JPH06510193A - 細胞の選択，分離および融合方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ２７、請求項２６に記載の融合細胞によって製せられる酵素、成長因子、壊死因 子または他の生体分子。

明細書 細胞の選択９分離および融合方法 発明の分野 本発明は規定生合成された標的分子を表す、または支持する１つまたは、それ以 上の細胞を選択的に回復させる方法、異なる型の細胞を分離する方法、およびこ れらとは別であるが付随した、このように分離された２つの細胞を融合、または 単一の融合細胞を形成するために、このような細胞および媒介を融合する方法に 関する。この融合方法は特に、ハイブリドーマ（融合雑種腫瘍細胞）即ち、単ク ローン性抗体を製する哺乳類雑種細胞および他の哺乳類細胞および、植物細胞構 造物に適している。

先行技術 ハイブリドーマは、例えばＢリンパ球のような正常抗体分泌細胞を実際には、は とんど抗体の非分泌型である不死化された細胞１通常は骨髄腫細胞系との融合に よって製される二重雑種（ハイブリッド）細胞である。この分泌細胞は、免疫処 理された動物から種々の手段によって採取することが可能であり、腫瘍系は培養 によって成長する。融合の目的及び効果は、多くの異なる不死雑種細胞を製する ことであり、この雑種細胞は免疫処理に用いられる抗原のうち１つの抗原決定基 だけに特異的な単クローン性抗体のような規定生合成された標的分子を製し分泌 する遺伝子を保持する。

ハイブリドーマの最も一般的な発生方法は、２つの型の細胞の直接積み重ねる融 合によって行われるが、不死化された細胞を分泌する抗体は軽質転換するウィル ス粒子の存在下においてヒトＢ細胞の融合のような危険な方法によって製された 。この方法はマウスの細胞に開発された方法を、人間の細胞への直接転換した場 合、非常に無駄が多かったために開発されたものである。このような不死化され た細胞も通常の骨髄腫細胞ハイブリドーマとは異なり、これらの形質転換した細 胞の正確な因果関係が知られていないので使用法は定まっていないが、ハイブリ ドーマと呼ばれている。

現在のハイブリドーマ製造方法は、一連の別個の段階からなる。

（この製造方法ではマウスを用いている。）１）予め抗体にめられる抗原に、免 疫化した動物からＢリンパ球細胞を抽出（場合によっては肺臓切除によって）す る。総セル数内のＢリンパ球の相対比を高める方法を採取した後に用いてもよい 。

ｉｉ）リンパ球は、骨髄腫細胞のような適した不死化細胞系と混合され、この混 合物の細胞間の融合は以下に示すものによって行われる。

ａ）化学的手段−例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加 ｂ）融合促進ビールスまたは Ｃ）短時間強い電界に露す。

時にはこれらを組み合わせて用いてもよい。

短時間電界に露すことにより電気穿孔及び電気融合する。これらの現象は例えば 、米国特許第４．４４１．９７２号及び、同第４゜８３２．８１４号に記載され ている。

１１１）生存しかつ融合した細胞の選択及び培養。この融合工程は単−及び骨髄 腫−骨髄腫、リンパ球−リンパ球及び、骨髄腫−リンバ球パートナ−の複数の融 合による融合細胞を製する。

適した不死融合パートナ−が選択された場合、骨髄腫−骨髄腫の融合細胞は、特 別な成育培養液、ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンによって補足さ れた典型的な通常の培養液で培養することによって除去され、これらの融合細胞 は、この培養液内では生存できない。

正常リンパ球−正常リンパ球融合細胞は生存し、限られた数の細胞分裂を行う。

骨髄腫−リンパ球融合細胞のいくつかは長期の培養後、生存可能である。これら の生存した融合細胞はハイブリドーマであるが、これらは目的とするハイブリド ーマである必要はなく、限定された生合成標的分子を製するものである必要はな い。

ｉｖ）生存したハイブリドーマは抗体、特に元の抗原に特異的な抗体を製するの を確実にするために振るい分けられる。時間がかかり、困難なこの処理で必要と される抗体を製するクローン融合細胞が得られた場合、この細胞は多量の単クロ ーン性抗体を製造するために培養育成することが可能である。

■）ハイブリドーマの遺伝安定性の試験は、長時間に亘る培養及び再クローン化 によって行わなければならない。

ハイブリドーマとして不死Ｂ細胞に採用された方法学は、いくつかの限定された 生合成標的分子（例えば、ヒト及びマウスインターロイキン）を分泌あるいは臨 床、または商業的に有益ないくつかの機能（例えば、Ｔ細胞エフェクター機能ま たは食細胞的活性）を奏する細胞系として、他の別個の正常細胞種を不死化する ために用いられできた。

所望の生成物を分泌する細胞を生する現行の方法には、欠点及び限界がある（こ こではハイブリドーマの場合について例示する）。

１）典型的な１億の肺臓細胞を１千万の骨髄腫細胞のＰＥＧ仲介融合に於いて、 得られる融合細胞は１．０００以下で、その内４または５つ、時には０のクロー ン細胞しか所望の特異性を有する抗体を製することができない。このことにより 、１度に５乃至１ｏ回の融合作業を行わなければならず、適したハイブリドーマ を得るためにさらに困難な処理を行わなければならない。

融合の確率は、非常に短時間の強力電界に細胞を露すことにより高くなる。この 工程は、この明細書の終わりの部分に示した参照例５で見られる「電気穿孔法」 として知られている。しかしながら、懸濁液内の細胞の融合確率は、米国特許第 ４．８３２，８１４号に見られるよう１．５Ｘ１０’と低いままである。

より高い融合の成功率は、電界に露す前に懸濁液の所望の型（即ち、骨髄とＢ細 胞）の対の細胞の連結及び、隣接させるのに効果のある化学薬品を用いることに よって達成される。この方法は、広範囲な使用ができない、何故なら複雑で汚染 または効力が少ないと思われているからであろう。このことは特に、細胞面で小 さい影響率で生じる分子が、免疫化及び融合で重要な抗原である場合顕著である 。

ｆｉ）細胞間の融合工程は無差別に行われる。融合のための細胞の選択の不足は 、細胞の特異性の２つの段階で生じる。

ａ）非雑種融合 この工程の識別性が欠けているので以下のものが生成される。

リンパ球−リンパ球融合細胞 骨髄腫−骨髄腫融合細胞 リンパ球−骨髄腫融合細胞、これらが唯一の雑種融合細胞であり、有用な融合細 胞である。

ｂ）非選択雑種融合 製せられるこれらのリンパ球−骨髄腫融合細胞は、無差別に製せられる。目的の 抗体を製するリンパ球だけを骨髄腫細胞と融合させる選択的機構は存在せず、不 均一な細胞融合混合の発芽後成長の数週間後、これらのハイブリドーマを、単離 しなければならない。

ｉｉｉ　）この方法は、５つの別な融合後の選択処理を必要とし、この処理には 汚染または選択方法の失敗によるハイブリドーマが損失するという危険を伴い、 これら５つの処理とは、ＨＡＴ選択（７日間に亘る培養供給を含む）、抗体分泌 型の離隔、クローン化、特定の抗体の検定及び最終的なりローン化である。ＨＡ Ｔ選択は骨髄腫細胞系がＨＡＴ感受性である場合のみ効果があり、このことによ って現行の方法に於ける融合相手の細胞の選択が大きく限られてしまう。

このことによって、従来の方法によるヒトハイブリドーマを発生させる上で大き な障害であるということが証明された。

前記の電気融合方法では、確実に３つの現象が発生すると言われた。その内の第 １の現象は、細胞が非均−な無線周波数電界に露された場合の細胞の動きに関す る誘電泳動現象である。この現象は、ボール（Ｐｏｈｌ）（参照１）による専攻 論文で詳述されている。

非均−な電界は通常無線周波数信号を、非均−な電界を発生させる円筒状ワイヤ 形状の電極に加えることによって発生し、ボール（参照１及び米国特許第４，４ ４１．９７２号）の文献によって、細胞は電界が最もワイヤ電極に対して強力で ある領域に向かって集まるということが明らかになった。ボールはまた、細胞の 誘電泳動は低電導率の懸濁液中の細胞を懸濁することによって著しく促進すると いうことも示した。無線周波数電流が非常に多く（百方単位）の細胞の懸濁液を 含むこのような溶液を介して通過する際、各細胞の周囲の間隙は、電界が不均一 である領域になり細胞の表面に近づくごとに増大する。ボール（参照１）及びシ マーマン（参照５）は、このことにより細胞は通常バールチェーンと言われる直 線状の鎖に細胞自体を整列させるということを示した。電気融合に於ける第２の 現象は細胞膜の破壊である。この工程は、大きいが非常に短い電流パルスがセー ル及びハミルトン（参照６）によって教示されたように、細胞の懸濁液を介しで あるいはコスタ−及びシマーマン他が（参照２．３及び４）によって示したよう に単細胞内を通過する際生じる。このような細胞膜の電気破壊はセール及びハミ ルトン（参照６）及びセペルス他（参照７）及びシマーマン他（米国特許第４゜ ０８１．３４０号）によって教示された細胞膜の電気穿孔と言われる細胞膜透過 性の増大につながる。第３の現象はニューマン他（参照８）、シマーマン他（参 照９）、ボール（米国特許第４．　４７６゜００４号）、ロック（米国特許第４ ，８３２．８１４号）、ホフマン（米国特許第４．５６１．９６１号）及びマー シャル（米国特許第４．９０６，５７６号）によって教示されたように、細胞が 最初に非均−の電界の直線状鎖に整列し、それから電気的破壊を受ける際生じる 細胞の融合に関するものである。誘電泳動によって「バールチェーン」に整列し た細胞は、細胞の懸濁液から無作為に取り出され、次に多数の融合が殆ど予知で きない方法で、多くの「バールチェーン」の隣接する細胞間で生じる。本発明の 装置及び方法は、選択的に１つの特定の属性（例えば分泌Ｂリンパ球）を有する 細胞（または媒介）と、異なる属性（例えば骨髄腫細胞）を有する他の細胞（ま たは媒介）を選択的に操作し、これら２つの細胞を一つの対の細胞として束ね、 この一つの対の細胞だけを融合することによって、先行の電気的融合を改良した ものである。

発明の説明 本発明は第１の態様において、規定リガンド（配位子）を発現させる細胞、媒介 または分子の選択的回収のための方法に於いて、この方法は標的の表面に配位子 または規定配位子に相補性のある配位子を付着させる工程、い（つかの細胞、媒 介または分子が規定配位子を表現あるいは発現する電導液内の細胞、媒介または 分子の懸濁液または溶液内に標的を導入する工程と、規定配位子を表現あるいは 発現する細胞、媒介または分子のうち少なくともいくつかを標的に接続するよう に移動させ、懸濁液または溶液中の一対の電極間に好適な周波数９強度及び不均 一性の交流電界を生じさせることによって相補性配位子と結合させる工程と標的 に結合した細胞、媒介または分子を懸濁液の少なくともいくつかの他の細胞、媒 介または分子から分離させる工程からなる。

絶縁電気泳動を低電導率媒体を介して細胞、媒介または分子を移動させるのに用 いてもよく、これによりこれらの経路、例えば時には標的上の相補性配位子に付 着する機会を有する開放メツシュに設置された標的と接触し、前記細胞等は標的 に結合するかあるいは横断するか標的を介して通過する。

本発明の好ましい実施態様に於いて、標的は実際相補性のある配位子が好適に塗 布された電極のうちの１つである。一定の範囲に亘る電界の周波数９強度及び不 均一性によって細胞は電極から分離し、この効果は細胞の種類によるものなので 、選択的に標的上の細胞の混合物のサブセットを保持することが可能でり、一方 他の細胞のサブセットを標的から分離することもできる。第１の電極上に細胞を 最初に誘引するこの方法は、いくつかの場合定常電界を用いることによって補わ れ、細胞を付着させるのに用いられる交流電界は必要とする細胞を塗布された電 極に誘導するような周波数でなければならず、細胞に働く力は連続的に変化する が、周波数は単調子でありかつ細胞の種類によって異なるので、選択的に特定の 電極に向かって選択された細胞を分離することが可能である。本発明は融合工程 を容易にするために回転または変換によって操作することも可能である。

本発明の第２の態様では、電導液の少なくとも２つの異なる種類の細胞、媒介ま たは分子の懸濁液または溶液中の細胞、媒介または分子を分離する方法に於いて 、この方法は一種類の細胞、媒介または分子を前記電導液を介して電極の方へ選 択的に移動させ、同時にまたは連続的に、前記電導液を介して電極から離れるよ うに移動させる周波数１強度及び不均一性の交流電界を前記電導液内の２つの電 極間に生じさせる工程と、電極の方へ移動したこれらの細胞、媒介または分子と 電極から離れて移動するものとを分離する工程からなる。

本発明のこの態様では、交流は１種類の細胞のうちいくつかまたは全てが少なく とも１つの電極と接触する迄保たれ、残りの細胞はその後電極からフラッシング されて除去される。

第３の態様では、選択された第１の細胞を選択された第２の細胞または媒介を単 一の融合細胞を形成するために融合する方法に於いて、前記選択された第１細胞 を単離する工程と、この細胞を前記第２の細胞または媒介を並列に配向させ、好 適な周波数９強度及び不均一性の交流電界によって細胞及び媒介を並列位置に保 持する工程と前記の細胞及び媒介を融合させる工程とからなる。

融合される細胞は原核または真核細胞であってもよい。本発明の好ましい実態態 様では、これら細胞は哺乳類細胞でさらに重要なことは、これら細胞のうち１つ はヒト細胞であるということである。

本発明による方法では、細胞内にプラスミツド（染色体外遺伝因子）のような媒 介またはリポソーム、小胞または変形した原核または真核である有用なりＮＡま たはＲＮＡを含む人工構造物を導入するために用いてもよい。ここで用いる媒介 という言葉は、自然発生または構成されたものであってもＤＮＡまたはＲＮＡキ ャリアーを意味し、細胞膜を介してＤＮＡまたはＲＮＡを移動させるものである 。

本発明の第３の実施態様による方法は、所望の分子種のための遺伝子暗号を表現 する細胞を不死細胞と融合するのに用いられる。所望の分子種は抗体であっても よいが酵素、成長因子、壊死因子または他の生合成配位子または生物分子でもよ い。本発明は他の用途に用いてもよい。２つの未発達細胞を倍数融合細胞を製す るために融合させることが可能であり、または２つの単相細胞を新しい２倍体の 融合細胞を製するのに用いることが可能である。

第１の態様による方法は、選択的な実施態様に於いて特に多くの組織培養を用い る際１つの細胞だけを含む少数の細胞の選択及び操作を必要とする処理を行うの に有用である。またこのような実施態様において好適な電極の形状寸法で及びま たは、それ自体は電極ではない選択的標的を細胞の混合物の均一なサブ・グルー プ内へのセパレーターとして使用することも可能である。

好ましい実施態様に於いて、本発明の目的は先行技術に関連する問題を克服する ことにある。本発明の方法では生物細胞及び細胞状媒介の選択、並置及び対をな す融合を行う。本発明の好ましい実施態様による方法により次の工程が実施され る。

ｉ）融合または他の目的、例えば特定の細胞を濃厚にするための選択。抗原特異 性を有する単クローン抗体分子を分泌するか、選択工程（抗体分泌型ではなく細 胞雑種型のための）で採用された（生）化学薬品に特異性を有する生合成分子を 分泌する細胞だけを選択する。

１ｉ）９０％以上の効率で、特異的抗原または他の標的分子を選択された融合パ ートナ−（骨髄腫細胞または他の不死細胞）と対をなす、特異的二元融合。

ｉｉｉ　）　ＨＡＴのような栄養感受性を必要とせずに、分泌または合成可能な 不死二元雑種を製するための通常の細胞を製造及びまたは分泌するための融合パ ートナ−として所望の細胞系からの細胞の採用する機会。

ｉｖ）融合後の特異性を有する生物的生成物の安定した分泌型の選択。この選択 は本発明の第１工程を今までの融合後の培養工程の代わりに良いものを抜粋する 工程として用いることによるものである。

先行技術の製造方法に用いられるいくつかの工程は本発明では採用していない。

本発明の方法は、単クローン性の抗体及び他の分泌型細胞生成物に適応した新規 かつ独自の方法を提供するために細分化されている。

本発明の方法により、ヒト単クローン性抗体及び他のヒトの器官の分泌型細胞生 成物の生成が可能になった。

図面の簡単な説明 本発明の好ましい態様を添付の図面を参照し詳述する。

第１図は細胞（１０）の簡単なモデルを示した図であり、この組織では比較的高 いコンダクタンスと誘導率の均一な内部（１１）は対向する属性の薄い膜（１２ ）によって包囲されている。

第２図は周波数依存分力のカーブの一例であり、細胞の単一モデル用周波数の関 数として表し、モデル細胞自体は低電導率の水溶液に懸濁されている。

第３図は標的抗原（１４）が塗布された電極（１３）の略図であり、この電極は 化学的選択性電極の一例である。

第４図は細胞（１６）が塗布された電極（１５）の略図であり、これらの細胞は 非特異的に電極に付着し、その表面に標的抗原を表現させる。

第５図は、第３図の電極にいくつかの通常の抗体分泌細胞（１７）が以下に説明 する電気化学的選択方法を用いて付着した電極の略図。

図６は、第４図の電極（１５）に多くの分泌（通常抗体分泌）細胞（１８）が付 着した状態の略式図。

第７図はいくつかの不死、パートナ−細胞（２１）が付着した電極（１９）を略 式に示した図。

第８図は、２つの融合細胞だけを強固に付着成長させるために第５図の電極（１ ３）上の細胞（１７）並列位置に隣接させた第７図の電極（１９）の細胞（２１ ）の略式図。

第９図は、２重細胞融合を融合細胞（２２）を製するために生じさせた後の第７ 図の電極（１９）の略図。

第１０図は本発明の一実施態様による方法を実践するための細胞反応器の平面図 。

第１１図は、第１０図の細胞反応器の横断面図。

第１２図は、第１０図の細胞反応器で用いられる電極（３１）の略式側面図。

第１３図は、本発明の方法を実践するための融合チャンバーの略式平面図。

第１４図は、第１３図の略式平面図の側面図。

第１５図は固定融合及び移動電極の三次元構成の略式投角投影図。

第１６図は、第１３図の融合チャンバー内に正圧を適用することによって、分泌 型細胞を導入する変位ピペットの略式側面図。

第１７図は、第１３図の融合チャンバーから未付着細胞を取り出す変位ピペット の略式側面図。

第１８図は、第１３図の融合チャンバー内に螢光パートナ−細胞を導入する変位 ピペットの略式側面図。

第１９図は、第１８図に示した変位ピペットで導入された細胞のクラスターから パートナ−細胞を抜き出すための電界の使用を例示した略式側面図。

第２０図乃至２４図は、細胞の移動作業を例示する一連の、平面にて示した拡大 略図であり、この作業１捏によって単一のパートナ−細胞が細胞融合に好ましい 形状の１対の融合細胞を形成するために、通常の分泌型細胞に付着する。

第２５図は融合の準備が整った１対の細胞の略図。

第２６図は、融合用にパルス化された電界を加える前に前記電界によって密着、 伸長した状態を示す。

第２７図は、第１３図の融合チャンバーの固定電極に融合後に付着したいくつか の対の細胞の略図であり、変位ピペットは未融合細胞（４４）を取り出している 状態に示されている。

第２８図は融合した対の細胞を示す略図であり、各必要な種類から１つの選択さ れた細胞がらなり、この融合した細胞は２つの電極間で溶液の所定の位置にいず れの電極にも触れずに位置し、２つの電極を介した融合用にパルス化された電界 を加える前に既にある電界によって密着伸長した状態にある。

第２９図乃至３０図は、何回か細胞分裂した、培養された融合細胞に適用される 電気化学的選択工程の略図であり、抗体を合成し表現させるこれらの細胞は、融 合前に正常な分泌細胞の電気化学的選択のところで述べたように抗原が塗布され た電極及び他の電極を採用することによって分離しない細胞から分離させること が可能である。

第２９図は選択電極に引き付けられる細胞を示す。

第３０図はいくつかの細胞を化学的に接着させる電気力による付着を示す。

第３１図は電極から解除された細胞の反発状態を示す。

本発明を実施するための実施態様 本発明の以下の方法を説明する。

１、分泌細胞のための細胞の選択方法。

融合に用いるための細胞の選択工程の好ましい実態態様は２つまたはそれ以上の 電極間で発生する複数の波形１強度及び周波数の直流及び交流電界によって発生 する力を利用し、前記電極のうち１つまたは２つ以上は中性の化学薬品が添付さ れ、それとは別の電極には抗原または標的細胞に付着する他の標的分子（配位子 ）が塗布され、これにより融合工程で用いるための１つまたはそれ以上の細胞の 付着が確実になる。これら電極の周波数及びその勾配は電界の強度及び方向が周 波数に依存するので所望の細胞の最適な選択を行うために調整することができる 。種々の細胞及び媒介用に周波数による力の変化の度合は、細胞及び媒介の膜及 び内部構造及びその構成によって変わる。この実施態様では付着した細胞を融合 位置に移動させ、そこで融合の予備段階として細胞をパートナ−の形に形成する 電気力及び電気化学的マニュピレータ−が用いられる。

第１図に示す如く、膜（１１）によって包囲された細胞（１ｏ）が水性培養液（ １２）内に懸濁されている。細胞の内部は比較的高いコンダクタンスと誘電率を 有し、細胞膜（１工）は対向する属性を有する。水溶液の導電率は低い。第２図 は、交流電界の周波数が細胞（１０）に加えられることによる細胞上の誘電泳動 の変化を示したものであり、前記泳動力は電界の強度の２乗（ＶＢ２）と、この 図で示した関数ｆ（α）の積の勾配に正比例し、実際の生物細胞の場合、非均− な電界の力は細胞膜及び内部構造及び構成によって変化させ、細胞の種類が変る ごとに変化する。第２図の曲線は相対誘電泳動力を下記の要件の交流電界の周波 数の関数として示したちのである。

細胞膜の誘電率（ε　）＝：１ｏＥ。

細胞質の誘電率（ε　）＝６０εＯ 外部媒質の誘電率（ε　）＝８０Ｅ。

細胞質の導電率（σ　）　＝１．　Ｏ３，ｍ−’外部媒質の導電率（σ　）＝Ｏ ，０ＯＩＳ、ｍ−１細胞膜の厚さくδ）＝１０ｎｍ 細胞の半径（Ｒ）＝１０μｍ 動力はＦ＝２πε　Ｒ（ＶＢ２）ｆ　（α）によって得られ、この場合（ＶＢ２ ）は電界強度の２乗の傾きであり、ｆ　（α）は第２図で示した関数である。一 対の電極の電界は、これら電極に交流信号を加えることによって設けることがで きる。電極面での電界あるいは電極間のいかなる位置の電界は、電極の形状寸法 （例えば直径）またはそれらの位置（例えば離れ具合）から計測することが可能 である。さらに溶液に亘って現れる、加えられた交流信号の割合を定める必要が あり、この割合が電極溶液の界面で形成する電気的２層に亘って現れる。溶液に 亘って現れる、加えられる総電位の割合は交流電位の周波数、溶液のイオン組成 物及び電極の特性により変わる。周波数による変化は、電極−溶液構成の１イン ピ一ダンス分散」として知られる工程によるものである。溶液に亘って現れる電 界の割合のみが溶液中の細胞または媒介の誘電泳動に貢献する。電極の２重層に 亘って現れる電位の一部分は、電極−溶液の界面での分子結合工程に貢献する。

選択工程の他の実施態様では、例えば螢光活性細胞分類、ＦＡＣ８が細胞または 媒介の全であるいは殆どを導入し関連する電極に付着させることによって所望の 生合成標的分子を製することを確実にするために採用されているので、電極のう ちいくつかあるいは全てを塗布する必要がない。このことは特に標的細胞がＢ細 胞系の細胞を製する最終分化抗体である形質細胞と供に生じるので、生合成され た限定配位子を合成するが、その表面に現さない場合に用いられる。

例えば好結果の融合後の培養で成長する望ましい雑種細胞の選択に於いて用いる 細胞選択工程の好ましい実施態様では、選択周期の異なる段階で電気化学的選択 法を採用しており、この方法は、この明細書の実施例で第２９．３０及び３１図 で略式に示す。

（ａ）細胞の選択 電気化学的選択法に於いて、規定配位子を相補する配位子を少なくとも１つの電 極に設けることが可能であり、また例えば相補性配位子分子が付着するプレーン 通気性ポリマーシートであり、標的支持配位子と接触する細胞の動きを別の電界 によって誘導することが可能な別の標的に配位子を設けることも可能である。こ のような非電極標的は容量の大きい及びまたは多数の非分化細胞から規定配位子 を表現させる細胞の予備濃縮に有利である。

必要とされる抗体を表現する細胞は、選択的に水溶液または良性張度及び性質の 非水性溶液内の電極に付着する。電極は通常、円筒状のワイヤ電極であるが、必 ずしもこの棒状の電極である必要はない。

例えばソルビトールまたはグルコースまたは他の糖質からなる等浸透圧の低導電 率の水性媒体に細胞懸濁液を用いると効果がある。

これら２つの主な特徴の理由は、水溶性に関して言えば、適切に用いた場合細胞 の生存度が良くなるということであり、低伝導率は、別な電流が媒介を介して通 過する際、細胞によって経験される電界を最大にすることに起因する。

この作業は僅かな数の細胞と非常に少量の溶液を要し、全ての工程は光学顕微鏡 で行われ、作業全体を顕微鏡で監視することが可能である。

ｉ）細胞選択用電極の構成 電極には抗原が塗布され、この抗原に分泌細胞が抗体を製し、または規定配位子 とは別の配位子が塗布され、この配位子に細胞が目的とする規定生合成標的分子 すなわち規定配位子を製する。ここで言う抗原とは、目的の抗原を表現すること が知られているが抗原分子が単離していないあるいは精製状態で容易にまたは全 く得ることができない全細胞を意味する。仮に抗原が目的とする抗原を表現する 全細胞である場合、電極は最初にこれらの細胞で塗布される。これはこの後で詳 述するいくつかの方法で行われる。

抗原による電極の塗布作業は第３図に示すように、好適な濃度の抗原を含む溶液 内で電極を浸漬することによって行われる。塗布工程は交流及びまたは定常電界 １変化可能な電位及び変更可能な時間的間隔、例えば塗布工程のいくつかの段階 でパルス化することによって促進させてもよい。従って最適な周波数、電界強度 及び電界勾配の交流電界と定常直流電界を組み合わせたものを用いることによっ て抗原または他の配位子を電極の異なる好ましい配向に付着させることが定常直 流電界の電位を変えることにより可能である。

１１）細胞を表現する抗原を有する選択性電極抗原を純粋な状態あるいは自然の 構造で入手できない場合（例えばタンパク質が精製処理によって変性される場合 ）は、抗原が抗原分子を表面に表現する細胞に表れる場合を除いて、選択電極を 細胞の懸濁液に浸漬し、この電極とこの電極から離れて位置する電極間に好適な 周波数（通常無線周波数）の交流電界を加えることによって、前記細胞を塗布す ることが可能である。細胞はその後電気的選択すなわち細胞を電極に誘引する誘 電泳動力によって電極に付着させることができる。標的細胞の選択的付着工程は 定常電界を用いることによって、ある場合補助される。一度抗原細胞が電極の表 面を覆った場合、これらの細胞は短い（マイクロセコンド）電気パルスを用いて 永久的に付着する。このようなパルスによってその強度及び期間が適正であれば 、細胞の表面の分子を電極に付着させることができる。もっとも適したパルスの 強度と期間の選択は細胞の種類によって決まる。付着した際、これらの細胞は交 流または定常電界が取り除かれても電極に付着したままである。しかしながら細 胞が強固に付着することは本発明の方法の必要条件ではない。

ｉｉｉ　）他種から誘導された抗体を有する選択電極ある場合、上記ｌｉ）項で のべたように電極を塗布するための細胞を表現する抗原を用いることが望ましい が、これらの特定の細胞だけからなる懸濁液は簡単に製することはできない。こ のような抗原のために異なる動物種のハイブリドーマから誘導される単クローン 性抗体または抗原に反する多クローン性抗体またはこれらいずれかの抗体の分子 フラグメントが使用可能である。この場合、電極は最初に種抗体あるいはその分 子フラグメントで目的の細胞によって表現される抗原に対抗して塗布されなけれ ばならない（他の細胞とこれら細胞の混合物のみが使用可能だとしても）。抗体 による電極の塗布は上記１）項で述べたように行われる。抗体が塗布された電極 は目的の抗原を表現する細胞を選択して、その細胞で電極自体に塗布するのに用 いられる。この工程は次の項で説明するが、ここでは電極を抗原を表現する細胞 で塗布することについて述べたが、次の項ではこのような選択電気がどのように して抗体を分泌する細胞によって抗原に塗布されるかについて説明する。

ｉｖ）電極または他の標的の予備塗布作業いくつかの場合、最初に電極または他 の標的をポリアミド、タンパク質Ａ、アビジンまたは他の強いが必要以上に選択 的に吸収する面を有する物質などの単量体または多量体物質を薄く塗布する必要 がある。電極または他の標的自体は伝導有機物質、例えばヨウ素トープポリアセ チレンまたはポリピロール等がら構成される。

ｂ）正常分泌細胞での電極の塗布 選択電極の塗布後に残存する非結合細胞のまたは分子の試薬は好適な手段、通常 新鮮な溶液によるフラッシングで除去される。先に選択電極に塗布された分子ま たは細胞は電極に付着したままで目的の細胞を確実に付着させる準備が整えられ たことになる。

目的の分泌型細胞を含むが、これらの細胞だけから構成される必要のない細胞の 懸濁液は電極チャンバー内に導入される。この細胞の混合物は正常細胞、細胞系 の不死パートナ−細胞または好適な媒介と融合される目的の生合成された分子の 生産者を含む。これらは典型的な外皮血液または他の、時には選択標的及び誘電 泳動によって及びまたは血液学による標準細胞分裂法または螢光活性細胞分類に よる細胞分類によって部分的に濃厚になる好適な器官（へん桃腺。

絆臓等）から得られる新鮮なリンパ細胞である。いくっがの用途に於いて、これ らは培養細胞、処理または非処理、正常または非正常細胞であってもよい。

上述の通り、電気化学的選択により選択的に誘引及び付着させ、その後さらに化 学的に選択する電極上の細胞の混合物の一部を保持することが可能である（第２ ９．３０及び３１図参照）。第１の電極上への第１の細胞の誘引工程は多くの場 合、正常電界を用いることによって補助され、細胞を引き上げるために用いられ る。交流電界は必要とする細胞が塗布された電極に引き付けられるような周波数 でなければならない。この電界の強度も互いに隣接する細胞の融合または細胞の 電気的破壊を招かない程度の低いものでなければならない。電界の強度は懸濁さ れた細胞を細胞の表面のタンパク質分子を変性を必要とせずに生じる局部的特異 化学結合を化学的に選択する電極上に序々に生じさせ、このようにしないと細胞 は無作為に電極に結合してしまう。電気的選択の反発作用を適切に用いた後、塗 布された電極上の塗布物と相補性のある正しい抗体を排出し、従って電極に充分 強く結合した細胞だけが付着した状態を維持する。

加えられた電極を抗体−抗原結合工程と相反する電界に変えることによって高い 親和性の抗体を表現する細胞だけを選択的に保持することができ、この対抗する 電界の強度は正常電界の強度及び方向を調整し、交流電界の周波数及び強さを変 えることによって調整することが可能である。

別の実施態様では、選択性電極は多孔性の電気導電性の材質からなり、細胞は電 極の一側面に吸収することによって電極に引き寄せられる、不必要な細胞の除去 はバックフラッシュまたは上述の方法によって行われる。

２、不死細胞融合パートナ−の選択 懸濁液に残ったいかなる分泌型細胞も水溶液で徐々にフラッシングするか上述し た他の方法で除去される。

ハイブリドーマの生成の場合、不死（例えば骨髄腫）細胞が同じチャンバーまた は隣接するチャンバー内に導入され、このチャンバーはいくつかの実施態様では 細胞が懸濁される水溶液で満たされた流路で第１チヤンバーと連通している。前 記不死細胞は別の非塗布（非選択）または塗布された化学的選択電極に付着され ることができ、この電極はチャンバー内のこの電極ともう一方の電極間に交流及 びまたは正常電界を加えることによって、パートナ−細胞を特異的に結合する。

適した電極の形状寸法の選択、電界の強度、波形。

加えられる電界の強度の制御及びチャンバー内に導入される不死細胞の数を制御 することなどにより所望の数の１つの細胞を含む細胞をこの電極に付着した状態 で保持することが可能である（第７図参照）。

不死細胞が付着する電極にも必ずしも必要ではないがポリマー。

タンパク質または上述した通りに付着する前に、不死パートナ−細胞に特異性を 有する分子を結合する抗原または他の配位子を含む他の物質で塗布することが可 能である。このことは、ある場合、抗原感作選択電極上の正常細胞も塗布された 電極に付着するので、このような予備塗布はさらに対称的電界分布を提供する上 で有利である。

しかしながら、不死細胞に用いられる電極の予備塗布作業は必ずしも必要ではな いということが判明した。いくつかの場合、２つの電極で電界強度の勾配で不整 を故意に生じさせることは有利である。

このことはいくつかの実施態様において誘電体の層で電極を塗布する及びまたは 異なる曲率または他の形状寸法の電極を用いて行われる。この特性は下記に示す 細胞移動作業において有利である。

３、選択された対の細胞を最適な融合状態に密着させる。

所望の雑種細胞を製する上で重要な事は、２つの選択された融合される細胞を１ つの対の細胞に結合させることである。このことは３つの好ましい方法のうちの １つによって行われる。第１の方法では、パートナ−細胞を支持する電極をマイ クロマニュピレータ−内に保持し、このマイクロマニュピレータ−によって、作 業員は電界によって保持された細胞を細胞選択電極に付着した分泌型細胞と接触 させ、従って選択された分泌型細ねと選択された不死パートナ−細胞を対をなす ように直接接触させる（第８図参照）。

細胞を対をなすように融合する第２の方法では（第２０乃至２４図参照）、パー トナ−細胞は移動電極によって搬送され、マイクロマニュピレータ−内に保持さ れ、機械的操作と電界の強度及びまたは周波数の変更（一時的または永久的）の 組み合わせによって前記電極から分泌型細胞上に移動させ、これにより前記電極 上の細胞またはこの電極上の別の細胞に非選択的に付着した細胞を分離させ、電 界の影響下で選択電極に保持された分泌型細胞上に移動させる。

この第２の方法をここでは「細胞移動作業」と呼ぶ。

細胞を対をなすように融合する第３の方法はそれぞれ必要な種類の予備選択され た細胞を単独で別個に融合チャンバーに導入させ、この導入の際電極は必要とし ない。この細胞の移動において、それぞれの役割を反対にすることも可能である 。

この対の細胞はその後、例えば実施例４で示す方法で電界の２乗の傾きによって 変化する力を加えることにより互いに対向位置に設置される。それからこの対の 細胞は完全にまたは部分的に固定化され、これにより対の細胞がどちらの電極に も付着していない間の融合が可能になった。

種々の実施態様は好適な融合を行うために、対の細胞を並べることが可能である が、第２６図に示すように同時に圧力下及び伸長下で細胞を保持するために好適 な強度２周波数、波形、傾き及び期間の交流電界を採用し、必ずしも必要ではな いが次項で詳述する方法で序々に融合する迄接触を維持することも必要である。

４、選択された対の細胞の融合 一度選択された分泌細胞及びその不死融合パートナ−を強固にしたならば、細胞 は短い（マイクロセコンド乃至ミリセコンド）パルス化された電界（電気融合） を加えることによって融合され、この電気パルスは分泌型細胞と不死細胞を各々 支持する電極間に加えられる（第８図参照）。また他の実施態様では、パルスは 付着した細胞が細胞移動工程（第２０乃至２４図）によって選択された正常細胞 の頂部に位置するように移動する電極及び融合される対の細胞と接触（第２５及 び２６図）あるいは接触しない（第２８図）別の離れた電極間に加えられる。ま たこれとは別に、融合化学物質（例えばＰＥＧ）またはウィルスによる仲介（例 えばエプスタイン・バーウィルス）を局部的にマイクロピペットを介して（化学 的融合のために）チャンバー内に導入することができ、または電界と融合作因（ 電気化学的融合）を組み合わせたものを用いることも可能である。

融合パルスが送られた後、このパルスは並置する交流電界をその予備融合値で保 持する場合もあり、しない場合もあり、しかしこの電界の保持は融合を促進させ る上で有用であるということが判明した。

強固な付着の維持はいくつかの場合、それによって細胞融合に必要な細胞膜を電 気的に破壊させるだけで十分であり、即ち一時的な電界パルスを用いないという ことであり、このことは選択的実施態様として処理される。

必要な電気パルスの最適な期間及び強度は２つの細胞の特異性（細胞の大きさを 含む）、水溶液のイオン強度及び組成、水溶液の強度及び他の生理的要件によっ て決まる。しかしながら、容易に９０％以上の確率で得られた融合雑種細胞を溶 解させずに対の細胞を融合させることが可能である。

５、融合細胞の操作 融合作業から融合を取り除（いくつかの標準的方法がある。細胞はマイクロピペ ット及びまたは可動電極（マニュピレータ−に取り付けられた）を操作すること によって取り除かれる。後者の場合、融合した細胞は溶液中のこの電極と離れた 同型の電極間に弱い交流電界を用いることによって、電極上に保持される（第９ 図参照）。

この融合した細胞は融合チャンバー内に付設された溜めに貯えられるか水性相内 の別の所に後で培養溜めに移動させるために移送される。

融合細胞はまた標準的育成培養液及びまたは酸性度の高い溶液に露すことによっ て電極から解放される。それから融合した細胞はチャンバーからフラッシングさ れ且つ培養のために集められるかあるいは他の好適な手段によって培養溜めに移 送される。

さらに変型例として、融合した雑種細胞は融合チャンバーに、電極に付着した状 態あるいは離れた状態のままにし、好適な培養液と融合チャンバー内の溶液を取 り換えることによってインシラ培養することが可能である。

また別の実施態様では、通常の培養液に露す作業を変位ピペット（第１８図また は２７図参照）を組み合わせて行ってもよく、このピペットはコンピューター制 御のもと少量の培養液を取り出すための形状及び設計であり、この培養液の量は 手作業及びコンピューター、そして融合細胞をＵ字状に曲がったトラップまたは 保持装置を通過させるのに充分な距離で、変位ピペット内に抽出するような電界 を生じさせることによって調整され（第２７図参照）、その後ピペットと細胞を 空気を介してチャンバー外に取り出し、Ｔｅｒａｓａｋｉまたは他の培養器に移 す。

６、雑種細胞の短期発芽後成長 融合後、個々の融合細胞はそれぞれ成長因子または供給細胞で補足可能な好適な 媒介を含む別個の溜めに置かれる。５つの分解された周期後、本発明では限界希 釈法または本発明の変位ピペットを介した単一の細胞計量分配を採用しており、 これにより２５乃至３０の抗体を単一の細胞として新しい溜め及び先に免疫グロ ブリン（もし特定のハイブリドーマ内で免疫グロブリンＭ、　Ａ、Ｅ、Ｄが検出 された場合これらも）が取り除かれた新しい培養液内に再クローン化され、これ により本発明では各新しい溜めでの発芽後成長による標的抗体／イソタイプ生成 物の早期検出が可能になった。このことにより有用なりローンの選出及び無関係 なものの廃棄が可能になり、従って安定した好結果のクローンの検出時間を最小 限にし、作業工程を減少させることができる。

高生産率を有する溜めでは上述の方法で必要に応して高親和性の抗体を製する細 胞を分離させるために電気化学的選択が行われるか、核型の（別個に測定する） 安定性によって及びまたは抗体の製造データによって示されるように拡大または 上述のように再クローン化される。

７、融合細胞の遺伝的安定性 融合細胞及び関連する分子製造は長期に亘る通常の細胞培養法及び単クローン性 （または他の分泌型）生成物の例えばエリザ法などの標準検定法またはフローサ イトメトリック分析を用いて変化させることができる。細胞が充分な数に達する と核型化し、フローサイトメトリーによって表面免疫グロブリン検出を行うこと ができる。

また別にあるいは加えて、新しいハイブリドーマ（または他の雑種細胞）によっ て製された抗体の親和性及び選択性は上述の電気化学的選択法を用いて選択され た個々の雑種によって評価される（第２９．３０及び３１図参照）。この方法で は例えば抗原に強い親和性を示す雑種が他の雑種から選択され、上述の通りのチ ャンバーから取り除かれる。再培養後、この工程は必要であれば繰り返すことが できる。この再選択工程は別のパートナ−細胞と再融合は行わず、ハイブリドー マを発生させる既存の繰り返し行われる方法で必要とされる殆どの工程を必要と しない。

８、トリオ−７（Ｔｒｉｏｍａｓ　）　、クアドＣ１−７（Ｑｕａｄｒｏｍａ） 及び高分泌型の生成 上述した選択及び融合工程は、抗体を分泌する２つのハイブリドーマ細胞と異な る抗原の選択及び融合（クアドローマ）に容易に拡張することができる。このよ うにして２つの特異的抗体を排出するハイブリドーマを生ずることが可能になる 。ハイブリドーマ細胞と分泌Ｂ細胞と融合（トライオーマ）も同じような結果が 得られる。

このような抗体は診断及び治療に広範囲に用いられるようになる。

すでにいくつかの診断用途には採用されているものある。

また２つの同一のハイブリドーマを以下に示す方法で融合することも可能である 。これは第１のハイブリドーマの安定した二重融合されたクローンの融合を繰り 返すことによって単クローン性抗体の高分泌型そしてそれから、それらのジハイ ブリドーマ抗体等を製するために用いることができ、単一の雑種細胞内の複数の 遺伝子の描写を包含することになる。本発明ではこのようなジハイブリドーマ生 成プログラムを実行しており、下記の実施例を参照されたい。

９、他種の細胞及び既存の遺伝子の増幅本発明ではいかなる種類の真核生物を、 限定された細胞または媒介パートナ−と融合させることによって細胞系を発生さ せ、これにより真核生物雑種は例えばインターロイキン、増殖因子、血液生成物 等の分泌された分子である必要はないが通常のグリコジル化された形状の天然生 成物を製することが可能になった。

本発明はまた細菌細胞を、哺乳類細胞を融合することにより真核遺伝子の細菌伝 達体によって判明した現在の生成の問題を回避することができる。ハイブリドー マの遺伝子増幅作業は高い分泌率を得るためにこれらの細胞に用いることができ るが、この遺伝子増−幅の作業の制限回数はまだ判明していない。

特に遺伝子増幅が有益に作用するのは、哺乳類または植物細胞（真核生物）が他 の遺伝子（時には媒介を介し、この媒介はその宿主細胞の染色体内にそのＤＮＡ を組み込む）で移入するところで、このことはヒトリンパ球［イ］エチンでなさ れることと同じである。本発明独自の技法によって行われるこれらの真核のトラ ンスフェクト構造の断続的自己融合は通常非常に高価な生成物の繰り返し行われ る生成のための現行の構造に対して高生産性を有する細ね系を発生させる。

１０、本発明の方法の利点 本発明の方法には少なくとも好ましい実施態様に於いて下記に示す特定の利点が ある。

ｉ）非常に僅かな数の細胞だけを必要とする。１ｏの細胞（現在の方法では１０ ０万以上を必要とするのに対し）で所望の数の雑種細胞が得られ、従って提供者 の末梢血液から特異的な分泌型細胞が得られる。このことにより現在の方法では 不可能とされた多種類のヒトハイブリドーマ及び他の分泌型ヒト雑種細胞の生成 の可能性が広がった。

ｉｌ）ヒト細胞と他種（例えばマウス）のハイブリドーマは培養が速く行え、ヒ ト−ヒトハイブリドーマより強健な雑種が得られるという点で有利である。

ｉｉｉ　）この新しい作用周期は従来のものより短い。この新しい作用周期は養 殖及びクローン化工捏を必要としない、何故なら細胞は最初からクローンとして 育成され浮遊物は５日間の融合内で検定され、ＨＡＴ選択が必要ではないからで ある。

ｉｖ）必要であれば融合時を最も高い親和性と特異性の抗体を選択することがで き、融合後すぐに再び検定を開始することができる。

ｖ）ＨＡＴ選択が不要であるので、不死融合パートナ−の選択は従来の方法の栄 養素の感受性の抑制をする必要がない。

ｖｉ）ハイブリドーマ自体の連結する自然融合からいかなる特定の分泌された抗 体または他の自然生成物の高分泌率を有する新しい細胞系を製することが可能で ある。これにより１つの雑種細胞ごとの抗体の生成率が高くなった。

ｖｉｉ）単りローン性２元的特異性抗体を製するトリオーマ及びクアドローマを 製することが可能になった。このような抗体は診断器具及び他の安価で且つ簡単 に製せられる抗体に基づいた診断器具を製することができる。１つの特異性が抗 体を基体または機能性作因（フルオロクローム、毒素、核種等）に付着させ、第 ２の特異性はその標識表現によって標的「生産者」細胞に誘導される。

ｖｆｉｉ）ヒト細胞表面抗原例えばＨＬＡ抗原（ヒトリンパ球抗原）に対する単 クローン性抗体のためのヒト外皮血液（特定のＨＬＡ抗原に高度に免疫化された 人の）から他の細胞表面抗原にでは多く、前記抗原のみを対する抗体を製する分 泌細胞の選択方法は本発明の方法により簡潔になった。

実施例 新しいハイブリドーマ及び細胞雑種を製する異なる方法の実施態様を採用した一 連の実施例を以下に示し、前記ハイブリドーマ及び細胞雑種はそれら自体が可能 性及び商業用途を有する分泌生成物を製する。

実施例Ｉ ＫＬＨ抗原（鍵穴型笠貝ヘモシアニン）に対する抗体を生成するマウスハイブリ ドーマ 本発明の方法が鍵穴型笠貝ヘモシアニン（ＫＬＨ）の抗体を分泌するマウス細胞 ハイブリドーマを製するのに、いかにして用いられたかの詳しい実施例を下記に 示す。

笠貝などの海洋軟体動物のヘモシアニンは多くの免疫学の研究でモデル抗原とし て用いられてきた。これは簡単に清浄状態にすることが可能である。

電界強度、波形と周波数、溶液の化学組成、！Ｉ出待時間び他の全ての要件に対 する特異性はこの特定のハイブリドーマを製する上で効果的であると判明した。

１、方法 抗ＫＬＨハイブリドーマの製造は下記５つの工程に分けられる。

ｉ）マウス膵臓細胞を用意する。

ｉ　１）ＫＬ）（タンパク質で固定された電極を塗布する。

ｉｉｊ　）電気化学／選択法を用いて抗ＫＬ、Ｈ抗体を分泌する正常なりリンパ 球を選択する。

ｔｖ）単一の融合される対の細胞を形成するためにマウス骨髄腫細胞系ＳＰ２か らパートナ−細胞を細胞を操作する。

■）選択された対の細胞の融合 これらの工程をさらに詳しく説明する。

２．８リンパ球の用意 成長したマウス（バルブ／Ｃ系）を等張塩溶液１ミリリッターに対して０．１ミ リグラムのヘモシアニンを含む４００ミクロリツター溶液で免疫化する。免疫化 は腹膜の腔内へのタンパク質の注入によって行われた。最初の免疫化から１０日 後、マウスにＫＬＨの２次免疫注射をした。注射と抗体に反応したマウスの免疫 系は、これら免疫化されたマウスの血清に存在した。このことは免疫化されたマ ウスの尾から取られた血液を標準エリサ試験したことで明らかになった。

エリサ試験では、タンパク質抗体の存在が２つの段階で明らかになった。

最初に、プラスチックプレートの小さい凹部または溜めの底部及び壁部を抗原タ ンパク質で塗布する。試験溶液を前記溜めに入れた。

非免疫化マウスからの対照溶液別の溜めに入れられる。仮に前記試験溶液が前記 抗原の抗体を含むものであれば、抗体分子は溜めの壁部に結合するはずであるが 、対照抗体の非特異的結合が生じただけであった。

第２に、結合した抗体はマウスの免疫グロブリンに反抗する酵素結合した羊の多 クローン性抗体を含む溶液に露された。抗体に付着した酵素は無色基質から有色 へと変換した。従って正結合が生じたことが変色によって示された。

膵臓は、本発明の方法を立証するため正確に制御された結果を得るために免疫化 されたマウスと対照（免疫化されていない）マウスから取り出された。膵臓は赤 血球と他の種類の細胞と同様に、Ｂ及びＴリンパ球の混合物を含む。標準アンモ ニアクロライド溶解法によって９０％の赤血球が取り除かれた。残りの細胞懸濁 液はＢとＴリンパ球双方を含む。電気選択工程は、この細胞懸濁液で行われた（ ３を参照）。

非免疫マウスからの膵臓を摘出し、選択工程の効果を証明するために用いた。

３、選択及び融合チャンバー この実施例で用いられるチャンバーの略図を第１０及び第１１図に示す。この特 別なチャンバーはプレキシグラスで機械成型された２つの溜めからなる。２つの 溜めを隔てるプレキシグラスは流路（２５）にも凹部が形成されている。前記の 溜めが完全に溶液で満たされた時、前記凹部を介して液体は前記溜め間を連通ず る。最大容量の８０％で溜めが満たされた時、液体量は互いに離隔する。

チャンバーは直径２順の２つの小さいポリスチレン管（２６）（２７）からなる フラッシング機構を有し、管（２６）は流体をチャンバー内に注入また、吸い上 げ管（２７）はチャンバーから流体を取り除く。

固定された電極（２８）はチャンバーの底部に平行に設けられている。電極は溜 めとそれを離隔する壁部（２９）を介して伸びている。使用されるワイヤはニッ ケル合金ワイヤから製せられ１２８マイクロメーターの直径を有する。このワイ ヤは溜めの底部から約０゜３ミリメートルの所に設けられている。

短い前記ニッケル合金ワイヤからなる第２の電極はＬ字型に湾曲している（第１ ２図）。この電極は油圧駆動マニュピレータ−に装着され、これによりこの電極 はチャンバー内の２つの溜めのいずれのいかなる位置に移動させ位置決めするこ とができる。

第３の電極（１９）（第７図）は短いニッケル合金ワイヤから製せられ、拡大さ れた球状頂部を有し、その半径は約２５０マイクロメーターである。この第３の 電極もマイクロマニュピレータ−に装着され、２つの溜めのいずれかに位置決め させることができる。

チャンバー全体は顕微鏡の下に取り付けられる。

４、細胞を選択する電極の調成 固定されたニッケル合金ワイヤ電極は電極が抗ＫＬＨ抗体を分泌するＢリンパ球 細胞を選択するようにＫＬＨタンパク質で塗布した。

この工程を以ｒに示す。

ｌ）融合チャンバーと電極を７０％のアルコール水溶液で繰り返し洗浄すること によって滅菌した。

１１）可動電極（３１）はマイクロマニュピレータ−を用いて溜め（２４）に設 置され、これによりＬ字型の電極（３１）の端部は電極（２８）から１ミリメー トル離れた平行状態になった。

ｊｉｉ　）　１ミリリットルのソルビトール溶液に０，２■のＫＬＨタンパク質 からなるＫＬＨタンパク質溶酸溶液め（２４）に入れた。ソルビトール溶液は酸 性度８ｐｈの１５０ミリモルのソルビトールを含む。酸性度は水酸化ナトリウム 及びまたは塩酸を加えるこよによって調整可能である。

ｉｖ）この特定の実施例のために、直流電圧が固定電極（２８）と可動電極（３ １）の間に加えられる（第１０図参照）。固定電極（２８）は可動電極（３１） に対して正となる。加えられる電圧を電極間の溶液の中間点の電界が２，０００ ｖ／ｍになるように調節した。電極間の電界強度は均一ではなく、容易に電界方 程式及び電極間の距離及び直径を用いて算出される。電位差は固定電極に塗布さ れたタンパク質の析出が観察（顕微鏡で）されるのに充分な長さを加えた。電位 差はおよそ１２分必要であった。逆の電極が用いられた場合、抗原は固定電極に 付着しなかった。

■）電位差は切り替えられ、チャンバーは結合しなかったＫＬＨタンパク質を除 去するために無菌の１５０ミリモルのソルビトール溶０＜酸性度８　Ｐ　Ｈの） で静かに５回フラッシングした。フラッシングは小さいポリスチレン管（２６） を介してさらにツルビートに溶液を射出しポリスチレン管（２７）を介して溶液 を取り除くことによって終了する。最後にチャンバーを１５０ミリモルのＰＨ６ ，５のソルビトールの無菌洗浄溶液でフラッシングした。

５、　８細胞の選択 ＫＬＨが塗布された固定電極（２８）をＫＬＨ抗原の抗体を分泌するＢリンパ球 で塗布した。このことを以下に示す手順で行なった。

ｉ）上記２項で説明したように用意されたリンパ球細胞の懸濁液を１５０ミリモ ルの濃度で、酸性度が６．５ＰＨのソルビトールを含む溶液で２度洗浄する。こ の洗浄は遠心管の細胞を回転させ新鮮なソルビトール溶液の遠心管の底部で細胞 の充填されたペレットを再懸濁することによって完了する。

ｉｉ）細胞密度が１ｍｌで約１００万の細胞が存在する洗浄されたリンパ球懸濁 液を準備した。

ｉｉｉ　）溜め（２４）の配位子が塗布された固定電極（２８）を含む融合チャ ンバーの溜めを洗浄されたリンパ球の懸濁液で満たした。

１ｖ）２．００メガヘルツの周波数で交流正弦波電流が塗布された電極と可動電 極（３１）の間を通過し、周波数はＢ細胞電極から押し返されず電極の方へ誘導 するするものであることが判明した。可動電極（３１）を約０．５市の深さで固 定電極に対して平行で且つ横方向に０．２ｍｍの間隔をおいて配した。この時、 溜めの中の細胞を抗原が塗布された電極（２８）によって細胞の電気化学的選択 を促進するために５回再懸濁した。電流のレベルを電極間の中間部分の交流電界 が約６，０ＯＯｖ／ａ＋になるように調整した。電流は５分間流され、５分間停 止する。電界は弱く付着した（非特異的結合）細胞を抗原が塗布された電極から 反発させるために変えられ、これは電界の周波数Ｉ　ＫＨｚに変えることによっ て行われ、電極間の中間地点における振幅を５００　ｖ／ｍに調整し、この値は ３０秒間で得られたものである。このサイクルは繰り返される。その後懸濁液を １０分間放置した。

■）この段階で試験マウスから得られた細胞のいくつかは、塗布された電極（２ ８）に付着したままであった。対照においては、リンパ球が非免疫のマウスから 抽出された場合、電極には殆ど付着しなかった。

ｖｉ）チャンバーをその後、６．５ＰＨの酸性度で１５０ミリモルのソルビトー ル溶液でフラッシングした。フラッシングは３ｍ、／ａｉｎの速度で行った。こ の工程により、最初に電極（２８）に付着したい（つかのリンパ球が取り除かれ る。残りの細胞は下記に示す検定工程のための抗原（ＫＬＨタンパク質）の抗体 を分泌する８９２８球である。約５ｍｌの容量のフラッシング溶液で通常溜めか ら非付着細胞の殆どが除去されるが、細胞は通常及び、最初の２週間の細胞培養 中分裂せずに死滅するので完全に除去する必要はない。

ｖ　ｉｉ）非免疫化マウスのリンパ球による対照実験に於てフラッシングされた 後も塗布された電極に付着したままの細胞はなかった。

６、選択工程の検定 ここで説明する工程によって選択工程が検証されるが、ハイブリドーマを繰り返 し製する場合は必要ではない。

以下に示す工程は上記５項で詳述された工程の終了部分で、塗布された電極（２ ８）に付着したままの細胞をＫＬＨタンパク質の抗体を表現する８９２８球であ るということを確かめるために用いた。

ｉ）７．５ＰＨの１５０ミリモルのソルビトール溶液に１ｍｌに対して３■ＫＬ Ｈタンパク質を含む少量の溶液を融合チャンバーの溜め（２４）に加える。これ を２０℃の室温で３０分間放置する。

ｉｆ）溶液をその後、酸性度が７．５ＰＨで１５０ミリモルソルビトール溶液で 緩やかにフラッシングし、約３００マイクロリツター（ｍｌ　）の容量の溶液を 残す。

ｉｉｉ　）フルオレセイン複合ヤギ抗マウス免疫グロブリンポリクローナル抗体 （オーストラリア　ビクトリア州、ハウスロン所在の５ｉｌｅｎｕｓ−ＡＩＩＤ 社製造）の溶液３０ｍ１を加え、良く混合し、その後室温で３０分間温湿原た。

ｉｖ）チャンバーを再び緩やかに上述のように、酸性度７．５ＰＨの１５０ミリ モルソルビトール溶液でフラッシングする。

■）チャンバーを紫外線照射し、顕微鏡でフルオレセインを調べた。

結果−塗布された電極に付着した細胞のうち９５％が螢光反応を示した。即ち、 これら細胞のうち９５％がＫＬＨタンパク質の抗体を表現したことになる。

対照実験では、非免疫化マウスを用いた場合、フラッシング後塗布された電極に 付着したままの細胞は存在しなかった（５項参照）７、骨髄腫細胞（Ｓ　Ｐ　Ｌ ）の操作 ＫＬＨタンパク質に対する抗体を分泌する選択された８９２８球とＳＰ２骨髄腫 細胞間に電気的二元融合を作用させるために、単一のＳＰ２細胞をすでに述べた 方法を用いて分離した単一の選択されたＢ細胞と良好に膜接触させ、上記工程５ （Ｖｉ）で述べたように溜め（２４）に放置した。

そのために、ニッケル合金ワイヤ（直径１２８マイクロメーター）からなる拡大 先端部を有する可動電極（１９）（第７図）、マイクロマニュピレータ−及び誘 電泳動が必要となる。単一のＳＰ２細胞を拾い上げ８９２８球との融合を誘発す るための作業の記録は下記の通りである。

ｉ）６．５ＰＨの１５０ミリモルのソルビトール溶液のＳＰ２細胞の懸濁液が用 意され、１ミリリツターに対して約１０．０００の細胞を含むものであった。

ｉｆ）溜め（２４）を上記工程５（ｖｉ）で示した通り、６．５ＰＨの１５０ミ リモルのソルビトール溶液で満たした。

ｉｉｉ　）溜め（２３）を空にし乾燥させた。

ｊｖ）溜め（２３）の３分の２はＳＰ２細胞懸濁液（工程ｉからの）で満たした 。その懸濁液を全てのＳＰ２細胞が溜めの底部に沈殿すように１０分間放置した 。溜めをそれから（ＳＰ２細胞が導管（２５）を介して溜め（２４）に移入しな いように）序々に１５０ミリモルソルビトール溶液で満たし、これにより溜め（ ２３）及び（２４）双方のソルビトール溶液がソルビトール溶液で満たされた流 路（２５）を介して連接する。ＳＰ２細鉋は、しかしながら、溜め（２３）に存 在し、２．３の細胞を除いて、溜めの底部に位置していた。

■）可動電極（１９）はマイクロマニュピレータ−を用いて溜め（２３）内に移 動する。

ｖｉ）この可動電極（１９）と固定電極（２８）を正弦電気波形発生器に接続し た。これら電極は電気パルス発生器に平行に接続された。正弦電気発生器は１． ８メガヘルツの周波数と３ボルトの振幅に設定され約６．　４００ｖｏｌｔｓ　 ／ｍの電極間の中間地点に電界強度を設け、ＳＰ２細胞を引き寄せる。このこと は可動電極（１９）（第７図参照）の球形頂部への優先的ＳＰ２細胞の移動及び 付着を前記電極頂部付近の非均−な電界の誘電泳動によって行うためのものであ る。この場合の付着は、分泌型細胞の選択で用いられた化学的結合ではないが、 部分的には電気的選択である。またこの場合、生じる付着は弱く且つ化学的に非 特異であり、これにより電界が一度適切に変えられたら、細胞は電極から落下し てしまうかあるいは簡単に緩やかに撹拌（電界をオフにした状態）または電極か ら振り落とされる（周波数を１キロヘルツに変えることにより）。

ｖｉｉ）１つまたは２．３のＳＰ２細胞が可動電極（１９）に付着した後、その 電極は常に電極が溜め（２３）と（２４）を連結する流路を満たすソルビトール 溶液内にあることを確信しなから流路（２３）を介して溜め（２４）内に緩やか に移動する。この電極の移動は電極が装着された油圧式マイクロマニュピレータ −によって行われる。

ｖｉｉｉ）電極の頂部に付着したＳＰ２細胞は次に、溜め（２４）の固定電極に 付着した選択された８９２８球細胞のうちの１つから約５マイクロメーター離れ た方へ向かうように操作される。

８１選択された細胞の融合 選択された正常な分泌型Ｂ　ＩＪンバ球と融合パートナ−である対のＳＰ２細胞 の電気的融合を作用させるために、次のような手順で行った。

ｉ）可動電極（１９）と固定された選択電極（１９）の間の電界を５０、　００ ０ｖｏｌｔｓ／ｍに増加させた。これにより両細胞はすぐに伸長し且つ強固に電 極に付着する。この伸長によって細胞の強固な接触がなされる。これは良好な細 胞膜接触を確実にするためのものである。電界の周波数は１．８メガヘルツに保 たれている。

ｉ】）矩形電気パルスが毎秒２パルスの速度で電極に加えられ、各パルスの存続 時間は１００マイクロセコンドである。パルス振幅は電極間の距離が５０マイク ロメーター（この単一の融合される対細胞に適した）で電界強度が約６５，００ ０乃至７０．　０００ｖｏｌｔｓ／ｍである場合、３及び４ボルトの間に設定さ れる。この段階で単一の対の細胞は単一の融合された細胞を形成するためにされ るが、その形状は１つの正常な単一細胞と言うよりも融合した対の細胞の形状の ままである。

ｆｉｉ　）融合後に、高周波数の交流電界をオフ状態にした。前記融合した細胞 は固定電極に付着したままである。

ｉｖ）可動電極（１９）はマイクロマニュピレータ−によって溜め（２３）内に 戻りこのセクション７．８で示した工程がさらなる２重融合を作用させるために 繰り返される。

ｖ）２．３の融合物質が得られた後、融合媒体は取り除かれ、融合チャンバー内 の組み込みフラッシング機構（管（２６）及び（２７））を用いて培養媒体と変 えられる。

ｖｉ）溜め（２４）内の融合細胞と伴にチャンバーは２．３日間二酸化炭素調整 された恒温器に移される。

この段階で、チャンバーは細胞が融合チャンバーから除去され標準９６型溜め恒 温器の小さな溜め内に塗布するのに充分な細胞を含む。２重融合した細胞の分裂 は殆ど４８時間以内に生じ、９０％の割合で生じる。その後、細胞は上述工程に 従って処理された。概略的に述べると、安定したクローン雑種は最初の細胞の融 合後約３週間後に離隔され、培養育成された。

実施例２ Ｂ型肝炎表面抗原のヒト−ヒトハイブリドーマ１、方法 Ｂ型肝炎表面抗原のヒト−ヒトハイブリドーマの生成は次の５つの工程に分けら れる。

ｉ）ヒト外皮血液細胞の調成及び予備精製１１）化学的選択をさせるためにＢ型 肝炎表面抗原で固定された電極を塗布する。

１１１）主に固定選択電極を用いた電気化学的選択によって抗Ｂ型肝炎表面抗原 抗体を表現するＢリンパ球の選択。

ｉｖ）移動電極上で、電気的選択を用いたヒトパートナ−細胞に５６２の操作。

Ｖ）適当数のハイブリッド融合細胞を得るために何回か繰り返される選択された 対の細胞の融合。

これらの工程をさらに詳しく説明する。

２、ヒト外皮血液細胞の調成及び予備精製１０ミリリツトルのヒト外皮血液のサ ンプルがＢ型肝炎表面抗原の免疫グロブリンＧ抗体の製造に陰性（対照）及び陽 性（試験）を予め示した被検者から抽出した。サンプルはオーストラリア、ビク トリア州７　ダンテソングのＳｍ１ｔｈ　Ｋ１１ｎｅ　ＢｅｅｃｈａＩＩによっ て市販されている組み換えワクチンによって最近増強された陽性被検者から取ら れたものである。各サンプルはＢ−細胞系以外の殆ど全ての細胞を除去し、最終 段階の分泌型Ｂ−細胞、形質芽球及び形質細胞用の残りの部分を精製する処理が 行われる。従って、各サンプルでは血液全体がパーコール（オーストラリア、ビ クトリア州つエストメルボルンの所在のＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｉｍ１ｔｅｄ社 ）に亘って離隔され、可塑接着によって単核細胞を激減させた。得られた細胞を ０ＫＴ３抗体（オーストラリア、ＮＳＷ、　ライド所在の０ｒｔｈｏ　Ｄｉａｇ ｎｏｓｔｉｃｓ社のパン−ニー細胞抗体）それからＢｌ（オーストラリア、ＮＳ Ｗ。

プルツクベル所在のＣｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社のナチュラルキ ラー細胞のようなヌル細胞のマーカー）で各段階で２度洗浄される。最後に、先 に行われた最終洗浄工種の非付着細胞はハイブリドーマ細胞系、ＣＲＬ８０２２ （米国特許第４．３６４．９３５）この細胞系は米国Ｒｏｃｋｖｉ　］　ｌｅ氏 のアメリカ式培養蓄積法によって得られる）と典型的な形質細胞の上澄みから得 られるが活性化したＴ−細胞と未熟なり一細胞すブセット上にも存在するＣ１ｕ ｓｔｅｒ社による抗体ＣＤ３８を用いて洗浄される。不必要な細胞即ち皿に付着 しない細胞を除去するため通常の塩溶液で洗浄した後、付着した細胞は最初に被 検者自身の１ミリリツターの血清に１０マイクロリッター以上のＣＤ３８抗体で 温室することによって前記付着した細胞を引き離すことによって皿から回収され 、この離れた細胞を集積する。何回かの洗浄によって得られた細胞はプールされ 、濃縮され洗浄される。これら細胞は通常の１０％のウシ胎児血清（Ｆ　ＣＳ） を培養液で再懸濁され、約４０，０００の細胞が回復する。芽球が精製されたこ れらの細胞は第１３．１４及び１５図に示す電極システムを用いる電気化学的選 択工程に付され、この電極システムは表面にＢ型肝炎表面抗原の抗体を表現する 細胞を製するためのものである。このことは下記５で詳述する。

３、選択及び融合チャンバー 細胞の選択及び細胞の融合工程はオーストラリア、シトニー所在のｌ１ｅｄｏｓ 　Ｌｔｄ社から購入した８つの溜めを有するプレート（３２）の１つのｒＮｕｎ ｃＪという溜め（３５）で行われ、本発明の目的のためにこれらプレートに改良 を加えた。その改良及び溜めと電極を用いた方法を第１３．１．４及び１５図に 示す。大まかに壁（３３）のプラスチック板はプレート（３２）から持ち上げら れ、直径１２８マイクロメーターでニッケル合金ワイヤからなる単一の固定電極 （３４）は溜め（３５）の壁（３３）内に切断されたスリットを介して、第１の ４つの溜めを横切り他の４つの溜めの底部に沿って戻るように溜め（３５）の底 部に沿って位置し、壁（３３）はシリコンラバー接着剤で密閉され、この接着剤 はまたワイヤ電極（３４）が溜め（３５）を横切るためのスリットをも密閉し、 いずれか１つの溜め（３５）に固定電極はガラス摺動底部（３２）から約５００ マイクロメーター上に通常位置する。プレート（３２）は倒立顕微鏡（図示せず ）に取り付けられ、一端で平面型マニュピレータ−（図示せず）に装着され、こ れにより溜めは顕微鏡の光学子と一線上に位置するように段階ごとに移動可能に なる。使用するチャンバー内の操作及びチャンバー上に設置するための好適な形 状寸法のトリプルピペット（トライピペット）が三軸マイクロマニュピレータ− に取り付けられ、このようにしてトライピペットは細胞を懸濁洗浄する溶液の射 出及び取り除く機能を有し、溜め（３５）を洗浄及びフラッシングし且つ溜め内 で用いられる溶液を変えたりするために融合／選択チャンバー内の最適な位置に 位置することができる。

単一の変位ピペット（４０）（、第１６図参照）は、別の３軸マニュピレータ− に別個に取り付けられ、これはごく僅かな数の細胞を溜め（３５）から間へと移 動させるために用いられ、好ましい細胞濃縮及び圧力制御状態で容易に溜めに所 望の少数の細胞１であるとか２または５つの細胞を加えたり取り除いたりするた めに設けられた。

４、細胞選択性電極 Ｂ型肝炎表面抗原はＡｂｂｏｔ　Ａｕ５ｔｒａｌｉａ　Ｐｔｙ　Ｌｔｄ社（オー ストラリア、　Ｎ　Ｓ　Ｗ、　Ｋｕｒｎｅｒ所在）より得たもので、電極を塗布 するために用いた。この抗原は水酸化ナトリウム及びまたは塩酸溶液を用いて８ ．０ＰＨに調整された酸性度の１５０ミリモルソルビトールで１対１０に稀釈さ れた状態で用いられる。１２８ミリマイクロメーターの直径の固定ニッケル合金 ワイヤ電極は抗Ｂ型肝炎抗原抗体を分泌するＢリンパ球を選択するようにＢ型肝 炎表面抗原で塗布した。

この工程を以下に示す。

ｌ）融合チャンバー即ち溜め（３５）と電極はチャンバーの繰り返し行われる洗 浄で用いられ７０％アルコール水溶液を含むトライピペットを用いることによっ て滅菌化した。

ｉｉ）融合電極（３６）を活性溜め（３５）（溜め内で一対の細胞を融合するの に用いる溜めの準備として実際に活性化が行われている溜め）内に設置し、これ により電極（３６）の近接端部は固定選択電極（３４）と１ｍｍの間隔をおいて 平行となり、抗原溶液を加える前の完全に排水される前に溜めは８．０ＰＨの１ ５０ミリモルのソルビトールで５回フラッシングされ、各時の量は１ｍｌである 。

ｉｉｉ　）　０．　５ｍｌの抗原溶液を固定電極が化学的選択ができるように活 性溜め（３５）に入れた。

ｉｖ）この特定の実施例のために、直流及び交流双方の電圧を固定電極（３４） 及び可動融合電極間に加えた。加えた直流電位の極性は固定された電極（３４） が融合電極（３６）に対して正になるようなものであった。加えた電圧は電極間 の溶液の中間部の電界が４゜０００　ｖｏｌｔｓ／ｍになるように調整した。加 えた交流電位は１．７メガヘルツの周波数を有し、平均交流電界強度は２　、　 ０００　ｖｏｌｔｓ／ｍであった。電極間の電界中間地点は加えた電位、電極間 の距離及び電極の直径によって算出することができる。電位差は固定電極（３４ ）上の化学的塗布物の析出が観察されるのに（顕微鏡で）充分な長さ、この場合 約１０分加えられ、その後電界の極性を逆にした。

同様な塗布物が他の溜め（３５）の異なる固定選択電極（３４）に発生し、この 溜め（３５）で直流電界の極性を１分間と１０分間それぞれ逆にした。これらの ことは、いくつかの他の雑種融合における細胞選択及びその後の対融合に好結果 をもたらした。

Ｖ）電位差は切り替えられオフになり、トライピペットを用いて非結合Ｂ型肝炎 表面抗原を取り除くためにソルビトール溶液で５回チャンバーを軽くフラッシン グした。チャンバーはその後、排出され電気化学的選択のための分泌型細胞を受 ける６、５ＰＨの１５０ミリモルのソルビトール溶液を加えた。

５、　８細胞の選択 電極（３４）をＢ型肝炎表面抗原の抗体を分泌するＢ細胞の芽球細胞（４３）用 に精製された細胞で塗布した。

このことは次のように行われる。

ｉ）上記２で述べたように調成したリンパ球細胞の懸濁液を濃度が１５０ミリモ ルで酸性度が６．５ＰＨのソルビトールを含む溶液で２度洗浄し、その倹約１． 　０００．　０００ｐｅｒｉｌの細胞濃度で再懸濁した。

１ｔ）５０ミクロリツターの分泌型細胞（４３）の分割量を固定、そして現在化 学的選択する電極（３４）を含む活性溜め（３５）に加えた。

ｉｉｉ　）細胞（４３）が射出される前に交流正弦電流を３０秒流し、固定選択 電極（３４）と融合電極（３６）間を通過する。電流のレベルは固定選択電極（ ３４）の表面で電界は電極の形状寸法及び加えられた電位から算出されたように 約８　、　０００　ｖｏｌｔｓ１０＋であった。

電流を１０分間流し、固定選択電極（３４）から弱く付着した（非特異的結）細 胞を分離するために変え、これらは電界の周波数をＩＫＨｚに振幅を１　、ｏ　 ｏ　ｏ　ＶＯＩｔＳ／ｍに５秒間切り替えることによって行われた。

Ｖ）この段階で細胞（４３）のうちいくつかは塗布された電極に付着したままで あり、非付着細胞は再利用のため溶液をこの選択工程に用いられた溶液と類似し たソルビトール溶液で入れ替える間、非付着及び緩（付着しただけの細胞を軽（ フラッシングすることによって回収される。緩く付着した細胞の除去は反発的電 気選択力（電極の表面で１００　ｖｏｌｔｓ／ｍの電界強度で１．０ＯＯＢｚ） によって補助される。細胞（４３）は約１ｍｌのソルビトール溶液で２度洗浄さ れ、それからチャンバーはパートナ−に５６２細胞（４４）を受け選択する準備 がなされた。固定選択電極を付着したままの細胞（３４）は抗原の抗体を分泌す るものであると推定された。

６、パートナ−細胞（Ｋ５６２）の操作Ｂ型肝炎表面抗原に対する抗体を分泌す る選択されたリンパ球細胞（４３）とに５６２パートナ−細胞（４４）間の電気 的２元融合を行うために、単一のに５６２細胞（４４）を先に詳述した方法を用 いて分離したリンパ球細胞（４３）を分泌する選択された抗体のうち１つと良好 な膜接触させなければならない。この目的のために「移動」電極（３８）を設け 、この電極は直径が２５０マイクロメーターで、直径１２８マイクロメーターの 円筒状シャフトに装着された球部（３９）からなる。電極は米国、カリフォルニ ア州所在のＣａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｗｉｒｅ　Ｃｏｍｐａｎｙ社製造 のニッケル合金ワイヤからなる。

移動電極を３軸マイクロマニュピレータ−（４２）に取り付けた。

細胞移動作業をここでは採用し、次の工程からなる。

１）１００ミリモルのソルビトールを含む溶液のに５６２細胞（４４）の懸濁液 を準備し、この懸濁液は１ミリリツターにｉｏ、ｏ。

Ｏの細胞を含むものであった。

ｉｆ）移動電極（３８）をそのマイクロマニュピレータ−（４２）を用いて活性 溜め（３５）内で操作した。

ｉｉｉ　）固定電極（３４）と移動電極（３８）を正弦電気波形発生器に接続し た。固定選択電極（３４）と円筒状（ワイヤ）融合電極（３６）もまた電気パル ス発生器に接続した。正弦発生器の周波数を２メガＦｌｚ、振幅を１ボルトに設 定した。これはに５６２細胞（４４）の移動電極（３８）の先端への移動及び付 着されるために設けられたものである（移動電極の先端部付近の非均−な電界の 電気泳動による）。この段階で、第２０図に示したような状態になる。その後電 極は５００マイクロメーターの別のに５６２細胞（４４）の範囲内で操作され、 電極（３８）の機械的移動の組み合わせ及び電界の強度を調整することによって 、第２のに５６２細胞（４４）は誘引され、すでに移動電極状に保持された第１ のに５６２細胞の頂部に保持される。この工程を第２０乃至２２図に示す。

ｉｖ）第２のに５６２細胞が移動電極（３８）に付着した後、付着したパートナ −細胞と伴に電極は第２のに５６２細胞がまだ移動電極（３８）上の第１のに５ ６２細胞の頂部の保持された位置へと緩やかに移動し、次に固定選択電極に付着 した正常な分泌型リンパ球から約１００マイクロメーターの位置へと操作される 。電極の移動は油圧式マイクロマニュピレータ−によって促進され、このマニュ ピレータ−には電極（３８）が装着されている。移動電極（３８）はそれからさ らに毎秒約２０マイクロメーターの速度で分泌型リンパ球に対して進退自在に移 動し、それから電極から離れ、その間交流信号を次のように連続的に変えた。０ ，５ボルトの電位を加えながら１，０ＯＯＨｚに周波数を減少した。これにより 第２の一番外のに５６２細胞（４４）は移動電極（３８）上の第１のに５６２細 飽（４４）から引き離され、移動電極（３８）と第１Ｋ５６２細胞（４４）が選 択電極（３４）から離れるように移動する際、周波数は４５０ＫＦＩｚ、振幅を ３ボルトに変えた。この移動の間、自由になったに５６２細胞（４４）は電界作 用下に素早く移動し、第２３及び２４図に示すように固定選択電極（３４）の方 へ移動し、この電極に既に付着した以前に選択された正常分泌型細胞上に保持さ れる。

７、選択された細胞の融合 選択されたリンパ球細胞（４３）とに５６２細胞（４４）の電気的融合を行うた めに次の工程に従って行った。

ｉ）球型移動電極（３８）を固定電極（３４）から離れるように緩やかに操作し 、融合電極（３６）を融合される細胞が付着した固定電極（３４）に接近し平行 になるように移動した。この状態を第２５図に示す。

ｉｉ）融合電極（３６）と固定電極（３４）間の電界を５０．００Ｑ　ｖ／ｍに 増加した。これにより両細胞は固定電極（３４）に強固に保持された分泌型細胞 によって急速に伸長した。この伸長により細胞（４３）（４，４）は強く接触す る。これは良好な細胞膜接触を行うためのものである。電界の周波数を２メガヘ ルツに維持した。

１ｉｉ）２．３の矩形電気パルスを２秒間隔で電極（３４）（３６）に加え、各 パルスの存続期間を１００マイクロセコンドとした。

パルス振幅を電極間の距離が５０マイクロメーター（２つの細胞にとって適した ）である時、８と９ボルトの間に設定した。通常１つまたは２つのパルスが融合 を生じさせるのに充分である。

ｉｖ）融合直後、高周波数の交流電界をオフにした。融合された対の細胞は固定 電極（３４）に結合したままであった。

■）移動電極（３８）をマイクロマニュピレータ−（３７）を用いて融合電極（ ３６）をある程度の距離を移動した後、この項で述べた段階６．７がさらに２重 融合を行うために繰り返され、多くの場合、１つの融合された細胞だけが溜め（ ３５）に存在するように所定の溜め（３５）で１一つの融合過程だけを終了させ るのが望ましいということが判明した。

ｖｌ）１つまたは２．３の融合細胞が得られた後、融合媒体は取り除かれ融合チ ャンバーにトライピペットフラッシング機構を用いて培養媒体に入れ変え、新し い溜めを観察し、すべての溜めに融合細胞が存在するようになるまで全工程を繰 り返した。

■１】）融合チャンバーと融合細胞と伴に８つの溜めプレートは２゜３日間の二 酸化炭素制御恒温器に移される。この段階でチャンバーは細胞が融合チャンバー から取り除かれ標準９６型溜め恒温器の小さい溜めにプレート状に置かれた充分 な細胞を含む。これらの細胞は２日間これらの溜めに温室され、個々の溜めから の細胞をさらに大きな培養機で培養した。

実施例３ ＭＵＤ５０抗原のマウス−マウスシバイブリド−ママウス−マウスハイブリドー マＭＵＤ５０からの対のクローン性細胞は２重融合細胞を製するのに互いに融合 され、これら融合された細胞を培養した。−通りの発芽後成長及びクローン化の 後、安定した核型を示し、最初の単クローン性抗体を分泌した。７つのクリーン 性ジハイブリドーマ細胞系が得られた。流動細胞計測法によるこれら細胞系は親 ハイブリドーマ細胞系より速い速度で抗体を分泌するいくつかの子孫細胞系を最 初に分泌するということが明らかになった。このような娘細胞系のうちの１つの ＭＵＤ５０Ｂは親細胞系の１つの細胞の平均分泌速度より７０％速い細胞１つ当 りの平均分泌速度の細胞を有するので量的酵素結合イムノソルベント検定法によ る生産性を特徴とする。この工程で使用される関連する段階の殆どは、本発明の 方法論の２つの先行実施例で述べたものである。

従って下記に簡単に説明する。

１、方法 ノハイブリドーマの発生は主に下記の４つの工程からなる。

ｌ）二重融合細胞の製造及びその培養処理１１）促進抗体の生成者用発芽後成長 溜めのスクリーニングＮｉ　）増強された生成りローンの膨張ｉｖ）適した特異 性の連続生成のスクリーニング２、細胞及び対融合のための調成 最初のハイブリドーマＭＵＤ５０はオーストラリア、ＮＳＷ、マクアリ−大学の ＫＬウィリアム教授によって提供された。ＭＵＤ５０はジクチオステリアム　ジ スコイデアム粘膜カビの細胞膜で免疫化されたＢａ１ｂ／ｃマウスの膵臓細胞と ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞系、ＮＳＩから得られた細胞とのＰＥＧ誘導融合 から製せられた。

ハイブリドーマは免疫グロブリンＧ３イソタイプの抗体を分泌し、この抗体は単 一の細胞ではなく多細胞の粘液カビの成長段階中現れる生物細胞の頭部に表現す る膜タンパク質の１つのエピトープに対するものである。

細胞はＮＳＷ、　ランウィック所在のプリンスオブウェールズ病院のＬａｇ　Ｐ ｏｈ　Ｔａｎｇ医師による中期拡散の画像分析及び２つの異なる細胞濃度で培養 液の上澄みの抗体の濃度として、そして流動細胞計測法によって計測されるこれ らの細胞及び対照としてＮＳＩ細胞に付着した螢光、ヤギ抗多クローン抗体の結 合の平均相対強度として測定される抗体生成速度によって核型化された。

１ｍｌあたり１，０００，０００の最大濃度に成長した細胞は融合を行う前日に ３対１に分けられた。細胞は成長の対数期で約１００゜ＯＯＯ細胞を収穫し、遠 心力によってそれらを濃縮し、その後それらの細胞を１ｍｌあたり約１，０００ ，０００の細胞の濃度が得られるように新しい媒体に細胞を移動することによっ て融合の準備がなされる。１０ミクロリツターのこれらの細胞を通常の５００ミ リリットル媒体、ＲＰＭ１１６４０　（オーストリア、ビクトリア州、メルボル ン所在のサイトシステム）と８つの溜めを有するプレートの１つの溜めの先に加 えられた１０％ＦＣ８内に設置され、この溜めは対融合の時に必要となる残りの 溜めに少数の細胞移動用の保持溜めとして用いられるものである（実施例２の３ 項の第１３．１４及び１５図参照）。第２の溜めは酸性度を調節せずに１ｍｌの １５０ミリモルのソルビトール溶液で満たし、これは溜めの導電率を最小にする 。約１００の細胞が変位ピペットを介して（上記実施例の３の終わりの部分で述 べた）保持溜めがら取り除かれる際、各融合サイクルの始めにＭＵＤ５０細胞用 の洗浄槽として用いられ、顕微鏡によって、変位ピペットは洗浄溜めから単一の ２重融合が行われる残りの６つの溜めのうちの最初の溜め内に５つの細胞を移送 するのに用いられる。各融合溜めが融合に用いられた後、洗浄溜めは３つの融合 が終了した後トライピペットを介してソルビトール及び細胞が排出され、溜めを ゆすぎながら新鮮なソルビトール溶液が加えられた。

３、二重細胞融合 １つの融合だけが８つの溜めを有するプレートの残りの６つのそれぞれで行われ た。この場合、３つの電極のうちいずれにも化学的に塗布する必要はないが（第 １５図参照）、中性の化学薬品を塗布することによって融合後の融合細胞の死亡 率を減少させる。パートナ−細胞をカルボキシフルオレセインジアセテート（オ ーストラリア、ＮＳＷ、シトニー所在のシグマケミカル社−いずれの融合が始ま る１５分前に保持溜めに２０ミクロリツターの通常の塩水に１ミクログラム加え た）と予備ローディングすることによって、２つの細胞を融合する前に変位ピペ ットによって各融合チャンバー内に導入された完全な少数のＭＵＤ細胞を視覚化 し数えるために螢光顕微鏡の螢光光学素子を採用することが可能になり、この特 性は後に融合されなかった生きた細胞ごとに溜めから取り除く際補助をする。

２つのＭＵＤ５０細胞を融合チャンバー／溜めのいずれか１つの固定電極に付着 させるために固定電極と離れた融合電極間の電界を約２０．０ＯＯｖ／ｍに設定 し、５つの細胞を溜め内に導入し、そのうち２つの細胞を互いに離れた固定電極 の融合電極に面した内側の面に付着させるために１．９５メガヘルツの電気的選 択を採用した。

移動電極によって（第１９乃至２２図参照）、第３及び第４の細胞は拾い上げら れ、第４の細胞を固定電極に付着した２つの細胞のうちの１つに付着させ融合さ れた２つのＭＵＤ５０を対にした融合細胞を形成するために移動作業（第２３図 及び２４図参照）に用いられる。可動融合電極は実施例２の７で述べた（第２５ 図参照）融合に適した位置に移動され、細胞は同時に固定電極と融合電極間の中 間地点で電界を５０，０００ｖ／ｍに増加させることにより伸長され強固に圧縮 される。細胞は、強度１００．０００ｖ／口の１００マイクロセコンドの直流パ ルスによって融合され、このパルスは通常１パルスであるが時には３パルスまで 使用され、これは３０秒乃至６０秒の先行のパルスを用いている間顕微鏡を介し て観察されるので最初のパルスに対する融合された対の細胞の反応によって決ま る。

融合が生じた後、第２の単一の細胞（まだ固定電極上にある）と時には残りの５ 番目の細胞と融合させる。いかなる時に於ても、変位ピペットは細胞が付着した 場所から溜めの一側部に移動したカウントされた細胞を見つけるための緑色内部 螢光を用いて融合チャンバーから、残りの生きた、単一の細胞を取り除くために 用いられた（第２７図参照）。トライピペットは同時に通常の媒体［ＰＲＭ１１ ６４０＋１０％ＦＣ３と０．１ｍｇ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシンの 抗生物質からなる（オーストラリア、ＮＳＷ、キャッスルヒル所在のＣｙｔｏｓ ｙｓｔｅｍ　Ｐル社による）］で稀釈し微量のソルビトールが溜めに残る迄、ソ ルビトールを取り除くのに用いられた。

すべての６つの使用可能な溜めがそれぞれ１つまたは２つの融合された細胞を含 む時、８つの溜めを有するプレートは覆われ、給温二酸化炭素恒温器内に置かれ た。合計１０枚のプレートの作業を行い、それらの内容物を培養した。同時に、 融合した細胞と同じ培養から得られたＭＵＤ５０細胞系サンプルの単一のオリジ ナル細胞を含むプレートを設けた。これらの細胞は融合された細胞の分裂（成長 ）速度とそれらの抗体生成速度の双方のために２重融合細胞と比較するための対 照サンプルを提供する。

４、発芽後成長及びスクリーニング 溜めは再育成のために２日ごとに監視され、いずれか１つの溜めで細胞の数が約 １．０００に達した時、定量ＥＬ　Ｉ　ＳＡによって抗体生成がスクリーニング された。溜めの上澄みはヒツジ抗マウス免疫グロブリンＧ抗体を用いて検定され 、自動プレートリーダーで読み取られる。明らかに高い抗体生成を示した（前記 リーダーによって最も密度の濃い対照プレートより０．　３ユニット高い値を示 した）２０の溜めから、本実施例ではさらに高成長速度の１０の溜めを選択し、 それらの軽鎖生成を（オーストラリア、Ｖｉｃ、パークビル所属のＣ３Ｌ社のセ イヨウワサビペルオキシダーゼに結合したヒツジ抗マウス、抗に軽鎖抗体）を検 定し、７つの陽性溜めを長期培養した。この実験例では複合フォレセイン抗マウ ス免疫イモグロビン抗体と複合フィコエリトリン抗に抗体で二重に標識化された 一連の各細胞系の細胞の相対螢光強度の流動細胞計測によって、これら細胞間の 各週の細胞の抗体生成の比較を直接行った。このことは媒体容量を日々調節する ことによって５Ｘ１０５細胞／ｍｌの濃度に細胞の培養を維持することによって 簡単になった。翌月に亘って４つの細胞系が一定の相対螢光を維持し、他の細胞 系の軽鎖螢光は減少した。さらに４週間の監視後、殆どの生成細胞系、ＭＵＤ５ ０Ｂがその特徴及び貯蔵制によって選択された。

５、親と子孫細胞系の比較 細胞系は核型であって、親細胞系ＭＵＤ５０より４染色体の多い典型的な８４の 染色体を有するということが判明した。抗体生成速度は平均的な細胞の抗体生成 速度を得るための２つの異なる培養方法を用い、絶対的及び相対的方法即ち定量 ＥＬＩＳＡ及び流動細胞計測法によって測定された２つの細胞系で測定された。

両側室に於いて、子孫細胞系は親細胞系より約７０％［８５と６５］高い値を示 した。

実施例４ 電気的選択され、融合される対の細胞を融合することによって得られるハイブリ ドーマ ２つの融合される細胞の必要となる幾何学的形状の２つの細胞を電気選択し、そ れから同時に２つの細胞のうちどちらかが電極に接触せず且つ１つまたは他の融 合電極に細胞を電気化学的選択をさせずに２つの細胞を融合できる１つの方法を ここでは実施例４とする。

ここでは正常な分泌型細胞がＢ型肝炎表面抗原に陽性のヒト外周血液細胞抗であ る場合の対形成及びさらにその密着、伸長及び融合の工程たけについて詳述する 。

１、これらの融合で用いられる正常ヒト血液型細胞は、実施例２の２で説明した ように、不必要且つ交差反応細胞を最初に激減させた後、０ＫＴＩＯマウス抗体 を用いてリンパ芽球様細胞用にヒト外皮血液のサンプルを精製し、準備した。融 合パートナ−細胞はその成長の対数期で細胞培養から得られたＳＦ３である。

２、融合チャンバー 融合チャンバーは８つの溜めを有するプレートの１つの溜めを実施例２の３で説 明したように設定し用いた。

３、８細胞の選択 上述のように芽球が予備精製された約４０．０００の血液細胞をその表面に表現 されたＢ型肝炎表面抗原に対する抗体を有する細胞を選択するためにパンニング した。平坦な底部を有するリンプロＥＩＡ９６溜めをＰ　ｉ（９に調整された塩 化ナトリウム溶液中のオーストラリア、ＮＳＷ、　カーネル所在のアボット　オ ーストラリア　ビティーＬｔｄ社による抗原で一晩湿原することによって区画面 を形成するのに用いられ、通常の塩化ナトリウムに１■／　ｍｌのウシ血清アル ブミンで遮断した。選択は２つの準備がなされた溜め内で行われ、これら溜めが それぞれに約２０，０００の細胞が加えられ、３７℃で１時間温室され、付着し た細胞を覆うために５０ミクロリツターの元の抗原溶液を加える前に２度培養液 で軽く洗浄され、細胞を解放する。３０分後、溜めは新鮮な培養液で満たされ、 この培養液も細胞が底部に落下したら入れ変えられる。

４、パートナ−細胞の準備 ＳＰ２細胞は実施例３の２で示した方法で準備された。概略的に述べると、成長 の対数期から得られた２００のＳＰ２細胞を、これらパートナ−細胞を保持する 溜めが設けられたＮｕｎｃ　８溜めプレートの１つの溜めの０．５ｍｌの通常の 培養液内に入れた。第２の溜めを融合直前に細胞を洗浄するためにソルビトール 溶液（ＰＨ７，５）で満たした。少数のＳＰ２細胞をそれらのうちの１つを変位 ピペットを用いて融合チャンバー内に移す５分前に洗浄溜め内に移される。

５、ベアリング及び融合に選択された正常細胞の準備いｎｂｒｏプレートの２つ の溜めのそれぞれの約２００の選択された正常細胞を再懸濁し、２００のパート ナ−の片方の細胞の保持溜め及び洗浄溜めを既に含む８溜めプレートの第３の溜 め内に全体的に移した。最後に第４の溜めをソルビトール溶液で満たし、細胞操 作及び選択前に正常細胞用洗浄溜めとし、て作用させる。

６、−組の選択された細胞のみの形成 変位ピペットをパートナ−細胞の洗浄溜めの少数のＳＰ２細胞から１つだけを５ 分前に拾い上げ、その後融合用に設定され、固定電極と可動電極を含む溜め内に 導入するために用い、前記２つの電極間に２．　０メガヘルツの周波数で電極の 中間部に２０．０００ｖ／ｍの強度になる交流電界を加える。細胞は溜めの底部 に向かって落下したので、固定電極の方へ上方に誘導される。ピペットは再び１ つの正常な分泌型細胞を５分前に入れられた（２．３の他の細胞と伴に）正常溜 めから拾い上げ、融合チャンバー内に移すために用いられる。前記分泌型細胞を 前記融合チャンバーに導入した後、この細胞は誘電泳動力によって２つの電極の うちの１つに緩やかに引き付けられる。正常細胞が電極に付着せずに溜めの底部 に落下し、２つの電極間の下方の間隙の外側の領域に溜まった時、可動融合電極 は正常細胞に誘導力を及ぼすように下降し、移動させ、前記細胞を融合電極に移 動させる。それから融合電極を互いに線状に位置した２つ以上または以下の細胞 と伴に固定電極から約３００マイクロメーターから離れて、同じ深さの位置に戻 し、これによりこれら細胞を密着させる（第２８図参照）。電界強度はこの時点 で約５００　ｖ／ｍに減少され、周波数を１．０００ヘルツに減少し、これによ りそれぞれの電極から２つの細胞を引き放し、電極間の間隙内に分離させる。細 胞が互いに細胞の５乃至１０個の直径内に近付いたら、これらの細胞を電界周波 数を２．０メガヘルツ、そして強度を２０．０００ｖ／ａに再び変えることによ って並列に配向させる。場合によっては、対の細胞は電極のうちの１つに向かっ て移動し、もしこのように移動する場合、この対の細胞はその電極の１点に溜ま る。この移動が生した場合、２つの細胞が溜めの底部に落下させるために電界を 切り、融合電極を溜め底部の真上に下降させ、再び電界を生じさせた。細胞は不 変な対形状になり、この時点で電極間の中間地点の電界強度が以前より僅かに強 ＜７０．０００乃至８０，０００ｖ／ｍになったとしても溜めの底部に溜まる。

時には対の細胞が伴に１つの電極の方へ移動するが、溜めの底部の接触による摩 擦によって妨害されているかのようにさらにゆっくりと移動し、これらが電極に 接触していない間、常時融合することができる。

これらの細胞は伸長して密着しく第２８図参照）、実施例３の３で述べた方法で 電気パルスを加えることによって融合する。それ以降の処理は既に述べた方法に 従って行われる。

参考文献 １．ポール、Ｈ９“Ｄｉｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　（誘電泳動）”、１ ９７８年、ケンブリッジ大学列 ２、コスタ−、Ｈ，Ｇ、Ｌ、／シマーマン、Ｕ、　、”ＤｉｒｅｃｔＤｅｍｏｎ ｓｔｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ　ｉｎ　 ｔｈｅ　ｌｌｅｍｂｒａｎｅｓ　ｏｆＶａｌｏｎｉａ　ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓ 、　（バロニアｅユートリキュラリスの細胞膜の誘電体分解の直接論証）　”　 、　Ｚｅｉｔｓｃｈｒｉｆｔ　ｆｕｒ　Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈｕｎｇ、社３０ ｃ、７７−７９．１９７５年。

３、コスタ−、Ｈ，Ｇ、Ｌ、／シマーマン、　Ｕ、　、”Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ　ｏｆ　Ｖａｌｏｎｉ ａ　ｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓ：ｔｈｅ　ｒｏｌｅｏｆ　ｅｎｅｒｇｙ　ｄｉｓｓ ｉｐａｔｊｏｎ　（バロニア・ユートリキュラリスの細胞膜の誘電体分解：エネ ルギー消費の役割）　”　、　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏ−ｐｈｙｓ ｉｃａ　Ａｃｔａ、社　３８２．４１０−４１８．１９７５年。

４、コスタ−、Ｈ，Ｇ、Ｌ、／シマーマン、Ｕ、　、”Ｔｈｅ　ｍｅｃｈａ−ｎ ｆｓｍｓ　ｏｆ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ　ｉｎ　ｔｈｅ　 Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ　ｏｆ　Ｖａｌｏｎｉａｕｔｒｉｃｕｌａｒｉｓ、　（バロ ニア・ユートリキュラリスの細胞膜の電気分解の手法）　”　、　Ｊｏｕｒｎａ ｌ　ｏｆ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｂｉｏｌｏｇｙ、社　２２．７３−９０゜１９７ ５年。

５、シマーマン、Ｕ、　、”Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　Ｆｉｅｌｄ　Ｍｅｄｉａｔ ｅｄ　Ｆｕｓｉｏｎ　ａｎｄＲｅｌａｔｅｄ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　Ｐｈｅｎ ｏｍｅｎａ　（融合を仲介する電気及び関連する電気現象）　’　、　Ｂｉｏｃ ｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、社　６９４．２２７− ２７７．１９８２年。

６、セール、Ｊ、Ｈ，／ハミルトン、Ｗ、Ａ、、“Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆＨｉｇ ｈ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｆｉｅｌｄｓ　ｏｎ　ｌｌｉｃｒｏ−Ｏｒｇａｎｉｓｍ ｓ　（微生物の高電界の効果）　’　、　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　Ｂｉｏ ｐｈｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、社　１６３．３７−４３゜１９６８年。

７、セペルス、Ｅ、Ｈ，／キノシタ、に、／ツォング、Ｔ、Ｙ、。

”Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　ａｎｄ　Ｉｒｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　１ｌｏｄｉｆｉ ｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ麗ｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｅｒｍｅａ ｂｉｌｉｔｙ　ｂｙ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃ　Ｆｉｅｌｄｓ　（電界による赤血球細 胞膜透過性の可逆的あるいは非可逆的変更例）”、　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅ ｔＢｉｏｐｂｙｓｉｃａ　Ａｃｔａ、社　８１２．７７９−７８５．１９８５年 。

８、、：ｌニーニーマン、Ｂ、他、　“Ｃｅ１ｌ　Ｆｕｓｉｏｎ　Ｉｎｄｕｃｅ ｄ　ｂｙ　Ｈｉｇｈ　Ｅｌｅｃｔ−ｒｉｃａｌ　Ｉｍｐｕｌｓｅｓ　Ａｐｐｌｉ ｅｄ　ｔｏ　ＤｉｃｔｙｏｓｔｅＪｉｕ＋ｓ　（ジクチオステリアムに用いられ た高電気インパルスによる細胞融合）”、　Ｎａｔｕｒｗｉｓｓｅｎ−ｓｃｈａ ｆｔｅｎ社　６７、’４１４．１９８０年。

９、シマーマン、Ｕ、他、”Ｆｕｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｖｅｎａ　５ａｔｉｖａ　 ＭｅｓｏｐｈｙｌｌＰｒｏｐｔｏｐｌａｓｔｓ　ｂｙ　Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　 Ｂｒｅａｋｄｏｗｎ　（電気分解によるフカラスムギ葉肉突出形状細胞の融合） 　”　、　Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ　ｅｔ　ＢｉｏｐｈｙｓｉｃａＡｃｔａ、社　 ６４１，１６０−１６５．１９８１年、１９８２年。

本発明の意図及び範囲から逸脱することなく、本発明の応用例及び変形例が想到 しつるということは当業者によって明らかである。

Ｆｌｇ、　１ 日９．２ 日ｇ、３ 〜．４ ０９．５ Ｆｉｇ、　６ 日９．７ Ｆｌｇ、　８ Ｆｅｇ、　９ Ｆｉｇ、　１０ Ｆｉｇ、１１ Ｆｉｇ、　１２ 〜．１３ ０９．１４ ８９．１５ ΔＰ＞０ 日９．１６ ΔＰ＜０ ＦＩｇ、　１７ 日９．１９ ＦＩ９．２２ 日９．２６ Δトク Ｆｌｇ、　２７ 日０．２８ 〜・汐 日９．３０ 国ＷＡｖ４査報告　１−一息□Ｎ。

ＰＣＴＩＡＬＩ！２１０６４フ３ 国際調査報告　“−１−１０１Ｎ・ ＰＣＴ／＾υ寛Ｖ劇−力 ＦｏｌｌＬＩＰｅ′ｒｎ５Ｍ１１０−一山■−糟ａｆ　眸−ｍ−ｖｕ９１町ｓｅ ｐ％フロントページの続き （５１）　ｒｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号／／（Ｃ１２Ｐ　２１１ ０２ Ｃ１２Ｒ１：９１） （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、　ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、　ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、　ＬＵ、　％ＩＣ，ＮＬ、Ｓ Ｅ）、０Ａ（ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、ＣＮｉ、ＧＡ、ＧＮ、ＭＬ、ＭＲ ，ＳＮ、ＴＤ、ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　Ｃ Ｈ，Ｃ３゜ＤＥ、　ＤＫ、　ＥＳ、　ＧＢ、　ＨＵ、ＪＰ、　ＫＰ、　ＫＲ，Ｌ Ｋ、　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　Ｒ○、ＲＵ 、ＳＤ、ＳＥ、ＵＳ Ｉ （７２）発明者　マハウォラシルパ、トサックオーストラリア、ニュー・サウス ・ウェールズ　２０３１、ランドウィック、アリソン・ロード　９４

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．規定配位子を表現するまたは発現する細胞，媒介または分子を選択的に回収 する方法において、標的の表面に配位子または規定配位子に相補性のある配位子 を付着させる工程と、細胞，媒介または分子のうちのいくつかが規定配位子を表 現あるいは発現する電導液内の細胞，媒介または分子の懸濁液または溶液内に標 的を導入する工程と、前記規定配位子を表現または発現する細胞，媒介または分 子のうち少なくともいくつかを標的に接触するように移動させ、懸濁液または溶 液中の一対の電極間に好適な周波数，強度及び不均一性の交流電界を生じさせる ことによって相補性配位子と結合させる工程と、標的に結合した細胞，媒介また は分子を懸濁液の少なくともいくつかの他の細胞，媒介または分子から分離させ る工程とからなる方法。 ２．前記相補性配位子を標的を構成する電極のうちの１つに付着させることを特 徴とする請求項１記載の方法。 ３．電界の周波数及びまたは強度及びまたは不均一性は細胞，媒介または分子が 標的上の配位子に結合した後、これら結合した細胞，媒介または分子のうち少な くともいくつかを標的から離れて移行することを特徴とする請求項１記載の方法 。 ４．振動，撹拌または他の機械的手段によって、細胞，媒介または分子を分離す ることを特徴とする請求項１記載の方法。 ５．前記標的に結合した細胞，媒介または分子と懸濁液または溶液中の他の細胞 ，媒介または分子を非結合細胞，媒介または分子を標的から離れるように物理的 にブラッシングするかあるいは標的を非結合細胞，媒介または分子近傍から取り 除くことによって離隔することを特徴とする請求項１記載の方法。 ６．電極間の細胞，媒介または分子の懸濁液または溶液に加えられる交流電界に さらに、定常電界が同時に前記溶液中の細胞，媒介または分子に加えることを特 徴とする請求項１記載の方法。 ７．前記標的に付着した配位子は細胞または媒介の一部ではない化学的配位子で あることを特徴とする請求項１記載の方法。 ８．前記標的に付着した配位子は細胞または媒介の一部であることを特徴とする 請求項１記載の方法。 ９．細胞を分離するために用いられることを特徴とする請求項１記載の方法。 １０．相補性配位子を配位子を含む溶液または懸濁液の電極間に好適な電界を加 えることによって誘引された電極に配位子を非特異的に結合させることによって 電極に付着させることを特徴とする請求項２記載の方法。 １１．電界は交流及び定常電界でありこれらを選択的に組み合わせて配位子を種 々の好適な状態に配向させて他の電極に付着させることを特徴とする請求項１０ 記載の方法。 １２．電導液の少なくとも２つの異なる種類の細胞，媒介または分子の懸濁液ま たは溶液中の細胞，媒介または分子を分離する方法に於いて、この方法は一種類 の細胞，媒介または分子を前記電導液を介して電極の方へ選択的に移動させ、同 時にまたは連続的に、前記電導液を介して電極から離れるように移動させる周波 数，強度及び不均一性の交流電界を前記電導液内の２つの電極間に生じさせる工 程と、電極の方へ移動したこれらの細胞，媒介または分子と電極から離れて移動 するものとを分離する工程からなる方法。 １３．交流電界は一種類のいくつかまたは全ての細胞，媒介または分子が少なく とも１つの電極と接触し、残りの細胞，媒介または分子が電極と接触したものか ら離隔される迄維持されることを特徴とする請求項１２記載の方法 １４．少なくとも１つの電極の表面が配位子を支持し、この配位子に一種類の細 胞，媒介または分子が特異的に結合することを特徴とする請求項１３記載の方法 。 １５．交流電界は１種類の細胞，媒介または分子を前記電導液を介して電極の方 へ移動させ、同時に他種類の細胞，媒介または分子を電極から離れるようにする ことを特徴とする請求項１３記載の方法。 １６．少なくとも２つの種類の細胞を離隔することを特徴とする請求項１３記載 の方法。 １７．選択された第１の細胞を選択された第２の細胞または媒介を単一の融合細 胞を形成するために融合する方法に於いて、前記選択された第１細胞を単擁する 工程と、この細胞を前記第２の細胞または媒介を並列に配向させ、好適な周波数 ，強度及び不均一性の交流電界によって細胞及び媒介を並列位置に保持する工程 と前記細胞及び媒介を融合させる工程とからなる方法。 １８．前記第１の細胞は前記第２の細胞または媒介と並列に配向する前に第１の 電極に付着し、交流電界は第１の電極及び第２の離れた電極間に加えられること を特徴とする請求項１７記載の方法。 １９．第２の細胞または媒介は第１の細胞と並列に配向される前に第２の電極に 付着することを特徴とする請求項１８記載の方法。 ２０．複数の細胞または細胞と媒介が並列配向を有するようになる細胞，媒介ま たは分子と並列に配向した後、細胞及び媒介がそれらが融合される前に少なくと も１つの電極から解放されることを特徴とする請求項１９記載の方法。 ２１．並列した複数の細胞、または細胞と媒介はそれらが融合される前に双方の 電極から解放されることを特徴とする請求項２０記載の方法。 ２２．並列した複数の細胞または細胞と媒介は強力な電界，融合薬品，ウイルス の調停及びこれらを組み合わせた融合促進作因によって融合されることを特徴と する請求項１７記載の方法。 ２３．第２の細胞または媒介は第２の電極に付着し、別の第２の細胞または媒体 は既に第２の電極に付着した第２の細胞または媒介に付着し、そしてこの別の第 ２の細胞または媒介は、前記別の第２の細胞が第２の電極から離れるように交流 電界を変え、第２の電極を前記別の第２の細胞の近傍から引き離し、そして別の 第２の細胞が第１の細胞と並列に配向するように再び交流電界を変えることによ って第１の細胞に接近するように第２の電極から解放されることを特徴とする請 求項１９記載の方法。 ２４．電界は第２の電極を引き離さずに、第２の電極上の前記別の第２の細胞が 第２の電極の第２の細胞から第１の電極の第１の細胞の方へと分離するように変 え、前記別の第２の細胞が第１の細胞と並列に配向するように２つの電極間の最 も適した位置に到達した時電界を変えることを特徴とする請求項２３記載の方法 。２５．請求項１乃至１６のいずれか１項記載の方法によって分離または回収さ れる細胞，媒介または分子。 ２６．請求項１７乃至２４いずれか１項記載の方法によって生せられる融合細胞 。 ２７．請求項２６に記載の融合細胞によって製せられる酵素，成長因子，壊死因 子または他の生体分子。