JPH0650998B2 - 凝固パラメ−タを測定する分析素子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、検出可能な又は検出反応を開始する基質、血
液凝固系のプロテアーゼ及び血液凝固系の少なくとも１
つの因子及び／又は補因子及び緩衝物質を用いて凝固パ
ラメータを測定する分析素子に関する。

従来の技術 この種の分析素子は、先願の西独国特許出願第Ｐ３５１
６５７９号明細書に記載されている。この特許出願明細
書を本願では完全に引用する。先願では、担体材料とし
て有利に紙又はフリースが使用される。そこに記載の分
析素子の別の１実施例では、基質及び／又は補因子は水
溶性の皮膜形成重合体内に存在する。ベースシート上に
試薬含有皮膜が施される。

引用した西独国特許出願明細書に記載された分析素子を
用いて例えばクウイツク（Quick）測定法に基づいて測
定しようとする場合には、該素子は補因子（時たまアク
チベータとも称される）としてのトロンボプラスチン、
カルシウムイオン及びトロンビンのための基質（血液凝
固系のプロテアーゼ）を含有する。この分析素子を、例
えば１滴の血漿を施すことにより、血漿と接触させる
と、トロンボプラスチン及びカルシウムイオンが存在す
ることにより、凝固の段階的変化（Gerinnungskaskacl
e）が開始せしめられる。凝固の段階的変化が経過する
際に生成するトロンビンが基質を分解する。基質は、分
解後に直接的に検出可能であるか又は検出反応を開始さ
せるように選択されている。一般に、発色剤が使用され
る。この場合、基質は自体で発色するか又は分解生成物
は間接的に二次反応を介して発色を開始する。選択的
に、検出反応のためには、例えば螢光発生色素を形成す
る基質を使用することもできる。検出反応の形式は本発
明にとつては重要でない。

前記に引用した特許出願明細書は著しい進歩性を有す
る、それというのも血液凝固系のパラメータを測定する
ための分析素子〔時たまドライテスト（Trockentest）
又はテストキヤリア（Testtraeger）とも称される〕を
初めて提供するからである。しかしながら、得られる測
定結果の精度に関してなお満足されない。本発明の範囲
内で、分析素子において常用の紙又はフリースは大抵の
場合凝固の段階的変化の過程に、測定結果が医学的見地
から所望される精度を達成しない程に影響することが判
明した。

試薬を水溶性皮膜内に配合すると、前記の意味における
凝固の段階的変化の影響は皮膜形成剤を適当に選択する
ことにより確かに回避されるが、それにもかかわらず測
定精度はなお満足されない。このことは、同様に本発明
の研究過程で判明したことであるが、皮膜層が試薬を比
較的緩慢に放出することに起因すると見なすことができ
る。しかし、凝結試験のためには、試薬はできるだけ単
期間に放出されねばならない、それというのも試料の凝
結特性は時間測定を介して検出されるからである。この
時間帯の開始点は、試薬の放出が遅延されると不精確に
なる。

発明が解決しようとする問題点 従つて、本発明の課題は、前記に引用した特願明細書に
記載のものと同様に容易に取扱うことができ、しかも改
善された精度を有する凝結試験のための分析素子を提供
することであつた。

問題点を解決するための手段 前記課題は、本発明により冒頭に記載した形式の分析素
子において、前記因子及び／又は補因子が、凝固の段階
的変化の経過に偽和作用しない水溶性の非イオン性重合
体と共に、凝固の段階的変化の経過に有害な作用を及ぼ
さない材料から成る開放型の平面状複合構造体に含浸さ
れていることにより解決される。

開放型の面状複合構造体としては、面状に延伸された全
ての構造体、すなわち面状の延伸に対して小さい厚さ
（有利には0.5mm未満、特に有利には0.25mm未満）を有
するものが理解されるべきである。用語“開放型”と
は、水性液体、例えば血漿試料を急速に浸透されること
ができることを意味する、この場合には該構造は、試料
と接触することができる、可能な限り大きな表面積を有
するべきである。例えばプラスチツク材料から成るシー
ブ状構造体、すなわち極めて多数の近接して配置された
孔を有するプラスチツクシートが適当である。しかしな
がら、糸から成る織物、編物又はネツトが特に有利であ
る。特にモノフイラメントが好適である。

面状の複合構造体を製造するための材料としては、凝結
の段階的変化の経過に有害な影響を及ぼさずかつそれか
ら制作技術的に前記形式の構造体を製造することができ
る全ての材料が原則的に適当である。更に、該材料は非
イオン性重合体がその上の試薬と付着するような特性を
有するべきである。特に有利な材料は、ポリアミド、ポ
リエステル及びこれらの織組から成る混紡織物である。
１cm当りのフイラメント数は、有利には２０本以上であ
る。

複合構造体のために選択した材料が外因の凝結の段階的
変化の経過に影響するかどうかとう疑問は、以下のよう
にして試験することができる。すなわち、材料４０mgを
クエン酸血漿３００μｌで３７℃で６０秒間培養する。
次いで、血漿を遠心分離する。血漿の凝固性が統系的に
顕著に変化すれば好ましくない。

非イオン性重合体は、適用において常用の温度では水性
媒体中で十分に急速に溶解する特性を有するべきであ
る。ところで、比較的に大きな層厚さでは室温よりも高
い温度で初めて水中に十分に急速に溶解する材料もなお
適当であることが判明した、それというのもこれらは本
発明による複合構造体では薄い層で存在するからであ
る。

更に、非イオン性重合体は、平面状複合構造体上で付着
性の薄い層を形成する特性を有する。重合体層が実質的
に織物構造の片面側に残りかつその孔をおおうように織
物層に重合体材料が絶される、例えば撥水性衣類の製造
において一般的であるような被覆とは異なり、本発明に
よる複合構造体には非イオン性重合体を含浸させる、す
なわち該重合体は全面的に複合構造体を包囲する。

適当な重合体は、例えば非イオン性セルロース誘導体、
ポリビニルピロリドン及びポリキサンタンである。

ポリエチレンオキシド、ポリアクリルアミド並びに部分
的に又は完全にポリビニルアルコールにケン化されたポ
リビニルアセテートが特に適当であることが立証され
た。最後に挙げた群のうちでも、部分的にケン化された
ポリビニルアセテートが有利である。特に有利であるの
は、７０〜９３モル％のケン化度を有するポリビニルア
セテートである。これらの全ての重合体は意想外にも、
トロンボプラスチンを安定化するという付加的な利点を
有する。このように、特に良好な貯蔵特性で優れたクウ
イツクテストを製造することができる。

場合により、適当な非イオン性重合体の混合物を使用す
ることもできる。

本発明による試薬担体を製造するには、まず因子及び／
又は補因子及び非イオン性の水溶性重合体の溶液を製造
する。場合により、なお別の成分、例えば軟化剤を加え
る。この溶液を平面状複合構造体に有利には浸漬によ
り、場合によりまた噴霧により含浸させる。含浸溶液の
適当な粘度は一般的に固定することはできないが、但し
夫々の非イオン性重合体もしくは重合体混合物のために
製造技術的見地においてその都度の織物に合せるべきで
ある。５０〜250mPasの粘度が好適であることが立証さ
れた。

指示薬として作用する基質は、因子及び／又は補因子及
び非イオン性の水溶性重合体と一緒に加工するのが問題
となることがある。この場合には、基質を別の支持材料
に施すのが有利であることが判明した。この目的のため
には、種々の公知の支持材料が該当する。しかしなが
ら、この場合も、基質の他に非イオン性の水溶性重合体
を含有する溶液を前記方法に類似して含浸させることが
できる、開放型の平面状の複合構造体を支持材料として
使用するのが特に有利である。それにより、一方では因
子及び／又は補因子、他方では指示薬として役立つ基質
を含有する両者の支持材料層の特に均質な溶解特性が生
じる。

もう１つの別の有利な実施態様によれば、開放型の平面
状の複合構造体もしくは複数の同種の構造体を使用する
限り、そのうちの少なくとも１つに、凝結試験の際に一
般に血漿の再石灰化のために必要なカルシウムイオンを
含浸させる。

緩衝物質は同様に因子及び／又は補因子と一緒に含浸さ
せることができるが、しかしながらこれらは分析素子の
別体の支持材料上に存在することができる。

次に、図面及び実施例につき本発明を詳細に説明する。

全体として１０で示された分析素子の支持成分として支
持シート１が示されている。図示の実施例では、これは
テストストリツプと同様に細長い形を有する。しかしな
がら、本発明は、例えば写真スライドポジチブの形状に
類似した矩形を有する分析素子の別の形態のためにも適
当である。

支持シート上には、帯状の溶融接着剤２で赤血球分離及
び血漿運搬フリースが固定されている。特に、例えば西
独国特許出願第３５２３９６９号及び同第３６１０４２
９号明細書に記載されているような、凝結に対して中性
のガラス繊維材料から成るフリースが特に適当である。
以下に短く運搬フリースと記載するフリース４は、一部
分が同様に接着剤２で固定されたカバーネツト３でおお
われている。このためにはナイロンネツトが適当であ
る。

分析素子１０の３つの別の面状成分は、帯状の溶融接着
剤で支持シート１上に、運搬フリース４に一部分オーバ
ラツプするように固定されている。これらはその縁部の
１つだけで相互にかつ支持シート１に固定されているの
で、これらは外的圧力により相互に押付けられない限
り、その残りの面上に相互間の間隔を有する。この形式
の試験片構造体に関する詳細は、例えばヨーロツパ公開
特許第４５４７６号明細書に記載されている。

最も下の層５は、以下に酸化マトリツクスとも称する酸
化剤支持体であつてもよい。更に、本発明による試薬担
体６は含浸した開放型の複合構造体の形で存在する。最
も上の層として、カバーフイルム７が設けられている。

層６のためには、皮膜形成剤、緩衝剤、トロンボプラス
チン又は外因もしくは内因性の凝固の段階的変化を開始
させるための別の開始剤並び血液凝固の経過の際に発生
するプロテアーゼのための、同時に指示薬として作用す
る基質、例えばフアクタIIａ、フアクタXa等、場合によ
りなおカツプラ、並びにカルシウムイオン及び場合によ
りなお皮膜形成剤のための軟化剤を水中に溶かした溶液
を含浸させた織布を使用する。緩衝物質としては、トリ
ス及び一連のグツド−プツフア（Good-Puffer）から成
る化合物が有利であることが立証された。基質として
は、そのアミノ酸配列に基づき十分に特異性である全て
のプロテアーゼ基質、例えばTos-gly-pro-arg−４−ニ
トロアニリド−アセテート及びカツプラとしてのＮ−メ
チルアントラニル酸を挙げることができる。別のヨツプ
ラ、例えばＮ−（４−フルオルフエニル）−Ｎ−メチル
アミノメタンホスホン酸等を同様に使用することができ
る。

プロテアーゼによる分解後に引続いての酸化性カツプリ
ングを介して発色する指示薬の場合には、層５内に酸化
剤、例えばK₃〔Fe(CN)₆〕を施すことが必要である。場
合により、層５内カルシウムイオンを施すこともでき
る。層５のためには、同様に含浸させた薄い織物を使用
するのが有利である。酸化性カツプリングを介する増強
反応を必要としない指示薬を使用する限り、酸化マトリ
ツクス５が省ける。

層５は基質が別に施される前記実施形では、基質を因子
及び／又は補因子とは別に含浸した平面状の複合構造体
であつてよい。

本発明のためにも適当である、種々の凝固試験の化学的
組成に関する詳細は、冒頭に引用した西独国特許出願第
５３１６５７９号明細書に記載されている。

以下の実施例で、引用した西独国特許出願明細書に基づ
くシート上の試薬皮膜で達成される結果を、本発明に基
づき含浸した織物を用いた結果と比較する。

クウイツクに基づく一相凝固時間を測定するための分析
素子の製造 シート上の試薬皮膜（試薬マトリツクス）の製造 厚さ２００μｍのポリカーボネートシートに第１表に記
載した組成の皮膜を湿式皮膜厚さ１００μｍで施しかつ
４５℃で乾燥する。乾燥後に、積層したシートウエブを
幅１５mmに切断する。

含浸した織物（本発明による）の製造 ポリアミド織物（Zuericher Beuteltuch-fabrik社のTyp
７５HC）に、第１表に記載した組成の含浸溶を含浸させ
かつ４５℃で乾燥する。乾燥後に、含浸した織物ウエブ
を幅１５mmに切断する。

酸化マトリツクスの製造 ナイロンネツト（Zuericher Beuteltuch-fabrik社、ス
イス国在のTyp NY２０HC Super）に、K₃〔Fe(CN)₆〕５
０mmol／、塩化カルシウム５０mmol／及びポリアク
リルアミド（Roehm社のRohagit７００）0.21の水溶液
を含浸させかつ４５℃で乾燥する。乾燥後に、含浸した
ネツトから幅１５mmのウエブを切断する。

被覆及び含浸材料の製造 蒸留水１中に、ヘプス（Hepes）１００mmol、Tos-gly
-pro-arg−ｐ−フエニレンジアミン１mmol、Ｎ−（４−
フルオルフエニル）−Ｎ−メチルアミノメタンホスホン
酸１５mmol、トロンボプラスチン2.5ｇ及び第１表に記
載の量の重合体を溶かす。この溶液をカセイソーダでpH
7.5に調整する。

分析素子の製造 幅１００mmのポリスチレンシート（第１図の１）に、西
独国特許出願第３５２３９６９号明細書に記載の面積当
り重量３０〜４０ｇ／m²のガラス繊維フリース（第１図
の４）を幅１５mmで施し、ナイロンネツト（第１図の
３）で一部分おおいかつ一方端部で接着剤（第１図の
２）を用いて固定する。ガラス繊維フリースの自由端部
に、酸化マトリツクス（第１図の５）及び試薬マトリツ
クス（第１図の６）を重ねかつ幅１５mmの、厚さ２００
μｍの透明なポリカーボネートシート（第１図の１）を
かふせ接着剤８（第１図の２）で固定接着する。こうし
て製造したテープを幅６mmのストリツプに切断する。

フイルム上の試薬皮膜を有する分析素子の構造は実質的
に第１図に記載の構造に相当する。しかしながら、これ
は層６及び７の代りに唯一の層が設けられている点によ
つて区別される。これは皮膜が施された透明なシートか
ら成る。該素子はシートが図面で上を向くように配置さ
れている。

クウイツクに基づく一相凝固時間を測定する際のシート
上の皮膜層及び本発明方法で達成される精度の比較 以下のとおり処理する： 前記試験ストリツプに、クウイツク値１００％及び生理
的食塩水で希釈することにより製造した血漿12.5％を有
する混注血漿３２μｌをピペツトを用いて載せる。血漿
試料を載せた試薬担体をBoeringer Mannheim社のレミツ
シヨンスホトメータ“Reflotron”で測定する。１０％
のレミツシヨン低下が起るまでの時間、すなわち一定量
のトロンビン（ファクタIIａ）が生じるまで外因性凝固
の段階的変化が経過するまでの時間を測定する。

測定列において、試験変形及びクウイツク％毎にその都
度２５回の測定を実施した。

結果は第２表にまとめて示す。

表の４つの欄は、第１表の４つの異なつた重合体もしく
は重合体混合物に関する。初めの２つの板には、シート
上の比較のために採用した皮膜の測定結果が示されてい
る。後方の２つの段は本発明による実施例のための測定
結果を示す。

実施形４の夫々のためには、１００％の血漿及び12.5％
の血漿のための測定された時間が示されている。本発明
を判定するために重要なことは、％で同様に示された変
化係数である。

表に示された測定結果は、本発明による実施形では統計
的に著しく改善された変化係数が得られることを明らか
に示す。低いクウイツクパーセントの範囲内、すなわち
重要な治療上の範囲では、改善された精度が明らかに生
じる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明による分析素子の略示横断面図を示す。 １……支持シート、２……溶融接着剤、３……カバーネ
ツト、４……運搬フリース、５……酸化剤担体、６……
試薬担体、７……カバーフイルム、８……接着剤、１０
……分析素子

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】検出可能な又は検出反応を開始する基質、
   血液凝固系のプロテアーゼ及び血液凝固系の少なくとも
   １つの因子及び／又は補因子及び緩衝物質を用いて凝固
   パラメータを測定する分析素子において、前記因子及び
   ／又は補因子が、凝固の段階的変化の経過に偽和作用し
   ない水溶性の非イオン性重合体と共に、凝固の段階的変
   化の経過に有害な作用を及ぼさない材料から成る開放型
   の平面状複合構造体に含浸されていることを特徴とす
   る、凝固パラメータを測定する分析素子。
2. 【請求項２】基質が因子及び／又は補因子及び水溶性の
   非イオン性重合体と一緒に開放型の平面状複合構造体に
   含浸されている、特許請求の範囲第１項記載の分析素
   子。
3. 【請求項３】基質が水溶性の非イオン性重合体と一緒
   に、因子及び／又は補因子を担持する複合構造体から分
   離された第２の開放型の平面状の複合構造体に含浸され
   ている、特許請求の範囲第１項記載の分析素子。
4. 【請求項４】開放型の平面状の複合構造体に付加的にカ
   ルシウムイオンが含浸されている、特許請求の範囲第１
   項から第３項までのいずれか１項記載の分析素子。
5. 【請求項５】平面状複合構造体が織物、編物又はネツト
   である、特許請求の範囲第１項記載の分析素子。
6. 【請求項６】織物、編物又はネツトがモノフイラメント
   から成る、特許請求の範囲第５項記載の分析素子。
7. 【請求項７】平面状複合構造体が最高0.25mmの厚さを有
   しかつ１cm当り少なくとも２０本のフイラメントを有す
   る、特許請求の範囲第５項記載の分析素子。
8. 【請求項８】非イオン性重合体が、５０℃未満の温度で
   水中に可溶性である皮膜形成剤である、特許請求の範囲
   第１項記載の分析素子。
9. 【請求項９】補因子としてトロンボプラスチンを使用す
   る際に、平面状複合構造体上のトロンボプラスチンを安
   定化する重合体を使用する、特許請求の範囲第１項記載
   の分析素子。
10. 【請求項１０】重合体がポリエチンオキシド、ポリアク
    リルアミド又はポリビニルアルコールである、特許請求
    の範囲第９項記載の分析素子。