JPH06510200A - インサイチューハイブリダイゼーション法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インサイチューハイブリダイゼーシ田ン法本出願は、１９９１年９月４旧に出願 され、共に所有され、係属中の同種出願米国出願第０７７７５５．２９１号の一 部継続出願である。

１、λ班！旦■ 本発明は、二本鎖のＤＮＡ標的とインサイチューノ＼イブリダイゼーシ３ンを行 なう診断方法に関する。

２．１尺文旦 入１ａｘａｎｄｒｏｖ、Ｓ、Ｐ、Ｍ、　５　、Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａ、９６：４ ４コ（１９８８）　。

Ｂａａｎ、　Ｒ，Ａ、’ｒ　、　Ｆｒｏｇ　Ｃ１１ｎ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｓ　３４ ０Ａ：１．０１（１９９０）　。

−Ｂｌｕｍ、　Ｈ，Ｅ、ｉ、−、Ｌａｎｃｅｔ、　７７１　（１９８４）。

Ｂｌｕｍ、Ｈ，Ｅ、　；　、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｌコ９：８７　（１９８４）。

Ｂｕｃｈｂｉｎｄａｒ、　Ａ、ら　、　Ｊ　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ　Ｍａｔｈｏｄｓ 、　２１：１９１（１９８８）　。

Ｃｈｅｎ、　Ｔ、Ｒ，、Ｃｙｔｏｇｅｎａｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎａｔ　４８：１ ９　（１９８１１）　。

Ｃｈｅｎｇ、Ｓ、　’ｓ　、Ｊ、Ｂｉａｓ、ｃｈａｍ、２６：ｌ：１５１０　（ １９８Ｂ）。

ＣｈｅｒＲ，Ｄ、う　、　）ｔｕｍａｎ　Ｇａｎｅｔｉｃｓ　８１：３５８　（ １９８９）　。

Ｃｏｏｋｅ、　Ｈ，Ｊ、う　、　Ｎｕｃｌａｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｓ、　６： ３Ｌ７７（１９７９）　。

Ｄｉｓｔａｃｈｅ、　Ｃ，Ｍ、”）　、　Ｃｙｔｏｍａｔｒｙ　１１：１１９　 （１９９０）　。

Ｅｍｍｅｒｉｃｈ、　ｐ、５　、　Ｅ）ｑ）　Ｃａ１ｌ　Ｒａ５１８１：１２６ 　（１９１１９）。

Ｆｕｊｉｙａｍａ、Ａ、　’ｙ　、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｇ、　 １１：４６０１（１９１ｉ１３）　。

ｃａｘｂａｒセ、Ｆ、　５　、、Ｎａｔｕｒｅ　２８１：６４６　（１９７９） 。

Ｇｒｉｆｆｉｔｈ　う　、　Ｂｉｏｃｈ＠ｍ、　２４：１５８　（１９８５）。

Ｈａａｓｅ、Ａ、Ｔ、　う　、ＶｉｒｏＬｏｇｙ、　１４０：２０１　（１９８ ５）。

Ｈａａｓａ、Ａ、Ｔ、　ら　、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｅａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ 、８７：４９７１（１９９０）。

Ｗａｒｄｅｒｓ、Ｊ、　；ｒ　、ＥＭＢＯ：ｆ、８（ｌコ）：３９４１　（１９ Ｂ９）。

Ｊｏｓｅｐｈ、　Ａ、　；　、　Ｅｘｐ　Ｃａ１ｌ　ＲＱＳｚ　１８３：４９４ 　（１９Ｂ９）。

Ｋ＠１ｌａｒ、　Ｇ、Ｈ，；　、　ｋｎ＆１．　Ｂｉｏｃｈａｍ、１７０：４４ １　（１９８８）。

Ｋｉｔａｚａｗａ、Ｓ、　ら　、ｕｉｓｔｏｃｈａｍｌｓｔｒｙ、９２：１９５ 　（１９８９）。

Ｋｏｒｂａ、　Ｂ、Ｅ、　；、ｒ　、　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１６５：１７２　（ １９８８）。

Ｋｏｒｅｎｂｅｒｇ、、Ｔ、Ｒ，’ｙ　、Ｃ＠ｌｌ、５コニ３９１　（１９８８ ）。

Ｌａｗｒ＠ｎｃｅ、　Ｊ、Ｂ、　う　、　Ｃａ１ｌ、５２：５１　（１９８Ｂ） 。

Ｌａｗｒａｎｃａ、　Ｊ、Ｂ、、　ｃｔｅｎｏｍａ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、　ｌ： ｌ　（１９９０）。

Ｌａｂｏ、　Ｒ，Ｖ、　；　、　Ｓｃｉ＠ｎｃａ、　２２５＝５７　（１９８４ ）。

Ｌｉｃｈｔａｒ、　Ｐ、　；　、　５ｃｉａｎｃａ、２４７：６４　（１９９０ ）。

Ｌｉｃｈｔａｒ、Ｐ、　ら　、Ｎａｔｕｒａ、コ４５；９３　（１９９０）。

Ｌｕｃａｓ、　Ｊ、Ｎ、　ｉ、　、工ｎｔ　Ｊ　Ｒａｄｉａｔ　Ｂｉｏｌ、　５ ６（１）　：３５（１９８９）　。

Ｍａｄｉｒａｊｕ、　Ｍ、　４　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　ＵＳＡ。

８５：６５９２　（１９ｓｇ）。

ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ、　ＭＪ、’＋　、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、 　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８６：９９９１　（１９Ｂ９）。

Ｍａｙｎａ、　ｓ、　；ｙ　、　Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　４７４７２　（１９ａ９） 。

Ｍｏｙｚｉｓ、　Ｒ，Ｋ、；　、　Ｐｒ０ＣＮａｔ１ｘｃａａ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ 。

Ｑ５：６６２２　（１９１１８）。

Ｎａｒａｙａｎｓｖａｍｉ、　Ｓ、’ｊ　、　Ｃｙｔｏｍａｔｒｙ、　ＬＬ：１ ４４　（１９９０）。

Ｎｉ＠ｄｏｂｉセｅｋ、Ｇ、　ら　、　入ｍ　Ｊ　ｏｆ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、 １ｊｌ（１）：１゜（１９８ｇ）　。

Ｎｏｏｎａｎ、　Ｃ，Ａ、　’ｐ　、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ υＳＡ。

Ｐｉｎｋｅｌ　Ｄ、　ｊｐ　、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、８３：２ ９コ４（１９８６）。

５ｈａｎ、Ｄ、　う　、Ｃａｎｃｅｒ　Ｒａ５ａａｒｃｈ、４Ｂ＝４３３４　（ １９８８）。

５ｈｉｂａｔａ、　Ｔ、ら　、　Ｊ、　Ｂｉｏ、　Ｃｈｅｍ、、　２５６：７５ ５７　（１，９８１）。

Ｓｉｍｏｎ、Ｄ−３、Ｃｙｔｏｇ＠ｎａｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、３９：１１ ６（１９８５）。

Ｔｒａｓｋ、　Ｂ、＞　、　Ｈｕｍ　Ｇｅｎａｔ　７８：２５１　（１９８８） 。

Ｕｎｇａｒ、　Ｅ、　Ｒ，；　、、　Ａｍ　Ｊ　ｏｆ　Ｓｕｒｇ　Ｐａｔｈｏｌ ｏｇｙ。

１０（Ｌ）：ｌ　（１９８６）。

Ｕｒｄｅａ　Ｍ、Ｓ、　ら　、Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、１６：４９コア　 （１９８８）。

ｖａｎ　Ｄｅｋ）ｃａｎ、　Ｈ，；　、　Ａｃｔａ　ｈｉｓｔｏ、　３７：９１ 　（１９８９）　。

ｖａｎ　Ｄａ）ｃｋｅｎ、Ｌ　ｉ）　、ｃｙｔｏｍｅセｒｙ、ｌｌ：１５３　（ １９９０）。

Ｖａｎ　Ｄｅｋｋｅｎ、　Ｈ，；）　、’　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、　１１：５７ ９　（１９９０）。

Ｗｅｉｅｒ、Ｈ，Ｌ　、ＢｌｏＴａｃｈｎｉｑｕｅｓｌｏ（４）＝４９８（１９ ９１）。

Ｚｉｓｃｈｌｅｒ、　Ｈ，；　、　Ｈｕｍ　Ｇｅｎｅｔ、　８２：２２７　（１ ９ａ９）　。

３、発渥しと１景 インサイチューハイブリダイゼーシヲンは、ＤＮＡプローブと、生物構造、代表 的には透過性を高めた細胞、細胞上画分（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）　、または 固定された染色体調製物中のＤＮＡまたはＲＮＡとの直接ハイプリダイゼーシ讐 ンを使用する。この方法は、固定された生物構造中の特定の配列標的核酸類の局 在についての形態学的な情報を生じ得、発生生物学、細胞生物学、遺伝学および 特に遺伝子マツピング、病理学および遺伝子診断法などの生体臨床医学研究の多 くの分野に適用し得る。

大部分の使用において、インサイチューハイプリダイゼーシコンは二本鎖二重鎖 （ｄｕｐｌｅｘ＞の核酸、代表的には病原体に、または、ウィルスまたは細胞の 染色体ＤＮＡ中の選択された配列に関連する二本鎖ＤＮＡに含まれる標的配列中 の標的配列に向けられる。この方法では、従来から実施されたように、−末鎖の ラベルされたプローブを、標的二重鎖核酸を変性するの（こ十分な温度まで加熱 された、上記透過性を高めた構造に添加し、このプローブおよび変性した核酸を 、適切な）＼イブリダイゼーシヲン、または、リアニーリング条件下で反応させ る。

未結合（／・イブリダイズしなかった）のプローブを除去した後、前記構造は、 レポーターラベルの存在を検査するの（こ処理され、標的二重鎖核酸にプローブ が結合する部位を、生物構造で、即ち、細胞または細胞上形態の状況で、局在化 させる。

この方法は、特定遺伝子配列の位置のマ・ソビングおよび既知の遺伝子配列間の 距離のマツピング（Ｌｉｃｈｔｅｒ、　Ｍｅｙｎｅ、　５ｈｅｎ）、サテライト ＤＮＡまたは反復ＤＮＡの染色体上分布（Ｗｅｉｅｒ。

Ｎａｒａｙａｎｓｖａｍｉ、Ｍｅｙｎｅ、　Ｍｏｙｚｉｓ、　Ｊｏｓｅｐｈ、　 Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ）の研究、核組織の検査（１，ａｖｒｅｎｃｅ％Ｄｉｓｔ ｅｃｈｅ、　Ｔｒａｓｋ）、染色体異常の解析（Ｌｕｃａｓ）、単−細胞類また は組織中のＤＮＡ損傷の局在イヒ（Ｂａａｎ）およびフローサイトメトリー分析 による染色体含量の測定（Ｔｒａｓｋ）など、染色体ＤＮＡに広く適用されて（ 入る。宿主細胞染色体に組み込まれたウィルス配列の局在化（こ関して幾つかの 研究が報告されている（例えば、Ｈａｒｄｅｒｓ、　Ｌａｗｒｅｎｃｅ、　Ｌｔ ｃｈｔｅｒ、　Ｋｏｒｂａ、　Ｓｉｍｏｍ）。この方法（ままｔコ、断面イヒさ れた核の三次元的再構築により（ｖａｎ　Ｄｅｋｋｅｎ）、そして、開明染色体 トポグラフィ−を研究するためのデジタルイメージ分析を用いる、水銀処理され たおよびビオチン化されたプローブを用いた二重のインサイチューハイプリダイ ゼーシコンにより（Ｅｍ！Ｉｅｒｉｃｈ）、染色体の位置を研究するのに使用さ れている。

インサイチュ−ハイブリダイゼーション法の別の一般的な使用としては、診断手 段として、宿主細胞中のウィルスの存在の検出がある（Ｕｎｇｅｒ、　Ｈａａｓ ｅ、　ＮｏｏｎａｎＳＮｉｅｄｏｂｉｔｅｋ、　Ｂｌｕｍ）。感染された細胞中 のウィルス粒子の数が非常に少ない特定の場合は、インサイチュ−で採用された ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によって最初にウィルス配列を増幅すること が必要であり得る（　Ｈａｓｓｅ、１９９０、Ｂｕｃｈｂｉｎｄｅｒ）。

上記のインサイチューハイプリダイゼーンヨン法は多（の制約を有する。最も重 大な制約は、二重鎖標的ＤＮＡを変性する必要がある点にあり、該標的の一本鎖 形態を形成する必要がある。変性は代表的には、試料を加熱することにより、ま たは、化学薬剤および加熱を用いて処理することにより行われる。この加熱処理 は、ＤＮＡ内の構造変化及び反復配列間の核酸再結合に関連する、予期できない 見せかけのおよび望ましくない変化を検出される核酸中に生じ得る。この反復配 列は互いにランダムに再結合しうる。この工程はまた、この方法において必要な 時間および労力を付加する。

第２に、目的の標的配列が極めて低コピー数で存在する場合は、この方法は、復 元動力学によって、長い復元時間に制約される。その時でさえ、この方法は、低 標的濃度でプローブ／標的復元反応を生じ得ない。この制約は、上記のよう（こ 、最初に改変されたＰＣＲ法により、インサイチュ−で標的二重鎖を増幅するこ とによって、部分的（こは克服し得る。し力）し、ＰＣＲアプローチは、付加的 な工程を含み、モしてゲノム染色体ＤＮＡ配列の局在化を含むインサイチュ−研 究のような、多くのインサイチュ−研究には不適切である。

４、聚粧且１１ 本発明の一般的な目的は、それ故、固定された生物構造で、標的核酸、代表的に は二重鎖ＤＮＡを検出する工程および／または局在化する工程で使用する、イン サイチューノ＼イフ゛ＩＪダイゼー７ｇン法を提供することにあり、該方法（よ 、（ａ）標的二重鎖の熱変性を必要とせず、そして（ｂ）再生動ブフ学；こよっ て標的二重鎖コピー数で制限されなし為。

本発明は、細胞または細胞下の生物種コ告中（こ、該構造と特定の形態学的関係 で含まれた二本鎖核酸中の既知の標的配ｒ７１１の存在を同定する方法を包含す る。この方法（よ、該構造ζこ、二重鎖標的配列の鎖の一方に相捕的な、レポー ターでラベルされた一末鎖核酸ブローブに安定１こ結合されたＲｅｃＡタンＢり 質からなるプローブ複合体を、この複合体力ジニ重鎖核酸と接触し得る条件下で 添加する工程を包含する。上Ｓ８複合体（よ、非変性条件下で標的配列【こ結合 し得る。未結合の複合体を除去する工程の後、上記構造は、核酸（こ結合された レポーターでラベルされたプローブの存在を検査される。

前記複合体は、好適には、ＡＴＰγＳの存在下の調製によって安定化される。プ ローブは、放射性ラベル、酵素または蛍光タグのような検出可能なレポーターを 用いて、または、ビオチンまたはジゴキシゲニンのような、続いてリガンドに特 異的なレポーター分子と反応し得、そして検出可能なレポーターを有するリガン ドを用いてラベルされ得る。上記複合体はまた、ＡＴＰγＳ、　ＧＴＰγＳ、　 ＡＴＰＳｄＡＴＰ、およびＡＴＰγＳとＡＤＰとの組み合せを含み、しかしこれ に限定されず、他のコファクターを用いて安定化され得る。

一つの一般的な適用において、本発明の方法は、分裂中期拡散物（ｍｅｔａｐｈ ａｓｅ　５ｐｒｅａｄｓ）中の固定された染色体ＤＮＡ構造中のゲノム配列の検 出および局在に用いられる。一つの実施態様において、染色体の顕微鏡的超微細 構造が、例えば、蛍光バンディングパターンを用いる蛍光顕微鏡使用により測定 され得る。次いで、既知の超微細構造に関係して結合した複合体の位置は、例え ば、染色体バンディング蛍光励起波長と異なる励起波長を有する蛍光ラベルされ たプローブ複合体により独立に測定される。あるいは、固定された細胞または細 胞構造類は、懸濁液中でプローブされ、フローサイトメーターまたは顕微鏡分析 される。

別の一般的な使用において、本発明の方法は、宿主細胞中のウィルスまたは組み 込まれたウィルス特異的なゲノム配列の存在を検出するのに使用し得る。このウ ィルス配列への蛍光ラベルされたプローブの結合は、蛍光顕微鏡使用、または、 蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、または、光学または蛍光またはレー ザー走査顕微鏡により測定され得る。酵素ラベルが使用される場合、光学顕微鏡 が、レポーター酵素により生成され、着色された（例えば、黒）ペルオキシダー ゼまたはアルカリホスファターゼ生産物を可視化するのに使用され得る。

本発明の別の実施態様は、固定された細胞または細胞下生物構造中に含まれる既 知のウィルス核酸標的配列の存在を同定する方法を包含する。そのような既知の ウィルス核酸標的類は、既知のＤＮＡウィルス（Ｂ型肝炎ウィルスのような）ま たはそのライフサイクル中の検出可能な二重鎖核酸フェーズを有し得るＲＮＡウ ィルスを含む。この方法では、固定された構造類または細胞軍構造類は、反応効 率を増加するために、前記ＲｅｃＡプローブ複合体の添加前に、ｐＨ７，５の１ ０ｍＭ　）リス−酢酸緩衝ｌ中、５５−６０℃でインキュベートされ得る：この 工程は、細胞ＤＮＡを変性しない。

本発明はまた、単一コピー核酸配列、代表的には、細胞または細胞下生物構造に 含まれる二重鎖ＤＮＡ配列を検出する方法を包含する。この方法では、細胞また は細胞下生物構造が固定される。プローブ複合体（単一コピーの核酸標的配列に 相補的な、−末鎖の、レポーターでラベルされたプローブに安定に結合したＲｅ ｅＡタンパク質からなる）を、この複合体が前記核酸標的配列と接触し得る条件 下で、細胞構造または細胞軍構造に添加される。前記複合体は、次いで、非変性 条件下で標的配列に結合させる。非結合の複合体は、次いで前記構造から除去さ れ、そしてこの構造は、核酸配列に結合されたレポーターラベルされたプローブ の存在を検査される。

単一コピー核酸検出するこの方法において、細胞構造または細胞軍構造は、溶液 中またはスライドガラス上で固定されそして分析され得る。この固定はまた、５ ５−６０℃で、固定された細胞構造または細胞軍構造の、ｐＨ７，５の１０ｇＭ 　）リス−酢酸緩衝液中でのインキュベーションを包含し得る。本発明の方法に おいて、前記複合体は、２時間以下で行われる反応中で、非変性条件下で標的配 列に結合され得る。

本発明の方法はまた、−末鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、トポイソメラーゼＩま たはトポイソメラーゼＩＩのようなアクセサリ−タンパク質の添加を包含し得る 。

本発明はまた、上記方法を実行するのに有用な成分を含むキット類を包含する。

試料中の既知のウィルス核酸のインサイチュ−検出のキットの一例は、（ｉ）こ のウィルスＤＮＡ配列に由来するプローブ、（ｉｔ）このプローブをコーティン グするために有効なＲｅｃＡタンパク質、そして（ｔｉｉ）試料中の既知のウィ ルスＤＮＡへのプローブの結合を検出する手段を含有し得る。そのようなキット 類はまた。　ＲｅｃＡタンパク質でコートされたＤＮＡを含有し得る。

本発明の、これらのおよび他の目的および特徴は、以下の発明の詳細な説明を、 付属の図面と組み合わせて読んだときに、より充分に明らかになり得る。

５、Ｍ囚囚星屋説所 図ＩＡおよびＩＢは、ネイティブな非変性の（ＩＡ）および熱変性された（ＩＢ ）メタノール−酢酸固定された開明ＨＥｐ−２細胞核中の、脱コンデンスされた または部分的に脱コンデンスされたアルファサテライト染色体セントロメアＤＮ Ａ樟的配列の検出に使用された、Ｘ染色体アルファサテライトＤＮＡプローブの 蛍光顕微鏡写真である； 図２Ａおよび２Ｂは、開明１（Ｅｐ−２細胞中のネイティブな非変性の（２Ａ） および熱変性されたく２Ｂ〉固定核中の脱コンデンスされた染色体セントロノア ＤＮＡ標的配列の検出に用いられた、第７染色体へのアルファサテライトＤＮＡ プローブの蛍光顕微鏡写真である； 図３Ａおよび３Ｂは、蛍光顕微鏡（３Ａ）および位相顕微鏡（３Ｂ）検鏡下、同 一焦点で撮られた顕微鏡写真を示し、固定された分裂中のＨＥｐ−２細胞核中の Ｘ染色体アルファサテライトＤＮＡの分布を示す。

図４　Ａ−４Ｄは、本発明の方法を用いる、染色体上の遺伝子局在化のための工 程を図示する； 図５−１０は、種々のタイプの染色体異常（上部フレームＡ）、およびそのよう な異常で見られるであろう、対応する蛍光パターンを示しく下部フレームＢ）； そして図１１Ａ−１１Ｃは、蛍光活性化された細胞ソーティングによる、本発明 の細胞のウィルス感染を検出する工程を図示する。

図１２は、ヒト第１染色体アルファサテライトセントロメア配列への、ＲｅｃＡ コートされピオチン化されニックトランスレートされたプローブとハイブリダイ ズした、固定されたＨＥｐ−２分裂中期染色体からのハイブリダイゼーションシ グナルを示す細胞調製物の写真を示す。

図１３Ａから１３Ｆは、懸濁液中の、ＡＴＣＣＨＥｐ−２およびＨＣＣ−Ａｌｅ ｘａｎｄｅｒ−細胞中の、唯一つのｐＳ３染色体１７腫瘍サプレッサー遺伝子配 列の、ＲｅｃＡが介在したネイティブの蛍光インサイチニーハイブリダイゼーシ ョン検出を示す。

図１４Ａから１４Ｄは、スライド上の、ＡＴＣＣＨＥｐ−２細胞核中の、唯一つ のｐ５３遺伝子配列の、ＲｅｃＡが介在したネイティブの蛍光インサイチュ−ハ イブリダイゼーション検出を示す。

図１５Ａから１５Ｅは、懸濁液中の、ＡＴＣＣＨＣＣ″Ａｌｅｘａｎｄｅｒ゛細 胞中のＢ型肝炎ウィルス（）ＩＢＶ）　ｌ酸配列の、ＲｅｃＡが介在したネイテ ィブの蛍光インサイチューハイブリダイゼーシロン検出を示す。

図１６Ａから１６ｃは、競合ハイブリダイゼーションにより試験されたヒ＋−ｎ ｃｃ細胞中の、ＲｅｃＡが介在したネイティブの蛍光インサイチューハイブリダ イゼーシロン検出を用いるＨＢＶ標的検出の特異性を示す。

（以下余白） ６、［ｌの−なセロ ■、インサイチューハイブリダイゼーションこのセクンコンでは、繰り返し、ま たは、唯一の特定の塩基対配列を有する、二重鎖ＤＮＡ標的を含む種々の生物構 造類に適用されるものとして、本発明による、インサイチュ−ハイブリダイゼー ションの基本的な方法論を記載する。

Ａ、ＤＮＡ　のための）　°１　の一 本発明の方法は、相補的塩基対ハイブリダイゼーションによって、二重鎖核酸、 通常、ＤＮＡ／ＤＮＡ二重鎖核酸を含む生物構造中の選択された標的配列を検出 するためにデザインされる。

生物構造は、標的核酸配列を含む、細胞、精子、寄生体、細胞下画分または染色 体調製物のような、任意の形態的に明瞭な構造である。

この構造中の標的二重鎖は、代表的には、染色体ＤＮＡ、または、色層化された またはウィルスコートタンパク質中に色層化されている状態から遊離したウィル ス二重鎖ゲノムからなるウィルス粒子のような、ウィルス、寄生体または細菌病 原体に関連した核酸二重鎖物質である。細胞、核、および染色体調製物のような 、固定された生物構造類を調製する方法は、通常、ＤＮＡ二重鎖の変性およびリ アニーリングによる従来のインサイチューハイプリダイゼーンヨンで使用される 方法に従要約すれば、細胞区画およびＤＮＡ構造は、そのままの形態学的関係で 、構造成分を固定するために、有機溶媒そして酸または架橋剤を用いる処理によ り、さらに固定されまたは透過性を高められ得る。常用の固定化剤は、酢酸、塩 類、メタノール、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、そしてグルタルアルデヒ ドを包含する。固定後、組織試料は、ワックス中に包埋することによりまたは凍 結することにより、次いで、薄いスライスに分割することにより、スライド形態 で調製され得る。

より一般的に、生物材料は、前記構造を除タンパク質化するおよび／または脱脂 肪化し得る多くの薬剤の一つまたは一つ以上で処理される。このような方法は、 プロテアーゼ、リパーゼ、酸、アルコール類を含む有機溶媒、界面活性剤類また は熱変性またはこれら処理の組み合せの使用を含み得る。

常用の処理は、メタノール：酢酸を用いる一回または一回以上の洗浄を含む。

核酸の非特異的結合のインヒビターの使用のような、他の前処理が、バックグラ ウンドを減少することにおいて有用であり得る。例えば、非特異的なキャリアＤ ＮＡ　（、例尤ば、サケ精子）またはＲＮＡ　（例えば、ｔＲＮＡ）を用いるプ レハイブリダイゼーションが、固定されたＤＮＡ−標的構造への非特異的プロー ブ結合を減少するために作用し得る。

目的の細胞構造は、例えば、細胞培養、組織切片または体液中に存在する細胞か ら得られた個々の細胞であり得る。代通常、さらに水冷したメタノール：酢酸の 添加および各添加の後の細胞の穏和な撹拌、次いで、引き続く遠心分離で、細胞 質は核から除去された。得られた単離された核調製物を、メタノール：酢酸中に 再懸濁し、顕微鏡スライドガラス上のｌＯμｌアリコートニー置き、乾燥し、そ してこのスライドガラスを後に使用するため一２０℃で保存した。あるいは、細 胞は、標準条件を用いて集められ得、ｌ×リン酸緩衝液（ＰＢＳ）中で洗浄され 得、そして１００％メタノールまたは７０％エタノール中で固定され、次いで、 −２０℃で保存し得る：これらの細胞は、溶液ハイブリダイゼーシッン検出反応 で使用し得る。

一般的な目的の別の構造は、代表的には、分裂中期の細胞に由来する固定された 染色体調製物である（Ｐｉｎｋｅｌ、Ｃｈｅｒｉｆ）。この調製物は、図ＩＡお よびＩＢ中の調製物のような細胞、または、公開された方法（Ｌｅｂｏ、　Ｍｃ Ｃｏｒｍｉｃｋ）または染色体フラグメントにより得られ得るような、個々の単 離された染色体からの完全なセットのゲノム染色体を含有し得る。この染色体は 、一般に、メタノール：酢酸で処理され得、スライドガラス上に置かれ得、次い で、乾燥することにより、スライドガラス上に固着される。

ミトコンドリアのような種々の他の細胞下構造、または、ピリオン粒子のような 細胞または血液試料から単離された寄生体を含む病原性構造はまた、標準方法に 従って調製され得、そして固定されそして上記のようにインサイチュ−１１イブ リダイゼーシヨンのために透過性を高められ得る。

Ｂ、・、・ＤＮＡプローブ 本発明の方法で使用されたプローブは、−末鎖の核酸で、通常ＤＮＡ鎖プローブ 、または二重鎖プローブの変性に由来し、それは、標的二重鎖核酸の一方（また は両方）鎖に相捕的である。プローブ配列は、好適には標的配列と少なくとも９ ０−９５％配列相同性を含み、プローブおよび標的の配列特異的ハイブリダイゼ ーションを確実にする。−末鎖ブローブは、より短い、または、より長いポリヌ クレオチドプローブを使用し得るが、代表的には、約１００−６００塩基長であ る。

プローブは、多くの標準法の一つにより構築または得られ得る。種々のサテライ トＤＮＡ配列のような多くのプローブが一本鎖または二本鎖形態で市販されてい る。他のプローブが、ウィルス、プラスミドおよびコスミドまたは特定配列を担 持する他のベクターから直接、または、所望ならば、ベクターのようなプローブ ＤＮＡの供給源から制限酵素消化、次いで、特定制限酵素消化フラグメントの電 気泳動的単離により得られ得る。このようにして得られたプローブは、代表的に は、二本鎖形態であるが、必要ならば、Ｍ１３ファージベクターのような一本鎖 ベクター中にサブクローンされ得る。

あるいは、上記プローブは、オリゴヌクレオチド合成法により一本鎖形態で調製 され得るが、この方法では、より長いプローブについては、プローブのサブフラ グメントを形成し、次いで、サブフラグメンを一緒につなぎあわせることが必要 である。

上記プローブは、レポーターまたはリガンドまたはインサイチュ−に標的された 配列の検出を可能にする部分でラベルされる。オートラジオグラフィー検出には 、レポーターは、例えば、ラベルされたヌクレオチドの存在下でニックトランス レーシランまたはポリメラーゼ連鎖反応により形成された３２ｐ−ラベルされた プローブのような放射性ラベルである。

蛍光検出には、プローブは、４９０．５４０．および３６１　ｎ■のような特定 波長で励起可能な、ＦＩＴＣ，ＢＯＤＩＰＹ、　Ｔｅｘａｓ　Ｒｅｄ、またはＣ ａ５ｃａｄｅ　Ｂｌｕｅのような蛍光基の選択の一つでラベルされ得る。これら の基は、３゛または５°プローブ末端にまたは標準法（Ｕｒｄｅａ、　Ｗｅｌｌ ｅｒ、　Ｚｉｓｅｈｌｅｒ）に従い、内部位置で取り込みまたは反応によって誘 導体化される。

あるいは、プローブは、ビオチン（Ｗｅｔｅｒ）　、ジゴキシゲニン（Ｚｔｓｃ ｈｌｅｒ）、または、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵｒｄ）またはフルオレ セイン−１１−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　（Ｋｉ ｔａｚａｖａ）を含む他の修飾塩基のような、リガンドタイプレポーターでラベ ルされ得る。プローブレポーター基は、ハイブリダイズされたプローブの第２の レポーター分子との反応によりインサイチューに検出される。このレポーター分 子は、（ａ）プローブリガンドに特異的におよび高い親和性で結合し、そして（ ｂ）検出可能なレポーターを含む。第２の分子の結合性部分は、ビオチン化され たヌクレオチドへの結合には、アビジンまたはストレプトアビジン、ジゴキシゲ ニンでラベルされたヌクレオチドへの結合には、抗ジゴキシゲニン抗体、そして ＢｒｄＬｌｒｄでラベルされたプローブへの結合には、抗ＢｒｄＵｒｄ抗体であ り得る。

第２の分子中の検出可能なレポーターは、代表的には、蛍光ラベルであり、しか しまた、オートラジオグラフ検出には、放射性ラベル、適切な基質の存在下での 比色または化学ルミネセンス検出には、抗体、酵素、または、電子顕微鏡可視化 には、ｃｌｌｏｉｄａｌ　ｇｏｌｄ　（Ｎａｒａｙａｎｓｖａｍｉ）であり得る 。

Ｃ，ＲｅｃＡおよび　ＲｅｃＡ８０３　ン／ぐり　の　１＝本発明で使用される ＲｅｃＡ／プローブ複合体を形成するのに用いるＲｅｃＡおよびＲｅｃＡ８０３ タン／４り質は、好適には、Ｅ、ｃｏｌｊ　ＪＣ１２７７２およびＪＣ１５３６ ９株（Ａ、Ｊ、　Ｃ１ａｒｋおよびＭ、　Ｍａｄｉｒａｊｕから得た）のような 過剰生産株から単離される。これらの株４ｉ、ＲｅｃＡコーディング配列を、細 胞あたり高コピー数で存在する°ｒｕｎａｗａｙ’複製プラスミドベクター上に 含む。ＲｅｃＡ８０３タンノｆり實は、野生型ＲｅｃＡ　（Ｍａｄｉｒａｊｕ） の高活性変異体である０ＲｅｃＡタンパク質は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から購入 し得、また：よヒドロキシアパタイトカラム上の高速タンノ櫂り質液体クロマト グラフィー（ＦＰＬＣ）次いでアニオン（Ｍｏｎｏ’Ｑ）交換カラムを用いて精 製し得る。単離手法は、公開された手法（５ｈｉｂａｔａら、Ｇｒｉｆｆ　１ｔ ｈ）の組み合せおよび改変である。詳細１よ、実施伊１１で提供される。

タンパク質精製をモニターする標準アッセイ↓Ｌ　５ＤＳ−ポ１ノアクリルアミ ドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）　（Ｐｈａｒ＋＋＋ａｃｉａ　Ｐｈａｓｔｇｅｌｓ ｙｓｔｅｍ）による３１１．０００ダルトンＲｅｃＡタンパク質のアッセイ、［ γ−３２Ｐｌ　ＡＴＰおよび０．５ＭＬｉＣ１および０．２５Ｍギ酸溶媒中で展 開されたＰＥＩセルロース薄層クロマトグラフィーを用いる５ｓＤＮＡ依存性Ａ ＴＰアーゼ活性の酵素アッセイ、ＤＮアーゼのアッセイ、５００マーオリゴヌク レオチドプローブを用いるＤ−ループ活性のアッセイを包含する。

５ＯＳ−ＰＡＧＥ　（変性条件）による、ＪＣ１２７？２およびＪＣＩＳ３６９ 細胞抽出物からの全タンパク質の分析は、３８．　ＧｏｏダルトンＲｅｃＡタン パク質が、これら株で産生された主要タンパク質であることを示す。

最終のＭｏｎｏ−Ｑ−精製されたＲｅｃＡおよびＲｅｃＡ８０３タンパク質の５ ＤＳ−ＰＡＧＥプロフィールは、銀染色により検出されたように、他の細胞ポリ ペプチドのない、単一の３８．　Ｇｏｏダルトンのバンドを示した。

Ｄ、ＲｅｃＡ　ＤＮＡプローブ　４　の　１目的の生物構造中の二重鎖核酸は、 −末鎖プローブに安定に結合したＲｅｃＡタンパク質からなるプローブ複合体と 反応する。この複合体は、好適には、ＡＴＰγＳの存在下で安定化された形態で 調製される。

プローブのＲｅｃＡタンパク質コーテコ−ティング常、実施例２に詳細に記載さ れたように行われる。要約すれば、プローブは、二本鎖または一本鎖にかかわら ず、９５−１００℃で５分間加熱することにより変性され、次いで２０秒から１ 分間水浴中：こ置かれ、その後、使用前に約２０秒間０°Ｃで遠心分離される。

変性されたプローブは、−２０℃でフリーザー中に保存し得る；しかしながら、 好適には、それらは、直ちに、室温で、ＡＴＰγＳを含む標準ＲｅｃＡコーティ ング反応緩衝液に添加され、そしてこれにＲｅｃＡタンパク質が添加される。

プローブのＲｅｃＡコーティングは、３７℃で１０−１５分間、ブローブーＲｅ ｃＡ混合物をインキコベートすることにより開始する。プローブとの反応の間、 試験されたＲｅｃＡタンパク質濃度は、プローブサイズおよび添加されたプロー ブの量に依存し、そして好適には、約２から２５μＭの間の範囲にある。−末鎖 プローブが、その相同プローブ鎖とは独立にＲｅｃＡコートされるとき、ＡＴＰ γＳおよびＲｅｃＡのｍＭおよびμＭ濃度は、それぞれ、二本鎖プローブで使用 されたそれらの半分に減少し得る（即ち、ＲｅｃＡおよびＡＴＰ７Ｓ濃度比は、 通常、−末鎖または二本鎖プローブが使用されるか否かに依存し、個々のプロー ブ鎖の特定濃度で一定に保たれる）。

本発明の重要な特徴に従って、ＲｅｃＡ／プローブ複合体の、生物構造中に含ま れる標的二重鎖への配列特異的結合は、この構造に、非変性条件下、即ち、二重 鎖ＤＮＡの変性温度以下で、プローブ複合体を添加する工程により、そして該標 的二重鎖に該複合体を、代表的には、１−４時間、３７°Ｃでプローブ複合体の 標的ＤＮＡ配列への相同結合が起こるまで接触させる工程により達成される。

標的ＤＮＡ配列へのプローブ結合の後、標的構造は洗浄され非結合のプローブ複 合体を除去する。通常の場合では、プローブレポーターがビオチンのようなリガ ンドであるとき、洗浄された前記構造は、蛍光ラベルされたアビジン（ＦＩＴＣ −アビジン）のような検出可能なレポーター分子と接触され、検出可能なレポー ターを標的に結合したプローブに結合する。試料物質は、次いで、非結合のレポ ーター分子を除去するためにさらに洗浄される。種々の洗浄手法が適切である。

前記構造は、例えば、以下に記載されたように、可視化され、または顕微鏡によ り、蛍光活性化された細胞ソーティング、オートラジオグラフィーなどにより観 察または検出される。

ビオチン化されたプローブの蛍光レポーター検出における使用のための、実施例 ３に記載されたノ＼イブリダイゼーシ茸ン条件は例示である。要約すれば、１０ −２０μｌの間のプローブ複合体が、スライドガラス上の固定された調製物に適 用される。ハイブリダイゼーション領域の上にカバーガラスを置き、そしてンー ルし、そして反応物は３７℃７％ＣＯ２インキュベーター中、湿潤コンテナ中で 、１−４時間インキュベートされる。インキュベーションに続き、カバーガラス ラバーセメントシールを除去し、そしてスライドガラスをカバーガラスと共に数 回洗浄し、カバーガラスを緩めそしてカバーガラスを除去し、そして非結合のプ ローブ複合体を除去する。

スライドガラスを、前ブロツク溶液中に置き、次いで（ａ）暗所中で前ブロツク 溶液中でＦＩＴＣ（フルオレセインインチオシアネート）−アビジンに浸漬また は適用し、次いで、数回洗浄して非結合のＦＩＴＣ−アビジンを除去する。抗進 色剤を、ヨウ化プロビジウムのようなカウンター染色と共にまたはカウンター染 色剤なしで、光退色を防ぐために使用し得る。

必要であれば、スライド上の材料を、標的二重鎖に結合する蛍光シグナルの量を 増加するために、ビオチン化された抗アビジン抗体と反応させた後、数回の洗浄 工程およびＦ　ＩＴＣ−アビジンを添加して、プローブシグナルは増幅される。

次いで、標的構造を、標的核酸に結合したレポーターでラベルされたプローブの 存在を、例えば、蛍光顕微鏡使用またはレーザー走査顕微鏡使用により検査する 。

図ＩＡは、実施例３で詳細に記載されたプロトコールに従った、本発明によりそ して増幅なしの、スライドガラス上に固定された、調製され、単離された）ＩＥ ｐ−２細胞間期核へのＸ染色体アルファサテライトＤＮＡプローブのインサイチ ューハイブリダイゼーンヨンからのＦＩＴＣシグナルを示す。Ｘ染色体は、約５ ，０００コピー／細胞のアルファサテライト配列（ＯＮＣＯＨの文献）を含むと 推定される。ビオチン化されたプローブを、上記のようにＦＩＴＣ−アビジンと 反応そしてボストラベルする。

比較の目的で、図１．　Ａの方法で使用した同一のストックからの変性されたビ オチン化されたＸ染色体アルファサテライトプローブを、ホルムアミドおよびデ キストランサルフェートと従来のプロトコールで組み合わせ、そして先行技術の 熱変性（および再生）工程を用いてＨＥｐ−２細胞核にハイブリダイズした。結 果を図ＩＢした。この手法は、図ＩＡの方法より数時間多い全調製およびハイブ リダイゼーション領域を必要とし、シグナル増幅を必要とし、そして一般的に、 核を通じて、蛍光シグナルのより低いレベルを与えた。

実施例４に報告された第２の方法は、この方法が、プローブシグナル増幅なしに 、低コピー数標的配列に高いプローブ標的特異性を与えるごとを示す。この方法 では、第７染色体アルファサテライトＤＮＡ／ＲｅｃＡ複合体を、上記のように 、ＨＥｐ−２開明核とハイブリダイズする。第７染色体は、約１０コピーの使用 されたアルファサテライト配列プローブを含む（ＯＮＣＯＲプローブＤ７Ｚ２） 。

図２Ａは、本発明による、プローブ結合およびＦＩＴＣラベリリング後の、標的 シグナルパターンを示す。図に見られるように、プローブは、二つの明瞭なスポ ットに局在化し、多分、二つの第７染色体に含まれるアルファサテライト配列に 対応する。

図２Ｂは、上記の先行技術の方法に従った増幅後の、同一プローブで達成された インサイチューノ＼イブリダイゼーンヨンプローブ結合標的パターンを示す。プ ローブの局在化は、本発明の方法におけるより特異性が低いように見光る。さら に、全調製時間およびプローブ／％イブリダイゼンツン時間は、冬時間より長か った。

実施例５に報告された、第３の方法は、共焦点のレーザー走査顕微鏡（Ｚｅｉｓ ｓ　ＬＳＭ−１０）を用いる、他の標的されたＤＮＡ配列および／または液膜に 対する核容量内の標的配列を局在化する能力を示す。この方法では、１００％メ タノールで固定されたＨＥｐ−２細胞を、上記図ＩＡのように、懸濁液中、Ｒｅ ｃＡ／染色体アルファサテライトＤＮＡプローブ複合体でプローブし、そしてＦ ＩＴＣ−アビジンでラベルした。図３Ａは分裂する液中めプローブ結合のパター ンを示す。結合したプローブを局在化するため、レンズの焦点を変えずに、位相 コントラスト顕微鏡使用により同一視野を検鏡した（図３Ｂ）。この二つの顕微 鏡写真を検査することにより、核膜および核分裂平面の相対位置が、プローブラ ベルされた染色体に関して観察され得る。

本発明による方法はまた、ネイティブなＲｅｃＡが介在した蛍光インサイチュ− ハイブリダイゼーションを用いて、分裂中期染色体における特定ＤＮＡ配列の検 出を容易にする。ヒト第１染色体アルファサテライトセントロメア配列に特異的 なＲｅｃＡコートされたビオチン化されたプローブを、ネイティブなＲｅｅＡが 介在した蛍光インサイチュ−／１イブリダイゼーションを用いて、スライドガラ ス上で固定されたＨＥｐ−２細胞と反応させた〈実施例６）。ＲｅｃＡコートさ れたプローブ混合添加前に、細胞を、６０℃で１０ｍＭ）リス−酢酸（ｐＨ７， ５）でインキュベートした。このインキュベーシコン工程は、細胞核酸標的の変 性ａ度以下で、蛍光インサイチューハイブリダイゼーシコン反応の効率を改善す る。実施例６では、このインキュベーシプン工程を用いて、全細胞核の７３％が 蛍光ハイブリダイゼーションシグナルを示した。ＦＩＴＣハイブリダイゼーショ ンシグナルは、４８８　ｎｓアルゴンイオンレーザ−走査モードのＺｅｉｓｓ　 ＬＳＭを用いて可視化された。このＦＩＴＣハイブリダイゼーションシグナルを 、その位置を同定するために染色体の位相イメージ上に二重に焼き付けた（図１ ２）。ＦＩＴＣプローブシグナルは、予期されたように、セントロメアに位置し ていることに留意。

ＲｅｃＡが介在した蛍光インサイチュ−ハイブリダイゼーションはまた、唯一の 遺伝子配列の検出を容易にする。ｐ５３遺伝子（０ｎｅｏｒ）に特異的なＲｅｃ Ａコートされたビオチン化されたプローブを、ネイティブな蛍光インサイチュ− ハイブリダイゼーション反応を用いて懸濁液中で、固定された細胞と反応させた （実施例７）。ＦＩＴＣプローブシグナルを４８８　ｎｔａアルゴンイオンレー ザ−走査モードのＺｅｉｓｓ　ＬＳＭで観察した。シグナルは、任意のシグナル 増幅（即ち、余分のシグナル増幅工程）なしに明瞭であった。この分析の結果は 図１３にある二重１３Ａ。

１３Ｃおよびｌ　３　Ｅ、　ＦＩＴＣ／＼イブリダイゼーシ茸ンシグナル；図１ ３Ｂ、１３Ｄおよび１３Ｆ、それぞれ１３Ａ、１３ｃ。

および１３Ｅにおける細胞の位相イメージ；図１３Ａから１３　Ｄ、　ＨＥｐ− ２細胞；および図１３Ｅおよび１３　Ｆ、　ＨＣＣ″Ａｌｅｘａｎｄｅｒ“細胞 。図１３ＥにおけるＦＩＴＣ／＼イブリダイゼーシ嘗ンシグナルは、図１３Ｆに おける細胞の位相イメージ上に二重に焼き付けられている。全てのハイブリダイ ゼーションシグナルが、細胞核内にあり、モしてＦＩＴＣ信号が、しばしば、新 規に複製されたＤＮＡを示すペアとして見られることに留意。図１３Ｄ中の細胞 核は、分裂のプロセスにあるように見える。これらの結果は、溶液ハイブリダイ ゼーション反応で唯一の配列を検出する本発明の方法の感度を顕示する。

溶液ハイブリダイゼーション反応における唯一の配列の検出に加えて、本発明の 方法はまた、スライドガラス上の固定された細胞を用いる唯一遺伝子配列の検出 に有効である。ＲｅｃＡコートされたビオチン化されたｐ５３プローブ（０ｎｃ ｏｒ）を、ネイティブ蛍光インサイチューハイブリダイゼーシヲン反応を用いて スライドガラス上の固定されたＨＣＣ細胞と反応させた（実施例８）。この反応 は、トポイソメラーゼＩＩを含み、そしてブロー、ブ添加前に緩衝液中でインキ ュベートしなかった（実施例８）。Ｆ　ＩＴＣプローブシグナルを４８８−ｎａ ＋レーザー走査モードのＺｅｉｓｓ　ＬＳＭで観察した。ハイブリダイゼーショ ンシグナルは、任意のシグナル増幅（即ち、余分のシグナル増幅工程）なしに明 瞭であった。試料の結果は図１４にある。図１４において：１４Ａおよび１４　 Ｃ，ＦＩＴＣシグナル；　１４Ｂおよび１４Ｄ、それぞれ１４Ａおよび１４Ｃで 見られる細胞の位相イメージ。全てのハイブリダイゼーションシグナルが核内に ありそしてシグナルがしばしばペアとして見られることに留意。示された液中の シグナルペアの位置は、例えば、１４Ａおよび１４Ｂにおいて、この核では、シ グナルがＤＮＡ複製後のステージを示し得ることを示している。これらの結果は 、ハイブリダイゼーション反応で固定された細胞を用いて唯一配列を検出する本 発明の方法の感度を示す。

唯一の細胞遺伝子配列の検出に用いられるべき本発明の方法の能力に加えて、こ の方法はまた、唯一のウィルス核酸配列の検出に使用され得る。ＲｅｃＡコート されたＩＩＢＶ　ＤＮＡプローブｐＡＭ６およびＢＩＯＰＲＯＢＥ“を、懸濁液 中で、ネイティブ蛍光インサイチュ−ハイブリダイゼーション反応を用いて、１ ００％メタノール固定された細胞と反応させた（実施例９）。これらの実験で用 いられた両プローブは、ヒトＩ（ＣＣ細胞中のＩＩＢＶ配列を高効率で検出した （”ＢＩＯＰＲＯＢＢ”、８１％；　ｐＡＭ６．９５％）。ＦＩＴＣハイブリダ イゼーションシグナルをレーザー走査モードの２ｅｉｓｓ　ＬＳＭで観察した。

図１５で、観察された）ＩＢＶプローブからのＦＩＴＣシグナルを、細胞の位相 イメージ上に二重に焼き付けて示す＝　１５Ａおよび１５Ｂ１”ＢＩＯＰＲＯＢ Ｅ−；　１５　Ｃ−１５Ｅ。

ｐＡＭ６ブローブ。全てのシグナルが、核領域内にあるように見えることに留意 。両ＤＮＡプローブは、各ＨＣＣ細胞核において複数のＦＩＴＣハイブリダイゼ ーシコンシグナルを生じた。“ＢＩＯＰＲＯＢＥ”シグナルは、ｐＡＭ６シグナ ルより強くないように見える。

これは、使用されたプローブのサイズに起因するらしい。溶液中の、−末鎖ブロ ーブと直鎖状二重鎖標的ＤＮＡとの間の、ＲｅｃＡで促進されたベアリング反応 は、プローブ鎖サイズの増加と共に効率が増加するニー末鎖”ＢＩＯＰＲＯＢＥ ”鎖は、平均＜　２５０ｂＳで、そしてｐＡＭ６−末鎖は、平均３０Ｇ−５００ 塩基のサイズである。

この差異はまた、プローブが、異なる血清型のＨＢＶゲノムじＢＩＯＰＩｊＯＢ Ｅ−１ａｄｒ−４；　ｐＡＭ６、ａｄｗ）を含む事実によるためであり得る。こ れらの結果は、本発明による方法は、ウィルスＤＮＡ配列の検出に有用であるこ とを示す。目的の任意のウィルスＤＮＡ標的に特異的なプローブを生成し、Ｒｅ ｃＡ−タンパク質でコートされ得、そして本発明のインサイチューハイブヮダイ ゼー／ヨン法において使用し得る。蛍光検出に加えて、多（の他の検出法を使用 し得、制限されないが、以下を包含する：化学ルミネセンス（Ｔｒｏｐｉｘ　Ｉ ｎｃ、、　Ｂｅｄｆｏｒｄ　ＭＡ）および放射能。

本発明の方法はまた、標的検出の良好な特異性を有する。

本発明の方法の特異性は、以下のように検査された。３０ｎｇのＲｅｃＡコート された一本鎖ビオチン化されたＨＢＶプローブ（ｐＡＭ６）を、標準のネイティ ブの懸濁液中の蛍光インサイチューハイブリダイゼーションブロトコールを用い て、ＡＴＣＣＨＣＣ″Ａｌｅｘａｎｄｅｒ”細胞と反応させた〈実施例１０）。

）ＩＢＶ標的に対する反応シグナルの特異性は、２４０ｎｇの過剰のＲｅｅＡコ ートされた一本鎖のビオチン化されていない相同ＤＮＡ。

または、２４０ｎｇの非相同の競合剤ＤＮＡのいずれかを添加することにより試 験した（実施例１０）。ビオチン化されたＨＢＶプローブおよびビオチン化され ていないＨＢＹおよびφｘ１７４競合剤ＤＮＡを同一条件下でニックトランスレ ートし、それらが類似のライズ（平均４００−５００ｂｓ）であることを確実に した。非ラベルのヒト胎盤ＤＮＡ　（１００−１２０ｂｐフラグメント）を、０ ｎｃｏｒから入手した（−ＢＬＯ（ＪＩＴ　ＤＮＡ“）。結果（表１；実施例１ ０）は、非相同のＤＮＡでない、相同ＨＢＶ　ＤＮＡのみが、ビオチン化された ＨＢＶｌ）ＮＡプローブングナルと特異的に競合することを示す。

よび解像度を非常に増強することを顕示する。大部分の遺伝表１に記載された競 合実験からの代表的な細胞を図１６に示す。図において＝　１６Ａ、ビオチン化 されたＩ（ＢＶプローブ＋過剰の非ラベルのＨＢＩ／　ＤＮＡ；　ｌ　６　Ｂ、 ビオチン化されたＨＯＷプローブ＋過剰の非ラベルのφＸ１７４　ＤＮＡ１そし て１６ｃ１　ビオチン化されたＩ（ＢＹプローブ＋過剰の非ラベルのヒト胎盤Ｄ ＮＡ。

Ｆ　ＩＴＣプローブシグナルをレーザー走査モードのＺｅｉｓｓ　ＬＳＭで観察 した。ＨＢＶプローブからの観察されたＦＩＴＣシグナルを、細胞の位相イメー ジ上に二重に焼き付けて示す。シグナルおよび細胞イメージから、相同ＨＢＶ　 ＤＮＡが、特異的に、ビオチン化された［ｌＢＹ　ＤＮＡプローブシグナルと競 合するが、非相同ＤＮＡは競合しないことが明かであることに留意のこと。それ 故、ＲｅｃＡ促進されたネイティブの蛍光インサイチューハイブリダイゼーシコ ン反応が、ラベルされたプローブＤＮＡに相同である特異的核酸標的を検出する 。

前記から、本発明の種々の目的および特徴がどのように満たされか認識し得る。

本発明は、生物構造において標的配列を局在化するための単純化されたそしてよ り短時間の手法を提供する。この方法は、熱変性工程の必要がないことにより、 シグナル増強の必要を減じることによりアーチファクトを減じ、そして、低コピ ー数の標的配列を含む、標的配列のより早いそしてより明瞭な検出を可能にする 。

特に、この方法は、最初に配列を増幅する必要なしに、低コピー配列の検出を可 能にする。図２Ａおよび２Ｂの比較は、この特徴が、先行技術アプローチに比べ 、本方法の特異性おＩｌ、■ 子マツピングおよび染色体研究が、特定の低コピー配列を含むと予想されるので 、本発明の方法が、診断遺伝子マツピング研究、および唯一のまたは低コピー数 の種々の病原体配列を含む診断用途に重要な利点を提供する。これらの後者の使 用は、以下のセクションＩＩに記載される。

さらに、本明細書に記載された方法は、溶液中およびスライドガラス上で行われ るハイブリダイゼーション反応で、（ｉ）唯一、即ち、単一コピー、遺伝子配列 、および（ｉｆ）唯一または慢数のウィルス核酸配列の検出に有効である。

本出願と同日に出願され、共に所有された、特許出願”ダブルＤ−ループ形成の 診断応用”で開示されたように、二重鎖ＤＮＡフラグメントから調製された安定 なＲｅｃＡコートされたプローブは、標的二重鎖ＤＮＡとのダブル−プローブハ イブリッド構造を形成し得る。そのようなタブループローブ構造が、インサイチ ュ−ハイブリダイゼーション条件下でのプローブ結合に関しては示されていない が、そのような構造の存在は、もし形成されれば、インサイチュ−標的部位で生 成されたシグナルの量を効果的に２倍にするために利用され得る。さらに、この 二つのプローブが異なるレポーター基、例えば、異なる吸収または放射ピークを 有する蛍光プローブでラベルされ得、その結果、両方のプローブを含む標的部位 が、一つのプローブのみを含む部位から区別し得る。

本発明の一つの一般的な応用は、染色体中、および／または染色体の特定領域中 の選択された遺伝子または調節配列を位置づけおよび可視化する診断的使用であ る。標的遺伝子または配列は、（ａ）選択された遺伝子産物を生成する、（ｂ） リポソーム、癌遺伝子、または腫瘍サプレッサー遺伝子などの機能のような重要 な細胞コントロール機能を行うと考えられる、（ｃ）反復配列に関係する、（ｄ ）活性な遺伝子産物の発現を妨害する遺伝子欠陥を含むと考えられる、（ｅ）染 色体位置において、既知のマツプ位置を持つマーカープローブ領域に関係する、 および／または（ｆ）固定されたクロマチンまたは固定されたピリオン中のＤＮ Ａ−肝炎ウィルス（例えば、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＹ＞　（Ｏｎｏら；Ｆｕ　 ｊｉｙａｍａら；Ｇａ１ｉｂｅｒｔら））のような、組み込まれたまたは組み込 まれていないウィルス配列を示し得る、遺伝子または配列であり得る。

この方法で使用された診断プローブは、特定の場合では、ヒトゲノムライブラリ ーのようなところから人手できるプラスミド、コスミド、ウィルスまたは他のベ クターから得られるか、または化学的に合成される。遺伝子産物が利用できる場 合、プローブを、ＰＣＲ増幅のためのプローブを生成するのに十分なタンパク質 産物のシーフェンシング、および、ゲノムＤＮＡ中の対応する遺伝子配列の、Ｐ ＣＲＣオフオーマット中ローブを用いる増幅およびタグ付けにより生成し得る。

増幅された遺伝子物質は、電気泳動により精製し得、そしてプローブとして直接 使用し得、または標準プロトコールを用いて適切なベクター中にクローンされ得 る。

代表的な方法では、核は、周知の方法を用いて分裂中期のステージにある細胞に 由来し、次いで、固定されそしてスライドガラス上に「滴下され」分裂中期染色 体拡散物を生成する。あるいは、調査中の染色体物質は、単離された個々の染色 体の拡散物であり得る。

図４Ａは、単一の分裂中期第１０染色体を示し、それは単離された形態または体 細胞染色体の完全なセットを含む視野の一部であり得る。染色体は、染色体上の マツプ位置が知られている、既知のマーカー領域１２（遺伝子位置Ｍ）を含み、 そして目的の遺伝子領域を含むと考えられる。スライドガラス上の染色体調製物 は、図４Ａ中１４で示された、プローブ複合体と反応し、そして１８で円によっ て示された、ＲｅｃＡタン、４り質でコートされたプローブ１６から成り、そし て２６で縦のダ・ノシュで示されたビオチン基を有する。本発明による、プロー ブ複合体と染色体物質との反応は、目的の標的領域である遺伝子部位Ｓ（図４Ｂ ）へのプローブの相同結合に導く。

結合部位Ｓは、種々の方法により部位局在化のために可視化され得る。図４Ｃで 図示された方法では、既知の領域１２（遺伝子部位Ｍ）に相同なプローブ２４か らなりそしてまたビオチン基２６を含む第２のプローブ複合体２２を、染色体調 製物に添加し、そして相同のその領域に結合させる。未結合プローブを除去する ために洗浄した後〈　この調製物をＦ　ＩＴＣアビジンレポーター２８と反応し 、蛍光タグで染色体上の両方の部位をラベルする。

蛍光顕微鏡使用により観察するとき、図４ｃ中３０で示された、二つの蛍光ポイ ントを有する、図４０で示されたような視野が見られ、染色体上で、マーカーと 試験配列との間の距離のめやすを提供する。

図４Ｄで示された、別の可視化方法では、染色体を、３２で示された、一種また は一種以上の特定の蛍光色素でラベルし、それは、分裂中期染色体中で特徴的な 染色パターンを与える（Ｋｏｒｅｎｂｅｒｇ、　Ｌａｗｒｅｎｃｅ、１９９０） 。染色体はまた、バンド染色蛍光分子の蛍光励起波長と異なる蛍光励起波長を有 する蛍光ラベルを含むアビジンレポーター３４でラベルされる。蛍光顕微鏡を用 い、図４Ｄ中の３６で示されたように、染色体を一種の波長で可視化し、そして 染色体部位上のプローブの位置を、第２の励起波長で可視化する。一種の相同体 との反応を示す（４Ｄ）けれども、全ての相同配列がプローブと反応し得る。

本発明はまた、種々の染色体異常を検出する、改良された方法を提供する。

図５−１Ｏは、この方法がどのように種々のタイプの染色体異常の検出に適用さ れ得るのかを図示する。図５、フレームＡは、染色体アームの一つ上にある２種 類の連鎖したマーカー領域４２および４４を含む正常染色体４０ａを示す。染色 体上の二つの領域は、本発明により、個々のプローブ複合体とハイブリダイズし 、次いで、異なる蛍光タグでラベルされる。例えば、一つの領域は、一つのプロ ーブ複合体上のビオチン基に対して特異的なアビジンに結合した蛍光レポーター で、そして第２の領域は、第二のプローブ複合体上のジゴキシゲニン基に対して 特異的な抗ジゴ牛シゲニン抗体を持つ第２の蛍光レポーターでラベルされ得る。

第１および第２の蛍光レポーターは、図５および関連する図６−１Ｏで、それぞ れ白丸および黒丸で示される。

二つの領域が、適切な励起波長で、蛍光顕微鏡使用で検査されるとき、この二つ の領域は、二つの区別し得る蛍光スポット（フレームＢで白丸および黒丸で示さ れる）により局在化される。この二つのスポ、トは、正常染色体中の二つの遺伝 子領域間の相対的な配向および距離を示す。

図６は、フレームＡで、染色体４０ｂを図示し、それは、染色体領域４４の欠失 により染色体４０ａと異なる。フレームＢにおいて、領域４２のみに対応する励 起波長で単一の蛍光スポットとして変異が見られる。

図７は、フレームＡで染色体４０Ｃを示し、それは染色体中で領域４２と４４の あいだの挿入によって染色体４０ａと異なる。この挿入は、フレームＢで見られ る蛍光顕微鏡視野で、図５の距離について二つの蛍光スポットの間のより大きい 距離によって証明される。

図８は、フレームＡで染色体４０ｄを図示し、それは領域４４の二重化によって 染色体４０ａと異なる。この二重化は、フレームＢで、示されたように、領域４ ４プローブの励起波長でダブレットとして観察される。

図９は、フレームＡで、染色体４０ｅを示し、それは領域４４を含むセグメント が第２の染色体４８ｅに転座したことで、染色体４０ａと異なる。この転座は、 フレームＢで、広くスペースされた蛍光スポットにより証明される。染色体４８ ｅの正体は、上記のように、染色体を、特徴的な分裂中期バンディングパターン を形成する色素で染色することにより（または染色体４８マーカーハイブリダイ ゼーシヨンを用い）、上記のように決定し得る。

図１０は、フレームＡで染色体４０ｆを示し、それは、領域４２．４４を有する セグメントが反転したことにより染色体４０ａと異なる。この反転は、フレーム Ｂで、二つの蛍光スポットの位置の逆転により証明される。

（以下余白） 図１２は、ネイティブのＲｅｃＡが介在した蛍光インサイチューハイブリダイゼ ーションを用いる分裂中期染色体における特定染色体ＤＮＡ配列を検出する本発 明の方法の能力を示す。これらのデータは、スライドガラス上のネイティブ蛍光 インサイチューハイブリダイゼーシヲンに対し、本発明の方法の使用を支持する 。実施例６は、図１２で示された分裂中期染色体蛍光インサイチニーハイブリダ イゼーションシグナルを生成するのに使用される工程を記載し、以下を含む：第 １染色体アルファサテライトプローブ、および、６０°Ｃで酢酸緩衝液で前処理 された）ＩＥｐ−２細胞の調製。図１２では、予想されたように、ＦＩＴＣハイ ブリダイゼーシ甘ンンせナルがセントロメアに位置している。これらのデータは 、ネイティブのＲｅｃＡが介在した蛍光インサイチｓ　”イブリダイゼーション 技法が、固定された染色体またはクロマチン中の非変性ＤＮＡ上で配列および遺 伝子位置を可視化するのに使用され得ることを支持する。

図１３および１４は、腫瘍サブレ・ソサー遺伝子配列のＲｅｅＡが介在したネイ ティブ蛍光インサイチュ−／−イブリダイゼーンコン検出の能力を示す。ネイテ ィブのＲｅｃＡが介在した蛍光インサイチニーノーイブリダイゼーション技法は 、懸濁液中（図１３Ａから１３Ｆ）およびスライドガラス上（図１４Ａカ）ら１ ４Ｄ）の固定された細胞中の唯一の単一コピー遺伝子配列を任意のシグナル増幅 工程なしに、検出および可視化するのに使用され得る。これらの結果は、ＡＴＣ ＣＩＩＥｐ−２およびＨＣＣ”Ａｌｅｘａｎｄｅｒ”細胞（実施例７および８） 中の第１７染色体上の唯一のｐ５３配列の検出を示す。

図１５は、懸濁液中のＡＴＣＣＨＣＣ″Ａｌｅｘａｎｄｅｒ−細胞中のＨＢＶ核 酸配列を検出する、ＲｅｃＡが介在するネイティブの蛍光インサイチュ−ハイブ リダイゼーション検出の能力を示す。図１５（実施例９）は、二種類の異なる、 ビオチン化されたＨｆ１Ｖプローブ、”ＢＩＯＰＲＯＢＥ”（図１５Ａから１５ Ｂ）およびｐＡＭ６　（図１５０から１５Ｅ）を用いて得られたハイブリダイゼ ーションシグナルを示す。ウィルス標的が、［ｌＢＶ核酸配列を含むことが知ら れるＡＴＣＣＨＣＣ″Ａｌｅｘａｎｄｅｒ“細胞中で検出され、細胞懸濁液中で ネイティブ蛍光インサイチュ−ハイブリダイゼーション技法を用いてプローブさ れた。ＨＢＶ核酸配列で感染されず、そして同一プローブおよび技法でプローブ された、＋１ｅｐ−２細胞は、任意のハイブリダイゼーションシグナルを示さな かった。これらの結果は、ＨＢＶ感染されたヒト肝臓細胞中で、診断学的に重要 なウィルス標的配列を検出するために本発明の方法の使用を支持する。

図１６は、ネイティブ蛍光インサイチューノλイブリダイゼーションを用いるＨ ＢＶ標的検出の特異性を示す。このネイティブ蛍光インサイチューハイプリダイ ゼーシロンアノセイは、プローブＤＮＡに相同な核酸標的を、特異的に同定する （図１６および表１）。このことは、ビオチン化されたｐＡＭ６ＨＢＶ　ＤＮＡ ブローブハイプリダイゼーションングナルが、反応が過剰の非）目同非ラベルφ Ｘ１７４ＤＮＡ　（図１６Ｂ）または過剰のヒト胎盤ＤＮ＾（図１６０）を含む ときでなく、反応が過剰の相同非ラベルｐＡＭ６　ＤＮＡを含むとき（図１６Ａ ）、特異的に競合されることを示すことにより顕示された。これらの競合実験の 結果は、ネイティブのＲｅｃＡが介在した蛍光インサイチニーノ＼イブリダイゼ −／ヨンシグナルが、例えば、懸濁液中でＨＢＶプローブＤＮＡおよびＨＣＣ細 胞を用いた場合、ＨＢＶ特異的であることを示す。

一般的に、本発明の、ＲｅｃＡが介在した蛍光イン号イチニーハイブリダイゼー ション反応は、ＲｅｃＡタンパク質、コファクター、および１−２時間のインキ ュベーション時間を使用する。平均サイズ１００−２００．２００−４００．３ ００−５００．４００−６００、そしてそれ以上のサイズを含む、しかし、これ らに限定されず、広いサイズ範囲の一末鎖ブローブが作用する。代表的には、約 １００−２００以上のサイズ範囲が好適であり、そして３ｏｏ−５ｏｏが最も適 している。ＲｅｃＡタンパク質でコートされたプローブは、将来の使用のために フリーザー中に保存され得る＝７日までの間保存されたプローブが試験され、そ して良好なノ〜イブリダイゼーンヨンングナルを与えた。

上記の競合実験は、ＲｅｃＡが介在したネイティブ蛍光インサイチュ−ハイブリ ダイゼーションが、相同核酸配列の検出（こ特異的であることを示した。）＼イ ブリダイゼーンジン反応１ま、単一コピー遺伝子および配列（例えば、ｐ５３） 、多重コピー配列（例えば、アルファサテライト第１染色体）、そして診断学的 に重要なウィルス標的配列（例えば、ＨＢＶ）を検出し得る。

ネイティブのＲｅｃＡタンパク質を用いる蛍光インサイチニーノ＼ィブリダイゼ ーション反応は一般に、標準の変性インサイチュ−ハイブリダイゼーションアッ セイより迅速である。本発明を支持において実行される実験は、ハイブリダイゼ ーション後の１．７５　ｘ　ＳＳＣ中の洗浄が、シグナルを改善し、そしてバッ クグラウンドを減少させることを示した。

ネイティブのＲｅｅＡが介在した蛍光インサイチュ−ハイブリダイゼーションの ための本発明のいくつかの特徴は、以下を含む：ネイティブのＲｅｃＡが介在し た蛍光インサイチューハイプリダイゼーンヲンは、懸濁液中のＩＸＰＢＳ洗浄さ れた、１００％メタノール固定された（または７０％エタノール固定された）細 胞に使用し得る；シグナルは、二時間またはそれ以下のプローブとのインキュベ ーションで得られ得る；この反応は効率的テする−　例えば、Ｓｏｎｇプローブ および標準条件を用いて、反応は、使用されたプローブの濃度に依存して、平均 して６５−９０％の間の細胞がシグナルを有する；反応は、５０ｎｇプローブよ り以下で実行でき−プローブの濃度は、Ｌｏｎｇを超えるのが好適である。　Ａ ＴＰγＳ、　ＧＴＰγＳ、　ＡＴＰ、　ｄＡＴＰ、およびＡＴＰ７ＳとＡＤＰと の組み合せを含む多くのコファクターがこれらの反応で作用する一−一つの実施 態様ではＡＴＰγＳを約０．２４から約２．４■Ｍの範囲の濃度で使用しく好適 な実施態様は、約０．２４から０．４８ｍＭの範囲を含む）　；　１：１、ｔ　 ：０．　ａ、１：２および１：２．５を含む、広範な範囲のＲｅｃＡモノマー： ヌクレオチド比が良く作用しく好適な実施態様は、１：２を利用する）；スライ ドガラス上でＨＥｐ−２細胞との、第１染色体アルファサテライトプローブおよ びネィティブのＲｅｃＡが介在した蛍光インサイチューハイプリダイゼーンヨン で得られたシグナルの量は、標準変性蛍光インサイチュ−ハイブリダイゼーショ ン技法を用いて得られたシグナルに匹敵し；反応は、アクセサリ−タンパク質（ 例えば、−末鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）、）ボイソメラーゼ■およびトポイソ メラーゼＩｆ）の存在下で作用し；そして反応がスライドガラス上で固定された 試料に対して実施されるとき、ＲｅｃＡコートされたプローブミックスを添加す る前に、３０−４５分間、５５−６０°Ｃで、ｐＨ７，５の１０＋＊Ｍ）リス− 酢酸緩衝液中でスライドガラスをインキュベートすることにより、５−２０％か ら５５−８０％の平均節回で反応効率が改善される。この温度は、細胞内核酸の 変性温度未満である。

この方法の上記の応用が、それらが、単一または小コピー数の標的配列へのプロ ーブ結合を含む範囲まで、本発明の方法により研究するのが唯−適していること が認識され得る。

本発明の方法の別の一般的な応用は、診断用途、代表的には、感染された生物、 器官、組織または細胞において、染色体の倍数性または再配列、もしくは、ウィ ルスまたは細菌または寄生病原体の存在を検出することである。この応用は、特 定して上記で論議され、そして一般的に、細胞５０のような、ウィルス感染され た細胞の検出する図１１Ａ−１１Ｃに図示される。細胞に含まれるピリオン粒子 （または組み込まれたウィルスゲノム）が５４で示される。細胞、例えば、血液 細胞が、試験対象から得られ、そして上記で論議されたように処理され細胞構造 の透過性を高める。透過性が高まった細胞に（図１１Ａ）、ウィルスに特異的な １）ＩＩＩＡプローブ複合体５６を添加し、ウィルス二重鎖核酸に対するＤＮＡ １合体の配列特異的結合をさせ、次いで、ウィルス−複合体ラベリング（図１１ Ｂ）のために蛍光マーカー分子５８を添加する。プローブシグナルは、もし必要 ならば、上記のようにレポーター試薬の増幅により、たとえば、ビオチン化され た抗アビジン抗体、ついで第２の蛍光ラベルされたアビジンレポーター分子によ って増幅され得る。

ラベルされた細胞は、蛍光顕微鏡使用により検査され得、細胞中で、感染ウィル ス核酸を検出および局在化する。あるいは、細胞感染、および感染された細胞の パーセントは、図１１ｃに図示されたように、蛍光活性化細胞ソーティング（Ｆ ＡＣ３）により測定され得る。この図は、細胞６０．６２のような血液細胞のグ ループを示し、それらは、検出器６６を備えたＦＡＣ３装置中の手中ピラリーチ ューブ６４を通過し、検出器領域を通過する個々の細胞中の蛍光が検出される。

蛍光ラベルされた細胞は、図において暗い影で示される。この方法は、診断目的 のために、感染された細胞の迅速検出を提供し、感染のレベルおよび感染された 細胞のパーセンテージを測定し得ることがわかる。それ故、例えば、この方法は 、治療期間に渡って、細胞感染の減少を測定することにより、抗ウイルス治療の 進行を評価するのに使用され得る。

ＦＡＣＳ装置は、さらに、蛍光ラベルされた細胞を捕捉するために、ソーティン グ装置を装着し得、感染された細胞の濃縮物を形成する。濃縮物は、順々に、ウ ィルスゲノムを同定しそしてクローニングする目的に、ウィルス核酸配列の供給 源として使用され得る。

以下の実施例は、本発明を説明する意図であり、しかし本発明を限定せず、本発 明の特定の方法および応用を説明する。

実１」レー ＲｅｃＡ　ンパク　の ＲｅｃＡおよびＲｅｃＡ８０３タンパク質を、過剰生産株ＪＣ１２７７２および ＪＣ１５３６９（Ａ、Ｊ、　Ｃ１ａｒｋおよびＭ、　Ｍａｄｉｒａｊｕから得た ）から単離し、またはＲｅｃＡは、Ｐｈａｒｍａｃｉａから購入した。

ＲｅｃＡおよびＲｅｃＡ８０３タンパク質は、辷ドロキシルアパタイトカラム（ Ｂｉｏｒａｄから粉末として得た）高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Ｆ ＰＬＣ）、次いでアニオン（”ＭＯＮＯＱ”、　Ｐｈａｒｍａｃｆａ）交換カラ ムを含む公開された手法（Ｓｈｉｂａｔａ、　Ｇｒｌｒｆｉｔｈ）の改変によっ て精製された。

タンパク質精製は、以下のようにモニターされた：（［）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによ る３１１．０００ダルトンＲｅｃＡタンパク質の同定（”　ＰｆｔＡＳＴＧＥＬ −システム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、　Ｐｉｓｅａｔａｗａｙ　ＮＪ）　：（ｉｆ ）　［７−３２Ｐ］　ＡＴＰおよび一本鎖ＤＮＡ　（５ｈｉｂａｔａ）を用いる 、ＲｅｅＡ　５ｓＤＮＡ依存性ＡＴＰアーゼ活性のアッセイ。この反応の生成物 を、ＰＥＩセルロース薄層クロマトグラフィー（ＥＭ　５ｃｉｅｎｃｅ。

ＮＪ）を用いて分離した：このＰＥＩプレートは、０．５ＭＬｉＣｌおよび０． ２５Ｍギ酸の溶媒中で展開した。生成物を、オートラジオグラフィーで検出した 。

（ｉｉｉ）ＤＮアーゼ活性のアッセイ。ＤＮアーゼ活性は、ＲｅｃＡ９ンパク質 試料を、ＲｅｃＡ鎖転移緩衝液（Ｃｈａｎｇ）中で、線状化されたφＸ１７４お よびスーパーコイル状の環状二本鎖ＲＦおよび環状一本鎖ＤＮＡの混合物と、３ ７℃で１時間インキュベートすることによりモニターした。ＤＮＡのニラキング および消化は、除タンパク質化の後、アガロースゲル電気泳動後のエチジウムブ ロマイドを用いた可視化により、そしてＲｅｃＡとインキュベートした試料中の 各ＤＮＡタイプの量をＲｅｃＡなし緩衝液中でインキュベートしたそれと比較す ることによりモニターした。検出可能なりＮアーゼ活性を示さないＲｅｃＡタン パク質試料のみを用いた。

（ｉｖ）Ｃｈｅｎｇから改変された方法を用いる、５ｏｏマーオリゴヌクレオチ ドプローブを用いるＤ−ループ活性のアッセイ。

最終の°ＭＯＮＯ−Ｑ”−精製されたＲｅｃＡおよびＲｅｃＡ８０３タンパク質 の銀染色されたＳＤＳポリアクリルアミドゲルプロフィールは、本實的に他の細 胞ポリペプチドのない、各調製物がら単一の３８、０００ダルトンのバンドを示 した。

支施五１ プローブ　ム　の ビオチン化されたＸ染色体アルファサテライトＤＮＡプローブを０ＮＣＯＲ（Ｇ ａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＤ）から得た。

滅菌ＭｉｌｌｉＱ　（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）　Ｈ２Ｏ中で希釈されたプローブを 、１００°Ｃヒートブロック溶液中の０．５■ｌ微量遠心分離チューブ中で、５ 分間変性し、そしてこのチューブを直ちに氷水浴中に置いた。ハイブリダイゼー シコン混合物に、変性されたプローブを添加する約５分前に、プローブを含むチ ューブを、−２０″Ｃのフリーザー中の氷の中に置いた。このブローブハイブリ ダイゼーシコン混合物は、以下の成分を広い濃度範囲で含みリストされた順で組 み合わさせる２１μｍのＩＯＸ　ＲｅｃＡ反応緩衝液［１０ＸＲｅｃＡ反応緩衝 液：１００ｍＭ）リス−酢酸３７°ＣでｐＨ１，５，２０ｍＭ酢酸マグネシウム 、５００ｍＭ酢酸ナトリウム、１０■ＭＤＴＴおよび５０％グリセロール（ｃｈ ｅｎｇ））　；　１６．２ｍＭ保存液からの１．５μ１ＡＴＰ７　Ｓ（３，２４ および１．．６７、ｍＭ保存液もまた使用し得る）、　（Ｐｈａｒ＋ｍａｃｉａ ）　（ｒＡＴＰｌｄＡＴＰ、　ＧＴＰ　７　Ｓ、　またはＡＴＰ７ＳおよびＡＤ Ｐの組み合せが、特定の反応で使用し得る）　、　０．７５μｌの２０ｍＭ酢酸 マグネシウム；　４４−６０ｎ　（または特定の反応ではそれ以上）の殺菌ｄｄ Ｈ２０またはＴＥ　（２０ｍＭ　トリス塩酸、ｐＨ７，５、そして０．１＋！１ Ｍ　ＥＤＴＡ）中の変性されたプローブ；　ＲｅｃＡ　（発明者らの実験室で調 製されたとき添加される正確なμＩ量が保存液の濃度に依存して変わり、Ｐｈａ ｒｍａｃｉａから購入されたときは、１．２５μｍの０．１３７＋ｓＭ保存液） 。この混合物を３７℃でｌＯ分間インキユベートシ、次いで、０５μｌ／２００ １Ｍ酢酸マグネシウム反応液を添加する。反応成分の最終濃度は：　４．ＯｍＭ から１（ｌｆｆ１Ｍのトリス酢酸、２．０＋ｌ１Ｍから１５ｍＭの酢酸マグネシ ウム、２０．０ｍＭから５０ｍＭの酢酸ナトリウム、０．４ｍＭから１．０ｍＭ のＤＴＴ、２％から５％のグリセロール、０．２４ｍＭから２．５＋ａＭのＡＴ Ｐ　７　Ｓ、　０．００５ｍＭから０．０２ｍＭのＲｅｃＡである。

実］ｌ引ｌ Ｘ　プローブとのインサイチュ−ハイプリ　イゼーシＪ−イ Ａ、ＨＥｐ−２細胞核の調製 ＦＩＥｐ−２細胞は、もとはヒト男性咽頭類表皮腫癌腫組織に由来した。ＨＥｐ −２の染色体倍数性は可変性である（Ｃｈｅｎ）。

細胞を、樟準条件下、３７°Ｃで、１０％ＦＢＳ、ピルビン酸ナトリウムおよび ペンストレノプ（Ｐｅｎ５ｔｒｅｐ）抗生物質ミックスを添加したＤＭＥＭ　（ ＊ｈＨｔａｋｅｒまたはＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ）中に接種した後、２４時間培養し た。これらの細胞を、低速遠心分離によりベレット化し、そしてゆっくりと３７ ℃水浴中で、７５ｍＭＫＣｌ中に再懸濁し、そして所望の量の核膨潤を起こすた めに５分から１５分間インキュベートし、次いで、水冷したメタノール：酢酸３ ：１を添加し、そして６℃で遠心分離した。

１ｍｌの液体を、ベレット化された細胞とともにチューブに残し、さらに水冷し たメタノール：酢酸を添加し、そしてチューブを穏やかに混合することにより細 胞を懸濁し、次いで遠心分離した。メタノール：酢酸の繰り返された添加は細胞 質を分解し、そして単離された核は、上記のように繰り返された、メタノール： 酢酸の添加に引き続く混合および遠心分離により得られた。　（ＨＥｐ−２およ び他の細胞タイプは、別の方法で固定化され得、それらのいくつかは、固定され た細胞質構造を分解しない）。

最後に、核調製物は、約２Ｘ　１０６／ｍｌ濃度で３：１メタノール：酢酸中に 再懸濁され、そしてピペットにより１０μｌアリコートで清浄なスライドガラス 上に滴下され一２０℃で保存されたか、または、懸濁された核または細胞調製物 は後の使用のために一２０℃で保存される。

Ｂ、非変性核酸標的−ハイブリダイゼ一シヨン反応実施例２からの１０μｍのプ ローブ混合物／反応物を、スライドガラス上の固定された調製物に適用した。カ バーガラスをハイブリダイゼーション領域の上に置き、そしてラバーセメントで シールし、そして反応物を３７℃ＣＯ２インキニベータ中の湿潤コンテナ内で封 入し１−４時間の間インキュベートした。インキュベーションに続いて、ラバー セメントを取り除き、そしてスライドガラスを、３７°Ｃの水浴中、コブリンジ ャー中で３回、各１０分間２ＸＳＳＣ中（これらアッセイにおいて全てのＳＳＣ を含む調製物中において、２０ｘＳＳＣ：　３Ｍ　ＮａＣ１，０，３Ｍクエン酸 ナトリウム、ｐＨ７，０が用いられる）で洗浄した。他の洗浄条件もまた、使用 し得る。

このスライドガラスを、前ブロツク溶液［４ｘＳＳＣ，０，１％Ｔｒｉｔｏｎ　 、Ｘ−１００，５％Ｃａｒｎａｔｉｏｎ脱脂ドライミルク、２％正常ヤギ血清（ Ｇｉｂｃｏ）　、・０．０２％アジ化ナトリウム、ｐＨ７，０］　中、室温（Ｒ Ｔ）で２５分間置き、次いで、前ブロツク溶液中、５μｇ／ｍｌ　ＦＩＴＣ−ア ビシフ　ＤＣＳ、細胞ソーターグレード（Ｖｅｃｔｏｒ、　Ａ−２０１１）中で 、　ＲＴで２５分間浸漬した。このスライドガラスを、４ｘＳＳＣ。

４ｘｓｓｃおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００、そして４ＸＳＳＣで、Ｒ Ｔで各１０分間洗浄し、次いで、三日蒸留した［２０で簡単にリンスしそして乾 燥した。抗退色剤を適用し［１０ｍ１ＰＢＳ中の１００＋ａｇ　ｐ−フェニレン ジアミンジヒドロクロリド（Ｓｆｇｍａ　Ｐ１５１９）を、０．５Ｍ炭酸−重炭 酸緩衝液（ＮａＯＨでｐＨ９に調整された０、４２ｇ　ＮａＨＣＯ３（１０ｍｌ 　ｄｄＨ２０中））を用いてｐｉ（８に調整し、９０Ｉｌｌのグリセロールに添 加し、０．２２μｍで濾過されたコ、そして抗退色マウティング媒体およびカバ ーガラスを調製物上に置いた。ヨウ化プロピジウムまたはＤＡＰ　＋などのよう なカウンター染色剤を含む抗退色剤が、しばしば、抗退色剤単独の代わりに使用 された。図ＩＡは、上記調製物（シグナル増幅なし）からの細胞核の蛍光顕微鏡 写真を示す。

必要ならば、シグナル増幅は以下のように実施され得るニスライドガラスを４ｘ ＳＳＣおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００中、ＲＴで５−１（１分間洗浄 し、カバーガラスおよび抗退色剤を除去し、次いで、２０分間までの間前ブロッ ク溶液中でインキユベートし、そして３７℃で３０分間前ブロック溶液中で希釈 された５μｌ／ｌｌの濃度で、ピオチン化されたヤギ抗アビジン抗体（Ｖｅｃｔ ｏｒ　ＢＡ−０３００）とインキュベートする。スライドガラスを各１０分間、 ＲＴで４ＸＳＳＣ，４ＸＳＳＣおよび０．１％Ｔｒ４ｔｏｎ　Ｘ−１００，４Ｘ ＳＳＣで洗浄し、次いで、ＲＴで、２０分間前ブロック溶液中でインキュベート し、モしてＲＴで２０分間５μｇ／ｍｌのＦ　ＩＴｃアビジンを含む前ブロツク 溶液中に浸１する。スライドガラスを再び４ｘｓｓｃシリーズ中で洗浄し、簡単 にｄｄＨ２０中でリンスし、そして抗退色剤またはカウンター染色剤を含む抗退 色剤でマウントする。

Ｃ１核酸標的の熱変性によるハイブリダイゼーション。

比較の目的で、核基質の熱変性によるインサイチューハイブリダイゼーションを 平行して行った。変性され、ラベルされたＸ染色体プローブを核に添加し、スラ イドガラス上で０ＮＣＯＲプロトコール下で変性した。非変性方法の場合と同じ 核調製物が使用された。０ＮＣＯＨにより示唆されたシグナル増幅手法をハイブ リダイゼーシコンシグナルを増強するために使用した。その後、スライドガラス を３７℃で一晩維持した。これらの手法および材料は、一般に、０ＮＣＯＲＣｈ ｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｉｎ　５ｊｔｕ　Ｋｔｔ、　Ｃａｔ　Ｎｏ、　５１３７０の それらに従った。

図ＩＢは、上記のシグナル増幅された調製物からの細胞核の蛍光顕微鏡写真を示 す。

支立五エ フ　プローブ七のインサイチュ−バイブ１　イゼーシ第７染色体アルファサテラ イトＤＮＡに対するピオチン化されたＤＮＡプローブを０ＮＣＱＩ？から得た。

プローブは変性されそして少なくとも５週間凍結して保存し得た。１６μＩ（１ ：２、プローブ、Ｈ２Ｏ，２ｎｇ／ｕ　ｌ　ＤＮＡ）中の３２口ｇの変性された 新たに融解されたＤＮＡプローブを、実施例２で与えられたハイブリダイゼーシ ョン混合物の同一量に同一順序で添加した。プローブ混合物の３７℃で１０分間 のインキュベーションに続いて、そして０．５μｌの２００■Ｍ酢酸マグネシウ ムの最終添加で、反応物は全２１μｌを含んでいた。

プローブを、非変性のＨＥｐ−２標的細胞核上で、ＣＯ２インキニベニラ−ター 中℃で２，５時間インキユベートシ（実施例３Ｂ）、次いで、実施例３Ｂ中でＸ 染色体に対するプローブで記載されたのと全く同様にして洗浄、ブロッキング、 およびＦＩＴＣ−アピジンインキユベーシヲンした。実験を行う時間は、スライ ドガラスのエタノールシリーズ処理を含んで、約５時間であった。図２Ａは、処 理された調製物からの細胞核の蛍光顕微鏡写真を示す。

比較のために、上記核は、第７染色体プローブと実施例３ｃ中のように、熱変性 条件下で反応させた。要約すれば、第７染色体アルファサテライトＤＮＡへの５ １ｇの変性されたプローブを、ハイブリダイゼーション緩衝液（図ＩＢ中のよう に、ＨｙｂｒｉｓｏＩ　Ｖ［、０ＮＣＯＲ）と合わせそして０ＮＣＯＲプロトコ ールを用いて変性した。７μｌのプローブ混合物を、ＨＥｐ−２細胞核と１６時 間ハイブリダイズし、そして反応液を、シグナル増幅を含む０ＮＣＯＲプロトコ ールに従って処理した。図２Ｂは、上記処理され、変性された核の蛍光顕微鏡写 真を示す。

支胤且ｉ 懸　゛　のメ　ノール　されたエ　の、　の列玉１１出 Ｘ染色体アルファサテライトＤＮＡに特異的なプローブ、０ｎｅｏｒプローブ保 存液（実施例２で使用された）を希釈しそして１００℃で５分間変性し、直ちに 氷水洛中に置き（約１５分間）そして上記ハイブリダイゼーション混合物に添加 する前−２０”Ｃフリーザーに短時間（約５分間）保存した。このハイブリダイ ゼーション混合物を、次の順で組み合わせた（成分、濃度、および混合物は、実 施例２で詳細に記載される）：１μｌｌ０ＸＲｅｅＡ反応緩衝液（実施例２参照 ）、１．５ｐ　Ｉ　ＡＴＰγＳ　（１６，２ｍＭ保存液、Ｐｈａｒｍａｃｉａ） 、０．７５μｌ酢酸マグネシウム（２０ｓ＋Ｍ保存液）、Ｈ２０中１：２希釈で ６０口ｇを含む１２μｌの変性プローブ（ＯＮＣＯＲ）（２０口ｇまたは６０口 ｇ以上がまた、使用し得る）、ＲｅｃＡ　（０，１３７ｍＭ保存液、Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）。反応液を３７℃水浴中で１０分間インキュベートし、次いで０．５ μｌの２００ｄ酢酸マグネシウムを添加した。

ＨＥｐ−２細胞は、１００％メタノール（または他の適切な溶液）中、−２０℃ で約２．５Ｘ　１０６／ｍｌの濃度で固定された。懸濁された細胞（１，２５Ｘ 　１０’）の約０．５ｍｌを、”ＴＯＭＹ−遠心分離セット中で１．５１微量遠 心管中６℃で遠心分離し、そして再懸濁し次いで２００μｍから１！１１の７０ ％、８５％および１００％水冷ＥＬＯＨ中で遠心分離した。最後の遠心分離およ び１００％ＥｔＯＨ上澄液の除去の後、ペレットをＲＴで、２００−５００μｍ の１　ｘ　１ｅｅＡ反応緩衝液中に再懸濁し、そして０．５＋ａｌ遠心管中に置 き遠心分離した。

完成されたプローブ混合物をペレｙ）と混合し、そしてチューブを３７℃水浴中 に１．５−２．５時装置いた。インキュベーションは、２５０μｌの２ＸＳＳＣ （３７℃に予備加熱）の添加により停止され、次いで遠心分離した。ペレットを ２ＸＳＳＣ（３７℃に予備加熱）中に再懸濁し、そして３７℃で５分間インキュ ベートした。

遠心分離に続いて、上記ペレットをＲＴで２０分間、５００μｌのブロッキング 溶液中に再懸濁し、次いで遠心分離し、そして１゜Ｏμｌのブロッキング溶液中 の１０ｇｇ／ｍｌ　ＦＩＴＣ−アビジン中に、ＲＴで暗所で、２０分間再懸濁し た。このチューブを遠心分離し、そして２５０μｌの４ｘＳＳＣとペレットを混 ぜ、再び遠心分離し、そして０．１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含む２ＳＯｕ 　Ｉの４ＸＳＳＣとペレットを混ぜ、そして再び２５０μｌの４ＸＳＳＣで遠心 分離した。すべては室温で行った。最後の遠心分離後、ペレットを約２０μｌの 抗退色剤と混合した。特異的なシグナルは、懸濁された細胞の約３０％に認めら れた。注記：１００％メタノール固定された全細胞および／または固定された核 、および、異なる洗浄成分の他の濃度を用いる実験は、５０−９０％反応を示し た。

図３Ａの顕微鏡写真は、Ｚｅｉｓｓ　ＬＳＭ−１０顕微鏡で観察されたように、 分裂中の固定化されたＨＥｐ−２細胞核を示し、対称的に位置されたＦＩＴＣラ ベルされたプローブ結合されたセントロメア標的を示す。図３Ｂ下の位相写真は 、顕微鏡写真の焦点を変えずに同一の核を撮影したものである。

大ＪＥ列」− における　の　ＤＮＡＩの 第１染色体アルファーサテライトセントロメア配列（ｐＵｃｌ。

７７：ＤＮＡベクターｐυＣ９中の１．７７塩基対長のヒトＥｃｏＲＩフラグメ ント；　Ｃｏｏｋｅら：　Ｅ＋ｍｅｒｉｃｈら）に対するビオチン化されたプロ ーブを、ｂｉｏ−１４−ｃ！ＡＴＰ　（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、　Ｇａｉｔｈｅｒ ｓｂｕｒｇ　ＭＤ）の存在下、ＢＲＬ　Ｎ１ｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｓ ｙｓｔｅｍを用いて調製した。二、２クトランスレーシヨンは、本質的に、製造 者（ＢＲＬ）によって記載されたように行ったが、以下の改変をした：推奨され た酵素量の二倍の量を添加し、そして反応物は１５℃で１時間４５分間インキュ ベートした。これらのニックトランスレーシラン反応により、平均−末鎖すイズ 約３００−４００ｂｐのプローブを得た。

二、クトランスレートされたプローブを、エタノール中の０．３Ｍ酢酸ナトリウ ム中で沈澱させ、ｉ、ｏｍＭ）リス−塩酸ｐＨ７，５，０，１ｎ＋Ｍ　ＥＤＴＡ 中ニ再懸濁ｔ、、ソｔ、ｒｏＮＡｌｉヲ−ｏＮＡＤＩＰＳＴＩＣＫ−（ｌｎｖｉ ｔｒｏｇｅｎ）で測定した。スライドガラス上にマウントされたメタノール：酢 酸固定されたＨＥｐ−２細胞（大部分が核；実施例３と同様に調製された）を、 ７０．８５、および１００％冷エタノールインキュベーションのシリーズに曝す ことにより脱水した。スライドガラス上の脱水された細胞は、次いで、１０ｍＭ のトリス−酢酸緩衝液ｐＨ７，５中、６０″Ｃで４５分間ブレインキュベートし 、一方ＲｅｃＡコートされた第１染色体アルファサテライトセントロメア配列プ ローブミックスを調製した。

６０°Ｃブレインキュベーション処理は標的ＤＮＡを変性せずに、スライドガラ ス上の固定された細胞上で行われるネイティブのＲｅｃＡが介在した蛍光インサ イチューハイブリダイゼーション反応の効率を改善する（　５−２０％から６０ −８２％の改善された／％イブリダイゼーション）。加温されたスライドガラス を、固定された細胞核調製物に調製されたプローブ混合物を添加する前に、３７ ℃表面上で３７°Ｃまで冷却した。上記細胞をカバーガラスでカバーし、そして 反応物をラバーセメントでシールした。

ＤＮＡプローブを５．１６μｍのｄｄ　Ｉ２０中、１００°Ｃ５分間加熱変性し 、氷水浴中で急冷し、４°Ｃで”ＴＯＭＹ”微量遠心分離機で２０秒間遠心分離 し液体を集め、そして次いで直ちに他の反応成分を含む混合物に添加した。第１ 染色体プローブを、１μｌの１０×酢酸反応緩衝液（Ｃｈｅｎｇら、１９８８） 、１．．５μｍの１６．２ｍＭ　ＡＴＰｙ　Ｓ　（Ｓｉｇｎａ）、０．７５μｌ の２０＋ａＭ　ＭｇＯＡｃ、　０．５９μｌのＲｅｃＡ　（１１，０５Ｍｇ／ｕ 　ｌ）、１μｌのＤＮＡプローブ（Ｓｏｎｇ／μｌ）を含む反応混合物中におい て、ＲｅｃＡタンパク質でコートした。プローブ添加後の反応ミックスの全容量 は１０μｌであった。このプローブ反応ミックスを３７℃で１０分間インキュベ ートし、そして次いで、０．５μｌの０．２Ｍ　ＭｇＯＡｃを添加した。プロー ブミックスを次いで、３７℃でスライドガラス上の上記緩衝液処理された細胞核 に添加した。この反応物をカバーガラスでカバーし、ラバーセメントでシールし 、そして３７°Ｃで２時間湿潤チャンバーでインキュベートした。

プローブとの細胞インキュベートぢン後、ラバーセメントを除去し、そしてスラ イドガラスを３７℃で１．７５Ｘ　ＳＳＣ（ｐＨ７，４）中で３回洗浄した。各 洗浄は１０分行った。このスライドガラスを濾過された前ブロツク溶液（１００ μｍ）中、室温で２０分間、次いで、濾過された前ブロツク溶液中の５μｇ／ａ ｌＦ　ＩＴＣ−アビジン（ｖｅｃｔｏｒ、　ＤＣＳグレード）と暗所で２０分間 室温でインキュベートシた。

スライドガラスを室温で、４ｘＳＳＣで１回、４ｘ　ｓｓｃ＋　ｏ、　１％“Ｔ ＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００”で１回、そして最後に４ＸＳＳＣで１回、洗浄した。

スライドガラスを最後の洗浄の後、簡単にｄｄ）Ｉ２０中に浸し、そして空気乾 燥した。カバーガラスをのせる前に、抗進色剤を添加し７、そして細胞をＺｅｉ ｓｓ　ＬＳＭで観察した。

図１２は、ヒト第１染色体アルファサテライトセントロメア配列に対する、Ｒｃ ｃＡコートされ、ビオチン化され、ニックトランスＬ／−トされたプローブとの 、固定された１（Ｅｐ−２分裂中期染色体からのハイブリダイゼーションングナ ルを示す。これらの条件下、染色体拡散物を含む細胞間期核の７３％がシグナル を示した。第１染色体アルファ号テライトは特異的に第１染色体１セントロメア と）１イブリダイズした。

Ｌ施■ユ Ｌ公ｆ↓」四及色体　サプレッサー　−連へ−ｎ血夏介］シたネイティブパ′イ ンサイチューノ＼イブリダ止１２」船出 Ａ、第１の条件：図１３Ａおよび１３Ｂ０１、２５ＸＩＯ’の１００％メタノー ル固定されたＡＴＣＣＨＥｐ−２（ＡＴＣＣ。

Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　１２ ３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒ、。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ　ＭＤ　２０８５２）細胞を微量遠心分離チューフ゛に置き 、そして７０％、８５％および１００％のエタノールンリーズ処理を行った（Ｌ ａｗｒｅｎｃｅ、　１９８Ｂおよび１９９０　；実施例５）。細胞を固定工程の 間にペレ、）化した。１００％エタノール処理工程の後、細胞を１×酢酸反応緩 衝液洗浄の直前までペレットとして保存した。工程間の全ての細胞遠心分離は、 ３０秒間、２．５にで”ＴＯＭＹ゛微量遠心分離機で行った。

プローブをＲｅｃＡタンパク質とインキュベートしている間、ベレット化された 細胞を１×酢酸反応緩衝液（Ｃｈｅｎｇら、１９８１１）中で洗浄した。この細 胞を再びベレット化し、そしてＲｅｃＡコートされたプローブ反応混合物の添加 前、洗浄緩衝液をできるだけ除去した。

プローブを、３７℃で、１０分間、１μｌの１０×酢酸反応緩衝液、０．７５μ ｌの０．０２Ｍ　ＭｇＯＡｃ、　１．５μｌの１．６２１Ｍ　ＡＴＰ７　Ｓ　（ Ｓｉｇｍａ）、０．５９μＩの１１．０２ｔｔ　ｇ／μＩ　ＲｅｃＡ、熱変性プ ローブ［５μｌのｐ５３プローブ（１０ｎｇ＃ｚｌ；　０ｎｃｏｒ　Ｉｎｃ、、 　Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ　ＭＤ）および１゜Ｘ６μｌ　ｄ１２０３を含む混 合物中、ＲｅｅＡタンパク質でコートした。

洗浄された細胞ベレットにプローブを添加する前、０５μｌの０．２Ｍ　ＭｇＯ Ａｃをプローブ混合物中に添加した。細胞はプローブと混合され、そして３７℃ で３時間５０分間インキュベートした。

インキュベーション後、細胞を１．７５　Ｘ　ＳＳＣｐＨ７，４（２５０μｍ洗 浄）中で３回洗浄し、次いで、室温で２０分間、濾過された前ブロツク溶液中で インキュベートし、ベレット化し、そして前ブロツク溶液を除去した。この工程 の次に、５，０Ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣアビジンを含む濾過された前ブロツク溶液 ５０μｌで２０分間室諷でインキュベートした。細胞を、４ｘ　ＳＳＣ，４ｘ　 ＳＳＣ＋０．１％“ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１００”、４ＸＳＳＣ，すべてｐＨ７， ４、（２５０μｍ／洗浄）で洗浄した。

少量（例えば、約２０μｌ）の抗進色剤を、最終細胞ペレットに添加し、そして 上記細胞の部分をスライドガラス上に置き、カバーガラスをかぶせ、そしてＺｅ ｉｓｓ　ＬＳＭを用いて観察した。

これらの一般的な条件下で、６５％またはそれ以上の細胞が、明るいｐ５３ハイ ブリダイゼーションシグナルを示した（図１３Ａおよび１３Ｂ）。

Ｂ、第２の条件：図１３Ｃおよび１３Ｄ０全ての細胞および細胞洗浄は、実施例 ７Ａと同じである。

プローブを、０．０２ＭのＭｇＯＡｃを省略し、そしてその代わりに０゜７５μ ｌのｄｄＨ２０を添加したことを除いて、上記のようにＲｅｃＡと反応させた。

これらの条件下で４０％の細胞が明るいＩ＼イブリダイゼーシ覆ノンリグナル持 った（図１３Ｃおよび１３Ｄ）。

Ｃ９第３の条件二面１３Ｅおよび１３Ｆ０全ての細胞洗浄は実施例７Ａと同様に 行った。プローブを、プローブコーティング混合物ミックスが１．５μｌの１６ ．２　ｌＩＭ　ＡＴＰγＳを含み、反応物混合物が、０．５μｍの０．２＋ｎＭ 　Ｍｇ０Ａｅの添加前に３７６Ｃで１３分間インキュベートされ、ＲｅｃＡコー トされたプローブが、１．２５ｘ１０６１００％メタ／−ル固定されたＡＴＣＣ ＨＣＣ”Ａｌｅｘａｎｄｅｒ”細胞に添加され、モして３７°Ｃで３時間２０分 間反応させたことを除いて、上記のように（実施例７Ａ）反応させた。

プローブ反応後の細胞洗浄は、細胞が１０．０Ｍｇ／ｍ　ｌのＦＩＴＣ−アビジ ンを含む５０μｍの濾過された前ブロツク溶液と反応させた点を除いて、実施例 ７Ａで記載されたように行った。これらの条件下、８２％の細胞が、明るいハイ ブリダイゼーションシグナルを持った（図１３Ｅおよび１３Ｆ）。

支ｎ外１ スライドガラス　のＨＥ−２の　−の５３°　ｊのＲｅｃＡが　したネイティブ ′インサイチューバイブ１　イ五二乏ニＬ乙塗聞 スライドガラス上のメタノール：酢酸固定されたＡＴＣＣＨＥｐ−２細胞を、Ｒ ｅｃＡコートされたｐ５３　（Ｏｎｃｏｒ）プローブと反応させた。］ＯｉＭの 酢酸緩衝液ｐＦＩ７．４との４５分間のインキュページ璽ンが省略されたことを 除いて、実施例６中に記載されたように、プローブ添加のために上記細胞を洗浄 しそして調製した。

ｐ５３プローブＤＮＡコーティングを、１．５μｍの３．２４　ｌＩＭ　ＡＴＰ ｙ　Ｓ。

０．５９μｍの５．５１Ｍｇ７μｌ　ＲｅｃＡおよび２ＵのトポイソメラーゼＩ Ｉ（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　Ｃｏｒｐ、Ｃ１ ｅｖｅｌａｎｄ　ＯＨ）を含む０．５μｌが添加され、そして変性プローブの半 分が添加された［３．６６μｌ　ｄｄｌ’１２０中の２．５　ｐ　ｌ　（２５Ｍ ｇプローブ）］ことを除いて、実施例６に記載されたように行われた。

ＲｅｃＡタンパク質を用いるプローブコーテイング後、０．５μｌの０．２Ｍ　 ＭｇＯＡｃを添加しそしてプローブミックスをスライドガラス上の核に添加した 。プローブとの反応後の洗浄条件は、実施例６に記載されたようであった。これ らの条件下で、２０％の核が、明るいハイブリダイゼーションシグナルを有した （図１４Ａから１４Ｄ）。この実験におけるハイブリダイゼーションシグナルを 有する開明核の数は、図１２（実施例６）中で観察されたより、少なかったー　 このプロトコールでは、緩衝液インキュベーション工程は含まれていない。

支癒史旦 ７１．　のＡＴＣＣＨＣＣ″Ａｌｅｘａｎｄｅｒ−のＨＢｖｌの　ＲｅｃＡが　 したネイティブ　″インサイチューノ＼イブＩＩダイゼ二Ｚ」二ｄ１山 １×１０′３の１００％メタノール固定されたＨＣＣＣＣ細胞７物応物０．５ｍ ｌの滅菌微量遠心チューブ中に置き、４℃で°ＴＯＭＹ”微量遠心分離機中で２ Ｋ　ｒｐｍで３０秒間遠心分離し、そして上澄液を除去した。２００μｍの水冷 ７０％ＥｔＯＦＩを添加し、処理された細胞を４°Ｃて遠心分離し、上澄液を除 去し、脱水工程を繰り返し、そして試料を上記のように、８５％および１００％ 氷冷ＥｔＯ■を連続的に用いて遠心分離した。

上記細胞を遠心分離し、そして２００μｍの１×酢酸反応緩衝液（グリセロール がないことを除いて、標準ＲｅｃＡ酢酸反応緩衝液と同じ）中に再懸濁し、遠心 分離し、そして同じ１×酢酸反応緩衝液（グリセロールなし）中に再懸濁した。

プローブ反応混合物の添加直前に、上記細胞を３７℃で１０分間インキュベート し、室温で遠心分離し、そして上澄を除去した。

ヒオチンラヘルサしたＨＢＶ特異的なＢＩＯＰＲＯＢＥ−をＥｎｚｏ　Ｄｉａｇ ｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｉｎｃ、（Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　ＮＹ）から入手した。この＝ 　ツクトランスレートされたプローブは、ｂｉｏ−１１−ｄＵＴＰでピオチン化 され、全ゲノム（ａｄｒ４血清型）および平均２５０ｂｐのサイズの二本鎖プロ ーブフラグメントを含有する。

第２のプローブ、ｐＡＭ６をＡＴＣＣ，から得た。ｐＡＭ６は、プラスミドｐＢ Ｒ３２２中に全ＨＢＶゲノム（ａｄｗ血清型）を含む。ｐＡＭ６を、実施例６で 記載されたように、ＢＲＬ　Ｎ１ｃｋ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ を用いるニックトランスレーションにより、ｂｉｏ−１４−ｄＡＴＰ　テラベル した。熱変性された一末鎖プローブは、３００−５００塩基の平均サイズを有し た。

両）ＩＢＶプローブを、ｌμｌの１０ｘ酢酸反応緩衝液（Ｃｈｅｎｇら、１９！ １１１）、１．５μｌの３．２４ｍＭ　ＡＴＰｙ　Ｓ、　０．７５μｌの２０ｍ Ｍ　ＭｇＯＡｃ、　０゜５３μｌの５．５Ｍｇ／μＩ　ＲｅｃＡ、および熱変性 プローブ［５，３９μｍｄｄＨ２０中の０８３μｌ″８１０ＰＲＯＢＥ“（６０ Ｍｇ／μｌ）；１．２２μｍ　ｄｄＨ２０中のＳｕ　ｌ　ｐＡＭ６プローブ（１ ０Ｍｇ／μｍ）］　を含む、ＲｅｃＡタンパク質１０μＩ反応物でコートした。

プローブコーティング反応物を３７°Ｃで１０分間インキュベートし、次いで、 ０．５μｌの０．２Ｍ　Ｍｇ０ＡＣ保存溶液を添加し、そして上記プローブ混合 物を、上記調製された細胞ペレットに添加した。

調製されたプローブ混合物を、個々に分離した細胞試料に添加し、そして３７℃ で水浴中２時間インキュベートした。この反応は、２５０μｌの１．７５ｘ　Ｓ ＳＣ（ｐＨ７，４）を３７℃で添加することにより停止した。各試料を混合し、 細胞をペレット化し、そして上澄を除去した。２５０μｍの１．７５　Ｘ　ＳＳ Ｃを添加し、そして試料を３７°Ｃで５分間インキュベートした。この洗浄を次 いで繰り返した。細胞をペレット化し、そして各試料に、３００μｍの濾過され た前プロ、り溶液を添加した。この試料を、室温Ｔ！２０分間インキュベートし た。上記細胞をべ１ノツト化Ｉ７＋シ、て前ブｒ１ツク溶液を除去Ｉまた。

、ＩＣ′）試料に、濾過された前ブロノノパ溶液中の９０μｌの５１１ｇ／・・ −１］’　ｉ　Ｔ　（″ニー“）″ビジンを添加し、た１、試料を室温で、暗所 ？！、２０分Ｈｉｉインキ、ベー　トｌ、ｒ−ｏＸ料を次いでベレ、・１・化し 、Ｆ：　Ｉ、’ｒ上澄を除去した。各試料に２ＳＯ＃ｌの４ＸＳＳＣを添加し、 試料を）ａやかに混合し、そし、て細胞をペレット化した。上澄を除去し、そし ”７：　２５０　μｍノ４　Ｘ　ＳＳＣ＋　０．１％−Ｔｌ？１ＴＯＮ　Ｘ−１ ００−を添加した。

細胞をペレット化し、上澄を除去し、２５０μｍの４ｘＳＳＣを添加する。細胞 をベレ７）化し、上澄を除去（１、ベレットを風乾し、そして２０μｍの抗進色 剤を添加した。次いで、試料をＺｅｉｓｓＬＳＭを用いて検査した。

図１５Ａおよび１５Ｂは、−ＢＩＯＰＲＯＢＥ−を用いる上記の）１イブリダイ ゼーシヲ：／の結果を示す二８１％の上記細胞が、ノ＼イブリダイゼー７ｇンン グナルを有した。図１５Ｃから１５Ｅは、ｐＡＭ６ブローブを用いる」二ｇ己１ １イブリダイゼー７．ａンの結果を示す：９５％の上記細胞がハイブリグイゼー ／ヨンシグナルを有した。

実長ｆｌ立 ムハイブリダイゼー／＝Ｉンによ　されたヒトＨＣＣ胞−但り＋ｆ６ユ（イｊ二 工２−゛′インサイチヱーハイブリ　イゼーンーＬ乙Ｅ度翌」ユ紅孫負−検追王 ２ＪＪＬユＡ、競合アッセイのためのプローブの調製。

ビオチン化されたおよび非ラベル両方の、ｐＡＭ６　（ＡＴＣＣ）およびφＸ１ ７４　ＲＦＩ　（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）　ＤＮＡをＢＲＬ 　Ｎ１ｃｋ−ｔｒａｓｉａｔｉｎｎ　５ｙｓｔｅｎヲ用いるニックトランスレー ションによす調７ｉ　した。二ノクトランスレーンヨンは、非ラベルのＤＮＡを 生成−イるための反応が、ｂｉｏ−１４−ｄＡＴＰの代わりにｄＡＴＰを含んだ こと以外は、本質的に実施例６に記載されたように実行された。

各競合反応は、１．ＸＩＯ’　１００％メタノール固定された細胞を使用し、そ して３０ｎｇのビオチン化されたｐＡＭ６　ＨＢＹプローブＤＮＡおよび２４０ μｇの競合ＤＮＡを含む。ビオチン化された）ＩＢＶプローブＤＮＡおよび非ラ ベルの競合物ＤＮＡを別の反応でＲｅｃＡでコートした。ＲｅｃＡコーティング の後、各反応のＭｇ４″イオン濃度を、１０μＩ（７）コ−ｆ　イ７グ反応あた り、０．５　μ］　（Ｄ　０．２μｌＭ　ＭｇＯＡｃを添加することにより調製 した。次いで、１０．５μｌのＲｅｃＡコートされたｂｉｏ−ｐＡＭ６ブローブ （３０ｎｇのＤＮＡ）を、等容積のＲｅｃＡコートされた競合物ＤＮＡ　（２４ ０μｇ）と混合した。ＲｅｃＡコートされビオチン化されたＨＢＶプローブおよ び競合剤ＤＮＡの各混合物の最終容積は２１μｌであった。

全てのビオチン化されたｐＡＭ６　ＤＮＡをＲｅｃＡでコートし、そして単一反 応に使用するために調製し、その１０．５μｌを各競合実験に使用した。一つの 反応における全てのビオチン化されたｐＡＭ６プローブのコーティングは、ＤＮ Ａ競合物以外、反応間で相違がないことを確実にした。適切なＲｅｃＡコーティ ングを行うため、プローブおよび競合剤ＤＮＡコーティング反応の両方は、同一 の平均ＲｅｃＡ　：ヌクレオチド比（ｉＲｅｃＡタンパク質モノマー：２ヌクレ オチド）を含有した。

全てのビオチン化されたｐＡＭ６ブローブを、４μｌのｌｏＸ酢酸反応緩衝液（ Ｃｈｅｎｇら、１９８８）、６μｍの３．２４ｍＭ　ＡＴＰｙ　Ｓ、　３μｍの ２Ｏｎ＋Ｍ　ＭｇＯＡｃ、　３．１６μＩのＬ　２１１　ｇ／μＩ　ＲｅｃＡ、 および１２μ＋の１０ｎｇ／μｌ　ｂｉｏ−ｐＡＭ６プローブ（これは、１１． ８４μ＋のｄｄＨ２０中で熱変性した）を含む反応物中でＲｅｃＡでコートした 。

各競合剤ＲｅｃＡ　ＤＮＡプローブコーティング混合物は、１１ｉ１の１、　Ｏ Ｘ　酢酸反応緩ｉｌｉ液、１．５μｌノ３．２４ｍＭ　ＡＴＰ７　Ｓ、　０．７ ５μｍノ２０ｍＭ　Ｍｇ０Ａｅ、　１．２５１１１の！１０Ｓμｇ／μｌ　Ｒｅ ｃＡ、および４．８Ｉｌｌの５゜ｎｇ、／〃ｌの、０７μｍのｄｄＨ２０中で熱 変性された競合物ＤＮＡ　＜ビオチン化されていないφＸ１７４またはビオチン 化されていないｐＡＭ６）、または、３１μｌのｄｄＨ２０中で熱変性された、 ２．４μｌの５１１　ｇ／ｕ　Ｉビオチン化されていない胎盤ＤＮＡ、　（−Ｂ ＬＯＣＫＩＴ”；０ｎｃｏｒ）を含む。

全てのプローブは、１００°Ｃ５分間で熱変性され、水浴中で約２０秒で冷却さ れ、４°Ｃ微量遠心分離機中で分離され、全ての液体を集めそして直ちにそれら の各々のＲｅｃＡ反応混合物に添加された。

プローブを、３７℃で１５分間ＲｅｃＡでコートし、そして次いで、１０μｌＤ ＮＡ混合物当り、０．５μｌの０．２Ｍ　ＭｇＯＡｃを添加した。

Ｂ３反応混合物。

一２０℃で保存されたメタノール固定された細胞を、実施例９で前記に述べたよ うに、冷ＥｔＯＨ洗浄のシリーズを介した脱水、次いで、Ｉ×酢酸反応緩衝液（ グリセロールなし）中で２回洗浄することにより、蛍光インサイチュ−ハイブリ ダイゼーションのために調製した。細胞を、緩衝液を除く前に、３７℃で１０分 間最終洗浄緩衝液中でインキュベートし、そして２１μＩのＲｅｃＡコートされ 、ビオチン化されたプローブおよび競合物ＤＮＡ混合物を、細胞ベレットに添加 した。

プローブを、３７°Ｃ水浴中で３時間細胞と反応させた。反応物は、３７°Ｃで 、２５０μ、　Ｉ（７）　１．７５ｘ　ＳＳＣ（ｐＨ７，４）　（Ｄ添加により 、停止１−シ、混合し、室温（ＲＴ）で遠心分離し細胞をペレット化し、−〇し 、て上澄を除去した。細胞を３７℃で２５０μｌの１．７５　Ｘ　ＳＳＣで５分 間２回洗浄し、次いで遠心分離し、そして上澄を除去した。

３０Ｑ７ｚ＋の濾過された前ブロツク溶液を、処理され、洗浄された細胞に添加 し、モしてＲＴで２０分間インキュベートした。

遠心分離および上澄除去の後、濾過された前ブロツク溶液中の、９０μｍの５μ ｇ／ｍｌ　ＦＩＴＣ−アビジンを各反応に添加し、暗所中で２０分間室温でイン キュベートした。遠心分離により、細胞をペレット化した後、ＦＩＴＣ−アビジ ンを除去した。反応した細胞を、細胞とゆっくり混合された４Ｘ　ＳＳＣ（ｐＨ ７，４）中、２５０μ１（７）４ＸＳＳＣ＋０．１％−ＴＲＩＴＯＮ　Ｘ−１０ ０−１および２５０μｍ１７１４ｘ　ＳＳＣで連続的に洗浄した。各洗浄の後、 細胞をペレ）ｌ）化し、そして洗浄液体を除去した。

最終洗浄の後、細胞を風乾し、そして約２０μｌの抗進色剤を各細胞反応に添加 した。細胞をスライドガラス上にマウントし、カバーガラスでカバーし、そして Ｚｅｉｓｓ　ＬＳＭで検査した。

過変ないし明るいハイブリダイゼータ１ンシグナルを含有スる細胞を、ハイブリ ダイゼーション陽性として数えた（表１参照）。

表土 ヒトＩ（ＣＣ細胞におけるＨＢＶ蛍光 インサイチ二一ハイブリダイゼーシッンの特異性６　ビオチン化されていない。

ｂ　これらの細胞の４．５％が、非常に弱いＦＩＴＣハイブリダイゼーシクンを 示した。他の競合するＤＮＡとのＦ［ＴＣシグナルは、蛍光顕微鏡のみを用いて 容易に観察されたが、この試料とのシグナルは、　４１１８ｎｗのアルゴンイオ ンレーザーイルミネーシロンが用いられたときのみ観察し得た。

°　蛍光インサイチューハイプリダイゼーシコンロ表１に示す結果は、異質なり ＮＡでなく、相同なＨＢＶ　ＤＮＡのみが、特異的にビオチン化されたＩＩＢＶ 　ＤＮＡプローブシグナルと競合することを示す。

図１６Ａから１６Ｃ中に示された細胞は、表１中に記載された競合実験から得ら れた。図１６：　１６Ａ、ビオチン化されたＨＢＶプローブ＋過剰の非ラベルＨ ＢＶプローブＤＮＡ；　１６Ｂ１　ビオチン化されたＩＢＭプローブ＋過剰の非 ラベルφＸ１７４ＤＮＡ；　１６　Ｃ，ビオチン化されたＩＩＢＹプローブ＋過 剰の非ラベルヒト胎盤ＤＮＡ　（−ＢＬＯＣＫＩＴ−；　０ｎｃｏｒ）　ｏ　Ｆ ＩＴＣプローブシグナルは、レーザー走査モードのＺｅｉｓｓ　ＬＳＭを用いて 観察した。

８８Ｍプローブからの観察されたＰｆＴＣシグナルは、細胞の位相イメージ上に 二重に焼き付けられて示された。各実験からのいくつかの細胞が示される。この シグナルおよび細胞イメージから、相同）ＩＢＶ　ＤＮＡが特異的にビオチン化 されたＨＢＶ　ＤＮＡプローブシグナルと競合するが、異質のＤＮＡは競合しな いことが明かである。

本発明が、特定のプロトコールと使用に関して記載されているが、種々の変化お よび改変が本発明を離れることな（成されるされ得ることが認識され得る。

Ｆｉｇ、２Ａ Ｆｉｇ、２Ｂ Ｆｉｇ、３Ａ Ｆｉｇ、３Ｂ 、？−′″−−−＼ Ｆｉｇ、４Ｂ Ｆｉｇ、９Ａ　Ｆｉｇ・　ＩＯＡ Ｆｉｇ、１２ Ｆｉｇ、１３Ｅ Ｆｉｇ、１．３Ｆ Ｆｉｇ、１６Ａ Ｆｉｇ、１６Ｃ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成６年３月４４心

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．固定きれた、細胞または細胞下生物構造内に含まれる二本鎖の核酸中の既知 の標的配列の存在を、該構造で規定された形態関係で同定する方法であって、該 構造に、二重鎖の標的配列に相補的な、一本鎖の、レポーターでラベルされたプ ローブに安定に結合したＲｅＣＡタンパク質を含むプローブ複合体を、該複合体 が、該二重鎖の核酸標的に接触し得る条件下で、添加する工程、該複合体を、非 変性条件下で、該標的配列に結合する工程、該構造から、未結合の複合体を、除 去する工程、および該構造を、該核酸に結合したレポーターラベルされたプロー ブの存在について検査する工程、を包含する方法。
2. ２．前記複合体が、ＡＴＰγＳ、ＧＴＰγＳ、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ、および、ＡＴ ＰγＳとＡＤＰとの組み合せからなる群から選択されるコファクターの存在によ り安定化される、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記プローブがリガンドレポーターでラベルされ、そして、前記検査する工 程が、前記構造に、該リガンドに安定に結合し、そして検出可能なレポーター基 を有する抗体を包含する、特定のリガンド分子を添加する工程を包含する、請求 項１に記載の方法。
4. ４．宿主細胞において、病原性（外来）標的二重鎖核酸配列の存在を検出するた めの、請求項１に記載の方法であって、前記複合体は、宿主細胞固定の条件下で 該細胞に添加され、そして前記検査する工程が、該固定された細胞中でプローブ に結合したレポーターの存在を検出する工程を包含する方法。
5. ５．前記検査する工程が、顕微鏡使用または蛍光活性化細胞ソーターを用いて、 前記核酸に結合したレポーターラベルされたプローブに結合した蛍光レポーター を検出する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
6. ６．宿主細胞ゲノム中に組み込まれた、選択された標的二重鎖核酸配列を局在化 するための、請求項１に記載の方法であって、前記複合体が、前記細胞の染色体 に添加され、そして前記検査する工程が、染色体を顕微鏡的に検査する工程を包 含し、染色体超微細構造に関係するレポーターラベルされたプローブの相対位置 を決定する方法。
7. ７．前記染色体が、第１の蛍光レポーターでラベルされ、前記プローブが、第２ の蛍光レポーターでラベルされ、そして前記検査する工程が、該２種類のレポー ターの各々で蛍光を励起するのに有効な波長で、蛍光顕微鏡により、前記細胞を 別々に観察する、請求項６に記載の方法。
8. ８．選択された染色体中で標的配列を局在化するための、請求項６に記載の方法 であって、該方法は、さらに、前記構造に、選択された染色体の既知の領域中の 二重鎖に相補的な、一本鎖の、レポーターでラベルされた核酸プローブに安定に 結合したＲｅｏＡタンパク質を含む第２のプローブ複合体を添加する工程を包含 し、そして前記検査する工程が、２種の複合体の各々と結合するレポーターの相 対位置を測定する工程を包含する方法。
9. ９．前記第１の複合体および第二の複合体が異なる蛍光レポーターでラベルされ 、そして前記検査する工程が、該２種類のレポーターの各々で蛍光を励起するの に有効な波長で、蛍光顕微鏡により、前記細胞を別々に観察する、請求項８に記 載の方法。
10. １０．前記添加する工程の前に、前記構造中の標的二重鎖核酸を増幅する工程を さらに包含する、請求項１に記載の方法。
11. １１．ポリメラーゼ、および４種類のデオキシヌクレオチドの全てを添加するこ とにより、前記標的に結合したプローブを増幅する工程をさらに包含する、請求 項１に記載の方法であって、該デオキシメクレオチドの一種が、レポーターラベ ルを含有する方法。
12. １２．固定された細胞または細胞下生物構造中に含まれる既知のウィルス核酸標 的配列の存在を同定する方法であって、該構造に、該ウィルス核酸標的配列に相 補的な、一本鎖の、レポーターでラベルされたプローブに安定に結合したＲｏｃ Ａタンパク質を含むプローブ複合体を、該複合体が該核酸標的に接触し得る条件 下で添加する工程、 該複合体を、非変性条件下で該標的配列に結合させる工程、該構造から未結合の 複合体を除去する工程、および該構造を、該核酸に結合した、レポーターラベル されたプローブの存在について検査する工程、を包含する方法。
13. １３．前記既知のウィルス標的が、Ｂ型肝炎ウィルスに由来する配列である、請 求項１２に記載の方法。
14. １４．前記ＲｅｃＡプローブ複合体の添加前に、前記固定された構造が、ｐＨ７ ．５の１０ｍＭトリスー酢酸緩衝液中、５５−６０℃でインキュベートされる、 請求項１２に記載の方法。
15. １５．前記複合体が、ＡＴＰγＳ、ＧＴＰγＳ、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ、および、Ａ ＴＰγＳとＡＤＰとの組み合せからなる群から選択されるコファクターの存在に より安定化される、請求項１２に記載の方法。
16. １６．前記プローブがリガンドレポーターでラベルされ、そして、前記検査する 工程が、前記構造に、該リガンドに安定に結合し、そして検出可能なレポーター 基を有する、特定のリガンド分子を添加する工程を包含する、請求項１２に記載 の方法。
17. １７．前記リガンドレポーターが、ジゴキシゲニンまたはビオチンであり、そし て前記リガンド分子が、抗体、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群か ら選択される、請求項１６に記載の方法。
18. １８．前記検査する工程が、顕微鏡使用または蛍光活性化細胞ソーターを用いて 、前記核酸に結合したレポーターラベルされたプローブに結合した蛍光レポータ ーを検出する工程を包含する、請求項１２に記載の方法。
19. １９．宿主細胞ゲノム中に組み込まれた、選択された標的二重鎖核酸配列を局在 化するための、請求項１２に記載の方法であって、前記複合体が、前記細胞の染 色体に添加され、そして前記検査工程が、染色体を顕微鏡的に検査する工程を包 含し、染色体超微細構造に関係するレポーターラベルされたプローブの相対位置 を決定する方法。
20. ２０．請求項１２に記載の方法を実施するためのキットであって、前記ウィルス 核酸配列に由来する、ＲｅｏＡ−タンパク質でコートされたＤＭプローブを含有 するキット。
21. ２１．前記プローブがＢ型肝炎ウィルス配列に由来する、請求項２０に記載のキ ット。
22. ２２．前記プローブがレポーターラベルされた、請求項２０に記載のキット。
23. ２３．前記レポーターがビオチンまたはジゴキシゲニンである、請求項２２に記 載のキット。
24. ２４．前記キットが、さらに、試料中の前記既知のウィルス核酸配列に対するプ ローブの結合を検出する手段を包含し、そして該検出手段が、顕微鏡使用または 蛍光活性化細胞ソーターを用いて、核酸に結合したレポーターラベルされたプロ ーブに結合した蛍光レポーターを検出することを包含する、請求項２０に記載の キット。
25. ２５．細胞または細胞下生物構造中に含まれる単一コピー核酸配列を検出する方 法であって、 該細胞または細胞下生物構造を固定する工程、該構造に、該単一コピーの核酸標 的配列に相補的な、一本鎖の、レポーターラベルされたプローブに安定に結合し たＲｅＣＡタンパク質を含むプローブ複合体を、該複合体が該核酸標的に接触し 得る条件下で添加する工程、該複合体を、非変性条件下で、該標的配列に結合す る工程、該構造から、未結合の複合体を除去する工程、および該構造を、該核酸 に結合した、レポーターラベルされたプローブの存在について検査する工程、を 包含する方法。
26. ２６．前記固定が溶液中またはスライドガラス上である、請求項２５に記載の方 法。
27. ２７．前記固定する工程が、５５−６０℃で、固定された構造のｐＨ７．５の１ ０ｍＭトリスー酢酸緩衝液中でのインキュベーションを包含する、請求項２５に 記載の方法。
28. ２８．前記複合体を、非変性条件下で、標的配列に結合する工程が、２時間未満 の間で実行される、請求項２５に記載の方法。
29. ２９．前記添加する工程が、アクセサリータンパク質の添加を包含する、請求項 ２５に記載の方法。
30. ３０．前記アクセサリータンパク質が、トポイソメラーゼＩまたはトポイソメラ ーゼＩＩである、請求項２９に記載の方法。
31. ３１．前記固定された構造が、溶液中またはスライドグラス上にある、請求項１ に記載の方法。
32. ３２．前記固定された構造が、前記ＲｅｃＡプローブ複合体の添加前に、ｐＨ７ ．５の１０ｍＭトリスー酢酸緩衝液中、５５−６０℃でインキュベートされる、 請求項１に記載の方法。
33. ３３．前記複合体を、非変性条件下で、標的配列に結合する工程が、２時間未満 の間で実行される、請求項１に記載の方法。
34. ３４．前記添加する工程が、アクセサリータンパク質の添加を包含する、請求項 １に記載の方法。
35. ３５．前記アクセサリータンパク質が、トポイソメラーゼＩまたはトポイソメラ ーゼＩＩである、請求項３４に記載の方法。
36. ３６．前記固定された構造が、溶液中またはスライドグラス上にある、請求項１ ２に記載の方法。
37. ３７．前記複合体を、非変性条件下で、標的配列に結合する工程が、２時間未満 の間で実行される、請求項１２に記載の方法。
38. ３８．前記添加する工程が、アクセサリータンパク質の添加を包含する、請求項 １２に記載の方法。
39. ３９．前記アクセサリータンパク質が、トポイソメラーゼＩまたはトポイソメラ ーゼＩＩである、請求項３８に記載の方法。
40. ４０．前記複合体が、ＡＴＰγＳ、ＧＴＰγＳ、ＡＴＰ、ｄＡＴＰ、および、Ａ ＴＰγＳとＡＤＰとの組み合せからなる群から選択されるコファクターの存在に より安定化される、請求項２５に記載の方法。
41. ４１．前記プローブがリガンドレポーターでラベルされ、そして、前記検査する 工程が、前記構造に、該リガンドに安定に結合し、そして検出可能なレポーター 基を有する、特定のリガンド分子を添加する工程を含む、請求項２５に記載の方 法。
42. ４２．前記リガンドレポーターが、ジゴキシゲニンまたはビオチンであり、そし て前記リガンド分子が、抗体、アビジンおよびストレプトアビジンからなる群か ら選択される、請求項４１に記載の方法。
43. ４３．前記検査する工程が、顕微鏡使用または蛍光活性化細胞ソーターを用いて 、前記核酸に結合したレポーターラベルされたプローブに結合した蛍光レポータ ーを検出する工程を包含する、請求項２５に記載の方法。
44. ４４．宿主細胞ゲノム中に組み込まれた、選択された標的二重鎖核酸配列を局在 化するための、請求項２５に記載の方法であって、前記複合体が、前記細胞の染 色体に添加され、そして前記検査する工程が、染色体を顕微鏡的に検査する工程 を包含し、染色体超微細構造に関係するレポーターラベルされたプローブの相対 位置を決定する方法。
45. ４５．請求項２５に記載の方法を実施するためのキットであって、単一コピー核 酸配列に由来するＲｃｏＡタンパク質でコートされたＤＮＡプローブを含有する キット。
46. ４６．前記プローブが、ｐ５３腫瘍サプレッサー遺伝子配列に由来する、請求項 ４５に記載のキット。
47. ４７．前記プローブが、レポーターラベルされる、請求項４５に記載のキット。
48. ４８．前記レポーターが、ビオチンまたはジゴキシゲニンである、請求項４７に 記載のキット。
49. ４９．前記キットが、さらに、試料中の前記単一コピー核酸配列に対するプロー ブの結合を検出する手段を包含し、そして該検出手段が、顕微鏡使用または蛍光 活性化細胞ソーターを用いて、核酸に結合したレポーターラベルされたプローブ に結合した蛍光レポーターを検出することを包含する、請求項４５に記載のキッ ト。