＡをアガロースゲル上で分画した（実施例１．ＢＩ　 ）。１．８ｋｂより大きいｃＤＮＡ画分をアガロースから溶出しく実施例ＩＢ、 １．）、λｇｔ１１に結合させ、パッケージングし、Ｙ２Ｏ２Ｓの細菌ローン− Ｌに広げた（実施例１．　Ｂ、１．　）。

４、ＴＭＲ３２ｃＤＮＡライブラリー＃４１ＭＲ３２細胞ポリ（Ａ′″）ＲＮＡ 　Ｃ実施例１．Ａ、１．）を鋳型として用いて１本ＭｃＤＮＡを合成した。最初 のｃＤＮＡ鎖合成のプライマーは以下のオリゴヌクレオチドである。α、、（Ｖ ＤＣＣＩＩＩ）タイプα、サブユニット（実施例２Ａ　参照）コート配列（ｎｔ ２９２７から２９５６の相補的配列、配列ＩＤＮｏ、Ｉ）に特異的な５９−３６ ５　ａ、　（１＋ｃ　（ＶＤＣＣＩＩ）タイプα、サブユニット（実施例２．　 ８　参Ｆ）コート配列（ｎ　ｔ　８５２から８７３の相補的配列、配列ＩＤ　Ｎ ｏ、３）に特異的な８９−４９５、Ｃ１，サブユニットコード配列（２４９６か ら２５２０の相補的配列、配列ＩＤ　Ｎｏ、３）に特異的な９〇−１２゜次に前 述したようにｃＤＮＡライブラリーを作成した（実施例１．　８゜３）か、１． ８ｋｂてはなく１．５ｋｂより大きいｃＤＮＡ画分をアガロースから溶出した。

５．１ＭＲ３２ｃＤＮΔライブラリー＃５前述したようにｃＤＮＡライブラリー を作成した（実施例１．　Ｂ、３、）か、１．８ｋｂではなく１．２ｋｂより大 きいｃＤＮＡ画分をアガロースから溶出した。

６　ヒト視床ｃＤＮＡライブラリー＃６ヒト視床ポリ（Ａ”　）ｍＲＮＡ　（実 施例１．あ、２．）を鋳型として用いて１本ＭｃＤＮＡを合成した。最初の鎖の 合成を開始するためにオリゴ（ｄＴ）を使用した（実施例１．　Ｂ、１．　）。

２重鎖ｃＤＮＡを合成しく実施例１．　Ｂ、１．）、以下の配列のＥｃｏＲＩ、 Ｋｐｎ　ｌ　ＮｃｏＩアダプター。

５’　ＣＣＡＴＧＧＴＡＣＣＴＴＣＧＴＴＧＡＣＧ３’　＝　２０　量体（配列 ＩＤ　Ｎｏ、１７）３°ＧＧＴＡＣＣＡＴＧＧＡＡＧＣＡＡＣＴＧＣＴＴＡＡ５ ’　＝　２４量体（配列ＩＤ　Ｎｏ、１８）を、前述した（実施例１．　Ｂ、１ ．　）ように２重鎖ｃＤＮＡに結合させ、１８量体の代オ）りに２０量体を、２ ２量体の代わりに２４量体か入った。ｃＤＮＡ−アダプター混合物を１ｍｌのバ イオゲルｌ−５０（バイオラットラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）、カリホルニア州、リソチモンド（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ））カラ ムを通過させて、結合していないアダプターを除去した。両分（３０μｌ）を集 め、放射能の最初のピークの各両分の１μｍを１％アガロースゲルで電気泳動し た。電気泳動後、真空ゲル乾燥機中でゲルを乾燥し、Ｘ線フィルムに露光させた 。６００ｂｐより大きいｃＤＮＡ断片を含む両分をプールし、エタノール沈澱さ せ、λｇｔｌｌに結合した（実施例１．　Ｂ、１．　）。

ｃＤＮＡライブラリーの作成は前述した（実施例１．　Ｂ、１．　）ように行っ た。

Ｃ，ハイブリダイゼーションと洗浄条件ｃＤＮＡライブラリー、ＤＮＡサザント ランスフｙ−（ＳｏｕｔｈｅｒｎｔｒａｎｓｆｅｒＬ　またはノーザントランス フ−ｒ−（Ｎｏｒｔｈｅｒｎｔｒａｎｓｆｅｒ）をスクリーニングするための、 放射能標識した核酸の固定化ＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、標準的ハイ ブリダイゼーション条件下でルーチンに行った［５ＸＳＳＰＥ、５Ｘデンハルト （Ｄｅｎｈａｒｄｔ″　Ｓ）、５０％脱イオン化ホルムアミド、２００μｇ／ｍ ｌの超音波処理したニシンの精子ＤＮＡ　（カタログ番号２２３６４６、ベーリ ンガーマンハイムバイオケミカルズ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ 　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、インディアナ州、インディアナポリス）］。５ ＳＰＥとデンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ）の組成と脱イオン化ホルムアミ ドの調製製法は、例えばサムブルーフ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、分子 クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　 ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ）、コールトスプリングハーバーラポラＩ・ リーブレス（ＣｏｌｄＳ−ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｐｒｅｓｓ）、第８章に記載されている。あるハイブリダイゼーションにおいて は、標準的ハイブリドーマ条件の５０％脱イオン化ボルムアミドの代オ）りに１ ０％脱イオン化ボルムアミドを用いるという、低緊縮条件を使用した。

非特異的プローブをフィルターから除去するための洗浄条件は、以下の高、中、 低緊縮条件である： １）高緊縮条件：０．ｌＸ５ＳＰＥ、０．Ｌ％ＳＤＳ、６５℃２）中緊縮条件： ０．２ＸＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０″Ｃ３）低緊縮条件：　１．０ＸＳＳ ＰＥ、０．Ｉ％ＳＤＳ、５ｏ″Ｃ別の緩衝液、塩および温度を用いて同様の緊縮 条件か得られることは理解される。

実施例２：ヒトの神経カルシウムチャンネルα１サブユニツトをコートするＤＮ Ａの単離 Ａ　Ｃ１，サブユニットをコードするＤＮＡの単離１、部分的αｌ＋ＩｃＤＮＡ クローンの参考リスト完全なコート・配列そして５′および３゛非翻訳配列の部 分を性状解析するために、無数のＣ１，特異的ｃＤＮＡクローンを単離した。配 列ＩＤ　Ｎｏ、１は、完全なα、ｏＤＮＡコート配列、翻訳開始部分と提唱され ているアデニンヌクレオチｌ−に隣接するグアニンヌクレオチドて終オ）るＣ１ Ｄ５′非翻訳配列の５１０個のヌクレオチド、および３°非翻訳配列の６４２個 のヌクレオチドを示す。配列ＩＤＮｏ、Ｉにはまた、推定されるアミノ酸配列か 示しである。Ｃ１，配列の性状解析および全長α＋ｎｃＤＮＡ配列に対する各ク ローンのヌクレオチドの位置を性状解析するのに使用される部分的ｃＤＮＡクロ ーン（配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌに記載されている）のリストを以下に示す。これらの クローンの単離と性状解析は後衛する（実施例２．　Ａ、１．　）。

１ＭＲ３２１，＋４４　５°非翻訳配列のｎｔ、ｌから５１０　配列ＴＤ　Ｎｏ 、１ｎｔ、５１１から２４３１　配列ＩＤ　Ｎｏ、１１ＭＲ３２本　１．１３６ 　ｎｔ、１６２７から２９８８　配列ＩＤ　Ｎｏ、１追加エクソンの ｎｔ、ｌから１０４　配列ＩＤ　Ｎｏ、２量ＭＲ３２＠　１．８０　ｎｔ、２０ ８３から６４６８　配列ＩＤ　Ｎｏ、１１ＭＲ３２＃　１．３６　ｎｔ、２８５ ７から４２８１　配列ＩＤ　Ｎｏ、１１ＭＲ３２１，１６３ｎｔ、５２００から ７６３５　配列ＩＤ　Ｎｏ、１本ｎｔ１６２７の５’　、１ＭＲ３２１，１３６ は実施例２．八　〇、ｄ、に記載のイントロンと追加のエクソンをコードする。

＠　１ＭＲ３２１，８０は２つの欠失、ｎｔ２９８４から３１３１とｎｔ５３０ ３から５３４９を存する（配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌ）。１４８ｎｔの欠失（ｎｔ。

２９８４から３１３１）は、実施例２．　Ａ、３．　ｂに記載のポリメラーゼチ ェイン反応により修正した。

＃　１ＭＲ３２１，３６は１３２ｎｔ欠失（ｎｔ、３０８１から３２１２）を含 む。

２、実施例２．　Ａ、１．に記載の各クローンの単離と性状解析ａ、ＩＭＲ３２ １，３６ ウサギの骨格筋カルシウムチャンネルα、ｃＤＮＡ　（ウサギの骨格筋カルシウ ムチャンネルα１サブユニツトｃＤＮＡについては、タナベ（ＴａｎａｂｅＳＴ 。

）ら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３２８：３１．３−３１８を参照）のコート配 列の放射能標識断片の混合物を用いて、１５０ｍｍのプレート１枚当たり約２０ ０゜０００個のプラークの密度て、２，０００，０００個の１ＭＲ３２ｃＤＮＡ ライブラリー＃ｌの形質転換体（実施例！、Ｂ、］、　）を２重測定てスクリー ニングした 断片　ヌクレオチド゛ ＫｐｎＩ−ＥｃｏＲＩ　−７８から１００６ＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ　Ｉ　Ｉ　００ ６から２６５３ＡｐａＩ−Ａｐａｌ　３０９３から４１８２ＢｇｌｌＩ−３ａｃ ｌ　４４８７から５３１０ハイブリダイセーシヨンは低緊縮ハイブリダイゼーシ ョン条件下で行い（実施例１、Ｃ，）、フィルターを低緊縮条件下（実施例Ｉ　 Ｃ）で洗浄した。スクリーニングした２、０００，０００個のうち１つのα、Ｄ 特異的組換え体（１ＭＲ３２，１，３６）のみか同定された。１ＭＲ３２１，３ ６は標準的方法（サムブルーフ（Ｊ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、分子ク ローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ　Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌＬ：＋−ル１−スプリングハーバーラボラトリ −ブレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒ ｅｓｓ）、第８章を参照）に従ってプラーク精製し、ｐＧＥＭ３　（プロメガ（ Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州、マジソン（Ｍａ　ｄ　ｉ　ｓ　ｏｎ）　 ）にサブクローニングし、ＤＮＡ配列決定により性状解析した。

ｂ、Ｉ〜ｌＲ３２］、８０ プローブとして１ＭＲ３２１，３６ｃＤＮＡ断片を用いて、１５０ｍｍのプレー ト１枚当たり約１００，０００個のプラークの密度で、約１．．０００，０００ 個の１ＭＲ３２ｃＤＮＡライブラリー＃２の形質転換体（実施例１．　Ｂ、２． 　）を２東測定でスクリー二〉・グした。標準的ハイブリダイゼーション条件（ 実施例１．　Ｃ，）を使用し、低緊縮条件下（実施例１．　Ｃ，）でフィルター を洗浄した。

：３−）の陽性プラークか同定され、その−）ちの１つは１ＭＲ３２１，８０て あった。標準的方法て１ＭＲ３２１，８０をプラーク精製し、制限マツピングを 行い、サブクロー二〉ゲし、ＤＮＡ配列決定により性状解析した。

Ｃ，１ＭＲ３２１，＋４４ １ＭＲ３２１，８０のＥｅｏＲＩ−Ｐｖｕｎ断片（ｎ　ｔ　２０８３から２５１ ８、配列ＩＤ　Ｎｏ、りを用いて、約１，０００，０００個の１ＭＲ３２ｃＤＮ Ａ→イブラリ−＃３の形質転換体（実施例１．　Ｂ、３．　）をスクリーニング しｔ：。標準的ハイブリダイゼーション条件（実施例１．　Ｃ，）を使用してハ イブリダイゼーションを行い、高緊縮条件下（実施例１．　Ｃ，）でフィルター を洗浄した。：３−〕の陽性プラークか同定され、そのうちの１つは１ＭＲ３２ １，１４４であった。、１ＭＲ３２１，１４４をプラーク精製し、制限マツピン グを行い、ｃＤＮＡ挿人体をｐＧＥＭ７Ｚ　（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）　、 ウィスコンソン州、マジソン（Ｍａｄ　ｉ　５ｏｎ））にサブクローニングし、 ＤＮＡ配列決定により性状解析した。この性状解ｔｆｌこより、１ＭＲ３２１， １４４は７つの可能性のある開始メチオニンをコードする一連のＡＴＧコドンを 有することか明らかになった（ｎｔ５１１から５３１、配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌ）、 ＰＣＲ解析そしてこれら７つのＡＴＧコドンをコートするクローン化したＰＣＲ 生成物のＤＮＡ配列決定により、この配列はｄ　ｂ　ｃ　ＡＭＰて誘導されるＩ 〜ｌＲ３２細胞中で発現されるαＩＤ転写体中に存在することか確認された。

ｄ、１ＭＲ３２１，＋３６ １ＭＲ３２１，８０（実施例２．　Ａ、１．　）のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕＩＩ断片 （ｎｔ２０８３から２５１８、配列ＩＤ　Ｎｏ、Ｉ）を用いて、約１，０００゜ ０００個の１ＭＲ３２ｃＤＮＡライブラリー＃４の形質転換体（実施例１．　８ ゜４　）をスクリーニングした。標準的ハイブリダイゼーション条件（実施例１ ゜Ｃ１）を使用してハイブリダイゼーシヨンを行い、高緊縮条件下（実施例１． Ｃ１）でフィルターを洗浄した。６つの陽性プラークか同定され、そのうちの１ つはＩＮｆＲ３２ｔ、１３６であった。１ＭＲ３２１，１３６をプラーク精製し 、制限マツピングを行い、ｃＤＮＡ挿人体を標準的プラスミツトベクターである ｐＳＰ７２（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州、マジソン（Ｍａ ｄ　ｉ　５ｏｎ））にサブクローニングし、ＤＮＡ配列決定により性状解析した 。この性状解析により、１ＭＲ３２１，１３６は不完全にスプライシングされた α、Ｄ転写体をコートすることか明らかになった。このクローンは配列ＩＤＮｏ 、ｌのヌクレオチド１６２７から２９８８を含有し、その前に約６４０ｂｐのイ ントロンかある。次にこのイントロンを１０４個のｎｔエクソン（配列ＩＤＮｏ 、２）（、これはＣ１，サブユニットのＩＳ６膜通過ドメイン（膜通過の命名法 については、例えばタナへ（Ｔａｎａｂｅ）ら、１９８７、Ｎａｔｕｒｅ、３２ ８：３１３−３１８を参照）をコードする別のエクソンであり、配列ＩＤ　Ｎｏ 。

１のｎｔ＋６２７から１７３０を置換することかできる）で先行させて完全にス プライシングされたＣ１．転写体を産生させる。

ｅ、１ＭＲ３２１，１６３ ｎｔ５８１１から６４６８　（、配列ＩＤ　Ｎｏ、Ｉ）を含む１ＭＲ３２１，８ ０（実施例２．　Ａ、１．　’）のＮｃｏｌ−Ｘｈｏｌ断片（ｎｔ２０８３から ２５１８、配列ＩＤ　Ｎｏ、Ｉ）を用いて、約１，０００，０００個の１ＭＲ３ ２ｃＤＮＡライブラリー＃３の形質転換体（実施例１．　Ｂ、３．　）をスクリ ーニングしたら標準的ハイブリダイゼーション条件（実施例１．　Ｃ，）を使用 してハイブリダイゼーションを行い、高緊縮条件下（実施例１．　Ｃ，）でフィ ルターを洗浄した。３つの陽性ブラーフカ洞室され、そのうちの１つは１ＭＲ３ ２１，１６３であった。１ＭＲ３２１，１３６をプラーク精製し、制限マツピン グを行い、ｃＤＮＡ挿入体を標準的プラスミントベクターであるｐＳＰ　（プロ メガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州、マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））に サブクローニングし、ＤＮＡ配列決定により性状解析した。この性状解析により 、１ＭＲ３２１，１３６はＣ１，停止コドン（ｎｔ６９９４から６９９６）を有 することか明らかになった（配列ＩＤ　Ｎｏ、１）。

３　全長α＋ｏｃＤＮＡの作成（ｐＶＤｃｃＩ［（Ａ））（？１ＤＣＤＮＡクロ ーンの１ＭＲ３２１，１４４，１ＭＲ３２１，１３６，１ＭＲ３２１，８０およ び１ＭＲ３２１，１６３（実施例２．　Ａ、２．　）は重復し、全Ｃ１１１コ一 ト配列であるｎｔ５１１から６９９３　（配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌ）を含むか、１４ ８ｂｐの欠失（ｎｔ２９８４から３１３１）がある（配列ＩＤＮｏ、］）。真核 細胞ヘクター中に全長α、、、ｃＤＮＡを作成するために、これらの部分的ｃＤ ＮＡクローンの一部を結合させた。得られたベクターをｐＶＤＣＣｍ　（Ａ）と 呼ぶ。ｐＶＤＣＣＩ　（Ａ）の作成は以下に詳述するように４つの工程で行った 　（１）１ＭＲ３２１，１４４，１ＭＲ３２１，＋３６、そして１ＭＲ３２１， ８０の部分を用いるｐＶＤｃｃＩ１５’の作成、（２）ｐＶＤＣＣ■１５’　の １ＭＲ３２１，８０部分の１４８ｎｔ欠失を修正するｐＶＤＣＣＩ１５’　、３ の作成、（３）１ＭＲ３２１，８０と１ＭＲ３２１，＋６３の部分を用いるｐＶ ＤｃｃＩＩＩ／３’　、ｌの作成、そして（４）ｐＶＤＣＣＩＩ［１５“３の一 部、ｐＶＤＣＣＩ／３’　、１の挿入体およびｐｃＤＮＡｌ　（インビトロゲン （Ｉｎｖ　ｉ　ｔ　ｒｏｇｅｎ）　、カリホルニア州、サンジエゴ）の結合によ るｐＶＤＣＣＩＩＩ　（Ａ）の作成。ｐｃＤＮＡＩは、哺乳動物宿主細胞のＲＮ Ａポリメラーゼ■により認識される構成性プロモーターであるサイトメガロウィ ルス（ＣＭＶ）プロモーターを含有する真核細胞発現ベクターである。

全長作成体の調製に使用される各ＤＮＡ断片は、アガロースゲルを介するＤＥ８ １濾紙（ワットマン（Ｗｈａ　ｔｍａｎ）　、ニューンヤージー州、クリフトン （Ｃ１ｉ　ｆ　ｔｏｎ））への電気亦動、モして１．ＯＭの塩化ナトリウム、１ ０ｍＭの１・り人ｐＨ８，０，１蘭のＥＤＴＡを用いる、濾紙からの溶出により 調製される。結合は典ν的には、ベクターに対して挿入体断片と２倍モル過剰の 全挿入体は同しモＴＬ比て１０７１１の反応容量で行われる。使用されるＤＮＡ の量は通常約５０ｎｇか＋？＋１１００ｎである。

ａ、ｐＶＤｃｃＴＩＴ１５’ ｐ〜’ＤＣＣＩＩＩ／　５゛ヲｆＴＪｌｌｔルｆ、：メＬ：、ＩＮ、１Ｒ３２１ ，１４４（実施例２Ａ、２．　Ｃ，＞をＸｈｏｌとＥｃｏＲｌて消化し、ベクタ ー（ｐＧＥＭ７Ｚ）、Ｃｌ１ｌｌｎｔＩから５ＩＯ（配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌ）そし てα＋ｎｎ　ｔ　５１１から１７３２を含む断片をゲル電気泳動て単離した。１ ＭＲ３２１，１３６（実施例２゜７＼　２ｄ、）のＥｃｏＲＩ−Ａｐａ　Ｉ断片 ヌクレオチド１７３２から２６６７（配ＶＩＩＩＤ　Ｎｏ、ｌ）を川離し、＋Ｍ Ｒ３２１，８０（実施例２．Ａ２ｂ、　）のＡｐａ　ｌ−ＨｌｎｄＩ［断片、ヌ クレオチド２６６７から４４９２　（配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌ）を単離した。この３ つのクローンを結合させて、ｎｔｌから５１０（５’非翻訳配列：配列ＩＤ　Ｎ ｏ、１）とｎｔ５１］から４４９２　（配列ＩＤ　Ｎｏ、Ｉ）を含有するｐＶＤ ｃｃＩＩ［１５°を作成した。

ｂ、ｐＶＤＣＣＩ［Ｉ１５′、３ １ＭＲ３２１，３６と１ＭＲ３２１，８０ＤＮＡ配列の比較により、これらの２ つのｃＤＮＡクローンは、Ｃ５，コード配列、ヌクレオチド２９８４から３２１ ２て異なることか明らかになった。１ＭＲ３２１，８０とｄ　ｂ　ｃ　ＡＭＰて 誘導される（Ｌ　０ｍ１ｌｌ、１０日間）１ＭＲ３２細胞性ＲＮＡ　（アウスベ ル（Ａｕｓｕｂｅ　ｌ　Ｆ、Ｍ、）ら（編）、１９８８、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏ ｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョンウイリーア ントサンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ）、＝ニーヨークの方法 に従い単離した）のＰＣＲ解析により、１ＭＲ３２１，８０は１４８ｎｔの欠失 、ｎｔ１９８４から３１３１　（配列ＩＤ　Ｎｏ、Ｉ）、そして１ＭＲ３２１， ３６は１３２ｎｔの欠失、ｎｔ３０８１から３２１２を有することか明らかにな った。ＰＣＲ解析を行うために、α１Ｄ特異的オリゴヌクレオチド＋１２（ｎｔ ２５４８から２５７２、配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌ）と３１１（ｎｔ３９２８から・３ ９５７の相補的配列、配列ＴＤ　Ｎｏ、１）で増幅反応を開始させた。次にこれ らの生成物をαＩＤ特異的オリゴヌクレオチド３１０（ｎｔ２５８３から２６０ ８、配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌ）と３１２（ｎｔ３８８３から３９０９の相補的配列） を用いて再び増幅させた。ＡｃｃＩとＢｇｌＩＩ制限部位を含むこの再増幅させ た生成物を、ＡｃｃＩとＢｇｌｎで消化し、ＡｃｃＩ−ＢｇｌｌＩ断片、ｎｔ２ ７６４から３８９０　（配列ＩＤ　Ｎｏ、Ｉ）を、Ａｃ　ｃ　Ｉ　−Ｂｇ　ｌ　 Ｉ［て消化した！ＤＶＤＣＣＩ［１５’　中にクローン化して、欠失のあったＡ ｃ　ｃ　Ｉ　−Ｂｇ　］　ＩＩｐＶＤＣＣ１１１１５°断片を置換した。この新 しい作成体をｐＶＤｃｃＩ［［１５°　３と命名した。増幅された領域を介する ｐＶＤＣＣＩ［Ｉ１５°　３の測定により、１ＭＲ３２１，８０において４８ｎ ｔ欠失か確認された。

ｃ、ｐＶＤＣＣＩＩ［／３’　、１ ｐＶＤｃｃＩ［［／３°、１を作成するために、１ＭＲ３２１，１６３（実施例 ２、　Ａ、２．　ｅ）のｃＤＮＡ挿入体を、ＸｈｏＩ断片としてｐＢｌｕｅｓｃ ｒ　１ｐｔＩＩ　（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリホルニア州 、ラボイヤ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ））中にサブクローニングした。ｃＤＮＡ断片１ ｃ７）Ｘｈｏ１部位に、ｃＤＮＡライブラリー（ｌ　Ｂ、３．　’）を作成する のに使用されるアダプターを結合させた。１ＭＲ３２１，１６３の挿入体の翻訳 配向はプラスミツト中のＩ　ａ　ｃ　Ｚｌｋ１ｍ子の配向と反対になるようにし た。これは、このプラスミツトで形質転換したＤＨ５α細胞中で、ＩａｃＺ遺伝 子との融合によりαＩＤ配列の発現の可能性を排除するために行った。次にこの プラスミツトをＨｉｎｄＩ［とＢｇｌＩＩて消化し、Ｈ４ｎｄｌＩ［−ＢｇｌＩ Ｉ断片（Ｈ４ｎｄｌｌＩ部位はヘクターに由来し、ＢｇｌＩＩ部位はｎｔ６２２ ０にある、配列ＩＤ　Ｎｏ。

りを除去し、１ＭＲ３２１，＋６３りａ−ン（Ｄｎ　ｔ　５２００から６２２０ （配列ＴＤ　Ｎｏ、Ｉ）を欠失させ、３’　ＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片、ｎｔ６ ２２０から７６３５　（配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌ）を含有する残りのプラスミツトが ら、この配列を除去した。次＋：ＩＭＲ３２１，８０（ヌクレオチド４４９１− ５２９４、配列ＴＤ　Ｎｏ、Ｉ）からのＨｉｎｄｌｌＩ−ＰｖｕＩ［断片、１Ｍ Ｒ３２１゜■６３（ヌクレオチｌ’５２９４から６２２０、配列ＩＤ　Ｎｏ、ｌ ）からのＰｖｕｌＩ−ＢｇｌＩ［断片、そして３’　ＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩＩＭ Ｒ３２１，＋６３断片−（ｎｔ６２２０から７６３５、配列ＩＤ　Ｎｏ、Ｉ）を 含有するＨｉｎｄＩ［［−ＢｇｌＩＩて消化したｐＢｌｕｅｓｃｒ　ｉｐｔプラ スミツドを一緒にスプライシングして、ｐＶＤｃｃＩＩＩ／３°　１を作成した 。

ｄ、ｐＶＤｃｃＩＩ［（Ａ）：全長α１０作成体ｐＶＤＣＣＩ［（Ａ）を作成す るために、ｐＶＤｃｃＩＩ［１５’　、３　（実施例２゜Ａ、３．　ｂ、　）の ＤｒａＩ−Ｈｉｎｄ１１１断片（５°非翻訳配列ｎｔ３２７から５１０、配列Ｉ Ｄ　Ｎｏ、！およびコード配列ｎｔ５１１から４４９２、配列ＩＤＮｏ、Ｉ）を 単離し；　ｐＶＤｃｃＩ［Ｉ／３’　、１　（４４９２から７６３５、配列ＩＤ 　Ｎｏ、Ｉ、およびアダプターのＸｈｏＩ部位を含む）のＨｉｎｄＩ［−Ｘｈｏ Ｉを単離し、プラスミツトヘクターのｐｃＤＮＡｌをＥｃｏＲＶとＸｈｏｌて消 化しアガロースゲル上で単離した。この３つのＤＮＡ断片を結合させ、ＭＣｌ０ ６１−Ｐ３（イントロン配 ンジすゴ）を形質転換した。単離したクローンを制限マツピングとＤＮＡ配列決 定て解析し、以下の断片か正しく結合したｐＶＤＣＣＩ　（Ａ）を同定した：Ｄ ｒａＩ−ＨｉｎｄＩＩ［、ＨｉｎｄＩ［Ｉ−Ｘｈｏｌ、ＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＶで 平滑末端ＤｒａＩとＥｃｏＲＶ部位が一緒に結合して環状プラスミツトを形成し ている。

Ｃ３，サブユニットのアミノ末端は７つの連続の５′　メチオニンコドン（ｎ　 ｔ　５１１から５３１、配列ＩＤ　Ｎｏ、Ｉ）によりコートされる。この５゛部 分と２つのりジン残基を含むｎｔ５３２から５３７はｐＶＤＣＣＩ　（Ａ）から 欠失され、効率的リボゾーム結合部位（５゛　−ΔＣＣＡＣＣ−３°）で置換さ れ、ｐＶＤＣＣＩＩ［、ＲＢＳ　（Ａ）か作成された。この作成体の転写体かゼ ノプスラエビス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）の卵母細胞に注入される発現 実験ては、ｐＶＤＣＣｎ［（Ａ）の転写体を注入した卵母細胞での発現レベルに 比較して、組換え電位依存性カルシウムチャンネル発現レベルは上昇しなかった 。

Ｂ、α１ｏサブユニツトをコードするＤＮＡの単離■８部分的α、ｃｃＤＮＡク ローンの参考リストα、Ｃコート配列、翻訳開始のα、。、および別にスプライ シングされたα１ｏの領域を性状解析するために、無数のαＩＣ特異的ｃＤＮＡ クローンを単離した。配列ＩＤ　Ｎｏ、３は、性状解析されたα１Ｃコ一ド配列 （ｎｔｌから５９０４）と推定されるアミノ酸配列を示す。配列ＴＤ　Ｎｏ、４ と５は、α１ｃ蛋白の２つの可能性のあるアミノ末端をコードする。配列ＩＤ　 Ｎｏ、６はＩＶ　Ｓ３膜通過ドメインの別のエクソンをコードする。α１ｃ配列 の性状解析および性状解析されたα、Ｃ配列（配列ＩＤ　Ｎｏ、３）に対する各 クローンのヌクレオチドの位置を性状解析するのに使用される部分的クローンの リストを以下に示す。これらのｃＤＮＡクローンの単離と性状解析は後衛する（ 実施例２．　Ｂ、２．　）。

１ＭＲ３２１，６６ｎｔｌから９１６、配列ＩＤ　Ｎｏ、３ｎｔｌから１３２、 配列ＩＤ　Ｎｏ、４＠ＭＲ３２］、１５７　ｎｔｌから８７３、配列ＩＤ　Ｎｏ 、３ｎｔｌから８９、　配列ＩＤ　Ｎｏ、５ｒＭＲ３２１，６７ｎｔ５０から１ ７１７、配列ＩＤ　Ｎｏ、３ネ　１ＭＲ３２１，８６ｎｔ１３６６から２５８３ 、配列ＩＤ　Ｎｏ、３＠　１．＋６Ｇ　ｎｔ７５８から８６７、配列ＩＤ　Ｎｏ 、３＠ＭＲ３２１，３７ｎｔ２８０４から５９０４、配列ＩＤ　Ｎｏ、３ＣＮＳ 　１．３０　ｎｔ２＋９９から３９０３、配列ＩＤ　Ｎｏ、３別のエクソンのｎ ｔｌから８４、配列ＩＤ　Ｎｏ、６＠ＭＲ３２１，３８ｎｔ２４４８から４７０ ２、配列１［Ｎｏ、３別のエクソンのｎｔｌから８４、配列ＩＤ　Ｎｏ、６本　 ＴＭＲ３２１，８６はウサギの骨格筋カルシウムチャンネルα１サブユニ、１− ｃＤＮＡ配列に比較して７３ｎの欠失を有する。

＠１．１６Ｇはα１ｅゲノムクローンである。

２　実施例２．　Ｂ、１．に記載のクローンの単離と性状解析ａ、ＣＮ５１．３ ０ 実施例２．　Ａ、２．　ａ、に記載のウサギの骨格筋カルシウムチャンネルα、 ＣＤＮＡの断片を用いて、ヒｉ・の視床ｃＤＮＡライブラリーＮｏ、６（実施例 １゜Ｂ６．）の約１，０００，０００個の組換え体をスクリーニングした。ハイ ブリダイゼーションは標準的ハイブリダイゼーション条件下で行い（実施例１゜ Ｃ）、フィルターを低緊縮条件下（実施例１．　Ｃ，）で洗浄した。６つの陽性 プラークか精製され、その１つはＣＮ５１．３０てあった。ＣＮ５１．３０をプ ラーク精製し、制限マツピングし、サブクローニングし、ＤＮＡ配列決定により 性状解析した。ＣＮ５１．３０は、２つの同定されたα１ｏエクソン（配列ＩＤ Ｎｏ、６）の１つのｎｔｌから８４か後に続＜　ａｒｃ特異的配列ｎｔ２１９９ から３９０３をコードする。配列ＩＤ　Ｎｏ、６の３’　、ＣＮ５１．３０はイ ントロンを含み、従いＣＮ５１．３０は部分的にスプライシングされたα１ｃ転 写体をコウサギの骨格筋カルシウムチャンネルｃＤＮＡ断片（ｎｔ−７８から１ ００６、実施例２．　Ａ、２．　ａ、　）を用いて、λＥＭＢ３に基づくヒトゲ ノムＤＮＡライブラリー（カタログ番号ＨＬ１００６ｄ、クロンチックコープ（ Ｃ１ｏｎｔｅｃｈ　Ｃｏｒｐ、）、カリホルニア州、バロアルト）の約１．Ｏｏ ｏ、Ｏｏｏ個の形質転換体をスクリーニングした。標準的ハイブリダイゼーショ ン条件（実施例１．　Ｃ，）を使用してハイブリダイゼーションを行い、低緊縮 条件下（実施例１．　Ｃ，）でフィルターを洗浄した。１４個の陽性プラークが 同定され、そのうちの１つは１．１６Ｇであった。クローン１．１６Ｇをプラー ク精製し、制限マツピングを行い、サブクローニングし、ＤＮＡ配列決定により 性状解析した。ＤＮＡ配列決定により、１．１６Ｇは実施例２．　Ｂ、２．に記 載のα１ｃ特異的配列をコートすることか明らかになった。

ｃ、１ＭＲ３２１，１６Ｇおよび１ＭＲ３２１，６７α１ｃ配列（ｎｔ７５８か ら８６７、配列ＩＤ　Ｎｏ、３）をコートする１、１６Ｇ（実施例２．　Ｂ、２ ．　ｂ、　）の＋５１ｂｐのＫｐｎＩ−３ａｃｌ断片を用いて、１ＭＲ３２ｃＤ ＮＡライブラリー＃５（実施例１．　Ｂ、５．　）＋７１約１，００ｏ、ｏｏｏ 個組換え体をスクリーニングした。標準的ハイブリダイゼーション条件（実施例 １．　Ｃ，）を使用してハイブリダイゼーションを行った。０．　５ＸＳＳＰＥ 中で６５°Ｃてフィルターを洗浄した。陽性プラークのうちの１ＭＲ３２１，６ ６と１ＭＲ３２１，６７か同定された。ハイブリダイズするプラークを精製し、 制限マツピングを行い、サブクローニングし、ＤＮＡ配列決定により性状解析し た。これらのｃＤＮＡクローンのうちの２つ（１ＭＲ３２１，６６と１ＭＲ３２ １，６７）は、記載される（実施例２．　Ｂ、１．　’）ようにαｌｃサブユ＝ ッｌ−をター１−する。さらに１ＭＲ３２１，６６は、ｎｔ９１６　（配列ＩＤ Ｎｏ、３）のヌクレオチド３゛で始まるＧＴスプライスドナージヌクレオチドを 特徴とする、部分的にスプライシングされたα１ｃ転写体をコードする。１．６ ６内のこのイントロン配列はｌ０１ｎｔの長さである。１ＭＲ３２１，６６はα １ｏ翻訳開始をコードし、ｎｔｌから３（配列１［Ｎｏ、３）と５゛非翻訳配列 （配列ＩＤ　Ｎｏ、３）の１３２ｎｔは１ＭＲ３２１，６６中て開始コドンの前 にある。

ｄ、ＴＭＲ３２１，３７と１ＭＲ３２１，３８ＣＮＳ１．３０ｃＤＮＡ断片（実 施例２．　Ｂ、２．　ａ、　）を用いて、ＩＭＲ３２ｃＤＮＡライブラリー＃Ｉ 　（実施例１．　Ｂ、１．　’）（Ｄ約２，０００，０００個組換え体をスクリ ーニングした。低緊縮ハイブリダイゼーソヨン条件（実施例ＩＣ）を使用してハ イブリダイゼーションを行い、低緊縮条件（実施例１．　Ｃ，）■・−てフィル ターを洗浄した。４個の陽性プラークか同定され、プラーク精製し、制限マツピ ングを行い、サブクローニングし、ＤＮＡ配列決定により性状解析した。これら のクローンのうちの２つ（１ＭＲ３２１，３７と１ＭＲ３２１゜３８）は、実施 例２．　Ｂ、！、に記載されるようにα＋ｃ特異的配列をコートする。

１ＭＲ３２１，３７と１ＭＲ３２１，３８のＤＮＡ配列の比較により、α、Ｃ転 写体はＩＶＳ３膜通過ドメインをコートする２つのエクソンを含有することか明 らかになった。１ＭＲ３２１，３７は単一のエクソン、ｎｔ３９０４から３９８ ７　（配列ＩＤ　Ｎｏ、３）を有し、１ＭＲ３２１，３８は両方のエクソン（ｎ ｔ３９０４から３９８７　（配列ＩＤ　Ｎｏ、３）とこれに続＜ｎｔｌから８４ （配列ＩＤ　Ｎｏ、６））か並列するように変則的にスプライシングされるよう °Ｃあることか明らかになった。ＩＶＳ３領域をコートする２つのエクソンのい ずれかを含有するα１Ｃ転写体の別のにスプライシングは、ＣＮ５１．３０配列 を１ＭＲ３２１，３７配列に比較して確認された。ＣＮ５１．３０は、１ＭＲ３ ２１，３７に同一の配列かｎｔ２１９９から３９０３　＜配列ＩＤ　Ｎｏ。

３）に含まれて先行されるｎｔｌから８４（配列ＩＤ　Ｎｏ、６）を含有する。

実施例２．　Ｂ、２．　ａ　に記載されるように、ｎｔｌから８４（配列ＩＤ　 Ｎ。

６）の後にイントロンか続く。２つの別のエクソンか、ＣＮ５１．３０に示され るｎｔ３９０３　（配列ＩＤ　Ｎｏ、３）と１ＭＲ３２１，３７か隣接してスプ ライソングされている。

ｅ、１ＭＲ３２１，８６ すりゴヌクレオチドブローブ９０−９　（ｎｔ　＋４６２から１４９１、配列Ｉ ＤＮ０３）と９０−１２　（ｎｔ２４９６から２５２０、配列ＩＤ　Ｎｏ、３） を用いて、１ＭＲ３２ｃＤＮＡライブラリー＃】（実施例１．　Ｂ、１．　）を スクリーニングした。これらのオリゴヌクレオチドプローブは、１ＭＲ３２１， ６７の３′末端（ｎｔ＋７１７、配列ＩＤ　Ｎｏ、３）とＣＮ５１．３０の５′ 末端（ｎｔ２＋９９、配列ＩＤ　Ｎｏ、３）の間のα１ｃサブユニツトをコード するクローンを単離するために、選択された。ハイブリダイゼーション条件は標 準的ハイブリダイゼーション条件（実施例１．ｃ、）であるか、５０％脱イオン 化ホルムアミドを２０％に低トさせた。低緊縮条件下（実施例１．ｃ、）でフィ ルターを洗浄した。３つの陽性プラークか同定され、そのうちの１つは１ＭＲ３ ２１，８６てあった。１ＭＲ３２１，８６をプラーク精製し、サブクローニング し、制限マツピングとＤＮＡ配列決定により性状解析した。１ＭＲ３２１，ＤＮ Ａ配列決定による性状解析により、１ＭＲ３２１，８６はウサギの心筋カルシウ ムチヤンネルα１サフ゛ユニツト（ミカミ（Ｍｉｋａｍｉ）ら、Ｎａ　ｔ　ｕ　 ｒ　ｅ。

３４０：２３０）、ｎｔ２１９１から２２６３をコートするＤＮＡに比較して、 ７３ｎｔの欠失を有することか明らかになった。これらの欠失ヌクレオチド配列 配列ＩＤ　Ｎｏ、３（＋）ｎ、ｔ２１７６−２２４８に対応する。ＣＮ８１．３ ０の５゛木端は１ＭＲ３２１，８６の３′末端と重複するため、これらの欠失し ているヌクレオチドの一部（すなわち配列ＩＤ　Ｎｏ、３のｎｔ２２０５−２２ ４８）は、ＣＮ５１．３０により説明される。］ＭＲ３２１，８６中の７３個の ヌクレオチドの欠失のうち残りの欠失ヌクレオチド（すなわちｎｔ２１７６−２ ２０４、配列ＩＤ　Ｎｏ、３）は、ｄ　ｂ　ｃ　ＡＭＰて誘導される１ＭＲ３２ 細胞ＲＮＡのＰＣＲ解析により決められた。この７３ｎｔの欠失はフレームシフ ト突然変異であり、従って修復する必要がある。この領域の正確なヒトの配列（ これはＣＮ５１．３０のＤＮＡ配列と１ＭＲ３２細胞ＲＮＡのＰＣＲ解析により められた）は、標準的方法（例えは制限断片の置換または部位特異的突然変異） によ１）＜　１ＭＲ３２１，８６中に挿入することかできる。

ｆ、１ＭＲ３２１，１５７ ａ＋ｃｎ　ｔ　５０から７７４（配列ＩＤ　Ｎｏ、３）をコートする１ＭＲ３２ １゜６７のＸｈｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片を用いて、１ＭＲ３２ｃＤＮＡライブラリ ー＃４（実施例１．　Ｂ、４．　）の約１，０００，０００個の組換え体をスク リーニングした。ハイブリダイゼーションは標準的ハイブリダイゼーション条件 （実施例１、Ｃ，）で行った。フィルターを低緊縮条件下（実施例１．　Ｃ，） で洗浄した。

同定された１つの陽性プラークは１ＭＲ３２１，１５７であった。このプラーク を精製し、挿入体を制限マツピングし、標準的プラスミッドヘクターであるｐＧ ＥＭ７Ｚ　（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）　、ウィスコンソン州、マジソン（Ｍ ａｄｉｓｏｎ））にサブクローニングした。ＤＮＡは配列決定により性状解析し た。１ＭＲ３２１，１５７は、ｎｔｌから８９（配列ＩＤ　Ｎｏ、５）て始まり ｎｔｌから８７３（配列ＩＤ　Ｎｏ　３）か続くα、Ｃ配列の別の５′部分をタ ー１−するよってある。１．６６と１．１５７の５′配列の解析は後述する（実 施例２．　８．　３）。

３、α、Ｃ翻訳開始部位の性状解析 ＩＭＲ３２１，１５７（ｎｔ５７から８９、配列ＩＤ　Ｎｏ、５；ｎｔｌから６ ７、配列ＴＤ　Ｎｏ、３）、１ＭＲ３２１，６６（ｎｔｌｏｏから１３２、配列 ＩＤ　Ｎｏ、４＋ｎｔｌから６７、配列ＩＤ　Ｎｏ、３）の配列の一部を、ウサ ギの肺ＣａＣＢ−リセブターｃＤＮＡ配列であるｎｔ−３３から６７（ビニル（ Ｂｉｅｌ）ら、１９９０、ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、　、２６９：４０９）と比較し た。ヒトの配列は、翻訳開始の領域をコードするα、Ｃ転写体の可能性のある別 の５′木端である。１ＭＲ３２１，６６はＣａＣＢリセブターｃＤＮＡ配列に非 常によく似ており、ｎｔ１２２（配列ＩＤ　Ｎｏ、４）で始まって５′方向にＣ ａＣＢリセブターｃＤＮＡ配列から分岐する。ＣａＣＢリセブターｃＤＮＡ配列 中に同定された開始コドンは、α１ｃコ一ト配列を説明するのに使用される開始 コドン、ｎｔｌから３（配列ＩＤ　Ｎｏ、３）と同しである。１ＭＲ３２１゜１ ５７配列、ｎｔｌから８９（配列ＴＤ　Ｎｏ、５）の機能的意義は不明である。

Ｉ　Ｉ５７とα１ｃコ一ト配列を含有するキメラを作成することかでき、機能的 差異を試験することかできる。

Ｃ１α１８サブユニツトをコートする部分的ｃＤＮＡクローンの単離と全長クロ ーンの作成 一７サギの骨格筋α１サブユニ７ｌ−ＣＤＮＡ断片（断片の説明については実施 例２　Ａ、２　ａを参照）を用いて、低緊縮条件下てヒトの脳底神経節ｃＤＮＡ ライブー１リーをスクリーニングした。ハイブリダイズするクローンの１つを用 いてＩｈ１Ｒ３２細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングして、追加の部分 的α１ＢｅＤＮＡクローンを得て、次にこれを用いて追加の部分的ｃＤＮＡクロ ーンについて１ＭＲ３２細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。部分 的１ＭＲ３２αＩ１１クローンの１一つを用いて、ヒトの海馬ライブラリーをス クリーニングしてα１８コ一１〜配列の３′木端をコートする部分的αＩＢクロ ーンを得た。ｃＤＮΔ配列のＩＬ確性を調へるために、部分的ｃＤＮＡクローシ の領域のいくつかの配列を、１ＭＲ３２細胞ＲＮＡのＰＣＲ解析の生成物の配列 と比較した。

α１１１サブユニツトをコードするＤＮＡの停止コドンの５゛　と３′に位置す る配列に対応するオリゴヌクレオチドブライマーを用いて、１ＭＲ３２細胞ＲＮ ＡとゲノムＤＮＡのＰＣＲ解析により、１ＭＲ３２細胞中に別にスプライソング されたα１ＢをコードするｍＲＮＡか明らかになった。この２つめのｍＲＮＡ生 成物は、最初に単離された他の３′　α、、ｃＤＮΔ配列に対応するｍＲＮＡ中 に存在しない別のエクソンを含むような、αＩ１１サブユニット転写体の差動ス プライシング（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　ｓｐｌｉｃｉｎｇ）の結果である。

α、サブユニットのこれらのスプライス変種を区別するために、追加のエクソン を含有する型に対応するＤＮＡ配列にコードされるサブユニットをα１８−１　 （配列ＩＤ　Ｎｏ。

７）と呼び、追加のエクソンを欠如している型に対応するＤＮＡ配列にコートさ れるサブユニットをαｌｌ−２（配列ＴＤ　Ｎｏ、８）と呼ぶ。αｌ８−１の配 列はｎｔ−６６３３（配列ＩＤ　Ｎｏ、７）で始まって、αｌ　Ｂ−２の配列か ら分岐する。

（Ｚ＋ｅ−、中の追加のエクソン（ｎｔ６６３３−６８＋９；配列ＩＤ　Ｎｏ、 ７）の配列の後は、α１８−１とα１！ｌ−２の配列は同しである（すなわち配 列ＩＤ　Ｎｏ、７中のｎｔ６８２０−７３６２と、配列ＩＤ　Ｎｏ、８中の６６ ３３−７１７５）。

配列ＩＤ　Ｎｏ、７と８は、ｃｒ、、をコードするＤＮＡの５゛非非翻訳列１４ ３個のｎｔ　（ｎｔｌ−１４３）と３゛非非翻訳列の２０２個のｎｔ（ｎｔ７１ ６１−７３６２、配列ＩＤ　Ｎｏ、７）、および１２１Ｂ−２をコードするＤＮ Ａの３′非非翻訳列の３２１個のｎｔ　（ｎｔ６８５５−７１７５、配列ＩＤ　 Ｎｏ、８）を示す。

α１１１転写体のＩＳ６領域のＰＣＲ解析により、ＰＣＲ反応の生成物を含有す るエチンウムブロマイトで染色したアガロースゲル上で観察される複数の断片サ イズに基つく追加のスプライス変種と思われるものか明らかになった。

ｐ　ｃ　ＤＮＡ　Ｌ２１１１−１と呼はれる全長αＩＢ−１０ＤＮＡクローンを 、以下のように８つの工程で調製した。

工程１　：　ｐＧＥＭ３　（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンノン州、 マノソン（Ｍａｄｉｓｏｎ））の５ａｃｌ制限部位を５ａｃ１部位で消化し、Ｔ ４ＤＮＡポリメラーゼの処理により平滑木端を作成し、再結合した。新しいヘク ターはｐＧＥＭ△Ｓａｃと呼んた。

工程２．断片１　（Ｈｉ　ｎｄＩＩ［／Ｋｐｎ　Ｉ　；配列ＩＤ　Ｎｏ、７のｎ ｔ２３３７から４３０３）を、ＨｉｎｄＩＩ［／ＫｐｎＩて消化したＩ）ＧＥＭ ３ΔＳａｃに結合してｐα１．１７７８Ｋを作成した。

１程３．断片１は２つのヌクレオチド欠失を存する（配列ＩＤ　Ｎｏ、７のｎｔ ３８５２と３８５３）、ｐｃｒｌ、１７７ＨＫ中に１ＭＲ３２ＲＮＡのＰＣＲ断 片（断片２）を挿入して、この欠失を修復する。すなわち断片２　（Ｎａ　ｒ　 Ｉ／ＫｐｎＩ、配列ＩＤ　Ｎｏ、７のｎｔ３８２８から４３０３）を、ＮａｒＩ ／ＫｐｎＩて消化したｐα１．１７７８Ｋに挿入して、断片１のＮａｒＩ／Ｋｐ ｎＩ部分を置換してｐα１．１７７ＨＫ／ＰＣＲを作成した。

−Ｌ程４　断片３　（Ｋｐｎ　Ｉ／Ｋｐｎ　Ｉ　；配列ＩＤ　Ｎｏ、７のｎｔ４ ３０３から５６６３）を、Ｋｐｎ　Ｉて消化したｐα１．１７７ＨＫ／ＰＣＲに 結合させてｐαＩ８５’　Ｋを作成した。

工程５　断片４　（ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄｌＩ；ＥｃｏＲＩアダプター十配列Ｉ ＤＮｏ、７のｎｔｌから２３３７）と断片５（ｐαｌＢ５°Ｉ（のＨｉｎｄｌｎ ／Ｘｈｏｒ断片、配列ＩＤ　Ｎｏ、７のｎｔ２３３７から５４４６）を、Ｅｃｏ ＲＩ／Ｘｈｏｌて消化したｐｃＤＮＡ（イントロン配リホルニア州、サンジエゴ ）中に一緒に結合させてｐαＩＢ５°を作成した。

工程６．断片６　（ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＩ　；両端のＥｃｏＲＩアダプター十 配列ＩＤ　Ｎｏ、７のｎｔ５７４９から７３６２）を、ポリリンカー中のＫｐｎ Ｉ部位の近傍に断片の５′末端を有する、ＥｃｏＲＩて消化したｐＢ］ｕｅｓｃ ｒｉｐｔｌＩＫｓ（ストラタシーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリホルニア州 、ラホイヤ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ））中に結合させてｐαｌ　２３０を作成した。

工程７　断片７　（Ｋｐｎ　Ｉ／ＸｈｏＩ　：配列ＩＤ　Ｎｏ、７のｎｔ４３０ ３から５４４６）と断片８　（ＸｈｏＩ／Ｃ５ｐＩ　；配列ＩＤ　Ｎｏ、７のｎ ｔ５４４６から６２５９）を、ＫｐｎＩ／Ｃ５ｐｌて消化したｐα１．　２３０ 　（ｐα１．　２３０にコートされていた配列ＩＤ　Ｎｏ、７のｎｔ５７４９か ら６２５９を除去し、配列ＩＤ　Ｎｏ、７のｎｔ６２５９から７３６２を維持す る）に結合させてｐα１８３’　を作成した。

工程８．断片９　（ＳｐｈＩ／ＸｈｏＩ　；配列ＩＤ　Ｎｏ、７のｎｔ４９９３ から５４４６）および断片１０（ｐαｌＢ３’　のＸｈ　ｏ　Ｉ／Ｘｂ　ａ　Ｉ 　：配列ＩＤＮｏ、７のｎｔ５４４６から７３１９）を、５ｐｈＩ／Ｘｂａｌて 消化したｐａｌＢ５’　（ｐαｌＢ５’　にコートされていた配列ＩＤ　Ｎｏ、 ７のｎｔ４９９３から５４４６を除去し、配列ＩＤ　Ｎｏ、７のｎｔｌから４８ ５０を維持する）に結合させてｐｃＤＮＡα１８−１を作成した。

得られる作成体（ｐｃＤＮＡα＋＋＋−＋）は、ｐｃＤＮＡＩ中にＣＭＶプロモ ーターの転写制御下でαＩＩ＋−１をコードする全長コード領域（ｎｔ　＋４４ −７３６２）、５″非翻訳配列（ｎｔｌ−１４３、配列ｒＤ　Ｎｏ、７）および ３゛非翻訳配列（ｎｔ７１６１−７３１９、配列ＩＤ　Ｎｏ、７）を含有する。

実施例３・ヒトの神経カルシウムチャンネルβ１サブユニットをコードするｃＤ ＮＡの単離 Ａ　βサブユニットをコードする部分的ｃＤＮＡクローンの単離とβ１サブユニ ットをコードする全長クローンの作成 標準的ハイブリダイゼーション条件（実施例１．　Ｃ，）を用いてヒトの海馬Ｃ ＤＮＡライブラリーを、ウサギの骨格筋カルシウムチャンネルβ１サブユニツト ｃＤＮＡ断片（ｎｔ４４１から１３７９）（ウサギの骨格筋カルシウムチャンネ ルβ１サブユニットｃＤＮＡの単離と配列については、米国特許出願第４８２゜ ３８４号またはルース（Ｒｕｔ１］）ら、１９８９．５ｃｉｅｎｃｅ、２４５＋ １１１５を参照）てスクリーニングした。ハイブリダイズするクローンの１つの 一部を用いて、海馬ライブラリーを再スクリーニングして追加のｃＤＮＡクロー ンを得た。このハイブリダイズするクローンのｃＤＮＡＤＮＡ断片２限マツピン グとＤＮＡ配列決定で性状解析し、ウサギの骨格筋カルシウムチャンネルβ１サ ブユニツトｃＤＮＡ配列と比較した。

部分的β１サブユニｙ　ｔ・ｃ　ＤＮＡクローンの一部を結合させて、全β１サ ブユニットをコートする全長クローンを作成した。配列ＩＤ　Ｎｏ、９は、β、 サブユニットをコードする配列（ｎｔｌ−１４３４）と３′非翻訳配列（ｎｔ１ ４３５−１５４６）の一部を示す。推定されるアミノ酸配列も配列ＩＣＮｏ、９ に示しである。発現実験を行うために、全長β１サブユニツトｃＤＮＡクローン を以下のようにして作成した。

工ＨＩ：ＤＮＡ断片１　（配列ＩＤ　Ｎｏ、９の一８００ｂｐの５′非翻訳配列 ＋ｎｔｌ−２７７）をＤＮＡ断片２（配列ＩＤ　Ｎｏ、９のｎｔ２７７−１５４ ６＋４４８ｂｐのイントロン配列）に結合させて、ｐＧＥＭ７Ｚにクローン化し た。得られるプラスミツト（ｐβｌ−１，１８）は４４８−ｂｐのイントロンを 含む、全長β、サブユニットクローンを含有していた。

工程２−ｐβ１１．１８の５′非翻訳配列をリボゾーム結合部位で置換するため に、ＥｃｏＲＩ、リボゾーム結合部位（５’　−ＡＣＣＡＣＣ−３°）をコート する配列そして配列ＩＤ　Ｎｏ、９のｎｔｌ−２５を含有する２本鎖アダプター を合成した。このアダプターを３ｍａＩで消化したｐβＩ−１，１８に結合させ 、結合反応の生成物をＥｃｏＲＩて消化した。

工程３：ＥｃｏＲＩアダプターを含有する工程２のＥｃｏＲＩ断片、効率的なり ホゾ−１、結合部位そして配列ＴＤ　Ｎｏ、９の１−１５４６＋イントロン配列 をプラスミツトベクターにクローン化し、ｐβｌ−１，１８ＲＢＳと命名した。

ｐβＩ−１，＋８ＲＢＳのＥｃｏＲＩ断片を、ＣＭＶプロモーターの近傍に開始 コドンを有するＥｃｏＲｌて消化したｐｃＤＮＡＩにサブクローニングして、ｐ ＨＧＢＣａＣＨβ、、ＲＢＳ　（Ａ）を作成した。

工程４．イントロン配列を欠ｂｏするβ１サブユニットをコートする全長クロー ンを作成するために、ＤＮＡ断片３（配列ＩＤ　Ｎｏ、９のｎｔ６９−１１４６ ＋配列ＩＤ　Ｎｏ、９のｎｔ１１４７−１５４６か？絽こ続くイントロン配列の ４４８ｂｐ）を部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅ ｎｅｓｉｓ）を行い、イントロン配列を除去して、ｐβｌ　（−）を作成した。

ｐβｌ−１，＋８ＲＢＳのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片（リボゾーム結合部位と配 列ＩＤ　Ｎｏ、９のｎｔｌ−２７７を含有する）をｐβ１　（＝）のＸｈｏＩ− ＥｃｏＲＩ断片（配列ＩＤ　Ｎｏ、９のｎｔ２７７−１５４６を含有する口こ結 合させ、ｃＮｔｖプロモーターの近傍に翻訳開始を有するｐｃＤＮＡＩ中にクロ ー〉化した。得られる発現プラスミツトはｐＨＢＣａＣＨβ１ｂＲＢｓ　（Δ） と命名した。

Ｂ　スプライス変種βｌ−３ β、サブユニットをコードするＤＮＡクローンのＤＮＡ配列解析は、ＣＮＳにお いては同しヒトβ、サブユニットー次転写体の少なくとも２つの別にスプライシ ングされた型か発現されることを示していた。１つの型は配列ＩＤ　Ｎｏ、９に 示す配列であり、β１−２と呼ぶ。β１−２と別の型（β１−３）の配列は、ｎ ｔ１３３４せ分岐する（配列ＩＤ　Ｎｏ、９）。３′非翻訳配列（ｎｔ１７９５ −１８５１）を含む完全なβ１−３配列（ｎｔｌ−１８５１）を、配列ＴＤ　Ｎ ｏ、１０に示す。

実施例４・ヒトの神経カルシウムチャンネルα２サブユニツトをコードするｃＤ ＮＡの単離 Ａ、ｃＤＮ△ＤＮＡクローン 完全なヒトの神経α、コター配列（ｎｔ３５−３３０７）＋５’非翻訳配列（ｎ ｔｌから３４）および３′非翻訳配列（ｎｔ３３０８−３６００）０’）一部を 配列ＩＤ　Ｎｏ、ＩＩに示す。

ヒトの神経α２サブコニツ１−をコートするＤＮＡを単離するために、ウサギの 告格筋カルシウムチャンネルα２サブユニッｔ−ｃＤＮＡ断片（ｎ　ｔ　４３か ら２７２、エリス（Ｅｌｌｊｓ）ら、１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ、２４０：１６ ６１）を用いてヒトのゲノムササンブロソ１〜をプローブ結合させて、まずヒＩ ・のα２ゲノムクローンを単離した。ヒトのゲノムＤＮＡをＥｃｏＲＩて消化し 、電気泳動し、ブロッティングし、標準的なハイブリダイゼーソヨン条件（実施 例１．　Ｃ，）と低緊縮洗浄条件下（実施例１．０）を用いてウサギの骨格筋プ ローブとプローブ結合させた。２つの制限断片を同定した（３．５ｋｂと３．０ ｋｂ）。２゜２ｋｂから４．３ｋｂの範囲のヒトゲノムＥｃｏＲＩ断片を含有す るλｇｉｌ＋ライブラリーを調製することにより、これらのＥｃｏＲＩ制限断片 をクローン化した。ウサギのα２プローブを用いて前述したようにライブラリー をスクリーニングし、ハイブリダイズするクローンを甲、離し、ＤＮＡ配列決定 により性状解析した。ＨＧＣａＣＨｃｒ２．２０ｉ、ｔ３．５ｋｂＣ７）断片を 含有し、ＨＧＣａＣＨα２゜９は３．Ｏｋｂの断片を含有していた。

制限マツピングとＤＮＡ配列決定は、ＨＧＣａＣＨα２．２０は６５０ｂｐ（７ ）ＰｓｔＩ−ＸｂａＩ制限断片上に８２ｂｐのエクソン（ヒトα２コー１’配列 のｎ目３０から２１１、配列ＩＤ　Ｎｏ、１１）と、７５０ｂｐのＸｂａｌ−Ｂ ｇ１■制限断片のトにｌ０５ｂｐのエクソン（コート配列のｎｔ２１２から３１ ６、配列ＩＤ　Ｎｏ、＋　１）を含有することを示していた。これらの制限断片 は脳底神経節ｃＤＮＡライブラリー（実施例２ｃ、Ｃ，２、ａ　）をスクリーニ ングするのに使用さオ］た。ＨＢ　Ｃａ　ＣＨｃｚ　２　、　１を単離しくｎ　 ｔ　２９から１１６３、配列ＴＤ　Ｎｏ、ＩＩ）、アメリカンタイプ力ルチャー コレクショノ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ）（２０８５２メリーラント州ロツクビル、パークローンドライブ１２３ ０１）から得Ｃ７れたヒトの脳幹ｃＤＮＡライブラリー（ＡＴＣＣ整理番号３７ ４３２）のスクリーニングに使用した。２つのクローン、ＨＢＣａＣＨα２．５ （ｎｔｌから１１６２、配列ＴＤ　Ｎｏ、Ｉｆ）とＨＢＣａＣＨｃｚ２．８　（ ｎ　ｔ　７１４から１５６２、配列ＩＤ　Ｎｏ、Ｉｔ）を単離した。クローント ＩＢＣａＣＨα２．５とＨｒ３ｃ　ａ　ＣＨα２．１１は重複して、全ヒト脳α ２蛋白をコードする。

Ｂ、ｐＨＢＣａＣＨｃｒ、Ａ　の作成 ヒ１への全長カルシウムチヤンネルα、サブユニットをコートするＤＮＡを含有 するｐ　ＨＢ　Ｃａ　ＣＨａ２Ａ　を作成するために、ＨＢＣａＣＨα２．５　 （ｎｔ　１から１０６１、配列ＩＤ　Ｎｏ、Ｉｔ、ＥｃｏＲＩアダプター、Ｐｖ ｕＩＩ部分的消化物）の（ＥｃｏＲＩ）−ＰｖｕｌＩ断片どＨＢＣａＣＨα２． Ｉ　ｌ　（ｎｔ　＋０６１から２４２４、配列ＩＤ　Ｎｏ、ＩＩ；ＰｖｕＩＩ部 分的消化物）のＰｖｕｎ−Ｐｓｔｌ断片を、ＥｃｏＲＩ−Ｐｓ　ｔ　Ｉて消化し たｐｌＢＩ２４　（ス１〜ラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリホルニア 州、ラホイヤ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ））中に結合させた。次に（ＥｃｏＲＴ）−Ｐ ｓ　ｔ　！断片（ｎｔｌから２４２４配列ＩＤ　Ｎｏ、１１）を単離し、Ｅｃｏ ＲＩで消化したｐｌＢＩ２４中のＨＢＣａＣＨａ２．ＩＩのＰｓ　ｔ　Ｉ　−（ ＥｃｏＲＩ）断片（ｎｔ２４２４から３６００、配列ＩＤ　Ｎｏ、ＩＩ）に結合 させて、ヒトの全長カルシウムチャンネルα２サブユニツトをコートするＤＮＡ 　（ＨＢＣａＣＨα２）を作成した。ＣＭＶプロモーターの近傍のメチオニン開 始コドンを用いて、ｐｃＤＮＡｌ　（ｐＨＢＣａｃＨα２Ａ）にＨＢＣａＣＨα ２　（ｎｔ　Ｉから３６００、配列ＩＤ　Ｎｏ、１１）の３６００ｂｐのＥｃｏ ＲＴ挿入体をサブクローニングした。またＨＢＣａＣＨα２の３６００ｂｐ（７ ）ＥｃｏＲＩ挿入体を、ＳＶ４０初期ブロモ−９−、マウスのノヒトロフォレー ト還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子、ＳＶ４０ポリアデニル化およびスプライソング 部位と、細菌中のベクターの維持に必要な配列を含有するｐＳＶ２ｄＨＦＲ（ス ブラ７−１−　（Ｓｕｂｒａｍａｎ　ｉ）ら、１９８１、Ｍｏ１Ｃｅ１１．Ｂｉ ｏｌ　、Ｉ：８５４−８６４）中にサブクローニングした。

実施例５　ヒトＣ２転写体とヒトＣ２転写体の差動処理（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉ ａｌ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）Ａ、β１転写体の差動処理 骨格筋、大動脈、海馬および脳底神経節、そしてＨＥＫ２９３細胞中に存在する ヒトβ１転写体のＰＣＲ解析により、各組織の配列ＩＤ　Ｎｏ、９のｎｔ６１５ −７８１に対応する領域の差動処理か明らかになった。この領域を介して５つの 差動処理されたβ１転写体になる４つの異なる配列力洞室された。異なる組織か らのβ１転写体は、４つの配列の異なる組合せを含有していたが、ＨＥＫ２９３ 細胞中で発現されたβ１転写体（β１−ｓ）は４つの配列すべてを欠如していた 。

４つの配列のそれぞれを含むβ１転写体はひとつもなかった。しかし参考のため ４つの配列すへてを配列ＩＤ　Ｎｏ、１２中の単一の長い配列として端から端ま で記載しである。差動処理された４つの配列は、配列１（ｎｔｌ４−３４、配列 、ＩＤ　Ｎｏ、１２）、配列２（ｎｔ３５−５５、配列ＩＤ　Ｎｏ、１２）、配 列３　（ｎｔ５６−１９０、配列ＩＤ　Ｎｏ、１２）そして配列４（ｎｔｌ９１ −２７１、配列ＩＤ　Ｎｏ、１２）である。同定されているβ、転写体の梨は・ （１）β１−１　と呼ばれる配列１を欠く型（骨格筋中で発現される）、（２） β１−２と呼ばれる配列２と３を欠く型（中枢神経系中で発現される）、（３） β１−１と呼ばれる配列１．２そして３を欠く型（大動脈で発現される）、そし て（４）配列β、−６と呼ばわる配列１−４を欠く型（ＨＥＫ細胞中で発現され る）である。さらにβ１−４型とβ、−６型は、β１−１型とβ、−２型に存在 しないグアニンヌクレオチド（配列ＩＤ　Ｎｏ、１２のｎｔｌ３）を含有する。

Ｂ、α１サブユニツトをコートする転写体の差動処理完全なヒト神経Ｃ２コート 配列（ｎｔ３５−３３０７）＋５’非翻訳配列の一部（ｎｔｌから３４）、およ び３°非非翻訳列の一部（ｎｔ３３０８−３６００）を配列ＩＤ　Ｎｏ　１１に 示す。

骨格筋、大動脈、中枢神経系中に存在するヒトα２転写体のＰＣＲ解析により、 各組織の配列ＩＤ　Ｎｏ、ＩＩのｎｔ　＋５９５−１９４２に対応する領域の差 動処理か明らかになった。

ｎｔ　１５９５−１９４２に対応するヌクレオチドを含有するゲノムＤＮＡの一 次転写体は、配列１［Ｎｏ、１１のｎｔｌ６４２と１６２５の間に挿入された追 加の配列（配列１３・５’　ＣＣＴΔＴＴＧＧＴＧＴＡＧＧＴＡＴＡＣＣＡＡＣ ＡＡＴＴＡＡＴＴＴＡＡＧＡＡＡＡＡＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＴＡＴＣＣＡＧ３′ ）を含むことを示していた。ｎｔｌ６２４と１６２５の間に挿入された配列ＩＤ Ｎｏ、ｌｉ４配列ＩＤ　Ｎｏ、１３のｎｔ、＋５９５−１９４２の領域を含む一 次転写体の領域の１つから３つの異なる部分の有無により異なる別にスプライシ ングされた５−）の変種の力洞室されている。異なる組織からのこの５つのＣ２ をコートする転写体は、３つの配列の異なる組合せを含むか、大動脈で発現され る（１．転写体の１つは３つの配列すべてを欠く。３つの配列のそれぞれを含む Ｃ２転写体はひとつもなかった。差動処理された３つの配列は、配列ｌ　（配列 ＩＤＮｏ、１３）、配列２　（５’　ＡＡＣＣＣＣＡＡＡＴＣＴＣＡＧ３’　、 これは配列ＩＤ　Ｎｏ、ＩＩのｎｔｌ６２５−１６３９である）、そして配列３ （５°　ＣΔＡＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＡＡＴＧＡ八〇Ｇ３°、これは配列ＩＤ　 ＮｏへＩＩのｎｔｌ９０８−１９２８である）である。同定されている５つのＣ ２転写体の型は　（１）Ｃ２，と呼ばれる配列３を欠く型（骨格筋中で発現され る）、（２）Ｃ２ゎと叶はれる配列ｌを欠く型（中枢神経系中で発現される）、 （３）α２ｃと呼はれる配列１ろ２を欠く型（大動脈で発現される）、（４）配 列α２．と呼はれる配列ｌ、２そし、て３を欠＜撃（大動脈で発現される）、そ して（５）Ｃ２，、＆呼ばれる配列ｌと３を欠＜Ｖ＜大動脈で発現される）であ る。

実施例６　ヒＩ・脳ｃＤＮＡライブラリーからのカルシウムチヤンネルγサブユ ニ・１・をター　１〜するＤＮＡ０単離 八　γ叶コユニソ１４コー１”ｔ６ＤＮＡの単離ヘク々−γＪＩｏ（：、’ｘイ （Ｊａｙ、Ｓ）ら、１９９０．５ｃｉｅｎｃｅ、２４８：４９０−４９２に含有 された４８４ｂｐのウサギの骨格筋カルシウムチヤンネルγサブユニットｃＤＮ Ａ（コート配列のヌクレオチド６２１−６２６＋３’非翻訳配列の４３８ヌクレ オチド）の４８４ｂｐの配列へのハイブリダイゼーションにより、λｇｔｉ＋を 基礎とするヒトの海馬ｃＤＮＡライブラリー（クロンチックコープ（Ｃ１ｏｎｔ ｅｃｈ　Ｃｏｒｐ、）、＃ＨＬＩ０８８ｂ、カリホルニア州、パロアルト）から 約１，０００，０００個の組換え体をスクリーニングした。中適度の緊縮条件下 （脱イオン化ホルムアミド２０％、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ） 、６ＸＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ、　２０　μｇ　／ｍｌニシンの精子ＤＮＡ、 ４２°Ｃ）でハイブリダイゼーションを行った。このプローブにハイブリダイズ したプラーク精製し、挿入体ＤＮＡをｐＯＥＭ７Ｚ中にサブクローニングした。

このｃＤＮＡ挿人体をγ１．　４と命名した。

Ｂ、７１．４の性状解析 ７１．４をＤＮＡハイブリダイゼーションで確認し、ＤＮＡ配列決定法により性 状解析した。γｌ　４の＋５００ｂｐの５ｓｔｌ断片は、サザンブロツティング 上のウサギの骨格筋カルシウムチャンネルγサブユニットｃＤＮＡγＪＩＯにハ イブリダイズした。この断片の配列解析により、これはヒトＤＮＡ配列の約５０ ０ｎｔとλｇｔ１１配列（λｇｔｌｌ中のＥｃｏＲＩクローニング部位か破壊さ れているために含有される）の−１０００ｎｔを含むことが明らかになった。

このヒトＤＮＡ配列はコート配列の１２９ｎｔを含有し、この配列のすぐ後に翻 訳停止コドンと３′非非翻訳列（配列ＩＤ　Ｎｏ、１４）か続く。

ヒトγサブユニットＤＮＡの残りの５°配列を単離するために、まずγ１．４の ｃＤＮＡ特異的配列に基つく汚水ヌクレオチドブライマーを用いてヒト中枢神経 系ライブラリーおよび／またはヒト中枢神経系組織からのｍＲＮＡの調製物が、 ＰＣＲ法により測定できる。追加のヒトの神経γサブユニットをコードするＤＮ Ａは、ＰＣＲ測定法に基づきγ特異的な増幅可能なｃＤＮＡを含むｃＤＮＡライ ブラリーから単離てきる。あるいはＤＮＡは、ＰＣＲ測定の結果に基づきγ特異 的な増幅可能な転写体を含むｃＤＮＡライブラリーから単離てきる。そのような ライブラリーは、ポリΔ”　ｍＲＮＡから最初のｊＪｌｃＤＮＡ合成を開始させ るオリゴ（ｄＴ）を用いて標準的方法により作成される。あるいは最初の鎖ＤＮ Ａは、γｌ　４中のヒトＤＮＡ配列に基づくγｃＤＮ△特異的オリゴヌクレオチ ドて最初の［ｃＤＮＡ合成を開始させることにより特定される。次に最初の鎖合 成に基づきｃＤＮＡライブラリーを作成できる。

実施例７：哺乳動物細胞中のヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコー ドするｃＤＮＡとＲＮＡ転写体の組換え発現Ａ、ＤＧ４４細胞中のヒト神経カル シウムチャンネルα、サブユニットｃＤＮＡの組換え発現 １、ＤＧ４４細胞の安定なトランスフェクションコロンビア大学のローレンスチ ェーシン（Ｌａｗｒｅｎｃｅ　Ｃｈａｓｉｎ）より入手したＤＧ４４細胞（ｄｈ ｆｒチャイニーズハムスター卵巣細胞；ウーラウブ（Ｒｕ　Ｉ　ａｕｂ）ら、１ ９８６、Ｓｏｍ、Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１ｅｃ。

Ｇｅｎｅｔ、＋２：５５５−５６６）を、トランスフェクションした細胞中のポ リンストロン性発現／選択のためのヒト神経カルシウムチャンネルα、サブユニ ットｃＤＮＡ（実施例４を参照）を含有するｐＳＶ２ｄｈｆｒベクターを用いて ＣａＰＯｔ沈澱法により安定にトランスフェクションされた。発現ベクターを取 り込んだ細胞を選択するためにヒボキサンチンまたはチミジンを含まない１ｏ％ ＤＭＥＭ培地上でトランスフェクション体を増殖させた。１２個のトランスフェ クション細胞株を、この培地上で生存できる能力により指示されたように確立し た。

２、トランスフェクションされたＤＧ４４細胞中のα２サブユニツトｃＤＮＡの 発現の解析 ヒト神経カルシウムチャンネルα２サブユニツトｃＤＮＡを含有するｐＳＶ２ｄ ｈｆｒて安定にトランスフェクションされた４つのＤＧ４４Ｇ４４細胞、バーン ポイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）（１９８８、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　、１ ６　：１４８７−１４９７）の方法に従って、総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ　（ レーン中り約１５μｇ）をアガロースホルムアルデニトゲル上に分離し、ニトロ セルロースに移し、ランダムにブライミングしたヒト神経カルシウムチャンネル α、ＣＤＮＡ　（ハイブリダイゼーション：５０％ホルムアミド、５ＸＳＳＰＥ 、５ＸデンハルＩ−（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’　ｓ）、４２°Ｃ１洗浄：０．２ＸＳ ＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５”Ｃ）にハイブリダイズした。ヒト神経カルシウ ムチャンネルα２サブユニツトｃＤＮＡを含有するｐＳＶ２ｄｈｆｒて安定にト ランスフェクションさせた４つのＤＧ４４Ｇ４４細胞総ＲＮＡのノーサンプロッ ト解析により、４つの細胞株のうちの１つは、ＩＯ−の醋酸ナトリウムの存在下 で２日間増殖させた時α、サブユニットｃＤＮＡ　（ｃＤＮＡのサイズに基づ＜ ５０００ｎｔ）の転写体に予測されるサイズのハイブリダイズするｍＲＮＡを有 していた。酪酸塩は非特異的に転写を誘導し、しばしばＳＶ４０初期プロモータ ーを誘導するのに使用される（ゴーマンとハワード（Ｇｏｒｍａｎ、Ｃ，ａｎｄ 　Ｈｏｗａｒｄ。

Ｂ、）、１９８３、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１１：ｌ６３１） 。

この細胞株（４４α、−９）は、α、ｃＤＮＡに基づくプローブにハイブリダイ ズするα、ｃＤＮＡ　（５０００ｎｔ）の転写体に予測されるサイズより小さい （いくつかの種）および大きい（６８００ｎｔ）ｍＲＮＡ種を産生した。この転 写体に産生される５０００ｎｔと６８００ｎｔの転写体は、全α２サブユニツト コ一ト配列を含有し、従って全長α２サブユニツト蛋白を産生ずる。弱くハイブ リダイズする８０００ヌクレオチド転写体が、トランスフェクションされないお よびされたＤＧ４４細胞中に存在していた。ＤＧ４４細胞は低レベルでカルシウ ムチャンネルα、サブユニットまたは類似の遺伝子を転写するようである。この 内因性のα２サブユニット転写体の発現レベルは、ノーサン解析のためのＲＮＡ の単離の前に細胞を酪酸に接触させても影響を受けないようである。

ヒト神経カルシウムチヤンネルα、サブユニットｃＤＮＡを含有するｐＳＶ２ｄ ｈｆｒて安定にトランスフェクションさせたＤＧ４４Ｇ４４細胞つから総蛋白を 抽出した。約１０．０００．０００この細胞を５０酬のＨＥＰＥＳ、１蘭のＥＤ ＴＡ、１酬のＰＭＳＦを含む３００μｍの溶液中て超音波処理した。この試料の 等量の２×添加色素（リムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ）　、英国、１９７０、Ｎａｔ ｕｒｅ、２２７：６８０）を加え、８％ポリアクリルアミドゲル上で蛋白を電気 泳動し、次にニトロセルロースに電気移動した。このニトロセルロースを、ウサ ギの骨格筋カルシウムチャンネルα２サブユニツト（キャムベル（Ｋ。

Ｃａｍｐｂｅ　Ｉ　＋）　、アイオワ大学）に対するモルモットのポリクローナ ル抗血清（１：２００希釈）でインキュベートした後、　［”’　Ｉ　］−蛋白 Ａでインキュベートした。プロットを一７０°ＣでＸ線フィルムに感光させた。

トランスフェクションしたおよびトランスフェクションしていないＤＧ４４Ｇ４ ４細胞の還元した蛋白試料は、ヒト神経カルシウムチヤンネルα２サブユニツト （１３０−１５０ｋＤａ）に予想される大きさの免疫反応性蛋白を含有していた 。この免疫反応性蛋白のレベルは、酪酸ナトリウムの存在しないところで増殖さ せた４４α２−９細胞より、ＩＯｄの酪酸ナトリウムの存在下で増殖させた４４ α２−９細胞で高かった。これらのデータは、４４α、−９細胞およびトランス フェクションしていないＤＧ細胞の総ＲＮＡのノーサン解析で得られたものとよ く一致する。細胞株４４α２−９はまた、全長α２サブユニツトの蛋白分解生成 物であるか、またはα、サブユニットｃＤＮＡプローブにハイブリダイズした細 胞株で産生された短い（＜５０００ｎｔ）ｍＲＮＡの１つの翻訳生成物かも知れ ない１１０ｋＤの免疫反応性蛋白を産生じた。

Ｂ、ＨＥＫ細胞中のヒト神経カルシウムチャンネルα１、α２およびβ１サブユ ニットをコートするＤＮＡの発現 ヒトの胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３細胞）を、カルシウムチャンネルサブユニッ トをコードするヒト神経ＤＮＡで、−次的および安定にトランスフェクションし た。各トランスフェクション体を、電位活性化バリウム電流および機能的組換え 性膜イオン化カルシウムチャンネルの存在について電気生理学的に解析した。

１、、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション上１−神カルルシウムチヤンネ ルαＩＤｓ　α、およびβ１サブユニットをコートするＤＮＡを含有する別々の 発現ベクター、プラスミツトｐｖＤｃｃＩ［Ｉ　（Ａ）　、ｐＨＢＣａＣＨαｔ 　Ａ　およびｐＨＢＣａＣＨβ、、ＲＢＳ　（Ａ）をそれぞれ実施例２、Ａ、３ ．．４．　Ｂ　および３．　Ｂ、３　に記載するように作成した。これらのベク ターをＨＥＫ２９３細胞を一次的に同時トランスフェクションするために使用し た。ＨＥＫ２９３細胞の安定なトランスフェクションのために、ｐＨＢＣａＣＨ β、、ＲＢＳ（Δ）の代わりにｐＨＢＣａＣＨβ、、ＲＢＳ　（Ａ）を使用して 、ｐＶＤｃｃＩＩＩ　（Δ）とｐＨＢｃａｃＨα２Ａ　とともにβ１サブユニッ トをコートするＤＮＡを細胞中に導入した。

ａ　−次的トランスフエクション（ｔｒａｎｓ　１ｅｎｔｔｒａｎｓｆｅｃｔｉ ｏｎ） ２つのセット１７）ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ整理番号ＣＲＬ　１５７３）　 （７）−次的トランスフェクションにおいて発現ベクターｐＶＤＣＣＩ［（Ａ） 　、ｐＨＢＣａＣＨ＋２２　Ａ　およびｐ　ＨＢ　Ｃａ　ＣＨ／３　＋　、　Ｒ Ｂ　Ｓ　（Ａ　）を使用した。１つのトランスフェクション法において、ＨＥＫ ２９３細胞を、α１サブユニツトｃＤＮＡ発現プラスミツト、α２サブユニツト ｃＤＮＡ発現プラスミツト、β１ザブユニットｃＤＮＡ発現プラスミツトおよび プラスミツドｐｃＭＶβｇａｌ（クロンチックラボラトリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃ ｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、カリホルニア州、パルアルド）で−次的に同 時トランスフェクションした。プラスミツトｐＣＭＶβｇａｌは、サイトメガロ ウィルス（ＣＭＶ）プロモーターに融合したＩａｃＺ遺伝子（ＥｃｏＲＩβ−ガ ラクトシダーゼをコードする）を含有し、トランスフェクションの効率を追跡す るためのマーカー遺伝子としてこのトランスフェクションに含まれた。池のトラ ンスフェクション法においては、ＨＥＫ２９３細胞ハα、細胞ハエッｈｃＤＮＡ 発現ブａ％−夕−ｐＶＤｃｃＩＩ［（Ａ）　とｐＣＭＶβｇａｌて一次的にトラ ンスフェクションした。両方のトランスフェクションにおいて、１０ｃｍの組織 培養プレート中（７）２，０００，０００がら４，０００゜０００個のＨＥＫ２ ９３細胞を、標準的Ｃａ　Ｐ　Ｏａ沈澱十ラうスフエクション法（ウィグラー（ Ｗｉｇｌｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ、Ａ、７６　 ：１３７３−１３７６）に従い、実験て各プラスミツド５μｇで一次的に同時ト ランスフェクションした。β−ガラクトソダーゼとＸ−ｇａ１基質を用いて反応 の生成物を直接染色すること（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ、Ｊ、Ｒ，）、１９８６ 、ＥＭＢＯ１５：３１３１３１４２）により、モしてβ−ガラクトソダーセ活性 の測定（ミラー（Ｍｊ　］　］　ｅｒ、　Ｊ、　Ｈ，）、】９７２、Ｅｘｐｅｒ ｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１３５２−３５５ 頁、コールドスプリングハーバ−プレス（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ 　Ｐｒｅｓｓ））により、転写体のβ−ガラクトシダーセ発現を解析した。これ らの転写体のサブユニットｃＤＮＡ発現を評価するために、ザブユニット転写体 産生（ノーサン解析）、サブユニット蛋白産生（細胞溶解物の免疫プロット解析 ）および機能的カルシウムチャン不ル発現（電気生理学的解析）について細胞を 解析した。

ｂ　安定なトランスフェクション リン酸カルシウムトランスフェクション法（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ 　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ、Ｌウィリーインターサ イエンス（Ｗｉｌｅｙ　Ｉｎｔｅｒ−３ｃｉｅｎｃｅ）、増刊１４号、ユニット ９．　１．　１−９．　１．　９．１９９０）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞をト ランスフェクションした。それぞれ１，０００，０００−２．０００゜０００個 のＨＥＫ２９３細胞を含存する１０ｃｍのプレートを、５μｇのｐＶＤＣＣｎＩ （Δ）、５μｇのｐＨＢＣａＣＨａｔ　Ａ　、５μｇのｐＨＢＣａＣＨβ１ｂＲ ＢＳ　（Ａ）、ｓμｇのｐｃＭＶｇａｌ、そしてＩｎ２のｐＳＶ２ｎｅｏ　（選 択マーカーとして）を含有する１ｍｌのＤＮＡ／リン酸カルシウム沈澱法でトラ ンスファクションした。５００μｇの０４１８を含有する培地中の１０−２０日 間の増殖の後、コロニーか形成され、クローニングシリンダーを用いて単離した 。

２、ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをコードするＤＮＡで一次的に トランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の解析ａ　β−ガラクトソダーゼ発 現の解析 細胞溶解物（実施例７．　Ａ、２に記載するように調製した）のβ−ガラクトシ ダーセ活性測定（ミラー（Ｍｉ　ｌ　ＩｅｒＳＪ、Ｈ，）、１９７２、Ｅ、ｘｐ ｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３５２−３ ５５頁、コールドスプリングハーバ−プレス（Ｃｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ ｏｒ　Ｐｒｅｓｓ））と、固定した細胞の染色（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ、　Ｊ 、　Ｒ，）、１９８６、ＥＭＢＯ１５：３１３３−３１４２）により、−次的１ −ランスフエクション体をβ−ガラクトシダーセ発現を測定した。

これらの測定法の結果は、約３０％のＨＥＫ２９３細胞がトランスフェクション されていることを示していた。

ｂ　ノーサン解析 α１、α２そしてβ１サブユニットのそれぞれおよび］ａｃＺ遺伝子またはα１ サブユニツトと１ａｃＺ遺伝子をコートするＤＮＡで一次的にトランスフェクシ ョンしたＨＥＫ２９３細胞から、インヒトロゲンファーストトラックキ・ソト（ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ　Ｆａｓｔ　Ｔｒａｃｋ　Ｋｉｔ）（インビトロゲン（Ｉ ｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリホルニア州、サンジエゴ）を用いてポリＡ＋ＲＮＡ を単離した。このＲＮＡをアガロースゲルで電気泳動し、ニトロセルロースに移 した。次にニトロセルロースを１つまたはそれ以上の次の放射能標識プローブで ハイブリダイズした　ＩａｃＺ遺伝子、ヒト神経カルシウムチャンネルαｌＩ。

サブユニットをコートするｃＤＮＡ、ヒ）・神経カルシウムチャンネルα、サブ ユニットをコートするｃＤＮＡ、またはヒト神経カルシウムチャンネルβ１サブ ユニットをコートするｃＤＮＡｏ　α１サブユニツトをコードするｃＤＮＡとハ イブリダイズした転写体か、α１、α２そしてβ１サブユニットをコードするＤ ＮＡ。

１ａｃＺ遺伝子でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞、およびα１サブ ユニツトｃＤＮＡと］ａｃＺ遺伝子でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細 胞中て検出された。１つのｍＲＮＡ種は、α１サブユニツトｃＤＮＡの転写体で 予想される大きさであった（８０００ヌクレオチド）。２っめのＲＮＡ種は転写 体で予想される大きさより小さかった（７０００ヌクレオチド）。ＩａｃＺ遺伝 　−子配列へのハイブリダイゼーションにより、１ａｃＺ遺伝子の転写体に予想 される大木サイトメガロウィルスのＲＮＡが、α１、α、そしてβ１サブユニッ トをコードするｃＤＮＡとＩａｃＺ遺伝子でトランスフェクションした細胞、お よびα１サブユニツトｃＤＮＡと］ａｃＺ遺伝子でトランスフェクションした細 胞中で検出された。

また、α１、α２そしてβ１サブユニットをコードするｃＤＮＡと］ａｃＺ遺伝 子でトランスフェクションした細胞からのＲＮＡをα２とβ１サブユニットＣＤ ＮＡプローブとハイブリダイズした。２つのｍＲＮＡ種はα２サブユニツトＣＤ ＮＡプローブにハイブリダイズした。１つの種はα２サブユニッＩ−ｃＤＮＡの 転写体に予想される大きさであった（４０００ヌクレオチド）。他の種は転写体 に予想される大きさより大きかった（６０００ヌクレオチド）。細胞中の複数の ＲＮＡｆｌは、α１、α、そしてβ１サブユニットをコードするｃＤＮＡと同時 トランスフェクションし、ＩａｃＺ遺伝子はβ１ザブユニツトｃＤＮＡプローブ とハイブリダイズした。βサブユニッ１−ｃＤＮΔ発現ベクターは可能性のある ２つのポリＡ４追加部位を存するため、種々の大きさのβサブユニット転写体か 産生された。

Ｃ電気生理学的解析 一次的に１〜ランスフエクシヨンした各ＨＥＫ２９３細胞を、バッチクランプ法 （ハミル（Ｈａｍｉ　ｌ　Ｉ）ら、１９８Ｌ　Ｐｆｌｕｇｅｒｓ　Ａｒｃｋ　、 ３９１：８５−１００）を用いて、電位依存性バリウム電流の存在について測定 した。

これらの実験てｐＣＭＶβｇａｌて一次的にトランスフェクションしたＨＥＫ２ ９３細胞のみを陰性対照として測定した。電流担体となるバリウムイオンを含存 する浸漬溶液（ｂａｔｈｉｎｇ　５ｏｌｕｔｉｏｎ）中に細胞を入れた。浸漬溶 液の主要な塩溶液として塩化ナトリウムや塩化カリウムの代わりにコリンクロリ ドを用いて、ナトリウムやカリウムチャンネルを介する電流を除去した。浸漬溶 液は１閘の塩化マグネシウムを含存し、１０關のＨＥＰＥＳ　（てｐ８７．　３ で緩衝化した（ｐｌｌは水酸化ナトリウムまたは水酸化テｉ・ラアセチルアンモ ニウムで調整した）。バッチピペットと、１３５閘の塩化セシウム、ｌｒｒ＃の 塩化マグネシウム、１０蘭のグルコース、ＩＯ酬のＥＧＴＡ、４ｎＮのＡＴＰ、 および１０ｍ１ｉｌのＨＥＰＥＳ（ｐｌ（は水酸化テトラエチルアンモニウムで 調整した）を含有する溶液で満たしたラセンラムとテトラエチルイオンはほとん どの型のカリウムチャンネルを阻止する。ピペッタ−をノルガード（Ｓｙｌｇａ ｒｄ）（ダウコーニング（Ｄｏｗ−Ｃｏｒｎｉｇ）、ミンガン州、ミツトランｌ ”（Ｍｉｄｌａｎｄ））て被覆し、１−４メグオーム（ｍｅｇｏｈｍ）の抵抗を 有していた。ＩＢＭコンパチブルＰＣ中にラブマスター（Ｌａｂｍａｓｔｅｒ） （サイエンティフィックソルーションズ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　５ｏｌｕｔｉ ｏｎｓ）、オハイオ州、フロン（Ｓａｌｏｎ））データアクイノンヨンホートを 中間に介してアクソパッチ（Ａｘｏｐａ　ｔ　ｃｈ）ＩＣ（アクソンインスツル メンツ（ΔｘｏｎＩｎｓ　＋　ｒｕｍｅｎ　ｔ　ｓ）　、カリホルニア州、フォ スターシティ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ））増幅器を有する５００メグオームのヘ ットステージレジスター（ｈｅａｄｓｔａｇｅ　ｒｅｇｉｓｔｅｒ）を介して電 流を測定した。電圧指令とデータの耳召悼（こＰＣ］ａｍｐ（アクソンインスッ ルメン゛ソ（ＡｘｏｎＩｎＳ　ｔ　ｒｕｍｅｎ　ｔ　Ｓ）を用いた。データはｐ ＣＩ　ａｍｐとクアトロプロフェノンヨナル（Ｑｕａｔｔｒｏ　Ｐｒｏｆｅｓｓ ｉｏｎａｌ）（ポランドインターナショナル（Ｂｏｒｌａｎｄ　Ｉｎｔｅｒｎａ ｔｉｏｎａｌ）、カリホルニア州、スコソツバレ−（Ｓｃｏｔｔｓ　Ｖａｌｌｅ ｙ））プログラムで解析した。

薬剤を添加するのに、試験中の細胞の数マイクロメートル内に位置した「ブファ ー」　（“Ｐｕｆｆｅｒ”）ピペットを使用して加圧して溶液を添加した。薬理 学的性状解析に使用した薬剤を、浸漬溶液と同一の溶液中に溶解した。添加前に 、ＤＭＳＯ中で調製したＢａｙ　Ｋ８６４４　（ＲＢＩ、？サチュセッツ州、ナ チック（Ｎａｔｉｃｋ））の１０扇の保存溶液を、１５酬のバリウムイオン含有 浸漬溶液中で最終濃度ｌμＭに希釈した。

２１の陰性対照ＨＥＫ２９３細胞（ＩａｃＺ遺伝子発現ベクターｐＣＭＶｇａ１ のみで一次的にトランスフェクションした））を、電流を記録するためにバッチ クランプ法の全細胞変種により解析した。１つの細胞のみがっくべつで着る内部 へのバリウム電流を示した：この電流はｌμＭのＢａｙ　Ｋ８６４４の存在で影 響を受けなかった。さらにバリウムイオン電流を示さなかった４つの細胞へのＢ ａｙ　Ｋ８６４４の添加ては、電流は現れなかった。

α１、α２そしてβ１サブユニットをコートするｃＤＮＡとＩａｃＺ遺伝子によ るＨＥＫ２９３細胞の一次的トランスフエクションの２日後に、各トランスフェ クション体を電位依存性バリウム電流について測定した。９個のトランスフェク ション体の電流を記録した。）・ランスフエクションの効率は細胞毎に異なるた め、各１〜ランスフ工クシヨン体の異種蛋白の発現の程度は異なり、外来ＤＮＡ を取り込まないまたは発現しない細胞もある。これらの９個のトランスフェクシ ョン体の２って内部バリウム電流か検出された。これらの測定法で膜の保持電位 は一９０ｍＶであった。膜は一連の電圧工程で異なる試験電位に脱分極され、ｌ μＭのＢａｙ　Ｋ８６４４の存在下または非存在下での電流か記録された。Ｂａ ｙＫ８６４４の添加による内部バリウム電流の大きさは有意に増加していた。膜 かｌμＭのＢａｙ　Ｋ８６４４の存在下てＯｍＶに脱分極された時最も大きいバ リウム電流（−１６０ｐＡ）か記録された。脱分極の後に記録された最大の電流 をＢａｙＫ８６４４の非存在下でまたは存在下での記録に対応する親分ｉｔ圧に 対してプロットすることにより作成されるＩ−Ｖ曲線の比較は、Ｂａｙ　Ｋ８６ ４４の存在下での電圧活性化電流の増加を示していた。

α１、α２そしてβ１ザブユニットをコートするｃＤＮＡとＩａｃＺ遺伝子てト う゛、ノスフエクンコンした）（ＥＫ２９３細胞中のＢａｙ　Ｋ８６４４の存在 下て産生された電流の追跡で顕著なテール電流か検出され、このト′：；ンスフ ェクションーＣ記録された電圧活性化バリウム電流に起因する組換えカルシウム チャンネルはＤＨＰ感受性であるらしいことを示していた。

内部ハｊｌ　ｒ′７ム電流を示した２つのトランスフェクションした細胞の２番 目のものは、膜を一９０ｍＶから脱分極した時−５０ｐＡを示した。この電流は ２００μＭのカトミウＩい（確立されたカルシウムチャンネルブロッカ−）によ りほとんど完全に阻止された。

（Ｉ２サブユニットをター！−するＤＮＡと１ａｃＺ遺伝子で一次的にトランス フェクションした１０個の細胞を、トランスフェクション後全細胞バッチクラン プ法により解析した。こオ］らの細胞の１つは３０ρＡの内部バリウム電流を示 した。

この電流はｌμＭのＢａｙ　Ｋ８６４４の存在下で２倍増加した。さらにＢａｙ Ｋ８６４４の存在下で小さいなテール電流か検出された。これらのデータはＨＥ Ｋ２９３細胞中でのヒト神経カルシウムチヤンネルα１ザブユニットをコードす るｃＤＮＡの発現は、機能的ＤＨＰ感受性カルシウムチヤンネルを与えることを 示している。

３　ヒト神経カルノウｊ、チャン不ルサブユニッ］・をコートするＤＮＡで安定 にトラ、ンスフェクンヨンしたＨＥＫ２９３細胞の解析−次的にトランスフェク ションしたＨＥＫ　２９３細胞（実施例８．　Ｂ、２．　ｃを参照）の電気生理 学的解析で記載したように、電位依存性バリウム電流について安定にトランスフ ェクションされた各ＨＥＫ２９３細胞を電気生理学的解析した。サイクリックＡ ＭＰ依存性のキナーゼ介在リン酸化（ベルブー（Ｐｅｌｚｅｒ）　ら、１９９０ 、Ｒｅｖ、Ｐｈｕｓｉｏｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。

Ｐｈａｒｍａｃｏｌ　、１１４　：１０７−２０７）を介するカルシウムチャン ネル活性を最小にするために、いくつかの記録てｃＡＭＰ　（ナトリウム塩、２ ５０ｕＭ）をピペット溶液に加え、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）（ｌ ｏμＭ）を浸漬溶液に加えた。これらの化合物の存在にかかオつらず、類似の定 量結果か得られた。

Ｂａｙ　Ｋ８６４４　（ｌｌＪＭ）の非存在下ておよびｒｒ在下て、安定にトラ ンスフ１７５／ヨシされた細胞からバリウム電流か記録された。Ｂａｙ　Ｋ８６ ４４の非存在下て細胞を一９０ｍＶの保持電位から一１０ｍＶに脱分極した時、 急速に不活性化さ第１るテール電流のある約３５ｐＡｉｔ流か記録された。Ｂａ ｙ　Ｋ８６４４の使用の間同じ脱分極法で約７５ｐＡの電流を誘導され、こねに 増強され長引いたテール電流か付随していた。一連の脱分極電圧の関数としての 同し細胞から記録された最大の電流を評価した。Ｂａｙ　Ｋ８６４４の存在下で 応答か増加したのみならず、全電流−電比関係か約−１０ｍＶ移動した。こうし てＢａｙ　Ｋ８６４４作用の３つの典型的な特徴（すなわち電流値の増加、テー ル電流の延長、そして活性化電圧の陰性側への移動）か観察され、これらの安定 にトランスフェクションさ第１た細胞におけるＤＨＰ感受性カルシウムチャンネ ルの発現を示していた。トランスフェクションされなかったＨＥＫ２９３細胞て はｃＡＭＰまたはフォスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌ　ｉｎ）の有無にかかわらず、 Ｂａｙ　Ｋ８６４４のそのような効果は観察されなかった。

Ｃ，ヒト神経カルシウムチャンネルサブユニットをター１−するＤＮＡの発現の ためのｐＣＭＶを基礎とするベクターとｐＣＤＮＡ＋を基礎どするベクターの使 用１、作成体の調製 ｐｃＤＮＡｌを基礎とする発現ベクターの代オ）りにｐＣＭＶを基礎とする発現 へ汐ターを用いた場合、宿主細胞中でのヒ１−のカルシウムチャンネルサブユニ ットをコートするＤＮＡの組換え発現のレベルか増加するか否かを調へるため、 通以下の発現ベクターを作成した。ｐＶＤＣＣＩ［Ｉ　（Δ）からの全長α、Ｄ ｃＤＮＡ（実施例２．　Ａ、３．　ｄを参照）　、ＨＢＣａＣＨα、からの３６ ００ｂｐのＥｃｏＲ１断片に含有される全長α２ＤＮＡ　（実施例４．　８を参 照）、およびｐＨＢＣａＣＨβ、、ＲＢＳ　（Ａ）からの全長β１サブユニット （実施例３．　８．　３を参照）を、別々にプラスミノｌ”ｐｃＭＶｇａ＋にサ ブクローニングした。ブラスミｙ　ｌ”ｐ　ＣＭＶｇ　ａ　ＩをＮｏｔＩて消化 して］ａｃＺ遺伝子を除去した。このプラスミントの残りのベクタ一部分（ｐＣ ＭＶを呼ぶ）をＮｏｔＩ部位てＮｏｔＩで平滑末端にした。別々のＥｃｏＲＩ断 片上の全長α２をコートするＤＮＡとβ１をコートするＤＮＡを単離し、平滑末 端にし、ｐＣＭＶのＣＭＶプロモーターとＳＶ４０ポリアデニル化部位の間にｃ ＤＮＡを有するｐＣＭＶの平滑末端にした断片に別々に結合させた。α、０をコ ートするＤＮＡにｐｃＭｖを結合させるために、ＣＭＶプロモーターの５′のす ぐ横とＳＶ４０のポリアデニル化部位の３′のすく横のポリリンカー中の制限部 位をｐＣＭＶから除去した。このポリリンカーは次の制限酵素認識部位の配列を 有する。

次にｐＶＤｃｃ］ＩＩ　（Ａ）からのＢａｍ）月／Ｘｈｏｌ断片として単離され た、α１．をコートするＤＮＡを、ＸｂａｌＩ／５ａｌＩて消化したｐＣＭＶに 結合させてＣＭＶプロモーターとＳＶ４０のポリアデニル化部位の間に配置させ た。

ブー７スミノｔ”ｐＣＭＶｌｉｐｃＤＮＡｌ　と同様＋、：ＣＭＶブａモーター を有スルカ、挿入されたサブユニットをター１へするＤＮＡに対するスプライス トナー／スプライスアクセプタ一部位においてｐｃＤＮＡＩとは異なる。サブユ ニ、ｙトをコードするＤＮＡをｐＣＭＶに挿入後は、スプライスｌ−カー／スプ ライスアクセプタ一部位はＣＭＶプロモーターの３′　とサブユニッ１−をコー ドするＤＮＡ開始コドンの、５′　に位置する。サブユニットをコートするＤＮ ＡをｐｃＤＮＡｌに挿入後は、スプライストナー／スプライスアクセプタ一部位 は、サブユニットｃＤＮＡ停止二７トシの３′（こ位置する。

２　Ｆ（ＥＫ２９３細胞の１〜ランスフ工クノヨン実施例７．　Ｂ、１．　ａ　 に記載したように、ｐＣＭＶ中のα１Ｄ、α２そしてβ１サブユニットをター１ −するＤＮＡ、またはｐｃＤＮＡｌ中のαｌＤ％α２そしてβ、刀ブユニットを コートするＤＮＡ　（それぞれベクターｐＶＤｃｃ］ＩＩ　（Ａ）、ｐＨＢｃａ ｃＨα２ＲＢＳ　（Ａ）およびｐＨＢＣａＣＨβ、、ＲＢＳ　（Ａ））で、ＨＥ Ｋ２９３細胞を一次的に同時トランスフェクションした。トランスフエクシー３ ノ効率の尺度として、各トランスフェクション中にプラスミソ］・ｐＣＭＶｇａ ｌをＩＪＩＩえた。１〜う／スフエクション体のβ−ガラクトシダーセ測定（実 施例７゜１３、　２．を参照）の結果は、ＨＥＩ＜２９３細胞はｐＣＭＶを基礎 とするプラスミツトで等しく効率的にトランスフェクションされることを示して いた。

３、ノーサン解析 実施例７．　Ａ、２．および７．　Ｂ、２．　ｂ、に記載のように、総およびポ リＡ”　ｍＲＮＡを一次的にトランスフェクションした細胞から単離した。ＲＮ Ａのノーサンプロットを以下の放射能標識したプローブとハイブリダイズさせた ：αＩＩ）ＣＤＮＡ、ヒト神経カルシウムチヤンネルα２サブユニツトおよびヒ ト神経カルシウムチャンネルβ１サブユニットをコードするＤＮＡ、すへてのト ランスフェクション体てα１、α２そしてβ１サブユニット転写体に予想される 大きさのメツセンジャーＲＮＡか検出された。大量のα、Ｄ転写体が、ｐＣＭＶ を基礎とするプラスミツトで同時トランスフェクションした細胞中に、次にｐ　 ｃ　ＤＮＡ　＋を基礎とするプラスミツトで同時トランスフェクションした細胞 中に存在していた。すべての１へランスフエクソヨン体で等量のα、そしてβ１ サブユニット転写体か検出された。

Ｄ　ヒト神経カルシウムチャンネルザブユニットをコードするＲＮＡのセノブス ラエヒス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　１ａｅｖｉｓ）卵母細胞中ての発現インビ１−口で 調製されたヒｌ−神経αＩＤ、α２そしてβ１サブユニットをコードするＤＮＡ の転写体の種々の組合せを、ゼノブスラエヒス（ＸｅｎｏｐｕｓＬａｅｖｉｓ） 卵母細胞中に注入した。α２．を含有する組合せて注入したものは、電圧活性化 バリウム電流を示した。

■、転写体の調製 ヒト神経カルシウムチヤンネルα３８、α２そしてβ１サブユニットをコートす る転写体を、ｍＣＡＰ　ｍＲＮＡキー１−７ビングキノト（ＣＡＰＰＩＮＧ　Ｋ ＩＴ）（ストラタシーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、カリホルニア州、ラホイヤ （Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）、カタログ番号２００３５０）の方法に従って合成した。

ｐｃＤＮＡＩとりポゾーム結合部位で始まるα＋ｏｃＤＮＡおよびコート配列の ８番目のＡＴＧコドン（実施例３．　Ａ、３．　ｄを参照）を含有するプラスミ ツドｐＶＤＣＣＩ［、ＲＢＳ　（Ａ）　、ｐｃＤＮＡｌとα、サブユニットｃＤ ＮＡ（実施例４を参照）を含有するプラスミントｐＨＢｃａｃＨα＋　Ａ、そし てｐ　ｃ　ＤＮＡ　１を含（ＴＬβ、ＤＮＡを欠々ｌするイントロン配列および リホゾーム結合部位（実施例３を参照）を含有するプラスミツトｐＨＢＣａＣＨ β、、ＲＢＳ　（Ａ）を、制限消化により線状化した。α、ｏＣＤＮＡおよびα ２サブユニットをコートするプラスミツドをＸｈｏＩて消化し、β１サブユニッ トをニー１〜するプラスミツトをＥＣ０ＲＶて消化した。ＤＮＡ挿入体をＴ７Ｒ ＮＡポリメラーゼで転写した。

、２　卵母細胞の注入 ゼノブスラエヒス（Ｘｅｎｏｐｕｓ　Ｉａｅｖｉｓ）卵母細胞を単離し、コラゲ ナーゼ処理により卵胞を除去し、注入の後および記録の前に２から５日間、１０ ０閘の塩化す１〜リウム、２蘭の塩化カリウム、１．　８ｍＭの塩化カルシウム 、１酬の塩化マグネシウム、５ｒｒＭのＨＥＰＥＳ、ピーエイチア、６．２０　 μｇ／ｍｌのアンピシリンそして２５μｇ　／ｍｌのストレプトマイシン中で維 持した。αサブユニット−に注入された各転写体につき、細胞当たり総量５０ｎ ｌて６μｇの特異的ｍＲＮ八を注入した。

３　細胞内雇用記録 ２つの７［ｔｔ＋の電圧クランプ法（ダスカル（Ｄａｓｃａ　ｌ、Ｎ、）、１９ ８７、ＣＲＣＣｒ１ｔ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、２２：３１７）を用いて、 注入した卵母細胞を電位依存性バリウム電流について調へた。電圧指令を作成し データを解析するために、ｐｃＩａｍｐ（アクソンインスツルメンツ（Ａｘｏｎ ｌ、ｎｓ　ｔ　ｒｕｍｅｎ　ｔ　ｓ））ソフトウェアパッケージをラブマスター （Ｌａｂｍａｓ　ｔｅｒ）１２５ｋＨｚデータアクイジソヨンインターフエース とともに使用した。クア］・ロブロフエツソヲナル（Ｑｕａｔｔｒ。

Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ）もこの解析で使用した。電流シグナルは！　−５ｋ Ｈ２てデソタル化し、適宜フィルターをかけた。浸漬溶液は以下を含有していた 。４０蘭の塩化バリウム、３６ｄｌのテトラエチルアンモニウムクロ１月ＣＩ） 、２ｍＭの塩化カリウム、５閘の４−アミノピリジン、０．＋５咄のニフルミン 酸（ｎｉｆｌｕｍｉｃ　ａｃｉｄ）、５ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７，６゜ａ　ヒ ト神経カルシウムチャンネルサブユニットα２、α２そしてβ１サブユニットを ニー１−する転写体を注入した卵母細胞の電気生理学的解析２つの電極の電圧ク ランプ法により注入しなかった卵母細胞を調へ、解析した７つの細胞のうちの１ つのみに内因性の内部バリウム電流か検出された。

α１ｏ、α、そしてβ１サブユニット転写体を同時注入した卵母細胞は、−９０ ｍＶまたは一５０ｍＶの保持電位（１５４±ｌ　２９ｎＡ、ｎ＝２１）から膜を 脱分極すると、維持された内部バリウム電流を示した。１４０から７００ミリ秒 の試験パルスを与えた時、これらの電流は典型的にはほとんと不活性化を示さな かった。

一連の電位の脱分極は、最初に現れる電流は一３０ｍＶであり、約ＯｍＶがピー クであることを示していた。

ＤＨＰＢａｙ　Ｋ８６４４を添加すると電流の強さが増加し、細胞の再分極のた めテール電流か延長され、電流活性化において過分極移動（ｈｙｐｅｒｐｏｌａ ｒｉｚｉｎｇ　５ｈｉｆｔ）が誘導された。ＤＭＳＯ中の保存溶液からＢａｙ　 Ｋ８６４４を新たに調製し、潅流ポンプ（ｐｅｒ　ｆｕｓ　ｉｏｎ　ｐｕｍｐ） か切られている時１０×濃縮液として６０μｍの浴中に直接導入した。細胞に接 触している最終の希釈薬剤溶液のＤＭＳＯ濃度は、決して０１％を越えなかった 。対照実験では０．１％のＤＭＳＯは膜層流に影響を与えなかった。

ＤＨＰアンタゴニストのニフェジピン（ＤＭＳＯ中の保存溶液として調製し、Ｂ ａｙ　Ｋ８６４４の添加について記載したように細胞に添加した）の添加は、α 、。、α２そしてβ１サブユニットの転写体を同時注入した卵母細胞の内部バリ ウム電流の大部分（９１±６％、ｎ＝７）を阻止した。内部バリウム電流の残基 損不活性成分は、ジフェニル添加の後も存在した。５０μＭのカドミウムイオン により内部バリウム電流は完全に阻止されたが、１００μＭのニッケルイオンで はわずかに約１５％阻止されたのみである。

α１ｏ、α２そしてβ１サブユニット転写体を同時注入した卵母細胞中の内部バ リウム電流へのωＣｇＴｘの影響を調へた。担体蛋白として用いるために、１５ 蘭の塩化バリウム浸漬溶液＋０．１％サイトクロームＣ（シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍ ａ））中てωｃｇＴｘ　（／＜ケムインク（Ｂａｃｈｅｍ、Ｉｎｃ、）、カリホ ルニア州、トランス（Ｔｏｒｒａｎｃｅ））を調製した。

対照実験はサイトクロームＣは電流に対して影響を与えないことを示していた。

−９０ｍＶの保持電位からＯｍＶへの一連の電圧パルスを２０ミリ秒間隔て記録 した。

２価の陽イオンによるωＣｇＴｘ結合の阻害を低下させるため、１５ｒｒＭの塩 化バリウｌ２．７３５咄のテトラエチルアンモニウムクロ１月・（残りの成分は ４０ｍＭのハリ内ムイオン記録溶液と同しである）中で記録を行った。延長した テール電流で区別されたＤＨＰ感受性電流成分に対してωＣｇＴｘの影響を調へ るために、ωＣｇＴｘの添加の前に細胞にＢａｙ　Ｋ８６４４を添加した。比較 的高濃度（１０−１５μｍ）のωＣｇＴｘにより内部バリウム電流は弱く（５４ ±２９％、ｎ−７）かつ可逆的に阻止された。ωＣｇＴｘの添加の２から３分以 内に試験電流と付随するテール電流は連続的に阻止されたか、浴からωＣｇＴｘ が追い出されるといずれも部分的に回復した。

■〕　ヒト神経カルシウムチャン不ルサブユニットα１．をコートする転写体の み、またはα１．サブユニットおよび他のサブユニットをコートする転写体を注 入した卵母細胞の解析 α１９、α２ぞしてβ１ザブユニットをコードする転写体を注入した卵母細胞中 の内部ノ刺つム電流へのα２どβ１サブユニットの寄与を、α１ｏサブユニツト のみの発現またはβ１サブユニットまたはα２サブユニットどの組合せとの発現 により評価した。αＩＤｃＤＮＡの転写体のみを注入した卵母細胞では、バリウ ムイオン電流は検出されなかった（ｎ＝３）。α１Ｄおよびβ、ｃＤＮΔの転写 体を注入した卵母細胞では、−９０ｍＶの保持電位から膜を脱分極すると、α１ ｏ、α２そしてβ、ｃＤＮＡの転写体を注入した細胞で観察された電流に似てい る弱い（１０８±３９ｎＡ）バリウムイオン電流か検出されたか、強さはそれよ り弱かった。

（γ１ｎおよびβ１をコートするＤＮＡの転写体を注入した４個の卵母細胞のう ちの２って、バリウムイオンてはＢａｙ　Ｋ８６４４に対して、α１ｏ、α１、 α２そしてβ１サブユニットをコートする転写体を注入した叩は細胞に現れた） ＼リウムイ１ンてのＢａｙ　Ｋ８６４４感受性に似た感受性を示した。

α１ｏど〔γ２サブユニットをコートする転写体を注入した５個の卵母細胞のう ち３　ｆｆ！］は、−９０ｍＶの保持電位からの膜の脱分極により、非常に小さ いハリウムイオ〕７玉流（１５−３０ｎＡ）を示した。これらのバリウムイオン ニーてはＢａｙＫ８６４４に対してはとんとまたはまった＜シチ答しなかった。

Ｃ，ヒト神経カルシウムチヤンネルα２および／またはβ１ザブユニットをコー トする転写体を注入した卵母細胞の解析α５８、α、そしてβＩサブユニットを コートする転写体を同時注入した卵母細胞中で検出される内部バリウム電流への α１８、α、サブユニットの寄与を評価するために、ヒト神経カルシウムチャン ネルサブユニットα２および／またはβ。

サブユニットをコートする転写体を注入した卵母細胞のバリウムイオンてを評価 した。α２サブユニツトをコードする転写体を注入した卵母細胞では内部バリウ ムイオンでは検出されなかった（ｎ＝５）。β、サブユニットをコードする転写 体を注入した卵母細胞は脱分極て、測定てきる（５４±２３ｎＡ、ｎ＝５）内部 バリウム電流を示し、α１およびβ、サブユニットをコートする転写体を注入し た卵母細胞は、β１をコードするＤＮＡのみの転写体を注入した卵母細胞で検出 されるものより約５０％大きな（８０±６１ｎＡ、ｎ−１８）内部バリウム電流 を示した。

β１サブユニットまたはα２そしてβ、サブユニットをコートする転写体を注入 した卵母細胞中の内部バリウム電流はまず、−９０ｍＶの保持電位から一３０ｍ Ｖに脱分極された時に典型的に観察され、膜が１０から２０ｍＶに脱分極された 時ピークに達した。マクロ的にはα、とβ１サブユニソ１〜をコートする転写体 またはβ１サブユニノＩ−をコートする転写体を注入した卵母細胞中の電流は区 別できなかった。α１９、α２そしてβ１サブユニツトｃＤＮＡの転与体を同時 注入した卵母細胞中の電流に比較して、これらの電流は試験パルスの間有意の不 活性化を示し、保持電位に対して強い感受性を示した。α２およびβ１サブユニ ットをコートする転写体を同時注入した卵母細胞中の内部バリウム電流は、通常 １４０　ミｌ）秒のパルスの間ピークの強さの１０−６０９６に不活性化され、 α１゜、α２そしてβ、サブユニットをコートする転写体を同時注入した卵母細 胞中におけるよりも保持電位に対して存意に感受性が強がった。α、とβＩサブ ユニットをコードする転写体を同時注入した卵母細胞の膜の保持電位を−９０か ら一５０ｍＶに変えると、これらの細胞の内部バリウム電流の強さが約８１％（ ｎ＝１１）低下した。

これに対してα１９、α２そしてβ、サブユニットをコードする転写体を同時注 入した卵母細胞中で測定された内部バリウム電流は、保持電位を−９０がら一５ ０ｍＶに変えると約２４％（ｎ−１１）低下した。

α２とβ１サブユニットをコートする転写体を注入した卵母細胞で検出される内 部バリウム電流は、α１１１．α、そしてβ１サブユニットをコートする転写体 を注入した卵母細胞で認められるものとは薬理学的に区別することかできた。α ２とβ１サブユニットをコートする転写体を注入した卵母細胞は、Ｂａｙ　Ｋ８ ６４４に非感受性の内部バ１１ウム電流を示した（ｎ＝１１）。ニフェジピンの 保持電位感受性とα、とβ１サブユニットをコードする転写体を注入した卵母細 胞中て観察される電流のｔ−め、ニフェジピン感受性を測定することかできなか った。

しかしα、とβ、サブユニットをコードする転写体を同時注入した２つの卵母細 胞は、−５０ｍＶの保持電位から脱分極されると測定可能な（２５ｋａｒａ４５ ｎＡ）内部バリウム電流を示した。これらの電流はニフェジピンに対して非感受 性であった（５から１０μ帽。α２とβ、ザブユニットをコートする転写体を注 入した卵（’Ｊ−細胞の内部バリウム電流は、重金属に対してα１ｏ、α２そし てβ、サブユニノ１−をコートする転写体を注入した卵母細胞中で検出される電 流と同し感受性を示した。

ヒト神経α２とβ１サブユニットをコートする転写体を注入した卵母細胞で検出 される内部バリウム電流は、セノブスラエピス（ＸｅｎｏｐｕｓＩａｅｖｉｓ） 卵母細胞のカルシウム電流に似た薬理学的および生物物理学的性質を有する。こ のヒト神経カルシウムチャンネルβ１サブユニットは膜通過ドメイシを作成する ことかできる疎水性部分を欠如しているため、組換えβ１サブユニットのみかイ オンチャンネルを作成する可能性は低い。卵母細胞には均一な内因性のαＩサブ ユニットか存在し、そのようなα、サブユニットに介在される活性はヒト神経β 、サブユニットの発現により増加する可能性かより大きい。

本発明の範囲を逸脱することなく、本発明を少し具体的に、当業者には明かな修 飾をＩＪＩ＋え説明してきた。そのような修飾は当業者に明らかであるが、本発 明は付随する請求の範囲にのみ限定される。

配列リスト （１）一般的情報 ■）出願人・バーボルト、ミッチェル（Ｈａ　ｒ　ｐｏ　Ｉ　ｄ、　Ｍｉ　ｃｈ ａ　ｅ　ｌ）エリス、スチーブン（ＥＩ　Ｉ　ｉｓ、５ｔｅｖｅｎ）ウィリアム ス、マーク（Ｗｉ　ｌ　Ｉ　ｉ　ａｍｓ、　Ｍａ　ｒ　ｋ）フェルトマン、ダニ エル（Ｆｅｌｄｍａｎ、Ｄａｎｉｅ＋）マキュー、アン（ＭｃＣｕｅ、Ａｎｎ） ブレナー、ロハート（Ｂｒｅｎｎｅｒ、Ｒｏｂｅｒｔ）２）発明の名称　ヒトカ ルシウムチャンネル組成物および方法３）配列の数・２１ ４）通信用住所。

（ａ）受信人　ツイツチ、エーブン、タビンとフラネリー（Ｐｉｔｃｈ、Ｅｖｅ ｎＳＴａｂｉｎ　＆　Ｆｌａｎｎｅｒｙ）（ｂ）ストリー１−　：　４２５０エ グゼキユテイブスクエア、スィート５１０（４２５０Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ　５ｑ ｕａｒｅ、５ｕｉｔｅ　５１０）（ｃ）市　ラホイヤ（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ）（ｄ ）州・カリホルニア （、ｅ）郵便番号　９２０３７ ５）コンピューターで読まれる型・ （ａ）媒体のタイプ、フロッピーディスク（ｂ）コンピューター：ＩＢＭＰＣコ ンパチブル（Ｃ）オペラーティングシステム：　ＰＣ−ＤＯ３／ＭＳ−ＤＯ３（ ｄ）ソフトウエア：バテンｉ・インリリース（Ｐａｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ ）＃ｌ　Ｏ、バージョン＃ｌ　２５ ６）現在の出願データ （ａ）出願番号・ （ｂ）出願口・ （ｃ）分類 ７）先行出願データ： Ａ＾＾＾στ入八ＣｃｃＴへＭＧｋＡＴＣＣａＧＣＡＣ？ＴＴＴＣＡＴＣＣ’Ｔ ｅＴＡｅＪＩＡＧＧｋＴ３７０２ｂ７諮５ｅｔＡｓｎＰｒｏＧｌｕＧＬｕＣｙ− ＾ｒｇＧＡＹ！ＪｌｌνｈｓＫｌｅＬ−ｕＴｙｒＬｙ−＾粛ＰＧＧＯＧＡＴ　（ Ｔ＋ｒＧＪＩ（：　ＡＧＴ　ｃｃＴ　Ｇ’ｒＯにＴＣＱＴ　（ＪＬＦＩ　ＱＸＩ 　Ａ１Ｃｍ　ＣＮＩＩ　ＭＣＭ丁　３７５O ｃｌｙ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ａｒｑ　 Ｇｌｕ　ｋｑ　Ｉｌｌ　丁ｒｐ　Ｇｉｎ　Ａｊｎ　８＠ｔ１０６５１０］Ｄ１０ フ５１０！１０ ＧＴＣＴＣＣＡｃｅｍＧＡＧ（ｊｌ；ｌ：丁＋１ＪＣＣ丁ＣＣｅｍＣ”ｆｌｌ＋ ＴＡＴＭＡｇＡＴＣ（ＩＡｃ３８４６Ｖａ１．Ｂａｔ　丁ｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ 　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　ｔａｕ　ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　ＡＬａ 　Ｘｌｅ　＾叩１１００、ｔｌＯ５ｌユｌＯ ＧＡＡ　丁＾Ｃｃｃｃ　テ↑Ｇ　入ｋＡ　ＧＣｋ　ＣＣＶ　ＣｃＣ丁ＴＧｃｃ４ 　＾Ｇ入τｈｃ　ｋＴｃ　ＣＣＣλλ＾　八＾ｅ　４０Ｂ６Ｃ１，ｕ　Ｔｙｒ　 Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｌｙ−ＡＬａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ１　Ａｒｇ＾ｒｇ　Ｔ ｙｒ　ＸＬ＠Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ１１１１０　ｋｉｌｌｓ　１１９Ｇ ＣＣＣ丁＾Ｃ（ＪＧ　丁ＡＣＭＧ　ｆｆｃ　ＴＧＧ　ＴＡＣＧ’ＴＧ　（ｍ　Ｍ ｅ　ＴＣＴ　’ｆ’ｃｃ　（：ｆｆｌ　ＴＴｅ　ＧＪｕ　４P３４ Ｐｒｏ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｌｙｅ　Ｐｈ＠　Ｔｒｐ　Ｔｙｔ　Ｖａｌ　 Ｖａｌ　Ａｓｎ　８＠ｒ　Ｂａｔ　Ｐｒｏ　Ｐｈ＠　０１ｕ丁＾Ｃ丁へＣＡｍ　 丁Ｔ丁　ＧＴＣＣＴＣＡＴＣＡＴＩｆｆ　ＣＴＣＭｅ　入Ｃ＾　ｅｙｅ　テＧＣ ？ＩＹ＋　ＧＣＣ１τＧ　４１１１２τｙｒ　Ｍ＠仁胸ｔ　Ｐｈｓ　Ｖａｌ　ｌ Ｊｕ　ｌｌｅ　）ｌｅｔ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｔｈｅ　Ｌａｕ　Ｃｙｓ　Ｌａｕ　 Ａｌａ　ＮｅｔｅＡｏＣＡＣ丁ＡＣＧＡＧＣＪｋＧＴＣＣＡＡＧＡＴ１７ｍＡＡ ？ＧｋＴＯＣＣＡ’ｌＴ＋ＣＡＣＡｆｆＣＴＣ４２３０Ｃ１ｎ　Ｈｉｓ　Ｔｙｒ 　Ｃ１ｕ　Ｇｉｎ　Ｓａｒ　Ｌｙｅ　Ｈａ乞　Ｐｈａ　Ａｇｎ　Ａｓｐ　Ａ１１ 　属−七　Ａ＠Ｐ　ＩＩ・　Ｌ・ＵＡＡＣＩ１ｍＧＴＣＴ丁ＣＡＣＣＧＧＧＧＴ Ｇτ丁Ｃ為ＣＣａ丁ＣＧ＾Ｃ＾丁ＧＧ丁Ｔ丁τＧ＾ＡＡｍ４２フ８ｋｌｎ　Ｍｅ ｔ　Ｖａｌ　Ｐｈ＠Ｔｈｒ　Ｃ１ｙ　Ｖａｔ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ 　Ｍｔ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　Ｖａ１＾丁ＣＧＣＡ　ｍ　ＡＡＧ　ＣｃＴ　 ＡＡＧ　ＧＧＧ　７１　丁Ｔ？　ＡＧＴ　ＧＡＣＧＣＣＴＧＧ　ＭＣＩＩｃＧ　 ｆｆＴ　４３２６１１−　ＡＬａ　ｔｈ＠　ＬＹ＠　Ｐｒｏ　ＬＦ　Ｇｌｙ　Ｔ ｙｒ　Ｐｈ＠　Ｓａｒ　ｈｏｐ　Ａｌｅ　Ｔｒｐ　Ａｓｎ　Ｔｈｅ　Ｐｈｅ１２ ６０１２６５１２フ０ ＧｋＣＴｅＣＣ’ＴＣＡＴＣＧＴＡ　Ａｔｅ　ＧＧＣＮ３ＣＡＴＴ　ＡＨＡ　Ｃ ＪｋＣ０τＧ　ＣＣＣＣＴＣＩＩＧｃ　ＧＡＡ　４３７４＾ｍｐ　Ｓｅｔ　Ｌａ ｕ　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ｈｌｍ　Ｇｌｙ　ｓｅｒ　ＩｌｌＩｌｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ 　Ａｌａ　ＬＪｕ　Ｓｅｒ　ＧｌｕＣＡＧ　ＣＣＴ　ＣＯＣｌ　ＣＴＧ　（ａ； 　ｍ　ＧＧＧ　ＡＡＧ　ＴｒＡ　ＴＧＴ　ＣＣＡ　ＣＡＣＡＧＯＧ丁八　ｃｃｃ 　丁ＧＣ５０９■ ｃｌｎ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｃ１ｙ　Ｐｈ＠Ｇｌｙ　Ｌｙｅ　Ｌｅｕ　Ｃ ｙｓ　Ｐｒｏ　ＦＩＬｓ　ｋｔｑ　ｖａｌ　ＡＬａ　Ｃ１ｍ（ａ　ｋＧＴ　ＯＸ ？　Ａ（ｆｆ　ＧＡＧ　ＡＡＦＩ　ＣＱｌｉ　ＣＴＴ２　ｍ　ＣＣＴ　ＣＣＡ　 ＧＣＡ　ｌｌ＋ｃＡ　Ｍｔ　ＴｅＧ　（FＴＧ　５７１８ ＾＞ｓ　Ｓｉｒ　入ｓｐ　テｈｒ　Ｏｌｕ　Ｌｙｅ　Ｐｒｏ　Ｌｓｕ　Ｐｈｓ　 Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　ＡＬａ　Ｇｌｙ　Ａｇｎ　Ｓｎｒ　Ｍａ１１フ２５１７３０１ ７３５ ’ｉ丁　ＣＡＴ　入＾ＣＯτ　ＣＡＴ　ＭＣＣＡＴ　Ａへテ　ＴＣＣＡ’ｒＡ　 ＧＧＡ　＾＾ａｃ入＾　ＧＴτ　ｃｃｃ　ＡＣＣＳフロロＣｙｌＲＬ＠へ−ｎＩ ｌｌｓＩｌｌｓ＾嘗ｎＢＬ−八−ｎＳａｔＸｉｓＣｌｙＬｙｓＣｌｎＶａｌ）’ ｒｏ丁ｂｒ１フ４０１フ４５１１５０ ＴｆＡ　ＡＣＡ　Ａ＾テ　ａｃｅ　１３丁　（？ｅ　＾ＡＴ　＾＾ＴＯＣＣへ＾ 丁　ＡＴＯＴＣＣＡＡＡ　００丁　ＧＣＣＣＡＴ　５８１４Ｓ＠ｒ　Ｔｈｃ＾ｓ ｎ　ＡＬａ　Ｍｎ　Ｌａｕ＾卸＾１ｎ＾１ｍ　Ａｗｎ　Ｍａｔ　Ｓｉｒ　Ｌｙｍ ＾１暴＾１ａ　）Ｉｔｓ１７５５　１７６０　１フロＳ にａ　ＭＧ　ｄ　ＣＣＣＡＧ（：　Ａ？’？　ＧＣＣＡＡＣＣｅＴ　ＣＡＧ　Ｃ ＲＴ　ＧＴＧ　ＴＣＴ　ＧＡＡ　ＡＡ丁　ＧＧＧ　５１１６Q Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　３１１（ＸＬ＠　Ｇｌｙ　入ｓｎ　Ｌａｕ　 Ｇｌｕ　ＲＬ嘗　Ｖａｌ　ｓｕｒ　Ｃ１ｕ　Ａｓｎ　Ｇｌｙニア７０　ニア〕Ｓ 　１７８０ ＣＡＴ　ｅＪＴ　ＴｃＴ　ｉＣＣｃＡＣＡＡＧ　ＣＡＴ　ＧＡＣｇ　ＧＡＧ　ｅ ｌｍ　ＣＡＯＡＣＡ　＾ＧＧＴＣＣＭ：Ｔ　５９１０）ＩｔｓＲ１ｓＳａｔＳｉ ｒＨ１ｓＬｙｓＨｉ＠入ｍｐ＾ｒｑＧＬｕＩ’ｔｏＧＬｎＡｒｇｋｒｑＳｅｔＳ ｅｒ１７８５１７９０１フ９Ｓ１８００ ＯＡ？　０）ＩＡ　ＣＡＧ　ＣＴＣＣｅ１ｌλＣＴ　ＡＴＴ　ｆｉｃ　ＣＧＧ　 ＧＶ　ＣＡＣＣＣＡ　ＧＡＧ＾ＴＲＣＡＴ　ＧＧＣ６００６＾＠ｐ　Ｇｌｏ　Ｇ ｌｒ＋　Ｌｅｕ　ｐｒｏ　Ｔｈｒ　ＩＩｓ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　（ｌｌｕ　ｈｏｐ 　Ｐｒｏ　Ｏｌｕ　Ｈｌｍ　Ｈｌｍ　Ｇ撃■ １８２０　１８２Ｓ１１１１０ ！Ａ？　ｍ　ＡＧＧ　ＧＡＣＣＣｅ　ＣＡＣＴＣＩＣＴＴＯａａａ　ａｐ＋ａ　 ｃ＾ＧＧ＾りＴｈｉττＣ＾Ｇ１”１０丁　６０５４Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ｋｘｑ　 Ａｓｐ　Ｐｒｃ＋　Ｈｌｓ　Ｃｙｓ　ｌＪｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ 　Ｔｙｒ　Ｐｈａ　Ｓｕｒ　５ｓ■ １８３５　１８４０　１８４Ｓ ＧＡＧ　ＯＡＡ　ＴｃｃＴａｌｅ　ＧＡＧ　０ＩＬＴ　ＧＡｅ　ＡｌｌＩＣｍ　 Ｃｆｆ１　Ａ（Ｎ：　ＴＷ　ＡにＣＡＧＯＣＭ　ＪＬＪＷ　U１Ｇ２ ０１ｕ　Ｃ１ｕ　（”７１　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｇｐ　ｈｏｐ　Ｓａｒ　ｊａｒ 　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　丁ｒｐ　１ｉａｒ　Ａｒｇ　Ｇｕｎ　Ａ唐秩{ １８５０°　１８５５　１Ｂ６０ 丁ＡＴＧＯＣＴＡＣＴＡＣＡＧＣ＾Ｇ＾丁＾ＣＣＣＡＧＧｅＡ（ＩＡＡＡＣＡＴ ＣＯ＾ＣτＣ？Ｇ＾Ｑ＾ＧＧ６１５０？ｙｒ　Ｇｕｙ　Ｔｙｔ　Ｔｙｒ　ｓｅｒ 　Ａｒ９　テアｒ　Ｐｒｏ　（＋１７　Ａｒ９　Ｍ＋ｔ　Ｉｌｌ　ｈｏｐ　Ｓａ ｒ　Ｇｌｕ　Ａｒ■ １８６５Ａｌｌフ０．１８７５１１１１１０ＣＣＣＣＣｊｌ　ＧＧＯＴＡＣＣＡ Ｔ　（ＪＴ　ＣＣＣＣＡＡ　ｌＸ１Ａ　ｆｆ１ｃ　ＴＴＯＧＡＧ　ＣＡＣＯ＾’ ｒ　ＧＡＣＴＣｌｆｆ　U１９Ｂ Ｐｒｅ　賞ｔｑ　Ｇｌｆ　Ｔｙｒ　Ｈｌｍ　Ｈｌｍ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｏｌｙ　 ｔｈ＠　Ｌ・ｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　ｈｏｐ　Ａｗｐ　５ｅｔ１１１！ｌ’ｉ　） １１９０　１１１９５（ＭＩＮＩ！Ｇ丁丁テＯＣＴ八丁ＯＡτへＣＡＣＧＣＡＧ ＩＩ丁ＣτＣＣ＾＾ＣＣ＾Ｇ＾Ｃｃｅｅτ＾ＣＴＡＣＣ丁６２４６１’ｒｏ　Ｖ ａ１ｅｙ１Ｔｙｒ＾ｍｐ　Ｓｓｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｓｅｔ　Ｐｒｏ＾ｒｇ　ｈ ｒｑ＾ｒｇ　ｔａｕ　Ｉａｕ　Ｐｒ。

ＣＣＣＡＣＣＣＣＪ　ＣＣＩ’ｌ　Ｗ　ＣＡＣＣＧＧ　Ｍ＾　ＴＣＣ丁ＣＣ丁Ｔ ｃ　ＡＡＣ丁τテ　ＣＡＣ丁ａｃｅテ０　６２９４１’ｒｏ　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　 ＡＬａ　Ｓｅｒ　ＩＬｓ　Ａｒｇ　Ａｒｑ　Ｓａｒ　’５＠ｒ　Ｐｈ＠　Ａｇｎ 　Ｐｈａ　Ｃ１ｕ　Ｃｙｓ　ｘ≠煤{ ＣＣＣＣＭ　ＣＡＣＡＣＣ＾ａＣＣ＾ＧＧ＾＾　Ｇ＾ＧＧ冗　ＣＣり　ＴＣＧ　 ＴｃＴ　ＣＣＣ＾丁ＣＴｆＣＣＣＣ６３４２ｋｒｑ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｓｕｒ　 Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｃ１ｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｉ’ｒｏ　Ｓａｒ　５＊ｒ　Ｐｒｏ 　Ｉｌ会Ｐｈｓ　Ｐｒ。

１９３０　１９］Ｓ　１９４０ ＣＪＴＣＧＣ＾Ｃ０ＧＣＣＣ丁ＧＣＣＴＣＴＧＣ八τＣ丁＾Ａ丁ＧＣ＾ＧＣ＾＾ Ｃ＾Ｇ＾丁ＣＡπＧＣ＾６３９０）Ｉｉｓ＾Ｆ９　Ｔｈｒ＾ｌａ　ｔＪｕ　Ｐｒ ｏ　Ｌｅｕ　Ｉｌｌ　Ｌａｕ　Ｍｅｔ　Ｇｉｎ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ｉｌｅ　Ｍｅ ｔ＾１１ＧＴ丁ＧＣＣＧＧＣＣ７Ａ　ＧＡＴ　ＴＣＡ　ＡＧＴ　ＡＡＡ　ＧＣＣ ＣＡＣＡＡＣ丁＾Ｃ丁Ｃ＾　ＣＣＣＡＧＴ　ＣＡＣ６４３８ＶａＬ　Ｒｌａ　Ｇ ｌｙ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｓｉｒ　５ＩＩｒ　Ｌｙｓλｌａ　Ｇｉｎ　Ｌｙｅ　Ｔ ３＋ｒ　Ｓｅｔ　Ｐｒｏ　５＊ｒ　Ｈｉ■ １９６５２９７０１９フ５ ＴＣｆｌＡＣＣＣＧＧテＣＧＴＧＧＧＣＣＡｃｅｅｃ丁ＣＣ八〇Ｃ鳥ＡＣＣＣＣ へＣＣＣＴ＾ｃｃｃｃａ＾Ｃ６４８６Ｓ＠ｒ　Ｔｈ【　Ａｔｑ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ 　ＡＬａ　Ｔｈｒ　ｐｒｏ　Ｉ’ｒｏ　へ１１丁ｈｒ　ｌｒｏ　ｌ’ｒｏ　Ｔｙ ｒ　八ｒ９　＾８■ 世＾Ｏαｎ　’ｌ’ｃｃ　ＴＡＣＡＣＣＣＣ’ＣＧＴＯＡＴＣＣＡＡ　Ｇｌ’Ｎ 　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ｍ　ＧＡＧ　ＧＣＣ６５３４ＴｒｐＴｈｒ　Ｉ’ｔｏ　ｃｙ ｓ　ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　スｌａ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｉ ｎ　Ｓｓｒ　Ｇｌｕ　＾ｌ＾１９９５　２０００　２００％ ０１ＯＡＣＣＡＯ（ｍ　ｊｌＪｌｅ　１ｊｔＡＧＣｅ？ｏ　０００　ＴＣＣｅｒ ＣＣＪＣＣＣＣＡＣＣＷＴＯＧ　６５８２しｌ＾＠Ｐ　ＧＬｎ　Ｖａｔ＾−ｎ　 Ｇｌｙ　ｓｅｔ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　ｓｅｚレーＨＬｓ　Ａｒｇ　５ｌｌｒ　Ｂｅ ｔ　Ｔｒｐ丁＾Ｃ丁へＧ＾ＣにＡＧＣＣＣＧＡ（：ＡＴＣＴＣＣ丁ＡＣＣＯＧＡ Ｃ７ＴＴＣ＾ＣＡＣＣＡＣＣＣＡＧＣ６６３０Ｔｙｒ丁ｈｅＡ＠ｐＧＬｕＰｔｏ ＡｓｐＩｌ＠Ｓｅｒ丁ｙｒ＾ｒ９丁ｈｒＩ’ｈｅ丁ｈｒＰｒｏＪｕａｌｌｅｒＣ ＯＧ＾ＣＴ　ＧＴＣＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣｃｃｃＡＡＣＡＡＡ　ＡＡＣＡＧ ＣＧ＾ＣＡＡＯＣＡＧ　ＡＧＧ　６６７８Ｌ＠ｕ　Ｔｈｅ　ＶａＬ　Ｐｃｏ　Ｓ ａｒ　Ｓａｒ　Ｐｈ−八ｒｇ　ｈｓｎ　Ｌｙ−Ａｇｎ　８畿ｒ　入−ｐ　Ｌｙｅ 　Ｃ１ｎ　＾ｒ９２０４５　２０５０　２０１％ ＡＣｍＡＣＡ丁＾　＾ｃｘｃ＾＾丁＾ＴＣ丁へＣフロ３５（２ン配列ＩＤ　Ｎｏ 、２の情報・ ｌ）配列の特徴 （ａ）長さ：１０４塩基対 （ｂ）型、核酸 （ｃ）鎖−２本鎖 （ｄ）形態、線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） ４）特徴 （ａ）名前／キー：　ＣＤ５ （ｂ）位置：１．、ＩＯ２ ４）特徴・ （ａ）名前／キー・種々の特徴 （ｂ）位置：１．．１０４ （ｄ）他の情報　注意＝“Ａ　１０４−ヌクレオチｌ’アルファＩＤの別のエク ソン” ６）配列記述　配列ＩＤ　Ｎｏ、２ （２）配列ＴＤ　Ｎｏ、３の情報− １）配列の特徴： （ａ）長さ　５９０４塩基対 （ｂ）型　核酸 （ｃＨＪｌ：１本鎖 （ｄ）形態　線状 ２）分１の型　ＤＮＡ　（ゲノムン ４）特徴 （ａ）名前／キー　ＣＤ５ （ｂ）位置　１．．５９０４ ６）配列記述　配列ＩＤ　Ｎｏ、３： ＧＧＴ丁ＣＣ＾＾ＣＴｋＴＧＧＧＡＣＣＣＣＮｃｃＣＣＣＣＧＣＣＣＡＴＧＣＣ ＭＣ＾丁ＧＡ＾？ＧＣＣ９６ＧＩＹ　Ｓｅｒ＾ｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃ１ｙ　Ｓｅｒ　 Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ＾ｌａ　Ｈｉｓ　Ａｌａ　Ａｓｎ　１ｍｔ　Ａｓｎ　Ａ ｌａ２０２５コＯ ＾ＴＯＧＯＣＡＣＣＧＣＴＧＧＣＡＡＴＧＣＧＡｃｔ：Ａ丁ｃｒｃｃ＾Ｃ＾σＴ ＣＭＣ？ＣＣＡＣＧＣＡＧ２４０ＭｅｔＧｌｙＳ＠ｒＡｌａ（：ＬｙＡｓｎλ１ ａＴｈｒＩｌ＠５ａｒＴｈｒＶａｔ釦ｒｇｅｒ丁ｈｒＧｉｎ６！＋７０　７５　 １１０ ＣＸＡ　ＡＡＧ　ＣＯＣＣＡＧ　ＣＡＡ　ＴｈＴ　ＧＧＣ＾入Ａ　Ｃ’ｅＣＡＡ Ｇ　ＡＡＧ　Ｃｌｌ＋Ｇ　（：ＯＣＡＧＣＡｃｅ　ＡＣＯ２P１１１ 人ｒｇ　Ｌｙ−八ｒｇ　Ｇｉｎ　（ｉｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｙ　ＬＦ　Ｐｒｏ　Ｌｙ ｅ　ＬＹ＠　Ｇｉｎ　ＧＬｙ　ｇｓｒ　Ｔｈｒ　ＴｈｒＩＩ５　９０　９５ （２）配列ＩＤ　Ｎｏ、４の情報。

１）配列の特徴 （ａ）長さ、１３２塩基対 （ｂ）Ｉ’＋２　核酸 （ｃｕｌｔ：２本鎖 （ｄ）形態・線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） ６）配列記述　配列ＩＤ　Ｎｏ、４ （２）配列ＴＤ　Ｎｏ、５の情報。

ｌ）配列の特徴 （ａ）長さ　８９塩基対 （ｂ）型　核酸 （ｃ）鎖　２本鎖 （ｄ）形態　線状 ２）分子のヘラ　ＤＮＡ　（ゲノム） ６）・配列記述　配列１［Ｎｏ、５ （２）配列ＩＤ　Ｎｏ、６の情ｔし １）配列の特徴 （ａ、）長さ　８４塩基対 （ｂ）　’Ｓツ　核酸 （ｃ、）ｊｎ：２本鎖 （ｄ’）旧管　線状 ２）分子のヤ　ＤＮＡ　（ゲノム） ４）特徴： （ａ）名前／キー　ＣＤ５ （ｂ）位置　１　８４ （ｄ）他の情報・注意＝“アルファＩＣの別のエクソン”６）配列記述　配列Ｉ Ｄ　Ｎｏ、６： （２）配列ＩＤ　Ｎｏ、７の情報 １）配列の特徴 （ａ）長さ　７６６２塩基対 （ｂ）型　核酸 （ｃ）ｔｌｔ：２本鎖 （ｄ）形態　線状 ２）分子の型　ＤＮＡ　（ゲノム） ４）特徴。

（ａ）名前／キー　ＣＤ５ （ｂ）位置：１４４．．７１６３ ４）特徴 （ａ）名前／キー−５’ＵＴＲ （ｂ）位置　１．、Ｉ４３ ４）特徴・ （ａ）名前／キー　３’　ＵＴＲ （ｂＣ位置　７１６１．．７３６２ ６）配列記述、配列ＩＤ　Ｎｏ、７： α工Ｃα：ａｃｃｃ　ｅｒｃαｔαＨＴ　＋５０ｃＱａｃ　Ｗ　！　ｆｌ　６０ Ｇｃ７３６２ （２）配列ＩＤ　Ｎｏ、８の情報・ ｌ）配列の特徴。

（ａ）長さ　７１７５塩基対 （ｂ）型　核酸 （ｃ）鎖＝２本鎖 （ｄ）形態−線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） ４）特徴： （ａ）名前／キー　ＣＤ５ （ｂ）位置：Ｉ４４．．６８５７ ４）特徴： （ａ）名前／キー　５’　ＵＴＲ （ｂ）位置：１．、Ｉ４３ ４）特徴： （ａ）名前／キー　３’　ＵＴＲ （ｂ）位置：６８５５．．７１７５ ６）配列記述・配列ＩＤ　Ｎｏ、８： ＣＣＣＣＭ　ＧｃｃＧＴＣＧＡＣＣＣ？　（ＩＣｏ　ＣＩｌ＋ＣＡＯＧ　ＣＡＣ Ｃｌ１ｋＣ（ＩＣＯＣＡＣＣｌ　ＯＡＣＩＩＡＯ２７１４Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｇｌ ｙ　Ｖｌｌｌ　ＭＰ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　）ｕｓ　Ｈｌｓ　Ａｒ ｇ　ＩＩＬｓ　Ａｒ９ｕｐ　ＬｙｅＧＡＣＡＩＩＩＧＡＣＣＣＣＣＧＣＧＧＣＧ ＧＧＧＧｋＣＣｊｌＧＯＡＣ０１；ＡＧＣＡＧＷＧＣＣＣＣＯＡ＾Ｃ２フロ２＾ 叩　Ｌｙｓ　丁ｈｒ　Ｐｒｏ　＾１龜＾１ａ　Ｇｌｙ　Ｍｐ　Ｏｌｎ　Ａｊｐ　 Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｙ：ｏ　ＬｙｓＧＣＤ　ＧＡＧ　八〇〇　 ＣＧＧ　０１Ｍ２　ＯＮ：　ＧＯＴ　＋ｌｅｅ　ＣＧＧ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＣＯ Ｇ　ＣＯＣ０１４ＣＱｉ　ＣＡＣQ１１１０ ＾１ｍ　Ｇｌｕ　Ｂａｒ　Ｃ１ｙ　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｙ　Ａｌａ　Ａｒｇ　 Ｃ１ｕ　Ｇｌ＋＋　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　）ｌ奄■ ８１５　８８０　１ｉｅｓ αｉｃ　ＡＧＣＣＡＣＡＧＣＡＡＧ　ＧＡＧ　Ｇｅｅ　Ｇ閃Ｇωα℃α℃ＧＡＧ Ｇ国αＧ＾閣Ｃ騙　２８５８Ａｒｇ　Ｓ＠ｒ　Ｈｉｓ　Ｓ＠ｙ：　Ｌｙｅ　Ｇｌ ｕ　ＡＬａ　Ａｌｅ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　ｋｑ　Ｓｅｒ 　（ｆｌ■ １１９０　８９５　９Ｃ）０　９０５ α；ｃ　ｃｃｃ　国＾ＧｃｃＣＣＡ　ＧＧＣＣＯＯＧＩＩＣ（、ＧＣＧＧＣＣ４ ＣＧＧ　ＣＡＣＣＡＣＣＯＯ（！　２９０６Ａｒｇ　（ｌｙ　Ａｒｇ　Ｇｕｙ　 Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　ＧＬｕ　Ｇ１．ｙ　Ｇｌｙ　Ａｚｇ　Ａｒｇ　Ｈｌｓ 　ＦＩＬｓ　ｋｇ　Ａｒ■ αｉｃ　ＴＣＣＣＣ１１＋　ＧＡＧ　ＣＸ：　ＧＣＭ　ＧＣＸ：　ＧＫ　Ｃｆ、 ＧＭ　ＣＯＧ　０１本ＣＧＣＣＡｅ　ＣＣＣＧＣＱ　２９５S Ｇｌｙ　Ｓ＠ｒ　Ｐｒｏ　Ｃ１ｕ　Ｃ１ｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　 Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ｊｌｆ９　Ａｒｇ　）Ｈｉｓ　Ａｚ′ｑ　`ｌ畠 Ｃ７１ＣｃＬＡＣＡＣＣＡＧ　ＣＡＴ　ＣＣＧ　ＦＩＧＣＭＧ　ＣＡＧ　ＴＧＣ ＧＣＣＧｌｌ；ＣＧＣＣＡＡＧ　ＩＩＪｃ　ＯｋＧ　３００Q １１Ｌａ　ＪＬｒｑ　ＩＫＬＩ　ＧＬｎ　Ａｓｐ　ｉ’ｔｏ　５ＩＩｔ　Ｌｙｓ 　Ｇｌｕ　Ｃｌ魯　八１ｍ　Ｃ１ｙ　ｈＬａ　Ｌｙｓ　Ｇｌ凵@Ｇｌｕ ？Ｔ（：　Ｔ’ＣＣＡＴＯＧＡＡ　ＷＣＧＴＧ　ＣＴＧ　ｕＧ　ＡＴＣＡＴＣＧ ＣＣ’ｍ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＣＴＧ　ＭＣ４７３０Ｐｈ＠’ｇｓｒ　Ｋ＠ｔ　Ｇ Ｌｕ　Ｃｙｓ　Ｖａｔ　Ｌ＠ｕ　Ｌｙｍ　Ｘｉ＠Ｉｌ管八Ｌａ　へＭ　Ｇｌｙ　 Ｖａｌ　ｌａｕ　ｋｓｎ＾テＣ入Ｒｅ　ＣＴＣＡＣＣ丁Ｔｃ　ｃＴＣｃｃＣｌ： Ｔｃ　７７丁　ＣＧＡ　ＧＣ丁ＧＣＧ　ＣＣＱ　（”ＴＧ　ＡＴｅ　ＡＡｏ　４ １１V４ Ｘｉ＠　ｘｓｎ　ｔＪｕ　Ｓｉｒ　Ｐｈｅ　ＩＪｕ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　 ｋｔｑ　Ａｌａ　Ｊｕａ　Ａｒｇ　Ｌｌｌｕ　ＩＩｓ　Ｌｙ■ １５６５　１５７０　Ｉｓ〕５ ＣＴＧ　ＣＴＣＣＳＣＣＭ　ＧＧＣ？ＡＣＡｃｅ　ＡＴＣＣＹ；ＣＡＴＣＣＴＧ 　ＣＴＧ　ＴＧＧ　Ａ（’ＣＴＴＴ　ＣＴＣ４９２２Ｌ＠ｕＬ・Ｕ入ｒｇＧｌｎ ＧｌｙＴｙｒＴｈｔＩｌｅＡｒｇＸｌｅＬｅｕＬｅ＋ａτｒｐＴｈｒＰｈｍＶ蟲 １ＣＡＧ　ＭＣＩＩＡＡ　Ａ（ＩＪ：　Ａｃｅ　ＪＩＧＡ　ＧＡＣｃＡＧ　ＡＴ ＯＧＡＧ　ＣＡＧ　（ｉｃ’Ｆ　ＣＣ”Ｆ　ＧＧ＾ＧＧＣＣＴb５１Ｂ６ Ｇｉｎ　触ｎ　Ｌｙｅ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ａｊｐ　Ｇｉｎ　＋４ｅｔ　 Ｇｉｎ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｏｌｙ　Ｇｌｙ　１ａｖ１１１７０１８７ｓ １１１８０ ＱＣＣｒ、ＣＡＧＧ　ＱｈＣＡＣＯＡＩＩＩＧ　ＣＩＩＩＧ　Ａｌ１４　ＴＣＣ ｅ？１）ＧＡＧ　＾ＡＧ　（ｉＧＧ　ＣＣＣ：　＾ｅｃｃテO　６３６２ Ａｒｇ　Ａｒｇ　入ｒ９　＾ｓｐ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｏｌｎ　入ｒｇ　Ｂａｒ　 Ｌ＠ｕ　Ｇｌｕ　１．ｙｓ　Ｇｌｙ　ＰＴＯＩｌｉ＊ｒ　Ｌ≠■ ２０６０２０６５２０）〇 丁Ｃテ　ＧＣｅ　ＧＡＴ　ＡＴＣＧＡＹ　ＧＧｃＧＣＡ　ＣＣＡ　ＡＧＣＡＧＴ 　ＧＣＴ　ＧＴＧ　ＧＧＧ　ＣｃＧ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　６４P０ Ｓｅｒ　Ａｈａ　Ｍｐ　Ｍ＠ｔ　Ａ＠ｐＧｌｙ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　ｓ＠ｒ　Ｓｉ ｒ　Ａｈａ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｌａｕｃｃｅ（３）弱＾Ｇ届暢 ｃ１儲就〜３京Ｉ回Ｇ鮎国＾Ｇ＾Ｇ口Ｃ（９）　６４５８想、Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｕ　Ｑｌｙ　Ｐｒｏ、Ｔｈｒ　Ｏｌｙ　ｃｙ″Ａｒｇ　Ａｒｇ、Ｇｌｕ　Ａ ｒｇ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｒｇ５（２）配列ＩＤ　Ｎｏ、９の情報− １）配列の特徴 （ａ）長さ　１５４６塩基対 （ｂ）撃　核酸 （ｃ）鎖　２本鎖 （ｄ）　斤〉り！　線状 ２）分子の型　ＤＮＡ　＜ゲノム） ４）特徴 （ａ）名前／キー　ＣＤ５ （ｂ）位置　１．、Ｉ４３７ ４）特徴。

（ａ）名前／キー　３°ＵＴＲ （ｂ）位置：１４３５１．＋５４６ ６）配列記述　配列ＬＤ　Ｎｏ、９： （２）配列ＩＤ　Ｎｏ、１０の情報。

ｌ）配列の特徴： Ｃａ）長さ：ｌ８５１塩基対 （ｂ）型・核酸 （ｃ）＠：　２本鎖 （ｄ）形態二線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） ４）特徴： （ａ）名前／キー：ＣＤ５ （ｂ）位置・１．．１７９７ （ｄ）他の情報、標準名＝“ヘーター３”４）特徴。

（ａ）名前／キー　３’　ＵＴＲ （ｂ）位置　＋７９５．．１８５＋ ６）配列記述、配列ｒＤ　Ｎｏ、１０ （２）配列ＩＤ　Ｎｏ、ＩＩの情報 １）配列の特徴 （ａ）長さ　３６００塩基対 （ｂ）型・核酸 （ｃ）鎖　２本鎖 （ｄ）形態・線状 ２）分子の型　ＤＮＡ（ゲノム） ４）特徴・ （ａ）名前／キー　ＣＤ５ （ｂ）位置　３５．．３３１０ （ｄ）池の情報、標準名＝“アルファー２”４）特徴 （ａ）名前／キー、５°　ＵＴＲ （ｂ）位置　１．３４ ４）特徴− （ａ）名前／キー　３°　ＵＴＲ （ｂ）位置　３３０８．．３６００ ６、）配列記述　配列ＩＤ　Ｎｏ、ＩＩ？Ｃ１１ＴＣＴ＾Ｔ’ＴＧ　ＧＡＡＰＩ Ｊ１ｍ１ＡＧαγ門ｉワｉ℃’！”ｒＯｃ１１１？ｒＧＴｉＩＸＩＴ　３６００ （２）配列ＩＤ　Ｎｏ、１２の情報： １）配列の特徴。

（ａ）長さ　３２３塩基対 （ｂ）型、核酸 （ｃ）Ｍ・２本鎖 （ｄ）形態　線状 ２）分子の型　ＤＮＡ　（ゲノム） ６）配列記述：配列ＩＤ　Ｎｏ、１２：（２）配列ＩＤ　Ｎｏ、１３の情報： ｌ）配列の特＠： （ａ）長さ　５７塩基対 （ｂ）型　核酸 （ｃ）鎖−２本鎖 （ｄ）形態　線状 ２）分子の型：ＤＮＡ（ゲノム） ６）配列記述　配列ＩＤ　Ｎｏ、１３ ＣＣＴＡＴＴＧＧＴＧＴＡＧＧＴＡ？ＡＣＣＡＡＣＡＡＴｒＡＡＴＴＴＡＡＧＡ ＡＡＡＡＧＧＡＧＡＣＣＣＡＡＴＡＴＣＣＡＣ５７（２）配列ＩＤ　Ｎｏ、１４ の情報 Ｉ）配列の特徴。

（ａ）長さ、１８０塩基対 （ｂ）型・核酸 （ｃ）鎖・２本鎖 （ｄ）形態　線状 ２）分子の型・ＤＮＡ　（ゲノム） ４）特徴。

（ａ）名前／キー：　ＣＤ５ （ｂ）位置　１．．１３２ ６）配列記述・配列ＩＤ　Ｎｏ、１４・（２）配列ＩＤ　Ｎｏ、１５の情ｆＦｉ ・■）配列の特徴 （ａ）長さ　２２塩基対 （ｂ）撃　核酸 （ｃ）鎖　１本鎖 （ｄ）形態、線状 ２）分子−のへ！　他の核酸 （ａ）記述　オリゴヌクレオチド ６）配列記述　配列ＩＤ　Ｎｏ、１５ ＡＡＴＴＣＣＣ丁ＡＣ（ｉＴＡｃＡＣＴｃｃＡ　ＧＣ２２（２）配列ＩＤ　Ｎｏ 、１６の情報・ １）配列の特徴。

（ａ）長さ、１８塩基対 （ｂ）型・核酸 （ｃ）鎖・１本鎖 （ｄ）形態二線状 ２）分子の型　他の核酸 （ａ）記述二オリゴヌクレオチド ６）配列記述　配列ＴＤ　Ｎｏ、１６：（２）配列ＩＤ　Ｎｏ、１７の情報： １）配列の特徴・ （ａ）長さ：２０塩基対 （ｂ）型：核酸 （ｃ）鎖、１本鎖 （ｄ）形態二線状 ２）分子の型：他の核酸 （ａ）記述　オリゴヌクレオチ１〜 ６）配列記述、配列ＩＤ　Ｎｏ、１７ ＣＣＡＴＧＧＴＡＣＣＴｒＯｌ；Ｔ１’ＧＡＣＣ２０（２）配列ＩＤ　Ｎｏ、１ ８の情報− １）配列の特徴。

（ａ）長さ、２４塩基対 （ｂ）型・核酸 ＜ｃ）ｔ１本鎖 （ｄ）形感　線状 ２）分子のｌ１ｌｉ！　池の核酸 （ａ’）記述　オリゴヌクレオチド ６）配列記述　配列ＩＤ　Ｎｏ、１８ ＾ＡＴ’ＴＣＧＴＣＡＡＯＣＦＩＡＧＧＴＡＣＣＡｉＧＧ２４（２）配列ＩＤ　 Ｎｏ、１９の情報 １）配列の特徴 （ａ）長さ・２４９塩ｗ対 （、ｂ）型Ｆ９酸 （ｃ）シ１１２本鎖 （ｄ）形感　線状 ２）分子の型！：ｃＤＮＡ ６）配列記述　配列ＩＤ　Ｎｏ、１９ ＡＣＡＣ八ＡＡＴＧ　２４９ （２）配列ＩＤ　Ｎｏ、２０の情報 ｌ）配列の特徴 （ａ）長さ　４０２塩嗅対 （１））へＩ！　核酸 （ｃ　）　ｉ′ｌ：　２．−４＜鎖 （ｄｌしり　線状 ２）分「の％’！：ＣＤＮ△ ６）配列記述　配列ＩＤ　Ｎｏ、２（］ＣＣＡＣＣＴＡ（ＣＡ　ＣＧＣＧ胃国ｉ ＣＣＣＭＣＣＣＧＧＣＣＭＡＣＣＣＧＧＧＣＴＣＣＣＣＧ　ＧＴＧＧＣＣＧＣＣ Ｏ６０ＧＣｋＴＴＴＧＣＧＧτＧＡにＧＡＣＣＡＡＴＣ丁ＣＡＧＣＴ＾Ｃ丁ＧＴ ＧＧＣＧＴ＾ＣＴｌ１ｉＧ＾ＴＧ＾ＧＧｋＧ丁ＧＣＣＣ八ＧτＣ２S０ （２）配列ＩＤ　Ｎｏ、２１の情報 １）配列の特徴 （ａ　、）長さ　２８塩基灯 （１））梨　（ｋ酸 （ｃ）ｊｉ’ｉ：１本１１１ （ｄ）ＩＦう聾、線状 ２）分トの望　池の核酸 （ａ、）記述　すりコフクレオチＩ・ ６）配列記述　配列ＩＤ　Ｎｏ、２１ ＣＴＣＩＬＧτ＾ＣＣＡ　ＴＣＴＣＴＧ＾ＴＡＣＣＡにＣＣＣ（Ｊ　２８補正書 の写しく翻訳文）提出書（特陀第１８４条の８）平成６年１月１４日 ＃！ｊδ乍１１°長丁Ｖ　殿 １　特許出願の表示　ＰＣＴ／ＵＳ９２１０６９０３　・；３　特れ出顎入 者に公知の他のそのような方法（こうしてγサブユニットをコードする全長クロ ーンか単離されるかまたは作成される）によりプローブとして開示されるＤＮＡ を用いて単離され同定される。γサブユニットは、本発明に記載のＤＮＡと低緊 縮条件下でハイブリダイズするＤＮＡ、または本発明に開示されるγサブユニッ トと約４０％の相同性を存する蛋白をコードする充分な配列相同性を示すＤＮＡ によりコートされる。

従って上記を考慮して当業者は、α１、α１、β、δおよびカルシウムチャンネ ルサブユニット（異なる遺伝子によりコードされるタイプ、およびスプライス変 種であるサブタイプを含む）をコートするＤＮＡを同定することができる。例え ば本発明で開示されるＤＮＡに基づ＜ＤＮＡプローブは、適当なライブラリー（ ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを含む）とスクリーニングした り、全蛋白をコードする読み取り断片（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇｆｒｇｍｅｎ ｔ）を含有する１つまたはそれ以上のクローン中のＤＮＡを得るのに使用される 。適当なライブラリーを本発明で開示されるＤＮＡでスクリーニングした後、そ こからコードされる蛋白の配列か推定される読み取り枠（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎ ｇ　ｆｒａｍｅ）の存無について単離されたＤＮＡを試験する。分子量の測定と 本発明の配列との比較により、サブユニットの正体（例えばα１、α・２なと） か明らかになる。必要な場合は、サブユニットがα１サブユニツト、α２サブユ ニツトまたはβサブユニットであるか否かをめるのに、機能的測定法が使用され る。

例えばαＩＡをコートするＤＮＡは、整理番号７５２９３て寄託されたファージ から単離された、ヒトα、Ａサブユニットのすべてまたは一部をコードするＤＮ Ａで適当なライブラリーをスクリーニングすることにより単離される（配列ＩＤ Ｎｏ、２１に示される配列を存するオリゴヌクレオチドによるスクリーニングを 含む）。同様にβ、をコートするＤＮＡは、ＡＴＣＣ整理番号６９０４８で寄託 されたプラスミツドβ１４２から調製されるＤＮＡプローブ、または配列ＩＤＮ ｏ、１９および２０に示される配列に従い調製された配列を有するプローブブダ ペスト条約で公布された特許手続きと規制のための微生物の寄託の国際的認識に 関するブダペスト条約の条件に従い、αゆサブユニットをコードするＤＮＡを含 有する生物試料は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（米ｉ２０８５２メリ ーランド州ロツクビル、パークローンドライブ１２３０１）に寄託されている。

ブダペスト条約の条件および規則、そしてアメリカ合衆国および本出願または本 出願の優先権を主張する出願が提出されるか、またはそのような出願に対して特 許か認可される他のすべての国または国際組織の特許法および規則に従い、これ らを受け取る資格のある工業所有権事務所や他の人々は、寄託された物質の試料 を入手できる。

α１Ａサブユニツトは、大腸菌宿主株ＮＭ５１４中でα１．２５４と呼ばれるλ ｇｔｌＯファージ中の３ｋｂの挿入体によりコードされる。この物質のファージ 溶解物は、前述のようにＡＴＣＣ整理番号７５２９３でアメリカンタイプカルチ ャーコレクションに寄託されている。α１ＡサブユニツトをコードするＤＮＡは 、配列ＩＤ　Ｎｏ、２１を存するＤＮＡ：５’　ＣＴＣＡＧＴＡＣＣＡＴＣＴＣ ＴＧＡＴＡＣＣＡＧＣＣＣＣＡ３’から調製されるプローブてスクリーニングす ることにより同定される。

α’１１１ザブユニットヒトのカルシウムチャンネルサブユニッｌ−をコードす るＤＮＡの同定と単離 α１．サブユニットをコートするＤＮＡは、ヒトの脳底神経節ｃＤＮＡライブラ リーを、ウサギの骨格筋カルシウムチヤンネルのα１サブユニツトをコートする ｃＤＮＡてスクリーニングすることにより単離された。陽性クローンの１つの一 部を用いて１ＭＲ３２細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。脳底神 経節ＤＮＡプローブにハイブリダイズするクローンを用いて１ＭＲ３２細胞ｃＤ ＮＡライブラリーをさらにスクリーニングして重複するクローンを同定し、次に これを用いてヒトの海馬ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。こうして ヒトのα１．サブユニットをコートするヌクレオチド配列のほとんと全長にまた がる充分なシリーズのクローンか得られた。１ＭＲ３２細胞のα１．サブユニソ ｈｍ請求の範囲 １、　ヒトカルシウムチヤンネルのα１サブユニットをコートするヌクレオチド の配列よりなる。単離されたＤＮＡ断片。

２　α１サブユニツトはヒト神経カルシウムチャンネルα、サブユニットである 、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ断片。

３、　α、サブユニットはα１タイプのα１サブユニツト、α１ｃサブユニツト タイプのα、サブユニット、αＩＩ＋サブユニットタイプのα１サブユニツトま たはα、Ａサブユニットタイプのα１サブユニツトである、請求の範囲第１項に 記載のＤＮＡ断片。

毛　ヒトカルシウムチャンネルのα、サブユニットのスプライス変種をコードす るヌクレオチドの配列よりなる、単離されたＤＮＡ断片であって、α、サブユニ ットをコートする該ヌクレオチドの配列はまた、ヒトのカルシウムチャンネルの δもコートする。

５、ヒトのカルシウムチャンネルはヒト神経カルシウムチャンネル、ヒト骨格筋 カルシウムチャンネルまたはヒト大動脈カルシウムチャンネルである、請求の範 囲第４項に記載のＤＮＡ断片。

６、　α２サブユニツトは、配列ＩＤ　Ｎｏ、ＩＩに記載のアミノ酸をコードす るＤＮＡと配列ＩＤ　Ｎｏ、１１のヌクレオチド１６２４と１６２５の間に挿入 された配列ＩＤ　Ｎｏ、１３のＤＮＡを含有する一次転写体の別の処理により産 生される、請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ断片。

７、　α、サブユニノ１−はα２１、α２１、α２ｅｓα２２、またはα７．サ ブユニットである、請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ断片。

８、　ヒトのカルシウムチャンネルのβサブユニットをコードするヌクレオチド の配列よりなる、単離されたＤＮＡ断片。

９、　サブユニットはβ１またはβ、サブユニッｌ−である、請求の範囲第８項 に記載のＤＮＡ断片。

１０、βサブユニットは、配列ＩＤ’Ｎｏ、９に記載のアミノ酸をコードするＤ ＮＡを含有する一次転写体の別の処理により産生されるが、配列ＩＤ　Ｎｏ、９ 国際調査報告 １、ｌｔｍ＃１１Ｍ６１Ａｕ１１．ｌ１ＭＮ＆　ＰＣＴ／ＵＳ　９２１０６９０ ３国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０２　 Ｃ８２１４−４Ｂ／／（Ｃ１２Ｐ　２１１０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＭ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ，ＳＮ、ＴＤ 、ＴＧ）、ＡＴ、ＡＵ、ＢＢ、ＢＧ、ＢＲ，ＣＡ、ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、Ｅ Ｓ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、　Ｉ、Ｕ、　ＭＧ、　ＭＮ、 　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、ＰＬ、ＲＯ，ＲＵ、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳ （７２）発明者　エリス、スチーブン　ブラッドリイアメリカ合衆国９２１２９ 　カリフォルニア州サン　ディエゴ、オビエド　ストリートＦＩ （７２）発明者　ウィリアムス、マーク　ニドワードアメリカ合衆国９２００９ 　カリフォルニア州カールスパッド、ペアー　トリー　ドライブ６９１９ （７２）発明者　フェルトマン、ダニエル　ハワードアメリカ合衆国９２１０９ 　カリフォルニア州サン　ディエゴ、ラモント　４６２１．ナンバー　９エイ （７２）発明者　マツキュー、アン　フランシスアメリカ合衆国９１９４２　カ リフォルニア州う　メサ、コロラド　アベニュー　６９３９（７２）発明者　ブ レナー、ロバート アメリカ合衆国７８７０３　テキサス州オースチン、ケンモアー　コート　２５ ０７

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトカルシウムチャンネルのα１サブユニットをコードするヌクレオチドの 配列よりなる、単離されたＤＮＡ断片。
2. ２．α１サブユニットはヒト神経カルシウムチャンネルα１サブユニットである 、請求の範囲第１項に記載のＤＮＡ断片。
3. ３．α１サブユニットはα１Ｄタイプのα１サブユニット、α１Ｃサブユニット タイプのα１サブユニット、α１Ｂサブユニットタイプのα１サブユニットまた はα１Ａサブユニットタイプのα１サブユニットである、請求の範囲第１項に記 載のＤＮＡ断片。
4. ４．ヒトカルシウムチャンネルのα２サブユニットをコードするヌクレオチドの 配列よりなる、単離されたＤＮＡ断片。
5. ５．ヒトのカルシウムチャンネルはヒト神経カルシウムチャンネル、ヒト骨格筋 カルシウムチャンネルまたはヒト大動脈カルシウムチャンネルである、請求の範 囲第４項に記載のＤＮＡ断片。
6. ６．α２サブユニットは、配列ＩＤＮｏ．１１に記載のアミノ酸をコードするＤ ＮＡと配列ＩＤＮｏ．１１のヌクレオチド１６２４と１６２５の間に挿入された 配列ＩＤＮｏ．１３のＤＮＡを含有する一次転写体の別の処理により産生される 、請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ断片。
7. ７．α２サブユニットはα２ａ、α２ｂ、α２ｃ、α２ｄ、またはα２ａサブユ ニットである、請求の範囲第４項に記載のＤＮＡ断片。
8. ８．ヒトのカルシウムチャンネルのβサブユニットをコードするヌクレオチドの 配列よりなる、単離されたＤＮＡ断片。
9. ９．サブユニットはβ１またはβ３サブユニットである、請求の範囲第８項に記 載のＤＮＡ断片。
10. １０．βサブユニットは、配列ＩＤＮｏ．９に記載のアミノ酸をコードするＤＮ Ａを含有する一次転写体の別の処理により産生されるが、配列ＩＤＮｏ．９のヌ クレオチド６１５−７８１の代わりに挿入された配列ＩＤＮｏ．１２に記載のＤ ＮＡを含有する、請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ断片。
11. １１．請求の範囲第８項に記載のＤＮＡ断片であって、サブユニットは、配列Ｉ ＤＮｏ．１２のヌクレオチド１４−３４、配列ＩＤＮｏ．１２のヌクレオチド１ ３−３４、配列ＩＤＮｏ．１２のヌクレオチド３５−５５、配列ＩＤＮｏ．１２ のヌクレオチド５６−１９０、および配列ＩＤＮｏ．１２のヌクレオチド１９１ −２７１よりなる群から選択されるヌクレオチドの１つまたはそれ以上の配列が 欠如している転写体によりコードされる、上記ＤＮＡ断片。
12. １２．ヒトのカルシウムチャンネルのγサブユニットをコードするヌクレオチド の配列よりなる、単離されたＤＮＡ断片。
13. １３．α１サブユニット、βサブユニット、α２サブユニットおよびγサブユニ ットよりなる群から選択されるヒトのカルシウムチャンネルの少なくとも１つを コードする異種ＤＮＡよりなる真核細胞。
14. １４．異種ＤＮＡはヒトのカルシウムチャンネルのα１サブユニットをコードす る、請求の範囲第１３項に記載の真核細胞。
15. １５．α１サブユニットはα１Ａサブユニット、α１Ｂサブユニット、α１ｃサ ブユニットまたはα１Ｄサブユニットである、請求の範囲第１３項に記載の真核 細胞。
16. １６．異種ＤＮＡはヒトのカルシウムチャンネルのα２サブユニットをコードす る、請求の範囲第１３項に記載の真核細胞。
17. １７．カルシウムチャンネルは、ヒト骨格筋カルシウムチャンネルまたはヒト大 動脈カルシウムチャンネルである、請求の範囲第１６項に記載の真核細胞。
18. １８．異種ＤＮＡはヒトのカルシウムチャンネルのβサブユニットをコードする 、請求の範囲第１３項に記載の真核細胞。
19. １９．異種ＤＮＡはヒトのカルシウムチャンネルのγサブユニットをコードする 、請求の範囲第１３項に記載の真核細胞。
20. ２０．異種ＤＮＡによりコードされる少なくとも１つのサブユニットを含有する 、機能的異種カルシウムチャンネルを有する、請求の範囲第１３項に記載の真核 細胞。
21. ２１．異種ＤＮＡによりコードされる少なくとも１つのサブユニットはヒトのカ ルシウムチャンネルのα１サブユニットである、請求の範囲第２０項に記載の真 核細胞。
22. ２２．異種ＤＮＡにより少なくとも２つのサブユニットがコードされ、異種ＤＮ Ａによりコードされるサブユニットはα１サブユニットに加えて、βサブユニッ トまたはα２サブユニットである、請求の範囲第２１項に記載の真核細胞。
23. ２３．カルシウムチャンネルは異種ＤＮＡにコードされる少なくとも３つのサブ ユニットを含有する、請求の範囲第２２項に記載の真核細胞。
24. ２４．カルシウムチャンネルは異種ＤＮＡにコードされる少なくとも４つのサブ ユニットを含有する、請求の範囲第２３項に記載の真核細胞。
25. ２５．ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔ ｅｒ）卵巣細胞、アフリカングリーン猿（Ａｆｒｉｃａｎｇｒｅｅｎｍｏｎｋｅ ｙ）細胞およびマウスＬ細胞よりなる群から選択される、請求の範囲第１３項に 記載の真核細胞。
26. ２６．ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター（Ｃｈｉｎｅｓｅｈａｍｓｔ ｅｒ）卵巣細胞、アフリカングリーン猿（Ａｆｒｉｃａｎｇｒｅｅｎｍｏｎｋｅ ｙ）細胞およびマウスＬ細胞よりなる群から選択される、請求の範囲第２０項に 記載の真核細胞。
27. ２７．機能的異種カルシウムチャンネルを有する真核細胞であって、該細胞中で ヒトのカルシウムチャンネルのα１サブユニットへ翻訳可能な最初のＲＮＡ、該 細胞中でヒトのカルシウムチャンネルのβサブユニットへ翻訳可能な２番目のＲ ＮＡ、該細胞中でヒトのカルシウムチャンネルのα２サブユニットへ翻訳可能な ３番目のＲＮＡ、該細胞中でヒトのカルシウムチャンネルのγサブユニットへ翻 訳可能な４番目のＲＮＡよりなる群から選択される、少なくとも１つのＲＮＡ転 写体を導入することよりなる方法により産生される、上記細胞。
28. ２８．両生類の卵母細胞てある、請求の範囲第２７項に記載の真核細胞。
29. ２９．異種カルシウムチャンネルは、該細胞に対して異種であるＤＮＡまたはＲ ＮＡによりコードされる少なくとも１つのヒトのカルシウムチャンネルサブユニ ットを含有し、 機能的、異種カルシウムチャンネルを有する真核細胞を、上記化合物とカルシウ ムチャンネル選択性イオンを含有する溶液中に懸濁し、該細胞の細胞膜を脱分極 して、 該細胞中を流れる電流を検出することよりなるカルシウムチャンネルの活性を調 節する化合物を同定するための方法であって、検出される電流は、同じカルシウ ムチャンネル選択性イオンは存在するが上記化合物の非存在下で、上記細胞また は実質的に同じ細胞を脱分極することにより産生される電流とは区別されること を特徴とする、上記方法。
30. ３０．脱分極の前に、細胞に対して内因性であるカルシウムチャンネルを実質的 に不活性化する保持電位に細胞を維持する、請求の範囲第２９項に記載の方法。
31. ３１．請求の範囲第３０項に記載の方法であって、細胞は両生類の卵母細胞であ り、 異種サブユニットは卵母細胞に注入されたＲＮＡによりコードされ、異種サブユ ニットはα１サブユニットとβサブユニットを含有する、上記方法。
32. ３２．ＲＮＡにコードされるサブユニットは、α２サブユニット、γサブユニッ トまたはα２サブユニットおよびγサブユニットをさらに含む、請求の範囲第３ １項に記載の方法。
33. ３３．細胞はＨＥＫ２９３細胞であり、異種サブユニットは異種ＤＮＡにコード される、請求の範囲第２９項に記載の方法。
34. ３４．請求の範囲第１項に記載のＤＮＡにコードされる、ヒトのカルシウムチャ ンネルの実質的に純粋なα１サブユニット。
35. ３５．請求の範囲第４項に記載のＤＮＡにコードされる、ヒトのカルシウムチャ ンネルの実質的に純粋なα２サブユニット。
36. ３６．請求の範囲第８項に記載のＤＮＡにコードされる、ヒトのカルシウムチャ ンネルの実質的に純粋なβサブユニット。
37. ３７．請求の範囲第１２項に記載のＤＮＡにコードされる、ヒトのカルシウムチ ャンネルの実質的に純粋なγサブユニット。
38. ３８．ヒトのカルシウムチャンネルはヒト神経カルシウムチャンネル、ヒト骨格 筋カルシウムチャンネルまたはヒト大動脈カルシウムチャンネルである、請求の 範囲第１項に記載のＤＮＡ断片。