JPH03224499A - 染色体―特異的染色の方法および組成物 - Google Patents

染色体―特異的染色の方法および組成物

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JPH03224499A JP2220946A JP22094690A JPH03224499A JP H03224499 A JPH03224499 A JP H03224499A JP 2220946 A JP2220946 A JP 2220946A JP 22094690 A JP22094690 A JP 22094690A JP H03224499 A JPH03224499 A JP H03224499A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、−船釣に細胞遺伝学の分野、より詳細には分
子細胞遺伝学に関する。本発明は、染色体を同定し分類
する方法に関する。なおより詳細には、本発明は、以下
に記載するプロセスによって設計することができる核酸
プローブに関し、これによりｌまたは複数の全染色体に
わたり、および／または１または複数の染色体上の１ま
たは複数の領域にわたる染色分布を作出し、かつこれに
は全ゲノムに及ぶ染色パターンも含まれる。染色パター
ンは、とりわけ出生前、腫瘍および疾虫に関連した細胞
遺伝学の適用を含む所望のいずれの細胞遺伝学的適用に
対しても適合させることができる。本発明は、核酸プロ
ーブの組成物および染色体を染色する方法を提供し、こ
れによって中期スプレッド（ａｐｒｅｎｄ）と間期核の
正常染色体および染色体異常を同定する。本発明のプロ
ーブ作出−染色パターンは、正常染色体、異常染色体の
顕微鏡的および／またはフローサイトメトリーによる同
定ならびに特定の異常の遺伝学的性質の解析を容易にす
る。
ここに記載ｔた例の多くはヒト染色体に関し、またここ
に使用した言葉の多（はヒト関係に向けられているが、
染色体を染色または着色するために核酸プローブを用い
るという概念は、植物と動物の両者を含むいずれの源か
らの染色体にも適用できる。
（従来の技術） 染色体異常は、遺伝性疾患、変性疾患、および変性疾患
を起こすことが知られている薬剤への暴露、特に癌と関
連がある６　　Ｇｅｒ＋＊ａｎ、−Ｓｔｕｄｙｉｎｇ１
１ｕｍａｎ　Ｃｈｒｏ＋＊ｏｓｏｔｅｓ　Ｔｏｄａｙ−
、Ａｍｅｒｉｅａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｓｔ。
Ｖｏｌ、　５８．　ｐｐ、　１８２−２０１　（１９７
０）；Ｙｕｎｉｓ、　”Ｔｈｅ　Ｃｈｒｏｍｏ−ｓｏｍ
ａｌ　Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　Ｈｕｍａｎ　Ｎｅｏｐｌａｓ
ｉａ”、江」１赳、Ｖｏｌ。
２２１、ｐｐ、２２７−２３６（１９ｇ３）；ａｎｄ　
Ｇｅｒｍａｎ、−ＣＩｉｎｉｃａｌｍｐｌｉｃａｔｉｏ
ｎ　ｏｆ　Ｃｈｒｏｓ＋ｏｓｏｍｅ　Ｂｒｅａｋａｇｅ
”、　ｉｎ　Ｇｅ−ｎｅｔｔｃ　Ｄａｍａ　ｅ　ｉｎ　
Ｍａｎ　Ｃａ□ｕｓｅｄ　ｂ　　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅ　
ｔａｌΔ」【９−１」ヨ５１．Ｂｅｒｇ、Ｅｄ、、ｐｐ
、６に−８６＜＾ｃａｄｅ＋＊ｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ、Ｎ
ｅｗＹｏｒｋ、　１９７９）参照のこと。染色体異常に
は数タイプがあり、なかでも個々に過剰または欠如のあ
る染色体、１個の染色体の部分的過剰または欠如（セグ
メント的重複または欠失）、切断、環および染色体再配
列を含む。染色体または遺伝子再配列は、転座（１つの
染色体から他の染色体へのピースのトランスファー）、
二動原体（２個の動原体を有する染色体）、逆位（染色
体セグメントの極性の反転）、挿入、増幅、および欠失
を含む。
検出可能な染色体異常は、ヒトの出生数２５０ごとに１
回の頻度で起きる。染色体物質の欠失または付加を伴う
異常は、生体の遺伝子の平衡を変え、普通は胎内死また
は重大な精神的、肉体的欠陥をもたらす。ダウン症候群
は、正常の１対の染色体の代わりに３個の第２１染色体
のコピーを有することによって起こることがある。この
症候群は、異常染色体数または異数性によって起こる状
態の一例である。また、ダウン症候群は、第２１染色体
のサブリージョンのセグメント的重複（例えば２１ｑ２
２）によっても起こることがあり、これは第２１または
他の染色体上に存在することがある。エドワーズ症候群
（１８４）、パトー症候群（１３４）、ターナ−症候群
（ｘＯ）、およびタラインフェルター症候群（ＸＸＹ）
が、数の異常を来す疾患のなかでよく見られるものであ
るｏ　　［Ｅｐｓｔｅｉｎ、Ｔｈｅ　Ｃｏｎ５ｅ　ｕｅ
ｎｅｅｓ　ｏｆＣｈｒｏ＋ａｏｓｏ＋＊ｅ　１ｍｂａｌ
ａｎｅｃ：Ｐｒ１ｎｃｉ　ｌｅｓ　Ｍｅｃｈａｎｉｓａ
ｓａｎｄ　Ｍｏｄｅｌｓ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ　Ｕｎｉ
ｖ、　Ｐｒｅｓｓ　１９１１６）；Ｊａｃｏｂｓ、＾ｍ
、Ｊ、Ｅ　１−ｄｅ＋＋Ｉｏ１．Ｌｉｉ：１８０（１９
７７）；ａｎｄＬｕｂｓ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃ
ｅ、１６９：４９５（１９７０）］網膜芽細胞Ｍｌ　（
ｄｅｌ　１３ｑ１４）、プレーダーウイリ症候群（ｄｅ
ｌ　１５ｑ１１−ｑ１３）、ウイルムス腫瘍（ｄｅｌ　
ＬＬｐｌＳ）およびクリーデコーシャ症候群（Ｃｒｉ−
ｄｕ−ｃｈａｔ）（ｄｅｌ　５ｐ）は、構造的異常と関
連した重要な疾患の例である。［Ｎｏｒａ　ａｎｄ　Ｆ
ｒａｓｅｒ、ＭｅｄｉｃａｌＧｅｎｅｔｉｃｓ：Ｐｒ１
ｎｃｉ　Ｉｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ、（Ｌｅａ
　ａｎｄＦｅｂｉｇｅｒ　１９８９）、］ 構造的に異常な染色体、例えば二動原体であって染色体
異常誘発物（ｃｌａｓｔｏｌｅｎｉｃ　ａｇｅｎｔ）、
例えば電離性放射線または突然変異誘発化学物質によっ
てひき起こされるものの頻度の測定は、このような物質
によって起こる遺伝子傷害の定量的指標として広く用い
られるｏ　　ＢｉｏｃｈｅＩＩｉｃａｌ　Ｉｎｄｉｃａ
ｔｏｒｓｏｆ　Ｒａｄｉａｔｉｏｎ　Ｉｎ’ｕｒ　　ｉ
ｎ　Ｍａｎ（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｔｏ＋＊ｉ
ｃ　Ｅｎｅｒｇｙ　Ａｇｅｎｃｙ、Ｉ／１ｅｎｎａ、１
９Ｔ１）；ａｎｄ　ＢｅｒｇＥｄ、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｄ
ａｍａ　ｅ　ｉ　　Ｍａｎ　Ｃａｕｓｅ”ｄ　ｂ　　Ｅ
ｎｖｊｒｏｎ−Ｉｅｎｔａｌ＾ｅｎｔｓ（Ａｃａｄｅｍ
ｉｅ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７９＞参照
のこと。潜在的に発癌性があり奇形腫を発生する多くの
化学製品が、工業、農業活動によって環境に広く分布さ
れている。これらの化学製品のなかには、殺虫剤および
ある範囲の産業廃棄物、同副産物、例えばハロゲン化炭
化水素、塩化ビニル、ベンゼン、ヒ素などがふくまれる
。Ｉｒａｙｂ１１ｌ　ｅｔａｌ、、Ｅｄｓ、、　ｎｖｉ
　ｏｎ　　　ａ　　Ｃａｎｃｅｒ（Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒ
ｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎ
ｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９７７）参照のこと。染色体切断お
よびその他の異常の鋭敏な測定は、このような職業的、
環境的薬剤への暴露の影響を評価するための改良された
線量測定による危険評価方法論の基礎を形成することが
できるであろ　う。
遺伝子スクリーニングと生物学的線量測定の現在の手法
は、カリオタイプ解析を含む。カリオタイプは、各個ま
たは各個の関連グループに相補的な特有な染色体であっ
て、通常は有糸分裂中期における染色体の数と形態の両
方によって定められる。これには、全染色体数、各染色
体型のコピー数（例えばＸ染色体のコピー数）および染
色体の形態（例えば長さ、動原体インデックス、連結性
（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄｎｅｓｓ）などによって測定され
る）のようなものが含まれる。染色体異常はカリオタイ
プの検査によって検出できる。カリオタイブは、従来は
生体の分裂中期を染色し、またはこれとは別に濃縮した
く例えば早期染色体濃縮によって）染色体によって決定
されている。濃縮染色体が用いられるのは、その分散状
態と核内において可視境界が無いために、中期染色体を
見えるようにすることが、最近まで可能でなかったため
である。
化学的染色に基づく多くの細胞学的技術が開発されたが
、これらは濃縮染色体に、普通はバンドと呼ばれる縦方
向のパターンを生じさせるものである。生体内の各染色
体のバンディングパターンは、普通は各染色体型の不明
瞭ではない同定を可能にする。Ｌａｔｔ、”０ｐｔｉｃ
ａｌ　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｆ　ＭｅｔａｐｈａｓｅＣｈ
ｒｏｍｏｓｏｍｅ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ−、Ａｎ
ｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆＢｉｏ　ｈ　５ｉｃｓ　
ａｎｄ　Ｂｌｏｅｎ　１ｎｅｅｒｉｎ　、Ｖｏｌ、Ｓ、
ｐｐ、１−３７（１９７６）参照のこと。ある重要な染
色体異常、例えば転座および逆位の正確な検出には、こ
のようなバンド分析を必要とした。
あいにく、このような慣用のバンド分析は、細胞培養と
高品質の中期スプレッドの調製を必要とし、これには時
間と労力を要し、しかもしばしば困難または不可能であ
る。例えば、多くの型の腫瘍からの細胞は培養が困難で
あり、かつ培養された細胞がもとの腫瘍細胞集団を代表
しているかどうかは明確ではない。培養可能な胎児細胞
は、侵襲的手段によって得ることが必要であり、また分
析に十分な中期細胞を得るには数週間培養しなければな
らない。多くの場合、異常染色体上のバンディングパタ
ーンは、これを構成している正常染色体の部分の明瞭な
同定を可能にするものではない。このような同定は、異
常に含まれる重要な遺伝子の位置を示すために重要であ
ろう。さらに、現在のカリオタイピング法の感度と分解
能とは、多数の染色体または染色体領域は非常に類似し
た染色特性を有し、かつバンドの一部分のみに含まれる
異常（例えば欠失）は検出できないという事実によって
制限される。したがって、このような方法は、実質的に
隣接する（ｃｏｎｔ　Ｉｇｕｏｕｓ）遺伝子症候群、例
えば部分トリソミー　ブレーダーウイリ症候群［Ｅｍａ
ｎｕｅｌ、　Ａｍ、　Ｊ、　ＨｕＩｌ、　Ｇｅｎｅｔ、
　、　４３：５７５（１９８８）Ｓｅｈｍｌｃｋｅｌ、
　Ｊ、　Ｐｅｄ！ａｔｒ、　、　１０９：２３１（１９
８６）］および網膜芽線側側［５ｐｉｒｋｅｓ、Ｂｌｏ
ｃｈｅｍ、Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ａｅｔａ、、工９５（１９
８５）］の診断および詳細分析に限られる。
（発明が解決しようとする課題） このように、慣用のバンド分析には幾つかの重要な制限
があり、そのなかには以下の事項が含まれる。ｌ）労力
と時間がかかり、かつ高度に訓練された分析化学者を必
要とする。２）濃縮染色体にしか適用できない。３）異
常の性質とバンディング技術の分解能によって、３−１
５メガベース（Ｍｂ）以下を含む構造的異常の検出には
向けられない。
［Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、５ｃｉａｎｅｅ
、２４２：２２９（１９８８）１本発明は、慣用のバン
ド分析の上記制限を克服するためにプローブ組成物と方
法を提供する。
従来技術による化学的染色手法は、よく分からない理由
でゲノム上にパターンを作るが、これは異なった適用で
の使用に対する要求に応じて変えることができない。こ
のような化学的染色パターンは、プローブの結合座位を
マツプ化するために用いられた。しかしながら、インン
トゥハイブリダイゼーンッンは、時たまに、しかも大き
な努力を払って、例えば特定のＤＮＡ配列から切断点ま
での距離といった、病変の部位に関するいくらかの情報
を得るために用いられたにすぎない。本発明は、核酸配
列に基づいてパターン内のゲノムを染色するので、プロ
ーブの核酸配列を変えることにより必要に応じてパター
ンを変え得るということにおいて、化学的染色の適応性
の欠如を克服する。本発明のブローブー作出染色パター
ンは、細胞遺伝学分析において有用な信頼できる基礎的
指標を提供する。
化学的染色バンドのイメージ分析による染色体の構造的
異常の自動化検出は、慣用技術によって中期染色体上に
作出されたバンディングパターンを検出しこれを解釈で
きるシステムの開発を必要とするであろう。化学的に染
色された正常染色体を、自動化手段によって信頼性をも
って同定することが非常に難しいことは分かったし、構
造的異常、例えば転座を有する異常染色体を区別するこ
とはもっと難しい。慣用的にバンド化した染色体の転座
の効果的な自動化検出は、１０年以上にわたる精深な研
究によっても完成しなかった。本発明のブローブー作出
バンディングパターンは、このような自動化検出、分析
に対して適している。
近年において、染色体構造とその遺伝子内容およびＤＮ
Ａ組成との関連に関する研究が急速に進歩した。一部に
は、この進歩は、遺伝子工学技術によって生産されたプ
ローブに対する大量の純化ＤＮＡおよびＲＮＡ断片の利
用に基づ（遺伝子マツピングの改良された方法という形
で行われた。例えば、Ｋａ。
−５ｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎ
ｄ　Ｇｅｎｅ　Ｍａｐｐｉｎｇ−。
Ｉｎｔｅｒｎａ目ａｎａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｃｔ
ｏｌｏ　　、Ｖｏｌ、８５．ｐｐ１０９−１４６　（１
９８３）、およびＤ’Ｅｕ５ｔａｃｈｉｏ　ｅｔ　ａｌ
、。
−Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃａ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｉｎ
　Ｇｅｎｅ　ＦａｍｉｌｉｅｓＳｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏ
ｌ、　２２０．　ｐｐ、　９．１９１９−９２４（１９
＞参照のこと。
遺伝子マツピングのためのプローブは、一重鎖もしくは
二重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの標識された断片からなり、
これらは染色体ＤＮＡ上の相補的座位にハイブリダイズ
される。このようなプローブにおいては、関心のある座
位以外の位置におけるハイブリダイゼーションを最小に
するような純粋な、または均一なプローブを作ることが
決定的に重要であった。
Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、−Ｃｙｔｏｌｏｇｌｃａｌ　Ｈｙ
ｂｒｉｄｉｚａｔｔｏｎ　ｔｏ　Ｍａｍ−＋ｅａｌｉａ
ｎ　　Ｃｈｒｏｍｏｓｏ＋＋ｅｓ　　、Ｉｎｔｅｒｎａ
ｔｉｏｎａｌ　　Ｒｅｖｉｅｗ　　ｏｆ虹旦力；ＬＪＬ
Ｉ、　Ｖｏｌ、　７６、　ｐｐ、　１−４６　（１９８
２）参照のこと。
ハイブリダイゼーションプロセスは、　（プローブと標
的が一重鎖核酸でなければ〉、加熱または他の手段によ
ってプローブと標的の二重鎖核酸を解くこと（ｕｎｒａ
ｖｅ１１ｉｎｇ）または融解（ｍｅｌｔｉｎｇ）を含む
。このステップは核酸の変成と呼ばれることがある。プ
ローブおよび標的の核酸の混合物が冷却すると、相補的
ベースを有するストランドは再結合またはアニールする
。プローブが標的の核酸と共にアニールすると、標的上
のプローブの位置は、プローブが持つ標識により、また
はプローブもしくはブローブー標的デ二ブレノクス（ｄ
ｕｐｌｅｘ）のある内在的特徴によって検出できる。も
し標的の核酸がその自然的生物学的セツティング（ｓｅ
ｔｔｉｎｇ）内に、例えばＤＮＡが染色体に、ｍＲＮＡ
が細胞質、染色体または細胞核の部分に残留すれば（ｇ
製技術によって固定されまたは変わるが）、このハイブ
リダイゼーションプロセスはインシトゥハイブリダイゼ
ーンヨンと呼ばれる。
インントウハイブリダイゼーションプローブは始めは、
染色体もしくは細胞の遺伝子または他の明かになった核
酸配列の同定に限られていた。シングル−コピー（ｓｉ
ｎｇｌｅ−ｃｏｐｙ）プローブの正常および異常染色体
へのマツピングの比較が、染色体異常の検査に用いられ
たａ　　Ｃａｎｎ１ｚｚａｒｏ　ｅｔ　ａｌ、Ｃｔｏ　
ｅｎｅｔｉｃｓ　ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
、３９：１７３−１７８（１９８５）参照のこと。反復
プローブの多数の結合座位の分布も決定することができ
た。
−倍体ゲツム中に１つの標的座位を有するプローブ、シ
ングル−コピーまたは単一配列プローブによるハイブリ
ダイゼーションは、ゲノム中の特定の遺伝子の位置をマ
ツプ化するために用いられてきたｏ　　［Ｈａｒｐｅｒ
　　ａｎｄ　　５ａｕｎｄｅｒｓ、−Ｌｏｃａｌｉｚａ
ｔｉｏｎ　　ｏｆｔｈｅ　ＦＩｕ＋ｅａｎ　Ｉｎ５ｕｌ
ｉｎ　Ｇｅｎｅ　ｔｏ　ｔｈｅ　Ｄｉｓｔａｌ　Ｅｎｄ
　ｏｆｔｈｅ　　５ｈｏｒｔ　　Ａｒｍ　　ｏｆ　　Ｃ
ｈｒｏｍｏｓｏ＋ｅｅ　　１１”　　Ｐｒｏｃ、　　Ｎ
ａｔｌＡｃａ、Ｓｃ１．、　Ｖｏｌ、７８゜ｐｐ、４４
５８−４４６０（１９８１−Ｋａｏ　ｅｔａｌ、、−Ａ
ｓｓｉｇｎｌＩｅｎｔ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　５ｔｒｕ
ｃｔｕｒａｌ　　ＧｅｎｅＣｏｄｉｎｇ　　ｆｏｒ　　
Ａｌｕｂｕａｉｎ　　ｔｏ　　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　
　４−、ＨｕｍａｎＧｅｎｅｔｉｃｓ、Ｖｏｌ、６２．
ｐｐ、３３７−３４１（１９８２）］　　Ｌかし、この
ようなハイブリダイゼーションは標的座位が小さいとき
には信頼性がない。低度コンプレキシティ（ｃｏ＋＊ｐ
ｌｅｘＨｙ）シングル−コピープローブに対する標的配
列の量は小さいので、細胞集団中の潜在的標的座位の一
部分のみがプローブによってハイブリッドを形成する。
したがって、プローブの特異的結合座位の位置のマツピ
ングは、プローブの非特異的結合によって生じるバック
グラウンドフグナルにより、また検出システム（例えば
オートラジオグラフィーまたは免疫化学）のノイズによ
って複雑化された。このような従来技術によるシングル
−コピープローブに対するシグナルの不信頼性の故に、
プローブの特異的結合座位をマ、ブ化するためには、多
数の細胞中の見かけのノ＼イブリダイゼーションシグナ
ルの位置の統計的分析を必要とした。
異なった反復配列は染色体上に異なった分布を有するで
あろう。これらは、先に引用した文献に示されたように
、全染色体上に広がっており、ゲノムのコンパクトな領
域、例えば染色体の動原体上に濃縮しており、または他
の分布を有するであろう。ある場合には、このような反
復配列は主に単一染色体上に位置しており、このためこ
れは染色体−特異的反復配列である。［Ｗｉ１１ａｒｄ
　ｅｔ　ａｌＩｓｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｃｈａｒａ
ｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ＭａｊｏｒＴａｎ
ｄｅｍ　Ｒｅｐｅａｔ　Ｆａ＋ａｉｌｙ　ｆｒｏｍ　ｔ
ｈｅ　Ｈｕｍａｎ　Ｘ　Ｃｈｒｏ−ｍｏｓｏｍｅ−、Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ、Ｖｏｌ
、１１．ｐｐ２０１．７−２０３３＜１９８３）］ 全染色体によって共有された反復配列に対するプローブ
は、もしその配列が種の１つに対して特異的であれば、
異なった種の染色体の間を識別するために用いることど
ができるであろう。このような反復配列に富む１つの種
からの全ゲノムＤＮＡは、このように用いることができ
る。［Ｐｉｎｋｅｌ　ｅｔａｔ、　　（ＩＩＩ）、ＰＮ
ＡＳ　ＵＳＡ、８３：２９３４（１９８６）；Ｍａｎｕ
ａｌｉｄｉｓ）１ｕｍ、Ｇｅｎｅｔ、、７１：２８８（
１９８５）　ａｎｄ　　Ｄｕｒｎａｍ　ｅｔ　ａｌ。
Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｇｅｎｅｔ
、、１１＋５７１（１９８５）］近来になって、選択さ
れた染色体に対して激しクカツ特異的にノ＼イブリダイ
ズする反復配列用のプローブ（反復プローブ）の利用の
可能性が増した。　　［Ｔｒａｓｋ　　ｅｔ　　ａｌ、
、ＬｄＬ−更し」ユ、、７８：２５１（１９８Ｂ）およ
びこのなかに引用された文献］　今やこのようなプロー
ブはヒト染色体の半分以上に利用できる。
−船釣に、これらは動原体近傍の標的染色体のコンパク
トな領域上の反復配列に結合する。しかしながら、　ヒ
ト染色体１ｐ３６にノ＼イブリダイズする１つのプロー
ブが報告されており、またヒト染色体Ｙｑにハイブリダ
イズする幾つかのプローブがある。
このようなプローブによるハイブリダイゼーンヨンは、
中期スプレッドにおける染色体の迅速同定、間期核中の
選択された染色体のコピー数の決定［Ｐｉｎｋｅｌ　ｅ
ｔ　ａｌ、（１）、ＰＮＡＳ　１］ｓＡ、８３：２９３
４（１９８６）；Ｐｉｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ、（ＩＩ）
、Ｃｏ１ｄ　Ｓ　ｒｉｎ　　Ｒａｒｂｏｒ　Ｓ　ｍｕａ
ｎｔ、　Ｂｉｏｌ、、５１＋１５１（１９８６）　ａｎ
ｄ　Ｃｒｅｍｅｒ　ｅｔ　ａｔＨｕＩｌ、　Ｇｅｎｅｔ
、、７４：３４６（１９８６）］および間期核中の染色
体の相対的位置の決定を可能にする。［Ｔｒａｓｋ　ｅ
ｔａｔ、　、庇旦；Ｐｉｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　（１
）、庇起：Ｐｉｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ（Ｉ　Ｉ）、　ｆ
ＪＪ、　；Ｍａｎｕａｌｉｄｌｓ、　ＰＮＡＳ　　ｔｌ
ｓＡ、　８１　：　３１２３　（１９８４）Ｒａｐｐｏ
ｌｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｈｕｍ、　　Ｇｅｎｅｔ、、
６ユ＋３１７（１９８４）Ｓｃｈａｒｄｉｎ　　ｅｔ　
　ａｌ、、Ｈｕ＋＊、Ｇｅｎｅｔ、、７１＋２８２（１
９８５）ａｎｄ　　Ｍａｎｕｅｌｉｄｉｓ、）Ｉｕ＋ｉ
、　　Ｇｅｎｅｔ、、７１＋２８８（１９８５）］しか
しながら、多くの適用は、適当なプローブの欠如によっ
てなお制約されている。例えば、ここに記載する方法が
発明されるまでは、出生前診断に対して十分な特異性を
有するプローブが第１３または第２１染色体に対して利
用できなかった。さらに、反復性プローブは構造的異常
の検出に対して非常に有用ではない。というのは、プロ
ーブがハイブリダイズした領域を異常が含む確率が低い
からである。
次の参考文献は、以下の記載において表示の番号によっ
て示す。
１、　Ａ、ｄｅ　Ｋｌｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎａｔｕ
ｒｅ　３００．７６５（１９８２）２、　　Ｊ、Ｇｒｏ
ｆｆｅｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｃｅ１１　３６，９３＜
１９８４）３、　Ｎ、Ｈｅｉｓｔｅｒｋａｍｐ　ｅｔ　
ａｌ、、Ｎａｔｕｒｅ　３０６．２３９（１９Ｂ３＞４
、　Ｅ、Ｓｈ口ｖｅ１ｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｌｏｏ
ｄ　６９，９７１（ＩＬ８７）５、　Ｊ、Ｂ、Ｋｏｎｏ
ｐｋａ、Ｓ、Ｍ、Ｗａｔａｎａｂｅ、Ｏ，Ｎ、Ｗｉｔｔ
ｅ、Ｃｅ１１３７．１０３５（１９！！４） ６、　　Ｙ、Ｂｅｎ−Ｎｅｒｌａｈ　　ｅｔ　　ａｌ、
、５ｃｉｅｎｃｅ　　２３３，２１２（１９８６）？、
　　Ｐ、Ｃ，Ｎｏｗｅ１１　　ａｎｄ　　Ｄ、Ａ、Ｈｕ
ｎｇｅｒｆｏｒｄ、５ｃｉｅｎｃｅ　　１３２１４９７
（１９６０） ８、　　Ｊ、Ｄ、Ｒｏｖｌｅｙ、Ｎａｔｕｒｅ　　２４
３，２９０（Ｊｕｎｅ　　１９７３）９、　Ｇ、Ｇｒｏ
ｓｖｅｌｄ　　ａｔ　　ａｌ、、Ｍｏｌ　　Ｃｅ１ｌ　
　Ｂｉｏｌ　　６　６０７（１９８６） １０、　　Ｅ、Ｃａｎａａｎｉ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｌ
ａｎｃｅｔ　　１，５９３（１９８４）１１、　　Ｒ，
Ｐ、Ｇａ１ｅ　　ａｎｄ　　Ｅ、Ｃａｎａａｎｉ、Ｐｒ
ｏｃ　　Ｎａｔｌ　　ＡｃａｄＳｃｉ　　ＵＳＡ　　８
１．５６４８（１９８４）１２、　　Ｋｏｎｏｐｋａ　
　Ｊ、Ｂ、　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔｌ
　　Ａｃａｄ　　５ｃｉＵＳＡ　　８２：１８１０（１
９８５）１３、　　Ｐ、Ｂｅｎｎ　　ｅｔ　　ａｌ、、
Ｃａｎｃｅｒ　　Ｇｅｎｅｔ　　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ　
　２９１（１９Ｂ？） １４、　　Ｓ、Ａｂｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｃａｎｃｅ
ｒ　　Ｇｅｎｅｔ　　Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ　　３８６１
（１９８９） １５、　　Ｍ、５ｈｔａｌｒｉｄ　　ｅｔ　　ａｌ、、
Ｂｌｏｏｄ　　７２，４８５＜１９８８）１６、　１．
Ｄｕｂｅ　　ａｔ　　ａｌ、、Ｇｅｎｅｓ　　Ｃｈｒｏ
＋＊ｏｓｏ＋＊ｅｓ　　ａｎｄＣａｎｃｅｒ　　１　１
０６（１９８９）１７　　＾　Ｊ、Ｆｉｓｈｌｅｄｅｒ
、Ｂ、５ｈａｄｒａｃｈ　　ａｎｄ　　Ｃ，Ｔｕｔｔｌ
ｅ。
Ｌｅｕｋｅｍｉａ　　３：１０，７４６（１９８９）Ｃ
，Ｒ，Ｂａｒｔｒａｍ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ　　Ｅｘ
ｐ、Ｍｅｄ　　１Ｎ（５）：１３８９（ＩＱ８６） Ｓ、）Ｉｉｒｏｓｗａ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ａｍ　　Ｌ
　　Ｈｅ＋ｎａｔｏｌ　　２８　１３３（１９８８） Ｍ、Ｓ、Ｌｅｅ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｂｌｏｏｄ　　７
３（８）：２１６５（１９８９）Ｅ、Ｓ、Ｋａｖａｓａ
ｋｉ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔｌ　　Ａ
ｃａｄ　　５ｃｉＵＳＡ　　８５．５６９８（１９８８
）Ｍ、Ｓ、Ｒｏｔｈ　　ａｔ　　ａｌ、、Ｂｌｏｏｄ　
　７４，８８２（１９８９）Ａ、Ｌ、Ｈｏｏｂｅｒｍａ
ｎｅｔａｌ、、Ｂ１ｏｏｄ７４．１１０１（ｌＪ８９）
Ｃ，Ａｌｅｓｔｂｒｏｏｋ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｂｌｏ
ｏｄ　　７１（３）：６９７−７０２（１９８＆） Ｂ、Ｔｒａｓｋ、Ｄ、Ｐｉｎｋｅｌ、ａｎｄ　　Ｇ、ｖ
ａｎ　　ｄｅｎ　　Ｅｎｇｈ。
Ｇｅｎｏｍｉｃｓ　　５．７１０（１９８９）Ｓ、Ｊ、
Ｃｏ１１ｉｎｓ　　ａｎｄ　　Ｍ、丁　Ｇｒｏｕｄｉｎ
ｅ　　Ｐｒｏｃ　　ＮａｔｌＡｃａｄ　　Ｓｃｉ　　Ｕ
ＳＡ　　８０，４８１３（１９８３）Ｄ、Ｐｉｎｋｅｌ
　　ｅＬ　　ａｌ、　　Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔｌ　　Ａｃ
ａｄ　　Ｓｅｔ　　ＵＳＡ８３．２９３４（１９８６） Ｄ、Ｐｉｎｋｅｌ、Ｔ、Ｓｔｒａｕｍｅ　　ａｎｄ　　
Ｊ、Ｗ、Ｇａｙ、、ＰｒｏｃＮａｔｌ　　Ａｃａｄ　　
Ｓｅｉ　　ＬＩＳＡ　　８５．９１３８（１９８８）２
Ｌ　　Ｂ、Ｔｒａｓｋ　　ａｎｄ　　Ｊ、Ｈａｍｌｊｎ
、Ｇｅｎｅｓ　　ａｎｄ　　Ｄｅｖｅｌｏｐ−ｍｅｎｔ
、３：１９１３（１９８９） ３０、　　Ｊ、Ｂ、Ｌａｖｒｅｎｃｅ、Ｃ，Ａ、Ｖｉ１
１ｎａｖｅ　　ａｎｄ　　Ｒ，Ｈ，Ｓｉｎｇｅｒ、Ｃｅ
１ｌ　　４２，５１（１９８８）３１、　　Ｇ、Ｄ、Ｊ
ｏｈｎｓｏｎ　　ａｎｄ　　Ｊ、Ｇ、Ｎｏｇｕｅｒｉａ
、Ｊ、ＩｎｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ　　４３，３４９
（１９８１）Ｈ，Ｈｅｇｅｗｉｓｃｈ−Ｂｅｅｋｅｒ　
　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｃｈｅａ
（Ｓｕｐｐｌ、）１３Ｂ、２８９（１９８９）３３、　
　Ｋｏｈｌｅｒ　　ｅｔ　　ａｌ、、”Ｅｘｐｒｅｓｓ
ｉｏｎ　　ｏｆ　　ＢＣＲ−ＡＢＬｆｒｏｍ　　Ｔｒａ
ｎｓｃｒｉｐｔｓ　　Ｆｏ１１ｏｗｉｎｇ　　Ｂｏｎｅ
　　ＭａｒｒｏｗＴｒａｎｓｐｌａｎｔ　　ｆｏｒ　　
Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ　　ＣｈｒｏｍｏｓｏＩｌｅ
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ　　Ｌｅｕｋｅｍｉａｓ”、（ｍａｎ
ｕｓｃｒｉｐｔ　　ｓｕｂｍｉｔ−ｔｅｃｌ） ３４、　　Ｈｅｉｓｔｅｒｋａｍｐ　　ｅｔ　　ａｌ、
、Ｎａｔｕｒｅ、３１５ニア５ｇ（１９８５）３５、　
　Ｈｅｉｓｔｅｒｋａｍｐ　　ｅｔ　　ａｌ、、Ｊ、Ｍ
ｏ１ｅｃ、　　Ａｐｐｌ、　　Ｇｅｎｅｔ２：５７（１
９８３） 第９染色体の長い腕からのプロトルオンコジーンｅ−Ａ
ＢＬと第２２染色体のＢＣＲ遺伝子との融合は、ＣＩＡ
Ｌにわける一致した所見である（１−３）。この遺伝子
変化は、ＢＣＲ−ＡＢＬ転写の形成となり、これは翻訳
されて実際止金てのＣＭＬ患者に存在する２１０ｋｄタ
ンパクを形成する（４−６）。患者の９０％において、
融合遺伝子は、第９及び第２２染色体を含み、フィラデ
ルフィア（Ｐｈ’）染色体と呼ばれる細胞遺伝学的に明
瞭な小さな末端動原体型染色体を生じる相互転座に由来
している（７−１２）（第８図謬照）。しかしながら、
標準的細胞遺伝学においては、間隔的に密接した切断点
、例えばＣＭＬおよび急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の
特徴である切断点を識別する解像力を有せず、またより
複雑な再配列によって生じた融合を見落とす。両方の遺
伝子における切断点領域のマツピングとクローニングは
、細胞遺伝学的にＰｈ１染色体が検出できなかったＣＭ
Ｌ患者のＢＣＲ−ＡＢＬ融合を立証することができる分
子的技術を生むこととなった（１３−１６＞。ＢＣＲ再
配列に対するササン分析は、ＣＭＬの診断に対する標準
となった。さらに最近になって、融合は、逆転写酵素を
用いＣＭＬ　ｍＲＮＡからコピーされたｅＤＮＡのイン
ビトロ増幅によって検出されるようになった（１７−２
３）。この技術は、低い頻度で現れるＣＭＬ細胞からの
ＢＣＲ−ＡＢＬ転写の検出を可能にする。
これら両技術は、細胞集団から得られた核酸を利用する
ので、各個の細胞に対する遺伝子型と表現型との相関は
あり得ない。
以下に記載するのは、遺伝子再配列、例えばＢＣＲ−Ａ
ＢＬ融合に対して例示した再配列を検出する染色体−特
異的試薬および方法であって、現有技術によっては入手
できない情報を提供する。
（課題を解決するための手段） 本発明は、１または複数の核酸プローブを使用し、核酸
配列に基づき染色体物質を染色する方法に関する。この
方法は、特異的細胞遺伝学的分析に対して適合できる染
色パターンを生じる。さらに、細胞遺伝学的分析に対し
て有用な核酸プローブを作ることも本発明の目的であっ
て、これは信頼性のあるシグナルによって染色体物質を
染色する。このプローブはインシトゥハイブリダイゼー
ションに適している。本発明のある適用に対して好まし
い核酸プローブは、２またはそれ以上の各様的座位を確
実に染色するのに十分なコンブレキ７テイを有するもの
である。
本発明は、染色体物質を染色するための方法および組成
物を提供する。ハイブリダイゼーシ１ン技術の現状にお
ける本発明のプローブ組成物は、典型的に高度のコンプ
レキシティを有し、通常は５０ｋｂよす大きいコンプレ
キシティであって、このコンプレキシティはプローブが
設計される適用に依存する。特に、染色体−特異的染色
試薬としては、核酸断片の不均一混合物からなり、各断
片は特異的染色が所望されている核酸−標的核酸、好ま
しくは標的染色体物質の一部分に実質的に相捕的である
配列の実質的断片を有するような試薬を提供する。−船
釣に、核酸断片は、ここに例示しかつ後に示すような手
段によって標識される。しかしながら、核酸断片はプロ
ーブ断片の被検出標的との結合のために順序正しく直接
に標識される必要はなく、例えばこのような核酸結合は
抗−ＲＮＡ／ＤＮＡデュフレックス抗体およびチミジン
ダイマーニ対する抗体によって検出できる。不均一混合
物の核酸断片には、二重鎖もしくは一重鎖ＲＮＡまたは
ＤＮＡを含む。
本発明は、疑わしい遺伝子再配列の近傍にある標的染色
体物質を染色する染色体−特異的試薬および方法に関す
る。このような遺伝子再配列には、転座、逆位、欠失、
増幅および挿入が含まれるが、これらに限定されない。
このような遺伝子再配列が疾患と関連しているときには
、この染色体特異的試薬は、疾患特異的試薬またはプロ
ーブと呼ばれる。また、このような遺伝子再配列が癌と
関連しているときには、この試薬は腫瘍特異的試薬また
はプローブと呼ばれる。
本発明は、ｌまたは複数の疑わしい遺伝子再配列の近傍
にある標的染色体物質を確実に染色する核酸プローブを
提供する。遺伝子再配列の検出に対して有用なこのよう
な核酸プローブは、典型的に高度のコンプレキシティを
有する。このような核酸プローブは、好ましくは遺伝子
再配列上関連する切断点を横切って部分的にまたは完全
に、わきに位置しくｆｌａｎｋ）および／または延びる
染色体領域における核酸配列と実質的に相同な核酸配列
からなる。
さらに、本発明は、細胞遺伝学的には類似であるが遺伝
学的には異なる染色体再配列の間を識別する方法および
試薬を提供する。
ここに特に例示するのは、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）
の診断に役立つＢＣＲ−ＡＢＬ融合を生じる遺伝子再配
列、例えば転座、欠失、増幅および挿入を検出する染色
体−特異的試薬および方法である。ＣＭＬ診断用のこの
染色体−特異的試薬は、ＣＭＬと関連する染色体領域９
ｑ３４および２２ｑ１１の転座切断点領域の近傍におけ
る染色体配列と実質的に相同な核酸配列を含む。
これらの試薬は、ＣＭＩ、の特徴であるＢＣＲ−ＡＢＬ
融合が起こると、独特に変わる染色パターンを生ずる。
第１１図には図式的に種々の染色パターンを示すが、こ
れらは他の潜在的染色パターンと共に、遺伝子再配列、
例えばＢＣＲ−ＡＢＬ融合の存在において変えられる。
遺伝子再配列の存在は、ここに記載した方法に従って本
発明の試薬を用い、かつ生じた染色パターンのシグナル
の近接および／または他の特徴を観察することによって
決定できる。
好ましくは、本発明のＣＭＬ検出用染色体−特異的試薬
は、約５０キロベース（ｋｂ）から約１メガベース（Ｍ
ｂ）まで、より好ましくは約５Ｏｋｂから約７５０ｋｂ
まで、さらにより好ましくは約２００ｋｂから約４００
ｋｂまでのコンプレキシティを有する核酸配列からなる
。
さらに、本発明は、１つのゲノム内において比較的に近
接して生じる疑わしい遺伝子再配列の間の識別方法を提
供するが、この染色体−特異的試薬は前記疑わしい遺伝
子再配列の近傍における核酸配列と実質的に相同な核酸
配列からなる。２つの潜在的遺伝子再配列の間のこのよ
うな鑑別の例としては、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）
からのＣＭＬの識別診断である。
さらになお、本発明は、遺伝子再配列と関連した疾患、
例えばＣＭＬにおけるＢＣＲ−ＡＢＬ融合と関連した疾
患に苦しむ患者において染色パターンを作出する方法お
よび試薬を提供し、この染色パターンは種々の治療的養
生、例えば化学療法、照射、外科、移植、例えば骨髄移
植に対する患者の反応を予知しおよび／または表示する
。このような染色パターンは、このような患者の状態を
、好ましくは個々の細胞を染色することによって監視す
るのに有用であり、また軽快化にある患者に対しては疾
患の再発を予知することができる。コンピュータを利用
した検鏡分析は、本発明の染色パターンの解釈を助ける
ことができ、また本発明は、コンビ１−夕利用の検鏡分
析が、個々の細胞を染色することによって患者の細胞を
試験する、例えば患者に残留する疾患を探索するのに用
いられる方法を提供する。
さらになお、本発明は、遺伝子的疾患の分子的ベーシス
を決定し、また特異的に遺伝子に基づく疾患を検出する
方法および試薬を提供する。
さらになお、本発明１は、核酸プローブのインシトゥハ
イブリダイゼーシ１ンからなる隣接する遺伝子症候群を
検出する方法と試薬を提供するが、このプローブは、隣
接する遺伝子症候群の１または複数の成分の特徴である
核酸配列に実質的に相同である配列を含む。このような
隣接する遺伝子症候群の代表はダウン症候群である。
また、１つのゲノム内の多数の座の遺伝子再配列を同時
に検出する方法を提供するが、これは高度コンプレキシ
ティ核酸プローブのインシトウハイブリダイゼーシ冒ン
からなり、かっこのプローブは、ゲノム内の多数の座に
おける核酸配列に実質的に相同である核酸配列を含む。
さらになお、１つのゲノム内の遺伝子再配列を探索する
方法を提供する。例えば、慣用のバンド分析は、検査さ
れているゲノムの染色体ｆｌ　域ニおける異常を示すで
あろう。本発明の方法は、正常なゲノムのその染色体領
域の近傍から作出した核酸プローブをインシトゥハイブ
リダイゼーションにより異常を含む細胞に適用すること
を含み、これによって、生じた染色パターンの観察によ
り前記異常の遺伝子再配列の正確な位置と種類とを詳細
に知ることができる。
さらになお、本発明は、遺伝子再配列の迅速、効率的、
かつ自動化された検出に対して最適化された高度コンプ
レキノティ核酸プローブを提供す高度コンプレキシティ
プローブを作出する１つのやり方は、数個または多数の
クローン、例えばとりわけファージ、プラスミド、コス
ミドおよび／またはＹＡＣクローンをプールすることで
あり、各クローンはゲノム内の標的のある部分にノーイ
ブリダイズすることができるインサート（ｉｎｓｅｒｔ
）を含む。このようなプローブを作出するもう１つのや
り方は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＢ）を用いることで
ある。
標識された核酸断片の混合物に関する不均一とは、染色
試薬は各断片が異なった配列および／またはサイズを有
する多くのコピー（例えばプローブを作るためにプール
した異なったＤＮＡクローン）からなるということを意
味する。使用のための準備としては、これ−らの断片を
ランダムに、または特異的に切断して、ハイブリダイゼ
ーションに関与する核酸のピースのサイズ分布を調整す
る０以下により十分に論議するように、好ましくは不均
一プローブ混合物は非標的核酸に対してハイブリダイゼ
ーション能力を持った核酸配列から実質的にフリーであ
る。このような配列の多くは、標的および非標的核酸に
よって共有された反復配列、すなわち共有反復配列に結
合している。
所望しない核酸配列を除去しおよび／またはこのような
配列のハイブリダイゼーション能力を役立たなくするた
めの方法については、後により十分に論議する。　［セ
クション■参照］このような方法は、共有反復配列のプ
ローブからの選択的除去またはスクリーニング、プロー
ブ中のインクルージヨン（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）に対す
る核酸配列の注意深い選択、標識されないゲノムＤＮＡ
の添加による共有反復配列のブロッキング、またはブロ
ッキング混合物中のインクルージ璽ンに対する核酸配列
のより注意深い選択、および高コピー反復配列の再結合
のために十分な時間をかけたプローブ混合物のインクル
−ジヨンなどを含むがこれに限定されない。
好ましくは、本発明の染色試薬は、インシトゥハイブリ
ダイゼーションによって間期または中期の染色体ＤＮＡ
に施され、かつ染色体は、染色試薬を含む核酸断片上に
おける標識、例えばビオチンまたは３Ｈの存在を検出す
ることによって同定、または分類、すなわちカリオタイ
ブされる。
本発明は、染色体の全ゲノム補体に対する染色体染色試
薬、単一染色体に特異的な染色試薬、染色体のサブセッ
トに特異的な染色試薬、および単一または多数の染色体
中のサブリージョンに特異的な染色試薬を含む。述語°
染色体−特異的°は、本発明の染色試薬のこれら実施喘
様の全てを包含するものと解釈される。また、この述語
は、正常染色体、異常染色体型の両方から作られ、また
この両方に向けられた染色試薬を包含するものと解釈さ
れる。
本発明の染色体−特異的染色試薬を作る好ましい方法に
含まれるのは、１）ゲノム内の特定の染色体型または１
もしくは複数の標的領域からの染色体ＤＮＡの分離、２
）核酸断片の不均一混合物を形成するための分離ＤＮＡ
の増幅、３）核酸断片中の共有反復配列のハイブリダイ
ゼーション能力を役立たなくすること、または除去、お
よび４）標識された核酸断片の不均一混合物を形成する
ために核酸断片に標識することである。より十分に後に
記載するように、特定の実施態様に対するステ、プの順
序は、ステップを実施するために採用される特定の手段
に従って変わる。
本発明は、染色体のカリオタイブに関連する問題、特に
診断的および線量測定的適用に向けられている。特に、
本発明は、次のような染色の欠如に起因する問題を克服
する。すなわち、それは、標的ＤＮＡおよび／またはＲ
ＮＡ、　　例えば標的染色体、染色体の標的サブセット
、または特定染色体の標的領域にハイブリダイズできる
核酸断片の不均一混合物を含む試薬を提供することによ
って十分に染色体−特異的な染色である。本発明の染色
技術は、標準的臨床および実験室装置と自動化技術を利
用する改善された分析を用いることによって、中期、間
期の両方の細胞における染色体異常、特に遺伝子再配列
の迅速、高＠度検出の可能性を切り開くものである。こ
れは遺伝子スクリーニング、癌診断、および生物学的線
量測定に直接に適用できる。
さらに、本発明は特に、中期のように濃縮していても、
また間部のように分散していても、胎児染色体物質を染
色する方法および核酸プローブを提供する。さらになお
、本発明は、胎児細胞の染色体物質のカリオタイピング
の胎児非侵襲的方法を提供し、胎児細胞は母性の血液か
ら分難されたものである。好ましくは、このような胎児
細胞は、白血球および／または細胞栄養層である。典型
的な核酸プローブは、染色体型１３．１８および／また
は２１に対して染色体−特異的な高貴コンプレキノティ
プローブである。代表的なプローブは、染色体−特異的
ブルースクライブ（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｂｅ）プラスミド
ライブラリーを含み、これは標的胎児染色体とのハイフ
リダイゼータ１ンの前および／または期間中に十分な数
の共有反復配列が除去され、またはそのハイブリダイゼ
ーション能力が役立たなくされたものである。
さらになお、本発明は、腫瘍細胞遺伝学、疾患関連の座
の検出、構造的異常、他の遺伝子再配列のなかでも例え
ば転座の分析に使用し、また生物学的線量測定に対して
適当な核酸プローブを含むテストキットを提供する。
さらに、本発明は、本発明の適当な核酸プローブを含む
出生前のスクリーニングキ、１・を提供する。また、本
発明は遺伝子再配列、特にＣＭ　Ｌの特徴であるＢＣＲ
−ＡＢＬ融合を生じる再配列検出用の高度コンプレキシ
ティプローブを含むテストキットを提供する。
本発明の方法および組成物は、所望の適用に対して適当
したパターンを伴った染色体物質の染色を可能にする。
パターンは、１または複数の染色体の幾つかの領域、ま
たは１つのゲノムの幾つかもしくは全染色体にわたって
延び、かつ例えば多数の色によって識別可能な多数の部
分を含むことができる。択一的に、パターンは、１つの
ゲノムの特定の１または複数の部分、例えばｌまたは複
数の膿瘍に対して診断的にもしくは予後的に重要な欠失
または切断点を潜在的に含むｌまたは複数の部分、また
は出生前の診断に重要な染色体のそれらの部分に焦点を
絞ることができる。
染色パターンは、用いられる分析方法、例えば人による
観察または自動化装置、例えばフローサイトメータまた
はコンビコータ利用の検鏡に対して調整できる。パター
ンは、濃縮染色体または分散染色体物質の分析に対して
適当するように選択することができる。
さらに、本発明は、本発明に従って作られた染色パター
ンによって示される、染色体異常、特に遺伝子再配列を
検出、分析する自動化手段を提供する。
本発明の他の目的は、非自己相補的一重鎖ＤＮＡハイブ
リダイゼーションプローブを調製し適用するために現在
利用できる技術に代わる方法を提供することである。
本発明の他の目的は、プローブの非特定的かつ誤った結
合を減少することによって、インシトゥハイプリダイゼ
ーシ田ンにおいて到達可能なシグナル対ノイズ比を改善
することである。
本発明の他の目的は、プローブの配列に対して非相補的
であり、ハイブリダイゼーションに対して利用できる一
重鎖領域を最小にする二重鎖標的ＤＮＡを、ハイブリダ
イゼーションプローブの適用に対して変性する手段を提
供することである。
プローブは、Ｉ）ＮＡを制限エンドヌクレアーゼにより
処理することによって染色体ＤＮＡから構成することが
できるが、これは用いるエンドヌクレアーゼの特徴をな
す”付着”端じ５ｔｉｃｋｙ″ｅｎｄ）または付着切断
端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ　ｃｕｔ）を有する制限断片の
コレクシロンを生じる。すなわち、力、トによって導入
された２つの断片末端は、それぞれ突出したストランド
と引っ込んだストランドとからなる。制限断片は、この
型の制限断片を受は入れるように加工されたベクターに
挿入され、そしてベクターは、制限断片の数を増すべく
成長した宿主生体内にトランスフェクトされる。次に、
ベクターは宿主生体から分離され、制限断片は切り出さ
れベクターから分離される。制限断片の各末端において
、引っ込んだストランドは適当なエキソヌクレアーゼに
よってダイジェストされる。グイジェスチョンは完結を
許されない。エキソヌクレアーゼ処理された制限断片は
次いでＤＮＡポリメラーゼに対する鋳型／ブライマーと
して使用され、これは標識された前駆体の存在において
ダイジェストされたストランドに代わる。このプロセス
に適した酵素ノ例は、ＤＮＡポリメラーゼ　１の大きな
断片によって処理されたエキソヌクレアーゼ■、または
ＴＡ　ＤＮＡポリメラーゼであって、これは反応条件の
変化によって両方の機能を果たすことができる。合成が
完了した後、制限断片は、最初の制限断片の標識した部
分が実質的に元のままに残るように、より細かな断片に
分割される。この細かな断片は変性され、標識されたス
トランドは標識されないストランドから分離されて、ハ
イブリダイゼーションプローブを形成する。一重鎖プロ
ーブを用いるこの方法においては、標的ＤＮＡにハイブ
リダイゼーションプローブを施す前に、先ず標的Ｄ）Ｉ
Ａを、クローニングベクターからプローブＤＮＡを切り
出すために用いたのと同じ制限エンドヌクレアーゼで処
理する〇この処理は、標的ＤＮＡを、各末端に制限エン
ドヌクレアーゼの特徴である尾部を有する制限断片のコ
レクシ曹ンに分割する。次に、標的ＤＮＡは、引っ込ん
だストランドを除去するエキソヌクレアーゼで処理され
るが、これによって制限エンドヌクレアーゼによって導
入されたカットの近傍に一重鎖ＤＮＡを露出させる。最
後に、より十分に後に記載するように、例えば標準イン
シトウハイプリダイゼーションブロトフル（ｐｒｏｔｏ
ｃｏｌ）を用いて、ノ＼イブリダイゼーシロンプローブ
を標的ＤＮＡに適用する。
一重鎖プローブ法の重要な特徴は、クローンされたプロ
ーブＤＮＡと標的ＤＮＡとを同一の制限エンドヌクレア
ーゼで処理することである。これは、標的の一重鎖ＤＮ
Ａがプローブの標識されたストランドと相補的であるこ
とを確実にする。もちろん、多くの制限カットがあるの
で、正しい結合座位に加えて標的の多くのセグメントが
一重鎖化されるであろうが、全一重鎖標的は無差別変性
によって作られるよりもずっと少ないであろう。加えて
、このやり方で一重鎖化された標的ＤＮＡは自身によっ
て再アニールができず、このためプローブへのアクセス
を妨げることができない。
このような方法の他の重要なくしがし決定的ではない）
特徴は、標識したストランドを標識されないストランド
から分離することを可能にする標識の選択である。好ま
しくは、前駆体はビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａＬｉ
ｏｎ）によって標識され、また標識されたストランドは
アフィニティークロマトグラフィーによって標識されな
いストランドから分離される。
（発明の作用および効果） 本発明は、プローブの使用上従来技術の有する制約を克
服し、細胞遺伝学的分析に対するインシ）・ウハイブリ
ダイゼーションの適用を劇的に増すものである。前記の
とおり、従来技術によるプローブは、徹底的な細胞遺伝
学的分析に対して有用ではなかった。低度コンプレキシ
ティシングルーコビーブローブは、ハイブリダイゼーシ
、ン技術のこの段階においては信頼性のあるシグナルを
発生しない。反復性プローブは信頼できるシグナルを生
ずるが、このようなシグナルは、ゲノムにおける反復配
列の固定した分布のために、異なった適用に対して適合
させることができない。本発明のプローブは、反復性プ
ローブのハイブリダイゼーシ褒ン信頼性を、プローブの
結合パターンを所望の適用に対して適合させることがで
きる融通性と結合させる。
本発明によるプローブの高められた能力は、その増加し
たコンプレキシティに由来する。プローブのコンプレキ
シティの増加は、標的領域へのハイブリダイゼーシッン
の確率、ひいては強度を増すが、またバックグラウンド
シグナルをもたらす非特異的ハイブリダイゼーシ璽ンの
確率も増加させる。しかしながら、本発明の概念におい
ては、このようなバックグラウンドシグナルはゲノム上
にほぼランダムに分布しているものと考えた。したがっ
て、最終的結果としては、標的領域は、このようなバッ
クグラウンドシグナルに対するコントラストの増加によ
って可視化できるということである。
ここには、概略のコンプレキシティ範囲で約５００００
ベース（Ｓｏ　ｋｂ）から数値ベースからなるプローブ
が例示されている。このような代表的プローブは、コン
パクトな座とヒト染色体全体に対するものである。本発
明の前には、インントウハイプリダイゼーシ運ンに使用
されるプローブは、４０ｋｂ以下、さらに代表的には数
ｋｂのオーダーのコンプレキシティを有していた。
本発明のプローブを用いた染色体物質の染色は、従来技
術による化学的染色とは顕著に異なっている。本発明の
プローブ作出染色の特異性は、全く新規な源−ゲノム中
の核酸配列から生じる。かくして、本発明の染色パター
ンは、特定の適用に対して重要な基礎的遺伝子情報を目
たたせるように設計することができる。
本発明により所望の特異性をもつプローブを作るための
手法は、細胞遺伝学研究の広い範囲に顕著な進歩をもた
らす。分析は中期染色体と間期核について行うことがで
きる。本発明の技術は、慣用の方法による高品質のバン
ディングが難しいか、偏った情報が得られるという懸念
がある適用、例えば腫瘍細胞遺伝学に対して特に有益で
ある。診断上または予後上重要であることが知られてい
る病変、他の腫瘍特異的遺伝子配列のながでも例えば腫
瘍型−特異的転座および欠失の座位を標的とした試薬は
、このような異常の迅速な認職を可能にする。分析の速
度が主な関心事である場合、例えば有毒環境薬剤によっ
て誘発される低頻度の染色体異常の検出には、本発明の
組成物は、慣用の染色体バンディングに基づ〈従来技術
と比較して、検査効率において劇的な向上を可能にする
。
さらに、疾患−関連の染色体異常（例えばトリソミ−２
１）に対する出生前スクリーニングは、本発明による方
法と組成物による異常の迅速検出によって強められる。
本発明による間期異数体分析は、出生前診断に対して特
に顕著であり、細胞培養法によるよりもより迅速に結果
が得られる。さらに、母性の血液から分離される胎児の
細胞は、日常の手法によっては培養することができず、
このため慣用のカリオタイピング技術によって分析する
こともできないが、本発明の方法と組成物によれば検査
することができる。これに加えて、染色パターンの強度
、コントラスト、色の組合せは、特定の適用に対してパ
ターンを適合させる能力と連携して、自動化された細胞
遺伝学的分析、例えばフローサイトメトリーまたはコン
ピユータ化した検鏡検査およびイメージ分析に対する機
会を増した。
本出願は、特に遺伝子再配列の検出のための染色体−特
異的試薬と、このような再配列を検出するためにこの試
薬を使用する方法について特許を請求する。このように
して検出される代表的な遺伝子再配列は、慢性骨髄性白
血病（ＣＭＬ）の診断に役立つ融合遺伝子−ＢＣＲ−Ａ
ＢＬ−を生じる再配列である。
慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）は、骨髄細胞の悪性増殖で
あって、−船釣に第９および第２２染色体上におけるＢ
ＣＲおよびＡＢＬの融合によって特徴づけられる。
この融合は通常は相互転座　ｔ（９；２２）　（ｑ３４
：ｑ１１）を含み、細胞遺伝学的に独特のフィラデルフ
ィア染色体　（Ｐｈ’）を生ずる。しかしながら、もっ
と複雑な再配列がＢＣＲ−ＡＢＬ融合の原因となること
がある。分子的レベルにおいては、融合はサザーン分析
またはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いる融合遺伝
子がり ｍＲＮＡのインビトロ増幅によって検出できる。これら
の技術は鋭敏ではあるが、単一細胞には適用できない。
明らかに、染色・体異常、より特定的には遺伝子再配列
、例えばＣＭＬと関連した腫瘍特異的配列検出の鋭敏な
方法は、遺伝学的スクリーニングに対して非常に有用な
道具であろう。本発明はこのような道具を提供する。
（発明の詳細な説明） 本発明は、標的染色体物質を１または複数の全染色体に
延びるパターンに染色し、および／または１または複数
の染色体におけるｌまたは複数の領域に延びるパターン
に染色する核酸プローブの使用に関するもので、当該パ
ターンは全ゲノムを越えて延びるパターンを包含する。
本発明の染色試薬は正常な染色体と異常な染色体の顕微
鏡的同定、および／またはフローサイトメトリック同定
を容易にし、かつ遺伝子配列のごとき特有の異常の遺伝
子的性質の特性を提供する。本明細書において、”染色
体−特異的”なる文言は”標的特異的”および”領域特
異的”なる文言を包含するものと定義される。すなわち
、染色組成物が１個の染色体に導びかれる場合、それは
染色体−特異的であるが、染色体組成物が例えば、多数
の染色体にける多数の領域に導かれる場合、単に１個の
染色体の１領域に導かれる場合、または全ゲノムを越え
る領域に導かれる場合にも、これらは染色体−特異的で
ある。染色体−特異的なる文言は組換えＤＮＡライブラ
リーを使用することに由来する。当該ＤＮＡライブラリ
ーは本発明の最初のプローブのための源物質のごとき、
単一の正常染色体から得られるＤＮＡをクローニングす
ることにより作られる。ｌまたは複数の染色体の領域か
らのＤＮＡから作られたライブラリーは、ゲノムのこれ
らの領域のプローブのためのＤＮＡの源である。かかる
源物質から形成されたプローブは領域−特異的プローブ
であり、これもまた“染色体−特異的”なる幅広い文言
に包含される０９襟的−特異的”なる文言は本明細書に
おいて°染色体−特異的”なる文言と互換的に使用され
る。
当該技術において一般に使用される”特異的”なる文言
は、２つのやや異なる意味を持っている。
本明細書においては下記の慣習に従う。”特異的”とは
核酸配列の起源または同核酸配列が、染色試薬の一部と
してゲノムにハイブリダイズする様式に関係する。例え
ば、特定された染色体からのＤＮＡの分離およびクロー
ニングは”染色体−特異的ライブラリ−”をもたらす。
　　［Ｅｇ、、Ｖａｎ　Ｄｉ１１ａ　ｅｔ　ａｌ、。
”Ｈｕｍａｎ　　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−Ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃ　　ＤＮＡ　　ＬｉｂｒａｒｉｅｓＣｏｎｓｔｒｕ
ｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ、”　
Ｂｌｏｔｅｃｈｎｏ−包■、　４：５３７（１９８６）
、　］。しかしながら、かかるライブラリーは他の染色
体と共有する配列を含んでいる。これらの共有配列は同
共有配列のハイブリダイゼーシ讐ン特性を誘導される染
色体に対しては染色体−特異的ではな（、同共有配列は
起源の染色体よりも多く結合する。配列は、ゲノムの所
望の部位にのみ結合する場合には”染色体−特異的”で
ある。かかる配列は標的または反復配列（ｒｅｐｅｔｉ
ｔｉｖｅ　５ｅｑｕｅｎｓｅｓ）に包含されるシングル
コピー配列を含み、これらの配列においてコピーは標的
物質に抜群に包含されている。
“染色試薬”を変更することにおける”染色体−特異的
“とは、試薬を含む核酸配列の全体のハイブリダイゼー
ションの様式に関係する。染色試薬は、標的染色体物質
と非標的染色体物質問に有効な顕著なコントラストが達
成されるならば、染色体−特異的である（すなわち、標
的物質が十分に可視化できる）。
本明細書においてプローブは、標的物質に対するハイブ
リダイゼーションが検出できる核酸断片の集合体である
と定義される。プローブは後述するごと＜橋本され、そ
の結果標的物質への結合が可視化出来る。プローブは核
酸配列のある源、例えばクローンの集合体またはポリメ
ラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）の集合体から形成される。源核
酸はその後ある手段例えば反復配列の除去、または同反
復配列を相補的配列とともに標識されない核酸によりブ
ロッキングすることにより処理され、その結果得られる
プローブによるハイブリダイゼーションは標的物質に十
分な差異ある染色物を作り出す。
従って、本明細書において、プローブなる単語は検出可
能な核酸のみならず、例えばブロッキング核酸等ととも
に標的物に適用される形態において検出可能な核酸に関
しても使用される。ブロッキング核酸については別に言
及する。”プローブが特別に関係することがらは、文言
が使用される状況から明確である。
本発明に係る２またはそれ以上の核酸プローブが混合さ
れる場合、これらの核酸プローブは新しい１つのクロー
ンを形成し、同プローブは本発明の方法に従って標的物
質にハイブリダイズされると、成分プローブにより個々
に形成される染色パターンの組合わせである染色体パタ
ーンを形成する。
従って、”プローブおよび″プローブズ（すなわち単数
および複数形態）なる文言は、形成される染色パターン
の状況において互換的に使用される。
例えば、本発明に係るあるプローブが第９染色体にドツ
トを形成し、かつ本発明に係る他のプローブが第１１染
色体にバンドを形成する場合、これら２つのブローブズ
はドツト／バンド染色パターンを形成する１つのプロー
ブを構成スル。
本明細書において″樟識される”なる文言は、プロブが
変更された構成物質を直接導くか否かにかかわらず、結
合プローブ（ｂｏｕｎｄ　ｐｒｏｂｅ）を可視化する方
法があることを示すために使用される。後述のセクショ
ン■はプローブを直接標識する種種の手段および結合プ
ローブが検出可能な他の標識手段を述べている。
本明細書において”染色（ｓｔａｉｎｉｎｇ）”または
”着色”（ｐａｉｎｔｉｎｇ）なる文言は、本発明に係
るプローブをゲノムまたはそのセグメントにハイブリダ
イズすることを意味するものと定義され、従ってプロー
ブは標的染色体物質に確実に結合し、結合プローブは可
視化可能になる。“染色”または”着色°なる文言は互
換的に使用される。“染色”または”着色“によりもた
らされるパターンは細胞遺伝学的分析、特に分子細胞遺
伝学的分析にとって有用である。
染色パターンは正常および異常染色体の顕微鏡的同定お
よび／またはフローサイトメトリ、り同定、および特殊
な異常状態の遺伝学的性質の特徴付けを容易にする。後
述のセクション■は可視的なプローブを分離する方法を
示している。プローブを可視化するのに多数の適合する
方法が利用でき、プローブの異なる構成物質の結合パタ
ーンが例えば色によって識別し得る。従って、本発明は
１または複数の色（多数色染色パターン）および／また
は池の指標手段で、可視化された染色体上で所望の染色
パターンを形成することができる。本明細書で定義され
た”染色”なる文言は、慣用的なカワタイピング法（ｋ
ａｒｏｔｙｐｌｎｇ　ｍｅｔｈｏｄｓ）のごとき化学試
薬で染色体を染色する概念を包含しない。
但し、かかる慣用の染料は、プローブが結合しないゲノ
ムの部分の可視化を可能にするために、本発明に係るプ
ローブとともに使用されてもよい。
かかる目的のためＤＡＰ　Ｉおよびプロビジラム　アイ
オダイドの使用が図面に示されている。
本明細書において°高度コンプレキシティ（ｈｉｇｈ　
ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ）なる文言は、プローブが同ブロ
ーブにおける非反復核酸配列をベースとして５００００
（５０ｋｂ）またはそれ以上、数１０００万または数１
０億までのオーダで含むことを意味するものと定義され
る。例えば、本発明に係る典型的な高度コンブレキ／テ
ィ核酸プローブは５０ｋｂ以上、　１００．０００（１
００ｋｂ）以上、　２００．０００　（２００ｋｂ）以
上、　５００．０００（５００ｋｂ）以上、　１００万
（ＩＭｂ）以上、　２Ｍｂ以上、１０（ＩＭｂ以上、５
０ＱＭｂｌＪ上、１０億以上、さらには数ｌＯ億以上の
コンプレツキ／ティを持つことができる。
本明細書において”コンプレキシティ゛なる文言は、プ
リテン等により確立された核酸コンプレキシティのため
の標準に従って定義される。
［Ｂｒ１ｔｔｅｎｓ　ａｔ　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄｓ　
ｏｆ　Ｅｎ　　＋ｅｏ１．，２９＋３６３（１９７４）
］。核酸ココンブレタスィのさらに詳しい説明および具
体例については、カンタ−およびシンメルの下記の文献
を参照せよ。　［’Ｃａｎｔｅｒ　ａｎｄＳｃｈｌｍｍ
ｅｌ、Ｂｉｏｐｈｓｉｅａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｐ
ａｒｔｌ［［：ＴｈｅＢｅｈａｖｉｏｒｏｆ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、ａｔ　
１２２８−１２３０（Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏ、
Ｌ９１ｉＱ）］。
本発明に係るプローブ組成物にと９での好ましいコンプ
レキシティは、設計される適用に依存するる。通常、標
的区域が大きいほど、プローブはより大きなコンブレタ
スである。染色体上の目標の好ましいパターンを形成す
るために必要とするプローブのコンプレキシティは、同
ノｆターンの形成の進行がハイブリダイゼーション技術
にて行われるために、ハイブリダイゼーション感受性が
増大する程減少することが予想される。感受度が増大す
ると、より小さな標的座位からのシグナルの確実性は増
大するであろう。それ故、現在約４０ｋｂから約１００
ｋｂの標的配列が確実で、容易に検出可能なシグナルを
形成するのに必要であるのに対して、将来にはより小さ
な標的配列が確実なシグナルを提供するであろう。それ
故、ノ＼イブリダイゼーンヨン感受性が増加するほど、
あるコンプレキシティ例、ｔ　ｉｆ　１００ｋｂのプロ
ーブは、現在確実に検出されるよりも多くのゲノムの遺
伝子座を相当に検出することをユーザに可能とする。従
って、より多くのｔｌ［Ｗが同じコンプレキシティのプ
ローブから得られルテあろう。”コンブレキ／ティ”な
る文言はそれ故、如何に多くの可視化的に個別の遺伝子
座が検出されようとも、すなわちゲノムを越えた標的座
位の分散にかかわらず、全プローブのコンプレキシティ
に関係する。
上記したように、現在の）〜イブリダイゼーション技術
では、ゲノムにおけるコンノイクトポイントを標的とし
た約４０ｋｂから１００ｋｂのプローブ（例え１１また
は小数のコスミツドのプローブインサート能力）で確実
で、容易に検出できるシグナルを得ることが可能である
。例えば、約１００ｋｂの範囲のコンプレキシティは腫
瘍の特異的転座の両側にノ１イプリダイゼーンヨンを許
容する。切断点の一方側を標的としたプローブの部分は
切断点の他側を標的とした部分とは異なって標識され、
これにより両側は例えば異なる色で識別できる。プロー
ブのコンプレキシティを比例的に増大することは、同時
にゲノムの多数の緻密な領域の分析を可能とする。化学
的染料によって形成された通常の、＜ンディングパター
ンは本発明により、プローブを基礎とし、カラーコード
された各染色体またはそれらの重要領域に沿った関連点
のシリーズに置き替えられる。
ゲノムの延在した隣接領域、例えば全染色体を均一に染
色するには、標的領域のコンプレキシティ例比例スるプ
ローブ　コンプレキシティが必要である。但し、実質は
それより少ない。要求されたコンプレキシティは、標的
物質上で確実で実質的に均一なシグナルを提供するため
にのみ必要である。後述するセクションＶ、　Ｂ、は、
約５０メガベース（Ｍｂ＞のＤＮＡを含むヒト第２１染
色体の蛍光染色が約ＩＷｂのプローブ　コンプレキシテ
ィで十分であることを証明している。第４Ｈ図は、約２
００ＭｂのＤＮＡを含むヒト第４染色体に対する約４０
０Ｋｂのプローブの）＼イブリダイゼーシコンを示して
いる。この場合、プローブの個々の要素のノ＼イブリダ
イゼーション間のギャブ（ｇａｐｓ）が可視化される。
第４Ｂ図および第４Ｆ図は、それぞれ第４染色体および
第２１染色体のために全ライブラリ７−により作り出さ
れたプローブで達成された結果を証明している。染色体
は第４Ｂ図および第４Ｆ図に示すように、第４Ｈ図のパ
ターンを形成するために使用されたシングルコピー核酸
配列からなる、より低度のコンプレキシティプローブに
よる場合に比較してより濃密に染色される。
コンプレキシティを十分な染色を行うのに要求される最
小値を越えて増加することは、プローブの全核酸濃度が
ノ＼イブリダイゼーションの損なわれる点を下回る程度
残る限りにおいては有害ではない。プローブにおける配
列の一部分の濃度の減少は、標的座位の数の増加により
補われる。実際に、二重鎖プローブを使用する場合、配
列の各部分を比較的低濃度に維持することは好ましく、
これにより同配列の各部位が標的物質における結合座位
を見つけることができるまで再結合を阻止する。
本発明の染色パターンは１または複数のバンドからなる
。本明細書において”バンド”なる文言は、プローブ成
分に結合した標的核酸配列からなるゲノムニおける関連
点（ｒｅｆｅｒｅｎｃａ　　ｐｏｉｎｔ）として定義さ
れる。同プローブ成分のデュプレックス（ｄｕｐｌｅｘ
）はある指示手段により検出することができ、かつ最も
狭いデイメンジョン（ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ）Ｅおいて、
ハイブリダイゼーションおび機器使用等の条件および慣
習（ｐｒｏｔｏｃｏｌ）のもとで確実なシグナルを提供
する。バンドは確実なシグナルを提供する配列の狭いデ
イメンジョンから、多数の染色体における多数の領域ま
で全染色体にまで延在することができる。
本発明ノブローブ−形成バンドは、上記した本発明の背
景で示したごとき化学的染色により形成さレタバンドと
は識別されることである。本発明のブローブー形成バン
ドは核酸配列に基づくものであり、これに対して化学的
染色により形成されたバンドは染色体の本来の特性によ
るもので、実質の核酸配列によるものではない。さらに
、化学的染色により形成されたバンディングパターンは
中期染色体に関して解明できるにすぎず、これに対しテ
本発明のプローブ−形成バンドは中期および間期染色体
の両者の解明に有効である。
本発明に係るプローブを形成する−の方法は、多くの異
なる低度コンブレキ７テイブローブをプールすることで
ある。かかるプローブは、その後それぞれクローン化さ
れた配列の”不均一混合物”を構成する。要求されるク
ローンの数は、標的区域の広がりおよびクローニングベ
クターの能力に依存する。標的物質が幾多′の個別のコ
ンパクトな遺伝子座、すなわち顕微鏡的解像の限界であ
るシングルスポット（ｓｉｎｇｌｅ　５ｐｏｔｓ）で構
成されている場合には、各スポットにとっては約４０ｋ
ｂ好ましくは１００ｋｂが通常の技術で与えられる確実
なシグナルを与える。各スポットためのプローブの部分
は、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣＳ）からのシングル
　インサート、３５−４０ｋｂを含む幾多のコスミッド
またはプローブ配列、４ｋｂの配列を伴う約２５プラス
ミドから構成される。
本明細書で例示されたクローンの典型的な不均一混合物
はファージ（第１．第２および第３図）、およびプラス
ミド（第４図）を含む。酵母人工染色体（ＹＡＣＳ）　
　（第５図）、および種間雑種細胞（第６図）における
単一ヒト染色体は、シングルクローンとして増殖できる
単一遺伝子座および全染色体のための高度コンプレキシ
ティ　プローブの例である。
ゲノムのある点における塩基配列は、゛シングルコピー
′または”反復”のいずれかに分類できる。実際の目的
のためには、配列は十分長いものであることを必要とし
、これにより相補的プローブ配列は、使用されるハイブ
リダイゼー７Ｈン条件のもとにおいて標的配列とともに
安定なノλイブリ・ノドを形成できる。かかる長さは典
型的には、ヌクレオチドの数１０〜数１００の範囲にあ
る。
”シングル−コピー配列”は、その中において標的核酸
配列の唯一のワンコピーが一倍体ゲツムとして存在する
ことである。”シングル−コピー配列“は当該技術にお
いて゛非反復配列”としても知られてイル。°反復配列
”は、ゲノムにおける同じ標的核酸配列のワンコピーよ
り大きいものが存在するということである。反復配列の
各コピーは、他のもの全てと同一である必要はない。重
要な特質は、配列が反復配列のファミリーの他の構成メ
ンバーに十分に類似していることであり、これにより使
用されるハイブリダイゼーションの条件のもとにおいて
、プローブ核酸の同じ断片が各コピーとともに安定なバ
イブリドを形成できる。”共有反復配列＋（ｓｈａｒｅ
ｄ　　ｒｅｐｅＨｔｉｖｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）はゲノ
ムの標的領域、およびその他の領域においてい（っがの
コピーを伴う配列である。
形容詞である”シングルコピー”、゛反復“、”共有反
復”、その他のこのような修飾語がプローブにおける配
列を記述するために使用される場合には、これらの文言
はプローブ配列が結合する標的物質における配列のタイ
プに関係する。従って、゛反復プローブは標的物質にお
ける反復配列に結合する例であり、かつ°シングルーコ
ピープローブはシングル−コピー標的配列に結合する例
である。
反復配列は一倍体ゲツムにおけるマルチプルコピーの状
態で生じる。コピーの数は２〜数１０万まで配列でき、
その中で反復ＤＮＡのＡｌｕファミリー（Ａｌｕ　ｆａ
ｍｉｌｙ）は後者の非常に多い変種の典型的なものであ
る。反復のコピーはクラスターされ（ｅｌｕｓｔｅｒｅ
ｄ）、またはゲノムからインタスパーズされる（Ｉｎｔ
ｅｒｓｐｅｒｓｅｄ）ｏ　　反復物はゲノム、例エバ各
染色体の動原体の近くに生じる反復配列、および多数の
タンデム反復（ＶＮＴＲｓ）における１または複数の場
所でクラスターされるｏ　　［Ｎａｋａｍｕｒａ　ｅｔ
　ａｌ、５ｃｉｅｎｃｅ、２３５：１６１６（１９８７
）］　；　反復物ハシンクル染色体から分散されてもよ
い。　［例えば、反［物＋ｔＢａｒｄｏｎｉ等、　　Ｃ
ｔｏ　ｅｎｅｔ、　　Ｃｅ１ｌ　　Ｇｅｎｅｔ、　　４
６：５７５（１９８７）により記述されたごとくｘ染色
体上でのみ発見された］。反復物は全染色体、例えば反
復配列のＡｌｕファミリーから分散されてもよい。
本明細書において、反復配列（ｒｅｐｅｔｉＮｖｅｓｅ
ｑｕｅｎｃｅｓ）、反復配列（ｒｅｐｅａｔｅｄ　　５
ｅｑｕｅｎｃｅｓ）および反復物（ｒｅｐｅａｔｓ）な
る文言は互換的に使用される。
共有反復配列（Ｓｈａｒｅｄ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ　
５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）はクラスターまたはインクスパー
ズされる。クラスターされた反復配列（Ｃ１ｕｓｔｅｒ
ｅｄ　ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）はタ
ンデム反復物（ｔａｎｄｅｍ　ｒｅｐｅａｔｓ）を含む
。タンデム配列は、それらが染色体のバンクボーンを形
成するＤＮＡ分子上に近接する故にそう呼ばれる。クラ
スターされた反復物は１または複数の染色体の明確に定
義された領域、例えば動原体領域に関連付けられる。１
または複数のクラスターされた反復物は、染色体の相当
大きなフラクションを形成するとともに、ゲノムの１ま
たは複数の非標的領域を共有し、かつその結果本発明で
偉容された断片の不均一混合物から除去されるか、また
はそれらのハイブリダイゼーションの能力が無能力化さ
れるとしても、標的領域の染色の完全な均一性は可能で
はない。この状況は、標識された核酸断片の不均一混合
物を標的物質に結合することに関連して”実質的均一°
なる文言の使用によって理解される。
本発明に係る染色体−特異的染色は、標的物質に対して
配列特異的にハイブリダイズする核酸断片を使用するこ
とにより達成される。これらの配列はシングルコピーま
たは反復のいずれかであり、その中で反復のコピーが標
的区域において支配的に生じる。第４Ｈ図および後述の
セクション■で詳述した実験結果は、プローブがシング
ルコピー配列でつくることができることを示している。
しかしながら、第４Ｂ図のプローブのごときプローブに
おいては、低度コピー染色体−特異的反復［Ｎａｋａｗ
ｕｒａ　　ａｔ　　ａｌ、、ａｎｄ　　Ｂａｒｄｏｎｔ
　　ｅｔ　　ａＬ、、５ｕｐｒａｌコが同様にハイブリ
ダイゼーションに寄与する。
ゲノムの非標的領域に相補的な核酸断片、例えば共有反
復配列または非特異的配列がプローブ中に含まれる場合
には、それらの）＼イブリダイゼーシ曹ンが十分に無能
力化されるかそれらの行き渡りが十分におさえられるこ
とを必要とし、これにより十分な染色コントラストが得
られる。セクションＶおよび第４Ｈ図には、クローンの
プールを含むプローブによるハイブリダイゼーションの
例が示されており、同側においては各クローンは個々に
選択され、その結果シングルコピー配列または極低間コ
ピー反復配列にハイブリダイズする。
残りの図面には高度コピー反復配列にハイブリダイズし
た断片を含むプローブの使用例が示されているが、かか
る高度コピー反復配列は無能力化されたそのような配列
のハイブリダイゼーシ１ン能力を持っている。
本発明に係る核酸プローブは、ゲノムの標的部分にとっ
て十分に特異的である必要はない。同プローブは”染色
コントラスト”を形成しようと意図する。”コントラス
ト”はゲノムの標的部分の染色強度の、他の部分の染色
強度に対する比によって決定される。例えば、東１表に
示すごとき特定の染色体をクローニングすることにより
形成されるＤＮＡライブラリーは、全染色体を染色し得
るプローブとして使用できる。ライブラリーはその染色
体上でのみ発見される配列と、他の染色体と共有する配
列を含む。ヒトゲノムの単純化されたモデル（生命にと
ってほぼ真実）においては、約半分の染色体ＤＮＡは各
クラスに分かれる。全ライブラリーによるハイブリダイ
ゼー７日ンが結合座位の全てを飽和することができるな
らば、標的染色体は他の染色体の明度の２倍である（コ
ントラスト比２）。何故ならば、標的染色体はプローブ
における特異的配列および共有配列からのシグナルを含
み、これに対して他の染色体は共有配列からのシグナル
を有するにすぎないためである。従って、ブ。
−ブにおける共有配列のノ＼イブリダイゼーションを適
度に減少させることのみが、実質的にコントラストを高
める。非標的配列にのみハイブリダイズする汚染した配
列例えばライブラリー中の不純物は、同配列が染色コン
トラストを有効レベル以下には低下させない限度におい
て、プローブ中に許容できる。
実際には、標的座位の全てがノ＼イブリダイゼーション
により飽和されることはなく、多くの他のメカニズムが
染色コントラストを形成することに関与する。しかしな
がら、このモデルはゲノムの大きな部分を標的としたプ
ローブの使用におけるある一般的な考察を示している。
要求されるコントラストは、プローブが設計される適用
に依存する。染色体および核等を顕微鏡的に可視化する
場合、全染色体を同定するため４こはフントラスト比が
２またはそれ以上でたりる。
第４　Ｄ図−１４Ｆ図においては、コントラスＩ・比は
３−５である。標的領域の個々のセグメントが小さいほ
ど、非標的領域の染色における変動に関係する標的の確
実な認識を可能にするために、大きなコントラストが必
要となる。フロー　サイトメトリーまたは定量顕微鏡法
を使用する蛍光強度測定により、細胞核中に存在する標
的領域の量を定める場合、要求されるコントラスト比は
ゲノムにとって平均１／Ｔまたはそれ以上のオーダであ
る。ここで、Ｔは標的領域に含まれるゲノムのフラクシ
ョンである。コントラスト比が１／Ｔに等しい場合、全
蛍光強度の半分は標的領域からもたされ、他の半分はゲ
ノムの残りからもたらされる。例えば、約１０％のゲノ
ムからなる第１染色体のために高度コンブレキ／ティプ
ローブを使用する場合、要求されるコントラスト比は１
０のオーダであり、それは第１染色体にとってゲノムの
残りのコントラスト強度に等しい。
プローブによりゲノムの非標的領域に染色する背景は一
様ではない。第４Ｆ図は、第２１染色体特異的プローブ
が、他の末瑞動原体型ヒト染色体の動原体に隣接するフ
ン、＜クト領域に弱くノ１イブリタイズする、プローブ
断片を含んでいることを示している。この程度の非特異
性は、例示された適用における上記プローブの使用を妨
げな〜１゜他の適用のためには、これらの配列に結合す
るプロブ断片の除去、またはさらには同断片のノ＼イブ
リダイゼーション能力の無能力化が必要である。
他の適用にとっては、動原体に結合する反復配列、例え
ばアルファサテライト配列および／またはテロメアは染
色体−特異的染色試薬の役目をすることができる。その
中で、標的物質は幾らかのまたは多くの動原体および／
またはテロメアをゲノム中に、多分他の染色体領域とと
も↓こ包含している。かかる適用の典型は次のようなも
のである。
かかる適用において、染色試薬は染色体異常誘発物に起
因するランダムな構造的異常を検出するために設計され
、かかる銹発物は転座のごとき二動原体および他の構造
的異常性をもたらす。ゲノムにおける全動原体、例えば
第４Ｄ図の染色ｉ＜ターンの形成のために使用されるプ
ローブに結合する配列の添加は、二動原体と転座物質と
をより確実に識別することを可能とする。
本発明に係る染色試薬のゲノムに対する適用は、ゲノム
の標的領域にハイブリダイズしたプローブの実質的に均
一な分散をもたらす。結合プローブは、ゲノムの標的領
域が有効なコントラストに可視化できるならば、”実質
的に均一”であるものとみなされる。例えば、もし遺伝
子座の多くが細胞の多くの中で可視的であるならば、標
的物質が可視的に分離された遺伝子座の系統である場合
、同標的物質は実質的に均一に染色体される。
染色体ＤＮＡに相補的である核酸断片の塩基配列に関す
る”実質的部分−（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ　ｐｒｏｐ
ｏ口ｏｎｓ）とは、使用されるハイブリダイゼーション
条件のもとで核酸断片が染色体ＤＮＡと安定なハイブリ
ッドを形成するほど相補性が十分に広い範囲であること
を意味する。特に、かかる文言は、不均一混合物の核酸
断片が標的染色体物質に完全には相補的ではない配列の
ある領域を有している状況を包んでいる。厳格性（ｓｔ
ｒｉｎｇｅｎｃｙ）は、ハイブリダイゼーションのため
に要求された相補性の精度を制御することにより調整す
ることができる。
本明細書において′中期染色体”　（ｍｅｔａｐｈａｓ
ｅｃｈｒｏ園ＯＳＯ■ｅｓ）なる文言は、有糸分裂の中
期ステージで凝縮した染色体のみならず他の凝縮した染
色体、例えば未成熟（ｐｒｅ■ａｔｕｒｅ）染色体凝縮
により凝縮された染色体をも意味するものと定義される
。
核酸配列のハイブリダイゼーション能力を無能力化する
ことは、本明細書においてはときどき、゛核酸配列を無
能力化すること“と略して書かれる。
本発明に係る方法および試薬は診断的細胞遺伝学の分野
、特に診断的間期細胞遺伝学の分野において特に適した
適用を見いだす。癌のごとき疾病に関連する遺伝子再配
列を検出することは、本発明に係る染色体特異的試薬お
よび染色方法の特有の適用である。
隣接する遺伝子症候群は、本発明に係るプローブおよび
方法が同定できる遺伝子再配列の例である。隣接する遺
伝子症候群は多数のおよび／または減少したコピー数の
状態にある、密の間隔に保持された遺伝子の幾多の存在
により特徴付けられる。ダウン症候群は隣接する遺伝子
症候群の例であり、同症候群には幾多の遺伝子を含む染
色体領域の余分のコピーが存在する。
特に本明細書での記載内容は、ＣＭＬに関連するＢＣＲ
−ＡＢＬ融合物を形成する遺伝子再配列を検出するため
の染色体特異的試薬および方法の適用である。
かかる試薬は疾病特異的、この場合は腫瘍特異的プロー
ブの典型であり、同プローブは直接的および／または間
接的に標識でき、これにより標的染色体物質に結合した
とき可視化される。同標的染色体物質はＣＭＬの場合、
ＣＭＬに関連することで知られている染色体領域９ｑ３
４と２２ｑ１１の転座切断点領域の隣接部位である。本
明細書のセクション■に提供された例においては、プロ
ーブは標識されて、二重色の蛍光がインシトウ　ハイブ
リダイゼーションにおける前記プローブの染色パターン
に形成される［蛍光インシトゥ　ハイブリダイゼーショ
ン（ＦＩＳ１１）］。しかしながら、染色パターンは他
のタイプのシグナルと同様に多くの色で形成でき、その
標的物質に結合したプローブを合図する可視化手段は本
発明の方法に使用できる。
本明細書におけるセクシｌン■は、遺伝子再配列を検出
する本発明に係る典型的な方法および試薬を記述してい
る。セクション■の例は、ＣＭＬの特性を示すＢＣＲ−
ＡＢＬ融合体を形成する遺伝子再配列に関する。かかる
例への手引は第９および第２２染色体からのプローブを
伴うＦＩＳ１１を基礎とするもので、同染色体はＣＭＬ
　（第８図）の全てのケースに必須である融合したＢＣ
ＲとＡＢＬの側面に位置する。プローブは正常および異
常の両細胞の染色体物質にノ＼イブリダイズした場合、
第８図−第１２図に示すごとく異なる染色パターンを形
成する。かかる典型的なプローブにて形成された染色パ
ターンは、正常および異常細胞で異なる。染色パターン
の提供（ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｐｒｅｓ
ｅｎｔ）は、遺伝子再配列が生じると、遺伝子再配列を
含まない染色体物質にプローブをハイブリダイズするこ
とにより示された染色パターンの提供とは明確に変えら
れる。さらに、染色パターンは遺伝子再配列の−のタイ
プを他のタイプに対して明確に異ならせる。例えば、本
発明に係る核酸プローブのＡＬＬに接近した遺伝子再配
列を含む染色体物質への／％イブリダイゼーンヨンによ
り形成された染色パターンは、同プローブのＣＭＬの特
性を示すＢＣＲ−ＡＢＬを含む染色体物質へのハイブリ
ダイゼ−７ヨンにより形成された染色パターンとは明確
に異なる。従って、本発明に係る方法および試薬は類似
の疾患の差別診断を提供する。
セフフン■の実施例は、染色パターンにおける蛍光７グ
ナルのプロキンミテイに基づ＜　ＣＭＬの診断のために
提供するもので、融合物の存在を決定するために１ミク
ロンの切断点（ｃｕｔｏｆｆ　ｐｏｉｎｔ）をたよりと
する。シグナルのプロキシミティ距離は、遺伝子再配列
の存在を検出するために使用できるシグナルの、多くの
特性のうちの一特性にすぎない。さらに、プロキ７ミテ
ィ距離は、採用される特定の細胞調製技術および核のサ
イズに依存し、特定の細胞調製にとっては正常および異
常細胞における／グチル間の距離に比較的依存する。
セクシ璽ン■の実施例で例示された染色１＜ターンは、
プローブ方法の典型的な一タイプである。
多くの他のプローブ方法が採用できる。第１１図は遺伝
子再配列を検出するためのい（つかの他の典型的なプロ
ーブ方法を示しており、それらのパターンは特定の遺伝
子再配列を検出するために変更でき、最適化でき、かつ
他の状態に変形できる。
本発明に係る他の疾病特異的試薬は、ＣＭＬとしてセク
ション■で詳述した方法に類似する。例えば、急性リン
パ性白血病（ＡＬＬ）の診断と研究は、セクンヨン■の
ＢＣＲプローブ（ＰＥＭ１２）をＢＣ遺伝子の５°末端
からのプローブと置き換えることにより遂行される。Ａ
ＬＬは、Ｒｈ’染色体がその診断において最も一般の細
胞遺伝的異常性である故特に興味があり、かかる染色体
の存在が非常に攻撃的新生物（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ　
ｎｅｏｐｌａｓ＋＋）の存在を表示する。
本明細書、特にセクンヨン■にて例示された方法および
試薬は、細胞遺伝学的には類似するが遺伝学的には異な
る疾病を識別する手段として提供される。特定の状況に
おける”細胞遺伝的”とは、慣用のバンド分析により確
定された類似性に関係する。ＣＭＬおよびＡＬＬはこの
ような状況のもとでは、それぞれを関連させる切断点が
ヒト遺伝子においては互いに密接している故に、慣用的
ｔ４ンド分析ではそれらを識別できず、細胞遺伝学的に
類似する。
さらに、本発明は遺伝子疾患の分子ベースの研究のため
の細胞遺伝学的探査形式に使用できる方法および試薬を
提供する。例えば、人のカリオタイブにおける異常が慣
用のバンド分析により示された場合、本発明に係るプロ
ーブおよび試薬が同異常の隣接部分における遺伝子再配
列を検出するために使用できる。異常の根底をなす分子
ベースは本発明に係る方法および試薬により確定でき、
遺伝子レベルでもたらされる差異は異なる処置を示唆し
、かつ予知的に重要である。根底をなす遺伝子再配列は
、人における表現型特性のセットに関連して矛盾なく発
見される。
次のセクンッンは本発明に係る染色組成物を調製すると
ともに使用する実施例を提供するが、それは単に例示の
目的のためであって本発明を限定する意味ではない。
次の略語が使用される。
（以下余白） ＢＮ ＡＰ　Ｉ Ｃ３ ＡＦ ＤＴＡ ＡＣＳ ＩＴＣ ＮＰ−４０ ＭＳＦ ＮＰ−４０を伴うビカーボネート緩衝液４．６−ジアジ
ジノ−２−フエニルインドールフルオロセインーアビデ
インＤＣＳ　（フルオロセインＡｖｉｄａｎ　Ｄの商業
的に入手できるセルツータグレイド〉 Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチル−アミノフルオレン エチレンジアミンテトラアセテート フルオロセインーアクチベイティド　セル　ソーティン
グ フルオロセイン　インチオシアネート 分離緩衝液 Ｓｉｇｍａ　ａｓ　Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０（Ｓｔ、
Ｌｏｕｉｓ。
ＭＯ）から商業的に入手できる非イオン界面活性剤 フォスフェードーブアファード　サリンブロビジウム　
アイオダイド フェニルメチルスルフォニル　フルオ ライド ＰＮ緩 新液 ＰＮＭ緩 新液 ＤＳ ＳＣ ０，１Ｍ　ＮａＨ２ＰＯ４と０．　ＩＭＮａａＨＰＯａ
の混合物ｐＨ８；　　０．１％ＮＰ−４０ 非脂肪ドライミルク（遠心分離）を伴 うＰｎ緩衝液；　　０．０２％Ｎａアジドソジウム　ド
デシルサルフェート ０．１５Ｍ　ＮａＣ１１０，０１５Ｍ　Ｎａサイ　トレ
ード。
Ｈ７ ＮＴＲ 可変数タンデム反復（ｖａｒｉａｂｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ
ｔａｎｄｅｍ　　ｒｅｐｅａｔ） （以下余白） （実施例） 本発明に係る組成物を調製する好ましい第１ステツプは
、染色体−特異的ＤＮＡを分離することである。　にの
文言は上記したごとく標的−特異的および／または領域
−特異的ＤＮＡを包含するもので、その特異性はＤＮＡ
の起源に起因する）。同ステップは第１に、染色組成物
が導がれる十分な量の特定の染色体タイプまたは染色体
サブリジョンを分離すること、その後分離された染色体
または染色体サブリジジンからＤＮＡを抽出すること含
む。ここで”十分な量”とは本方法のその後のステップ
を遂行するに十分な量のことを意味する。好ましくは、
抽出されたＤＮＡは標準的栓遺伝子工学技術を用いてク
ローニングすることによりＤＮＡインサートを形成する
ために使用される。
好ましいクローニングベクターは、限定はされないけれ
ども酵母人工染色体（ＹＡＣＳ）、プラスミド・バクテ
リオファージおよびコスミドを含む。好ましいプラスミ
ドはブルースクライブプラスミドである。好ましいバク
テリオ　ファージはラムダインサーンジン　ベクターで
あり、より好ましくはカロン４Ａ（Ｃｈａｒｏｎ　４Ａ
）、カロン２１＾（Ｃｈａｒｏｎ　２１Ａ）、カロン３
５（Ｃｈａｒｏｎ　３５）、カロン４０（Ｃｈａｒｏｎ
　４０）およびＧＥＭＩＩである。好ましいコスミドは
ロウリスト４（Ｌａｗｒｉｓｔ４）、ロウリスト５（Ｌ
ａｖｒｉｓｔ５）および５ｃｏｓｌを含む。
上記したごとく、ＤＮＡはいくつかの源から分離できる
。染色体−特異的染色試薬は本発明により植物および動
物両者のＤＮＡから調製できる。動物ＤＮＡの重要な源
は哺乳動物特に霊長類またはゲ、シ動物であり、その中
では霊長類の源は特にヒトおよびモンキーであり、ゲッ
シ動物の源は特にラットまたはマウスであり、特にマウ
スである。
１、　　　　　　　ｅｎＮｒｅ　　ｃｈｒｏｍｏｓｏｍ
ｅがらＤＮＡ　を１１工ｊ匹」工特定の全染色体（ｗｈ
ｏｌｅｃｈｒｏ諷ｏｓｏ■ｅ）（特異的染色体タイプ）
を分離するための好ましい手段は、インタースペシフノ
ク　ハイブリッドセル　システムを使用するか否かにか
かわらず、中期染色体のダイレクト　フロー　ソーティ
ング（フルオロセンス−アクティベイティド　セルソー
ティング）による手段である。ある種にとって、全ての
染色体は慣用の有効なソーティング技術により分離でき
る。全てではないが、多くのヒト染色体は一般にフロー
　ソーティングによりヒト細胞から分離できるｏ　　［
Ｃａｒｒａｎｏ　ｅｔ　ａｌ”Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ
　ａｎｄ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｈｕｍａ
ｎＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　ｂｙ　Ｐｌｏｗ　Ｃｙｔｏ
ａｅｔｒｙ　ａｎｄ　Ｓｏｒｔｉｎｇ。
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ、７
Ｓ、ｐｐ、１３Ｂ２−１３８４（１９７９）］。従って
、ヒト染色体の分離にはヒト／ゲラン動物ハイブリッド
　セル　システムが必要であるｏ　　　［Ｋａｏ、”Ｓ
ｏｍａｔｉｃ　　Ｃｅ１ｌ　　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　ａ
ｎｄ　　ＧｅｎｅＭａｐｐｉｎｇ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉ
ｏｎａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　Ｃｔｏｌ。
Ｖｏｌ、ａ５．ｐｐ、１Ｑ９−１４６（ｌＨ３）、Ｇｕ
ｓｅ１１ａ　ｅｔ　ａｌ＋ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ
　Ｌｏｃａｌｔｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＤＮＡ　Ｓｅｇｍ
ｅｎｔｓｆｒｏｍ　　５ｐｅｃｉｆｉｃ　　Ｈｕｍａｎ
　　Ｃｈｒｏ＋ａｏｓｏｍｅｓ、”　　Ｉ’ｒｏｃＮａ
ｔ１．Ａｃａｄ、　Ｓｃ１．、Ｖｏｌ、７７、Ｇ＋ｐ、
２８２９−２８３３（１９８０川を参照。染色体ソーテ
ィングは商業的に入手できるフルオルセン−アクティベ
イティド　ソーティングマシン、例エハベクトン　ディ
キンソンＦＡＣＳ−ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ　Ｄｌｃｋｉｎ
ｓｏｎ　ＦＡＣＳ−ＩＩ）、カウルター　エヒンス　■
　ソータ（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｐｉｃｓ　Ｖ　５ｏｒｔ
ｅｒ）、または染色体ソーティングに活用できる特殊目
的のソーターまたはこれに類似する機器により行われる
。
ＤＮＡは分離された染色体から、例えばマームル等の標
準技術により抽出される。　［Ｍａｒｍａｒ、”ＡＰｒ
ｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎ
　ｏｆ　Ｄｅｏｘｉｙ−ｒｉｂｏｎｕｅｌｅｉｃ　Ａｃ
１ｄ　ｆｒｏｍ　Ｍｉｃｒｏ−Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ、−
Ｊ。
ＭＯｌＢｉｏ１１、Ｖｏｌ、　３．　ｐｐ、　２０Ｂ−
２１８（１９６１）　；Ｍａｎ　ｉａｔ　ｉｓ　ｅｔａ
ｌ、、Ｍｏ１ｅｅｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒ
ｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８
２）ｐｐ、２８０−２８１コ。これらの引用文献はＤＮ
Ａ分離技術の叙述のために参考文献として取り入れられ
る。
分離された染色体−特異的１）ＮＡからのインサー！・
ライブラリーの世代は、例えば下記に文献に示す標準的
遺伝子工学技術を使用することにより遂行される。［Ｄ
ａｖｔｅｓ　ｅｔ　ａｌ、、”ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　
ａｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ　　Ｇｅｎｏｍｉｃ　
　［，１ｂｒａｒｙ　　ｏｆ　　ｔｈｅ　　ｌ＋ｕｉａ
ｎＸ　　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ　　Ａｆｔｅｒ　　ｂｙ
　　ｆｌｏｗ　　Ｃｙｔｏ＋ｅａｔｒｙＮａｔｕｒｅ、
Ｖｏｌ、２９３．ｐｐ、３７４−３７６（１９８１）［
ｒｕｍｌａｕｆ　　ｅｔａｌ、　　−Ｃｏｎｓｔｒｕｃ
ｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉ
ｏｎ　　ｏｆＧｅｎｏｍｌｃ　　１ｉｂｒａｒｉｅｓ　
　ｆｒｏ＋ｅ　　５ｐｅｃｉｆｉｃ　　ＨｕｍａｎＣｈ
ｒｏｍｏｓｏｍｅｓ　　”Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ　　
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｖｏｌ、７９．ｐｐ。
２９７１−２９７５＜１９１！２）；Ｌａｗｎ　　ａｔ
　　ａｌ、、”Ｔｈｅ　　ｌ５ｏｌａｔｉｏｎａｎｄ　
　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｌｉ
ｎｋｅｄ　　Ｄｅｌｔａ−ａｎｄ−Ｂｅｔａ−Ｇｌｏｂ
ｉｎ　　Ｃａｎｅｓ　　ｆｒｏｙｇ　　ａ　　Ｃ１ｏｎ
ｅｄ　　Ｌｉｂｒａｌｙ　　ｏｆＨｕ＋Ｉａｎ　　ＤＮ
Ａ、＋　　Ｃｅ１１．Ｖｏｌ、１５．ｐｐ、１１５７−
１１７４（１９７４）ａｎｄ　　Ｍａｎｉａｔｉｓ　　
ｅｔ　　ａｌ、、”Ｍｏ　　ｅｃｕｌａｒ　　Ｃ１ｏｎ
ｉｎ　　：ＡＬａｂｏｒａｔｒｉ　　　Ｍａｎｕａｌ、
−（Ｃｏｌｄ　　Ｓｒｉｎｇ　　Ｉ（ａｒｂｏｒＬａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ　　、１９８２）、ｐｌ）、２５６−３
０８：Ｖａｎ　　Ｄｉ１１ａ　　ｅｔａｌ、　　ｉｄ；
Ｆｕｓｃｏｅ　　（ｉｅｎｅ、５２：２９１（１９８７
）；ａｎｄ　　Ｆｕｓｃｏｅｅｔ　　ａｌ、、ｃ　　ｔ
ｏ　　ｅｎｅｔ、ｃｅ１１　　Ｇｅｎｅｔ、、４３ニア
９（１９８６）。
れらの文献は参考文献として本明細書に取り入れられる
。
ヒト染色体のそれぞれのための組換えＤＮＡライブラリ
ーは、ナシｌナル　ラボラトリ−ゲン　ライブラリー　
プロジェクト（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　ＧｅｎｅＬｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｏｊｅｃｔ　）によ
って考案され、アメリカン　タイプ　カルチャー　コレ
クンヨン（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）から入手テキル。
［Ｖａｎ　Ｄｉ１１ａ　ａｔ　ａｌ、、　Ｂｉｏｔａｃ
ｎｏｌｏｇｙ、４：５３７（１９８６）、　］。］小イ
ンサートー含有ライブラリーｓＩＩａ１１　　ｉｎｓｅ
ｒｔ−ｃｏｎｔｅｉｎｉｇ　　１ｉｂｒａｒｉｅｓ）は
、　　ＨｉｎｄｍまたはＥｃｏＲＩを伴うフローソート
されたヒト染色体ゲノムＤＮＡの完全なダイジェンヨン
により構成され、ラムダ　インサー／Ｗン　ベクター　
カロン２ＬＡにてクローニングされる。ベクターは９．
　ｌｋｂのサイズまでのヒトインサートを受入れること
ができる。従って、９．１ｋｂより大きいＢｉｎｄｎｌ
　（またはＥｃｏＲＩ）制［１ｉ−は、これらのライブ
ラリーから取り戻すことができない。これらのラボラト
リ−における観測された平均挿入サイズは約４ｋｂであ
る。ＨｉｎｄＩ［［染色体−特異的ライブラリーとそれ
らのＡＴＣＣ登録番号を伴う代表的リストが第１表に示
される。
第し！！（その１ Ｓ１１５３ ７７５４ ７７４４ ７７５１ ７７００ ７７４５ ７７４６ ７７０１ ７７５５ １１０２ ７７０３ ５７）３６ ５７フ０４ ７７５６ ７７０５ ７７５７ ） ＬＬＯＩＮＳＤＩ ＬＬＯＩＮＳＯ２ ＬＬ０２ＮＳＯＬ ＬＬ０３ＮＳＯＩ ＬＬ０４ＮＳＯＩ ＬＬ０４ＮＳＯ２ ＬＬＯ５ＮＳＯＩ ＬＬ０６ＮＳＯＩ ＬＬＯＹＮＳＯＩ ＬＬ０８ＮＳＯ２ ＬＬ０９ＮＳＯＩ ＬＬＩＯＮＳＯＩ ＬＬＩＩＮＳＯＩ ＬＬ１２ＮＳＯＩ ＬＬ１３ＮＳＯＩ ＬＬ１３ＮＳＯ２ の２） ＡＴＣＣ＃ ５７７θ６ １７７０７ ７７３７ ７７５８ ７７５９ ７７１０ ７７１１ ７７１２ ７７１３ ７７１４ ７７４７ ７７１５ ライブラリー ＬＬ１４ＮＳＯＩ ＬＬ９９ＮＳＯＩ ＬＬ１５ＮＳＯＩ ＬＬ１６ＮＳＯ３ ＬＬ１７ＮＳＯ２ ＬＬ１８ＮＳＯＩ ＬＬ１９ＮＳＯＩ ＬＬ２ＯＮＳＱＩ ＬＬ２１ＮＳＯ２ ＬＬ２２ＮＳＯＩ ＬＬＯＸＮＳＯＩ ＬＬＯＹＮＳＯＩ （以下余 白） 選別された染色体タイプから抽出されたＤＮＡは、ベク
ター中で同ＤＩＩＡをクローニングするよりはむしろポ
リメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるか、または同ＤＮＡ
を細胞系で増殖することにより増幅できる。
ＰＣＨの調整においては、抽出されたＤＮＡに適当なフ
ァージの尾部が添加される。かかるＰＣＲの手法に関連
した事項が後述のセクションＩＢで述べられている。
ハイブリッドセルから所望の配列を分離する他の実行で
きる方法は、７ユメツクペーパ＜Ｓｃｂｍｅｃｋｐｅｐ
ｅｒ＞等の下記の方法を含む。
［Ｓｃｈｍｅｃｐｅｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、−Ｐａｒｔ
ｉａｌ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ　Ｃｈａｒｃ
ｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ　ＤＮＡ　ｆｒｏＩＩ）Ｉｕ
ｍａｎ　ＸＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅ、　”Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　Ｖｏｌ、　７６、
　ｐｐ。
６５２５−６５２８（１９７９）；Ｑｌｓｅｎ　ｅｔ　
ａｌ、、ｓｕｐｒａ（ｉｎＢａｃｋｇｒｏｕｎｄ　）。
それ故、これらの文献は参考文献として取入れらでいる
。
２、　　　　の−からＤＮＡを　　すること　領域−特
異的染色体ＤＮＡを分離するのに使用できる方法には、
下記の方法が含まれる。前もってマツプ化されたＤＮＡ
、例えばマツプ化されたコスミドのライブラリーからの
適宜の染色体領域の選択：例えばＦＡＣＳによる誘導染
色体のソーティング：選択された染色体の微視的解体二
　減ハイブリダイゼーション；所望の染色体断片を含み
、ＤＮＡを抽出するとともに増幅し、かつ所望の増幅さ
れたＤＮＡを選択する適宜のハイブリッドセルの同定：
　放射線ハイブリッドからの適宜の染色体物質の選択。
サブセクシ目ン１．Ａ、１で概略的に記載した標準的遺
伝子工学技術は、本技術分野の周知の手法で使用される
。
領域−特異的ＤＮＡの増幅は、適宜のベクターでクロー
ニングすることにより、適宜の細胞系で増殖することよ
り、および／またはＰＣＲの使用により遂行できる（後
述の！Ｂを参照）。
染色体領域−特異的ＤＮＡを分離する好ましい方法は、
長いＤＮＡ配列のライブラリーをプローブするマツプ化
された短いＤＮＡ配列を使用することであり、長いＤＮ
Ａ配列のライブラリーは通常異なるベクターでクローン
化される。例えば、プラスミドでクローン化されたプロ
ーブは、コスミドまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）ライ
ブラリーをプローブするために使用できる。イニシャル
　シード　プローブ（ｉｎＨｌａｌ　５ｅｅｄ　ｐｒｏ
ｂｅ）を使用することにより、より長いインサートライ
ブラリーにおける重複クローンを見いだすことができ（
”ウオーキング（ｗａｌｋｉｎ１１）とよばれる方法）
、より高度なコンプレキシティ　プローブはシードプロ
ーブを取り巻く染色体領域の確実な染色を形成できる。
結局、種のための全ゲノムがマツプ化されるとく例えば
ヒト種のためにヒユーマン　ゲノム　プロジェクトによ
り）、種の全ゲノムのために配列されたクローンが有効
である。その後、所望の特異性プローブを形成するため
に、適宜クローンを容易に選択できる。
染色体の１または複数の領域（または全染色体）からＤ
ＮＡを分離する他の方法は、適宜の細胞系（例えば、ヒ
ト／ハムメタ　）＼イブリッド　セルのごときハイブリ
ッド細胞系）において、かかる染色体の１または複数の
領域を増殖し、細胞系からＤＮＡを抽出し、それを適宜
のベクターでクローン化し、かっライブラリーを形成す
るためにヒトＤＮＡを含むクローンを選択することであ
る。ノ＼イブリ１．ドセルが使用される場合、ヒト染色
体物質を含むノ＼イブリ、ド中の染色体はクローニング
する以前に、ライブラリー中でヒトクローンの頻度を増
大するためにフロー　ソーティング（ＦＡＣＳ）により
分離される。なおさらに、第６図に例示するごとく、ノ
ーイブリッドからの全てのＤＮＡは分離でき、さらにク
ローニングすることな１１１ｍ化でき、かつプローブと
して使用できる。
３．１ｔｔＸユニ１゜あるケースにおいては、不均一混
合物の核酸断片は一重＠　ＲＮＡまたはＤＮＡからなる
ことが好ましい。ある条件のもとでは、重鎮核酸プロー
ブの結合効率（ｂｉｎｄｉｎｇｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）
は例えばコックス等の下記の文献に１−めされているよ
うに、インシトウ　ノ＼イブリダイゼーンヲンの間によ
り高（なることが発見された。
［ＣＯＸ　　ｅｔａ１１−Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　　ｏｆ
　　ｍＲＮＡ５　　ｉｎ　　５ｅａＵｒｃｈｉｎ　Ｅｍ
ｂｒｙｏｓ　ｂｙ　Ｉｎ　５ｉｔｕ　Ｈｙｂｒｔｄｌｚ
ａｔｉｏｎυｓｉｎｇ　　Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｅ　　Ｒ
ＮＡ　　Ｐｒｏ？＋ｅｓ、−Ｄｅｖｅｌｏ　　ｍｅｎｔ
ａｌＶｏｌ、１０１．ｐｐ、４８５−５０２（１９１１
４）］。
れたＤＮＡ断片からＲＮＡ断片を生み出すため準的な方
法が使用される。例えば文献［Ｃｅ１ｌ、　Ｖｏｌ、　
３２．　ｐｐ、　ａ１１−６９４（１９８３）］　にて
記述されているグリーン等により発展された方法は、プ
ロメガバイオチック（Ｐｒｏｍｅｇａ　Ｂｌｏｔｅｃ）
　［Ｍａｄｌｓｏｎ、Ｗ１１から商品名°リボプローブ
（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ）として商業的に入手できる。本
発明とともに使用する好ましい他の転写キットは、商品
名”ジェネスクライブ（Ｇｅｎａ＠ｅｒ　１ｂａ）とし
てユナイテイ、ド　ステイト　／＜イオケミカル　コー
ポレイシ瑳ン（クレベランド。
ＯＨ）　　　（Ｕｎｉｔｅｄ　　５ｔａｔｅｓ　　　Ｂ
ｉｏｃｈａｇ＋１ｃａｌ　　　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ
）　力）ら入手できる。一重鎖１）＋１八プローブは一
重鎖ノくクテリ　オファージＭ１３にて形成することが
でき、例えばベセスダ　リサーチ　ラボラトリ−（ガイ
サー、＜−グ、　　ＭＤ）　　（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（Ｏ
ａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、　ＭＤ）等のキットホームの状
暢で入手できる。箪４図に示すハイブリダイゼーション
は、ブルースクライブ　プラスミド　ベクター（ストラ
タジェン、　ラ　ジ１う＋　　ンーエー）　（Ｓｔｒａ
ｔａｚｅｎｅＬａ　Ｊｏ１１ａ、ＣＡ　）中でサブクロ
ーンされた第１表のライブラリーで遂行された。ブルー
スクライブ　プラスミドはＲＮＡプロモータを含み、同
ＲＮＡは一重鎖ブローブの形成を可能とする。
後述のセクンッン■、は非自己相補的一重鎖核酸クロー
ンを調製し、かつ適用する方法を提供する。
同プローブはプローブの非特異的および不適当な結合を
減すことにより、インントウ　ハイブリダイゼーション
で達成し得るシグナル／ノイズ比を改良する。さらに、
かかるセクションは二重鎖標的核酸を変性する方法を提
供する。同二重鎖標的核酸はハイブリダイゼーションに
有効な一重鎖領域を最小にし、プローブ配列に非相補的
である。簡単にいえば、プローブはＤＮＡを、ＤＮＡポ
リメラーゼのための鋳型／ブライマーを形成する制限酵
素とエキソヌクレアーゼとで処理することにより構成さ
れる。ダイジェストされた鎖は標識されたヌクレオンド
　トリホスフェート前駆体の存在のもとでで再合成され
、標識された一重鎖断片はプローブを形成するために再
合成された断片から分離される。標的核酸は、プローブ
を構成するために使用したものと同様の制限酵素で処理
され、かつプローブの適用以前にエキソヌクレアーゼで
処理される。
１、Ｂ、ＰＣＲ 本発明に係るプローブを形成する他の方法は、ポリメラ
ーゼ鎖反応［ＰＣＲ］の使用を含む。　［ＰＣＨのメカ
ニックの説明として、”５ａｌｋｉ　ｅｔ　ａｌ、、５
ｃｉｅｎｓｅ　２３０：１３５０（１９８５）”、”Ｕ
ＳＰ　Ｎｏｓ、　４．６８３．１９５．４．６８３，２
０２（１９８７，７，２４）、４．８００．、第５９（
１９８９，１，２４）”］。
上記したごとく、分離された標的−特異的核酸配列はＰ
ＣＨによって増幅でき、反復配列の少ないまたは皆無で
ある標的−特異的配列を形成する。かかる手法に使用さ
れたＰＣＲブライマーは、反復配列の末端のためのもの
であり、反復物によりフランクされた配列の増幅をもた
らす。
第７図はＴ’ＣＲを使用するかかる方法を示しており、
かかる方法において典型的な反復配列はＡｌｕである。
ショート　　セグメントのみが増幅される場合には、そ
のような配列は他の反復物を含まないものと思われ、従
って反復配列の減少されたＤＮＡを提供する。
それはさらに、相補的配列の前記反復配列に対する最初
のハイブリダイジングにより、かかるＰＣＢ手法におけ
る反復配列の形成を抑制でき、かかる手法において前記
相補的配列は非相補的フランキン　グエンド（ｆｌａｎ
ｋｉｎｇ　ｅｎｄ）を拡張するか、またはポリメラーゼ
によって拡張を許さないヌクレオチドにターミネートさ
れる。ブロッキング配列の非相補的末端は、ＰＣＲプロ
セスの間ブロッキング配列をＰＣＲブライマーとして機
能することから抑制する。
亙 本発明に係るプローブは典型的には、以下の幾多のステ
ップにより形成される。ゲノムの標的領域に相補的であ
る核酸配列源を得るステップ。同配列が標的物質に能率
的にハイブリダイズしかつそれらが結合した後検出し得
るように、同配列を１１ｍＬまたはその他の処理を行う
ステップ。ノ＼イブリダイゼーシヲン能力を無能力化し
または共有反復配列の十分な量を除去し、またはかかる
配列を無能力化しかつ除去すべく同配列を処理するステ
ップ。これらのステップの順序は、採用される特定の方
法に依存する。
共有反復配列の除去、および／またはかかる反復配列の
ハイブリダイゼーション能力の無能力化をおこなうには
、次の方法が使用できる。これらの方法は典型的なもの
であって、当業者の周知の手法で模式的に説明されてお
り、かつこれらの方法は当業者の周知のパラメータおよ
び手法に応じて変更および拡張できる。
１、　シングル−コピー　プローブ。シングル−コピプ
ローブは、ゲノムの標的領域に含まれるシングルフピー
配列に相補的である核酸断片からなりたっている。かか
るプローブを構成する一方法は、標的領域をクローニン
グにより形成されたＤＮＡライブラリーで始めることで
ある。ライブラリーにおけるクローンの中には、全配列
がシングル−コピーであるＤＮＡを含むであろうし、他
のものは反復配列を含むであろうし、またさらに他のも
のはシングル−コピー配列および反復配列の部分を持つ
であろう。個々のクローンによる選択、およびシングル
−コピー配列のみを含んでいるこれらのクローンのプー
リングは、標的領域に特異的にハイブリダイズするプロ
ーブをもたらす。クローンのシングル−コピーの性質は
最終的には、標準技術を使用するサザンハイプリダイゼ
ー７！Ｉンにより確認される。
第４Ｈ図は、第４染色体ライブラリーからこの方法で選
択された１２０クローンによるハイブリダイゼーション
を示す。
サザン法分析は非常に時間を消費し、かつ緊張する労働
である。それ故、完全ではないにしても、候補的（ｃａ
ｎｄｉｄａｔｅ）シングル−コピー　クローンを得るた
めのより効率的なスクリーニング方法が有用である。セ
クシ貫ンＶ、Ｂ、においては、改良された方法の実施例
は反復ＤＮＡの存在のために、個体ファージおよびプラ
スミド　クローンをスクリーニングするために提供され
、それはゲノムＤＮＡによるハイブリダイゼータ１ンを
使用するものである。プラスミド　クローンのスクリー
ニングはより効率的であり、選択されたクローンの約８
０％がシングル−コピー配列のみを含んでいる。残りは
低度コピー反復物である。しかしながら、かかる方法で
調製されたプローブは十分な染色コントラストを形成で
き、低度コピー反復配列がプローブ中に許容できること
を示している（当セクションのサブセクション３を参照
）。
クローン手法によるクローンの不利益は、クローンが含
んでいる配列の一部がたとえ反復配列であるとはいえ、
同クローンが捨てられるということである。クローン化
された核酸の長さが長いほど、同核酸が反復配列を含む
機会は多くなる。それ故、核酸が大きなインサート例え
ばコスミド、ＹＡＣ等を含むベクター中で、またはハイ
ブリッドセルのごとき細胞系で増殖される場合には、シ
ングル−コピー選択が行われる以前に同核酸を小さな断
片にサブクローンすることが有利である。上記した選択
手法は共有反復配列と特異的反復配列とを区別するもの
ではない。いずれか一方のタイプの検出可能な反復配列
を伴うクローンは、プローブには使用されない。
２、ハイブー　イゼーショツ　　の　　　　　核酸のピ
ース、例えばクローンのハイブリダイゼーション特異性
は、インシトゥ　ハイブリダイゼーションにより試験で
きる。適宜のハイブリダイゼーション条件のもとで、上
記ピースが所望の標的領域としての特異的なシングル−
コピーまたは反復配列に結合するならば、同ピースはプ
ローブに包含できる。染色体−特異的反復配列［Ｔｒａ
ｓｋ　ｅｔ　ａｌｕ上■、（１９ｇり　ａｎｄ　ｒｅｆ
ｅｒｅｎｃｅｓ　ｔｈｅｒｅｉｎ］、　　ＶＮＴＲｓ多
数のマツプ化されたシングルコピー配列等のごとく、特
異的ハイブリダイゼーション特性を持っている多くの配
列がすでに知られている。もっと多くのものが連続的に
マツプ化されている。かかる配列は本発明のプローブに
包含できる。
３　、　　　　　　　　Ｂｕｌｋ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ
ｓ　　　ヒトゲノムのごと（多くのゲノムにおいて、共
有反復ＤＮＡの主要部分はＡｌｕのごとき高度に反復さ
れた配列の若干のファミリーに含まれている。このよう
な高度コピー反復配列を実質的に含んでいないプローブ
は、多くの適用において有効な染色コントラストを形成
するであろう。かかるプローブは核酸配列のある源、例
えば策１表のライブラリーから比較的簡単な集団固定法
で形成できる。それ故、かかる集団固定法はかかる適用
にとって好ましい方法である。
これらの方法は先づ第１に、相補的核酸鎖の濃度が増加
するほど開鎖のハイブリダイゼーション率が増加すると
いう事実を促進する。従って、核酸断片の不均一混合物
がハイブリダイゼーションを許容する条件のもとで変性
されかつインキュベイ！・される場合には、高濃度で存
在する配列は他の場合に比較してより早く二重鎖になる
であろう。
二重鎖核酸はその後除去され、残りのものがプローブと
して使用できる。部分的にハイブリダイズした混合物は
プローブとして使用できるが、二重鎖配列は標的物質に
結合し得ない。次の方法は本発明に係る標的−特異的染
色を形成するのに有効な集団固定法の典型的な方法であ
る。
３ａ、プローブの　　　　　。ハイブリダイゼーション
混合物における二重鎖プローブ核酸は変性され、その後
ハイブリダイゼーション条件のもとで高度コピー配列の
ための十分な時間プローブ中でインキュベイトされて、
実質的に二重鎖配列となる。ハイブリダイゼーション混
合物はその後サンプルに適用される。高度に反復された
配列の残留している標識された一重鎖コピーは、サンプ
ルのいたるところに結合し、弱くかつ幅広く分散された
シグナルを形成する。ゲノムの標的領域のための特異的
な低度コピー配列の多様な結合は、容易に識別し得る特
異的シグナルを形成する。
かかる方法は、染色体のプローブとして第４染色体およ
び第２１染色体（ｐＢＳ４とｐＢｓ２１）のための、染
色体−特異的ライブラリーを用いた後述のセクシジ７　
Ｍｌ　、Ｈに例示されているｏ　　［Ｐｊｎｋｅｌ　ｅ
ｔ　ａｌ。
ＰＮＡｓ　（ＵＳＡ）　８５：９１３８−９１４２　（
Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　１９８８）　］。
１１−１Ｏｎ／ｕｌの範囲のプローブ濃度を含んでいる
ハイブリダイゼーション混合物はサンプルに適用される
以前に、プローブを変性するために加熱されがつ３７℃
で２４時間インキコベイトされた。
３ｂ、ブロッキング　　の　　　ハイブリダイゼーンヨ
ン混合物には、ハイブリダイゼーション能力を抑制する
ことが望まれる配列と相補的である標識されない核酸配
列が添加される。必要によりプローブおよびブロッキン
グ核酸は変性され、また適宜のハイブリダイゼーション
条件もとてインキュベイトされる。ブロックされるべき
配列は他のものより早く二重鎖配列になるため、ハイブ
リダイゼーンヨン混合物が標的物質に適用される場合に
は同標的物質に結合することはできない。あるケースに
おいては、ブロッキング反応はインキュベイト期間が極
めて短縮できるほど早く生じ、ハイブリダイゼーション
混合物が変性後直ちに標的物質に適用される場合には十
分な結果が得られる。ブロッキング方法は一般にシーリ
イ等により下記の文献に記述され、かかる文献は参考文
献として取り入れられる。　［５ｅａｌｙ　ｅｔ　ａｌ
　、Ｒｅｍｏｖａｌｏｆ　Ｒｅｐｅａｔ　５ｅｑｕｅｎ
ｃｅ　ｆｏｒｍ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｐｒｏｂ
ｅｓ−、Ｎｕｅｌａｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ
、１３：１９０５（１９８５）］。
ブロッキング核酸の実施例はゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮ
Ａの高度コピーフラクシ讐ンおよび下記（ｉ−ｉｉｌ）
に概略的に示したごとく特定の配列を含んでいる。
３ｂ、ｉ、ゲノムＤ　ＮＡ、　　ゲノムＤＮＡは生物の
核酸配列の全てを、それらのゲノムにおけるコピー数に
比例して含む。従って、ゲノムＤＮＡをハイブリダイゼ
ーション混合物に添加することは、高度コピー反復配列
の濃度を低度配列より増加し、それ故前者をブロッキン
グするのにより効果的である。しかしながら、ゲノムＤ
ＮＡは標的物質に対して特異的である配列のコピーを含
み、同ゲノムＤＮＡがあマリニも多（添加される場合に
は所望の染色体−特異的結合を減少するであろう。添加
すべきゲノムＤＮＡ量を決定するガイドライン（後述の
３　ｅ項のＱの概念を参照）、およびゲノム　ブロッキ
ングＤＮＡを使用スる実施例は下記に提供される。ゲノ
ムＤＮＡのブロッキング効果性はある条件のもとでは、
そのハイブリダイゼーション混合物への添加タイミング
の調整により高めることができる。ががるタイミング調
整の実施例は、後述の第４Ｂ図〜第４Ｅ図（プロトコル
Ｉ）および第４Ｆ図（プロトコル■）に示されたプロト
コルＩおよびプロトコル■　ハイブリダイゼーションで
提供され、またセクシｌン■に詳述されている。
３、ｉｉ、ゲノムＤＮＡの　　コピー　フラクション。
ゲノムＤＮＡの使用での難しさは、同ゲノムＤＮＡもま
た低ｔコピー配列のハイブリダイゼーションをブロック
することであり、かかるブロックは所望の標的染色を与
える配列に対して支配的である。従って、単に高度コピ
ー配列のみを得るためにゲノムＤＮＡを分別すること、
およびこれらをブロッキングに使用することはこの困難
性を克服する。かかる分別は例えば、後述（３ｃ、　ｉ
、）するごとくハイドロオキシアパタイトで行うことが
できる。
３ｂ、ｌｉｉ、ａニブローブにおける特定の配列のブロ
ッキングは、同配列の標識されないコピーを多く添加す
ることにより成し遂げられる。
例えば、プローブにおける＾Ｉｕ配列は、クローン化さ
れたＡｌｕを添加することによりブロックできる。
ヒトゲノムにおける最高度コピー配列を含んでいるわず
かなりローンの混合物から調製されたブロッキングＤＮ
Ａは、染色体−特異的ライブラリー例えば第１表のライ
ブラリーとともに効果的に使用できる。ｌまたは複数の
染色体−特異的ライブラリーからの標識されない核酸配
列は、１または複数の他の染色体−特異的ライブラリー
からの標識された配列を含んでいるプローブをブロック
するのに使用できる。共有配列はブロックされ、標的染
色体上にのみ存在する配列は影響されない。第４Ｆ図は
、ゲノムＤＮＡがヒト第２１染色体および他の末端動原
体型染色体の動原体型領域により共有された配列、また
は配列類のハイブリダイゼーションを完全にブロッキン
グするには効果的ではないことを示している。これらの
配列または配列類を含んでいるクローンまたはクローン
ズが最終的に分離されると、これから形成された標識さ
れないＤＮＡは染色の特異性を改良するためにゲノムブ
ロッキングＤＮＡに添加される。
３ｅ、Ｌ乱立１１ ３ｃ、ｉ、ハイドロオキシアパタイト。
一重鎖核酸および二重鎖核酸は、ノーイドロオキシアパ
タイトに対して異なる結合特性を持っている。かかる特
性は核酸を分別するのに一般的に使用される基礎を提供
する。ハイドロオキシアパタイトは商業的に入手できる
（　ｅｇ、　Ｂｌｏ−ＲａｄＬａｂｒａｔｏｒｉｅｓ、
　ＲＩｃｈ＋ｅｏｎｄ、　ＣＡ）。最高度コピー数から
シングルコピー数までの反復の特定の度合の配列を含ん
でいるゲノムＤＮＡのフラクンヲンは、ゲノムＤＮＡを
変性し、それを適宜の条件のもとでＣｏｔの特定の値に
再結合することを許容することにより得られ、それに続
いてハイドロオキシアパタイトを使用する分離に付され
る。一重鎖核酸および二重鎖核酸もまた、Ｓｔヌクレア
ーゼの使用により識別できる。かかる技術およびＣ０ｔ
の概念はプリテン等により以下の文献に説明されており
、かかる文献は参考文献として本明細書に取り入れられ
ている（Ｂｒｌｔｔｅｎ　ａｔ　ａｌ、、　”Ａｎａｌ
ｙｓｉｓ　ｏｆ　ｒｅｐｅａｔｉｎｇＤＮＡＳｅｑｕｅ
ｎｃｅｓ　　ｂｙ　　Ｒｅａｓｓｏｅｉａｔｌｏｎ”、
ｉｎ　　Ｍｅｔｈｏｄ　　ｉｎ■ｎム山江■、Ｖｏｌ、
２９．ｐｐ、３６３−４１８（１９７４）。
上記した３ａ、または３ｂ、にて形成された一重鎖核酸
フラクシ璽ンは、ハイドロオキシアパタイトによす分難
でき、かつプローブとして使用できる。
従って、ブロックされた配列（二重鎖となる）は物理的
に除去される。その後、プローブは必要とするまで保存
される。その後、プローブは添加ブロッキング核酸なし
に使用でき、またはその染色コントラストは多分添加ブ
ロッキング核酸により改良できる。
３ｃ、ｉｊ、　　　　れた　　による　　　特定の配列
の除去は、一重鎖”吸収”（ａｂｓｏｒｂｉｎｇ）核酸
配列をソリ、ドサポート（ｓｏｌｉｄ　５ｕｐｐｏｒｔ
）に付着することによっても遂行できる。−重鎮源核酸
は固定された核酸にハイブリダイズされる。ノ＼イブリ
ダイゼーシ四ン後、未結合配列は収集されプローブとし
て使用される。例えば、　ヒトゲノムＤＮＡはヒトプロ
ーブから反復配列を吸収するために使用できる。かかる
方法の一つの方法がブロック等により以下の文献に記述
されており、かかる文献は参考文献として取り入れられ
ているｏ　　［Ｂｒ１ｓｏｎｅｔ　ａｌ、。
”Ｇｅｎａｒａｌ　　Ｍｅｔｈｏｄ　　ｆｏｒ　　Ｃｌ
ｏｎｌｎｇ　　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　　ＤＮＡ　　ｂｙ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ　　Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ　　
ｗｉｔｈ　　Ｇｅｎｏｍｌｃ　　Ｐｒｏｂｅｓ”Ｍｏ１
ｅｃｕｌａｒ　　ａｎｄ　　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　　Ｂｉ
ｏｌｏ　　　、Ｖｏｌ、２．ｐｐ、５７８−５８７（１
９８２）］。簡単に言えば、わずかに奪い取られたヒト
ゲノムＤＮＡは、ジアゾニウムセルロースまたはその類
似のサポートに結合される。断片に適宜にカットされた
源ＤＮＡは固定されたＤＮＡに対してハイブリダイズさ
れ、約１〜１００のＣｏｔ値になる。ノ＼イブリダイゼ
ーシ曹ン条件の好ましいストリンジェンンイは、ＤＮＡ
のベース組成により変化する。かかる手法は染色体−特
異的ライブラリ−例えば第１表のライブラリーから反復
配列を除去し、全ヒト染色体を染色し得るプローブを形
成する。
３ｄ、　　　ゲノムにおける　　　　　をブロックゑ！
≧」ｉ−標的ゲノムにおける非標的結合座位を、標識さ
れない相補的反復配列によるハイブリダイイー／１ンを
行うことによりブロックすることは、結合する潜在力を
持つプローブにおける標識された配列の結合を阻止する
。例えば、標識されないゲノムＤＮＡによるハイブリダ
イゼーションは、標的ゲノムニ重鎖に高度コピー反復配
列を与える。プローブにおけるかかる配列の標識された
コピーは、プローブがその後に適用される場合結合する
ことができない。
実際に染色コントラストを形成するためには、多（のメ
カニズムが組み合わさっている。例えば、ブロッキング
ＤＮＡが上記３ｂに示したごとくプローブに添加される
と、同ＤＮＡは一重鎖配列として留まり、プローブが標
的物質に適用される場合には標的配列に結合でき、かつ
同標的配列をプロ、、りできる。
ブロッキングＤＮＡをともなうプローブのインキュベイ
トが最小限である場合には、その後ゲノムＤＮＡは同時
にプローブをブロックし、かつプローブと標的物質にお
ける結合座位を競う。
３ｅ工立亙盈。上記３ｂ、１セクシ冒ンで示したごとく
、プローブにおける高度コピー反復のＩ＼イブリダイゼ
ーシッン能力を抑制することと、標的−特異的配列の結
合を抑制することによる所望の７グナル強度を減すこと
との間の最適な妥協を図るためには、正確な量のゲノム
ＤＮＡを添加することが必要である。次のディスカッジ
ョンは、ゲノムの標的領域からのＤＮＡをクローニング
することにより形成された、または同ＤＮＡの広がり（
ｓｔｒｅｃｈｅｓ）をクローニングとは異なる他の複製
により形成されたプローブをともなうゲノム　ブロッキ
ングＤＮＡの使用に関するものである。従って、プロー
ブはシングルコピー　染色体−特異的反復配列、および
標的において発見される共有反復配列の典型的なサンプ
リングを含んでいる。かかるプローブは、コンプレキシ
ティがゲノムの小さな領域、例えばいくつかの接近され
たコスミド　クローンから誘導された１００ｋｂから、
例えば第１表からの多数のライブラリーのフンビネーシ
ジンである数位ベースまでの範囲のものである。下記の
ディスカッジョンは例示的であり、異なる核酸が使用さ
れる他の状況にまで拡大できる。下記のｑのディスカッ
ジョンは、本発明を如何に進行すべきかに関する一般的
なガイドラインを与えることのみを意図したものである
。
標識されたプローブ配列を含んでいるハイブリダイゼー
ション混合物への標識されないゲノムＤＮＡの添加は、
全配列の濃度を増大するが、共有配列がゲノムの他の場
所で見つかるのに対して標的−特異的配列が見つからな
いことから、標的−特異的配列の濃度よりも大きなファ
クターにて共有配列の濃度を増大する。従って、共有配
列の再結合が優先的に増大され、これにより標的物質に
対する共有配列の標識されたコピーのハイブリダイゼー
ションは優先的に抑制される。
この概念を定量化するために、第１表の第１染色体ライ
ブラリーからのプローブＤＩｊＡのマス■。
（ｍａｓｓ　Ｉｐ）と、標識されないゲノムＤＮＡのｌ
ｂとを含んでいるハイブリダイゼーシ日ン混合物中の東
上染色体に特異的にハイブリダイズする配列、反復また
はシングル−コピーについて最初に考慮する。
配列の標識されたコピーの数は閣、に比例する。
方、標識されないコピーはｆｌｏに比例する。但し、ｆ
ｌは東上染色体上に含まれたＤＮＡのフラクションであ
る。従って、標的染色体にとっての配列特異的な各々の
標識されたコピーに対する標識されないコピーの比率は
ｆ＋ｍｂ／＋＋ｐであり、これは本発明においてＱとし
て規定される。正常のヒト染色体においては、０．０１
６≦ｆ１≦０．０８であるｏ　　［Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈ
ｎｅｔ　ａｌ、、５ｃｉｅｎｃｅ、１７９：１１２６（
１９７３）］。典型的な実施例として、セクシ目ンＶ１
．ＢではｆａＩＩＱ、　０６６とｒ２＋−０，０１５が
示されている。Ｌ塩基対からなる領域に標的されたプロ
ーブとってはｆｌ＝Ｌ／Ｇである。但し、Ｇはゲノム中
の塩基対の数である（ヒトおよびその他の哺乳動物にお
いては約３Ｘ　１０’）。従って、Ｑ・（Ｌ／Ｇ）（ｍ
ｂ／ｍ））である。
ゲノム全体にわたって多かれ少なかれ均一に分散される
共有配列、例えばＡｌｕについて考慮する。
標識されたコピーの数はｍ−こ比例するのに対して、標
識されないコピーの数はｌｂに比例する。従って標識さ
れたコピーに対する標識されないコピーの比率は■ｂ／
−ｅ”Ｑ／Ｂである。これは、コピー数にかかわらず全
て均一に分散された配列にとって正しい。従って、添加
するゲノムＤＮＡはファクター（１＋Ｑ）により各特異
的配列の濃度を増大し、これに対して各均一分散された
配列はより大きなファクター（１＋Ｑ＃＋）により増大
する。従って、共有配列の再結合比率は、ゲノムＤＮＡ
の添加により特異的配列の再結合比率よりより大きなフ
ァクターにより増大される。
相対的再結合比率におけるゲノムＤＮＡの有益す効果の
おおよそ半分は、Ｑ・１で達成され、Ｑ・５となると、
さらに増大することにより得られるべき利益はもはや本
質的にはないが示される。従って、後述のセクシジンＶ
１．Ｈのプロトコル■ハイブリダイゼーションはＱ≦５
を保持する。
ゲノム　ブロッキングＤＮＡの使用を例示するには、ゲ
ノムのモデルを考慮するのが便利であって、同モデルに
おいてはＤＮＡの５０％が特異的配列（反復およびシン
グル−コピーの両者）であり、ＤＮＡの他（０５０％は
ゲノム全体にわたって均一に分散している共有反復配列
である。従って、モデルによると、標的物質がＬ塩基で
ある場合（すなわち、プローブがゲノムの標的区域のし
塩基である断片を含む）、Ｌ／２塩基を含んでいる配列
は標的物質に対して特異的であり、かつＬ／２は全ゲノ
ムと共有される。
ｍ、　　　　−”　　の　　　　を　　　ること不均一
混合物の一重鎖および二重鎖核酸断片を標識するにはい
くつもの技術がある。これらの方法は放射線的標識の結
合を含んでいる。例えば、ハーバ−等［Ｈａｒｐｅｒ　
ａｔ　ａｔ、　、　ａ皿ｎ旦ｎ、　Ｖｏｌ、　８３ｐｐ
、４３１−４３９（１９８４）］　；フルオロクロムま
たは酵素の直接付着（ｄｉｒａｃｔ　ａｔｔａｃｈｍｅ
ｎｔ）、例えばスミス等［Ｓ＊ｉｔｈ　ａｔ　ａｌ、、
　Ｎｕｃ　ｅ　ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅ　ａｈ、Ｖｏ
ｌ、１３、ｐｐ、２３９９−２４１２（１９ＢＢ）、お
よびコ／リイ等［Ｃｏｎｎｏ１１ｙ　ｅｔ　ａｌ、、　
Ｎ１ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＶｏ１
．１３．ｐｐ、４４８５−４５０２（１９１１５）］　
；免疫化学的または他のアフィニティ　リアクションに
より核酸断片を検出し得るようにする同断片の種種の化
学的変更、例えばテーン等［Ｔｃｈｅｎ　ｅｔ　ａｌ、
、”ｃｅｍｔｅａ１１ｙＭｏｄｉｆｉｅｄ　Ｎｕｃｌｅ
ｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　ａｓ　Ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔａ
ｂｌｅＰｒｏｂｅｓ　ｉｎ　Ｆｌｙｂｒｉｄｉｚａｔｉ
ｏｎ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ、−１’ｒｏｉｅ。
Ｎａｔｌ、　　　ｅａｄ、　　Ｓｃ１．、ＶｏＩＪｌ、
ｐｐ、３４６６−３４７０（１９８４）コ；リチャード
ソン等ＣＲｌｃｈａｒｄｓｏｎ　ａｔ　ａｌ。
ＢＬｏｔｌｎ　ａｎｄ　Ｆｌｕｏｒｅｓｅｅｎｔ　Ｌａ
ｂｅｌｉｎｇ　ｏｆ　ＲＮＡＵｓｉｎｇ　Ｔ４　ＲＮＡ
　Ｌｌｇａｓａ、”　Ｎｕｃ　ｅｉ　　ｃ’ｄｓ　Ｒｅ
５ｅ　ａｈＶｏｌ、１１．ｐｐ、６１６７−６１８４（
１９１１３＞］　：ランガー等［Ｌａｎｇａｒ　　ａｔ
　　ａｌ、、−Ｅｎｚｙｍａｔｌｃ　　５ｙｎｔｈｅｓ
ｉｓ　　ｏｆＢｔｏｔｉｎ−ＬａｂｅｌｅｄＰｏｌｙｎ
ｕｅｌｅｏＬｔｃｌｅｓ：ＮｕｅｌｅｉｃＡｃｉｄＡｆ
ｆｉｎｉｔｙ　　Ｐｒｏｂｅｓ、”　　Ｐｒｏｉｃ、Ｎ
ａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、、Ｖｏ１７８．１．６６３
３−６６３７（１９８１）］　：ブリガテイ等［、Ｂｒ
ｉｇａｔｉ　　ｅｔ　　ａｌ、、”Ｄｅｔｅｅｔｌｏｎ
　　ｏｆ　　Ｖｉｒａｌ　　Ｇｅｎｏｍｅｓｉｎ　　Ｃ
ｕ１ｔｕｒｅｄ　　Ｃｅ１ｌｓ　　ａｎｄ　　Ｐａｒａ
ｆｆｌｎ−ＥｍｂｅｄｄｅｄＴｉｓｓｕｅ　　５ｅｃｔ
ｉｏｎｓ　　Ｕｓｉｎｇ　　Ｂｔｏｔｉｎ−Ｌａｂｅｌ
ｅｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｌｏｎ　　Ｐｒｏｂａｓ、−
Ｌは！暉Ｉ１．Ｖｏ１．１２６．ｐｐ３２−５０（１９
８３）］　；プロカー等［：Ｂｒｏｋｅｒ　ｅｔ　ａｌ
”Ｅｌｅｃｔｒｏｎ　　Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｉｃ　　Ｖ
ｌｓｕａｌｉｚａｔｌｏｎ　　ｏｆ　　ｔＲＮＡＧｅｎ
ｅｓ　　Ｆｅｒｒｌｎ−Ａｖｌｄｉｎ：　　Ｂｉｏｔｌ
ｎ　　Ｌａｂｅｌｓ、−ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒ
ｅ５ｅａｒｃｈ　Ｖｏｌ、５．ｐｐ、３６３−３８４（
１９７８）］　：　　］ベヤー［Ｂａｙｅｒ　ｅｔ　ａ
ｌ、、−Ｔｈｅ　Ｕｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｖｉｄｉｎ
Ｂｉｏｔｉｎ　　Ｃｏｍｐｌｅｘ　　ａｓ　　ａ　　Ｔ
ｏｏｌ　　ｉｎ　　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ
、＋　Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｏｆ　　Ｂｌｏｃｈｅｒｉｃ
ａｌ　　Ａｎａｌ　　５ｉｓＶｏ１．２６．　ｐｐ、　
１−４５　（１９８０）　；　　クールマン［Ｋｕｈｌ
ｍａｎｎＩｍｍｕｎｏｅｎｚ　ｍｅ　　Ｔｅｃｈｎｊ　
　ｕｅｓ　　ｉｎ　　Ｃｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒ（Ｗｅｉ
ｎｈｅｌｍ、　Ｂａ５ｅｄ、　１９８４）］、］ランガ
ーーサファー［巨■二ｎ、７９：４３８１（１９Ｂ２）
］　：ランデゲント等［ＬＬ」１土１■、、Ｌ５３：１
ｉｔ（１９！１４）コ；ホップマン等［）Ｉｏｐｍａｎ
　ｅｔ　ａｌ、、ＬＬ工にＲｅｓ、　、　Ｌａ９：Ｊ６
ｆｆ＜ｌＱ＆？）’ＩＩ。
典型的なｅ１１識化手段はこれらを含み、これらの手段
においてプローブ断片はビオチニル化され、Ｎ−アセト
キシ−Ｎ−２−アセチルアミノフルオレンで変更され、
フルオロクロムで変更され、水銀／ＴＮＰリガントで変
更され、スルホン化され、ジゴキンゲニン化され、また
はＴ−Ｔダイマを含む。
”プ７−ブ標識化−（ｐｒｏｂｅ　ｌａｂｅｌｉｎｇ＞
のキイとなる特徴は、標的物質に結合したプローブが検
出できるということである。あるケースでは、付加され
た特徴よりもプローブ核酸の固有の特徴がこの目的のた
めに利用できる。例えば、特異的にＲＮＡ／ＤＮＡデュ
プレックスを見いだす抗体は、ＤＮＡ標的物質に結合さ
れるＲＮＡから作られたプローブを確認する能力を持つ
ことを証明されている。
［Ｒｕｄｋｉｎ　ａｎｄ　Ｓｔｏ＋１ａｒ、■ａユニ６
５：４７２−４７３（１９７７＞１゜かかるプローブの
ために使用されたＲＮＡは変更されない。プローブ核酸
断片は、変更されたヌクレオチドまたは特定の正常なヌ
クレオチドの尾部を付加すること番こより拡張できる。
正常ヌクレオチドの尾部が使用される場合には、数ある
標識する手段の中で、尾部に相補的でありかつフルオロ
クロム、酵素、放射能、変更塩基対を含んでいる核酸に
よる第２の〕１イブリダイゼーシヨンが結合プローブの
検出を可能とする。かかるシステムは商業的にはエンゾ
バイオケムから入手できる。
プローブにおける核酸配列が変更構成物を直接誘導する
ことのない、結合プローブを可視化する手段の他の実施
例は、チミジンダイマーに対する抗体の使用である。ナ
カネ等［■（２）：２２９（１９８７）］は、その中で
チミジン−チミジンの三量化ＤＮＡ（Ｔ−ＴＤＮＡ）が
インントウ　ノ＼イブリダイゼーションのためのマーカ
として使用された方法を例示している。ハイブリダイズ
されたＴ−ＴＤＮＡはラビット抗−Ｔ−ＴＤＮＡ抗体を
使用して免疫組織化学的に検出された。
上記文献に記載された標識化技術の全ては、特定の状況
のもとで選択される。それ故、上記文献は参考文献とし
て取り入れられる。さらに、当業者にとって周知の標識
化技術は、本発明にかかる染色組成物を標識するのに有
用である。標識化手段の選択は、下記のファクターを含
む幾多のファクターにより決定される。ハイブリダイゼ
ーションの効率における標識効果および染色体ＤＮＡに
対する核酸断片の結合効果、最初のハイブリダイゼーシ
ョン後に適用されるラベリングモイエティ（ｌａｂｅｌ
ｉｎｇ　＋＊ｏｉｅｔｉｅｓ）への結合プローブの隣接
性、ラベリングモイエティの相互の適合性、標識により
引き起こされたシグナルの性質と強度、標識が適用され
る費用および容易性、これらに類似する事項。
異なる方法によりそれぞれ標識された幾多の異なる高度
コンプレキシティ　プローブは、同時に使用できる。そ
れ故、興なるプローブの結合は例えば異なる色により識
別される。
■、インシトウ　ハイブリダイゼーション染色体に対す
る本発明に係る不均一混合物の適用は、標準的なインン
トゥ　ハイブリダイゼーション技術により遂行される。
技術上の幾多の優れたガイドが役に立つ。例えばガルお
よびパードウ［Ｇａ１ｌ　ａｎｄ　Ｐａｒｄｕｅ、”Ｎ
ｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄ　ＨｙｂｒＩｄｉｚａ−ｔｉｏ
ｎ　ｉｎ　Ｃｙｔｏｌｏｇｊｃａｌ　Ｐｒｅｐａｒａｔ
ｊｏｎｓ、”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ□ユ□旦虹、Ｖｏｌ
、”２ｌ−ｐｐ、４７０−４８０（１９８１）］　、例
エハヘンダーソン［Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ、　”Ｃｙｔｏ
ｌｏｇｉｃａｌＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｍ
ａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｈｒｏ■ｏ−ｓｏｍｅｓ。
−Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　ｏｆ　
Ｃｔｏｌｏ　　、１１０１．７Ｂ。
ｐｐ、　１−４６＜１９８２）コ、例えばアンゲラ−等
［Ａｎｇｅｒｅｒ。
ｅｔ　ａｌ、、−１ｎ　５ｌｔｕ　Ｈｙｂｒｉｄｌｚａ
ｔｉｏｎ　ｔｏ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒＲＮＡｓ、”ｉｎ　
Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎ　！ｎｅｅｒｎ　：　　ｒｉｎｃ
ｉ　ｌｅｓ　ａｎｄＭｅｔｈｏｄｓ、　　５ｅｔｌｏｖ
　　ａｎｄ　　Ｈｏ１ｌａｅｎｄｅｒ、Ｅｄｓ、、Ｖｏ
ｌ、）。
ｐｐ、４４３−６５（Ｐｌｅｎｕ　　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅ
ｗ　　Ｙｏｒｋ、１９８５）］　。　　従　って、これ
らの文献は参考文献として取り入れられる。
以下の３つのファクターがハイブリダイゼーション　プ
ローブの染色感受性（ｓｔａｉｎｉＢ　５ｅｎｓｉ−ｔ
！ｖｉｔｙ＞に影響を及ぼす。：（１）ハイブリダイゼ
ーションの効率（プローブによりハイブリダイズできる
標的ＤＮＡのフラクシヨン）、＜２）検出効率（すなわ
ち、ハイブリダイゼーション　プローブの与えられた量
から得られる可視化シグナルの量）、（３）プローブの
非特異的結合または検出システムの成分により形成され
たノイズのレベル。　　一般ｉこ、インシトウ　ハイブ
リダイゼーションは次の主ステツプからなる。（１）試
験されるべき組織または生物学的構造の固定、（２）標
的ＤＮＡの隣接性を増加しかつ非特異的結合を減少する
ために生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理
、（３）プローブの不均一混合物の生物学的構造または
組織における［）ＨＡに対するプローブの不均一混合物
のハイブリダイゼーション、（４）特異的ハイブリッド
における結合していないプローブを除去するボストハイ
ブリダイゼーション洗浄（ｐｏｓｔｈｙｂｒｊｄｉｚａ
ｔｉｏｎ　ｗａｓｈｅｓ＞、（５）不均一混合物のハイ
ブリッドされたプローブの検出。これらのステップの各
々に使用され−た試薬および使用条件は、特定の状況に
より変わる。
次のコメントは、上記した一般的ステップを適用するた
めのガイドとして供するために意図されている。ある実
験は特定の適用のために最善の染色条件を確立すべく要
求される。
ハイブリダイゼーションに備えて、プローブはその形成
方法にかかわらず、適宜のサイズの断片に切断してハイ
ブリダイゼーションの最良の強度と特異性を得るように
してもよい。断片のサイズに関する一般的なガイドライ
ンとして、次の事項を認識することは必要なことである
。断片が余りにも長い場合には、同断片は結合するため
の標的内に侵入し得ず、その代わりハイブリダイゼーシ
ョンにバックグランド　ノイズを与える集団を形成する
。しかしながら、断片が余りにも短いと、シグナル強度
が低減される。
セフシコンＶｆ、Ｂで例示されたハイブリダイゼーショ
ンの条件のもとでは、ヒトゲノムＤＮＡは高度コピー共
有反復配列のハイブリダイゼーションをブロックする試
薬として使用され、プローブ断片の好ましいサイズの範
囲は約２００ベース〜約２ｏｏｏヘ−ス、より好ましく
は約１ｋｂである。プローブ断片のサイズが約８００〜
約１０００ベースの範囲である場合には、好ましいハイ
ブリダイゼーション温度は約３０℃〜４５℃、より好ま
しくは約３５℃〜４０’Ｃ１なお好ましくは約３７”Ｃ
である。また、好ましい洗浄温度の範囲は約４０”０〜
５０℃、より好ましくは約４５℃である。
プローブ断片のサイズは、標的物質に対するハイブリダ
イゼーションの以前にチエツクされる。
断片のサイズは、好ましくは電気泳動によりモニターさ
れ、より好ましくは変性アガローズゲル電気泳動により
モニターされる。
固定液は酸アルコール溶液、酸アセトン溶液、ベトラン
クウィッチ試薬（Ｐｅｔｒｕｎｋｅｗｉｔｓｃｈ’　ｓ
ｒｅａｇｅｎｔ）、およびホルムアルデヒド、パラポル
ムアルデヒド、グルタルアルデヒドまたはそれらの類似
物等のごとき種種のアルデヒドを含む。好ましくは、約
３：ｌの比率のエタノール−アセティクアシド溶液また
はメタノール−アセティクアンド溶液がメタフェーズ　
スプレッドにおける染色体を固定するのに使用される。
サスベンジ１ン中の細胞および染色体にとってはトラス
フ等［Ｔｔａｓｋ、　ａｔａｌ、　、　ｉｎ　５ｃｉｅ
ｎｃｅ、　Ｖｏｌ、　２３０．　ｐｐ、　１４０１−１
４０２（１９８５）］により記述された固定手法が使用
できる。それ故、かかる文献は参考文献として取り入れ
られる。簡単に言えば、１ｆａＣＯ＠とジメチルサブエ
リミゾイト（ＤＮＳ）　　（５倍に濃縮されたストック
溶液、使用前に十分に混合）が、約Ｓｘ　ｌＯ”ｎｕｃ
ｌｅｉ／■１を含むサスベンジ１ンに付与される。最終
のＸ２ｃｏｓとＤＭＳ濃度はそれぞれ２０ｍＭと３１Ｍ
である。２５℃で１５分放置後１００ｍＭサイトリック
アンド／■ｌサスペンションの５０μｍを添加してｐＨ
が１０，０〜８．０に調整される。細胞核は遠心分離に
より一度洗浄される（　３００ｇ、１０ａｉｎ、、５０
ｍＭ　ＸＣＩ、５ｖＭ　ｐｉ４９．０のへペスバッハア
ーおよび１０ｍＭ　ＭｇＳＯ４中４℃にて）。
サスベンジ１ンにおける細胞または細胞核の好ましい固
定手法はトラスフ等により開示されており　　［Ｔｒａ
ｓｋ　　ａｔ　　　ａｌ、、Ｈｌｍ、　　　Ｇｅｎｅｔ
、、７８：２５１−２５９（１９８８）　］、同文献は
参考文献として取入れらる。
簡単に言えば、細胞核はＰＢＳ、５０’ｍＭ　Ｍｇ５Ｏ
ａ、ｐＨ７，６（Ｄ１％パラホルムアルデヒド中室温で
約１０分間で固定され、そして二度洗浄される。細胞核
は分離緩衝液（ＩＢ）中で再度懸濁される。かかる緩衝
液は（５０ｍＭ　ＭＣ１，５ｍＭ　１ｌＥＰＥｓ、１０
ｍＭ　ＭｇＳＯ４，３＋ｅＭジｆｔエリ　スＩＪ　　ト
　−　ル　、　　０．　　ｌ５ｍｇ／ｍｌ　　　ＲＮａ
ｓｅ、　　ｐＨ８，０）　　　／（Ｏ，ＯＳ％　　ト　
ＩＪ　　ト　ン　Ｘ−１００，１０”／ｍｌ　　）　　
。
しばしば、インシトウ　ハイブリダイゼーションの前に
、染色体は蛋白質を除去する試薬で処理される。かかる
試薬は酵素または緩酸を含む。プロナーゼ、ペプシン、
ブロティナーゼに等がしばしば酵素として使用される。
典型的な酸処理は０．０２−０．２Ｎ　ＨＣＩでなされ
、続いて高温（例えば７０”Ｃ）で洗浄される。脱タン
パク質の効率は、ハイブリダイゼーションを最高にする
ブロティーズ濃度とグイジェシ１ン時間との組合せを必
要とするが、形態学的詳細（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　ｄｅｔａｉｌ）の許容し得ないロスの原因とはなら
ない。最適の条件は組織型および固定方法により異なる
。ブロティーズ処理後の付加的固定は有用である。従っ
て、特定の適用のためには、ある実験がブロティーズ処
理を効率的にするために要求される。
あるケースでは、標的物質から残余のＲＮＡを除去する
ためにＲＮａｓによる前処理が望ましい。かかる除去処
理は、５０−１１１０μｇ／　ｍｌ（ＲＮａｓａ　ｉｎ
　２Ｘ　５ＳＣ）中で室温で１−２時間、固定された染
色体のインキュベイン１ンにより遂行できる。　（但し
、ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣ１と０．０１５Ｍソジウム
　サトレイトの溶液である）不拘−ブローブ混合物のプ
ローブを染色体ＤＮＡにハイブリダイズするステップは
、以下のステップを含んでいる。（１）プローブが相補
的一重鎖領域への接近を促進できるために標的ＤＮＡを
変性すること、および（２）プローブを標的物質におけ
る相補的座位にアニール（ａｎｎｅａｌ　）することを
可能にする条件のもとで不均一混合物を適用すること。
変性方法は高ｐｌ＋、　　低ｐＨ５高温、またはホルム
アミド、テトラアルキルアンモニウム　ハライドのごと
き有機溶剤、またはそれらの類似物の存在のもと、濃度
および温度の種種の組合せでのインキュベイジョンを含
む。標的物質中の一重鎖ＤＮＡはエキソヌクリアーゼｍ
　［ｖａｎ　Ｄｅｋｋｅｎ　ａｔ　ａｌ、、ｃｈｒｏｍ
ｏｓｏ＋＋ａ（Ｂｅｒｌ）９’１１−５　（１９８Ｂ）
］のごとき酵素で形成できる。好ましい変性手法は約３
５−９５％ｉｎ　２Ｘ　ＳＳＣの濃度、約２５−７０℃
の温度でのホルムアミドにおける１−１０分のインキ二
ベイ７震ンである。これらの範囲内での効率的なインキ
１ベイシ■ン時間、濃度、および温度の決定は、固定方
法およびプローブ核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）の
型を含む種種の変動要因に依存する。
染色体Ｄｌが変性された後、変性要因は典型的には不均
一プローブ混合物の適用以前に除去される。
ここでホルムアミドと熱は主要な変性要因であり、それ
らの除去は溶剤による幾度かの洗浄により都合良く遂行
される。かかる溶剤は例えば７０％、８５％１００％冷
エタノール　シリーズのごと（、シばしば冷却される。
変性物質の組成は他の構成物の付加または適宜の溶剤で
の洗浄のいずれかにより、インシトゥ　ハイブリダイゼ
ーションのために適宜に調整できる。プローブおよび標
的核酸はハイブリタイセーンヨン混合物の適用、および
その後の適宜の加熱により同時に変性される。
不均一混合物が適用される時間の間の、染色体ＤＮＡお
よびプローブの雰囲気の物理化学的条件はハイブリダイ
ゼーション条件、またはアニーリング条件に関係する。
特定の適用における最上の条件は、幾多のファクターを
コントロールすることにより調整でき、同ファクターと
しては以下のものが含まれる。成分の濃度、不均一混合
物中の染色体のインキュベイシ璽ン時間、不均一混合物
を構成する核酸断片の濃度、コンプレキシティ、および
長さ。概略的には、ハイブリダイゼーション条件は、非
特異的結合を最小限にするために溶融温度に十分に近ず
けなければならない。他方、かかる条件は、相補的配列
の正確なハイブリダイゼーションを検出レベル以下に低
減し、または長いインキュベイシ菌ン時間を過剰に要求
すること程には厳格なものではない。
ハイブリダイゼーション混合物中の核酸の濃度は重要の
要因である。かかる濃度は十分に高（なければならず、
これによりそれぞれの染色体結合座位の十分なハイブリ
ダイゼーションが適当な時間内（数時間〜数日）に生じ
る。十分なシグナルを得るのに要する濃度より高い濃度
は避けるべきであり、これにより非特異的結合が最小と
なる。
不均一混合物のプローブにおける核酸の濃度に関する、
重要な実際の拘束は溶解度である。断片濃度、例えば単
位体積当りの核酸の単位長さに関しては上限が存在し、
それは溶液中で保持できかつ効果的にハイブリダイズす
る。
後述のセクション■、Ｂで記述された典型的な実施例に
おいて、ハイブリダイゼーション混合物におけるＤＮＡ
濃度はｌｕｇ／ｕｔのオーダの上限を持っている。かか
る全染色体染色のためには、１１−２０ｎ／ｕｌのプロ
ーブ濃度が使用された。ゲノム　ブロッキングＤＮＡの
量は、ｑが５未満であるように調整された。プローブ濃
度の下限において、１時間のインキュベインヨンで十分
なシグナルが得られた。すなわち、プローブおよびブロ
ッキングＩ）ＨＡは標的物質に適用する以前にいっしょ
に保持され、高度コピー配列をブロックし、１６時間の
ノーイブリダイゼーションに付される。シグナルはハイ
ブリダイゼーションの２時間後可視化された。最良の結
果（最高コントラストの光輝シグナル）は、１００時間
ハイブリダイゼーンヨン後に生じた。かかるハイブリダ
イゼーションは、低度コピー標的配列に結合座位を発見
するためのより多くの機会を与えた。プローブ濃度の上
限において、光輝シグナルは１６時間またはそれ未満の
時間のハイブリダイゼーション後に得られた。コントラ
ストは、より多くの標識された反復配列がプローブ中に
含まれている故に減少した。
固定された標的物質はプローブＤＮＡの非特異的結合を
減らすために、ハイブリダイゼーションステノブの間ま
たはその後に幾多の手段で処理される。
これらの処理は下記の処理を含む。非プローブ、゛キャ
リア”、　　ＤＮＡを不均一混合物に添加すること、デ
ンハルト溶液（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏ
ｎ）　（１Ｌ幻ロシ譚。
Ｂｉｏ　ｈ　ｓ、Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、、Ｖｏｌ、２
３．ｐｐｙ６４１−８４５（１９６Ｂ））のごときコー
ティング溶液を不均一混合物とともに使用すること、数
分〜数ｌＯ分例えば５−２０分、変性溶剤中ハイブリダ
イゼーション温度より上５−１０℃の温度でインキュベ
イトすること、ＲＮ＾プローブのケースでは一重鎖ＲＨ
ａｓｅ　ｉｎ　２ｘ　ＳＳＣ（例えば５−１Ｏμｇ／ｍ
ｌ　ＲＮａｓｅ）による室温での１時間の緩処理。
■ された 一コピーの からからなる ヒト染色体−特異的ライブラリーからのＤＮＡ断片は、
ナンッナル　ラボラトリ−ジーン　ライブラリプロジェ
クト（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｇｅ
ｎｅＬｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｏｊｅｃｔ）から、アメリカ
ン　タイプ　カルチャー　コレクシ璽ン［Ａｍｅｒｉｅ
ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏ１１ｅｅＮｏｎ（
＾ＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉ１１ｅ、ＭＤ、］を通じて入
手可能である。第２１染色体からのＤＮＡ断片は、フス
コー等により記載された手法［Ｆｕｓｃｏｅ　ｅｔ　ａ
ｌ、、１ｎ−Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　　ｏｆ　　Ｆ
ｉｆｔｅｅｎ　　Ｈｕｍａｎ　　Ｃｈｒｏ＋＊ｏｓｏｍ
ｅＳｐｅｃｉｆｉｃ　ＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　ｆ
ｒｏ＋＊　Ｆｌｏｗ−ＰｕｒｉｆｉｅｄＣｈｒｏｍｏｓ
ｏｍｅ”、Ｃｔｏ　　ｅｎｅｔ、　　Ｃｅ１ｌ　　Ｇｅ
ｎｅｔ　　、Ｖｏｌ、４３゜ｐｐ、　７６−８６（１９
８６）コで造られ、この文献は参考文献として取り入れ
られる。簡単に言えば、ヒト二倍体繊維芽細胞培養は新
生児包皮組微から確立された。細胞の染色体はファン　
デン　エンフ等のＭｇ５Ｏａ法［ｖａｎ　ｄｅｎ　Ｅｎ
ｐｈ　ｅｔ　ａｌ、、江」１匹■、　　ＶｏｌＳ、ｐｐ
、　１０８−１２３（１９８４）］により分離され、蛍
光染料ヘキスト３３２５８およびクロモマイシンＡ３−
で染色された。第２１染色体はビータース等［Ｐｅｔｅ
ｒｓ　ｅｔａｌ、　、　江二□匹ｕ、　Ｖｏｌ、　６．
　ｐｐ２９０−３０１　（１９８５）］により述べられ
たローレンス　リバーモア　ナシヲナル　ラボラトリ−
の高速ソーターにより分離された。
ソーティングの後、染色体濃度は約４Ｘ　１０５／＋＊
ｌであった。それゆえ、ＤＮＡの抽出に先立って、染色
体（０，２−１，Ｏｘ　１０”）は４℃で３０分間、４
０．０ＯＯｘ　ｇで遠心により濃縮された。それからペ
レットは０５％のＳＤＳと１００μｇ／■１のブロテイ
ナーゼＫを含む１００μｍのＤＮＡ分離緩衝液（１５■
ＭＮａＣ１，ｉｏ＊Ｍ　ＥＤＴＡ、　１０ｍＭ　）リス
ＨＣＩ　ｐＨ１８，０）中に再浮遊された。３７℃で一
晩のインキュベーションの後に、タンパク質はフェノー
ルクロロフォルム：イソアミルアルコール（２５：２４
ｉ＞で二度、そしてクロロホルム　イソアミルアルコー
ル（２４＋１）で−度、抽出された。ＤＮＡの量が少量
であるので、各有機相は少量のｌｏｍＭトリスｐｌ＋０
．８１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ＴＥ）で再抽出された。水様層
はシコライヒャーとシュエルのミニコロジオン＠　（Ｓ
ｃｈｉｌｅｌｃｈｅｒ　　ｓｎｄ　　５ｃｈｕｅ１１　
　ｇｌｉｎｔ−ｃｏ１１ｏｄｉｏｎ　　＋ｌｅｍｂｒａ
ｎｅ）（＃Ｕ）１０２０／２５）に結合されて移され、
６−８時間家屋でＴＨに対し透析された。それから精製
されたＤＮＡ溶液は、５０＋＋Ｍ　　ＮａＣ１，１０ｍ
Ｍ　ト　リ　ス　ＨＣＩ　　ｐＨ１，５，１０ｍＭ　　
ＭｇＣｌ２．１＋ｅＭジチオトレイトール中で５０ユニ
ツトのＢｉｎｄ　ｎｌ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａ
ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　　Ｉｎｃ。）で
もってダイジェストされた。３７℃で４時間後、反応は
上述のごとくフェノールおよびクロロホルムを用いた抽
出により停止された。水相はミニコロジオンバッグ中で
一晩４℃で水に対し透析され、それから［１ｉｎｄ　ｍ
でクリープ（ｃｌｓａｖｅ）されウシ−アルカリホスフ
ァターゼ（ｃａｌｆ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ｐｈｏｓｐｈ
ａｔａｓｅ）（Ｂｏｅｈｒｊｎｇｅｒ　Ｍａｎｎ−ｈｅ
ｊｍ）で処理された２μｇのカロン２１＾アームズ（Ｃ
ｈａｒｏｎ　２１Ａ　ａｒｍｓ）が加えられた。
溶液は真空の下で５ｏ−ｉｏｏμｌの容積まで濃縮され
、０．５１のマイクロフユージチューブ（ｍｉｅｒｏｆ
ｕｇｅｔｕｂｅ）に移されて、そこでＤＮＡは１０分の
１容積の３ＭソジウムアセテートｐＨ５，０および２容
積のエタノールと共に沈降された。沈降物は遠心により
集められ、冷たい７０％エタノールで洗浄され、１０μ
ｍのＴＥに溶解された。
ＤＮＡが数時間溶解するのを許容した後、ｌμｌの１０
Ｘリガーゼ緩衝液（０，５ＭトリスｌＩＣ１ｐＨ７、４
，０，１ＭＭｇＣ１２，０，１Ｍジチオトレイトール、
　１０ｍＭ　ＡＴＰ、　ＩＢ／＊１ウシ血清アルブミン
）および１ユニ、トのＴ４リガーゼ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ
　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｉｎｅ
、）が加えられた。連結反応は１０℃で１６−２０時間
インキュベートされ、ｓμ＋のアリコート（ａｌ　ｔｑ
ｕｏｔｅｓ）がホーンにより記載［）！ｏｒｈ　ｉｎ　
Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｗｏｎ　、Ｖｏｌ、６
８ｐｐ、２９９−３０９（１９７９）Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　　Ｍ
ａｎｕａｌ、（Ｃｏｌｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂ
ｏｒ　　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＮｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９
８２）コされた旦ニュ細胞株ＢＨＢ２６ｇｇおよびＢＨ
Ｂ２６９０から調製されたインビトロ抽出物を用いてフ
ァージパーチクルに組み込まれた。簡単に言えば、両袖
出物は音波処理により調製されてインビボパフケージン
グ（ｉｎ　ｖｉｖｏ　ｐａｃｋａｇｉｎｇ）のときに組
み合わされた。これらの抽出物は野生型ラムダＤＮＡを
、マイクログラムあたり１−５Ｘ　ＩＱ＠プラークフォ
ーミングユニット（ｐｆｕ）の効率でパッケージした。
結果として生じたファージは、プラークが一緒に成長す
るのを阻止しまた異なる組換え物の成長率の差を最小に
するために、約１０’ｐｆｕ／１５０ａｍデイ、ンユの
密度で８時間、旦、ニュＬＥ３９２上で増幅された。フ
ァージはプレートごとに１０１のＳＭ緩衝液（５ｈＭ　
ト　リスＨＣＩ　　ｐＨ７，５，１０ｍＭ　Ｍｇ５Ｏａ
、１００ｇ１Ｍ　　ＮａＣ１゜０．０１％ゼラチン）中
で、４℃で１２時時間中かに揺り動かすことにより溶離
された。それからプレートは余分の４ｍｌのＳＭでリン
スされた。細胞の破片をベレット化した後、ファージ浮
遊液はクロロホルムによって４℃で貯えられた。
Ｖ、Ａ、２　　ヒトリンパ細胞の第２１染色体を染色す
るための第２１染色体−特異的染色剤の構造および使用 非反復配列インサートを有するクローンはベントンおよ
びデイビスの方法［Ｂｅｎｔｏｎ　ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ
。
５ｃｉｅｎｃｅ、　Ｖｏｌ、　１９６．　ｐｐ、　１８
０−１８２（１９７７）］により分離される。簡単に言
えば、約１０００の組換えファージが第２１染色体−特
異的ライブラリーからランダムに分離される。これらは
二トロセルロースニ移すしてニックトランスレートされ
た全ゲノムヒトＤＮＡでプローブされる。
強いハイブリダイゼーションを示さないクローンのうち
、明白な非反復配列ＤＮＡを含むおよそ３００が抽出さ
れる。選択されたクローンが増幅すれた後、各クローン
中の第２１染色体インサートは３２ｐ標識されて、第２
１染色体ライブラリーを構成するのに使われたと同じ酵
素すなわちｆｌｉｎｄ　ｍでダイジェストされたヒトゲ
ノムＤＮＡのサザンプロット（Ｓｕｏｔｈｅｒｎ　ｂｌ
ｏｔｓ）にハイブリダイズされる。クローンを含む非反
復配列はサザン分析の間に単一のバンドを生じるものと
して認識される。およそ１００のこのようなりローンが
不均一な混合物に対して選択される。非反復配列クロー
ンは増幅され、インサートはＢｉｎｄ　ｍダイジェスシ
ヨンにより除去されて、インサートはゲル電気泳動によ
りファージアームから分離される。プローブＩ）ＨＡ断
片（すなわち非反復配列インサート）はゲルから除去さ
れてニックトランスレージ目ンにより（例えばＢｅｔｈ
ｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓから入手可能なキットにより）ビオチン化される。標
識されたＤＮＡ断片は、ｐＨ７、ｓのＳＯｍＭ）リス、
１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．１％ＳＤＳ中で膨潤されたセフ
アゾ・ノクスＧ−５ｏ　（媒体）で充ｔＪＩした０、５
璽１エッベンドルフチ二−ブ（Ｅｐｐｅｎ−ｄｏｒｐｈ
　ｔｕｂｅｓ）中に造られた小型のスピンカラム（ｓｐ
ｉｎ　ｃｏｌｕ＋Ｉｎ５）を用いて、二ノクトランスレ
ーシッン反応から分離される。ヒトリンパ細胞染色体は
ハーバ−等［Ｈａｒｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔ”１．Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、　、　Ｖｏｌ、　７８．　ｐｐ、　４４５ｇ−
４４６０（１９８１）１に従って調製される。中期およ
び間期の細胞は燐酸緩衝溶液中で３回洗浄され、メタノ
ールーアセティノクアシνＦ（３：１）中で固定され、
清潔にされた顕微鏡スライド上に落された。スライドは
一２０℃で窒素雰囲気中に貯えられる。
間期の細胞および／または中期のスプレッドを載せたス
ライドは窒素から取り出され、４時間かけて空気中で６
５℃まで加熱され、ＲＮアーゼで処理（１００μｇ／■
１．３７℃で１時間）されて、エタノールフリーズ中で
脱水される。それからブロテイナーゼにで処理（６０ｎ
ｇ／ｍ１．３７”Ｃで７５時間）されて脱水される。
ブロティナーゼにの濃度は、細胞の型と酵素のロフトに
基づいて、染色体の位相顕微鏡による像が乾燥したスラ
イド上に殆ど残らないように關整される。ハイブリダイ
ゼーション混合物は（最終濃度で）、５０％のホルムア
ミド、２ＸＳＳＣ，１０％のデキストランサルフェート
、５００μｇ／■ｌのキャリヤＤＮＡ　（音波処理され
たニンン精子ＤＮＡ）および２，０μｇ／■ｌのビオチ
ン−標識された第２１染色体−特異的ＤＮＡからなって
いる。この混合物はガラスのカバースリップの下に３μ
ｌ／ａｍ”の密度でスライドに適用されてラバーセメン
トでシールされる。３７℃で一晩のインキュベーション
の後、スライドは４５℃で洗浄（５０駕ホルムアミド−
２Ｘ　ＳＳＣｐＨ７，３回３分、続いて２Ｘ　ＳＳＣｐ
Ｈ７，５回２分）されて、ＢＮ緩衝液（０，１Ｍソジウ
ムビカーボネート、０．０５％ＭＰ−４０，ｐＨ８）に
浸される。
この時点以後、スライドは決して乾燥させてはならない
。
スライドはＢＮ緩衝液から取り出されて、室温で５分間
、５％の脱脂粉乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）および９９２
％のソジウムアジド（プラスチック製カバースリップの
下で５μＩ／ｃｇ＋２）でブロックされる。カバースリ
ップは取り除かれ、余分の液体は手早く排出されて、フ
ルオレセイン−アビジンＤＣＳ（５％の粉乳と０．０２
％のソジウムアジドを有するＢＮ緩衝液中で３μｇ／＋
＊ｌ）が加えられる（５μｌ／ｃ璽２）。同カバースリ
ップは戻されてスライドは３７℃で２０分間インキュベ
ートされる。それからスライドは３回２分間、それぞれ
４５℃ノＢＮ緩衝液中で洗浄される。ビオチン一連結さ
れたフルオレセインの強さは、ビオチン化されたヤギ抗
−アビジン抗体（５％のヤギ血清と０．０２％のソジウ
ムアジドをを有するＢＮ緩衝液中で５μｓ／ｍｌ）の層
を加え、続いて上記と同様に洗浄した後、フルオレセイ
ン−アビジンＤＣ３の別の層を加えることにより増幅さ
れる。フルオレセイン−アビジンＤＯＳ、　　ヤギ抗ア
ビジンおよびヤギ血清は全て商業的に入手可能［例えば
Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉ
ｎｇａｍｅ、ＣＡ）コである。ＢＮ中での洗浄後、蛍光
抗フェード液、ｐ−フェニレンジアミン（カバースリッ
プに関し１．５μｌ／ａｍ”）が観察の前に加えられる
。最適の顕微鏡像を得るにはこの層を薄く保持すること
が重要である。この抗フェード液はフルオレセインの減
退を大幅に減少させて５分間までの連続した顕微鏡観察
を可能にする。この抗フェード液には、ＤＮＡ対比染色
剤（ＤＡＰＩまたはプロピジウムーアイオダイド）が０
．２５−０．５μｇ／璽１で含まれている。
赤い蛍光を発するＤＮＡ−特異的染料プロビジラムアイ
オダイド（Ｐｌ）は、ハイブリダイズされたプローブと
全ＤＮＡを同時に観察することを可能にするために使用
される。フルオレセインおよびＰＩは４５０４９０ｎ＋
＊　（Ｚｅｊｓｓ　ｆｉｌｔｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉ
ｏｎ　４８７７０９）で励起される。励起波長を５４６
ｎｍ　（Ｚｅｉｓｓ　ｆｉｌｔｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉ
ｏｎ　４８７７１５）に増大すればＰＩのみの観察を可
能にする。　　ＤＡＰＩ、紫外線（Ｚｅｉｓｓ　ｆｉｌ
ｔｅｒｃｏ＋＋ｂｉｎａｔｉｏｎ　４８７７０１）で励
起される青い蛍光のＤＮＡ−特異的染色剤は、ビオチン
−標識されたものと全ＤＮＡが別々に観測される場合に
対比染色剤として使用される。中期第２１染色体は染色
体の本体上に散らばるランダムに位置する黄色いスポッ
トにより検出される。
Ｖ、８．　２１　　　　シングルコピー　　を　　よフ
スコー等［Ｆｕｓｅｏａ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｇｅｎｏ
ｎｌｃｓ、　”−：　１００−１０９（１９８９）］は
、多数のシングルコピー配列または非常に低いコピー数
の反復配列クローンを組換えファージライブラリーから
選択するための、すぐ上（Ｖ、　Ａ、　２）で述べた方
法よりもつと効率的な手法を提供して、第２１染色体を
染色するためのその使用につき実証している。前記記事
はこれにより参考として取り入れられる。簡単に言えば
、り、ローンは２つの基本的手法を用いて（ヒト第２１
染色体のＤＮＡから造られた）カロン２１Ａから選択さ
れた。第１に、ファージライブラリーは、クローン内の
反復配列の存在に対しセクションＶ、Ａ、２．の方法よ
りもっと敏感になるように案出された方法を用いて２つ
のステージに区別された。それから選択されたクローン
はプラスミドにサブクローンされた。
このようにして選択された４５０のインサートがライブ
ラリーｐｕｓ−０２１を形成する。第２は複数ステノフ
の処理からなり、そこでは　１）ＬＬ２１ＮＳＯ２から
のインサートはブルースクライブプラスミドにサブクロ
ーンされ、２）プラスミドはニトロセルロースのフィル
ター上のバクテリアコロニー中で高密度で増殖され、３
）放射性ヒトゲノムＤＮＡがニトロセルロースのフィル
ター上のプラスミドＤＮＡに２ステツプの低い厳格性で
ハイブリダイズされ、４）ノーイブリダイズされなかっ
たインサートを有するプラスミドがシングルコピー配列
を備えている可能性があるものとして選択された。この
ようにして五千三十のコロニーが選び出されて、ライブ
ラリーｐｓｓ−Ｌ１２１／１５３０を形成した。
サザン分析は、反復配列を見分けるのに第２の手法の方
が第１のよりも効率的であることを示した。ＰＢＳ−Ｕ
２１／１５３０からのＤＮＡでの蛍光イン／トウハイプ
リダイゼーン書ンは、ヒトリンパ細胞から造られた中期
スプレッド中の第２１染色体の特異的で強い染色を可能
にした。ｐＢＳ−Ｕ２１でのハイブリダイゼーン褒ンは
第２１染色体につきより少ない特異的染色を与える。フ
スコー等の組換えライブラリーからシングルコピー配列
または非常に低い反復配列を選択する方法に関する詳細
は、フスコー等〔Ｐｕ５ｃ６ｅ　ｅｔ　ａｌ、　、　ｉ
ｄｌ　に記載されている。
ピンケル等［Ｐｉｎｋｅｌ　ａｔ　ａｌ、　、　ヒフ工
１ｕ、　８５９１３８−９１４２（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ　
１９Ｎ＞］は、第第４染体シングルコピー配列を調製す
る手法および、次いで前記シングルコピープローブをヒ
ト中期スプレッドにハイブリダイズするためのプロトコ
ル（ビンケル等［Ｐｉｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ；ＰＮＡＳ
（ＩＩＳＡ＞、８３：２９３４−２９３８（１９８６）
］　ｌ　に記載された手法の変形を記載している。第４
Ｈ図は第４染色体からの１２０のシングルコピー−プロ
ーブのプールでのヒト中期スプレッドに対するハイブリ
ダイゼーションを示す。
高濃度の標識されていないヒトゲノムＤＮＡとラムダフ
ァージＤＮＡが標的染色体に対し反復およびベクターＤ
ＮＡ配列結合を抑制するのに使用された。重質ブヮティ
ナーゼのダイジェスシーンとこれに続（標的の固定は標
的ＤＮＡに対するプローブのアクセスを改良する。
ヒト中期スプレッドは標準的手法でもって顕微鏡スライ
ド上に調製されて一２θ℃で窒素雰囲気中に貯えられた
。
スライドはフリーザーから取り出されて染色手法を始め
る前に窒素雰囲気中で室温まで温まるようにされた。暖
められたスライドは先ずＰ緩衝液（２０＋Ｍ　）リス、
２ｍＭ　ＣａＣ１ａ　ｐＨ７，５）中で０．６ａｇ／ｍ
ｌのブロティナーゼにで処理されてＰ緩衝液中で一度洗
浄された。使用されたブロテイナーゼにの量はスライド
の異なるバッチ毎に調整する必要がある。変性後スライ
ドは２ＸＳＳＣ中に貯えられた。５０％のホルムアミド
、　　ｉｏｘのデキストランサルフェート、　　１％の
トウイー　ン２０．　２ｘ　ＳＳＣ，０，５ｍｇ／＋Ｉ
ｌのヒトゲノムＤＮＡ０．０３＋ｅｇ／ｍｌのラムダＤ
ＮＡ、　　および３ａｇ／ｍｌのビオチン標識されたプ
ローブＤＮＡからなるハイブリダイゼーション混合物が
調製された。プローブＤＮＡはセンウムクロライドグラ
ディエント（ｃｅｓｌｕ＋ｅ　ｃｈｌｏｒｉｄｅｇｒａ
ｄｉｅｎｔ）により決定された、第２１染色体旧ｎｄ　
ｍフラグメントライブラリー（ＡＴＣＣ登録番号５７７
１３　）　カらのファージの最高密度のフラクシ四ンか
ら成っていた。　（プローブのインサートおよびファー
ジＤＮＡ１ｔ何れもニックトランスレーションにより標
識された。）ゲル電気泳動により決定された平均的イン
サートのサイズ（第２１染色体ＤＮＡの量）は約５キロ
ベースであった。反復配列をインサートから除いたりイ
ンサートをラムダファージベクターから分離する試みは
なされなかった。ハイブリダイゼーション混合物は７０
℃で５分間加熱し続いて３７℃で１時間インキュベーシ
ョンすることにより変性された。インキュベーションは
ハイブリダイゼーション混合物内のヒトゲノムＤＮＡと
標識されていないラムダＤＮＡが、プローブ内のヒト反
復配列およびベクター配列をブロックするのを可能にす
る。
ヒト中期スプレッドを含むスライドは２ＸＳＳＣから取
り出されてレンズペーパーで拭っテ乾かされた。ハイブ
リダイゼーション混合物は直ちにスライドに適用され、
ガラスのカバースリ、ブがラバーセメント共にスライド
上に置かれて、スライドは３７℃で一晩インキエベート
された。その後スライドの調製はセクシ言ンＶ、　Ｂ、
で述べた手法で進められたにこでは第２１染色体ＤＮＡ
はフルオレセインで染色されて全染色体ＤＮＡはＤＡＰ
＋で対比染色された）。
第１Ａ−０図はその結果を示す。第１Ａ図はコンビ二−
タ画像分析装置で得られたヒト中期スプレ。
ドのＤＡＰ　Ｉ像である。これは全てのものをしきい値
以上は白でそれ以外は黒で示すバイナリ−イメージであ
る。基本的データは２５６の強度レベルの灰色レベル像
で記録された。　（小さい矢印は第２１染色体の位置を
示す。）３１ＫＩＢ図は第１Ａ図と同じスプレッドの、
これもバイナリ−形式での、フルオレセイン像である。
　にこでも小さい矢印は第２１染色体の位置を示す。）
第１Ｃ図は、他のより淡（染色されたものが標準的イメ
ージ処理技法で除かれた後の第２１染色体の位置を示す
。
ＶＴ、８．　２１１リソミーの　　およびブルースクラ
イブプラスミドライブラリーを　用した　　　４　　　
　　　の セクン膳ンＶ１．Ａ、で説明したごとく、共有反復配列
を含むヒト染色体−特異的ライブラリーは、橋本しない
ヒトゲノムＤＮＡでのインキユベーションにより共有反
復配列のハイブリダイゼーンヨンキャパンイティが減少
されていれば、その染色体を染色するのに使用すること
が出来る。セクションＶ１．Ａでは、不均一な混合物の
核酸配列がファージベクターカロン２１Ａ中でクローン
され、そこではベクター　ＤＮＡのインサートの比は約
０．１　（４０ｋｂのベクターに対し平均４ｋｂのイン
サート）である。このセクションでは、より小さいクロ
ーニングベクター　約３キロベースのブルースクライブ
プラスミド、に対して同じインサートの転移することが
、ベクターＤＮＡに対するインサートの比を０５に増大
させて、染色の特異性と強さを改良したことを実証する
。
前に論議したごとく、プローブのインキュベーンヨンは
プローブ単独ででも、標識されていないゲノムＤＮＡと
混合されたプローブででも、また全体で濃縮された標識
されていないＤＮＡまたはある共有反復配列と混合され
たプローブででも行えることを論議した。もし標識され
ていないゲノムＤＮＡが加えられるならば、プローブ内
の共有反復配列を充分に無能力化するに足るだけ加える
ことが重要である。しかしながら、ゲノムＤＮＡはハイ
ブリダイセーフ１ンが要望される配列の標識されていな
いコピーも含んでいる。上に述べたごとく、ここではハ
イブリダイゼーション混合物中の染色体−特異的配列の
標識されたコピーに対する標識されていないものの比と
してＱが定義される。
ビンケル等［Ｐｉｎｋｅｌ　ｅｔ　ａｌ、、ＰＮＡｓ（
ＬＩＳＡ）、８５９３１８−Ｑ１４２（Ｄｅｃｅｍｂｅ
ｒ　１９８Ｂ）］は、他の染色体と共有している染色体
−特異的ライブラリー中の配列のハイブリダイゼーショ
ンを競争して阻止するための標識されていないゲノムＤ
ＮＡの使用を記載している。この論文はヒト染色体−特
異的ライブラリ−［ブルースクライブプラスミド（ｐＢ
Ｓ−４）にサブクローンされた第４染色体ライブラリー
ＬＬ０４ＮＳＯ２、ブルースクライブプラスミド（ｐＢ
Ｓ−２１）にサブクローンされた第２１染色体ライブラ
リーＬｌ、２１ＮＳＤ２］での蛍光インシトウハイプリ
ダイゼーシヲンのための原料および方法を記載している
。これらのハイブリダイゼーションの結果は第４Ａ−Ｃ
図および第４ＦおよびＧ図に示されている。
■二、７つの酵母クローン）ＩＹｌ、　ＩＹｌ９．ＨＹ
２９１（ＹＡｌ、Ａ２．１ｌＹＡ３．Ａ２．）ｌＹＡ３
．Ａ９、およびＨＹＡ９．Ｅ６がり、パーク（Ｗａｓｈ
ｉｎｇｔｏｎ　１Ｉｎｊｖｅｒｓｉｔｙ、Ｓｔ、Ｌｏｕ
ｉｓ、Ｎｏ）から得られた。クローン中のヒトＤＮＡの
長さは約１００ｋｂから６００ｋｂの範囲であった。ゲ
ル電気泳動がこれらのインサートのサイズを確かめるた
めに行われた。
これらの各クローンは増殖されて全てのＤＮＡが分離さ
れた。分離されたＤＮＡはチミジンの１０−３０％がビ
オチン−１１−ｄＵＴＰで置換されるようにニックトラ
ンスレーアｇンによりビオチン化された。ニックトラン
スレーション後の全ての標識されたＤＮＡの濃度は１１
０−２０ｎ／ｕｌの範囲内だった。
プロ　キング［）ＨＡ、　　ヒト胎盤ＤＮＡ（Ｓｉｇｍ
ａ）がブロテイナーゼＸで処理され、フェノールで抽出
されて、２００−６００ｂｐのサイズ範囲にまで音波処
理された。人工染色体を含まない酵母から分離された全
ＤＮＡが同様のサイズ範囲まで音波処理された。これら
のＤＮＡは両方とも１１−１Ｏｕ／ｕｌのｄ１４度に保
持された。
インシトゥハイブリダ１゛ゼーンヨン　ＦＩＳＨハイブ
リダイゼー７１ンは僅かの変更を加えてよ胆ビンケル等
（１９８８）に従って行われた。中期スプレッドは、ハ
ーバ−等の手法［Ｈａｒｐｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　。
Ｔ’ＮＡＳ（ＩＩＳＡ）７Ｂ＋４４５８−４４６０．　
（１９８１）］　ニヨ６１　トｈ　レキセード同期培養
により調製された。細胞はメタノール／アセティソクア
ンソド（３１）中で固定され、スライド上に落とされ、
空気乾燥されて、使用されるまで−２０”Ｃで窒素中に
貯えられた。それからスライドは標的ＤＮＡ配列を変性
するために７０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣ中に２分間
浸され、７０−８５−１００％エタノール系中で脱水さ
れ、空気乾燥された。　（ＳＳＣは０．１５Ｍ　ＮａＣ
１１０，０１５Ｍ　Ｎａ　Ｃ１ｔｒａｔｅ、ｐＨ７であ
る。）それから１１０−１Ｏ０ｎのビオチン化された酵
母ＤＮＡ、　　およびそれぞれ約ｌｕｇの標識されてい
ない酵母とヒトゲノムＤＮＡがハイブリダイゼーション
混合物（最終容積１０ｕ１、最終組成５０％ホルムアミ
ド／２ＸＳＳＣ／１０％デキストランサルフェート）に
加えられ、７０℃で５分間加熱され、それから更に高度
に反復された配列の相捕的ストランドが再結合するのを
許容するために７０℃で１時間加熱される。
次いでハイブリダイゼーション混合物はスライド（面積
およそ４ｃｌ１２）に適用されてガラスのカバースリッ
プのもとにラバーセメントでシールされた。３７℃で一
晩のインキュベージジンの後に、カバースリップは除か
れてスライドは３回３分それぞれ４２−４５℃の５０％
ホルムアミド／２ＸＳＳＣ中で、また１回ＰＮ緩衝液［
ｐＨ８の０．１Ｍ　ＮａＨ２ＰＯａと０．１Ｍ　ＮａＪ
ＰＯ４の混合物；Ｏ，１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ−４０（
Ｓｉｇｍａ）１中で洗浄された。それから結合されたプ
ローブは、アビジン−ＦＩＴＣおよびヤギー抗−アビジ
ン抗体（何れもＰＮＭ緩衝液（ＰＮ緩衝液プラス５％脱
脂粉乳、固形分除去のため遠心分離ｉ　０．０２％ソジ
ウムアジド）中に５層ｇ／ｖＡ１）　中で交互の２０分
のインキュベージジン（室温）で検出された。アビジン
および抗−アビジンインキュベーションはそれぞれＰＮ
緩衝液中での３回３分の洗浄で分離された。２または３
層のアビジンが加えられたくアビジン、ＤＯＳグレード
およヒヒオチン化されたヤギー抗−アビジンはＶｅｃｔ
ｏｒ　Ｌａｂ。
ｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ、、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、
ＣＡから得られる）。
第５図はＨＹＡ３．　Ａ２　（５８０ｋｂのヒトＩ）Ｎ
Ａ）の１２ｑ２１．１に対するハイブリダイゼーション
を示している。
ハイブリダイゼーションの位置は、ＤＡＰＩ／アクチノ
マイシンＤ法［Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ、−Ｒｅｖｅｒｓｅ
　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔｅｈｒｏｍｏｓｏ＋＋ｅ　ｂ
ａｎｄｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎ　ａ
ｎｄＤＡＰＩ”、Ｃｈｒｏ＋ｍｏｓｏｍ＋、５８：３０
７−３２４（１９７６）コ　（ＤＡＰ　Ｉ／ａｃｔｊｎ
ｏＢｃｉｎ　Ｄ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を採用した通常
の蛍光バンディング手法を用いて確定された。ハイブリ
ダイゼーション信号は各第２１染色体の幅を横切るバン
ドを形成し、染色体のその領域におけるＤＮＡの充填の
形態構造を示している。
ＹＡＣクローンの位置は下記第２表に示すとおりと考え
られる。
（以下金白） 第２表 ＹＡＣ競合ハイブリダイゼーション （ＹＡＣＣｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ　　Ｈｙｂｒｌｄｉｚ
ａｔｉｏｎ）ＹＡＣクローン １Ｙ１ １（Ｙ１９ Ｙ２９ １１ＹＡ１．Ａ２ ＨＹＡ３．Ａ２ ＨＹＡ３．Ａ９ ＦＩＹＡ９．Ｅ６ イ ンサートサイズ ２０ ５０ 部位 ｑ２３ ８ｑ２３．３ ２１ｑ２１．１ ４Ｑ１２ ｑ１６ １２ｑ２１．１ ４ｑ２１ １ｐ３６．２ ｑ２２ Ｖｌ、Ｄ、　　ヒト　ハムスター　　　　とのハイブリ
上記ビンケル等（１’ｌ［１Ｉｌ）の手法で詳述され上
記セクンヨンＶ、　Ｃ，およびＶｌ、Ｂ。で例示された
と本質的に同じハイ・プリダイゼーンヨンおよび染色条
件が、この例では使用された。この例では、ヒト第１９
染色体の一つのコピーを含むハムスター−ヒト雑種細胞
からの４００ｎＨのビオチン様識されたＤＮＡが、１Ｏ
ｕｌのハイブリダイゼーション混合物中で、１．９層ｇ
の標識されていないヒトゲノムＤＮＡと混合された。ハ
イブリダイゼーションは３７℃でおよそ６０時間であっ
た。結合プローブの蛍光染色と染色体の対比染色は上述
の他の例と同様であった。第６図はハイブリダイゼーシ
ョンの結果を示す。
■、具体的適用例 この発明は、細胞上において細胞ベースで、顕微鏡的な
またある場合にはフローサイトメトリー的な遺伝的異常
の検出を可能にする。検鏡は全て人間の観察者によりな
されてもよいし、完全なオートメーシ目ンにいたるまで
の種々の程度の付加的器具の使用および算出方法の助成
手段を含んでもよい。このような分析のための器具の使
用やオートメーションは多くの利点を与える。その中に
は、人間の観察者には不可視な蛍光染料（例えばインフ
ェアードダイ（ｉｎｆａｒｅｄ　ｃｌｙｅｓ））の使用
や、同時的には可視でない多重標識法（例えば蛍光およ
び吸収染色、オートラジオグラフィー等の組合せ）で得
られた結果を判断する機会がある。量的測定は人間の観
察者では検出できない染色の差を検出するのに使用でき
る。以下に述べるごとく、オートメーン冒ン化された分
析は、細胞および染色体が分析される速度を増大させる
こともできる。
本発明のプローブで検出できる細胞遺伝学的異常のタイ
プはつぎのものを含む。■；　染色体タイプの全体また
は部分の重複が、その染色体タイプまたは部位のための
プローブでのハイブリダイゼーションに続く中期スプレ
ッドまたは間部核中の識別できるハイブリダイゼーンヨ
ンドメインの数またはサイズの増加として、または結合
されたプローブの量の増加により検出できる。もしプロ
ーブが蛍光により検出されるならば、結合されたプロー
ブの量はフローサイトメトリー的にまたは定量的蛍光検
鏡により確定される。装入：　全染色体または染色体部
位の欠失が、その染色体タイプまたは部位のためのプロ
ーブでのハイブリダイゼーシ贈ンに続く中期スプレッド
または間部核中の識別できるハイブリダイゼーンヨンド
メインの数またはサイズの減少と１．て、または結合さ
れたプローブの量の減少により検出できる。もしプロブ
が蛍光により検出されるならば、結合された量はフロー
サイトメトリー的にまたは定量的蛍光検鏡により確定さ
れる。　　　　二　　　および２転座、二動原体および
逆位が、普通は再配列の点にある染色体の領域の側部に
位置しまたは伸びるプローブでのハイブリダイゼーショ
ンに続いて分離されるハイブリダイゼーションドメイン
の異常な並置により中期スプレッドおよび間部核中にお
いて検出される。転座は少な（とも２つの異なる染色体
タイプに影響を与えて、ただ一つの動原体をそれぞれ有
する派生的染色体という結果となる。二動原体は少なく
とも２つの異なる染色体タイプに影響を与えて、動原体
を欠く少なくとも一つの染色体断片と２つの動原体を有
するもう一つという結果となる。逆位は染色体の一部の
極性の逆転を伴う。
■、Ａ、二２」二矩丘 中期スプレッドによる自動的な染色体の分類および異常
検出のためのオートノーン１ン化されたシステム（特に
コンピューター制御顕微鏡）の開発に向けて、過去３０
年間相当な努力がなされてきた。近年は、種々の染色体
タイプ上にはっきり認識できるバンディングパターンを
生ずるように化学的に染色された染色体の自動分類に努
力が向けられてきた。これらの努力は、おおよそ同じサ
イスノ染色体タイプの間のバンディングパターンの微妙
な差のために、また異なる中期中の染色体の特質的な双
輪は各タイプの染色体上に見られるバンドの数および幅
の変化の原因となるので、ごく部分的にしか成功してい
ない。本発明は、間隔、幅および標識の差異（例えば異
なる色）がオートメーシ璽ン化された染色体の分類およ
び異常検出を容易にするように最適化される染色ノくタ
ーンを生じる試薬の構成を可能にすることにより、これ
らの問題を克服する。このことは、ノ飄イブリダイゼー
ションプローブが染色体の長さに沿って所望のように選
択できるので可能である。このような試薬により生じる
バンドのサイズは、単一の小さいドツトから一つまたは
それ以上の染色体を本質的に一様に覆うものまでの範囲
に及ぶであろう。
従って本発明は、隣接したノ・イブリダイゼーションド
メインが例えば色により見分けられるような、ハイブリ
ダイゼーションプローブの構成、および好ましくは蛍光
のような標識手段の使用を可能にし、これにより分解す
るには空間的に余りにも接近しているバンドもスペクト
ル的に検出される（すなわち、もし赤と緑の蛍光を発す
るバンドが合体していれば、この２つのバンドの存在は
結果として生じる黄色の蛍光により検出される）。
本発明はまたバンディングパターンの１１１５を具体的
な適用例に適応させるのを可能にする。従つてそれらは
、例えば全体的形状およびサイズが同様であり従来の技
法を用いたのでは同様のバンディングパターンを有する
染色体上において、空間的配置および色の混合がきわめ
て異なるものになり得る。本発明のプローブにより生じ
るハイブリダイゼーシ日ンバンドのサイズ、形および標
識（例えば色）は、機械評価（ｍａｃｈｉｎｅ　ｓｃｏ
ｒｉｎｇ）の誤りを除くように最適化でき、正確なオー
トメーション化された異常検出が可能になる。この最適
化されたバンディングパターンはまた視覚による染色体
分類および異常検出を大幅に改良する。
特異的転座切断点の認識の容易さは、切断の領域に対し
ぴったりと標的化された試薬の使用により改良される。
例えば、染色体の切断の両側にハイブリダイズする配列
からなる本発明による高コンプレキシティプローブが使
用できる。切断の一側に結合されるプローブの部分は他
側に結合されるものとは、例えば興なる色により異なっ
て検出される。このようなパターンでは、正常な染色体
は互いに隣あった興なる色のハイブリダイゼー／冒ン領
域を有するであろうし、このようなバンドは接近して現
れるであろう。切断はプローブを異なる染色体に分離す
るか結果的に染色体断片となるであろうし、平均して更
に離れて視覚化されるであろう。
■、Ｂ、先Ｊ口り亘」」［広 生物学的線量法への一つの接近手段は、潜在的に有毒な
薬剤に暴露された個体により被った遺伝学的損傷の兆候
として、構造的に異常な染色体の頻度を測定することで
ある。多数の研究が、染色体異常誘発物と呼ばれる電離
性放射線およびその他の薬剤に対する暴露の増大と共に
構造的異常の頻度が増大することを示している。二動原
体染色体は、その特徴のある性質がバンド分析なしに速
やかに記録することを可能とするので、最も普通に記録
される。作業場で見いだされるレベルに暴露された個体
におけるこのような異常は低い頻度（〜２Ｘ　１０−３
／細胞）であるので、速やかな分析が重要である。遺憾
ながら、二動原体は安定して維持されないので測定され
た二動原体の頻度は暴露後の時間と共に減少する。従っ
て、長時間にわたる低レベルの暴露は、異常が連続的に
除去されるので結果的に高い二動原体頻度とはならない
。転座は多かれ少なかれいつまでも維持されるのでこの
ような線量法的研究のための記録にはより適した異常で
ある。従って、遺伝子損傷の評価を暴露板長時間たった
ときに行うことが出来る。転座は、それを見分けること
の困難さが線量法のために充分な数の細胞を記録するこ
とを論理的に不可能にするので、生物学的線量法のため
には日常的に記録されない。
本発明はこの困難さを除くものである。特にいくつかの
染色体（例えば第１．第２．第３および第４染色体）を
本質的に一様に染色するプローブでのハイブリダイゼー
シ■ンは、これらの染色体を巻き込んだ構造的異常の中
期スプレッド中における即時の顕微鏡的同定を可能にす
る。正常な染色体はプローブにより完全に染色されまた
は染色されないで現れる。標的および非標的染色体の間
の転座の結果派生した染色体は、部分的にのみ染色され
たものとして認識される（第４Ｄ図）。このような部分
的にハイブリダイズされた染色体は、顕微鏡内で視覚的
にまたはコンピューターにより助成された検鏡を採用し
たオートメーション化されたやり方で即時的に認識され
る。転座と二勤原体の間の識別は、プローブに全ての染
色体動原体で見出される配列を加えることにより容易に
なる。
プローブエレメントの残りを検出するのに使用されたも
のとは異なる、標識手段例えば色を有するプローブの動
原体の成分の検出は染色体動原体の即座の識別を可能に
し、それは次いで二動原体と転座の間の識別を容易にす
る。この技術はこれまでの技法では必要であった記録の
ための努力を劇的に減少させて、低レベルの生物学的線
量法のために必要な一万もの中期スプレッドを検査する
ことを可能にする。
■、Ｃ６直進」し１皿 出生前に発見される最も普通の異常は、第２１染色体（
ダウン症候群）、第１８染色体（ニドワード症候群）お
よび第１３染色体（パトー症候群）ならびにｘＯ染色体
（ターナ−症候群）、ＸＸＹ染色体（クラインフェルタ
ー症候群）およびＸＹＹ染色体の異常を伴う三染色体性
である。構造的異常も生じる。
しかしながら、これらはまれであってその臨床的重要性
もしばしば不確実である。従って、これらの異常を検出
することの重要性は疑問である。羊水穿刺や絨毛生検の
様な伝統的な核型のために胎児細胞を得る今の技法は、
分析のための百から千の細胞をもたらす。これらは通常
細胞遺伝学的分析に充分な分裂細胞を作り出すために、
２から５週間培養基中で増殖される。中期スプレッドが
調製されれば、伝統的バンド分析で分析される。このよ
うな処理は高度に熟練した分析家によってのみ実行でき
また時間を浪費するので、最大の細胞遺伝学研究所によ
るものでも信頼性を持ってなされる分析の数は年に数千
たけである。結果的に、出生前の細胞遺伝学的分析は通
常、子供に遺伝病の高いリスクがある婦人（例えば３５
才以上の婦人）に限られている。
本発明は、細胞培養不要または最小限の細胞培養で、間
部細胞中の普通の数字で表した細胞異常の簡単な速やか
な同定を可能にしてこれらの困難さを克服するものであ
る。特に、ｔＪ　２１．　　第１８．第１３、ｘおよび
Ｙ染色体の異常の数が、これらの染色体くまたはそれの
ダウン症候群に対する２１ｑ２２のごとき重要な領域）
に対し特異的なプローブでのノーイブリダイゼーシロン
に続いて、ハイブリダイゼーションドメインの数を計数
することにより間期細胞において検出できる。ノ）イブ
リダイゼーションドメインはハイブリダイゼーションの
強さが高くなっている密ではつきりした領域である。第
２１第１８および第１３染色体に対する３つのドメイン
を示す細胞の増大した頻度（特に１０％より大となる）
は、それぞれダウン、ニドワードおよびバトー症候群の
発生の兆候である。Ｘ−特異的およびＹ−特異的プロー
ブでのハイブリダイゼーショ／に続く、シングルス−特
異的ドメインを示しＹ−特異的ドメインを示さない細胞
の数の増加は、ターナ−症候群の発生の兆候である。２
つのスー特異的ドメインおよび１つのＹ〜特異的ドメイ
ンを示す頻度の増加はクラインフェルター症候群の兆候
であり、１つのＸ−特異的ドメインおよび２つのｙ−特
異的ドメインを示す細胞の頻度の増加はＸＹＹ胎児の兆
候である。
ハイブリダイゼーションの強さはそれに対しプローブが
特異的である標的染色体の数とおおよそ比例するので、
間朋細胞中でのドメイン計数は、例えば量的蛍光検鏡ま
たはフローサイトメトリーを使用したハイブリダイゼー
ションの強さの計測により補われ（またはときには置き
換えられ）る。
いくつかの染色体を含む数字で表した異常は、異なる染
色体のハイブリダイゼーションを異なる標識手段例えば
異なる色で検出することにより同時に記録できる。これ
らの異常検出手法は、集団中の全ての細胞を記録できる
ので、手法に必要な大規模な培養の必要性を克服する。
これらは数字的異常というハイブリダイゼーション橋示
の簡単で明確な特質の故に高度に熟練した分析家の必要
性を除く。
数的異常が間期でも検出できるという事実はまた、普通
は有糸分裂へと刺激できない細胞の細胞遺伝学的分析を
可能にする。特に、母性抹消血液中に見いだされる胎児
細胞の分析を可能とする。
このような特性は、羊水穿刺または絨毛生検のような侵
略的胎児細胞サンプリングの必要性を除くので有益であ
る。
背景でも示したごとく、このような胚−侵入的方法が必
要な理由は、これまでの核型およびノ４ンド分析は中期
の染色体を必要とするということである。いまのところ
、中期の染色体を有する細胞の集団を調製するために母
性血液から分離した胎児の細胞を培養するための一般に
認められた手法はない。本発明の染色試薬は間部核に利
用できるという点において、胎児細胞を核型分析する非
−胚侵人的方法が本発明により提供される。
このような方法における最初のステ、ブは胎盤を通り抜
けまたは胎盤から母性血液中に流れ出た胎児細胞を分離
することである。母性血液中の胎児細胞の率は非常に低
く、細胞数は１０−４から１０−ａ／慣１のオーダーで
あり、妊娠の時期により非常に変化しやすい。しかしな
がら、適切にマークされた胎児細胞は母性細胞から区別
でき、例えば高速細胞選別により濃縮できる。
男性胎児の細胞の存在はＹ染色体に対し染色体−特異的
染色試薬による標識、例えば蛍光タグにより同定できる
。明らかに母性血液から分離されたリンパ細胞または赤
血球前駆体である細胞はＹ−染色質一陽性であることが
示された。　［Ｚｉ１１ａｃｕｓ　ａｔａｌ、、５ｃａ
ｎ、Ｊ、ｌ（ａｅｍａｔｏｌ、１５＋３３３（１９７５
）；Ｐａｒｋｓ　ａｎｄ）１ｅｒｚｅｎｂｅｒｇ、Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｌｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ
、１０゜ｐｐ、２７？−２９５（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐ
ｒｅｓｓ、Ｎ、Ｙ、、１９ｇ２）および５ｔｅｂｅｒｓ
　ｅｔ　ａｌ、、Ｈｕｍａｎｇｅｎｅｔｉｋ、２８：２
７３（１９７５）’ｌ。
胎児細胞を母性血液から分離する好ましい方法は母性血
液には存在しないある成分に対し優先的に親和性を有す
るモノクローナル抗体の使用である。胎児細胞は父方＋
１Ｌ４　（ヒト白血球抗体）マーカーまたは胎児細胞の
表面上の抗体により検出することもできる。異なるＫＬ
Ａタイプに基づき胎児と母性白血球を区別するための好
ましい免疫学的手法はＨＬＡ−Ａ２．−Ａ３および一８
７遺伝子座、更に好ましくは−Ａ２遺伝子座における差
を利用している。更に、第１および第２の三ケ月期の栄
養芽層は、母性白血球中には存在しない内部細胞を構成
するサイトケラチンに対する抗体でマークしてもよい。
代表的なモノクローナル抗体は次の参考文献に述べられ
ている。
ヘルツエンベルク等ＣＨｅｒｚｅｎｂｅｒｇ　ｅｔ　ａ
ｌ、、ＰＮＡＳ７６：１４５３（１９７９）］は、明ら
かにリンパ起源の胎児細胞を、蛍光活性化された細胞選
別（ＦＡＣ３）により母性血液から分離することを報告
しており、そこでは分離は母性血液中のＨＬＡ−Ａ２ネ
ガティブ細胞と結合する標識された抗体の検出に基づい
ていた。
このようなやり方で分離された男性胎児細胞は更にＹ−
染色質の牛ナクリン染色により同定された。
コボーン等（Ｃｏｖｏｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｌａｎｃｅ
ｔ、ｏｃｔ、１３１９８４・８４１）はＨ３１５と称す
るモノクローナル抗体を使用したフローサイトメトリー
による母性血液からの胎児栄養芽層の回収を報告した。
報告によれば、前記モノクローナルは他の栄養芽層と同
じ（ヒト合胞体栄養細胞の表面に絞り出された糖タンパ
ク質で、抹消血液細胞にはないものであることが同定さ
れた。
カワタ等［にａｗａｔａ　ａｔ　ａｌ、、Ｊ、Ｅｘｐ、
Ｍｅｄ、、１６０：６５３（１９８０）はヒト胎盤の懸
濁液から胎盤細胞集団を分離する方法を開示している。
この方法は協調した二色および光散乱ＦＡＣＳ分析およ
び選別を使用している。５つの異なる細胞集団が、サイ
ズ、ならびにＨＬＡ−Ａ、　Ｂ、　Ｃモノモルフイ・ツ
ク決定基（ＭＢ４０．５）およびヒト栄養芽層（ａｎｔ
ｉ−Ｔｒａｐ−１およびａｎｔｉ−Ｔｒｏｐ−２）に対
するモノクローナル抗体により検出された細胞表面抗原
の協調表現における量的差異に基づき分離された。
ローフおよびバターワース［Ｌｏｋｅ　ａｎｄ　Ｂｕｔ
ｔｅｒ−ｗｏｒｔｈ、Ｊ、Ｃｅ１ｌ　Ｓｅｔ、、７６：
１８９（１９８５）コは、２つのモノクローナル抗体、
１８Ｂ／Ａ５および１８Ａ／Ｃ４、を述べており、これ
らは第１の三ケ月期の細胞栄養層および合胞体栄養細胞
を含む他の胎児上皮組織とよく反応する。
本発明による染色のために胎児細胞を母性血液から分離
するための好ましいモノクローナル抗体は抗−サイトケ
ラチン抗体Ｃａｍ５．２であり、これはヘクトンーディ
キンソン＜Ｂｅｅｔｏｎ−Ｄｉｅｋｉｎｓｏｎ＞（Ｆｒ
ａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ、Ｎ、Ｊ、、ＵＳＡ）から商
業的に入手可能である。
胎児細胞を母性頭液から分離するための他の好ましいモ
ノクローナル抗体は、１９８９年８月３日に出願され、
′胎児細胞栄養層細胞の分離方法”と題する同時係属出
願中で共有の米国特許出願番号第３８９、２２４号に開
示されたものである［次も参照：Ｆｉｓｈｅｒ　ｅｔ　
ａｌ、、Ｊ、Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、１０９（２＞：８
９１−９０２（１９８９）１゜そこに開示されたモノク
ローナル抗体は第１の三ケ月期のヒト細胞栄養層細胞上
の抗原と特に反応するが、その胎児細胞は母性血行に達
する蓋然性が最も高い。前記出願および記事はここに特
に参考に組み込まれる。簡単に言えば、開示されたモノ
クローナル抗体は、子宮吸引法により分離された胎盤（
ｐｌａｃｅｎｔａｌ　ｂｅｄ）の切片から得られた細胞
栄養層細胞を用いた試験動物の注射により造られた。造
られた抗体は、第１の三ケ月期の羊膜絨毛の細胞栄養層
幹細胞層と反応する抗体を選択するためにいくつかの細
胞学的スクリーンを受けた。
フィノンヤー等により開示されたこのような第１の三ケ
月期の細胞栄養層細胞に対する好ましいモノクローナル
抗体は、ブダペスト条約に基づきアメリカン　タイプ　
カルチャー　コレクンヨン［Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ
ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＴＣ
Ｒｏｃｋｖ口１ｅ、　ＭＤ、　ＬＩＳＡ）コに寄託され
た次のハイブリドーマから造られたモノクローナル抗体
を含んでいる。
ハイブリドーマ　　　ＡＴＣＣ登録番号ＪＩＤ８　　　
　　　　　　ＨＢ１００９６ＰＩＢ５　　　　　　　　
　）１８１００９７両ハイブリドーマの培養は１９８９
年４月４日にＡＴＴＣにより受は入れられて１９８９年
４月１４日に生育可能と報告された。
フィノ／十−等は前記モノクローナル抗体により母性血
液から分離された胎児細胞が試験管内で複製可能である
と述べている。従って、フィッシャー等の方法により分
離された胎児細胞すなわち第１の三ケ月期の胎児細胞栄
養層は、中期および間部における胎児の染色体物質を提
供できる。
胎児細胞、好ましくは白血球および細胞栄養層、更に好
ましくは細胞栄養層は、適切な抗体で一旦マークされて
から、直接または好ましくは前記胎児細胞を細胞選別ま
たはパンニング（ｐａｎｎｉｎｇ）　ニヨり分離し濃縮
することにより、母性血液から分離される。例えば、Ｐ
ＡＣ３は蛍光標識された細胞を分離するのに使用され、
またはフローサイトメトリーも使用される。
母性血液から一旦分離された胎児細胞は、本発明の適切
な染色体−特異的染色試薬、好ましくは出生前診断に特
に重要なものでもって本発明の方法により染色される。
好ましい染色試薬は異数体、例えば染色体タイプ２１．
１８．１３．　ＸおよびＹならびに第２１染色体上のサ
ブリジョン２１ｑ２２のごときこれらの染色体上のサブ
リ′）Ｗンを含むいくつかの染色体の何れかの三染色体
性、を検出するように造られたものである。
好ましくは、本発明による染色分析のための胎児サンプ
ルは少な（とも１０個の細胞または咳、更に好ましくは
約１００個の細胞または核から成る。
■、Ｄ、１１１１１旦１ 近年の多数の研究は、特定の病気の表現型の診断に役立
ちまた病気それ自信の遺伝学的性質への手がかりを提供
する、構造的および数的染色体の異常の存在を明らかに
した。著名な例には、慢性骨髄性白血病と第９および第
２２染色体に伴う転座との密接な関連、１３ｑ１４の部
位の欠失と網膜芽細胞腫との関連および第８および第１
４染色体に伴う転座とバーキットリンパ慢との関連が含
まれる。新種の腫瘍の特異的異常を明らかにする今日の
進歩は、細胞遺伝学的分析のための代表的な高品質のバ
ンプ、ド中期スプレッドを造ることの困難性により制限
されている。これらの問題は、多くのヒト腫瘍は培養基
中で増殖させることが困難または不可能であるという事
実に由来する。従って、分裂細胞を得ることは普通は困
難である。たとえ細胞が培養基中で増殖できたとしても
、増殖する細胞が腫瘍集団を代表するものでないという
少なからぬ危険がある。この困難性はまた存在する遺伝
学的知識を臨床的診断および予後に応用することを妨げ
ろ。
本発明はこれらの制限を、開明核内の特定の構造的およ
び数的異常の検出を可能にすることにより克服する。こ
れらの異常は上に述べたごと（検出される。全染色体プ
ローブでのハイブリダイゼーションはこれまでは知られ
ていなかった異常の同定を容易にし、これにより異常と
病気の表現型の間の新しい関連の速やかな進展を可能に
する。
特定の悪性腫瘍の遺伝学的性質が次第によく知られてき
ているので、遺伝学的障害を標的とするハイブリダイゼ
ーションプローブを選択することにより、開明評価分析
はますます具体的に行うことが出来る。選択された染色
体上の特定の転座は、ぴったりと切断点を側面から攻撃
するハイブリダイゼーションプローブの使用により検出
できる。
これらのプローブの使用は特定の病気の表現型の診断を
可能にする。これらは正常では分離されているハイブリ
ダイゼーションドメインを一緒にし、またはハイブリダ
イゼーションドメインを２つのはっきり分離されたドメ
インに分離するので、転座は開明において検出できる。
これに加えて、これらは治療の途中で悪性細胞の減少お
よび再出現をフォローするために使用できる。このよう
な応用では、存在するかも知れない細胞が少数であり、
またそれらは刺激して有糸分裂させることが困難または
不可能であるかも知れないので、開明分析が特に重要で
ある。
重複および欠失、遺伝子増幅およびヘテロ接合度がなく
なることに伴うプロセスも、本発明の技法を用いて中期
および開明において検出できる。
そのようなプロセスは異なる腫瘍の数の増大に関連して
いる。
プローブ、このセフシロンは、本質的に全てのＣＭＬ患
者において融合ＢＣＲ，ＡＢＬ配列のわきに位置する第
９及び第２２染色体からのプローブを用いるＦＩＳ）ｌ
に基づ＜　ＣＭ、、試験について詳述する（第８図）。
このセクンコンの例において用いられたＢＣＲ，ＡＢＬ
プローブは、米国イリノイ州シカゴのユニパーシティオ
ブシカゴメディカルセンターの血液学／腫瘍学セクショ
ン、デパートメントオブメディノンのカロル　エイ、ウ
ェストプルツクによって好意的に提供された。
第９染色体上のＡＢＬプローブ、ｃ−ｈｕ−ＡＢＬは、
切断が起きるエキソンＩＢと！Ｉの間のＡＢＬの２００
−ｋｂ領領域テロメリツクであるように選ばれた３５−
ｋｂコスミド（ｐｃＶ１０５）りｏ　−ンテある（２４
）、　　第２２染色体上のＢＣＲプローブ、ＰＥＭ１２
は、殆ど全てのＣＭＬ切断点が起きるＢＣＲ遺伝子の５
．８−ｋｂ切断点クラスター領域の部分を含み、かつこ
れにセントロメリックに延びる１８−ｋｂファージクロ
ーン（ＥＭＢＬ３内）である。ＦＩＳＩ（はフルオロク
ロームテキサスレッドによって検出されるビオチン標識
ＡＢＬプローブと、グリーンフルオロクロームＦＩＴＣ
によって検出できるジゴキ／ゲニン標識ＢＣＲプローブ
を用いて行われた。両プローブのハイブリダイゼーショ
ンは、二重バンド通過フィルターセットの付いた蛍光顕
微鏡（オメガオプティカル）を用いて同時に観察するこ
とができた。
第８図は、第２２染色体上のＢＣＲ遺伝子、第９染色体
上のＡＢＬ遺伝子、およびフィラデルフィア染色体上の
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の略図であって、ＣＭＬ切断
点の位置とプローブに対する関係を示す。ＢＣＲ遺伝子
のエキソンはソリッド枠で示す。ローマ数字１はＢＣＲ
遺伝子の第１のエクソンを示し、アラビア数字１５は、
破線で表した切断点クラスター領域内のエクソンを示す
。１８ｋｂフア一ジＰＥＭ１２プローブ（ＢＣＲプロー
ブ）の概略の位置は、無地の水平の棒によって示す。Ｃ
ＭＬにおける切断点の大部分はエキソン２と４との間で
起きるので、ＰＥＭ１２に対する１５ｋｂまたはそれ以
上の標的がフィラデルフィア染色体上に残るであろう。
標準的相互転座においては、ＰＥＭ１２に対する数ｋｂ
の標的（検出できない蛍光シグナル）が派生染色体上に
見出されるであろう。マツプとエクソンの番号付け（尺
度は別として）は、ハイスターカンブ等（前記文献３４
）から改作した。
ＡＢＬ遺伝子のエクソンは、無地の垂直の棒で示す（尺
度は別として）。ローマ数字１ａ％　ｌｂは択一的に第
１のエキソンを、１１は第２のエキソンを示す。
エキソン１１は２８ｋｂコスミドｃ−ｈｕ−ａｂｌ　（
ＡＢＬプローブ）の末端の上流的２５ｋｂにある。全て
のＣＭＬ切断点は、二手ソン１１の上流、通常はエキソ
ンＩｂとＩａの間で、長さ約２００ｋｂの領域内で起き
る。このため、。−ｈｕ−ａｂｌは、融合結合から常に
２５から２００ｋｂ離れているであろう。マツプは（尺
度は別として）ハイスターカンプ等（前記文献３５）か
ら改作した。
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子が示されている。ＣＭＬにお
いて、ＰＥＭ１２は常に結合に位置するであろうが、　
ｃ−ｈｕ−ａｂｌはＰＥＭ１２から２５ないし２２５ｋ
ｂ離れているであろう。
１乙工土星Ｊｌ：　ＣＭＬ−４：　末梢血液を５分間遠
心分離した。界面の１０滴をＰＢＳで希釈し、攪はんし
く５ｐｕｎ　ｄｏｗｎ）、メタノール／アセティクアシ
ッド＜３：１）中で固定し、スライド上に滴下した。Ｃ
ＭＬ−２，３，７：　凝固を防ぐためにＰＢＳで希釈し
た５ないし１０滴の髄をメタノール／アセティクアシッ
ド中で固定し、スライド上に滴下した。ＣＭＬ−１，４
，５，６：　　末梢血液および／または骨髄を、ＲＰＭ
Ｉ　１６４０中で、１０％のウシ胎児血清、抗生混合物
（ゲンタマインン５００＋＋ｇ／ｍｌ）および１％Ｌ−
グルタミンを補って２４時間培養した。培養は、Ｊ、Ｊ
ユニスおよびＭ、Ｅチャンドラ−、Ｐｒｏ　、ｌｎ　Ｃ
１１ｎ、Ｐａｔｈ、、？＋２６７（１９７７）に従って
シンクロナイズさせ、これに続いてギビスおよびジ＋　
り７７　、　■１■］、　１１　：　９１　（１９８５
）に従って染色体調製を行った。
ハイブリダイゼーションおよび　　プロトコルハイプリ
ダイゼーン１ンは、Ｄ、ビンケル等（２７）、　ｈラス
タ等（２５）、およびＪ、　Ｂ、ローレンス等（３０）
によって記載された手続きを修正して行った後に続いて
実施した。ＢＣＲプローブは、平均して２５％の組み込
みを伴ったジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Ｂｏｅｈ
ｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃ
ａｌｇ）を用い、ニック−トランスレートされた（Ｂｅ
ｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ　Ｎ１ｃｋ−Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　５ｙｓｔｅ
＋ｔ）ｏ　　ＡＢＬプローブは、同様にビオチン−１１
−ｄｔｌＴＰ（Ｅｎｚｏ　Ｄｉａｇ−ｎｏｓＮｃｓ）を
用いてニック−トランスレートされた。
１、ハイブリダイゼーション、標的開明細胞および／ま
たは中期スプレッドを、ガラススライド上で７２℃で７
０％ホルムアミド／２ＸＳＳＣ中にｐ１７で２分間変性
する。エタノールシリーズ（７０％、８５％、１００％
各２分間）中で脱水する。空気乾燥し、３７℃（２Ｘ　
ＳＳＣは０．３Ｍ　ＮａＣ１／３０ｍＭソジウムサイト
レート）に置く。各プローブ２ｎｇ／ｍ１．５０％ホル
ムアミド／２　ｘ　ＳＳＣ，１０％デキストランサルフ
ェート、および１ｍｇ／ｍｌヒトゲノムＤＮＡ（２００
−６００ｂｐに音波処理）を含むノ＼イブリダイゼーシ
ョン混合物１０　ｍｌを７０℃に５分間加熱してＤＮＡ
を変性スる。３０分間３１℃でインキュベートする。温
めたスライド上に置き、２０ｍｍＸ　２０＋ｕｅのカバ
ースリラッテ覆い、ラバーセメントでシールし、！！ｉ
ｉ潤室中で３７℃で一夜インキユペートする。カバース
リップを取り除き、３回２０分間それぞれｐＨ７，４２
°Ｃの５０％ホルムアミド／２ｘＳＳＣで、２回２０分
間それぞれ４２℃の２ＸＳＳＣで洗浄し、最後に室温で
４ＸＳＳＣでリンスする。
２、　　ムしたプローブの　　：　全でのインキコベー
シ目ンステップは、約１００１の溶液と共に室温でカバ
ースリップの下で行う。ビオチン化されたＡＢＬプロー
ブが先ず検出され、 次いでジゴキシゲニ ンー標ｍ　ＢＣＲプローブが検出された。
ａ、　ビオチン　ＡＢＬプローブ：　　４Ｘ　ＳＳＣ／
１％ウソ血清アルブミン（ＢＳＡ）によ３５分間プレブ
ロックする。
テキサスレッド−アビジン（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓＩｎｃ、　、　４ｘ　ＳＳＣ／１％ＢＳ
Ａ中２Ｂ／ｍｌ）を４５分間施す。４×ＳＳＣで一回、
　４Ｘ　５ＳＣ７１％ト　リ　ト　ンーＸＩＱＯ（Ｓ（
Ｈｍａ）で、さらに再び４ｘ　ＳＳＣでそれぞれ５分間
洗浄する。５分間ＰＮＭ（脱脂ドライミルク５％、ソジ
ウムアジド０．０２％を含み、遠心分離により固形物を
除いたＰＮｏＰＮは、０、１ＭＮｇ）Ｉ２ＰＯａ１０．
　ＩＭＮａｔＨＰＯｎ、　０．０５％ＮＰ４０．　ｐＨ
８である）中でブレブロックする。ビオチン化されたヤ
ギ抗−アビジン（Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ　　Ｉｎｅ、、ＰＮＭ中Ｓｍｇ／ｍｌ）を４５分間
施すウ　ＰＮで２回５分間洗浄する。第２層目のテキサ
スレッド−アビジン（ＰＮＭ中２ｍｇ／Ｉ）を４５分間
施す。ＰＮで２回それぞれ５分間洗浄する。
ｂ、　ジゴキシゲニン　　ＢＣＲプローブ：　　ＰＮＭ
で５分間プレブロックする。ヒツジ抗−ジゴキシゲニン
抗体（Ｄ、Ｐｅｐｐｅｒ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａ
ｎｎｈｅｉ＋＊　ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＩｎｄｉａ
ｎａｐｏｌｉｓ、　ＩＮから入手、　ＰＮＭ中１５．４
ｍｇ／ａｌ）を４５分間施す。ＰＮで２回それぞれ５分
間洗浄する。ＰＮＭで５分間プレブロックする。ＦＩＴ
Ｃにより抱合されたウサギ−抗−ヒツジ抗体＜０ｒｌＢ
ａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ−ＣａｐｐｅｌＰＮＭ中１＋
ＳＯ）を４Ｓ分間施す。２回それぞれ５分間ＰＮで洗浄
する。必要により、シグナルは、５分間ＰＮＭによりプ
レブロックし、かつＦＩＴＣにより抱合されたヒツジ抗
−ウサギＩｇＧ抗体（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ
−Ｃａｐｐｅｌ、　ＰＮＭ中１５０）を４５分間施すこ
と（：　ヨツ”’Ｃ増Ｎｆｌされる。ＰＮでリンスする
。
ａ、　　１監立：　　スライドは、対比染色剤としてＩ
Ｂ／＋ｔ１４°、６−アミジノ−２−フェニルインドー
ル＜ＤＡＴ’ｌ）を含む蛍光アンチフエイド溶液（Ｇ、
ＤＪｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｊ、Ｇ、Ｎｏｇｕｅｒｉａ
、Ｊ、Ｉａｖｕｎｏｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ口：３４９（１
９８１）　（肛旦文献３１）にマウントされ、ＦＩＴＣ
／テキサス赤色二重バンド通過フイルターセ１．ト（０
＋＋ｅｇａ　０ｐｔｉｃａｌ）を用い、ノアイスアキ／
オスコープにより検査される。
ここで試験したＢＣＲ−ＡＢＬ　ＰＣＲに対して用いら
れた方法は、ＣＭＬ−３，４と７に対してはヘーゲウイ
９．ンユーベ、カー等によって記載され（前記文献３２
）、またＣＭＬ−５と６に対してはコーラ−等によって
記載された（前記文献３３）方法である０ ！Ｌｉ、　　ＡＢＬおよびＢＣＩ’ｌハイブリダイゼー
／ヨン座位は、たいていの中期スプレッド中の染色体の
両染色分体上に見られた。正常な個体からの中期スプレ
ッドと結合したＡＢＬプローブは、９ｑのテロメア近く
にあるが（第９Ａ図）、ＢＣＲプローブは２２ｑ１１に
おいて結合している（第９Ｂ図）。正常な開明核へのＡ
ＢＬまたはＢＣＲによるハイブリダイゼーションは、典
型的には両相同染色体上の標的配列に対応した２つの小
さな蛍光点を生じた。これらの点は、二次元内核イメー
ジ内に外見上ランダムに分布しており、通常はよく分離
していた。少数の細胞は、２つのダブレットハイプリダ
イゼーションシグナルを示したが、これはたぶんＤＮＡ
のこの領域を複製した細胞内の両相間の両姉妹染色分体
（すなわち細胞サイクルのＳ−またはＧ２−フェイズに
おけるそれら）へのハイブリダイゼーションの結果であ
ろう。正常なＧ１核へのＡＢＬ　（赤色）、ＢＣＲ（緑
色）プローブの二重カラーＦＩＳＨは、核の周囲にラン
ダムに分布した２つの赤色（ＡＢＬ）および緑色（ＢＣ
Ｒ）ハイブリダイゼーションシグナルを生じた。
ＣＭＬの遺伝子再配列は、第８図に示すように、異常染
色体上、通常はＰｈ１であるが、に共に、また間期核内
に共にプローブと相同なりＮＡ配列を生じる。
融合遺伝子中のプローブ結合座位間のゲノム距離は、Ｃ
ＭＬ患者間で変わるが、２５ないし２２５ｋｂの範囲で
あって、単一の白血病クローンの全ての細胞において同
一である。間期ＣＭＬ細胞へのＡＢＣ，ＢＣＲプローブ
による二重カラーハイブリダイゼーンヨンは、核内にラ
ンダムに位置する１つの赤色と１つの緑色のハイブリダ
イゼーションシグナルと、２色間の分離が１ミクロン以
下である１つの赤色−緑色ダブレットシグナル（または
非常に近接したハイブリダイゼーションに対する１つの
黄色のハイブリダイゼーションシグナル、第１Ｏ図参照
）を生じた。ランダムに位置する赤色と緑色のシグナル
は、正常染色体上のＡＢＬ、　　ＢＣＲ遺伝子へのハイ
ブリダイゼーションに、また赤色−緑色ダブレットシグ
ナルはＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子へのハイブリダイゼー
ションに起因する。間期マツピングの研究は、分離が２
５０ｋｂ以下のＤＮＡ配列は間期核においては１ミクロ
ン以下の分離でなければならないことを示唆する（２５
）。結果として、１ミクロン以上分離した赤色と緑色の
ハイブリダイゼーションシグナルを示す細胞は、正常で
あると評価された、というのはこのことはハイブリダイ
ゼーション座位が異なった染色体上にあることと合致す
るからである。しかしながら、統計的考察によれば、正
常細胞のなかには、異常と評価されるのに十分なほど互
いに近接した赤色と緑色の点を示すものがあるであろう
。
この二次元内核分析においては、７５０個の正常核中の
９個が互いに１ミクロン以下の分離の赤色と緑色のハイ
ブリダイゼーションシグナルを示した。かくして、正常
細胞の約１％が異常として分類された。
第３表は、６人のＣＭＬ患者からの７個のサンプルに対
するハイブリダイゼーションの結果を、慣用のカリオタ
イプおよびその他の診断結果（ＰＣＢおよびサザンブロ
ノトデータ）と共に示す。６人の患者全てが、そのなか
には　バンド分析によってＰｈｌ陰性であることが見い
だされた３人（ＣＭＬ−ｆｉ、−６および−７）が含ま
れるが、検査された核の５０％以上において分離が１ミ
クロン以下の赤色−緑色のハイブリダイゼーションシグ
ナルを示した。多くハ、融合事象が殆ど全ての細胞で見
られた。１患者（ＣＭＬ−７）では、ＰＣＲ分析は融合
遺伝子の存在の検出に失敗し、またバンド分析はフィラ
デルフィア染色体を現出しなかったにもかかわず、殆ど
全ての細胞に融合シグナルを示した。
（以下余白） 中期スプレッドへのＪ、＼イブリダイゼーションは３人
の患者（ＣＭＬ−１，−５および−６）について行った
。
これら全ては、単一の末端動原体盟染色体上にごく近接
した赤色と緑色のハイプリダイゼーシ、ンシグナルを示
した。２人の患者において、バンディングによってｔ（
９＋２２）（Ｑ３４；Ｑ１１）と定められたが、Ｐｈ’
に対して予期されたように、その赤色−緑色の対は小さ
な末端動源体型染色体の長い腕のテロメアにごく近接し
ていた（第９Ｃ図）。１人の患者（ＣＭＬ−６）は、古
典的細胞遺伝学によって、２２ｑ１１に染色体物質の挿
入を有すると考えられた。この患者からの中期スプレッ
ドへの二重力ラーハイプリダイゼーンヨンは、小さな染
色体内に中心的に位置する赤色−緑色の対を示したく第
９Ｄ図）。
この結果は、挿入によるＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の形
成と合致する。１人の患者（ＣＭＬ−１）では、２対の
赤色−緑色ダブレットシグナルが１５０個中３個（２％
）の間期核において見られた。これは、これらの細胞中
のダブルＰｂ’（またはダブル融合遺伝子）を示す。
このような事象は、２５の中期スプレッドの分析に限定
されていた標準的細胞遺伝学によっては検出されなかっ
た。付加的Ｐｈｌの取得は、芽球化に伴う最も頻度の高
い細胞遺伝学的事象であって、その細胞遺伝学的検出に
よって、疾患の加速を予告することができるであろう。
ＣＭＬ派生細胞系［−５６２の中期スプレッドへのＡＢ
Ｌ。
ＢＣＲプローブの同時ハイブリダイゼーションは、単一
の末端動源体型染色体の両腕に沿って多くの赤色−緑色
ハイブリダイゼーション座位を示した。間期核へのハイ
ブリダイゼーションは、赤色と緑色のシグナルが核の同
一領域に局限されていることを示した。このことは、そ
のらが単一の染色体上に局限されていることと合致する
。１２がら１５のハイブリダイゼーション対が容積に見
られたが、これはＢＣＲ−へＢＬ融合遺伝子の対応した
増幅を示す（第９Ｅ、９Ｆ図参照）。これらの発見は、
この細胞系における融合遺伝子の増幅を示す前のサザン
プロットデータと合致する（２６）。
要約すれば、７例のＣＭＬ、　　４例の正常細胞サンプ
ルに対しｋＡＢＬ、　　ＢＣＲプローブを用い二重カラ
ーＦＩＳＨを使用する間期細、胞の分析は、ＣＭＬの日
常的診断とこの疾患の臨床的監視に対するこのアプロー
チの有用性を示唆する。その非常に重要な利点の１つは
、個々の間期または中期細胞から２４時間以内に遺伝子
情報が得られるという能力である。
か（して、これは１つの集団の全細胞に適用でき、偶然
にまたは培養により、たまたま中期にある細胞に限らな
い。さらに、遺伝子型分析は、形態学または他のマーカ
ーによって判断されるように、細胞表現型と関連させる
ことができ、これによってＣＭＬ遺伝子型をもつ細胞の
血統的特異性の研究と、異常をもつ細胞の頻度の評価と
を共に可能にする。
正常細胞の二次元イメージにおける赤色と緑色のシグナ
ルのランダムな並置は、正常細胞のうち約０．０１にお
いて起きるが、低頻度の検出限界を示す。この検出限界
は、コンピユータ化したイメージ分析を用い、各核内の
ハイブリダイゼーションシグナルの分離と強度のより完
全な定量的測定をすることによって低めることができる
。このような分析は、細胞が低頻度にＢＣＲ−ＡＢＬ融
合をもつ（例えば軽快化中、骨髄移植後、再発中または
モデルシステムにおいて）患者集団の研究において特ニ
重要であろう。
また、この試験は、少数の細胞しが必要としないので、
分析のために利用できる細胞の数が少ない場合、治療中
にＣＭＬ細胞の検出に対して有利であるべきである。最
後に、ハイブリダイゼーションスポットをただ数えるだ
けで、Ｋ５６２細胞系に対して示したように（第９Ｅ図
）、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子の増幅の検出と定量を可
能にする。蛍光強度の定量的測定はこの分析の助けにな
るであろう。
一般に一重鎖ＤＮＡハイブリダイゼーションブヮーブを
調製してこれを二重鎖標的ＤＮＡに適用する方法は、標
的ＤＮＡとプローブＤＮＡの両方を同一の制限エンドヌ
クレアーゼで処理することとこれに続く制限切断端付近
での一重鎖のグイジェスションを含んでいる。プローブ
はダイジェストされた一重鎖を標識１されたヌクレオチ
ドで再合成することにより構成される。標識された鎖は
標的ＤＮＡのダイジェストされていない一重鎖と本質的
に相補的である。
標識された一重鎖を含む二重鎖ＤＮＡ断片はより小さい
ピースに切断されて変性される。パイプリダイゼーシリ
ンブローブは標識された一重鎖断片を標識されていない
断片から分離することにより得られる。
プローブで使用すべきＤＮＡは、制限エンドヌクレアー
ゼで処理されて”付着”端を有する制限断片に構成され
る。すなわち、制限エンドヌクレアーゼが二重鎖ＤＮＡ
を通して付着切断端を造ることは重要である。適当な制
限エンドヌクレアーゼはＨｉｎｄｍ、Ｂａｇ　１１１．
Ｅｅｏ　Ｒ１または類似物を含むがこれらに限定される
ものではなく、これらは全て商業的に入手可能［例えば
Ｐｒｏａｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｅ（ＭａｄｉｓｏｎＷｌ）
またはＢｏｅｂｒｌｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｉｎ
ｄｌａｎａｐｏｌｉｓ。
ＩＮ）〕である。制限エンドヌクレアーゼを選択する際
には、結果として生じる制限断片が利用できるクローニ
ングベクターに直接挿入できるサイズ範囲内となるよう
にすることが好ましい。適当なりローニングベクターは
、ｐＢＲ３２２のごときプラスミドおよびラムダファー
ジのごときファージ、これら両方からの商業的に入手可
能な種々の派生物［例えばＰｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅ
ｃ（ＭａｄｌｓｏｎＪＩ）およびＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ
　Ｍａｎｈｅｉｍ（ｌｎｄｉａｎａｐｏ１１ｓ、　ＩＮ
）］を含んでいた。制限断片の増幅されたコピーは標準
的技法［例えばＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ
１ｅｃｕｌａｒ　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　ＡＬａｂｏｒａｔ
ｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ
ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ、　１９Ｂ２）］を
使用して分離される。あるいはまた、ある応用では制限
断片は存在する研究所から得られる。例えば、アメリカ
ン　タイプカルチャーコレクシテン（ｔｈｅ　Ａｍｅｒ
ｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅＣｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉ１１ｅ、ＭＤ）は、誰でも利用でき
る、制限断片のヒト染色体−特異的ライブラリーのコレ
クションを備えている。
標準的技法に続いて、エキソヌクレアーゼでの制限断片
の処理、および標識された前駆体の存在のもとでダイジ
ェストされた鎖を酵素的に再−合成することがなされる
。特にジェームズおよびレファ３．クー。より開示され
た技法［Ｊａ＋ｍｅｓ　ａｎｄ　ＪｅｆｆａｋＡｎａｌ
、　Ｂｉｏｅｈｅｍ、　、　Ｖｏｌ、　１４１．　ｐｐ
３３−３７　（ＬＨ１４）　］が続いてなされる。よっ
て、この文献は参考文献として取り入れられる。簡単に
言えば、制限断片に対しＤＮＡ　１マイクログラム当た
り約３ユニツトのエキソヌクレアーゼｍが、１００ｍＭ
ノＮａＣノ、　５（ｌａＭ（７）　トｉ　スーＨＣＩ（
ａｌ１８．　ｏ＞、　ｌｏｍＭのＭｇＣｌ２およびＬａ
Ｍのジチオトレイトールよりなる３７℃の溶液中で加え
られる。ダイジェスンヨンはサンプルを６０°Ｃで５−
１０分加熱することにより終了される。ジェームズおよ
びレファックは、これらの条件は毎分当たり約８０−２
００のヌクレオチドのグイジェスンツンという結果にな
ると報告している。実際のダイジェスシ璽ンの率は、Ｄ
ＮＡ基質の源と同様にエキソヌクレアーゼ■の源および
バッチにより変化する（例えばＧｕｏ　ｅｔ　ａｌＮｕ
ｃｌ、Ａｅｉｄｓ　Ｒｅｓ、、Ｖｏｌ、ｌＯｐｇ、２０
６５）。所望の長さの標識された鎖を得るには多少の実
験が必要かも知れない。エキソヌクレアーゼ■は開業的
に入手可能［例えばＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈ
ｅｉｎ（ｌｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓＩＮ）またはＰｒｏ
ｍｅｇａ　Ｂｔｏｔｅｃ（Ｍａｄｉａｏｎ、Ｗｌ）コで
ある。
また、Ｔ４ポリメラーゼ（ＢＲＬ、　Ｂｅｔｈｅｓｄａ
、　ＭＤ＞もエキソヌクレアーゼおよび再合成ステップ
の両方のために使用できる。
エキソヌクレアーゼで処理された制限断片は、標識され
た前駆体の存在のもとでダイジェストされた鎖を再−合
成するＤＮＡポリメラーゼのためのブライマー／鋳型と
して役にたつ。好ましい標識された前駆体は、チミジン
の代替物としてのビオチン化されたウラシルである。再
−合成はＤＮＡポリメラーゼＩまたはＴ４　ＤＮＡポリ
メラーゼを使用して、ランガー等の手法［Ｌａｎｇｅｒ
　ａｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’ＩＡｃａｄ、　Ｓ
ｅｔ、　、　Ｖｏｌ、　７８．　ｐｐ、　６６３３−６
６３７　（１９８１）］　に従ってなされ、この手法は
リグビー等［Ｒｉｇｂｙ　ｅｔ　ａｌ、。
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　１ｌｏ１．１１３．　Ｉ）
ｇ、　２３７（１９’１７９コにより開示された基本的
ニックトランスレーション技法の改作物である［例えば
ＤＮＡ　１マイクログラム当たり１ユニツトのＥ、コリ
ポリメラーゼＩが、１００ｍＭのＮａＣ１５０ｍＭのト
リス−ＨＣＩ（ｐｆ１８．ｏ＞、　１０ｍＭのＭｇＣｌ
２．１＋＋Ｍのジチオトレイトールおよび５０ｍＭのＫ
ＣＩからなる溶液中で３７℃でインキュベートされる〕
。また溶液の中に１は適切な量のトリフオスフェート前
駆体くそのひとつまたはそれ以上は標識されている）も
含まれているく例えば各５０−１００マイクロモル濃度
のものを、制限断片１ミリリツトル当たり２０−５０マ
イクログラム）。これらの条件のもとで、再合成は約４
Ｏ−１ｉｏ分で終わる０ 標識された制限断片は、標識された制限断片の各端の標
識された領域が確実に分離されるようにするために、よ
り小さい断片に切断される。　（さもなければ、一端の
標識された断片は、他端の標識された断片に対する相補
的領域を含んだ一重鎖ＤＮＡのより大きいピースの一部
であるかも知れない。
）このようなより小さい断片への切断は標準的技法、例
えば音波処理、酵素処理または同様なものノー”）　［
Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
　Ｃ１ｏｎｉｎ　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎ
ｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａ
ｂｏｒａ−ｔｏｒｙ、　１９８２）］によりなされる。
標識された制限断片はより小さいピースに適切に切断さ
れた後、変性されて一重鎖の標識された断片は標識され
ない断片から分離される。分離はいくつかの方法ででき
る。好ましい標識、ビオチンが使用されるときは、好ま
しい分離方法はＩｎ的なアビジンアフイニテイ力ラムに
よるものである［例えばＢａｙｅｒ　ａｎｄ　Ｗｉｌｃ
ｈｅｋ、”Ｔｈｅ　ｌ１ｓａ　ｏｆ　ｔｈｅＡｖｉｄｉ
ｎ−Ｂｉｏｔｉｎ　　Ｃｏｍｐｌｅｘ　　ａｓ　　ａ　
　Ｔｏｏｌ　　Ｉｎ　　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏ
ｇｙ−、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆ　Ｂｔｏｅｈｅ＋ａｉｅ
ａｌ　Ａｎａｌ　５ｉｓＶｏ１．２６．　ｐｐ、　１−
４５（１９８０）およびＭａｎｎｉｎｇ　ｅｔ　ａｌＢ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　、　Ｖｏｌ、　１６．　ｐｐ、
　１３６４−１３７０（１９７７）］。アビジンは、ガ
ラス、セファロース、アガロースその地間種類のものの
ごとき多数の異なる基質に、上記文献に記載されたごと
き標準的技法で共有結合される。よって、マンニング等
およびノ＜イヤーとウィルチエツクの９〜１６頁は委考
文献として取り入れられる。アビノンアフイニテイ力ラ
ムも商業的に入手可能［例えばＺｙｍｅｄ　Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ（Ｓｏｕｔｈ　Ｓａｎ　Ｆｒａ
ｎｃｉｓｅｏ、ＣＡ）］である。ヒビオチンされたプロ
ーブは、チコレソトおよびカワシマ［Ｃｈｏ１１ｅｔ　
ａｎｄ　Ｋａｗａｓｈｉｍａ、　Ｎｕｅｌｅｔｃ　Ａｃ
ｂｌｓ　Ｉｔｅ−ｓｏｕｒｃｅｓ、　Ｖｏｌ、　５．　
ｐｐ、　１５２９−１５４１（１９８５）コの手法に従
ってアビジンカラムから除去される。
前記酵識手法の代替手段が可能である。例えば、プロー
ブに使用されるＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで処理
された後、結果として生じた制限断片は２つの部分に分
離される。第１の部分は上に述べた処理を受ける。すな
わち、ＤＮＡの標識された鎖を再合成するための鋳型／
プライマーを形成するためにエキソヌクレアーゼで処理
される。結果として再合成された制限断片は、それから
上述のごとくより小さいピースに切断される。この場合
の標識は、ビオチンである必要はない。例えば放射性の
標識も使用できる。第２の部分もエキソヌクレアーゼ、
好ましくはエキソヌクレアーゼｍで処理される。しかし
ながら反応は、各制限断片が親の鎖の長さのおよそ半分
の２つの非相補的一重鎖ピースに変えられるように完了
まで進むようにされる。結果として生じるこれらの一重
鎖は、それから標準的技法［例えばＭａｎｉａｔｉｓ　
ｅｔ　ａｌ；Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎ　＋　Ａ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ　　Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９
８２＞ｐｐ、３３５−３３９および＾１ｖｉｎｅ　ｅｔ
　ａｌ、、Ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　　
、Ｖｏｌ、６８ｐｐ、２２０−２４２（Ａｃａｄｅｍｉ
ｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ、１９７９）］を］
開しｒ　ＤＢＭペーパー（ＤＢＭ　ｐａｐｅｒ）に共有
結合される。よって、これらの文献の引用頁は参考文献
として取り入れられる。第１の部分の断片は変性されて
、共有結合された第２の部分の断片を含むＤＢＭペーパ
ーと結合される。条件は、ＤＢＭペーパーに共有結合さ
れた相補的績に対し標識された鎖のハイブリダイゼーシ
ョンを可能にするように調整される。第１の部分からの
標識されない鎖はペーパーから洗浄される（それらがハ
イブリダイズすべき相補的績はない）。洗浄の後標識さ
れた鎖は、例えば加熱により除去され、使用できる状態
になる。
標的ＤＮＡにプローブを適用する前に、標的ＤＮＡはプ
ローブを構成するのに使用されたと同じ制限エンドヌク
レアーゼで処理される。制限エンドヌクレアーゼ処理の
後に、標的ＤＮＡはエキソヌクレアーゼ、好ましくはエ
キソヌクレアーゼｍｔた１ｉＴ４ポリメラーゼで処理さ
れる。好ましくは、エキソヌクレアーゼ処理の条件は、
造られた一重鎖領域の長さがグローブＤＮＡの長さと本
質的に同じになるように調整される。
標的ＤＮＡに対するプローブのハイブリダイゼーション
は、標準的手法［例えばＧａ１ｌ　ａｎｄ　Ｐａｒｄｕ
ｅＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ　ｍｏｌｏ　　、’１
０１．２１．ｐｐ、２７０−４８０（１９８１）；Ｈｅ
ｎｄｅｒｓｏｎ、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｒｅｖ
ｉｅｗ　ｏｆ　Ｃｔ０立■、　’１０１．７６、　ｐｐ
、　ｌ−１−４６（１９＞およびＡｎｇｅｒｅｒ　ｅｔ
ａｌ、、ｉｎ　　Ｇｅｎｅｔｉｃ　　Ｅｎ　　１ｎｅｅ
ｒｉｎ　　：Ｐｒ１ｎｃｉ　　Ｉｅｓ　　ａｎｄＭｅｔ
ｈｏｄｓ、Ｓｅｔｌｏｗ　　ａｎｄ　　Ｈｏ１ｌａｅｎ
ｄｅｒ、Ｅｄｓ、、Ｖｏｌ、７．ｐｐ４３−６５（Ｐｌ
ｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋ、１９８５）
］を］開してなされる。よって、これらの文献は、イン
シトゥハイブリダイゼーションにおける本発明の実施の
指針として参考に取り入れられる。簡単に言えば、本発
明に従って調製されたプローブは、非特異的結合の減少
、プローブされる生物学的構造の無欠性の維持その他た
めに、いくつかの他の薬剤と組み合わされる。結果とし
て生じる混合物は、ここではハイブリダイゼーション混
合物と呼ぶ。以下に、この方法はヒト第２１染色体の染
色体−特異的染色に適用される。
ヒト第２１染色体のＨｉｎｄ　ｍ制限断片は、アメリカ
ン　タイプ　カルチャー　コレクシワン（Ｒｏｃｋｖ１
１ｌｅ。
ＭＤ、）を通じてナシ９ナル　ラボラトリ−ジーン　ラ
イブラリー　プロジェクトから入手可能［ＶａｎＤｉ１
１ａ　ｅｔ　ａｌ、、−Ｈｕｍａｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏ
ｍｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＤＮＡＬｉｂｒａｒｉｅｓ：
Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　　ａｎｄ　　Ａｖａｉｌａ
ｂｉｌｉｔｙ”Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ　　、Ｖｏｌ、
４．ｐｐ、５３７−５５２（１９８Ｂ）］である。
代わりに、そのような断片は上に引用したファンディラ
等、またはフスコー等口Ｆｕｓｃｏｅ　ｅｔ　ａｌ、。
−Ｃｏｎｓｔｒｕｅｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆｉｆｔｅｅｎ　
Ｈｕ＋＋ａｎ　Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ−３ｐｅｃｉｆｉ
ｃ　ＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｉｅｓ　ｆｒｏＩｉＦｌｏｗ
−ＰｕｒｉｆｉｅｄＣｈｒｏｍｏｓｏ＋＊ｅｓ、”Ｃｔ
ｏ　ｅｎｅｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ、、４３ニア９−
８６（１９８６）］の開示に従って造ることもできる。
非反復配列インサートを有するライブラリーからのクロ
ーンはベントンおよびデービスの方法［Ｂｅｎｔｏｎ　
ａｎｄ　Ｄａｖｉｓ、５ｃｌｅｎｃｅ４ｏ１．１９６．
ｐｐ、１８０−１８２（１９７７）］により分離される
。簡単に言えば、約１０００の組変えファージが第２１
染色体−特異的ライブラリーからランダムに分離される
。これらはニトロセルロースに移されてニックトランス
レートされた全ｌゲノムヒトＤＮＡでプローブされる。
強いハイブリダイゼ７シ目ンを示さないクローンのうち
、明白な非反復配列ＤＮＡを含むおよそ３００が抽出さ
れる。選択されたクローンが増幅された後、各クローン
中の第２１染色体インサートは２２ｐ標識されて、第２
１染色体ライブラリーを構成するのに使われたと同じ酵
素すなわち旧ｎｄ　ｍでダイジェストされたヒトゲノム
ＤＮＡのサザンプロット（Ｓｕｏｔｈｅｒｎ　ｂｌｏｔ
ｓ）にハイブリダイズされる。クローンを含む非反復配
列はサザン分析の間に単一のバンドを生じるものとして
認識される。およそ１００のこのようなりローンがプロ
ーブＤＮＡの不均一な混合物に対して選択される。非反
復配列クローンは増幅され、インサートはＨｉｎｄ　ｍ
ダイジェスシヨンにより除去されて、インサートはゲル
電気泳動によりファージアーム（ｐｈａｇｅ　ａｒ＋ｅ
ｓ）から分離される。プローブＤＮＡ断片（すなわち非
反復配列インサート）はゲルから除去されて上述のよう
にエキソヌクレアーゼ■で処理され、続いてビオチン化
されたｔｌＴＰ前駆体の存在のもとに再合成される。結
果として生じる二重鎖断片は各断片が平均して約１．５
−２．０の切断を受けるように音波処理される。結果と
して生じたピースは変性され、ビオチン化された断片は
上述のようにアビジンアフィニティクロマトグラフィに
より分離される。
ヒトリンパ細胞染色体はハーバ−等［Ｈａｒｐｅｒａｔ
　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ’１．＾ｅａｄ、　Ｓｃｉ
、　、　Ｖｏｌ、　７８．ｐｐ、　４４５ｇ−４ｕ＋ｏ
（ｔ９ａｔ）］に従って調製される。中期および間期の
細胞は燐酸緩衝溶液内で３回洗浄され、メタノール−ア
セティツクアシッド（３：１）中で固定され、清潔にさ
れた顕微鏡スライド上に落された。スライドは一２０℃
で窒素雰囲気中に貯えられる。
間期の細胞および／または中期のスプレッドを載せたス
ライドは窒素から取り出され、ＲＮアーゼで処理（１０
０μｇ／閣１．３７°Ｃで１時間）され、３７°ＣのＨ
ｉｎｄ　　ｍ　（１０ユニットＭＩＯ＋ｉＭト　リス−
ＨＣｌ、５０ｍＭ　ＮａＣ１，１トＭ　ＭｇＣｌ２およ
び１４ＩＩＭジチオエリ　トリ　トール。
Ｐｈ７．６）で約１−１６時間処理され、上述のように
エキソヌクレアーゼ■で処理されて、エタノールシリー
ズ中で脱水される。それからブロテイナーゼにで処理（
６１０μｇ／＋ｅ１．３７℃で７．５時間）されて脱水
される。
ブロテイナーゼＸの濃度は、細胞の型と酵素の０．２ト
に基づいて、染色体の位相顕微鏡による像が乾燥したス
ライド上に殆ど残らないように調整される。ハイブリダ
イゼー７フン混合物は（最終濃度で）、２ｘＳＳＣ（０
゜１５Ｍ　ＮａＣ１およびＯ，０１５Ｍ７ジウムー１−
イトレート）、１０％のデキストランサルフェート、５
００μｇ／ｍｌのキャリヤＤＮＡ　（音波処理されたニ
シン精子ＤＮＡ）および２．０μｇ／＋ｔｌのピオチン
−標識されたプローブＤＮＡからなっている。この混合
物はガラスのカバースリップの下に３μＩ／ｃｍ２の密
度でスライドに適用されてラバーセメントでシールされ
る。
３７°Ｃで一晩のインキュベーションの後、スライドは
４５°Ｃで洗浄（５０％ホルムアミド−２Ｘ　ＳＳＣｐ
Ｈ７，３回３分、続いて２Ｘ　ＳＳＣｐＨ７，５回２分
）されて、ＢＮ緩衝液（０，１Ｍソジウムビカーボネー
ト、０．０５％ＮＰ−４０゜ｐＨ８）に浸される。この
時点以後、スライドは決して乾燥させてはならない。
スライドはＢＮ緩衝液から取り出されて、室温で５分間
、５％の脱脂粉乳（Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）および０．０
２％のソジウムアジド（プラスチック製カバースリップ
の下で５μｌ／ｃａ２）でブロックされる。カバースリ
・ノブは取り除かれ、余分の液体は手早（排出されて、
フルオレセイン−アビジンＤＯＳ（５％の粉乳と０．０
２％のソジウムアジドを有するＢＮ緩衝液内で３μｇ／
＋＊ｌ）が加えられる（５μｌ／Ｃｌ２）。同カバース
リップは戻されてスライドは３７℃で２０分間インキュ
ベートされる。それからスライドは３回２分間、それぞ
れ４５℃のＢＮ緩衝液内で洗浄される。ビオチン−結合
されたフルオレセインの強さは、ビオチン化されたヤギ
抗−アピジン抗体（５％のヤギ血清と０．０２％のソジ
ウムアジドをを有するＢＮ緩衝液内で５μｇ／ｍｌ）の
層を加え、続いて上記と同様に洗浄した後、フルオレセ
イン−アビジンＤＣＳの別の層を加えることにより増幅
される。フルオレセイン−アビジンＤＣ３，ヤギ抗アビ
ジンおよびヤギ血清は全て商業的に入手可能［例えばＶ
ｅｃｔｏｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉ
ｎｇａｍｅ、ＣＡ）コである。ＢＮ内での洗浄後、蛍光
抗フェード液、ｐ−フェニレンジアミン（カバースリッ
プに関し１．５μｌ／ｃｍ”）が観察の前に加えられる
。最適の顕微鏡像１を得るにはこの層を薄（保持するこ
とが重要である。この抗フェード液はフルオレセインの
減退を大幅に減少させて５分間までの連続した顕微鏡観
察を可能にする。この抗フェード液には、ＤＮＡ対比染
色剤（ＤＡＰＩまたはプロピジウム　アイオダイド）が
０．２５−０．５Ｂｇ／ｍｌで含まれている。
赤い蛍光を発するＤＮＡ−特異的染料プロピジウムアイ
オダイド（Ｐｌ）は、ハイブリダイズされたプローブと
全ＤＮＡを同時に観察することを可能にするために使用
される。フルオレセインおよヒＰＩ１１４５０−４９０
ｎｍ　（Ｚｅｉｓｓ　ｆｉｌｔｅｒ　ｃｏｍｂｉｎａｔ
ｉｏｎ　４ｇ？７０９）で励起される。励起波長を５４
６ｎｍ　（Ｚｅｉｓｓ　ｆｉｔｅｒｃｏｍｂｉｎａｔｉ
ｏｎ　４８？７１５）に増大すればＰｌのみの観察を可
能にする。ＤＡＰＩ、紫外線（Ｚｅｉｓｓ　ｆｉｌｔｅ
ｒｅｏｗｉｂｉｎａｔｌｏｎ　４８７７０１）で励起さ
れる青い蛍光のＤＮＡ−特異的染色剤は、ビオチン−標
識されたものと全ＤＮＡが別々に観測される場合に対比
染色剤として使用される。中期第２１染色体は染色体の
本体上に散らばるランダムに位置する黄色のスポットに
より検出される。
本発明の以上の実施例の記述は例証および説明の目的で
提示された。それらは網羅的であるとか、または本発明
を開示されたまさにその形態に限定することを意図する
ものではなく、上記教示に照らして明らかに多くの変更
や変形が可能である。
実施例は本発明の原理と実際の適用を最もよく説明し、
これによりこの技術に熟練した他の者が本発明を種々の
実施例でまた期待される特定の用途適合した種々の変更
と共に最もよ（利用することが可能となるようにするた
めに、選ばれ記述された。ここに添付する特許請求の範
囲により本発明の技術的節を定義することが意図されて
いる。
ここに引用された全ての文献は参考文献として取り入れ
られる。
アメリカ合衆国政府は、同国エネルギー省とユニバーシ
ティ　オブ　カリフォルニアとの間の、ローレンスリバ
ーモアナシ冒ナルラボラトリ−の運営のための契約書第
Ｗ−７４０５−１１：ＮＧ−４８号に従って、本発明に
おける権利を有する。
【図面の簡単な説明】
第１Ａ、　　ＩＢ、　　ＩＣ図および第２Ａ、２Ｂ図は
、インサートがラムダファージカロン２１Ａにクローン
された、第２１染色体−特異的ライブラリーのヒト中期
スプレッドへのハイブリダイゼーションを示めす。ライ
ブラリーにおける高度コピー反復配列のハイブリダイゼ
ーション能力は、標識されないゲノムＤＮＡのハイブリ
ダイゼーション混合物への添加によって減少させた。プ
ローブはビオチンによって標識され、これは緑色ＦＩＴ
Ｃ−アビジン（ｆｌｕｏｒｅｓ−ｃｅＩｎ　１ｓｏｔｈ
ｉｏｅｙａｎａｔｅ　ａｖｊｄｉｎ）によって検出され
た。染色体中の全ＤＮＡは、青色蛍光染料ＤＡＰＩ（４
，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏ
ｌｅ）によって染色した。 第１Ａ図は、蛍光顕微鏡に取り付けたＴＶカメラを用い
て得られたヒト中期スプレッドにおけるＤＡＰ１染色の
バイナリ−イメージである。ＤＡＰ＋可視化のために適
当なフィルターを用いた。イメージのコンピュータ処理
により、選ばれたしきい値強度以上の全ての部分は白く
、残りは黒く示された。 第１Ｂ図は、第１Ａ図と同一のヒト中期スプレッドのＰ
ＩＴＣ染色のバイナリ−イメージである。このイメージ
は第１Ａ図と同様に処理されたが、顕微鏡のフィルター
を変えたので、プローブに付けたＰＩＴＣがＤＡＰＩよ
りもよく見える。 第１Ｃ図は、第２１染色体のみのバイナリ−イメージで
あって、第１Ｂ図のバイナリ−イメージ上の非特異的染
色対象物にれらはより小さい）は、標準イメージ処理技
術によって除いた。 第２Ａ図は、ヒト中期スプレッドにおけるＤＡＰＩ染色
のカラー写真であって、第１Ａ、　　ＩＢ、　　ＩＣ図
のコンピュータ処理により生じたバイナリ−イメージに
示されたスプレッドと同時に準備されハイブリダイズさ
れたものである。 第２Ｂ図は、第２Ａ図に示すものと同一のヒト中期スプ
レッドにおけるＤＮＡプローブに付けたフルオレセイン
のカラー写真である。これは、ＤＡＰＩよりもフルオレ
セインをエキサイトするために、蛍光顕微鏡のフィルタ
ーを変えることによって得らこれた。この写真は、第１
Ｂ図のバイナリ−イメージと比較できる。 第３図は、第１Ａ、ＩＢ、ＩＣ図および第２　Ａ。 ２Ｂ図に示すスプレッドと同時に準備しハイブリダイズ
したヒト中期スプレッドの写真である。用いられた手法
は、全染色体を染色するためにＤＡＰＩの代わりにＰＩ
（プロビジラムアイオダイド、ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ　Ｉ
ｏｄｉｄｅ）を用いる以外は同一であった。 ＰＩとフルオレセイン染色の両者は同一の顕微鏡フィル
ターで見ることができる。カラーフィルムを用いたのは
、カラーフィルム上でプロビジラムアイオダイド対比染
色剤は赤色で現れ、プローブのフルオレセインは黄色で
現れるからである。 第４Ａ図は、ブルースクライブプラスミドにおける第４
染色体−特異的ライブラリ−（ライブラリｐＢＳ−４）
のヒト中期スプレッドへのハイブリダイゼーションを示
すが、標識しないヒトゲノムＤＮＡは用いず、かつハイ
ブリダイゼーション混合物は変性後すぐに施用した。第
４染色体の両方のコピーは、他の染色体より僅かによく
輝いて見える。 小さな矢は、プローブによって非染色の領域を示す。第
３図および以下の残りの図のように、ＰＩは対比染色剤
であり、フルオレセインはプローブを標識するために用
いる。 第４Ｂ図は、ヒト中期スプレッドへのｐＢＳ−４のノ１
イブリダイゼーシ画ンを示すが、標識しないヒトゲノム
ＤＮＡがハイブリダイゼーションの間に用いられた（ゲ
ノムＤＮＡに関しＱ＝２、Ｑの意味は後に説明する）。 定量的イメージ分析は、第４染色体の単位長さ当りの強
度が他の染色体のそれの約２０Ｘであることを示す。第
４染色体は黄色であり、他の染色体はプロビジラムアイ
オダイドのために赤色である。 ２層のアビジン−フルオレセインインチオサイアネート
が、正確に測定するために、標的染色体を十分に輝かせ
る目的で用いられた。しかし、第４染色体は、単一の層
を施した後に容易に認識できる。 第４Ｃ図は、第４Ｂ図と同一のスプレッドを示すが、フ
ルオレセインイソチオサイアネート蛍光のみを通過させ
るフィルターを通したものである。 第４Ｄ図は、ｐＢＳ−４特異的ライブラリーを用いたヒ
ト中期スプレッド中に第４染色体を含む放射−誘発転座
（矢印）の検出を示す。コントラスト比は約５ｘである
。 第４Ｅ図は、正常染色体と、第４および第１１染色体の
間の（細胞系Ｒ５４Ｈ１１において）転座の結果である
２つの派生染色体が、本発明の組成物と方法によって間
期核中に検出できることを示す。これらは、３つの別個
のドメインのように見える。 第４Ｆ図は、ブルースクライブプラスミド中における第
２１染色体−特異的ライブラリ−（ライブラリー　ｐＢ
Ｓ−２１）の、　トリラミー２１細胞系の中期スプレッ
ドへのハイブリダイゼーションを示す。少量のハイブリ
ダイゼーションが、他の末端動原体型染色体の動原体の
近くに見える。 第４Ｇ図は、第４Ｆ図と同様のハイブリダイゼーション
であるが、間期核を用いるものを示す。 ３つの第２１染色体ドメインが明かに示されている。 第４Ｈ図は、第４染色体からの１２０のシングルコピー
プローブのプールを用いた、ヒト中期スプレッドへのハ
イブリダイゼーションを示す。第４染色体が矢印によっ
て示されている。 第５図は、ヒトＤＮＡの５８０ｋｂインサートを含む酵
母人工染色体（ＹＡＣ）クローンの、ヒト中期スプレッ
ドへのハイブリダイゼーションを示す。各染色体第１２
上（１２ｑ２１．１において）の黄色のフルオレセイン
バンドが、プロビジラムアイオダイド対比染色剤に対比
して見える。 第６図は、ヒト第１９染色体の１つのコピーを含むヒト
／ハムスターハイブリッド細胞からのＤＮＡの、ヒト中
期スプレッドへのノ＼イブリダイゼーションを示す。写
真の中心から少し右寄りに、スプレッド中の他の染色体
より輝いている２つの第１９染色体がある。 第７図は、本発明のプローブを作るためにポリメラーゼ
鎖反応（ＰＣＲ）を用いる代表的な方法を示し、このプ
ローブは反復配列が減少している。 第８図は、正常な、またＣＭＬの中期および間期核の両
方におけるＣＭＬ切断点および対応した染色パターンへ
のプローブの位置付けを示す。 左側は、第２２染色体上のＢＣＲ遺伝子、第９染色体の
ＡＢＬ遺伝子、およびフィラデルフィア染色体上のＢＣ
Ｒ−ＡＢＬ融合遺伝子の図式的表示である。また、ＣＭ
Ｌ切断点の位置とプローブに対するそれらの関係も示さ
九ている（３２）。右は、ｅ−ｈｕ−ＡＢＬおよびＰＥ
Ｍ１２プローブに対して期待される、正常な、またＣＭ
Ｌの中期スプレッドおよび間期核へのハイブリダイゼー
シジンパターンを示す。 第９図は、中期スプレッドと間期核における蛍光インシ
トゥハイブリダイゼーシ目ン（ＦＩＳＨ＞を示す。パネ
ルＡ％　Ｂは、正常な中期スプレ、ドへのＡＢＬとＢＣ
Ｒのハイブリダイゼーションを示す。ＡＢＬシグナル（
Ａ）は９ｑのテロメア部分に局限され、ＢＣＲシグナル
（Ｂ）は２２ｑの動原体近（に局限されている。 パネルＣは、４６ＸＹ、　ｔ（９：２２）　（Ｑ３４；
ｑ１１）を伴ったＣＭＬ患者において、ａｂｌ染色がフ
ィラデルフィア染色体のテロメア領域に局限されている
ことを示す。パネルＤは、４６ＸＹＩｎｓ（２２：９）
（ｑ１１；ｑ３４）を伴ったＣＭＬ患者において、挿入
的事象から生じた派生第２２染色体上に、ａｂｌ染色が
間質的にあることを示す。パネルＥは、Ｋ５６２細胞系
が間期核の領域に局限された多数のシグナルを示してい
ることを表している。 同一の染色パターンが、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子増幅
を示すＢＣＲプローブに伴って見られた。パネルＦは、
単一の染色体へ局限された融合遺伝子増幅を示すに５６
２細胞系からの中期スプレッドを示す。 第１０図は、二重バンド通過フィルターを通して同時に
可視化されたＡＢＬ　（赤色）およびＢＣＲ（緑色）プ
ローブによるＣＭＬ間期間期おける蛍光インシトウハイ
プリダイゼーシ冒ンを示す。ＣＭＬ患者からの細胞は、
ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子へのハイブリダイゼーション
に起因する赤色−緑色（黄色）シグナルと、第２２およ
び第９染色体上の正常なりＣＲ，ＡＢＬ遺伝子への単一
な赤色および緑色ハイブリダイゼーションシグナルとを
示している。 第１１図は、構造的異常検出のための幾つかの典型的な
プローブ戦略を示す。プローブの結合パターン、色など
の設計は、中期および／または間期細胞における遺伝子
異常の検出のために、最適にすることができる。異なっ
たパターンが個々の適用に対して有利となるであろう。 第１１図の図面は、幾つかの異常の検出に対して有用な
幾つかのパターンを示す。これらの例は、代表的なもの
であって究極的なものではないので、異なったパターン
を組み合わせることができ、同一細胞内の多数の異常の
検出を可能にする。 第１１図の各図面において、中期染色体は両染色分体に
結合したプローブを伴って示されている。 間期核が描かれているのは、プローブが結合する染色体
の部分の複製前における細胞サイクルの段階であるので
、各間期染色体に対してただ１つの染色分体があるにす
ぎない。プローブの結合が染色体のただ一部分のみに制
限されると、シブナノνは、黒または白の円として示さ
れる。このような表示は、異なった色または別の識別可
能な染色特性を示すために用いられる。２つ以上の識別
可能な特性（３色、色の異なった比など）を含むパター
ンは、ここに図示されたものよりより複雑な染色パター
ンを可能にする。ＤＮＡ中の切断点の染色体上の位置は
、異常染色体に隣接する水平線によって示される。 ａ、セクションａ）は、染色体全体を染色するプローブ
の使用を示す。このようなプローブは、その染色体に沿
ってどこかで起きる転座を検出するために用いることが
できる。第１２図のカラー写真は、転座を検出するため
に第２２染色体に対するこの染色の使用を示すが、この
患者においてはＣＭＬに伴って起きているものである。 染色のこのようなアプローチは、染色される核の領域が
比較的に大きいので、間期核においては非常に有効であ
るとはいえず、染色された領域における重複は多くの核
において解釈を難しくする。 ｂ、セクションｂ）は、ａ）で示された染色体の染色領
域の切断点近傍の領域への縮小を示し、その領域におけ
る事象に焦点を合わせた情報を提供する。染色パターン
は、切断点を横切って連続または不連続であり、このた
めある結合は切断点の両側にある。このような染色パタ
ーンは、ただ１つの”色”のみを必要とするが、他のど
のようなゲノム領域が組み換え（ｅｘｃｈａｎｇｅ）に
含まれるかについては何ら情報を与えない。 Ｃ，セクシ日ンＣ）は、再配列の結粱として共に生じた
配列と結合して、中期、間期の細胞中の検出を可能にす
るプローブの使用を示す。この場合にはＪ　異なった配
列は異なった”色”で染色される。このような染色パタ
ーンは、この出願のセクション■の例において使用され
るものである。 ｄ、セクションｄ）は、再配列に含まれる両切断点の両
側の染色を含むことによって、Ｃ）の延長を示す。示し
たように、異なった”色”が使用される。より複雑な染
色パターンによって供給される追加の情報は、核の解釈
の助けとなる。また、そこでの議論のように明白な挿入
事象の認識も可能となる。 ｅ、セクションｅ）は、染色体の１つの相同体における
挿入の検出を示す。 ｆ、セクションｆ）は、欠失の検出に有用な染色パター
ンを示す。欠失は、欠失領域のみを染色するプローブに
よっても検出できるが、プローブ結合の欠如は、標的配
列の欠失以外の理由によるかもしれない。わきに位置す
る異なった”色”に染色された領域は、ハイブリダイゼ
ーションに対する対照としての役目をする。 第１２図は、染色体全体を染色することによる再配列を
検出するための染色パターンを示すが、この場合にはＣ
ＭＬと関連した第２２染色体の再配列である。この図の
中期スプレッドは、ずっと第２２染色体に沿って結合し
たプローブによって染色されたＣＭＬ細胞からのもので
ある。ブローブー染色された領域は黄色に見える。ＤＮ
Ａの残りは赤色−蛍光化学染色プロビジラムアイオダイ
ドによって染色された。全く黄色の染色体は、第２２染
色体の正常なコピーである。この正常第２２染色体のち
ょうど下にフィラデルフィア染色体、小さな一部黄色で
一部赤色の染色体がある。このフィラデルフィア染色体
の下衣に、第２２染色体（黄色）の遠位部分の付いた異
常第９染色体（赤色）がある。この図の写真は、前の図
面のパー）ａ）に示した染色バタンを表す。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１）、核酸プローブを使用する核酸配列を基礎とした
    標的染色体物質を染色する方法であり、当該方法におい
    て前記標的染色体物質は１または複数の疑わしい遺伝子
    再配列の近傍にあり、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）の診
    断に役立つ標的染色体物質の染色方法。 （２）、第１項に記載の方法において、遺伝子再配列が
    転座、欠失、逆位、増幅および挿入からなる群から選択
    される標的染色体物質の染色方法。 （３）、第２項に記載の方法において、前記核酸プロー
    ブがＣＭＬに関連する染色体領域９ｑ３４と２２ｑ１１
    の転座切断点領域の近傍における核酸配列に相同である
    標的染色体物質の染色方法。 （４）、第３項に記載の方法において、ＣＭＬの特性を
    示すＢＣＲ−ＡＢＬ融合が生じると前記核酸プローブが
    明瞭に変化する染色パターンを形成する標的染色体物質
    の染色方法。 （５）、第３項に記載の染色方法において、前記核酸プ
    ローブが核酸配列にハイブリダイズしたとき同核酸プロ
    ーブからのシグナルが第１１図、セクションｂ−ｅの全
    てを含めて例示されたごとき染色パターンを形成する標
    的染色体物質の染色方法。 （６）、第４項に記載の方法において、前記染色パター
    ンのシグナルのプロキシミティおよび／または他の特徴
    が前記ＢＣＲ−ＡＢＬの存在の有無を示す標的染色体物
    質の染色方法。 （７）、第６項に記載の方法において、ＢＣＲ領域にお
    けるプローブの部分がある手法で標識化／可視化されか
    つＡＢＬ領域におけるプローブの部分が他の手法で標識
    化／可視化され、その結果ＢＣＲ−ＡＢＬ融合が存在す
    ると前記２つの標識化／可視化手段のプロキシミティが
    間期および／または中期染色体スプレッドに比較的近く
    なる標的染色体物質の染色方法。 （８）、第５項に記載の方法において、前記核酸プロー
    ブは約５０キロベース（ｋｂ）〜約１メガベース（Ｍｂ
    ）のコンプレキシティを持っている標的染色体物質の染
    色方法。 （９）、第８項に記載の方法において、コンプレキシテ
    ィは約５０ｋｂ〜約７５０ｋｂである標的染色体物質の
    染色方法。 （１０）、第９項に記載の方法において、コンプレキシ
    ティは約２００ｋｂ〜約４００ｋｂである標的染色体物
    質の染色方法。 （１１）、核酸プローブを使用する核酸配列を基礎とし
    た標的染色体物質を染色する方法であり、当該方法にお
    いて前記標的染色体物質は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）
    および／または急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）に関連す
    る１または複数の疑わしい遺伝子再配列の近傍にある標
    的染色体物質の染色方法。 （１２）、第１１項に記載の方法において、前記核酸プ
    ローブは慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に関連する遺伝子
    再配列を急性リンパ性白血病に関連する遺伝子再配列か
    ら識別する染色パターンを形成する標的染色体物質の染
    色方法。 （１３）、核酸プローブを使用する核酸配列を基礎とし
    た染色体物質を染色する方法であり、当該方法において
    前記標的染色体物質は母性血液から分離された胎児細胞
    からなる標的染色体物質の染色方法。 （１４）、確実に標的染色体物質を染色する核酸プロー
    ブであり、前記標的染色体物質は慢性骨髄性白血病（Ｃ
    ＭＬ）または急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）のいずれか
    に関連する１または複数の疑わしい遺伝子再配列の近傍
    にある核酸プローブ。 （１５）、第１４項に記載の核酸プローブにおいて、１
    または複数の疑わしい遺伝子再配列はＣＭＬの診断に役
    立つ核酸プローブ。 （１６）、標的染色体物質を染色する高度コンプレキシ
    ティ核酸プローブであり、前記標的染色体物質は慢性骨
    髄性白血病（ＣＭＬ）および／または急性リンパ性白血
    病（ＡＬＬ）に関連する１または複数の疑わしい遺伝子
    再配列の近傍にある高度コンプレキシティ核酸プローブ
    。 （１７）、第１６項に記載の核酸プローブにおいて、１
    または複数の疑わしい遺伝子再配列はＣＭＬに関連して
    いる高度コンプレキシティ核酸プローブ。 （１８）、第１７項に記載の核酸プローブにおいて、前
    記遺伝子再配列は転座、逆位、欠失、挿入および増幅か
    らなる群から選択される高度核酸プローブ。 （１９）、第１８項に記載の核酸プローブにおいて、Ｃ
    ＭＬおよび／またはＡＬＬの特性を示すＢＣＲ−ＡＢＬ
    融合が生じると明確に変化される染色パターンを形成す
    る高度コンプレキシティ核酸プローブ。 （２０）、第１９項に記載の核酸プローブにおいて、約
    ５０ｋｂ〜約１メガベースのコンプレキシティを持って
    いる高度コンプレキシティ核酸プローブ。 （２１）、第２０項に記載の核酸プローブにおいて、コ
    ンプレキシティが約５０ｋｂ〜約７５０ｋｂである高度
    コンプレキシティ核酸プローブ。 （２２）、第２１項に記載の高度コンプレキシティ核酸
    プローブにおいて、コンプレキシティが約２００ｋｂ〜
    約４００ｋｂである高度コンプレキシティ核酸プローブ
    。 （２３）、下記（ａ）〜（ｃ）のステップからなる慢性
    骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性リンパ性白血病（Ａ
    ＬＬ）に関連する遺伝子再配列を識別する方法。 （ａ）、第１４項に記載のプローブを疑わしい遺伝子再
    配列の近傍における標的染色体物質にハ イブリダイズすること。 （ｂ）、前記プローブからのシグナルのプロキシミティ
    および／または他の特徴を観察および ／または測定すること。 （ｃ）、ステップ（ｂ）での観察結果および／または測
    定値から遺伝子再配列の発生の有無を決定 すること。 （２４）、第２３項に記載のＣＭＬに関連する遺伝子再
    配列を検出する方法であり、当該方法においてステップ
    （ａ）のプローブは１または複数の疑わしい遺伝子再配
    列の近傍において標的染色体物質を染色し、かつＣＭＬ
    の診断に役立つ高度コンプレキシティ核酸プローブであ
    る遺伝子再配列の検出方法。 （２５）、第２３項に記載の方法において、白血病はＣ
    ＭＬであり、検出されるべき遺伝子再配列がＢＣＲ−Ａ
    ＢＬ融合を形成する遺伝子再配列の検出方法。 （２６）、第２５項に記載の方法において、染色体物質
    は中期または間期にある検出方法。 （２７）、第２６項に記載の方法において、染色体物質
    は中期にある遺伝子再配列の検出方法。 （２８）、第２６項に記載の方法において、染色体物質
    は間期にある遺伝子再配列の検出方法。 （２９）、第２４項に記載の方法において、形成された
    染色パターンは予後および／または療法の効果の確定の
    目的で、正常および悪性細胞を識別するために使用され
    る遺伝子再配列の検出方法。 （３０）、第２９項に記載の方法において、前記療法の
    ための養生法は化学的療法、放射線療法、外科的処置お
    よび移植法から選択される遺伝子再配列の検出方法。 （３１）、第２４項に記載の方法において、形成される
    染色パターンは患者の状態をモニターするのに有効であ
    り、同患者の染色体物質が個々の細胞を染色することに
    よりテストされる遺伝子再配列の検出方法。 （３２）、第２３項の方法にて形成される染色パターン
    を基礎としてＣＭＬとＡＬＬとを識別する識別方法。 （３３）、第３１項に記載の方法において、患者は軽快
    な状態にあり、形成される染色パターンはＣＭＬの再発
    を予言している遺伝子再配列の検出方法。 （３４）、標的染色体物質を染色する高度コンプレキシ
    ティ核酸プローブをハイブリダイズすることからなる遺
    伝子疾病の分子的基礎を決定する方法であり、当該方法
    において前記標的染色体物質はヒト第１〜第２２、Ｘお
    よびＹ染色体のＤＮＡから選択され、かつ１または複数
    の潜在的遺伝子再配列の近傍にある決定方法。 （３５）、第１７項に記載の核酸プローブにおいて、プ
    ローブ核酸配列は細胞系および／または１または複数の
    ベクター中で増殖される高度コンプレキシティ核酸プロ
    ーブ。 （３６）、第３５項に記載の核酸プローブにおいて、前
    記細胞系はハイブリッドセルラインであり、前記１また
    は複数のベクターは酵母人工染色体、プラスミド、バク
    テリオファージおよびコスミドからなる群から選択され
    る高度コンプレキシティ核酸プローブ。 （３７）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に関連する疑わ
    しい遺伝子再配列の近傍における標的染色体物質を第１
    ７項に記載の高度コンプレキシティ核酸プローブで染色
    する方法であり、当該方法において核酸プローブ配列は
    標的染色体物質へのハイブリダイゼーションの以前に約
    ２００ベース〜２０００ベースの断片に切断される標的
    染色体物質の染色方法。 （３８）、第３７項に記載の方法において、断片のサイ
    ズは約１ｋｂである標的染色体物質の染色方法。 （３９）、第３８項に記載の方法において、断片のサイ
    ズは約８００ベース〜約１０００ベースであり、ハイブ
    リダイゼーションは約３０℃〜約４５℃の温度にて遂行
    され、その後の洗浄ステップは約４０℃〜約５０℃の温
    度にて遂行される標的染色体物質の染色方法。 （４０）、第３９項に記載の方法において、ハイブリダ
    イゼーションは約３５℃〜約４０℃の温度にて遂行され
    る標的染色体物質の染色方法。 （４１）、第４０項に記載の方法において、ハイブリダ
    イゼーションは約３７℃の温度にて遂行され、その後の
    洗浄ステップは約４５℃の温度にて遂行される標的染色
    体物質の染色方法。 （４２）、第３７項に記載の方法において、断片はハイ
    ブリダイゼーション後のフローサイトメトリーによる検
    出のために標識化／可視化される標的染色体物質の染色
    方法。 （４３）、第３７項に記載の方法において、断片は検鏡
    による検出のために標識化／可視化される染色方法。 （４４）、第３７項に記載の方法において、検鏡は自動
    化される標的染色体物質の染色方法。 （４５）、標識された核酸断片の不均一混合物からなる
    染色体−特異的染色試薬であり、当該試薬において標識
    された核酸断片は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に関連す
    る１または複数の疑わしい遺伝子再配列の近傍における
    標的染色体物質の座位に相補的であり、非標的染色体物
    質の座位へのハイブリダイゼーション能力を持つ核酸配
    列を実質的に含んでいない染色体−特異的染色試薬。 （４６）、第４５項に記載の染色試薬において、前記標
    識された核酸断片は一重鎖である染色体−特異的染色試
    薬。 （４７）、第４５項に記載の染色試薬において、前記核
    酸断片は放射線的、酵素的、免疫反応的、フルオロクロ
    ムおよび／または親和性検出試薬で標識される染色体−
    特異的染色試薬。 （４８）、第４７項に記載の染色試薬において、前記断
    片はビオチン化され、Ｎ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチ
    ルアミノフルオレンで変更され、フルオロセインイソチ
    オシアネイトで変更され、水銀／ＴＮＰリガンドで変更
    され、スルホン化され、ジゴキシゲニン化され、または
    Ｔ−Ｔダイマーを含む染色体−特異的染色試薬。 （４９）、下記のプロセスにより形成され、慢性骨髄性
    白血病（ＣＭＬ）に関連する１または複数の遺伝子再配
    列を表示する染色パターンを提供する染色体−特異的染
    色試薬。 （ａ）、ＢＣＲとＡＢＬ遺伝子の近傍における染色体−
    特異的ＤＮＡを分離すること。 （ｂ）、分離された染色体−特異的ＤＮＡのピース断片
    を増幅すること。 （ｃ）、１または複数の遺伝子再配列の近傍における標
    的染色体ＤＮＡに優先的にハイブリダイズする核酸断片
    の集合物を形成するために、 分離されたＤＮＡの増幅ピースに含まれる共有反復配列
    のハイブリダイゼーション能力を無能力化し、および／
    または同共有反復配列を除去すること。 （ｄ）、標識された核酸断片の不均一混合物を形成する
    ために集合物の核酸断片を標識すること。 （５０）、第４９項に記載の染色試薬において、前記分
    離ＤＮＡのピースを増幅するステップはクローニングに
    て遂行される染色体−特異的染色試薬。 （５１）、第４９項に記載の染色試薬において、前記分
    離ＤＮＡのピースの前記増幅ステップはポリメラーゼ鎖
    反応（ＰＣＲ）により遂行される染色体−特異的染色試
    薬。 （５２）、前記４９項に記載の染色試薬において、前記
    共有反復配列を除去するステップは、非標的染色体物質
    に相補的な核酸配列を実質的に含まない前記分離ＤＮＡ
    の増幅ピースを選択することからなる染色体−特異的染
    色試薬。 （５３）、第５２項に記載の染色試薬において、前記増
    幅ピースの前記選択はサザンハイブリダイゼーションの
    使用からなる染色体−特異的染色試薬。 （５４）、第５３項に記載の染色試薬において、前記増
    幅ピースの前記選択は、ゲノムＤＮＡでのハイブリダイ
    ゼーションによる反復配列の存在のために、クローンを
    スクリーニングすることからなる染色体−特異的染色試
    薬。 （５５）、第５４項に記載の染色試薬において、前記ク
    ローンはプラスミドクローンである染色体−特異的染色
    試薬。 （５６）、第５５項に記載の染色試薬において、前記増
    幅ピースの前記選択は標的染色体物質へのハイブリダイ
    ゼーションのために前記クローンをスクリーニングする
    こと、およびこのようにハイブリダイズしないクローン
    を除去することからなる染色体−特異的染色試薬。 （５７）、第４９項に記載の染色試薬において、前記ハ
    イブリダイゼーション能力を無能力化する前記ステップ
    は、前記分離されたＤＮＡの前記標識されたピースを標
    識されない核酸配列でハイブリダイズすることからなる
    染色体−特異的染色試薬。 （５８）、第５７項に記載の染色試薬において、前記ハ
    イブリダイゼーション能力を無能力化する前記ステップ
    は、標識されないブロッキング核酸を標識された核酸に
    、標的染色体物質へのハイブリダイゼーションの前およ
    び／または途中で付加する染色体−特異的染色試薬。 （５９）、第５８項に記載の染色試薬において、標識さ
    れないブロッキング核酸ＤＮＡはゲノムＤＮＡである染
    色体−特異的染色試薬。 （６０）、第５９項に記載の染色試薬において、ブロッ
    キング核酸はゲノムＤＮＡの高度コピーフラクションで
    ある染色体−特異的染色試薬。 （６１）、第５８項に記載の染色試薬において、標識さ
    れないブロッキング核酸ＤＮＡは、ゲノムからの高度コ
    ピー配列を含んでいるクローンおよび／または有効なコ
    ントラストを形成するのに要求されるごとき付加的クロ
    ーンの選択によるものである染色体−特異的染色試薬。 （６２）、第４９項に記載の染色試薬において、前記共
    有反復配列の前記ハイブリダイゼーション能力を無能力
    化する前記ステップは、高度コンプレッキシティプロー
    ブを自己−再結合することからなる染色体−特異的染色
    試薬。 （６３）、第４９項に記載の染色試薬において、共有反
    復配列を除去する前記ステップは、ハイドロオキシアパ
    タイトクロマトグラフィの使用からなる染色体−特異的
    染色試薬。（６４）、第４９項に記載の染色試薬におい
    て、共有反復配列を除去する前記ステップは、分離され
    たＤＮＡの増幅されたピースを前記共有反復配列に相補
    的である固定された一重鎖核酸配列と反応することから
    なる染色体−特異的染色試薬。 （６５）、ＣＭＬに関連する遺伝子再配列を表示する染
    色パターンを形成するために、標的染色体物質を第１７
    項に記載の高度コンプレキシティ核酸で染色する方法で
    あり、当該方法において標識されない高度コピー反復核
    酸またはゲノムＤＮＡは標的染色体物質に、高度コンプ
    レキシティ核酸プローブでのハイブリダイゼーションの
    前または途中でハイブリダイズされる標的染色体物質の
    染色方法。 （６６）、ＣＭＬに関連する遺伝子再配列を表示する染
    色パターンを形成するために、標的染色体物質を第１７
    項に記載の高度コンプレキシティ核酸で染色する方法で
    あり、下記のステップからなる標的染色体物質の染色方
    法。 （ａ）不均一混合物における標識された核酸断片の実質
    的な部分が標的染色体物質に実質的に相補的である塩基
    配列を有し、同標的染色体物質がＣＭＬに関連する疑わ
    しい遺伝子再配列の近傍にある、標識された核酸断片の
    不均一混合物を提供すること。 （ｂ）不均一混合物を標的染色体ＤＮＡでインシトゥハ
    イブリダイゼーションにより反応すること。 （ｃ）遺伝子再配列の有無を確定するために、前記染色
    パターンのシグナルのプロッキシミティおよび／または
    他の特徴を観察および／または測定すること。 （６７）、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）手法を使用す
    るプロセスにより形成された共有反復配列を実質的に含
    んでいない第１７項に記載の高度コンプレキシティ核酸
    プローブ。（６８）、第６７項に記載の高度コンプレキ
    シティ核酸プローブにおいて、前記ＰＣＲプロセスの間
    、前記共有反復配列に相補的な配列であり、かつ非相補
    的末端を拡張するか、またはポリメラーゼによる拡張を
    許さないヌクレオチドに末端化される配列が、前記反復
    配列の増幅を阻止するために同反復配列にハイブリダイ
    ズされる高度コンプレキシティ核酸プローブ。 （６９）、ＣＭＬに関連する疑わしい遺伝子再配列の近
    傍における標的染色体物質を第１７項に記載の高度コン
    プレキシティ核酸プローブにて染色する方法であり、当
    該方法においてプローブは直接には標識されず、かつ標
    的染色体物質に結合したプローブの検出が直接的標識と
    は異なる他の手段にてなされる標的染色体物質の染色方
    法。 （７０）、第６９項に記載の染色方法において、標的染
    色体物質に結合したプローブを検出する手段は抗−ＲＮ
    Ａ／ＤＮＡデュプレックス抗体、および／または抗−チ
    オミジンダイマー抗体の使用からなる標的染色体物質の
    染色方法。 （７１）、第１７項に記載のプローブからなるテストキ
    ット。 （７２）、高度コンプレキシティ核酸プローブでインシ
    トゥハイブリダイゼーションを行うことからなる、ゲノ
    ムにおける比較的近接するプロキシミイテイ（ｃｌｏｓ
    ｅｐｒｏｘｉｍｉｔｙ）に生じる疑わしい遺伝子再配列
    を識別する方法であり、同プローブは疑わしい遺伝子再
    配列の近傍における核酸配列に実質的に相同である配列
    を含む識別方法。 （７３）、第７２項に記載の方法において、前記疑わし
    い遺伝子再配列がＣＭＬおよび／またはＡＬＬに関連す
    る識別方法。 （７４）、高度コンプレッキシティ核酸プローブのイン
    シトゥハイブリダイゼーションからなる隣接する遺伝子
    症候群を検出する方法であり、同プローブは隣接する遺
    伝子症候群の１または複数の成分の特性を示す核酸配列
    に実質的に相同である配列からなる検出方法。 （７５）、第７４項に記載の検出方法において、前記隣
    接遺伝子症候群はダウン症候群である検出方法。 （７６）、細胞遺伝学的には類似するが遺伝学的には相
    違する疾病に関連する切断点をよこぎって部分的または
    全体にわたって側面に位置し、および／または延びる染
    色体領域における核酸配列に実質的に相同である核酸配
    列からなる第１４項に記載の核酸プローブ。（７７）、
    ＣＭＬの特性を示すＢＣＲ−ＡＢＬにとって特異的であ
    る第４５項に記載の染色体−特異的染色試薬。 （７８）、下記により調製された染色体−特異的染色試
    薬の前記ゲノムに対するインシトゥハイブリダイゼーシ
    ョンからなる、異常物を含む慣用のバンド分析により表
    示されるゲノムの染色体領域における１または複数の遺
    伝子再配列を検査する方法。 （ａ）前記染色体領域から染色体−特異的ＤＮＡを分離
    すること。 （ｂ）分離された染色体−特異的ＤＮＡのピースを増幅
    すること。 （ｃ）標的染色体領域に優先的にハイブリダイズする核
    酸断片の集合物を形成するために、分離されたＤＮＡの
    増幅されたピースに含まれている共有反復配列のハイブ
    リダイゼーション能力を無能力化し、および／または同
    共有反復配列を除去すること、および標識された核酸断
    片の不均一混合物を形成するために核酸断片集合物を標
    識すること。 （７９）、核酸プローブを使用する核酸配列を基礎とし
    た染色体物質を染色する方法であり、当該方法において
    染色体物質は１または複数の中期および／または間期染
    色体、またはそれらの１または複数の領域であり、母性
    血液から分離された胎児細胞からなる染色体物質の染色
    方法。 （８０）、インシトゥハイブリダイゼーションによる細
    胞遺伝学的分析のための高度核酸プローブであり、当該
    プローブにおいてプローブ核酸配列はハイブリッド細胞
    系で増殖される高度コンプレキシティ核酸プローブ。 （８１）、第８０項に記載の核酸プローブにおいて、前
    記ハイブリッド細胞系はヒト／ゲッシ動物の細胞系であ
    る高度コンプレキシティ核酸プローブ。 （８２）、高度コンプレキシティ核酸プローブであり、
    当該プローブにおいて同プローブのある要素はゲノムの
    １または複数の染色体の動原体および／またはテロメア
    に標的化される高度コンプレキシティ核酸プローブ。 （８３）、第８２項に記載の核酸プローブにおいて、動
    原体に標的化される要素はアルファー付随配列である高
    度コンプレキシティ核酸プローブ。 （８４）、高度コンプレキシティ核酸プローブで標的染
    色体物質を染色する方法であり、当該方法においてプロ
    ーブ核酸配列は標的染色体物質へのハイブリダイゼーシ
    ョン以前に約２００ベース〜約２０００ベースの断片に
    切断される標的染色体物質の染色方法。 （８５）、第８４項に記載の染色方法において、断片の
    サイズは約１ｋｂである染色方法。 （８６）、第８４項に記載の染色方法において、断片の
    サイズは約５００ベース〜約１０００ベースであり、ハ
    イブリダイゼーションは約３０℃〜約４５℃の温度、そ
    の後の洗浄は約４０℃〜約５０℃の温度で遂行される染
    色方法。 （８７）、第８６項に記載の染色方法において、ハイブ
    リダイゼーションは約３５℃〜約４０℃で遂行される染
    色方法。 （８８）、第８７項に記載の染色方法において、ハイブ
    リダイゼーションは約３７℃の温度で、その後の洗浄は
    約４５℃の温度で遂行される染色方法。 （８９）、第８４項に記載の染色方法において、標識さ
    れた断片はハイブリダイゼーション後フローサイトメト
    リーにより検出される染色方法。 （９０）、第８４項に記載の染色方法において、検出は
    検鏡によりなされる染色方法。 （９１）、第９０項に記載に染色方法において、検鏡は
    自動化される染色方法。 （９２）、第８９項に記載の染色方法において、光散乱
    法が使用される染色方法。 （９３）、インシトゥハイブリダイゼーションによる細
    胞遺伝学的分析のための高度コンプレキシティプローブ
    であり、当該プローブにおいて同プローブの標的染色体
    物質は母性血液から分離された胎児細胞からなる高度コ
    ンプレキシティプローブ。 （９４）、第９３項に記載のプローブにおいて、前記胎
    児細胞は同胎児細胞に特異的であるモノクロナール抗体
    の使用により母性血液から分離される高度コンプレキシ
    ティプローブ。 （９５）、第９４項に記載のプローブにおいて、前記胎
    児細胞は白血球および細胞栄養芽層である高度コンプレ
    キシティプローブ。 （９６）、第９３項に記載の高度コンプレキシティ核酸
    プローブからなる胎児期のテストキット。 （９７）、高度コンプレキシティ核酸プローブで胎児細
    胞の標的染色体物質を染色する方法であり、当該方法に
    おいて胎児細胞は母性血液から分離されている標的染色
    体物質の染色方法。 （９８）、第９７項に記載の染色方法において、胎児細
    胞は同細胞に特異的な抗体の使用により母性血液から分
    離される染色方法。 （９９）第９８項に記載の染色方法において、前記胎児
    細胞は白血球および細胞栄養芽層である染色方法。 （１００）、標識された一重鎖核酸断片の不均一混合物
    からなる染色体−特異的染色試薬であり、当該染色体−
    特異的染色試薬において前記標識された核酸断片は標的
    染色体物質の座位に相補的であり、非標的染色体物質の
    座位に対するハイブリダイゼーション能力を有する核酸
    配列を実質的に含まない染色体−特異的染色試薬。 （１０１）、第１００項に記載の染色試薬において、前
    記一重鎖核酸断片は放射線的、酵素的、免疫的および／
    または親和性検出試薬にて標識される染色体−特異的染
    色試薬。 （１０２）、第１０１項に記載の染色試薬において、前
    記断片はＮ−アセトキシ−Ｎ−２−アセチルアミノフル
    オレインで変更され、水銀／ＴＮＰリガンドで変更され
    、スルホン化され、ジゴキシゲニン化され、またはＴ−
    Ｔダイマーを含む染色体−特異的染色試薬。（１０３）
    、下記のプロセスにより調製された染色体−特異的染色
    試薬。 （ａ）染色体−特異的ＤＮＡを分離すること。 （ｂ）分離された染色体−特異的ＤＮＡのピースをポリ
    メラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅すること。 （ｃ）標的染色体ＤＮＡに優先的にハイブリダイズする
    核酸断片の集合物を形成するために、分離されたＤＮＡ
    の増幅されたピースに含まれている共有反復配列のハイ
    ブリダイゼーション能力を無能化し、および／または同
    共有反復配列を除去すること。 （ｄ）核酸断片の不均一混合物を形成するために集合物
    の核酸断片を標識すること。 （１０４）、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）手法を取り
    入れるプロセスにより形成された共有反復配列を実質的
    に含まない高度コンプレキシティ核酸プローブ。 （１０５）、第１０４項に記載の高度コンプレキシティ
    核酸プローブにおいて、前記ＰＣＲプロセスの間、前記
    共有反復配列に相補的配列であり、かつ非相補的末端を
    拡張するか、またはポリメラーゼによる拡張を許さない
    ヌクレオチドに末端化される配列が、前記反復配列の増
    幅を阻止するために同反復配列にハイブリダイズされる
    高度コンプレキシティ核酸プローブ。 （１０６）、標的染色体物質を高度核酸プローブで染色
    する方法であり、当該方法においてプローブは直接には
    標識されず、標的染色体物質に結合したプローブの検出
    は直接的標識とは異なる他の手段にてなされる染色方法
    。 （１０７）、第１０６項に記載の染色方法において、標
    的染色体物質に結合したプローブを検出する手段は抗−
    ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックス抗体、および／または抗
    −チミジンダイマー抗体の使用からなる標的された染色
    体物質の染色方法。 （１０８）、下記のステップからなる染色体中の細胞学
    的異常を検出する方法。 （ａ）２またはそれ以上の染色されたバンドのパターン
    を形成するために、遺伝学的異常を含んでいる疑わしい
    ゲノムの２またはそれ以上の染色体領域に標的された高
    度コンプレキシティ標識化／可視化核酸プローブをハイ
    ブリダイズすること。 （ｂ）ステップ（ａ）にて形成されたバンディングパタ
    ーンを、異常を含む疑いのある同種の正常な染色体物質
    に前記プローブをハイブリダイズすることにより得られ
    たバンディングパターンと比較すること。 （ｃ）ステップ（ａ）にて形成されたバンディングパタ
    ーンと正常なバンディングパターン間の差異を検出する
    こと。 （１０９）、第１０８項に記載の検出方法において、染
    色体が中期にある遺伝学的異常の検出方法。 （１１０）、第１０８項に記載の検出方法において、染
    色体が間期にある遺伝学的異常の検出方法。 （１１１）、第１１０項に記載の検出方法において、バ
    ンディングパターンは２つの染色領域からなり、疑わし
    い遺伝学的異常は慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）に関連す
    る遺伝子再配列である遺伝学的異常の検出方法。 （１１２）、第１０８項に記載の検出方法において、検
    出は自動化された手段にてなされる遺伝学的異常の検出
    方法。 （１１３）、第１１２項に記載の検出方法において、検
    出はコンピュータにて助成された検鏡にて行う遺伝学的
    異常の検出方法。 （１１４）、下記のステップからなる染色体−特異的一
    重鎖ＤＮＡを調整し、かつ同ＤＮＡを二重鎖標的ＤＮＡ
    に適用する方法。 （ａ）付着端を有し同付着端が突 出鎖と引っ込み鎖とからなる制限断片を提供すること。 （ｂ）鋳型／プライマーを形成する引っ込み鎖の部分を
    ダイジェストするために、制限断片をエキソヌクレアー
    ゼで処理すること。 （ｃ）鋳型／プライマーをＤＮＡで処理し、エキソヌク
    レアーゼによりダイジェストされた一重鎖が再合成され
    た断片を形成するために、標識されたヌクレオチドトリ
    ホスフェートの存在のもとで再合成されること。 （ｄ）再合成された断片をより小さなピースに切断し、
    その結果各再合成断片の互いに反対側末端の標識された
    領域がＤＮＡの分離されたピースの状態であること。 （ｅ）切断再合成断片を変性すること。 （ｆ）一重鎖ＤＮＡプローブを形成するため変性された
    切断再合成断片からＤＮＡ断片の標識された鎖を分離す
    ること。 （ｇ）制限断片を生み出すために使用された同様の制限
    エンドヌクレアーゼで二重鎖標的ＤＮＡを処理すること
    。 （ｈ）制限エンドヌクリアーゼでの処理後、二重鎖標的
    ＤＮＡをエキソヌクレアーゼで処理すること。 （ｉ）エキソヌクレアーゼでの処理後、一重鎖ＤＮＡプ
    ローブを二重鎖標的ＤＮＡに適用すること。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003530892A (ja) * 2000-04-20 2003-10-21 シーメグ リミティド 臨床診断のための方法
JP2004089046A (ja) * 2002-08-30 2004-03-25 Fuso Pharmaceutical Industries Ltd カンジダアルビカンス菌の検出用プローブおよびそれを用いた方法
JP2009148291A (ja) * 1997-05-13 2009-07-09 Erasmus Univ Rotterdam 染色体異常の分子検出

Families Citing this family (110)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6344315B1 (en) 1986-01-16 2002-02-05 The Regents Of The University Of California Chromosome-specific staining to detect genetic rearrangements associated with chromosome 3 and/or chromosome 17
US6475720B1 (en) 1986-01-16 2002-11-05 The Regents Of The University Of California Chromosome-specific staining to detect genetic rearrangements associated with chromosome 3 and/or chromosome 17
US7115709B1 (en) 1986-01-16 2006-10-03 The Regents Of The University Of California Methods of staining target chromosomal DNA employing high complexity nucleic acid probes
US5721098A (en) * 1986-01-16 1998-02-24 The Regents Of The University Of California Comparative genomic hybridization
US5756696A (en) * 1986-01-16 1998-05-26 Regents Of The University Of California Compositions for chromosome-specific staining
US6872817B1 (en) 1986-01-16 2005-03-29 The Regents Of The Univ. Of California Method of staining target interphase chromosomal DNA
US5447841A (en) 1986-01-16 1995-09-05 The Regents Of The Univ. Of California Methods for chromosome-specific staining
US6280929B1 (en) 1986-01-16 2001-08-28 The Regents Of The University Of California Method of detecting genetic translocations identified with chromosomal abnormalities
ES2112833T3 (es) * 1988-12-06 1998-04-16 Flinders Technologies Pty Ltd Aislamiento de celulas fetales a partir de sangre materna para permitir el diagnostico prenatal.
US8592155B2 (en) 1989-07-19 2013-11-26 The Regents Of The University Of California Method of detecting genetic deletions identified with chromosomal abnormalities
AU647741B2 (en) * 1989-12-01 1994-03-31 Regents Of The University Of California, The Methods and compositions for chromosome-specific staining
US5491224A (en) * 1990-09-20 1996-02-13 Bittner; Michael L. Direct label transaminated DNA probe compositions for chromosome identification and methods for their manufacture
US5789161A (en) * 1990-09-20 1998-08-04 Amoco Corporation Methods for genome identification using direct label probe composition
WO1992010566A1 (en) * 1990-12-13 1992-06-25 Board Of Regents, The University Of Texas System In-situ hybridization probes for identification and banding of specific human chromosomes and regions
US5538869A (en) * 1990-12-13 1996-07-23 Board Of Regents, The University Of Texas System In-situ hybridization probes for identification and banding of specific human chromosomes and regions
US6025126A (en) 1991-10-28 2000-02-15 Arch Development Corporation Methods and compositions for the detection of chromosomal aberrations
GB9204610D0 (en) * 1992-03-03 1992-04-15 Lynxvale Ltd Detection of trisomy 21;materials and methods
EP1134293A3 (en) * 1992-03-04 2004-01-07 The Regents of The University of California Comparative genomic hybridization (CGH)
US7534567B2 (en) 1992-03-04 2009-05-19 The Regents Of The University Of California Detection of nucleic acid sequence differences by comparative genomic hybridization
US5976790A (en) * 1992-03-04 1999-11-02 The Regents Of The University Of California Comparative Genomic Hybridization (CGH)
AU680412B2 (en) * 1992-04-09 1997-07-31 Ig Laboratories, Inc. Probes for detecting common liveborn chromosomal aneuploidies
WO1994009022A1 (en) * 1992-10-09 1994-04-28 Oncor, Inc. Methods for the detection of chromosome structural abnormalities by in situ hybridization to fixed tissue
WO1994016104A1 (en) * 1993-01-08 1994-07-21 Ctrc Research Foundation Color imaging system for use in molecular biology
US5597694A (en) * 1993-10-07 1997-01-28 Massachusetts Institute Of Technology Interspersed repetitive element-bubble amplification of nucleic acids
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5814444A (en) * 1995-06-07 1998-09-29 University Of Washington Methods for making and using single-chromosome amplfication libraries
WO1997008339A1 (en) * 1995-08-25 1997-03-06 Dade International Inc. Chronic myelogenous leukemia diagnostic assay
US7455964B1 (en) 1996-07-15 2008-11-25 The Hospital For Sick Children Genes from the 20q13 amplicon and their uses
US5801021A (en) 1995-10-20 1998-09-01 The Regents Of The University Of California Amplifications of chromosomal region 20q13 as a prognostic indicator in breast cancer
US5892010A (en) * 1996-07-15 1999-04-06 The Regents Of The University Of California Genes from the 20Q13 amplicon and their uses
US7049424B2 (en) 1996-07-15 2006-05-23 The Regents Of The University Of California Genes from the 20Q13 amplicon and their uses
US5776683A (en) * 1996-07-11 1998-07-07 California Pacific Medical Center Methods for identifying genes amplified in cancer cells
IL129222A0 (en) 1996-10-01 2000-02-17 Geron Corp Telomerase reverse transcriptase
EP2264427B1 (en) 1997-01-31 2017-05-03 Xy, Llc Optical apparatus with focussing reflector for converging radiation onto a flow of particles, and related method of analysis
US6149867A (en) 1997-12-31 2000-11-21 Xy, Inc. Sheath fluids and collection systems for sex-specific cytometer sorting of sperm
US6071689A (en) 1997-12-31 2000-06-06 Xy, Inc. System for improving yield of sexed embryos in mammals
EP1092783A4 (en) * 1998-02-25 2004-11-03 Sumitomo Electric Industries CANCER DIAGNOSIS METHOD BASED ON DETECTION OF CHROMOSOMAL ABNORMALITIES
JP2002513587A (ja) 1998-05-04 2002-05-14 ダコ エー エス 染色体異常を検出するための方法およびプローブ
US6414133B1 (en) 1998-10-13 2002-07-02 Ventana Medical Systems, Inc. Multiple fusion probes
US7208265B1 (en) 1999-11-24 2007-04-24 Xy, Inc. Method of cryopreserving selected sperm cells
GB0016742D0 (en) * 2000-07-10 2000-08-30 Simeg Limited Diagnostic method
US7083924B2 (en) 2000-07-10 2006-08-01 Btg International Limited Diagnostic method for the identification of foetal DNA in a material sample
WO2002043486A1 (en) 2000-11-29 2002-06-06 Xy, Inc. System for in-vitro fertilization with spermatozoa separated into x-chromosome and y-chromosome bearing populations
US7713687B2 (en) 2000-11-29 2010-05-11 Xy, Inc. System to separate frozen-thawed spermatozoa into x-chromosome bearing and y-chromosome bearing populations
US7585964B2 (en) 2001-05-14 2009-09-08 Cancer Genetics, Inc. Methods of analyzing chromosomal translocations using fluorescence in situ hybridization (FISH)
JP4595067B2 (ja) 2002-08-01 2010-12-08 エックスワイ，エルエルシー 低圧精子細胞分離システム
US8486618B2 (en) 2002-08-01 2013-07-16 Xy, Llc Heterogeneous inseminate system
CA2534394C (en) 2002-08-15 2013-01-08 Xy, Inc. High resolution flow cytometer
US7169548B2 (en) 2002-09-13 2007-01-30 Xy, Inc. Sperm cell processing and preservation systems
EP2359689B1 (en) 2002-09-27 2015-08-26 The General Hospital Corporation Microfluidic device for cell separation and use thereof
BRPI0408857B1 (pt) 2003-03-28 2018-09-11 Inguran Llc aparelho, métodos e processos para separar partículas e para prover esperma de animal separado por sexo
ES2541121T3 (es) 2003-05-15 2015-07-16 Xy, Llc Clasificación eficiente de células haploides por sistemas de citometría de flujo
WO2005079474A2 (en) 2004-02-17 2005-09-01 The Regents Of The University Of California Detection of nucleic acid sequence differences by comparative genomic hybridization
DK2801363T3 (en) 2004-03-29 2018-05-28 Inguran Llc PROCEDURE FOR STORING SORTED SPERMATOZOES
US7306916B2 (en) * 2004-05-04 2007-12-11 Dako Denmark A/S Methods for detecting chromosome aberrations
CA2574499C (en) 2004-07-22 2016-11-29 Monsanto Technology Llc Process for enriching a population of sperm cells
US8409808B2 (en) 2005-02-18 2013-04-02 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Method for detecting risk of progression of low grade cervical dysplasia
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
US8921102B2 (en) 2005-07-29 2014-12-30 Gpb Scientific, Llc Devices and methods for enrichment and alteration of circulating tumor cells and other particles
EP2522746B1 (en) 2006-03-02 2014-11-12 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA expression profile associated with pancreatic cancer
WO2008036851A2 (en) 2006-09-20 2008-03-27 Colorado State University Research Fondation Detection of chromosomal inversions
AU2008239594B2 (en) 2007-04-13 2013-10-24 Beth Israel Deaconess Medical Center Methods for treating cancer resistant to ErbB therapeutics
EP2255190A4 (en) * 2008-02-12 2011-05-04 Brigham & Womens Hospital FISH TEST FOR EML4-ALK FUSION IN LUNG CANCER
TWI518325B (zh) 2010-02-04 2016-01-21 自治醫科大學 對ａｌｋ抑制劑具有先抗性或後抗性癌症的識別、判斷和治療
WO2012027224A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for predicting anti-cancer response
US9090935B2 (en) 2010-10-11 2015-07-28 Kromatid, Inc. Characterization of chromosomal inversions using anti-parallel probes
CA2815787A1 (en) 2010-10-25 2012-05-10 Massachusetts Institute Of Technology Wound healing metakaryotic stem cells and methods of use thereof
KR20140049993A (ko) * 2011-06-02 2014-04-28 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 메타핵 줄기 세포의 dsRNA/DNA 하이브리드 게놈 복제 중간체
JP6117194B2 (ja) 2011-06-17 2017-04-19 ミリアド・ジェネティックス・インコーポレイテッド アレル不均衡を評価するための方法および材料
WO2012174419A2 (en) 2011-06-17 2012-12-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Signatures for predicting the survivability of myelodysplastic syndrome subjects
BR112014004213A2 (pt) 2011-08-23 2017-06-20 Found Medicine Inc novas moléculas de fusão kif5b-ret e usos das mesmas
WO2013056178A2 (en) 2011-10-14 2013-04-18 Foundation Medicine, Inc. Novel estrogen receptor mutations and uses thereof
US10378060B2 (en) 2011-10-14 2019-08-13 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. ZNF365/ZFP365 biomarker predictive of anti-cancer response
WO2013059740A1 (en) 2011-10-21 2013-04-25 Foundation Medicine, Inc. Novel alk and ntrk1 fusion molecules and uses thereof
BR112014015152A2 (pt) 2011-12-21 2017-07-04 Myriad Genetics Inc métodos e materiais para a avaliação da perda de heterozigosidade
CA2864481C (en) 2012-02-23 2020-07-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for predicting anti-cancer response
WO2013182645A1 (en) 2012-06-07 2013-12-12 Institut Curie Methods for detecting inactivation of the homologous recombination pathway (brca1/2) in human tumors
AU2013296237B2 (en) 2012-08-03 2019-05-16 Foundation Medicine, Inc. Human papilloma virus as predictor of cancer prognosis
EP2914621B1 (en) 2012-11-05 2023-06-07 Foundation Medicine, Inc. Novel ntrk1 fusion molecules and uses thereof
US11230589B2 (en) 2012-11-05 2022-01-25 Foundation Medicine, Inc. Fusion molecules and uses thereof
CA3150658A1 (en) 2013-01-18 2014-07-24 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating cholangiocarcinoma
US10308986B2 (en) 2013-03-14 2019-06-04 Children's Medical Center Corporation Cancer diagnosis, treatment selection and treatment
EP2986326B1 (en) 2013-04-15 2018-09-05 Cedars-Sinai Medical Center Methods for detecting cancer metastasis
HK1224331A1 (zh) 2013-07-17 2017-08-18 Foundation Medicine, Inc. 治疗尿路上皮癌的方法
WO2015081073A2 (en) 2013-11-26 2015-06-04 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods for modulating an immune response
WO2015086473A1 (en) 2013-12-09 2015-06-18 Institut Curie Methods for detecting inactivation of the homologous recombination pathway (brca1/2) in human tumors
EP3134546A4 (en) 2014-04-24 2017-12-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Tumor suppressor and oncogene biomarkers predictive of anti-immune checkpoint inhibitor response
WO2015164605A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions and methods for treating subjects with immune-mediated diseases
CA2958801A1 (en) 2014-08-15 2016-02-18 Myriad Genetics, Inc. Methods and materials for assessing homologous recombination deficiency
CA2963091A1 (en) 2014-10-06 2016-04-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Angiopoietin-2 biomarkers predictive of anti-immune checkpoint response
WO2016057651A1 (en) 2014-10-09 2016-04-14 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Multiple-variable il-2 dose regimen for treating immune disorders
WO2016144673A1 (en) 2015-03-06 2016-09-15 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Pd-l2 biomarkers predictive of pd-1 pathway inhibitor responses in esophagogastric cancers
US11174518B2 (en) 2015-10-05 2021-11-16 Cedars-Sinai Medical Center Method of classifying and diagnosing cancer
JP6821693B2 (ja) 2016-02-29 2021-01-27 ジェネンテック， インコーポレイテッド がんのための治療方法及び診断方法
CA3015913A1 (en) 2016-02-29 2017-09-08 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating cancer
JP6231709B1 (ja) * 2016-05-31 2017-11-15 シスメックス株式会社 蛍光画像分析装置および分析方法
US20230183780A1 (en) 2016-07-25 2023-06-15 InVivo BioTech Services GmbH Dna probes for in situ hybridization on chromosomes
ES3033182T3 (en) 2016-09-20 2025-07-31 Dana Farber Cancer Inst Inc Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of aml using usp10 biomarkers and modulators
US11820822B2 (en) 2017-06-06 2023-11-21 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for sensitizing cancer cells to T cell-mediated killing by modulating molecular pathways
WO2019168897A2 (en) 2018-02-28 2019-09-06 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating cancer using combinations of anti-btnl2 and immune checkpoint blockade agents
JP7429192B2 (ja) 2018-04-06 2024-02-07 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド Ｈｈｌａ２受容体としてのｋｉｒ３ｄｌ３、抗ｈｈｌａ２抗体、およびその使用
JP2022513082A (ja) 2018-11-19 2022-02-07 デイナ ファーバー キャンサー インスティチュート，インコーポレイテッド 免疫応答を調節するためのＩＲＥ１α－ＸＢＰ１シグナル伝達経路バイオマーカーの使用
JP7403965B2 (ja) 2019-03-29 2023-12-25 シスメックス株式会社 蛍光画像分析装置及び蛍光画像分析方法
EP3962529A4 (en) 2019-04-30 2023-11-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods for treating cancer using combinations of anti-cx3cr1 and immune checkpoint blockade agents
EP4093513A4 (en) 2020-01-24 2024-05-08 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Uses of biomarkers for improving immunotherapy
WO2022187374A1 (en) 2021-03-02 2022-09-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods of treating red blood cell disorders
US20240280561A1 (en) 2021-06-08 2024-08-22 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Compositions and methods for treating and/or identifying an agent for treating intestinal cancers
WO2023097119A2 (en) 2021-11-29 2023-06-01 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Methods and compositions to modulate riok2
CN114240883B (zh) * 2021-12-16 2022-06-07 易构智能科技(广州)有限公司 一种染色体图像处理方法及系统
WO2025034542A1 (en) 2023-08-04 2025-02-13 Cornell University Gene signature panel predicting cancer response to immune checkpoint blockade and radiation therapy

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4999290A (en) * 1988-03-31 1991-03-12 The Board Of Regents, The University Of Texas System Detection of genomic abnormalities with unique aberrant gene transcripts
US4874853A (en) * 1988-04-18 1989-10-17 City Of Hope Synthetic oligonucleotides useful in diagnosis of chronic myelogenous leukemia
ES2018959A6 (es) * 1988-11-15 1991-05-16 Univ Yale Metodo de delineacion de cromosomas humanos individuales en celulas metafasicas e interfasicas mediante hibridacion de suspension in situ.
AU647741B2 (en) * 1989-12-01 1994-03-31 Regents Of The University Of California, The Methods and compositions for chromosome-specific staining
EP1134293A3 (en) * 1992-03-04 2004-01-07 The Regents of The University of California Comparative genomic hybridization (CGH)
US6590076B1 (en) * 1999-04-02 2003-07-08 Corixa Corporation Compositions for the treatment and diagnosis of breast cancer and methods for their use
WO2000061814A1 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 The Regents Of The University Of California Detection of chromosome copy number changes to distinguish melanocytic nevi from malignant melanoma
JP2006094733A (ja) * 2004-09-28 2006-04-13 As One Corp 癌の検出方法
JP2008048668A (ja) * 2006-08-24 2008-03-06 Yamaguchi Univ Ｄｎａコピー数多型を用いた癌発症体質の判定方法

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2009148291A (ja) * 1997-05-13 2009-07-09 Erasmus Univ Rotterdam 染色体異常の分子検出
JP2003530892A (ja) * 2000-04-20 2003-10-21 シーメグ リミティド 臨床診断のための方法
JP2004089046A (ja) * 2002-08-30 2004-03-25 Fuso Pharmaceutical Industries Ltd カンジダアルビカンス菌の検出用プローブおよびそれを用いた方法

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Publication number Publication date
IE20070380A1 (en) 2007-06-27
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