DK166884B1

DK166884B1 - Analyseelement til bestemmelse af stoerkningsparametre

Info

Publication number: DK166884B1
Application number: DK240787A
Authority: DK
Inventors: Knut Bartl; Helmut Lill; Hans Wielinger
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1986-05-16
Filing date: 1987-05-12
Publication date: 1993-07-26
Also published as: ES2026479T3; DK240787A; NO169981C; KR960016336B1; JPS62274262A; KR870011473A; EP0245802B1; JPH0650998B2; DK240787D0; EP0245802A3; GR3003359T3; CA1294857C; NO872036D0; DE3616496A1; ATE67602T1; ZA873329B; US4861712A; NO169981B; AU7290387A; AU582688B2

Description

DK 166884 B1

Opfindelsen angår et analyseelement til bestemmelse af størkningsparametre ifølge indledningen til krav 1.

Et sådant analyseelement er beskrevet i den ældre, men ikke offentliggjorte tyske patentansøgning P 35 16 579. Der henvi-5 ses til hele indholdet af denne ansøgning. Det der beskrevne analyseelement indeholder et bærermateriale, som er imprægneret med reagenser til bestemmelse af størkningsparametre, nemlig et kromofort substrat, en protease fra blodstørknings-systemet og mindst én faktor og/eller cofaktor fra blodstørk-10 ningssystemet. Som bærermateriale foretrækkes papir eller et ikke-vævet tavemateriale. I en anden udførelsesform for det deri beskrevne analyseelement befinder substratet og/eller cofaktoren sig i en vandopløselig, filmdannende polymer. Af denne filmdannende polymer fremstilles opløsninger, der er så 15 viskose, at der ud fra disse ifølge de kendte fremstillingsmetoder, såsom appretering, valsecoating osv., kan fremstilles film. Forinden indarbejdes reagenserne i disse opløsninger. Belægningsmasserne påføres på bærerfolier, tørres, og de færdige film forarbejdes til teststrimler, idet den reagensholdi-20 ge.film påføres på en grundfolie.

Hvis man med det i nævnte patentansøgning beskrevne analyseelement f.eks. vil bestemme enkeltfase-størkningstiden ifølge DK 166884 B1 2

Quick, indeholder det tromboplastin som cofaktor (undertiden også betegnet aktivator), calciumioner og et substrat for trom-bin (en protease fra blodstørkningssystemet) . Hvis dette analyseelement bringes i kontakt med plasma, idet der f.eks.

5 påføres en dråbe plasma, startes størkningskaskaden ved tilstedeværelsen af tromboplastinet og calciumionerne. Det ved forløbet af størkningskaskaden opstående trombin spalter substratet. Substratet er valgt således, at det efter spaltningen enten er umiddelbart påviseligt eller udløser en påvisnings-10 reaktion. I almindelighed anvendes en farvedannelse. Substratet er i dette tilfælde enten selv farvedannende, eller spalteproduktet udløser indirekte en farvedannelse via en følgereaktion. Alternativt kan der til påvisningsreaktionerne f.eks. også anvendes substrater, der frembringer fluorescerende 15 farvestoffer. Typen af påvisningsreaktionen er uvæsentlig for den foreliggende opfindelse.

Den i nævnte patentansøgning beskrevne fremgangsmåde betyder et betydeligt fremskridt, fordi der for første gang er skabt et analyseelement (der til tider også betegnes som tørprøve 20 eller prøvebærer) til bestemmelse af parametre af blodstørkningssystemet. Det lader dog stadig noget tilbage at ønske med hensyn til nøjagtigheden af de fremkomne måleresultater. Inden for rammerne af den foreliggende opfindelse blev det erkendt, at de til analyseelementer sædvanlige papir- eller 25 tavematerialer i mange tilfælde påvirker forløbet af størkningskaskaden, således at måleresultatet ikke opnår den ud fra et medicinsk synspunkt ønskede grad af nøjagtighed.

3 DK 166884 B1

Hvis reagenserne inkorporeres i en vandopløselig film, undgås ganske vist en påvirkning af størkningskaskaden i den førnævnte forstand ved passende valg af filmdanner, men nøjagtigheden af målingen lader meget tilbage at ønske. Dette skyl-5 des, således som det er erkendt inden for den foreliggende opfindelses rammer, at filmlaget frigør reagenserne forholdsvis langsomt. Til størkningsprøven må reagenserne imidlertid frigøres hurtigst muligt, fordi størkningsegenskaberne af prøven konstateres via en tidsmåling. Begyndelsespunktet for dette 10 tidsrum bliver upræcist på grund af en forhalet frigørelse af reagenserne.

Det var derfor den foreliggende opfindelses opgave at skabe et analyseelement til størkningsprøver, der er lige så let at håndtere som det, der er beskrevet i den nævnte patentansøgning, 15 men som har en forbedret nøjagtighed.

Denne opgave løses ved hjælp af det i kravene definerede analyseelement.

San åben, flad, af tråde bestående struktur forstås enhver struktur, der er udstrakt i en flade, d.v.s. som har en ringe tykkelse 20 (fra fortrinsvis mindre end 0,5 mm, især mindre en 0,25 mm) i forhold til fladedimensionen. Fladedimensionen er bestemt af prøvefeltfladen inden for analyseelementet. Med "åben" menes, DK 166884 B1 4 at strukturen skal være egnet til at muliggøre en hurtig indtrængning af en vandig væske, f.eks. en plasmaprøve, idet strukturen skal have den størst mulige overflade, som kan bringes i kontakt med prøven. Egnet ville f.eks. være en si-5 agtig struktur af et kunststofmateriale, d.v.s. en kunststof-folie med mange tæt ved hinanden anbragte huller. Særligt foretrækkes dog et vævet eller strikket stof eller et net, der består af tråde. Især egner sig monofile tråde.

Som materiale til fremstilling af den flade, af tråde bestående struk-10 tur egner sig i princippet ethvert materiale, der ikke har nogen forstyrrende indflydelse på forløbet af størkningskaskaden, og hvoraf der rent teknisk kan fremstilles en struktur af den beskrevne art. Desuden må materialet være således beskaffent, at den ikke-ionogene polymer med reagenserne hæfter derpå. Sær-15 ligt foretrukne materialer er polyamid, polyestere og blandingsvæv af disse taver. Trådtallet pr. cm ligger fortrinsvis over 20.

Spørgsmålet om, hvorvidt det til den af tråde bestående struktur valgte materiale påvirker forløbet af den eksogene størkningskaska-20 de, kan undersøges som følger: 40 mg af materialet inkuberes med 300 Ail citratplasma i 60 sekunder ved 37°C. Derefter fracentrifugeres plasmaen, og størkningsevnen af plasmaen må ikke have ændret sig statistisk signifikant.

Den ikke-ionogene polymer må have den egenskab, at den opløses 25 tilstrækkeligt hurtigt i det vandige medium ved de ved anvendelsen sædvanlige temperaturer. Det har vist sig, at også materialer, som i større lagtykkelse først opløser sig tilstrækkeligt hurtigt i vand ved temperaturer over stuetemperatur, er egnede, fordi de foreligger i tyndt lag på den af tråde bestående 30 struktur ifølge opfindelsen.

5 DK 166884 B1

Endvidere skal den ikke-ionogene polymer have den egenskab at danne et vedhæftende tyndt lag på den flade, af tråde bestående struktur. I modsætning til et overtræk, der f.eks. er sædvanligt ved fremstilling af regntæt tøj, ved hvilket et polymermateria-5 le påføres på et vævet lag således, at polymerlaget i det væsentlige bliver på den ene side af den vævede struktur og spåender over dennes åbninger, bliver den af tråde bestående struktur ifølge opfindelsen imprægneret med den ikke-ionogene polymer, dvs. at polymeren angiver den af tråde bestående struktur på alle 10 sider.

Egnede polymerer er f.eks. ikke-ionogene cellulosederivater, polyvinylpyrrolidon og polyxanthaner.

Som særligt egnede har vist sig polyethylenoxider, polyacryl-amider samt helt eller delvis til polyvinylalkohol forsæbede 15 polyvinylacetater. Inden for den sidstnævnte gruppe foretræk kes de delvis forsæbede polyvinylacetater. Særligt foretrukne er polyvinylacetater med en forsæbningsgrad mellem 70 og 93 mol%. Alle disse polymerer har overraskende den yderligere fordel, at de stabiliserer tromboplastinet. På denne måde kan 20 fremstilles en Quick-test, der udmærker sig ved særligt god lagerholdbarhed.

Ligeledes kan der også anvendes blandinger af egnede ikke-ionogene polymerer.

Til fremstilling af reagensbæreren ifølge opfindelsen fremstil-25 les først en opløsning af faktoren og/eller cofaktoren og den ikke-ionogene, vandopløselige polymer. Eventuelt kan der også tilsættes andre bestanddele, f.eks. blødgøringsmiddel.

Med denne opløsning imprægneres den flade, af tråde bestående struktur, fortrinsvis ved neddypning, men under nogle omstændig-30 heder også ved besprøjtning. Den egnede viskositet af impræg- DK 166884 B1 6 neringsopløsningen kan ikke fastslås generelt, men skal afpasses til det til enhver tid anvendte vævede stof for hver ikke-ionogen polymer eller polymerblanding ud fra produktionstekniske synspunkter. Velegnede har vist sig viskositeter 5 mellem 50 og 250 mPa/sek.

Det som indikator virkende stof kan imprægneres på den flade, af tråde bestående struktur sammen med faktoren og/eller cofaktoren og den ikke-ionogene, vandopløselige polymer. Under nogle omstændigheder kan det dog være problematisk at forarbejde 10 faktoren og/eller cofaktoren sammen med substratet. I dette tilfælde har det vist sig hensigtsmæssigt at anbringe substratet på et separat bærermateriale. Til dette formål kan der anvendes forskellige kendte bærermaterialer. Fortrinsvis anvendes dog også i dette til feide en åben, flad, af tråde bestående 15 struktur som bærermateriale, som analogt med den foran beskrevne fremgangsmåde imprægneres med en opløsning, der foruden substratet indeholder en ikke-ionogen, vandopløselig polymer. Derved fås et særligt ensartet opløsningsforhold af de to bærermaterialelag, som på den ene side indeholder faktoren 20 og/eller cof aktoren og på den anden side det som indikator tjenende substrat.

Ifølge en anden foretrukken udførelsesform bliver den åbne, flade, af tråde bestående struktur eller, for så vidt der anvendes flere sådanne strukturer, mindst én af strukturerne samtidig 25 imprægneret med de calciumioner, der i almindelighed er nødvendige til rekalcificering af plasmaen ved størkningsprøven.

Stødpudestoffer kan ligeledes imprægneres sammen med faktoren og/eller cof aktoren, men de kan dog også findes på et separat bærermateriale i analyseelementet.

30 Opfindelsen belyses nærmere i det følgende ved hjælp af teg- 7 DK 166884 B1 ningen og udførelseseksemplerne.

Fig. 1 viser skematisk i tværsnit et analyseelement ifølge opfindelsen.

Som bærende bestanddel af det alment med 10 betegnede analyse-5 element haves en bærerfolie 1. I den viste udførelsesform har den en aflang form ligesom en prøvestrimmel. Opfindelsen er dog også egnet til andre former for analyseelementer, der f.eks. har en kvadratisk form af lignende art som fotografiske diapositiver.

10 På bærerfolien er med en stribe smelteklæbemiddel 2 fastgjort et tavemateriale til erythrocyt-fraskillelse og plasmatransport. Særligt egner sig et tavemateriale af et størknings-neutralt glastavemateriale, således som det er beskrevet i de tyske patentansøgninger 35 23 969 og 36 10 429. Tave- 15 materialet 4, der i det følgende kort er betegnet transport- tavemateriale, er delvis overdækket med et overdækningsnet 3, der ligeledes er fastgjort med klæbemidlet 2. Hertil egner sig et nylonnet.

Tre andre flade bestanddele af analyseelementet 10 er med en 20 strimmel smelteklæbemiddel fastgjort således på bærerfolien 1, at de delvis overlapper transporttavematerialet 4. Da de kun er fastgjort til hinanden og på bærerfolien 1 ved en af deres kanter, har de over deres tilbageblevne flade en afstand fra hinanden, så længe de ikke af ydre tryk presses mod hinanden.

25 Nærmere enkeltheder om denne måde til prøvens opbygning' kan f.eks. ses i den europæiske patentansøgning med publikations-nummeret 45 476.

Det nederste lag 5 kan være en oxidationsmiddelbærer, der i det følgende også betegnes som oxidationsmatrix. Derover fin- DK 166884 B1 8 des reagensbæreren 6 ifølge opfindelsen i form af den imprægnerede, åbne, sammensatte struktur. Som øverste lag haves en afdækningsfolie 7.

Fortrinsvis anvendes til laget 6 et vævet stof, der er impræg-5 neret med en opløsning, hvori filmdanneren, stødpuden, trombo- plastinet eller andet startreagens til start af den eksogene eller endogene størkningskaskade samt et ligeledes som indikator virkende substrat for en af de ved forløbet af blodstørkningen opstående proteaser, såsom f.eks. faktor II a, •Lo faktor X a etc., og eventuelt endnu en kobler samt calciumioner og eventuelt et blødgøringsmiddel til filmdanneren, er opløst i vand. Som stødpudestoffer har tris og forbindelser af rækken af Good-Puffere vist sig egnede. Som substrater kan anvendes alle proteasesubstrater, der på grund af deres amino-syresekvens er tilstrækkeligt specifikke, såsom f.eks. Tos-Gly-Pro-Arg-4-nitroanilid-acetat eller Tos-Gly-Pro-Arg-p-phenylendiamin-acetat og N-methylanthranilsyre som kobler.

Andre koblere, såsom N- (4-fluorphenyl) -N-methylaminomethan-phosphonsyre etc., kan ligeledes anvendes.

2o Hvor det drejer sig om indikatorer, som efter spaltning med proteasen giver en farve via en tilsluttet oxidativ kobling, er det nødvendigt i laget 5 at have et oxidationsmiddel, såsom f.eks. K^tFeiCNJg]. Eventuelt kan der i laget 5 også indføres calciumioner. Fortrinsvis anvendes til laget 5 ligeledes et 25 tyndt væv, der er blevet imprægneret. Hvis der anvendes en indikator, til hvilken der ikke kræves en forstærkningsreaktion via en oxidativ kobling, bortfalder oxidationsmatrixen 5.

Laget 5 kan i den ovenfor omtalte alternative udførelsesform med separat anbringelse af substratet også være en flad, sammen-30 sat struktur, hvorpå substratet er imprægneret adskilt fra faktoren og/eller cofaktoren.

9 DK 166884 B1 Nærmere enkeltheder om den kemiske sammensætning af forskellige størkningsprøver, der også er egnede til den foreliggende opfindelse, kan ses i den tidligere nævnte tyske patentansøgning 35 16 579.

5 I de følgende eksempler sammenlignes resultaterne, der opnås med reagensfilm på folie ifølge den nævnte tyske patentansøgning, med resultater med vævede stoffer imprægneret ifølge opfindelsen.

Fremstilling af et analyseelement til bestemmelse af enkeltfase-10 størkningstiden ifølge Quick.

Fremstilling af reagensfilm (reagensmatrix) på folie: På polycarbonatfolier med tykkelsen 200 /im påføres med en rakel film med de i tabel 1 anførte sammensætninger med en våd filmtykkelse på 100 /am, og de tørres ved 45°C. Efter tørring ud-15 skæres de overtrukne foliebaner til en bredde på 15 mm.

Fremstilling af imprægnerede væv (ifølge opfindelsen):

Polyamidvæv (type 75 HC fra firmaet Ziiricher Beuteltuchfabrik, Schweiz) imprægneres med imprægneringsopløsninger af de i tabel 1 anførte sammensætninger og tørres ved 45°C. Efter tørring 20 udskæres de imprægnerede vævsbaner til en bredde på 15 mm.

Fremstilling af oxidationsmatrixen:

Et nylonnet (type NY 20 HC Super fra firmaet Ziiricher Beuteltuch-fabrik, Schweiz) imprægneres med en vandig opløsning af 50 mmol K3[Fe(CN)g]/liter, 50 mmol calciumchlorid/liter og 0,2 g/liter 25 polyacrylamid (Rohagit 700 fra firmaet Rohm) og tørres ved 45°C. Efter tørring udskæres der af det imprægnerede net 15 mm brede baner.

10 DK 166884 B1

Fremstilling af overtræks- eller imprægneringsmasserne: I 1 liter destilleret vand opløses Hepes (100 mmol),Tos-Gly~ Pro-Arg-p-phenylendiamin (1 mmol) , N- (4-fluorphenyl) -N-methyl-aminomethanphosphonsyre (15 mmol), 2,5 g tromboplastin og 5 de polymerer, der er anført i tabel 1. Disse opløsninger indstilles til en pH-værdi på 7,5 med natronlud.

TABEL 1.

Mængde i Mængde i imprægneringspolymerer overtræksmasse opløsning 1. Polyvinylalkohol (Mowiol 26/88, Hoechst) 70 g 40 g 10 2. Polyvinylalkohol (Mowiol 18/88, Hoechst) 75 g 50 g 3. Polyethylenoxid (Polyox 301, Union Carbide) 10 g 1 g

Polyacrylamid 15 (Rohagit 700, Rohm) 5 g 2,5 g 4. Polyvinylalkohol (Mowiol 18/88, Hoechst) 60 g 40 g

Polyacrylamid (Rohagit 700, Rohm) 10 g 5 g 20 Fremstilling af analyseelementet: På en 100 mm bred polystyrolfolie (1 på fig. 1) lægges et glas-tavestof (4 på fig. 1) ifølge tysk ansøgning 35 23 969 med en fladevægt på 30 - 40 g/m i en bredde på 15 mm, overdækkes delvis med et nylonnet (3 på fig. 1) og fikseres i den ene ende DK 166884 B1 π med et klæbestof (2 på fig. 1). Ved den frie ende af glas-tavestoffet lægges oxidationsmatrixen (5 på fig. 1) og reagensmatrixen (6 på fig. 1) over hinanden og dækkes med en 200 ,um tyk transparent polycarbonatfolie (7 på fig. 1) med en bredde 5 på 15 mm og fastgøres med et klæbestof (8 på fig. 1) . De således fremstillede bånd udskæres til 6 mm brede strimler.

Opbygning af analyseelementet med en reagens film på folie svarer i det væsentlige til den på fig. 1 beskrevne opbygning. Den adskiller sig dog ved, at der i stedet for lagene 6 og 7 er 10 anbragt et enkelt lag. Dette består af en gennemsigtig folie, der er belagt med filmen. Den er indrettet således, at folien på figuren vender opad.

Sammenligning af den nøjagtighed, der kan opnås med filmbelægning på folie og med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, ved 15 bestemmelse af enkeltfase-størkningstiden ifølge Quick:

Der gås frem på følgende måde: På de ovenfor beskrevne prøvestrimler pipetteres 32 ;ul Poolplasma med en Quick-værdi på 100% og en ved fortynding med fysiologisk kogsaltopløsning fremstillet plasma på 12,5%.

20 Den med plasmaprøverne overtrukne reagensbærer måles i remis-sionsfotometer ("Reflotron", Boehringer Mannheim). Der måles den tid, som går, indtil der er sket en formindskelse af remissionen på 10%, d.v.s. tiden, indtil den eksogene størkningskaskade er forløbet så vidt, at der er opstået en 25 bestemt mængde trombin (faktor II a).

I målerækken blev der i hvert enkelt tilfælde udført 25 bestemmelser pr. prøvevariant og % Quick.

Måleresultaterne er vist i tabel 2.

12 DK 166884 B1

De fire linier i tabellen vedrører de fire forskellige polymerer eller polymerblandinger i tabel 1. I de første to spalter er vist måleresultaterne for den til sammenligningen anvendte film på folie. De sidste to spalter viser måleresulta-5 terne for udførelsesformen ifølge opfindelsen.

For hver af udførelsesformerne er anført de målte tider for 100% plasma og for 12,5% plasma. Væsentligt for bedømmelse af opfindelsen er især de ligeledes anførte variationskoefficienter (VK) i procent.

10 De i tabellen gengivne måleresultater viser tydeligt, at der med udførelsesfomen ifølge opfindelsen opnås statistisk signifikant bedre variationskoefficienter. I området med lave Quick-procenter, i det vigtige terapeutiske område, fremtræder den forbedrede nøjagtighed særlig tydeligt.

13 DK 166884 B1 ϋ i i

O) I I 0\° I I

t n i λ: i i i

ri I O I -H I H CM ro CM I

0) I -ri I I ·* * * I

Ό I 3 I ίΠ I CO CO CN <N I

ti I a I > I I

Η I I I I

m i cjp i i i dl I LO I IH CO CO (Ml O I * I · I ·· ** *> -i

I (N i Ai I lo r- co o I

<L) I Η I <D I to lo co Γ" I

Cn i l t n i i

Hil i i i !

IH I I I

Hil I

I 1 \

G I I

HI I o\° I I

0111 Λ !

Ή I Λ I Ή I LO O' f" LO I

in i o i i - - ** -i (D I H 1 W I CM Η H Hl tn i 3 i > i i h i σ i i !

(Dill I

Η I 00 I I I

•©.101*1 LO lo H Hl IH I O I M I - - *» - i

«ΰ I H I <D I Η cn to 00 I

Dl i tn i h co to co i i i I i

I I

I 1

I dP I I

i ^ 1 1 , ! I ϋ I Η I H CO CN Hl

I Η I I ** k k ** I

i ø i W i o o io t"· i

I O I > I H I

III I

I of> I I I

I in i lo cm <M r·» I

1-1*1 *> *· * ·* i

Ul I CM I x I 00 (O co O I

ti I Η I (U I H CM 00 Hl HI I tn I Η H Hl

ti I I I

tJ> I I I

æ i i

Hil I

Φ I I I

rQ I I I

g I I df> I I

Η I I I I

Η I X I Η I O’ H cn Hl

IH I O I I - - " - I

I Η I W I CO CM «3* Η I

i ti i > i ! i σ i i i III i

I cap I I cn cn cn I

I o I · I *· *> - ·* I

I Ο I Λ I CM CM Η Η I

I Η I Q) I Η H *4· Η I

i tn i i i i i i i i i i i i i i i i * I I i

cm I HI I

I Φ ' j

Hl g I I

pq I >ι I H CM co θ' I

CQ I Hl I

<C I 0 1 I

E-t I (HI I

Claims

1. Analyseelement til bestemmelse af størkningsparametre ved hjælp af et påviseligt substrat eller et substrat, der udløser 5 en påvisningsreaktion, en protease fra blodstørkningssystemet og mindst én faktor og/eller cof aktor fra blodstørknings systemet og et stødpudestof, kendetegnet ved, at faktoren og/eller cof aktoren sammen med en vandopløselig, ikke-ionogen polymer, som ikke på forfalskende måde påvirker forlø-10 bet af størkningskaskaden, er således imprægneret på en åben, flad, af tråde bestående struktur, der består af et materiale, som ikke har nogen forstyrrende indflydelse på forløbet af størkningskaskaden, at polymeren omgiver strukturen på alle sider.

2. Analyseelement ifølge krav 1, kendetegnet ved, at substratet sammen med faktoren og/eller cofaktoren og den vandopløselige, ikke-ionogene polymer er imprægneret på den åbne, flade, af tråde bestående struktur.

3. Analyseelement ifølge krav l, kendetegnet ved, 20 at substratet sammen med en vandopløselig, ikke-ionogen polymer er imprægneret på en anden åben, flad, af tråde bestående struktur, der er adskilt fra strukturen, som bærer faktoren og/eller cofaktoren.

4. Analyseelement ifølge krav 1-3, kendetegnet 25 ved, at den flade, åbne, af tråde bestående struktur yderligere er imprægneret med calciumioner.

5. Analyseelement ifølge krav l, kendetegnet ved, at den flade, af tråde bestående struktur er et vævet eller strikket stof eller et net.

6. Analyseelement ifølge krav 5, kendetegnet ved, at det vævede eller strikkede stof eller nettet består af DK 166884 B1 monofile tråde.

7. Analyseelement ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den flad, af tråde bestående struktur har en tykkelse på højst 0,25 mm og har mindst 20 tråde pr. cm.

8. Analyseelement ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den ikke-ionogene polymer er en filmdanner, der er opløselig i vand ved temperaturer unde 50°C.

9. Analyseelement ifølge krav 1, til hvilket der som cofaktor anvendes tromboplastin, kendetegnet ved, at den 10 vandopløselige, ikke-ionogene polymer er et polyethylenoxid, et polyacrylamid eller en polyvinylalkohol.