JPH06510305A - インスリン様成長因子およびアナログの適用による疾患の治療 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インスリン様成長因子およびアナログの適用による疾患の治療発明の背景 本発明は、例えば、神経学的疾患および他の疾患の治療に有用な治療剤ポリペプ チドに関する。

インスリン様成長因子（ＩＧＦ）は、特に発育の間に（レビューについては、デ ルコール（Ｄ’　Ｅｒｃｏｌｅ）、ジャーナル・オブ・デベロプメンタル・フィ ジオロジ−（Ｊ、　Ｄｅｖｅｌ、　Ｐｈｙｓｊｏｌ、）、９　：　４８１−４９ ５　（１９８７）参照）、種々の組織（レビューについては、バクスター（Ｂａ ｘｔｅｒ）ら、コンパラティブ・バイオケミストリー・アンド・フィジオロノー ・レビューズ（Ｃｏｍｐ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ。

Ｒｅｖ、）９１Ｂ：２２９−２３５　（１９８９）；およびダウガディ（Ｄａｕ ｇｈａｄａｙ）ら、エンドタリン・レビューズ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖ、 ）１０　：　６８−９１　（１９８９）参照）にて、細胞の成長を刺激するよう 作用するポリペプチドとして種々の動物種で同定されている。その各々が約７５ ００ダルトンの分子量を有するＩＧＦは化学的にヒト・プロインスリンに関連し ている；すなわち、それらは、（１）プロインスリンの対応するドメインに高度 に相同であり、（２）より小さくかつ関連のないＣドメインによって結合された 、ＡおよびＢドメインを有する。カルボキシル末端伸長、ＤドメインもまたＩＧ Ｆに存在するが、プロインスリンには見い出されない。

ＩＧＦのある種のポリペプチド断片は、各ＩＧＦに特異的な抗体を生じさせる抗 原として有用なことが判明している（例えば、特願昭５９−６５０５８号：ヒン ツおよびリウ（）Ｉｉｎｔｚ　ａｎｄ　Ｌｉｕ）、ジャーナル・オブ・クリニカ ル・エンドクリノロジー・アンド・メタポリツク（Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｅｎｄｏ ｃｒ、　Ｍｅｔａｂ、）５４　：　４４２−４４．６　（１９８２）：ヒンッ（ Ｈｊｎｔｚ）ら、ホルモン・アンド・メタポリツク・リサーチ（ＨａｒＩ！、　 Ｍｅｔａｂ、　Ｒｅｓ、）２０　＋　３４４−３４７　（１９８８）参照）。標 識したＩＧＦ−特異的抗体をプローブとして使用し、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ＝ ］Ｉ（時々、各々、「ソマトメジンＣＪおよび「ソマトメジンＡ」と呼ばれる） が、哺乳動物中枢神経系（ＣＮＳ）を含めた種々の組織で見い出されている：こ れらのポリペプチドをコードするｍＲＮＡがＣＮＳに存在するのは、ＣＮＳにお ける局所的合成を示唆する（レビューについては、バスキン（Ｂａｓｋｉｎ）ら 、■ｌＮ５ＩＩ：１０７−１１１　（１，９８８）参照）。加えて、ＩＧＦ−１ １１（または「脳ＩＧＦＪ）、後者の蛋白の３つのＮ−末端アミノ酸残基を欠＜ ＩＧＦ−１の切形が、胎児および成人ヒト脳（サラ（Ｓａｒａ）ら、プロンーデ ィングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ８３：４９０４−４９０７　（１９８６ ））　、ならびに初乳（フラッジス（Ｆｒａｎｃｊｓ）ら、バイオケミカル・ジ ャーナル（Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｊ、）２５１　：　９５−１０３　（１９８８）　 ）で見い出されている。２つの異なるＩ’ＧＦ受容体が、脳（サラ（Ｓａｒａ） 、ニューロサイエンス・レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｌｅｔ、）３４　：　 ３９　４４’（１９８２）　）を含めた成人ヒ１−ＣＮ５（バスキン（Ｂａｓｋ ｉｎ）ら、１９８８、前掲）で同定されティる。

加えて、欧州特許第２２７．６１．９号は、ヒト胎児膜に局在する第３のタイプ のＩＧＦ受容体についての証拠を記載している。この領域における複雑なリサー チは、（１）脳膜のインスリン受容体はインスリンのみならずＩＣＦを認識する という証拠：　（２）成人ｌＧＦ受容体の２つのタイプにうち１つがインスリン ならびに１ＧＦ−１および■双方に対する親和性をいくらか示すという発見、お よび（３）成人ＩＧＦ受容体の第２のタイプ（バスキン（Ｂａｓｋｉｎ）ら、１ ９８８、前掲）へのＩＧＦ−１１の結合の生理学的有意性に関する現在の不確実 性である。

１ＧＦ−１およびＩＧＦ−１１は、広範囲の罹患細胞タイプの発育または増殖に 刺激的効果を及ぼすようである（レビューについては、ダウガデイ（Ｄａｕｇｈ ａｄａｙ）ら、１９８９、前掲、参照）。ＴＧＦまたはそのある種のポリペプチ ド断片での治療は、骨の修復および置換療法（欧州特許出願第２８９３１４号） として、制癌剤のある種の有害な副作用と戦う手段として（日本国特許第６３１ ９６５２４号）、およびウノおよび他の農業動物における乳および肉の生産を増 加させる方法として（ラルゼン（Ｌａｒｓｅｎ）ら、米国特許第４．７８３．５ ２４号））種々に示唆してきた。また、各ＩＧＦは、ＣＮＳの種々の部分（アイ ゼンマン（Ａｉｚｅｎ■ａｎ）ら、プレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、 ）４０６　：　３２−４２　（１９８７）　；フヱロウズ（Ｆｅｌ］ｏｖｓ）ら 、ソサイエティ・ニューロサイエンス・アブストラクッ（Ｓｏｃ。

Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、＾ｂｓｔｒ、）１３　：１６１５　（１９８７）；オニファ ー（Ｏｎｉｆｅｒ）ら、ソサイエティ・ニューロサイエンド・アブストラクッ（ Ｓｏｃ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、＾ｂｓｔｒ、　）　１３１６４５　（１，９８７ ）：欧州特許２７７．６１９号）から、および末梢神経系（ポスウ幻しくＢｏｔ ｈｗｅｌｌ）、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチズ（Ｊ。

Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　Ｒｅｓ、）８　：　２２５−２３１　（１９８２）　；レ チオーピント（Ｒｅｃｊｏ−Ｐｉｎｔｏ）ら、ジャーナル・オブ＊　ニューロサ イエンス（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、　）６　：　１２１１、−１．２１．９　 （１９８６）　）からの培養した胚ニューロン（これは、成熟ニューロ〉とは異 なり、細胞分裂を受けるその能力を未だ喪失していなしりの生存、増殖および／ または神経突起の成長を促進するようである。加えて、ＩＧＦは未分化神経細胞 の発育に影響することが示されており：ヒト神経芽細胞腫の腫瘍細胞は、神経突 起を延ばすことによって（レチオーピントおよびインイ（Ｒｅｃｉｏ−Ｐｉｎｔ 。

ａｎｄ　ｌ５ｈｉｉ）、ジャーナル・オブ・ニューロサイエンス・リサーチ（Ｊ 、　ＮｅｕｒｏｓｃｉＲｅｓ、）１９：３１２−３２０（１９８８））ならびに 有糸分裂を受けることによって（マットマン（Ｍａｔｔｓｏｎ）ら、ジャーナル ・オブ・セル・バイオロジー（Ｊ、　Ｃｅ１１．。

Ｂｊｏｌ、）１０２　：　１・９４９−５４　（］−９８６））　、添加された ＩＧＦに応答することが示されている。酵素オルニチンデカルボキシラーゼの誘 導は、これらの細胞の有糸分裂活性の刺激に関係することが示されているので、 細胞増殖についてのアッセイはこの酵素の活性レベルの測定を基礎として開発さ れてきた（マットマン（ｌ［ａｔｔｓｏｎ）ら、１９８６）。

前脳コリン作動性ニューロン（培養したラット・中隔ニューロン）の発育は、試 験官内では、種々の増殖因子に対して感受性である。培養培地に神経増殖因子（ ＮＧＦ）を添加すると、伝達物質特異的酵素（アセチルコリンエステラーゼ（Ａ ＣｈＥ）およびコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）（バーティツカ およびヘフティ（Ｈａｒｔｉｋｋａ　ａｎｄ　Ｈｅｆｔ１）、ジャーナル・オブ ・二二一口サイエンス（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）８　：　２９６７− ２９８５　（１９８８）　）の発現につき陽性の細胞数が増加する。また、甲状 腺ホルモンは培養した中隔ニューロンにおけるＣｈＡＴのレベルを増加し、また 甲状腺ホルモンをＮＧＦと組み合わせると、これらの２種の物質の個々の添加効 果の総和を遥かに超えてＣｈＡＴ活性を刺激する（ハヤシ（Ｈａｙａｓｈｉ）お よびパテル（Ｐａｔｅｌ）、デベロップメンタル・プレイン・リサーチ（Ｄｅｖ 、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）３６　：　１０９−１２０　（１９８７）　）、ま た、ＩＧＦ−Ｉ、ＴＧＦ−ＩＴ、およびインスリンは、培養した中隔ニューロン でＣｈＡＴ活性を誘導する（クヌセル＋Ｊｎｕｓｅｌ）ら、ジャーナル・オブ・ ニューロサイエンス（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）１０　：　５５８−５ ７０　（１９９０）　）　。ＮＧＦおよびインスリンを共に培地に添加するど、 ＣｈＡＴ活性に対する影響は付加的なものであるが、インスリンと組み合わせた ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１１の影響は付加的なものではない（クヌセル（Ｋｎ ｕｓｅｌ）ら、１９９０、前掲）。

また、ｉｎ　ｖｉｖｏ研究は、ＩＧＦが未成熟な末梢および中枢神経系の発育お よび分化で役割を演するという仮説を支持するが（サラ（Ｓａｒａ）ら、ジャー ナル・オブ・デベロップメンタル・フィジオロジー（Ｊ、　Ｄｅｖ、　Ｐｈｙｓ ｉｏｌ、　）　１　：　３４３−３５０　（１９７９）；フィリップス（Ｐｈｉ ｌｉｐｐｓ）ら、ベディアトリック・リサーチ（Ｐｅｄｉａｔｒ、　Ｒｅｓ、） ２３　＋　２９８　３０５　（１９８８）　：サラ（Ｓａｒａ）ら、プログレス ・イン・プレイン・リサーチ（Ｐｒｏｇ、　Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）７３　：　 ８７−９９　（１９８８））、この役割の生理学的性質は未確定のままである。

ＣＮＳのニューロン細胞は一旦成熟に達すれば、さらに細胞分裂を受けない。

ＴＧＦ以外の神経親和性因子が、ニューロンの生存を促進する可能な手段として 、例えば、（２０，０００−２２，０００ダルトンおよび１６．０００−１８． ０００ダルトン範囲の見掛けの分子量を有する骨格筋由来蛋白を用いての（ＰＣ Ｔ出願Ｎｏ、ＰＣＴ／ＵＳ８８１０１３９３））神経変性病の筋萎縮性側索硬化 症の、および（ホスホエタノールアミンを用いての（ＰＣＴ出願Ｎｏ、ＰＣＴ／ ＵＳ８８１０１６９３）　）アルツハイマー病の治療として提案されている。サ ラ（Ｓａｒａ）は、通常の対照と比較して、アルツハイマー病に患う患者におい て血清および脳を髄流体ソマトメジン（ＩＧＦ）レベルの「有意な上昇」を見い 出しているにも拘わらず、次のように結論している。

ソマトメジンがアルツハイマー型の痴呆性障害の病因で救急的（ｓｉｃ）役割を 果すか否かは決定されていない。しかしながら、ソマトメジンはアミノ酸の脳組 轍への摂取を刺激するので、その投与は有益な治療効果を提供し得る。

結局、正常な高齢者で観察されるソマトメジンの落ち込みは、細胞老化における その役割に一般的な疑問を投げかける。（引用省略：サラ（Ｓａｒａ）ら、ニュ ーロバイオロジー・オブ・エイジング（Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、＾ｇｉｎｇ）３　 ：１１７−１２０．１１９　（１，９８２））。

ＩＧＦ−ＩＴではなくＩＧＦ−Ｉが成体ラット脳のスライスからアセチルコリン が直ちに（２０分以内）放出されるのを刺激するという報告において、コリン作 動性酵素活性の増大よりもアセチルコリンの神経伝達の一過性増加に関連してい ると考えられるプロセスにルソン（Ｎｉｌｓｓｏｎ）ら、ニューロサイエンス・ レターズ（Ｎｅｕｒｏｓｃｊ、　Ｌｅｔ、）８８　：　２２１−２２６．２２１ ．２２４　（１９８８））は、以下のように指摘している。

アルツハイマー病における主要な欠損の［１つ］は、脳のコリン作動性系に関係 し、そこでは、［アセチルコリンの］合成および放出の減少が見い出されている 。・・・・・・。アルツハイマー病のごとき神経変性障害でＩＧＦの役割をさら に調査するのは非常に重要である。・・・・・・（引用省略）。

損傷を受けた末梢神経で、顕著には「ンユワン細胞」と呼ばれる非ニューロン細 胞でＩＧＦ−１の存在下に増加を検出するためにＩＧＦ−Ｉに特異的な抗体を用 い、ハンソン（Ｂａｎｓｓｏｎ）らは［アクタ・フィジオロジカ・スカンジナビ カ（＾ｅｔａ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　５ｃａｎｄ、　）、１３２：３５−４１．３ ８．４０　（１９８８）］、以下のように示唆している。

かくして、ＩＧＦ−Ｉ免疫活性の増加がいずれの損傷後の末梢神経再生でも観察 され、一般的な反応パターンの一部を形成するようであり、これはンユワン細胞 で最も証明される。著者らの超構造研究は、シュワン細胞が振動外傷後に肥大を 受け、活性化の兆候を示すことを明らかにした。すなわち、顆粒状の小胞体およ びゴルジ複合体は種度が増大した。かくして、著者らは、振動に暴露した神経に ついてのこの研究で著作したシュワン細胞におけるＩＧＦ−１免疫反応性の増加 を、修復プロセスの初期段階で有益な一過性の反応性応答の一部と解釈する。・ ・・・・・。著者らは、損傷した組織または器官の修復を生じる一連の事象にお いて主として初期反応を反映するＩＧＩ−１免疫反応性の増加は、［この増加が ］、［ＩＧＦ−１分子量の軸索輸送の乱れを反映すると解釈され得るものの、部 分的には、振動量ｆＩｌ＆に起こることが報告されている微小管の減少によるも のと考える。

さらに、スヨベルグ（Ｓｊｏｂｅｒｇ）ら［プレイン・リサーチ（Ｂｒａｉｎ　 Ｒｅｓ、　）　４８５　：１０２−１０８　（１９８９）］は、損傷した末梢神 経へのＩＧＦ−Ｉの局所投与は、神経の再生ならびに関連非ニューロン細胞の増 殖を刺激することを見い出している。

例えば、ポリペプチドにおいて天然に存在するし一アミノ酸残基の代わりにＤ− 異性体で置換することを含め、ペプチダーゼによりポリペプチドが分解を受ける のを減少させるために、いくつかの方法が使用されてきた（コイ（Ｃｏｙ）ら、 バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミューニケーション ズ（Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｂｆｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、　Ｃｏｍｕｎ、）７３　：　 ６３２−８（１９７６））。該ポリペプチドをＣＮＳの障害用治療剤として用い ることを企画する場合には１．いわゆる「血液脳関門」、血液に存在する選択さ れた範鴫の分子以外のすべてを効果的に遮断する脳毛細管壁構造を克服し、その 脳への通過を妨げるというさらなる問題をクリアしなければならない。血液脳関 門は該ポリペプチドを脳に直接注入することによって効果的に避けられる一方、 より現実的な方法についてのサーチは、ポリペプチドをより新油性にすることに より、天然では当該関門を横切って輸送される分子に注目するポリペプチドを接 合することにより、あるいはポリペプチド鎖の全長を短くすることによるなどし て、血液脳関門を横切って注目するポリペプチドを輸送するのを促進することに 焦点を当ててきた（バードリッジ（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）、エンドタリン・レビ ューズ（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ）　７　：　３１４−３３０　（ １９８６）：米国特許第４．８０１．５７５号）。

発明の概要 一般に、本発明は、有効量のＮＧＦ、毛様体神経親和性因子（ｃｉｌｉａｒｙｎ ｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　ｆａｃｔｏｒ）　（ＣＮＴＦ）　、またはその機能的 誘導体を投与すると共に、あるいは投与することなく、以下の：　ＩＧＦ−Ｉ、 ＩＧＦ−１の機能的誘導体、ＩＧＦ−１，またハ１ＧＦ−１１１７）機能的誘導 体、Ｉ　ＧＦ−１１、または１ＧＦ−■の機能的誘導体のうち少なくとも１種の 有効量を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物において、好ましくは、老 化、損傷、または病気、例えば、アルツハイマー病、卒中、癲瘍、筋萎縮性側索 硬化症、またはパーキンソン病の影響を蒙っているニューロン組織の治療的処置 の意味で、死滅の危険にあるニューロン細胞、好ましくは非有糸分裂性ニューロ ン細胞および／またはコリン作動性ニューロン細胞の生存を促進する方法をその 要旨とする。

また、本発明は、細胞生存促進量の成長因子、例えば、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−■ 、もしくはＩＧＦ−１［１、または該成長因子の機能的誘導体（例えば、第１の 成長因子の断片、アナログ、断片のアナログ）を、単独で、あるいはもう１つの かかる成長因子または機能的誘導体と生物学的活性に組み合わせて投与すること を含めた第１の処置で哺乳動物を治療し、次いで、伝達物質促進剤、例えば、Ｎ ＧＦ、ＣＮＴＦ、または該伝達物質促進剤の機能的誘導体（例えば、該伝達物質 の断片、アナログ、または断片のアナログ）の神経伝達物質増大量の投与を含め た第２の処置で該哺乳動物を治療することによる、哺乳動物において、好ましく は、老化、損傷、または病気、例えば、アルツハイマー型、卒中、癲瘍、筋萎縮 性側索硬化症、またはパーキンソン病の影響を蒙っているニューロン組織の治療 的処置の意味で、死滅の危険にあるニューロン細胞、好ましくは非有糸分裂性ニ ューロン細胞および／またはコリン作動性ニューロン細胞の生存を促進する方法 をその要旨とする。好ましい具体例において、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ｎ、ＩＧＦ −ｍ、またはＮＧＦの、断片、アナログ、または断片のアナログを投与する。

また、本発明は、有効量のＮＧＦ、ＣＮＴＦ、またはその機能的誘導体を投与す ると共に、あるいは投与することなく（ただし、ＩＧＦ−１またはＩ　ＧＦ−Ｉ Ｉを投与する場合は、ＮＧＦまたはその機能的誘導体も投与し）、以下の・ＩＧ Ｆ−ＩＳ　ＩＧＦ−ｎ、ＩＧＦ−１１、ＩＧＦ−Ｉの機能的誘導体、ＩＧＦ−Ｕ の機能的誘導体またはＩＧＦ−Ｉ［１の機能的誘導体のうち１種またはそれ以上 の有効量を哺乳動物に投与することによって（好ましくは、ＩＧＦ−１、ＩＧＦ −ＩＩ、もしくはＩＧＦ−Ｉｌｌの断片を投与し、別法として、ｒＧＦ−１のア ナログ、ＩＧＦ−Ｈのアナログ、またはＩＧＦ−ＩもしくはＩＧＦ−１１の断片 のアナログを投与することによって）、好ましくは、老化、損傷、または病気、 例えば、アルツハイマー病、卒中、癲痛、筋萎縮性側索硬化症、またはパーキン ソン病の影響を蒙っているニューロン組織の治療的処置の意味で、哺乳動物にお けるコリン作動性ニューロン細胞、好ましくは、非有糸分裂性ニューロン細胞の コリン作動性活性（すなわち、アセチルコリン合成能）を促進する方法をその要 旨とする。

また、本発明は、成長因子、例えばＩＣＦ−１、ＩＧＦ−ＩＴ、もしくはＩＧＦ −ｍ、または該成長因子の機能的誘導体（例えば、断片、アナログ、断片のアナ ログ）の細胞生存促進量を単独で、あるいはもう１つのかかる成長因子または機 能的誘導体と生物学的活性に組み合わせて投与することを含めた第１の処置で哺 乳動物を治療し、次いで、伝達物質促進剤、例えば細胞で伝達物質特異的酵素の レベルを増大させる因子、例えば、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、または伝達物質促進剤の 機能的誘導体（例えば、断片、アナログ、または断片のアナログ）の神経伝達物 質増大量を投与することを含めた第２の処置で該哺乳動物を治療することによる 、好ましくは、老化、損傷、または病気、例えば、アルツハイマー病、卒中、癲 癩、筋萎縮性側索硬化症、またはパーキンソン病の影響を蒙っているニューロン 組織の治療的処置の意味で、哺乳動物におけるコリン作動性ニューロン細胞、好 ましくは非有糸分裂性ニューロン細胞のコリン作動性活性（すなわち、アセチル コリン合成能）を促進する方法をその要旨とする。

本発明のもう１つの方法は、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、またはその機能的誘導体を投与 すると共に、あるいは投与することなく、（１）以下の物質：ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧ Ｆ−Ｔ（７）機能的誘導体、Ｉ　ＧＦ−ＪＴ、ＪＧＦ−］ｆｆの機能的誘導体、 ＩＧＦ−ｍ。

またはＩＧＦ−１［［の機能的誘導体のうちの少なくとも１種の有効量を哺乳動 物に投与することによって、あるいは（２）第１の群の物質、例えば、ＩＧＦ− １゜ＩＧＦ−Ｉの機能的誘導体、Ｉ　ＣＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−ＩＩの機能的誘導体 、ＩＧＦ−■、ＩＧＦ−１［［の機能的誘導体の１種またはそれ以上の細胞生存 促進量の投与を含めた第１の処置で哺乳動物を治療し、次いで、伝達物質促進剤 またはその機能的誘導体、例えば、ＮＧＦ、ＣＮＴＦ、またはその機能的誘導体 の神経伝達物質増大量の投与を含めた第２の処置で該哺乳動物を治療することに よる、哺乳動物の頭部またはを髄の損傷、または哺乳動物の病気疾患、例えば、 卒中、癲痴、年齢の関与するニューロン喪失、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイ マー病、またはパーキンソン病の治療をその要旨とする。

前記した組合せ治療の使用の特別の利点は、高用量にて単独で望まない副作用、 すなわち、毒性を示さないであろう１の成分、例えばＣＮＴＦの必要用量を減少 できることにある。

また、本発明は、まずリガンドを受容体の調製に結合させ、次いで、修飾手法（ 好ましくは、カチオン化、グリコノル化、またはポリペプチドの新油性増大化） を行い、次いで該修飾リガンドを該受容体から放出させることによる、細胞表面 に位置した受容体に結合できるリガンド、好ましくは神経活性ポリペプチドの修 飾方法をその要旨とする。

また、本発明は、哺乳動物において神経突起の再生を促進する方法をその要旨と し、該方法は、成長因子、またはその機能的誘導体の神経突起再生量の投与を含 めた第１の処置で哺乳動物を治療し、次いで、伝達物質促進剤、またはその機能 的誘導体の神経伝達物質増大量の投与を含めた第２の処置で該哺乳動物を治療す ることを含む。成長因子の機能的誘導体は、好ましくは、ＩＧＦ−ｎ　（５４− ６７）（配列番号３）、ＩＧＦ−ＩＩ　（５８−６７）（配列番号２）、ＴＹＣ ＡＰＡＫＳＥ　（配列番号１）、ＴＧＦ−１（５５−７０）（配列番号４）、あ るいは成長因子のアナログ、あるいは成長因子の断片のアナログであり、より好 ましくは、ＩＧＦ−ＩＴ　（５４−６７＋Ｄ−Ｙ）（配列番号４５）、またはＩ ＧＦ−１１（５８−６７；ｏ−Ｙ）（配列番号４６）、あるいは本明細書中にリ ストするいずれかの他のペプチドである。

本発明の方法で投与するポリペプチドは、例えば、新油性を増大させ、グリコジ ル化を改変し、または正味の正電荷を増大させるポリペプチドの修飾によって、 血液脳関門を横切っての当該ポリペプチドの輸送を増加させるように化学的に修 飾できる。

本発明の具体例は、１種またはそれ以上の神経活性ポリペプチドの投与を包含す る。好ましい具体例において、ポリペプチドの投与の組み合わせた望む効果は付 加的であり、より好ましい具体例において、該効果は相乗的である。

Ｉ　Ｇ　Ｆ−ＩＩの断片を投５する池の好ましい具体例において、好ましいＩＧ Ｆ−■断片はＩＧＦ−ＩＩ　（５４−６７、）　（配列番号３）、ＩＧＦ−ＩＴ 　（５８−６７）（配列番号２）を包含するが、それらに限定されるものではな く、あるいはＴＧＦ−１１断片のアナログ、例えば、ＴＹＣＡＰＡＫＳＥ　（配 列番号１）、ＩＧＦ−ＩＩ（５４−６７：。−Ｙ）（配列番号４５）、またはＩ ＧＦ−１１（５８−６７：。−Ｙ）（配列番号４６）を包含し得る。ＩＧＦ−Ｉ ＴまたはＩＣＦ−Ｉｌｌの断片を投与する場合、好ましい＋（”、Ｆｉ、■断片 はＩＧＦ−４（５５−７０）Ｃ配列４）を包含できる。

また、本発明は、精製したＩＧＦｉ、ＩＧＦ−１の精製した機能的誘導体、精製 し、たＩＧＦ−ｎ、ＴＧＦ−ＩＩの精製した機能的誘導体、精製したＩＧＦ−Ｉ ｌｌ、またはＩＧＦ−Ｉｌｌの精製した機能的誘導体の群から選ばれる第１の成 分、ならびに精製したＮＧＦ、またはＮＧＦの精製した機能的誘導体の群から選 ばれる第２の成分を含む組成物をその要旨とする。Ｉ製したとは、当該物質が９ ５％またはそれを超える純変（重量で）であること、すなわち、天然では一緒に 存在する蛋白、脂質、および炭水化物が実質的にないことを意味する。

もう１つの態様において、本発明は実質的に純粋なペプチドを包含し、ここに、 該ペプチドはアミノ酸配列ＴＹＣＡＴＰＡＫ、（配列番号５１）　、ＬＥＴＹＣ ＡＴＰ（配列番号５２）　、ＣＡＴＰＡＫＳＥ　（配列番号５３）　、ＹＣＡＰ ＡＫＳＥ（配列番号５４）、ＹＣＡＰＡ（配列番号５５）　、ＴＹＣＡＰＡ（配 列番号５６）、ＣＡＰＡＫＳＥ　（配列番号２４）　、ＥＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰ ＡＫＳＥ　（配列番号３６）　、ＡＬＬＥＫＹＣＡＫＰＡＫＳＥ　（配列番号３ ７）、およびＡＰＳＴＣＥＹＫＡ（配列番号３８）よりなる群から選択される配 列を包含する。好ましい具体例としては、これらのペプチドは本発明の種々の方 法のいずれで使用することもできる。

また、本発明は、実質的に純粋なペプチドＴＹＣＡＰＡＫＳＥ　（配列番号１） 、Ｔ、ＹＣＡＰＡＫＳＥ　（配列番号５０）Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ　（５４−６７） （配列番号３）、ｒＧＦ−ＩＩ　（５８−６７）（配列番号２）、ＩＧＦ−４（ ５５−７０）（配列番号４）　、ＥＰＹＣＡＰＰＡＫＳＥ　（配列番号５）、ま たは前記ペプチドのアナログ（好ましくは、ここに、チロシン−５９はチロシン のＤ−異性体）、例えばＩＧＦ−１１（５４−６７；。−Ｙ）（配列番号４５） またはＩＧＦ−Ｉｆ（５８−６７：、−Ｙ）（配列番号４６）を包含する。ＩＧ Ｆ−１またはＩＧＦ−ｍの断片を投与する場合、好ましいＪＧＦ−１およびＩＧ Ｆ−ＤＩ断片はＩＣＦ−１（５５−７０）（配列番号４）を包含し得る。

また、本発明は、好ましくは５〜４０個のアミノ酸の、より好ましくは６〜２５ 個のアミノ酸の環状ペプチドを包含する。好ましくは、該環状ペプチドは各々Ｉ ＧＦ−４，ＩＧＦ−１１、またはＩＧＦ−Ｉ［１を、そのアミノ酸配列の少なく とも一部として包含する。該環状ペプチドは当該ペプチドの２つのンステインの 間のジスルフィド結合を包含でき、該ンステインは当該ペプチドの末端または内 部位置いずれかに位置している。別法として、あるいは該ジスルフィド結合に加 えて、該環状ペプチドは当該ペプチドのアミノおよびカルボキシル末端の間にア ミド結合を包含し得る。好ましい環状ペプチドは、環状化によって、例えば、以 下のペプチド　ＣＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号６）　、ＣＴＹＣ ＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号７）、ＣＥＰ’ｒ’ＣＡＰＰＡＫＳＥＣ（配列番号 ８）　、ＣＴＹＣＡＰＡＫＳＥＣ（配列番号９）　、ＣＡＬＬＥＴｆｉＹＣＡＴ ＰＡＫＳＥＣ（配列番号４７）　、ＣＴａ”ｌ’ＣＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号 ４８）　、ＣＴ、ＹＣＡＰＡＫＳＥＣ（配列番号４９）　、ＣＴＹＴＡＰＡＫＳ ＥＣ（配列番号１０）、ＣＡＬＬＥＴＹＡ、ＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号１１）　 、ＣＲＲＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡＣ（ＦＪ１１番号１２）　、ＣＧＹＧＳ ＳＳＲＲＡＰＱＴＣ（配列番号１３）、ＣＹＦＮＫＰＴＧＹＧＣ（配列番号１４ ）、ＣＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲ，ＡＰＱＴＣ）（配列番号１５）　、ＣＫ ＰＴＧＹＧＳＳＳＲ，Ｃ（配列番号１．６）、７ミ／酸配列ＣＧＣＥＬＶＤＡＬ ＱＦＶＣ（ＦＪ１１番号１８）　、７　ミ／Ｉｆｆ配列ＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣＣ ＰＬＫＰＡＫＳＥ　（配列番号２１）　、ＣＧＰＥＴＬＣ（配列ｆ号２６）　、 ＣＧＹＧＳＳＳＲＲＣＰＱＴＧＩＶＤＥＣ）ＵＰ、列番号２７）、ＣＧＤＲＧＦ ＹＦＮＫＰＴＣ（配列番号２８）　、ＣＣＰＬＫＰＡＫＳＡＣ（配列番号２９） 、ＣＤＬＲＲＬＥＭＹＡＰＬＫＰＡＫＳＡＣ（配列番号３０）　、７ミ／酸配列 ＣＤＬＣＬＬＥＴ￥Ｃ（配列番号３３）、アミノ酸配列ＣＤＬＣＬＬＥＴＹＣＡ 、ＴＰＡＫＳＥ　（配列番号３５）　、ＣＣＹＲＰＳＥＴＬＣ（配列番号、１． ０）、ＣＲＰＣ３ＲＶＳＲＲ３ＲＧＩＶＥＥＣ（配列を号４１）　、ＣＧＤＲＧ ＦＹＦＳＲＰＣ（配列番号４２）　、ＣＣＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号４３）、お よびＣＤＬＣＬＬＥＴＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号４４）のジスルフィド結合形 成またはアミド結合形成によって得られたものを包含するが、それらの限定され るものではない。

（１本明細書中で用いるｏＹおよび。−Ｙとは、チロシンのＤ−異性体をいう。

）環状ペプチドのアミノ酸残基は、Ｌ−アミノ酸の形態、または表２にリストす るアミノ酸のアナログ、例えばＤ−アミノ酸の形態でよい。当該アミノ酸配列を 挟む残基は、好ましくは、ＩＧＦ−１の天然に存在する配列またはＴＧＦ−ＩＩ の天然に存在する配列に相同である。

また、本発明は実質的に純粋なペプチドを包含し、ここに、該ペプチドはアミ／ ＭｆＥ列ＣＤＬＲＲ，ＬＥＭＹＣ（配列番号１９）　、７ミ／酸配列ＣＣＦＲ３ ＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣ（配列番号２０）、７ミ／酸配列ＣＣＦＲ８Ｃ（配列番号 ２２）、およびアミノ酸配列ＣＦＲ８Ｃ（配列番号２３）よりなる群から選択さ れ、ここに、該ペプチドは当該ペプチドの２つの残基の間の共有結合によって環 状化される。

また、本発明は、実質的に純粋なペプチドを包含し、ここに、該ペプチドは、ｙ ミ／酸配列ｃＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶｃ　（配列番号３２）、アミノ酸配列ＣＣ ＦＲ８ＣＤＤＬＡＬＬＥＴＹＣ（配列番号３４）よりなる群から選択され、ここ に、該ペプチドは当該ペプチドの２つの残基の間の共有結合によって環状化され る。

また、本発明は、実質的にアミノ酸配列ＣＧＣＥＬＶＤＡＬＱＦＶＣ（配列番号 １８）およびＣＣＦＲ３ＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣ（配列番号）かラナル実質的に純 粋な環状化ペプチドを包含し、ここに該環状化ペプチドはループ状ペプチドの２ つの残基の間に少なくとも１つの共有結合を包含する。

また、本発明は、実質的にアミノ酸配列ＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣ（配列番号 ３２）およびＣＣＦＲ３ＣＤＬＣＬＬＥＴＹＣ（配列番号３９）　の実’ｌｌｌ 的に純粋な環状化ペプチドを包含し、ここに該環状化ペプチドは当該環状化ペプ チドの２つの残基の間に少なくとも１つの共有結合を包含する。

本発明の種々の方法のいずれに対しても好ましい具体例として、機能的誘導体は レトローインベルソ（ｒｅｔｒｏ−ｉｎｖｅｒｓｏ）ペプチド、好ましくはＩＧ Ｆ−１に相同なレトローインベルソ・ペプチド、またはその断片、あるいはＴＧ Ｆ−Ｉ［に相同なレトローインベルソ・ペプチド、またはその断片である。本明 細書中で用いる「レトロ−インベル゛ハペプチド」とは、少なくとも１つの位置 でペプチド結合の方向が逆のペプチド、すなわち、当該アミノ酸の側鎖に関して アミノ−およびカルボキシ−末端が逆のものをいう。レトローインベルソ・ペプ チドはＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸、あるいはＬ−アミノ酸およびＤ−アミ ノ酸の混合物を含有してもよい。

本明細書に掲げたＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１１ペプチドのいずれに対しても、 最も好ましいものはジスルフィド結合形成に関与しない少な（とも１つのシステ ィン残基を含有する線状および環状ペプチドである。天然に存在するアラニンが システィンに変更されているいくつかの場合において、本発明は、少なくとも部 分的な活性を有する天然に存在するアラニンを含有するペプチド、ならびに好ま しい活性を有する置換されたシスティンを含有するペプチドが共にその具体例で ある。本発明のいずれのペプチドもヨウ素化され得る。

「相同」とは、２つのポリペプチド分子の間、または２つの核酸分子の間での配 列同様性をいう。２つの比較された配列の双方における位置が同一の塩基または アミノ酸モノマーのサブユニットによって占められている場合、例えば、２つの ポリペプチド分子の各々における位置がロイシンによって占められている場合、 該分子はその位置で相同である。２つの配列の間の相同性は、２つの配列によっ て保有される合致するまたは相同の位置の数の関数である。例えば、２つの配列 における位置の１０のうち６が合致または相同であれば、２つの配列は６０％の 相同性である。例えば、アミノ酸配列Ｌｅｕ−ｇｌｙ−ｖａｌ−ａｌａ−ｇｌｙ −ｐｒｏおよびＬｅｕ−ｈｊｓ−ｔｙｒ−ａｌａ−ｇａｙ−１ｅｕは５０％の相 同性を有する。

実質的に十分な長さのポリペプチドに加え、また、本発明はＩＧＦ−１、ｒＧＦ −１１、または！ＧＦ−Ｉ［１ポリペプチドの断片を包含する。本明細書で用い るごとく、ポリペプチドに適用される「断片」なる語は、長さが、通常少なくと も約５個の隣接アミノ酸、典型的には、少なくとも約２０個の隣接アミノ酸、通 常、少なくとも約４０個の隣接アミノ酸、好ましくは、少なくとも約６０または これを超える隣接アミノ酸である。ＩＧＦ　Ｉ、■、または■の断片は当業者に 公知の方法によって製造され得る。

本発明の方法では、病気、損傷、または自然の老化過程のごときいくつかの因子 により死滅の危険性が高まった哺乳動物細胞の生存率および／またはコリン作動 性活性を促進させるために、あるいはコリン作動性活性の刺激が哺乳動物の疾患 に有利な効果を有する場合に、ｒＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−１１、Ｉ　ＧＦ−Ｉ［１、 ＩＧＦ−４，ＩＧＦ−１１、およびＴ　ＧＦ−１［［の機能的誘導体、およびそ の組合せ、ならびにＮＧＦもしくはＮＧＦの機能的誘導体も包含するその組合せ を用いる。本発明で利用する機能的誘導体のいくつかは公知である：他のものは 本明細書中で開示するルーチン的方法を適用することによって見い出すことがで きる。例えば、本発明の種々の方法のいずれかで使用すべき機能的誘導体は、本 明細書に記載するアッセイによって決定されるごとく、ＩＧＦ−ＩＳ　ＩＧＦ− ＩＩ、ＩＧＦ−１［１のいずれもの断片もしくはアナログ、またはＩＧＦ−Ｌ　 ＩＧＦ−１１、もしくは■ＧＦ−Ｉｌｌの生物学的活性を模擬したいずれのペプ チドでもあり得る。かかるペプチドの例は、本明細書に記載するごとき、保存的 アミノ酸の挿入、欠失または修飾アミノ酸、環状ペプチド、レトローインベルソ ・ペプチド、または放射能標識またはヨウ素化ペプチドを含有するＩＧＦ断片を 包含できる。本明細書中に記載するペプチドは例として挙げられるものであって 、本発明の方法に有用なペプチド範囲を限定するものと解釈されるべきでない。

本発明の方法（および組成物）、例えば、ＩＧＦ−１およびＮＧＦの共投与は、 以前は知られていない有利方法で、コリン作動性ニューロンの生存および神経伝 達物質合成能を促進する。

治療したニューロン細胞の生存は、未治療対照細胞のそれよりもかなり大きな細 胞活性の維持を示す。成熟ＣＮＳのニューロン細胞のほとんどは、通常、細胞分 裂できないと信じられているので、かかる細胞の生存を促進する薬剤の能力は、 本明細書中に開示するオルニチンデカルボキシラーゼアッセイのごとき細胞親和 性応答を指標とするアッセイによって測定することができる。別法として、生き た細胞として染色する、または生きたニューロンの他の特徴を有する細胞を直接 数える、あるいはｍＲＮＡまたは蛋白への適当な標識化前駆体の取込を検定する ごとき、生存する細胞の相対的な数を再現性よく示すいずれの他のアッセイを利 用することもできる。コリン作動性ニューロンの機能に対する、添加した成長因 子、機能的誘導体、または成長因子および／または機能的誘導体の組合せの効果 が特に興味深い場合、本明細書中に開示するコリンアセチルトランスフェラーゼ もしくはアセチルコリンエステラーゼ・アッセイのごときその機能を測定する別 のアッセイを利用することができる。

成長因子、機能的誘導体、または成長因子および／または機能的誘導体の組合せ が、筋萎縮性側索硬化症におけるを髄コリン作動性ニューロンのごとき、特定の 変性病に弱いことが知られているニューロンの特定のサブセットに対する効果を テストするために、これらのアプローチのいずれを適用することもできる。

ＩＧＦまたはＮＧＦ受容体に結合するポリペプチドについての予備的スクリーニ ングをまず使用して、前記したアッセイ、例えば、細胞生存またはコリン作動性 活性アッセイについての候補を示すことができる。本明細書中に開示するのは、 かかる目的のために設計したＩＧＦ−Ｉ−受容体置換アッセイである。その受容 体に結合するＮＧＦまたはその機能的誘導体の能力を測定する方法は当業者に公 知である。前記アッセイの１またはそれ以上の下で細胞生存またはコリン作動性 活性を促進するようなポリペプチドは、さらに、動物の神経系または他の組織に おける老化、損傷または病気の変性効果と戦うその能力につき、適当なｉｎ　ｖ ｉｖ。

投与によってテストすることができる。

標的組織内において、あるいはそれ無くして、生物を種々のペプチダーゼの作用 に暴露した場合、治療剤としていずれのポリペプチドを用いても、該生物への投 与後にポリペプチドの安定性の問題が持ち上がる。かかる安定性の欠如が問題と 予測される場合、本明細書中に開示するある種の安定性−促進修飾をポリペプチ ドに施すことができる。本明細書中に開示するごとく、血液脳関門を横切っての ポリペプチドの輸送を容易にするために設計した他の修飾をポリペプチドに施す こともできる。

本発明の方法は、ニューロン細胞の病気または老化、または損傷に起因する障害 を含めた、細胞、特に神経細胞の死滅によって特徴付けられるヒトまたは他の哺 乳動物の障害を治療的に処置するのに有用である。ＩＧＦおよび／またはその機 能的誘導体、ならびにＩＧＦおよび／またはその機能的誘導体とＮＧＦもしくは その機能的誘導体との組合せを含めた神経親和性ペプチドは、別の方法による治 療では扱いにくいことが判明しているアルツハイマー病、卒中、癲痛、筋萎縮性 側索硬化症のごとき神経変性病、ならびに一般的な年齢が関与するニューロンの 喪失、疾患を治療するのに有用である。

本発明の他の特徴および利点はその好ましい以下の具体例の記載、ならびに請求 の範囲から明らかであろう。

好ましい具体例の記載 図面につきまず記載する。

図面 図１はラットを髄培養におけるコリン作動性ニューロンの生存に与えるＩＧＦ− １の効果を示すグラフである。

図２はラットを髄培養におけるコリン作動性ニューロンの生存に与えるＩＧＦ− ■およびＩＧＦ−ＩＩＩの効果を示すグラフである。

図３はラットを髄培養におけるコリン作動性ニューロンの生存に与えるＩＧＦ− ■およびＩＧＦ−ＩＩのある種の合成ペプチド断片の効果を示すグラフである。

図４は未成熟ラットの脳へ徐々に用量を増大させて投与したＩＧＦ−Ｉ注射が、 脳オルニチンデカルボキンラーゼ活性に与える効果を示すグラフである。

図５は未成熟ラットの脳へのＩＧＦ−１またはＩＧＦの合成ペプチド断片の注射 が脳オルニチンデカルボキシラーゼ活性に与える効果を示すグラフである。

図６は成熟ラットの脳へのＩＧＦ−１の注射が、脳オルニチンデカルボキシラー ゼ活性に与える効果を示すグラフである。

図７はロイノン取り込みによって評価した、ＴＧＦ−１１誘導体およびＩＧＦ− ■が皮質細胞の生存に与える効果を示すグラフである。

図８は形態学的特徴によって評価した、ＩＧＦ−１１誘導体およびＩＧＦ−Ｉが 皮質ニューロンの生存に与える効果を示すグラフである。

図９はＮＧＦ（飽和濃度）およびＩＧＦ−Ｉが、培養したラットを髄細胞におけ るＣｈＡＴ活性に与える付加的効果を示すグラフである。

図１０はＮＣＦおよびＩＧＦ（飽和濃度）が、培養したラットを髄細胞における ＣｈＡＴ活性に与える付加的効果を示すグラフである。

図１１はＮＧＦおよびＩＧＦ−１の適宜の添加が、培養したを髄細胞におけるＣ ｈＡＴ活性に与える効果を示すグラフである。

図１２はＮＧＦおよびＩＧＦ−１が、を髄培養におけるＡＣｈＥ陽性細胞数に与 える効果を示すグラフである。

図１３は細胞数と相対的蛍光の間の関係が直線的であることを示すグラフである 。

図１４はカルボキシ末端ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−ＩＩベブヂド、およびその機 能的誘導体が、生存する細胞の合計数に与える影響を示すグラフである。

図１４ａは、カルボキシ末端ＩＧＦ−■およびＩＧＦ−１１ペプチド、その機能 的誘導体、ならびに「かき集めた（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）Ｊペプチドが、生存す る細胞の合計数に与える影響を示すグラフである。

図１５は、Ｄ−Ｙ修飾ペプチドＩＧＦ−ＩＩ　（５４−６７）が、細胞と共にイ ンキュベートされた場合に分解に対して安定化されることを示すグラフである。

図１６は、ペプチドＴＹＣＡＰＡＫＳＥが皮質ニューロン細胞の生存に与える影 響を示すグラフである。

図１７は、ペプチドＴＹＣＡＰＡＫＳＥ　（配列番号１）が神経突起の成長に与 える影響を示すグラフである・ａ）ペプチド無し；ｂ）１００ｆ１Ｍペプチド。

図１８は、血清の不存在下で培養したを髄細胞におけるコリンアセ千ルトランス フェラーゼ活性に与えるＩＧＦ−１，ＩＧＦ−ＩＴ、およびＩＧＦ−１１１の影 響を示すグラフである。

図１９は、ＩＧＦ−ＩおよびＴＣＦ−１１が皮質細胞の生存に与える影響を示す グラフである。

図２０は、Ｉ　Ｇ　Ｆ−１およびＩＧＦ−１１が皮質細胞生存に与える影響を示 すグ本発明は、とりわけ、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１１ならびにその機能的誘 導体のごとき神経活性ポリペプチドの修飾、ニューロンの死滅の取り扱いの困難 性の増大によって特徴付けられるある種の神経学的病気または障害用の治療剤と しての、ＮＧＦまたはＮＧＦの機能的誘導体の投与を伴う、および伴わないその 使用に指向される。「神経活性ポリペプチド」または「成長因子」は、ニューロ ン細胞に対して生存促進効果を働くポリペプチド：例えば、ＩＧＦ、例えば、Ｉ ＧＦ＝■およびＩＧＦ−ｎ、神経成長因子（ＮＧＦ）　、表皮細胞成長因子、線 維芽細胞成長因子、およびインスリンと定義される。ポリペプチドの「機能的誘 導体」は、当該分子の断片、アナログ、断片のアナログであって、本明細書中で 定義するニューロン細胞の生存を促進しおよび／またはコリン作動性活性を促進 する能力という、望まれる生物学的活性を保有する化合物である。ポリペプチド の「断片」とは、そのポリペプチドのいずれのポリペプチドサブセットをもいう 。ポリペプチドの「アナログ」とは、生物学的活性を有するが、当該ポリペプチ ドと比較していくらか構造的相違、例えば、アミノ酸配列の改変、あるいは正常 には当該分子の一部ではない追加された化学的部位の存在を有する分子をいう。

（例えば、アンル化、アルキル化、カチオン化、またはグリコジル化反応によっ て導入された）かかる部位は、当該分子の溶解性、吸収、輸送、生物学的半減期 等を改善するであろう。別法として、あるいは加つるに、いくつかの部位は当該 分子の毒性を減少させ、あるいは当該分子のいずれの望まない副作用をも排除ま たは軽減するであろう。かかる効果を媒介できる部位はレミントン（１？ｅｍｊ ｎｇｔｏｎ）のファルマノユーテイカル°サイエンス（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ ｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ）　［７−／り・パブ・カンバ＝　−（ｌｌａｃｋ　Ｐ ｕｂ、Ｃｏ、　）、イートン、ペンシルベニア州、１９８０］に開示されている 。ＩＧＦ−Ｔ、ＩＧＦ−１１、およびＮＧＦのいくつかの誘導体は、単独で、あ るいは組み合わせても作用せず、より詳細に後記するごとく、当業者はいずれが 使用でき使用できないかを認識するであろう。「伝達物質促進剤」は、伝達物質 のレベル増大を引き起こすポリペプチドをいう。ＮＧＦは伝達物質促進剤の例で ある。口伝達物質」は神経伝達物質、例えばアセドルコリンをいう。

「伝達物質特異的酵素」は、ニューロンに存在し、伝達物質代謝に関与する酵素 であり、例えば、コリン作動性ニューロンの場合には、アセチルコリンエステラ ーゼ（ＡＣｈＥ）またはコリンアセチルトランスフェラーゼ（ＣｈＡＴ）である 。

「ニューロン細胞」はニューロンである。

本発明の範囲内にある化合物のいくつかは表１に示し、それは、ＩＧＦ−Ｉ、Ｉ ＧＦ−ｎの（表２に定義される単一文字省略を用いて表した）アミノ酸配列、な らびにＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−Ｉ［の機能的誘導体の番号を示す。これらの誘 導体は、ＩＧＦ−１またはＩＧＦ−１１受容体への結合能力に関する、１または それを超える以下の基準に基づく実験につき選択され、かくして、本発明のさら なる機能的誘導体を同定するのに有用である＝　（１）種間のアミノ酸配列の保 存：（２）種間における「保存的」アミノ酸置換の存在（すなわち、同様の形状 、電荷または他の顕著な特徴）；　（３）放射能ヨウ素化からのチロシン残基の 受容体シールド（マリおよびルーシイ（Ｍａｌｙ　ａｎｄ　Ｌｕｔｈｉ）、ジャ ーナル・オブ・ノくイオロジカ／ｌｚ・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ ｅｍ、）２６３　：　７０６８−７０７２　（１９８８）；　（４）ポリペプチ ドの表面に受容体結合ドメインが位置すること（受容体相互作用についての推定 的要件）を示唆する親水性残基の優勢；および（５）三次元モデルの疎水性およ び極性領域の考慮［例えば、ブルンデル（Ｂｌｕｎｄｅｌｌ）ら、フエ１ノテー ノヨン・プロシーデイングズ（Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃ、）４２：２５９２−２５９ ７　（１，９８３）］および可能な結合部位である領域をそれから同定すること 。

類似の因子をＮＧＦ機能性誘導体の領域で適用することができる。

表１ 血液脳関門を貫通するペプチドの能力は、その親油性またはその正味のイオン荷 に関係するため、その輸送能力［カスティン（Ｋａｓｔｉｎ）ら、ファルマコロ ジー・バイオケミストリー・アンド・ビヘイビア−（Ｐｈａｒｍａｃ、　Ｂｉｏ ｃｈｅｔ　Ｂｅｈａｖ、）１１　ニア１３−７１６（１９７９）＋ラボボルト（ Ｒａｐｏｐｏｒｔ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２０７　：８４−８６ 　（１９８０）：バルドリッジ（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）ら、バイオケミカル・ア ンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミューニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍｕｎ、　）　；リーキネン（Ｒｉｅｋｋｉ ｎｅｎ）ら、ベブタイズ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）８　：　２６１−２６５　（１９ ８７）］を増加させるための、（例えば、フェニルアラニンに代えてペンタフル オロフェルアラニンに置き換えることによる、あるいはカチオン化アルブミンへ の連結による）これらのペプチドの適当な修飾が、血管脳関門の外部での投与に 続くその生物学的利用性で重要であり得、またこれらの修飾は本発明の範囲内の ものである。加えて、ペプチドの生物学的利用性は、プロテアーゼおよびペプチ ダーゼによる分解の受け易さによって制限され得るので（リトルウッド（Ｌｉｔ ｔｌｅｖｏｏｄ）ら、二ニーロケミスドリー・インターナショナル（Ｎｅｕｒｏ ｃｈｅｔ　Ｉｎｔ、）１２　：　３８３−３８９　（１９８８）　）　、その代 謝安定性を増加させるための（コイ（Ｃｏｙ）ら、１９７６）これらのペプチド の修飾（例えば、Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸での置換え）はその治療効果で有 用であり得、またこれらの修飾されたペプチドもまた本発明の範囲内のものであ る。

本発明の機能的誘導体は、とりわけ、以下の方法：１　当該ペプチドの各末端に 存在するアミノおよびカルボキシル基の化学的修飾、 ２　天然配列中のアミノ酸残基のうち１またはそれ以上を、生物学的に適合する 他のアミノ酸残基で置換すること、３、天然配列中のアミノ酸残基のうちの１ま たはそれ以上を、化学的に修飾した生物学的に適合する他のアミノ酸残基で置き 換えること、４、天然配列中のアミノ酸残基のうちの１またはそれ以上の欠失、 ５　当該配列の１またはそれ以上のメンバーへの化学的修飾、またはその置換も しくは欠失を伴う、あるいはそれを伴わない、天然配列中のいくつかのアミノ酸 残基のうちの１つの、好ましくはその配列の反復、６、環状化、すなわち、線状 ペプチドのアミノ末端とカルボキシ末端とを連結すること、 ７、ジスルフィド、ペプチド、エステルまたは他の共有結合による、ＩＧＦ−■ 、ＩＧＦ−ｎ、ＩＧＦ−ＩＩ［、ＣＴＮＦｌＮＧＦ、またはＩＧＦ−Ｔ、ＩＧＦ −■、ＩＧＦ−ＩＩＩ、ＣＴＮＦ、もしくはＮＧＦのいずれかの機能的誘導体と 、ポリペプチド（例えば、ＩＧＦ−７、ＩＧＦ−１１、Ｉ　ＧＦ−１［１、ＣＴ ＮＦ、またはＮＧＦのもう１つの断片）または炭水化物のごときもう１つの分子 との連結、８　デブソベブチド・アナログ、 ９、レトローインベルソ・ペプチド、 のうちのいずれか１つまたはそれ以上で、天然のＩＧＦまたはＮＧＦ分子から変 化させたペプチドを包含する。

本発明の機能的誘導体のいくつかの例を表３に示し、さらに表４に記載する。

表３のペプチドのアミノ酸および分子量分析は表４にまとめる。

また、本発明は、前記したＩＧＦ機能的誘導体内の好ましい下位群として、配列 ：Ｒ１Ａ、ＡＩ　ＡＡ２　ＡＡｓ　Ａ、Ａ４．　、　、　ＡＡ、　Ｒ２［式中、 ＡＡ、、ＡＡ２、ＡＡ、、ＡＡ４．、、ＡＡ、はＩＧＦの、またはＩＧＦ−ペプ チドのサブセットのアミノ酸残基であるか、あるいは表２に定義したそれらの代 わりの保存的置換であり、ｎはＩＧＦ−ｎ機能的誘導体については５ないし７０ のいずれかの整数、ＴＧＦ−ｎ機能的誘導体については５−６７のいずれかの整 数］ を有する機能的誘導体を用いる。Ｒ１はＡＡ、のアミノ基に結合しており、水素 、低級（Ｃ＋−Ｊアルキル、低級アルキルカルボニル、低級アルケニル、低級ア ルキニル、ホルミル、低級（Ｃｅ−＋ｏ）アリール、アロイル、アリールオキシ −カルボニル、アラルキルオキシ−カルボニル、低級アルキルオキシカルボニル 、ベンゾイル、１−モンクハ２−チオノイル、ニコチノイル、ジヒドロニコチノ イル、Ｎ−アルキルジヒドロニコチノイル、イソニコチノイル、およびＮ−アル キルジヒドロイソニコチノイルよりなる群から選択される。当該ペプチドのカル ボキシル−末端置換基（Ｒ２）は以下の：ＯＨ：ＮＨｔ；０Ｒｓ（ここに、Ｒ８ は低級アルキルまたは低級アリール）；０Ｒ３ＯＨ（ここに、Ｒ５は前記定義の 通り）：およびＮＨ−Ｒ３またはＮ　（ＣＨｓ）Ｒｓ　（ここに、Ｒ３は前記定 義の通り）の群から選択される。また、カルボキシル−末端アミノ酸のカルボキ シル基は、−ＰＯ３Ｈ，、Ｂ　（ＯＨ）　！、　ＣＨ２０Ｈ、Ｓ　Ｏｓ　Ｈまた は５−テトラゾール基のうちいずれか１つで置換され得る。

保存的アミノ酸置換 アミノ酸　コード　以下のもので置換 アラニン　Ａ　Ｄ−Ａｌａ、ＧｌｙＳＡｉｂ、β−ＡｌａＳＡｃｐ。

Ｌ−ＣｙｓＳＤ−Ｃｙｓ、または欠失 アルギニン　ＲＤ−ＡｒｇＳＬｙｓＳＤ−Ｌｙｓ、ホモ−Ａｒｇ。

Ｄ−ホモ−Ａｒｇ、Ｍｅｔ、Ｔ　Ｉ　ｅ、　Ｄ−Ｍｅ　ｔ。

Ｄ−１１ｅ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、または欠失アスパラギン　Ｎ　Ｄ−Ａｓｎ、 ＡｓｐＳＤ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。

Ｄ−ＧｌｕＳＧｉｎＳＤ−Ｇｉｎ、または欠失アスパラギン酸　Ｄ　Ｄ−Ａｓｐ 、Ｄ−Ａｓｎ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ。

Ｄ−Ｇｌｕ、Ｇｉｎ、Ｄ−Ｇｌｎ、または欠失ノステイン　ＣＤ−Ｃｙｓ、Ｓ− Ｍｅ−Ｃｙｓ、Ｍｅｔ、Ｄ−Ｍｅｔ。

Ｔｈｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、または欠失 グルタミ〉　Ｑ　Ｄ−Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｇｌｕ。

Ｄ−Ｇｌｕ、ＡｓｐＳＤ−Ａｓｐ、または欠失クルタミン酸　Ｅ　Ｄ−ＧｌｕＳ Ｄ−ＡｓｐＳＡｓｐ、Ａｓｎ。

Ｄ−Ａ　Ｓ　ｎ、　Ｇ　ｌ　ｎ、　Ｄ−Ｇ　］　ｎ、または欠失グリシン・　Ｇ 　Ａｌａ、Ｄ−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ａｉｂ、β−ＡｌａＳＡｃｐ、ま たは欠失 イ’１０イ’ｉン　Ｅ　Ｉ）−１１ｅ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、ＡｄａＡ。

ＡｄａＧＳＬｅｕＳＤ−ＬｅｕｌＭｅ　＋、Ｄ−Ｍｅｔ。

または欠失 ロイシン　Ｌ　Ｄ−Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａｌ、ＡｄａＡ、ＡｄａＧ、Ｌｅｕ 、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｍｅ　３　Ｄ−Ｍｅ　ｔ。

または欠失 リンノ　Ｋ　Ｄ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｄ−Ａｒｇ、ホモ−Ａｒｇ。

Ｄ−ホモ−Ａ　ｒ　ｇ、　Ｍｅ　ｔ、　Ｄ−Ｍｅ　ｔＳＩ　ｌ　ｅ。

Ｄ−１１ｅ、Ｏｒｎ、Ｄ−Ｏｒｎ、または欠失メチオニン　Ｍ　Ｄ−Ｍｅｔ、Ｓ −Ｍｅ−Ｃｙｓ、Ｔｉｅ、Ｄ−１１ｅ。

Ｌｅｕ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｖａ　ｌ、Ｄ−Ｖａｔ、または欠失 フェニルアラニン　Ｆ　Ｄ−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｌ−Ｄｏｐａ。

Ｈ４５ＳＤ−Ｈｉ　ｓ、Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ、）ランス−３，４−もしくは５− フェニルプロリン、ＡｄａＡ。

ＡｄａＧ、シス−３，４−もしくは５−フェニルプロリン、Ｂｐａ、Ｄ−Ｂｐａ 、または欠失プロリン　Ｐ　Ｄ−ＰｒｏＳ　ｔ−１−チアゾリジン−４−カルボ ン酸、Ｄ−もしくはＬ−１−オキサゾリジン−４−カルボン酸（カラエル（Ｋａ ｕｅｒ）、米国特許第４５１１３９０号）、または欠失 セリン　Ｓ　Ｄ−３ｅｒＳＴｈｒＳＤ−Ｔｈｒ、アｏ−Ｔｈｒ。

ＭｅｔＳＤ−ＭｅｔＳＭｅ　ｔ（０）、Ｄ−Ｍｅｔ　（０）、Ｌ−Ｃｙｓ、Ｄ− Ｃｙｓ、または欠失 スＬ／オニンＴ　Ｄ−Ｔｈｒ、　Ｓｅｒ、　Ｄ−Ｓｅｒ、アｏ−Ｔｈｒ。

Ｍｅ　ｔＳＤ−Ｍｅｔ、Ｍｅ　ｔ（０）、Ｄ−Ｍｅｔ（０）、Ｖａｌ、Ｄ−Ｖａ ｌ、または欠失 チロシン　Ｖ　Ｄ−ＴｙｒＳＰｈｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｌ−Ｄｏｐａ。

Ｈｉ　ｓ、　Ｄ−Ｈｉ　ｓ、または欠失バリ：／　Ｖ　Ｄ−Ｖａｔ、Ｌｅｕ、Ｄ −Ｌｅｕ、Ｉｌｅ。

Ｄ−１１ｅＳＭｅｔ、Ｄ−Ｍｅｔ、ＡｄａＡ。

ＡｄａＧ、または欠失 また、本発明は、前記したＮＧＦ機能的誘導体内の好ましいサブグループとして 、配列：Ｒ＋　ＡＡ＋−ＡＡｚ　ＡＡｓ　ＡＡ４．、、ＡＡ−Ｒ，ｚ［式中、Ａ Ａ、、ＡＡ！、ＡＡ３、ＡＡ４．、、ＡＡ、はＩＧＦもしくはその機能的誘導体 のアミノ酸残基であか、あるいは表２に定義したそれらの代わりの保存的置換で あり、ｎはＮＧＦもしくはその機能的誘導体におけるアミノ酸残基の番号に対応 する整数である］ を有する機能的誘導体を利用する。Ｒ■はＡＡ、のアミノ基に結合しており、水 素、低級（Ｃ＋−＠）アルキル、低級アルキルカルボニル、低級アルケニル、低 級アルキニル、ホルミル、低級（Ｃ＠、□＋０）アリール、アロイル、アリール オキシ−カルボニル、アラルキルオキシ−カルボニル、低級アルキルオキシ力ル ボニル、ベンゾイル、１−もしくは２−チオノイル、ニコチノイル、ジヒドロニ コチノイル、Ｎ−アルキルジヒドロニコチノイル、イソニコチノイル、およびＮ −アルキルジヒドロイソニコチノイルよりなる群から選択される。当該ペプチド のカルボキシル−末端置換基（Ｒ７）は以下の・ＯＨ；ＮＨ２；ＯＪ　（ここに 、Ｒ３は低級アルキルまたは低級アリール）；０Ｒ３０Ｈ（ここに、Ｒ３は前記 定義の通り）：およびＮＨ−Ｒ３またはＮ　（ＣＨｓ）Ｒｓ　（ここに、Ｒ３は 前記定義の通り）の群から選択される。また、カルホキ／ルー末端アミノ酸のカ ルボキシル基は、−ＰＯ３Ｈ２、Ｂ　（ＯＨ）　！、−ＣＨ２０Ｈ１−８○３Ｈ または５−テトラゾール基のうちいずれか１つで置換され得る。

当該ペプチドの範囲内に存在するアミノ−末端アミノ基および／またはリンノ、 セリンまたはスレオニン側鎖は、所望により、ホルミル、アセチル、プロピオニ ル、および同様の低級アルキルアシル残基によって、あるいはベンゾイル、テノ ニル、ニコチノイル、イソニコチノイル、Ｎ−アルキルニコチニイルならびにそ のジヒドロおよびテトラヒドロ誘導体のごときアリールまたは複素環アシル残基 によってアシル化されていてもよい。かかる修飾は治療剤の血管脳関門浸透性を 促進することが期待される（フレベリング（Ｃｒｅｖｅｌｉｎｇ）ら、エクスペ リエンンア（Ｅｘｐｅｒｉｅｎｔｉａ）２５　＋　２６−２７　（１９６９）　 ；ポドール（Ｂｏｄｏｒ）ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２１４　：１３７ ０−１３７２　（１９８１）　）。

プロリン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸をアミノ−末端に含有するペプ チド配列において、該アミノ末端アミノ酸は、所望により、Ｌ−ピログルタミン 酸によって置換されていてもよい。

ＩＧＦ−１、ＩＧＦ−１１、およびＮＧＦの断片ポリペプチドは、（各々）天然 の分子以外の少数のアミノ酸残基を含有するＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−Ｕ、およびＮ ＧＦ分子のサブセットである。好ましいＩＧＦ配列は５−４ｏ残基のものであり 、最も好ましいのは６−２５残基の配列である。断片のアミノ酸の一部は、産物 ペプチドの化学的もしくは生物学的安定性を改良し、あるいは血管脳関門を横切 ってのその輸送を改善する保存的置換、欠失、または挿入によって置換されてい てもよい。好ましくは、アミノ酸残基の３０％以下、より好ましくは２０％以下 は置換されているか、あるいは欠失されている。適当な保存的置換のリストは、 蛋白で見い出される通常の天然に存在するアミノ酸残基についての単一文字に対 する鍵と共に表２に示す。表２で用いるある種の他の省略をここに定義する：Ｎ Ｉ　ｅはノルロイシンを意味し、Ａｉｂはアミノイソ酪酸を意味し、ＡｄａＡは β−アダマンチルアラニンを意味し、ＡｄａＧはα−アダマンチルグリシンを意 味し、ホモ−ＡｒｇはＬ−ホモアルギニンを意味し、Ｄ−ホモ−ＡｒｇはＤ−ホ モアルギニンを意味し、Ａｃｐはε−アミノカプロン酸を意味し、ＣｈｇはＬ− α−シクロへキノルグリシンを意味し、ｏＹはＤ−チロシンを意味し、およびア ローＴｈｒはＬ−アロスレオニンを意味する。さらに、Ｃｈａはβ−ソクロへキ ノルアラニンを意味し、Ｍｅはメチル（ＣＨ，）を意味し、Ｏｒｎはオルニチン を意味し、ビローＧｌｕはピログルタミル基を意味し、Ｍｅｔ（０）およびＤ− Ｍｅｔ　（０）は各々Ｌ−およびＤ−メチオニンに由来するスルホキシドを意味 し、β−Ａｌａはβ−アラニンを意味し、Ａｃｍはアセトアミドメチルを意味し 、Ｌ−Ｄｏｐａは３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−Ｌ−アラニンを意味 し、Ｂｐａは４−ベンゾイルフェニルアラニンを意味する。

用いる記号および省略は、特に断りがない限り、生物学命名法についてのＩＵＰ ＡＣ−ＴＵＢジヨイント・コミッションにより推奨されているもの、ｒＮｏｍｅ ｎｃｌａｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｓｙｍｂｏｌｉｓｍ　ｆｏｒ　Ａｍ１ｎｏ＾ｃｉｄ ｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、Ｒｅｃｏｍｍｅ獅р≠狽奄盾獅■ ｌ、９８３Ｊ、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉ ｏｌ、　Ｃｈｅｔ　）　２６０・１４−、！！２　（１９８５）である。常法に おけるごとく、これらの同一の記号は、それらがペプチド鎮に連結している場合 アミノ酸の対応する残基を定義するに使用する。該アミノ酸残基が異性体形を有 する場合、特に断りのない限り、表されるアミノ酸のＬ−形態である。通常の表 記に従うと、各ペプチドのＮ−末端におけるアミノ基は左側に現れ、Ｃ−末端の カルボキシル基は右側に現れる。

前記にて示唆されたアミノ酸置換以外に、ポリペプチドの化学的修飾のごとき、 血液脳関門を横切ってのポリペプチドの輸送を改善する他の方法を使用すること もできる。いずれの化学的修飾手法においても、例えば（例えば、バルドリッジ （Ｐａｒｄｒｊｄｇｅ）ら、１９８７の方法による）カチオン化または（ンユバ ルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）ら、アーカイブズ・オブ・バイオケミストリー・アン ド・バイオフイノノクス（＾ｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、） １８１　：　５４２−５４９　（１９７７）の方法による）グリコノル化よりな り得る化学的修飾プロセスの間、受容体結合部位構造を保護し維持するために、 当該ポリペプチドをまずその受容体に付着させるまた、本発明は、前記したＩＧ Ｆ機能的誘導体内の好ましい下位群として、好ましくは５−４０個のアミノ酸残 基、最も好ましくは６−２５個のアミノ酸残基の環状ペプチドを利用する。かか るペプチドは好ましくはＩＧＦ分子のループ化ドメインの後に作成される。かか るループは天然ジスルフィド結合形成の結果である得る一方、他のものは、結合 を許容する最小エネルギーのコンフォメーションまたは受容体誘導コンフォメー ションに達する蛋白の折り畳みの結果である。

前記したごとく、環状化は、線状ペプチドのアミノおよびカルボキシル末端を、 直接結合させてアミド（ラクタム）結合を形成させるか（実施例２５Ｂ）、ある いは末端ンステイン基を使用するジスルフィド結合形成によって行うことができ る。存在するいずれの内部システィン基も、好ましくは、環状化の前に選択的に ブロックされ、十分に確立された手法を用いて後にブロックを解除することがで きる（実施例２５Ａ）。別法として、内部システィンは、突然変異誘発を探す実 験でしばしば用いられる、ベブチドノのコンフォメーションに影響が最小である ことが期待されるアミノ酸、例えばアラニンによって置換され得る。

好ましい環状ペプチドの例は、末端ンステイン基のジスルフィド結合形成を介し て以下のモノマーペプチドを環状化することによって得られる。

ＣＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号６）ＣＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥＣ（ 配列番号７）ＣＥＰＹＣＡＰＰＡＫＳＥＣ（配列番号８）ＣＴＹＣＡＰＡＫＳＥ Ｃ（配列番号９）ＣＡＬＬＥＴ、ＹＣＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号４７）ＣＴＩ 、ＹＣＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号４８）ＣＴＤＹＣＡＰＡＫＳＥＣ（配列番号 ４９）ＣＴ’ｙ’ＴＡＰＡＫＳＥＣ（配列番号１０）ＣＡＬＬＥＴＹＡＴＰＡＫ ＳＥＣ（配列番号１１）ＣＲＲＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡＣ（配列番号１２ ）ＣＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴＣ（、配列番号１３）ＣＹＦＮＫＰＴＧＹＧＣ（ 配列番号１４）ＣＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴＣ（配列番号１５）Ｃ ＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＣ（配列番号１６）アミド結合形成によって形成された環 状ペプチドの例は以下の通りである：環状（ＴＹＣＡＰＡＫＳＥ）（配列番号１ ）。

ＩＧＦ−ＩおよびＴＧＦ−ＩＩ分子のループ化ドメインに基づく好ましい環状ペ プチドの例は以下の通りである： ＧＰＥＴＬＣＧＡＥＬＶＤＡＬＱＦＶＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲ ＲＡＰＱＴＧ提案されるループペプチド １．１ＧＦ　Ｉに存在するＣｙｓを使用。

ａ）　ＣＧＣＥＬＶＤＡＬＱＦＶＣ６−１８”　（配列番号１８）ｂ）　ＣＤＬ ＲＲＬＥＭＹＣ５２−６１（配列番号１９）ｃ）　ＣＣＦＲ８ＣＤＬＲＲＬＥＭ ＹＣ４７−６１（配列番号２０）ｄ）　ＣＤＬＲＲ，ＬＥＭＹＣＣＰＬＫＰＡＫ ＳＥ　５２−７０（配列番号２１）ｅ）　ＣＣＦＲ３Ｃ４７−５２（配列番号２ ２）ｆ）　ＣＦＲ３Ｃ４８−５２（配列番号２３）ｇ）　ＣＧＣＥＬＶＤＡＬＱ ＦＶＣ６−ｆｉｌｌ　（配Ｆ１１番号１８）ＣＣＦＲ３ＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣ４ ７−６１（配列番号２０’）２、：Ａ剰のＣｙｓ使用 ｈ）　ＣＧＰＥＴＬＣＣ＋］−６（配列番号２６）ｉ）　ＣＧＹＧＳＳＳＲＲＣ ＰＱＴＧＩＶＤＥＣｃ＋３Ｏ−４７（配列番号２７）Ｄ　ＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫ ＰＴＣ２＋−３１＋Ｃ（配列番号２８）ｋ、）　ＣＣＰＬＫＰＡＫＳＡ、Ｃ５２ −７０＋Ｃ（配列番号３０）１）　ＣＤＬＲＲＬＥＭＹ＊ＡＰＬＫＰＡ、ＫＳＡ Ｃ３５２−７０＋Ｃ（配列番号３０）２　番号対応する天然に存在するＩＧＦ− １中のアミノ酸の位置をいう。

３　＊は天然に存在するＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＴの対応する位置からのア ミノ酸の欠失を表す。

ＧＩＶＥＥＣＣＦｌ？５ＣＤＬＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ　（配列番号３１ ）提案されるループペプチド４： １、　１ＧＦ　旧こ存在するＣｙｓの使用：ｇ）　ＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣ ９−２１（配列番号３２）ＣＣＦＲ３ＣＤＬＣＬＬＥＴＹＣ４６−６０（配列番 号３９）４　以下のペプチドのうちいくつかはＡ　Ｉ　ａ　−−−＞Ｃｙ　ｓ置 換を含有する。

５　番号は対応する天然に存在するＩＧＦ−ＩＩ中のアミノ酸の位置をいう。

２、過剰のＣｙｓの使用 ペプチドのレトロ異性体は、側鎖のトポ化学を維持しつつ、ペプチド結合の方向 を逆にすることと定義される。レトローインベルソ・ペプチドにおいて、Ｄ−ア ミノ酸はＬ−アミノ酸の代わりに置き換えられて、天然ペプチドと同様の生物学 的応答および受容体結合のための全体としてのコンフォメーションを保持する（ ハイワード（Ｈａｙｗａｒｄ）ら、ベブタイズ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）　１９７４ 　：第１３回欧州ベブチドシンポンウム、ワイ・ウォルマン（Ｙ、　ｆｏｌｍａ ｎ）編、２８７−２９７頁；グツドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）ら、アカウンツ・オ ブ・ケミカル・リサーチ（＾ｃｃ、　Ｃｈｅ！ｌ、　Ｒｅｓ、）１２　：１−７ 　（１９７９）　）。レトローインペルソ・ペプチドは十分にはっきりとしたコ ンフォメーションの拘束を導入することが示されており、エンドペプチダーゼに よる限定的な生分解を示した。

−ＮＨ−Ｃｌ−Ｃｏ−ＮＯ−ＣＢ−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ−ＣＯ−Ｎｌ（−天然ペプ チド−Ｎ）Ｉ−ＱＣ−ＣＦＩ−ＮＨ−ＱＣ−ＣＩ−ＮＨ−ＱＣ−ＣＨ−ＮＨ−レ トロＤ−ペプチド−Ｎ）１−ＣＨ−Ｎ）１−区−ＣＨ−Ｎ）Ｉ−ＱＣ−ＣＩ（− Ｃｏ−ＮＯ−末端修飾レトロＤ−ペプチド末端基が活性に関与する場合、レトロ Ｄ−ペプチドにおけるアミノ−およびカルボキシル末端を反対にすると、活性が 減少される。アミノ末端に２−アルキルマロナート誘導体および２−アルキル置 換ｇｅ謹−ジアミンを導入することによってカルボキン−末端で修飾を行った。

部分的または単一のアミド修飾レトローインベルソ・セグメントを天然の配列に 取り込む場合、これらの基は架橋残基として使用することもできる。部分的で選 択した単一のアミド修飾レトロペプチドは、生物学的活性を修飾するのに用いる ことができる。異なるレトローインベルソ・ペプチドの例は一般的な配列にてこ こに示す。

ｇＡＡ−−ＡＡ−−ＡＡ−−、ＡＡ−−ＡＡ−−ｍＡＡ　末端−末端修飾ｇ　Ａ 　Ａ　−−Ａ　、Ａ　−−、へＡ−ｍＡＡ−−、八Ａ−−ＡＡ　部分的修飾ｇ　 Ａ　Ａ　−−ｍ　Ａ　Ａ　−−Ａ　Ａ　−−Ａ　Ａ　−−Ａ　、Ａ　−−、Ａ　 Ａ　単一アミド修飾ｇＡＡ＝２−置換ｇｅｍジアミンアミノ酸の代わりｍＡＡ＝ ２−アルキルマロナートアミノ酸の代わりＡＡ＝設計に基づ＜Ｌ−、Ｄ−または 異常アミノ酸１ノドローインベル′ハペプチドは、溶液相セグメント縮合法およ び固相法双方によりて合成される。アラニンのｇｅｍジアミノおよびマロニル誘 導体を以下に掲げる。

提案される配列：ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−ＩＩの以下の断片のレトロ−インベ ル′ハベブチドは以下の一般に知られたペプチド手法によって作成できる。番号 は、各々、全長ＩＧＦ〜■（配列番号１７）の、または全長ＩＧＦ−■（配列番 号３１）の対応するアミノ酸の位置を示す。

ＳＣＤムＲＲＬＥＭＹ　ＣＡＰＬＸ　ＰＡＸＳＡ　５１５１−７０ＲＬＥ　ＣＡ ＰＬＫ　ＰＡＸＳＡ　５ｇ−７０ＣＡＰＬＫ　ＰＡＸＳＡ　６４−７０ ＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹ　ＣＡＰＬＫ　５１−６５Ｌ「三は： 表３ 配列　使用樹層　精製法冨（ＲＴ）　Ｍ粋ペプチドの　配列表分子量（ｍｇ） ＴＹ（ｒ２１ｃＡＰ　ＡＸＳＥ　Ｆｍｏｃ−＾ＰｋＸＳＥ−謝脂　ｖ１工　１７ ．９　２５ｉｏ、３１ｇ、０．９１ｍ＠ｑｌｑ）　（ｌコ、４　分　〉ＫＡＬＬ Ｅ　丁ＹＣＡＴ　ＰＡＸＳＥ　Ｆｍ０ｃ−Ｇｌｕ（ｔ−Ｂｕｌ−樹脂　Ｖ！ｆｌ 　１０．８　３６１０．５ｇ、　０．３６ｍｅｑ／ｇ）　（１２，７分）入ＬＬ Ｅ＊　ＹＣ入ｘｐ　入ＸＳＥ　Ｆｍｅ−Ｇｌｕ（を−日ｕ１−抄ｉｌｌ　！！　 ３５．０　コツ１０．５ｇ、Ｏ，コロ１＋１＠（１／９１　４１４．３　分　） 液速−９，５ｍＬ／分（Ｗａ　＋　ｓ　ｒ　ｓ＞および３．５ｍＬ／分（Ｖｙｄ ａｅ）＋ｘ、４０分におＬＩＴＢ（１）１０−３０％　カラム：　Ｖｙｄａｃ　 Ｃ８表４（続き） π　システィンは未測定 ペプチドの使用 以下により詳細に記載するごとく、本発明は、特にニューロン細胞の死滅を含め た細胞死滅の危険性の増大によって特徴付けられる病気または障害の治療用の薬 剤としての、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−ＩｒならびにＩＣＦ−４、ＩＧＦ−ｆｆ のその機能的誘導体、ならびにＮＧＦおよびその機能的誘導体と組み合わせたそ の機能的誘導体の新規な使用を提供する。本発明の各ポリペプチド（またはポリ ペプチドの組合せ）の生物活性は、都合よくは、脳オルニチンデカルボキンラー ゼアッセイ、を髄コリンアセチルトランスフェラーゼアッセイ、培養中隔細胞ア ッセイ、または培養皮質細胞アッセイによって検定することができ、それらすべ てを後記にて詳細に記載する。別法として、ポリペプチドをまず受容体−成長因 子置換アッセイ、例えば、ホモゲナイズした脳組織中の受容体に結合した標識Ｉ ＧＦ−１を置き換えるポリペプチドの能力を測定する後記受容体−ＩＧＦ−Ｉ置 換アッセイによってスクリーニングすることができる。このアッセイは、２つの 酵素アッセイによって測定されたポリペプチドの生物活性と関連することが証明 されている。後記実施例に記載したごとく、これらのアッセイは、ＩＧＦ−４、 ＩＧＦ−Ｉ［、ＩＣＦ−ｍおよびこれらの分子のいくつかの機能的誘導体の、単 独での、およびＮＧＦまたはＮＧＦの機能的誘導体と組み合わせた場合のこれま でに知られていなかった生物活性を開示する。かくして、本発明のペプチドは、 前記したごとく、ニューロン細胞の死滅の危険性の増大によって特徴付けられる 神経学的病気または障害に罹ったヒトまたは他の哺乳動物への投与に有用である 。これらの神経学的病気または障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋 萎縮性側索硬化症、卒中、および脳またはを髄の振盪もしくは貫通の負傷を包含 するが、これらに限定されるものではない。

本発明の処方は、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、眼 窩内投与、経眼投与、心室内投与、頭蓋内投与、被膜内投与、を髄内投与、槽内 投与、腹腔内投与、局所投与、鼻孔内投与、エアロゾル投与、乱切投与に、およ び経口、バッカル、直腸または膣投与に有用である。該組成物は前記した神経学 的病気のための療法を提供するために、治療上有効な量（例えば、患者の病理的 症状を排除または減少させる量）にてヒトまたは他の哺乳動物の非経口投与用に 処方できる。

本明細書中に提供する化合物は、医薬上許容される非毒性賦形剤および担体と混 合することによって医薬組成物に処方できる。前記したごとく、かがる組成物、 特に液状の液剤または懸濁剤の形態で非経口投与に、特に錠剤またはカプセル剤 の形態で経口投与に、特に散剤、点鼻剤、またはエアロゾルの形態で鼻孔内投与 に調製できる。

都合よくは、該組成物は単位投与形態で投与でき、例えば、レミントンズ・ファ ルマンユーティカル・サイエンス（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’　ｓ　Ｐｈａｒｍａｃ ｅｕｔｊｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅ）に記載されているごときよく知られた方法い ずれによっても調製できる。非経口投与用処方には、通常の賦形剤として、滅菌 水または生理食塩水、ポリエチレングリコールのごときポリアルキレングリコー ル、植物起源の油、水素化ナフタレン等を含有させることができる。特に、生体 適合性で生分解性のラクチドポリマー、ラクチド／グリコリド共重合体、または ポリオキシエチレンーポリオキシブロビレノ共重合体は当該ペプチドの放出を制 御するための有用な賦形剤である。これらのペプチドのための他の有用な非経口 送達系は、エチレン−酢酸ビニル共重合体粒子、浸透圧ポンプ、植え込み可能な 注入系、およびリポソームを包含する。

吸入投与用の処方は賦形剤として、例えばラクトースを含有させるが、あるいは 例えばポリオキシエチレン−９〜ラウリルエーテル、グリココレートおよびデオ キシコレートを含有する水性溶液、あるいは点鼻剤の形態の投与用の油性溶液、 あるいは鼻孔内に適用すべきゲルとじつる。また、非経口投与用処方には、バッ カル投与用にグリココレート、直腸投与用にメトキシサリチレート、あるいは膣 投与用にはクエン酸を包含させることもできる。

本発明の物質は医薬中にての唯一の活性剤として使用できるか、あるいは他の活 性成分、例えば、神経学的病気にてニューロンの生存を容易とできる他の成長因 子、あるいはペプチダーゼもしくはプロテアーゼ阻害剤と組み合わせることがで きる。

治療組成物Ｊこおける本明細書中開示の化合物の濃度は、投与すべき薬物の用量 、使用する化合物の化学的特徴（例えば、疎水性）、および投与経路を含め、多 数の因子に依存して変化するであろう。一般的事項において、本発明の化合物は 、非経口投与では、約０．１ないし１０％ｗ／ｖの化合物を含有する水性生理学 的緩衝液中にて供することができる。典型的な用量範囲は、１日当たり約１μｇ ／ｋｇないし約１．ｇ／ｋｇ体重であり：好ましい用量範囲は１日当たり約０． ０１ｍｇ／ｋｇないし１．００ｍｇ／ｋｇ体重である。投与すべき薬物の好まし い用量は、神経学的病気のタイプおよび進行の程度、個々の患者の総じての健康 状態、選択した化合物の相対的生物学的効果、化合物賦形剤の処方、および投与 経路に依存するであろう。

以下の実施例により、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、添付の請求 の範囲によって決定される本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきでない 。

実施例１ 組換えヒトＩＧＦ−１，ＩＧＦ−１１、およびＩＣＦ−ＩＩ［、ならびにＩＧＦ −ＩまたはＩＧＦ−１１の部分配列からなるいくつかの化学的に合成したペプチ ドは、表１に示した商業的入手源から得た。Ｎ３１−標識［スレオニン”］　Ｔ ＧＦ−７はアメルスハム（＾ｍｅｒｓｈａｍ）　（アーリントン・ハイツ（＾ｒ ｌｉｎｇｔｏｎ　Ｈｅｉｇｈｔｓ）、イリノイ州）から得た。ＩＧＦ−１または ＩＧＦ−Ｉ［の部分配列からなる他のペプチドは、ミリゲン・バイオサーチ（Ｍ ｉｌｌｉｇｅｎ　Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）モデル９６００ペプチド合成器にてＦｍ ｏｃ化学を用いて化学的に合成し、ハドソン（Ｈｕｄｓｏｎ）　［ジャーナル・ オブ・オーガニック・ケミストリー（Ｊ、　Ｏｒｇ、　Ｃｈｅｍ、）５３　：　 ６１７−６２４　（１９８８）］の方法に従ってヒユーレット−バラカッド・モ デル（Ｈｅｖｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ　Ｍｏｄｅｌｓ）　１０５０および１０ ９０Ｍ　ＨＰＬＣで精製した。

Ｆｍｏｃアミノ酸、ＢＯＰ　（カスドロ（Ｃａｓｔｒｏ）の試薬）、および樹脂 はバイオサーチ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）　（サン・ラファ工ｏ　（Ｓａｎ　Ｒａ ｐｈａｅｌ）、カリフォルニア州）およびバケム・バイオサイエンス、インコー ホレイテッド（Ｂａｃｈｅｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ。

Ｉｎｃ、）（フィラデルフィア、ベンノルベニア州１９１０４）から購入した。

溶媒はプルディック・アンド・ジャクソン（Ｂｕｒｄｉｃｋ　ａｎｄ　Ｊａｃｋ ｓｏｎ）　（ムスケゴン（Ｍｕｓｋｅｇｏｎ　）、ミンガン州４９４４２）から 購入した。他の試薬はングマ・ケミカル・カンパニー　（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍ ｉｃａｌ　Ｃｏ、　）　（セントルイス、ミズリー州６３４７８）から購入した 。

大脳皮質および小脳を含有する脳組織は、成体スブラグードーレイ・ラット（ヒ ルトップ・ラブ・アニマルズ、インコーポレイテッド（ｌｌｉｌｌｔｏｐ　Ｌａ ｂ　Ａｎｔｍａｌｓ。

１、ｎｃ、　）、スコツツブイル（Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ）、ペンシルベニア州 ）から解剖し、１．ＯｍＭＨＥＰＥＳＳＯ，５％ＢＳＡ、領０１２５九０１２５ ０．０２５％バシトラシン、およびｌ００ＫＩＵ／ｍｌのアプロチニン、ｒ＋Ｈ ７，６、からなる５０容量の水冷緩衝液を含有するブリンクマン・ポリトロン（ Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｐｏ１ｙｔｒｏｎ）ホモゲ±イザー（ウェストベリー（Ｗｅ ｓｔｂｕｒｙ）、ニューヨーク州）中、低出力にて５分間、ホモゲナイズした（ ボハンノン（１３ｏｈａｎｎｏｎ）ら、エンジクリノロジー（Ｅｎｄｏｃｒｉｎ ｏｌｏｇｙ）１１９　：　９４３−９４５（１９８６））　。ホモゲナイゼーシ ョンの後、該組織を２０分間の７８００Ｘｇでの遠心後に収集し、１０容量のア ッセイ緩衝液に再懸濁した。組織（５０μ＋）、１００μｍ１２５７　［スレオ ニン５１］ＩＧＦ−１（２０ｐＭ）　、および５０１の緩衝液または変更する濃 度のペプチドを９６−ウェルのプレートに添加し、水上で３時間インキュベート した。インキュベーション期間の後、該組織を領０１％ポリエチレンイミンに予 め浸漬したワットマンＧＦ／Ｃフィルター上に収集し、ブランデル（Ｂｒａｎｄ ｅｄ、　）細胞収穫器（ガイセルスブルグ、マジソン州）を用いて水冷アッセイ 緩衝液で４回洗浄した。

フィルターを取り出し、結合した＋２５１　［スレオニン”］　ＩＧＦ−Ｉをベ ックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）モデル５５００Ｂガンマカウンターを用いて測定し た。

表５は天然のＩＧＦおよびＩＧＦ断片を利用した１２３Ｉ　［スレオニン５９］ ■ＧＦ−１置換アツセイの結果をまとめる。該結果は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ −Ｈｔ”’　Ｉ　−（スレオニン”３　１　Ｇ　Ｆ　−１（７）優ｔｌりｆｆｉ 換体テアルカ、ＩＧＦ−ＩＩは本質的に不活性であることを示し、該アッセイは ＩＧＦｉ様分子の同定につき選択的であることが示される。このアッセイにおい て、ＩＧＦ−１（２４，−４１）は、単独で、あるいはＩＧＦ−Ｉ［（５４−６ ７）と組み合わせて、＋２３１−［スレオニン”］　ＩＧＦ−１の置き換えにて 活性であった。ＩＧＦ−ＩＩ　（５４−６７）は単独で、および表５にリストし たい（っかの他の断片は、Ｉ″Ｉ［スレオニン”］　ＩＧＦ−Ｉの有意で効果的 な置換体ではなかった。

表５ ＩＧＦｉ受容体競合アッセイの概要 ペプチド（濃度）　最大％　結合（ＳＤ）ＩＧＦ−１（１０ｐＭ）　１００　（ １，１）ＩＧＦ−１（４０ｎＭ）　９．６　（０，７）ＩＧＦ−ＩＩ　（４０ｎ Ｍ）　９２．１　（０，７）ＩＧＦ−ｍ　（４０ｎＭ）　１７．６　（２，６） ＩＧＦ−１（２４−４１）（１００μＭ）　４４　（７）ＩＧＦ−１（２４−４ １）（５０μＭ）　９９　（６）ＩＧＦ−１（２４−４１）　（５０μＭ）　十 ＩＧＦ−１１（５４−６７）（５０μＭ）　４９　（１１）ＩＧＦ−ｎ　（５４ −６７）（１００μＭ）　９４　（６）ＩＧＦ−Ｉ　（６２−７０）（１００μ Ｍ）　８３　（２０）ＩＧＦ−１（３０−４１）（１００μＭ）　９４　（１， ４）ＩＧＦ−■（６２−６７）（１００μＭ）　８３　（２１）ｒＧＦ−ｆ［（ ３３−４０）（１ｍＭ）　９２　（１，８）実施例２ 脳は、成体スブラグードーレイ・ラットから無傷で取り出し、粉末化したドライ アイス上で凍結し、（小脳および脳幹のレベルにて）２０μｍのセクションに切 断し、これをゼラチン被覆の顕微鏡スライドグラス（ヘルケンハムおよびベルト （Ｂｅｒｋｅｎｈａｍ　ａｎｄ　Ｐｅｒｔ）、ジャーナル・オブ’二１　Ｃｆｆ サイエンス（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、）２：１１２９−１１４９（１９８２） ）上に解凍設置した。ボハンノン（Ｂｏｈａｎｎｏｎ）ら（１９８６）の方法の 修正法を用い、０．０１ｎＭ　、　ｓＩ−［スレオニン５Ｉ］ＩＧＦ−１を単独 で、あるいは未標識ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−１１、またはその合成ペプチド断片と 組み合わせて含有する２５０μｍのＨＥＰＥＳアッセイ緩衝液（実施例１参照） で該組織セクションを覆った。該セクションを４℃にて２４時間インキュベート し、次いで、水冷したＨＥＰＥＳアッセイ緩衝液を３回の１分間の変更にて（各 ２００ｍ１）すすいだ。次いで、組織セクションをフィルターを具備したスライ ドからぬぐい去り、組織に結合した放射能活性をペックマンのモデル５５００Ｂ ガンマカウンターで測定した。

このアッセイにおいては、実施例１に記載したアッセイとは対照的に、＋２３７ −［スレオニン’］　ＩＧＦ−１結合はＩＧＦ−１およびＩＧＦ−１１双方によ って強力に置き換えられ、これは、これらの分子の双方の強力に活性な誘導体を 検出するこのアッセイの有用性を示す（表６）。１０１　［スレオニン”］　Ｉ ＧＦ−Ｉ結合はＩＧＦ−ｎ　（３３−４０）によって置き換えられたが、ＩＧＦ −１１（５４−６７）によっては置き換えられなかった。

表６ ペプチド　最大結合％ ＩＧＦ−Ｉ　（４μＭ）　９１ １ＧＦ−Ｉ　（４００μＭ）　３０ ＴＧＦ−ＩＩ　（２００μＭ）　５０ ＩＧＦ−ＩＩ　（４００μＭ）　２３ ＩＧＦ−ｎ　（３３−４０）（１ｍＭ）　７６ＩＧＦ−ＩＩ（３３−４０）（， １０ｍＭ）　８２ＩＯＦ−ＩＩ　（５４−６７）（，２５ｍＭ）　１６７ＩＧＦ −ｎ　（５４−６７）（，０２５ｍＭ）　１．３２実施例３ ＩＧＦ−４，ＩＧＦ−１１、またはこれらの分子の合成ペプチド誘導体の活性は 、１４日齢の胚ラットを髄ニューロンの解離した培養につきアッセイに付した。

を髄ニューロンはトリプシンでばらしたを髄から得られ、これを平板培養し、ペ プチドと共にインキュベートし、引き続いて、マツクマナマン（Ｍｃｌｌａｎａ ｍａｎ）　［デベロップメンタル・バイオロジー（Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、）１２ ５　：　３１１−３２０　（１９８８）］によって記載されているごとくコリン アセチルトランスフェラーゼ活性につき検定した。

このアッセイでは、ＩＧＦ−１はコリンアセチルトランスフェラーゼ活性の実質 的で用量依存的な増加を生じさせ（図１）、これは、ＩＧＦ−１はを髄コリン作 動性ニューロンのコリン作動性活性および／または生存を劇的に促進することを 示唆する。さらに、ＩＧＦ−ＩＴおよびｆＧＦ−１１１はを髄アッセイで活性で あることが判明した（図２）。加えて、ＩＧＦ−Ｉ　（２４−４１）およびＩ　 ＧＦ−ＩＴ（３３−４０）もまたコリンアセチルトランスフェラーゼ活性で用量 依存的増加を生じることが判明し、これは各ペプチドが活性なＩＧＦ機能的誘導 体であることを示す（図３）。

実施例４ ＣＮＳ神経親和性活性についての生化学的マーカー、脳オルニチンデカルボキシ ラーゼの誘導を用い、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−ＩＩまたはこれらの分子の合成ペプ チド誘導体のｉｎ　ｖｉｖｏ活性をテストした。オルニチンデカルボキシラーゼ の誘導（すなわち、活性の増大）は種々の親和性因子の作用についての一般的マ ーカーであることが報告されている（シュバルッ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）ら、デベ ロップメンタル・プレイン・リサーチ（Ｄｅｖ、　ＢｒａｉｎＲｅｓ、）１　： 　４０３−４１３　（１９８１）　：カンジエ（Ｋａｎｊｅ）ら、プレイン・リ サーチ（Ｂｒａｉｎ　Ｒｅｓ、）３８１　：　２４−２８　（１９８６）；ラッ セル（Ｒｕｓｓｅｔ）ら、ライフ・サイエンス（Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉ、）１９　： 　１２９７−１３０６　（１９７６）；７ツクドネル（１ＩａｃＤｏｎｎｅｌ　 １　）ら、ブロンーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ ンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃｄ。

Ｓｃｉ、）ＵＳＡ７４．４６８１−４６８４　（１９７７）；リネハート（Ｒｉ ｎｅｈａｒｔ）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・ サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃｄ、Ｓｃｉ、　）Ｕ　Ｓ　Ａ　８２ ．４３６５−４３６８　（１９８５））。

１ＧＦ−１、ＩＧＦ−ＩＩまたは合成ペプチド誘導体（１，２５−２，５μｇ用 量、１処理群当たり６匹の動物）を含有する０、１Ｍリン酸緩衝生理食塩水（Ｐ ＢＳ）５μｍを、４日齢のスプレィゲート−レイ・ラットに大脳内注射した（側 転室の領域）。６時間後、脳を取り出し、実質的にルイス（Ｌｅｗｉｓ）ら［プ ロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ。

５ｃＬ）ＵＳＡ、７５　：１０２１−１０２３　（１９７８）］によって紀載さ れているごとくに、オルニチンデカルボキシラーゼを検定した。

ＩＧＦ−Ｉの投与は、脳オルニチンデカルボキシラーゼ活性の用量依存的増加を 生じさせた（図４）。加えて、ＩＧＦ−ｒ　（２４−４１）およびＩＧＦ−１１ （５４−６７）は脳オルニチンデカルボキシラーゼ活性を増加させた（図５；こ れらのペプチドは図５では、各々、ＩＧＦ−Ｉ　（２−４）およびＩＧＦ−Ｉ　 （５−６）として言及されている）。

実施例５ ＩＧＦ−Ｉによる脳オルニチンデカルボキシラーゼの誘導が動物を発育させるこ とに限定されるか否かを決定するために、成体スプレィゲート−レイ・ラットの 側転室にＩＧＦ−Ｉを注射した。６時間後、脳を取り出し、いくつかの領域に解 剖しく大脳皮質、内側中隔、および海鳥）、次いで、実施例４に記載されている ごとくにオルニチンデカルボキシラーゼ活性について検定した。図６に示すごと （、ＩＧＦ−４は、検定したすべての脳領域でオルニチンデカルボキシラーゼを 刺激した。この結果は、ＩＧＦ−関連分子は脳の広範囲な領域で潜在的利用性を 有することを示す。

［’Ｈ］−ロインンの取込を増進する、および神経突起を担持する細胞の生存を 促進するＩＧＦ−１およびＴＧＦ−ＩＩの合成誘導体（ＩＧＦ−ＩＴ　（５４− ６７））の能力を、培養したラット皮質性細胞で調べた（ＩＧＦ−１における番 号「５４−６７」は、当該断片が天然のＩＧＦ−１のアミノ酸残基５４−６７を 包含することを示す）。ＩＧＦ−１と同様に、ＩＧＦ−ＩＩ　（５４−６７）は 、図７に示すごとく、低密度の２４時間混合皮質培養における［３Ｈ］−ロイン ン取込を増大させた。また、ＴＧＦ−ｎ　（５４−６７）は、図８に示すごとく 、（神経突起担持細胞の存在によって決定される）皮質ニューロンの生存を増加 させる点でＩＧＦ−１様の生存促進活性を示した。

当業者に知られている標準的な技術を用い、１８−１９日齢胚う・ソトから得ら れた解離した皮質細胞につき測定を行った。無血清Ｎ２培地中のポリ−１−オル ニチン−ラミニン被覆プラスチック組織培養細胞につき、１．５　Ｘ　１０’／ 　ｃｍ２で細胞を接種した（ボッテンンユタイン（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ）ら 、ブロンーデイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（ Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ７６：５１４−５１７ 　（１９７８））。取込アッセイにつき平板培養中の細胞に［３１刊−ロイシン を添加した。平板培養の２４時間後に培養を終止し、［３Ｈ］−ロインン取込ま たは、顕微鏡観察によって、神経突起細胞の数を測定した。

表７ 培養しこラットを髄細胞におけるＣＨＡＴ活性に対するＮＧＦおよびＩＧＦ−１ の付加的効果 成長因子　濃度（ｎＭ、）　対照を上回る％増加ＮＧＦ　２．０　４４ ＩＧＦ−１１，３２０ １，２，５５０ ２５，０３７ ２ｎＭ　ＮＧＦ＋ＩＧＦ−Ｉ　１．３　５８１２．５　９３ ＮＧＦ　０．０２　５６ ２５ｎＭ　ＩＧＦ−１＋ＮＧＦ　０．０２　７５０．２　１００ ＴＧＦ−１およびＮＧＦの同時投与がＣｈＡＴ活性に与える効果を、培養した中 隔ニューロンで検定した。ＣｈＡＴは神経伝達物質アセチルコリンの合成におけ る最初の酵素であり、コリン作動性ニューロンについての特異的生化学的マーカ ーである。この酵素のアッセイは、コリン作動性ニューロンの生存および／また はこの酵素の調節に与えるＩＧＦ（および他の因子）の効果の指標として用いる ことができる。図９に示すごとく、ＣｈＡＴ活性のさらなる増加が、飽和または 最大上濃度のＩＧＦ−１と組み合わせた飽和濃度のＮＧＦで観察された。図９中 、中抜四角印はＩＧＦ−Ｉを示し、菱形はＩＧＦ−１＋２ｎＭ　ＮＧＦを示し、 中抜丸印は２ｎＭ　ＮＧＦ”を示し、および４０３　ＤＰＭにおける水平線は未 誘導細胞を表す。図１０に示すごとく、同様の付加的効果が、飽和濃度のＩＧＦ −１を飽和もしくは最大上濃度のＮＧＦと組み合わせた場合に観察された。図１ ０中、中抜四角印はＮＧＦを示し、菱形はＮＧＦ＋２５ｎＭ　ＩＧＦ−１を示し 、中抜丸印は２５ｎＭ　ＩＧＦ−Ｉを示し、５５４　ＤＰＭにおける水平線は未 誘導細胞を表す。対照未誘導細胞より優れたＣ　ｈ　Ａ　Ｔ活性のパーセント増 加は表７にまとめる。

培養したラット中隔細胞実験は、一般に、バーティックおよびヘフテイ（Ｒａｒ ｔｉｋｋｕ　ａｎｄ　［１ｅｆｔｉ）　［）＋−ナル・オブー＝ニーａサイエン シズ（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）、８　：　２９６７−２９８５　（１ ９８５）　、ノーヤシおよびノくチル（Ｈａｙａｓｈｉ　ａｎｄ　Ｐａｔｅｌ） 、デベロブメンタル・プレイン・リサーチ（Ｄｅｖ、　ＢｒａｉｎＢｅｓ、　） 、３６　：１０９−１２０　（１９８７）］に記載されているごとくに、以下の ように行った。

第１７８目の胚ラットの中隔領域の解離した細胞培養は、組織の酵素的（デイス ベイス（Ｄｉｓｐａｓｅ）、コラボラトラティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒ ａｔｊｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ））解離を用い、当業者に知られている標準的な 技術によって調製した。細胞は、ポリ−１−オルニチン−ラミニン被覆プラスチ ック組織培養ウェル中、６Ｘ１０’細胞／ｃｍ’で接種しく平板に塗布）、栄養 補給することなく、無血清Ｎ２培地（ボッテンノコティン（Ｆｌｏｔｔｅｎｓｔ ｃｉｎ）ら、１９７８）中で５日間培養した。対照（未誘導）培養には、添加し た成長因子を摂取させず：誘導した培養には、平板への塗布時に、図９および図 １０に示した製産のＩＧＦ−１およびＮＧＦを摂取させた。ＮＧＦは商業的に入 手可能である。ＣｈＡＴは、マクマナマン（ＭｃＭａｎａｍａｎ　ｌら［デベロ ブメンタル・バイオロジー（Ｄｅｖ、　Ｂｉｏｌ、）１２５　：　３１１−３２ ０　（］　９８８）］に記載されている方法によってアツセイを行った。ＡＣｈ Ｅの染色は、バーティツカおよびヘフテイ（Ｈａｒｔｉｋｋａ　ａｎｄ　１ｌｅ ｆｔｉ）　［リサーチ／Ｌ　−ｔブー＝　ニーｏサイｘ＞ス（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏ ｓｃｉｅｎｃｅ）８　：　２９６７−２９８５　（１９８８）］の方法により行 った。

酵素アセチルコリンエステラーゼ（八ＣｈＥ）についての陽性の細胞化学的染色 は、ラット中隔細胞培養におけるコリジアセチルトランスフェラーゼ陽性ニュー ロレについての信頼できるマーカーであることが示されている（）＼−ティツカ およびヘフティ（Ｈａｒｔｉｋｋａ　ａｎｄ　Ｈｅｆｔ１）、ジャーナル・オブ ・ニコーロサイエンス（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）８　：　２９６７− ２９８５　（１９８８）　）。

ＮＧＦおよびＩＧＦ−１が培地に添加された配列は、図１１に示すごとく、培養 したラット中隔細胞におけるＣｈＡＴ活性の増加の大きさに対して有意な効果を 有する。図１１中、Ａは２ｎＭ　ＩＧＦを示し、Ｂは２５ｎＭ　ＴＧＦ−Ｉを示 し、ＣはＩＧＦ−Ｉ＋ＮＧＦを示しく共にアッセイの５日間前に添加）、および Ｄは実験の最初に添加したＩＧＦ−１＋実験の第３日に添加したＮＧＦを示し、 実験の第５日にアッセイを行った。別々に加えた場合、ＮＧＦまたはＩ　ＧＦ− Ｉは５日の古い培養中、Ｃｈ　Ａ　Ｔ活性を５０％ないし６０％増加させた。Ｎ ＧＦおよびＴＧＦ−１を全５日間−緒に存在させた場合、Ｃｈ　Ａ　Ｔ活性に対 するＮＧＦおよびＩＧＦ−１の影響は、図９．１．０、および１１に示すごとく 、付加的（１００％増加）であった。

ＩＧＦ−Ｉを実験の最初から存在させ、かつＮＧＦを第３日に添加した場合、第 ５日におけるＣｈＡＴ活性は、図１１に示すごとく、未誘導培養を３００％上回 って増加した。かくして、ＩＧＦ−１およびＮＧＦは、以前は知られていな有利 な方法で作用して、コリン作動性ニューロンの生存および神経伝達物質合成能を 促進させることが判明した。

培養したラント中隔細胞実験は前記したごとくに行った。

実施例９ 本発明者らは、図１２に示すごとく、特別の培養条件下では（１０％子ウシ血清 を含有する培地の存在下にて４Ｘ］、Ｏ’細胞／ｃｍ’）、対照の無成長因子培 養の３〜４倍、ＡＣｈＥ陽性細胞の数を増加させたことを示す。図１２中、Ａは 未誘導細胞を表し、Ｂは２ｎＭ　ＮＧＦで処理した細胞を表し、Ｃは１００ｎＭ １００ｎで処理した細胞を表し、およびＤはＮＧＦ＋ＩＧＦ−１で処理した細胞 を表す。（ＤＰＭ＝１分当たりの放射能活性崩壊）。同一条件下のＮＧＦは、Ａ ＣｈＥ陽性細胞の数に影響を与えなかった。こわらの結果は、ＩＧＦ−１はコリ ン作動性細胞の生存に大きな影響を有する（すなわち、コリン作動性生存を増加 させる）一方、ＮＧＦは存在するコリン作動性ニューロンにおいてＣｈ　Ａ　Ｔ 活性を調節する（増加させる）ことを示す。

実施例１０ カチオン化は、ポリペプチド上の酸性アミノ酸残基（すなわち、アスパラギン酸 およびグルタミン酸残基）の遊離カルボキシル基を、ポリペプチド上の正味の正 荷電を増加させるために修飾する方法である。カチオン化方法は、アルブミンお よびホースラディツシュペルオキシダーゼのごとき大分子をマウス線維芽細胞へ 取り込むことを促進させるために用いらてきた（ジエン（Ｓｈｅｎ）ら、プロン ーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ 、　Ｎａｔｌ。

＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ７５　：１８７２　１．８７６　（１９７８））　 。クマガイ（ｋｕｍａｇａｉ）らは「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ ストリー〇、　Ｂｊｏｌ、Ｃｈｅｍ、）２６２　＋１５２１４−１５２１９　（ １９８７）］　、血液脳関門を横切っての輸送を測定するモデル系であると報告 されているウシ脳からの無傷の微小血管（ｍｉｃｒｏｖｅｓｓｅｌ）を用い、単 離したウシ脳微小血管によるカチオン化アルブミンの摂取は天然アルブミンの摂 取と比べると促進されることを示した。

遊離カルボキシル基の全体的修飾については、ポリペプチド（例えば、ＮＧＦ、 ＩＧＦｉ、ＩＧＦ−４または機能的誘導体）を室温にて３０分間過剰のへキサメ チレンジアミン（ＨＭＤ）（１５，５ｇ／ｇ合計蛋白）と反応させ、続いて、室 温にて３時間、ＨＭＤを１−エチル−３１−３−ジメチル−アミノプロピルＪカ ルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）（１，、Ｏｇ／ｇ合計蛋白）と共有結合カップ リングさせる。未反応種は、セントリコン（Ｃｅｎｔｒｊｃｏｎ）−３ＭＰＳ− １分離波！ｌ（アミコン（八ｍ１ｃｏｎ）、ダンベルズ（Ｄａｎｖｅｒｓ）、マ サチューセッツ州）またはイオン交換クロマトグラフィーを用い、濾過によって 除去できる。精製したポリペプチドは等電点電気泳動を用いて分析して、カチオ ン化の量を測定することができる。

細胞表面受容体に結合するりガントであるポリペプチドに対して該全体的修飾を 用い、該修飾が生物学的活性を欠く分子を生じる場合、カチオン化プロセスは、 ポリペプチド上の受容体結合部位を保護するために、カチオン化に先立って適当 な受容体にポリペプチドを予め結合させる以外は前記したごとくに反復すること ができる。この保護手法は以下のごとくに行う二組織、例えば、注目するポリペ プチド（例えば、ＴＧＦ−■）についての受容体を含有する脳を実施例１に記載 したごとくに調製する。受容体結合を可能とするために４℃における２時間のポ リペプチドリガンドと一緒にしたインキュベーションの後、反応混合物を室温ま でもって行き、前記したごと＜ＨＭＤおよびＥＤＡＣを用いてカチオン化手法を 行う。次いで、５ｏｒｖａ１．Ｉ　ＲＣ５Ｂ遠心装置にて、５Ｓ−３４ｃｙ−タ ー中、反応混合物を４℃、１６０００ｒｐｍで３０秒間遠心する。上澄みを捨て 、べ１ノツトを、ウシ血清アルブミン（１ｍｇ／ｍ＋）を含むＰＢＳ中で３回洗 浄する。該ベレットを１００ｍＭ酢酸に再懸濁し、４℃で１０分間インキュベー トとして、カチオン化ポリペプチドをその受容体から放出させる。再度の１６０ ０Ｏｒｐｍでの遠心の後、放出されたカチオン化ポリペプチドを含有する上澄み をＮａＯＨでｐＨを中性化する。次いで、それを、等電点電気泳動、実施例１に 記載した受容体結合アッセイ、または生物学的活性についてのいずれかの適当な アッセイによって分析することができる。

実施例１１ 全体的修飾方法に対する別法は、実施例１０に記載したごとく受容体を保護し、 あるいは保護することなく、（ＩＧＦ−Ｔ、ＩＧＦ−１１、またはいずれかの機 能的誘導体のごとき）ポリペプチド上の少なくとも１つの遊離カルボキシル基に ポリリシンをカップリングさせることである。該方法に続いてジエン（Ｓｈｃｎ ）ら、１９７８、の方法を行う。例えば、ポリリシン、ＩＧＦ−ｉおよびカルボ ジイミドを、室温にて、３時間、水中または緩衝液中で１・１：１の比率で加え る。修飾された蛋白を分離し、実施例１０に記載したごとくに分析する。

実施例Ｊ２ 血液脳関門輸送を促進させるための蛋白カルボキシル基の第３の修飾方法は、ジ アゾメタンまたはＮ、Ｎ−ジメチルホルムアミドＲアセタール（ＤＭＦアセター ル）（ここに、Ｒはジメチル、ジエチル、ジブチル、ジベンジル等）とでエステ ルを形成させることである。このタイプの修飾は負に荷電したカルボン酸基がら エステルを迅速に形成させ、かくして、全体として正の電荷を増加させる。この 修飾からのさらなる利点は、これらの付加されたエステル基は、ポリペプチドの 全体としての新油性を増加させ、固有のｉｎ　ｖｉν０エステラーゼによって除 去され、完全な成長因子を生じるようである。実施例１０に記載したごとき受容 体保護を行うと共に、あるいはそれを行うことなく、この修飾方法はジアゾメタ ンまたはＤＭＦアセタールをポリペプチドと１：１の比で室温で３０分間反応さ せ、続いて実施例１０に記載したごとくに精製し、特徴付けを行うものである。

実施例１３ 実施例１０に記載した受容体保護を伴う、あるいは伴わないカチオン化の第４の 方法では、ポリリジンのカチオン化の利点を切断可能なエステルの形成と組み合 わせて、血液脳関門輸送を促進させ、ならびに輸送後に完全な成長因子を生じる 。ポリリシンは、塩化ベンジルオキシアセチルと反応させ、続いて水素化し、温 和なエステル結合を行うことによって反応性としうる（ハスナー（Ｈａｓｓｎｅ ｒ）ら、子トラへドロン・レターズ（Ｔｅｔ、Ｌｅｔ、）４６　：　４４７５− ４４７８（１９７８）；ミハラ（Ｍｉｈａｒａ）ら、インターナショナル・ジャ ーナル・オブ・ベブタイド・アンド・プロティン・リサーチ（Ｉｎｔ、　Ｊ、　 Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、）２８　：　１４１−１４５　（１ ９８６））。別法として、ポリリジンと反応できるＤＭＦアセタール誘導体は、 エステル結合を用いて、ポリリジンを遊離カルボキシル基に連結するのに用いる ことができるであろう。

実施例１４ さらなるタイプのポリペプチドの修飾はグリコジル化・例えば、グルコースおよ びシアノホウ水素化ナトリウム（ＮａＣＮＢＨｓ）を用いる還元的アミノ化によ るグルコースまたは同様の残基の導入である。蛋白のグリコジル化は、こねらの 蛋白の細胞摂取を促進することが示されており、血液脳関門輸送を改善するのに 有用でありうる（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、ファルマンユーティカル・リサーチ （Ｐｈａｒｍ、　Ｒｅｓ、）、印刷中）。実施例１０に記載した受容体保護を伴 う、あるいは伴わない、グリコジル化についての手法はンユワルツ（Ｓｃｈｗａ ｒｔｚ）ら、１９７７、の方法に基づいており、ここに、ＩＧＦ−１％　ＩＧＦ −Ｉｆ、またはいずれかの機能的誘導体のごときポリペプチドをｐＨ７の２００ ｍＭリン酸緩衝液中、３７℃で少なくとも２４時間で、１　：　３００　：１６ ００のモル比でグルコースおよびＮａＣＮＢＨ，と組み合わせる。未反応物は実 施例１０に記載したごとくに除去できるか、あるいはレクチンアフィニティーク ロマトグラフィーで除去できる。

グリコジル化アルブミンを用いる従来の研究では、修飾したアルブミンを天然ア ルブミンよりも大きな比率でラット副毫丸微小血管に取り込ませる（ウィリアム ス（Ｗｉｌｌｉａｗｓ）ら、ブロンーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ −・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　＾ｃａｄ、　Ｓｃｊ、）ＵＳ Ａ７８　：　２３９３−２３９７　（１血液脳関門輸送モデル：オーダス（＾ｕ ｄｕｓ）ら、アナルブ・オブ・ニューヨーク・アカデミ−・オブ・サイエンス（ ＾ｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、ｓｃｆ、）５０７：９　１８（１９８微小血管内皮 細胞を新鮮なウシ脳の大脳の灰色物質から単離する。脳は地方の屠殺場から得ら れ、抗生物質を含んだ水冷最小必須培地（ＭＥＭ）に入れて研究所に輸送される 。滅菌状態下、大表面積の血管および髄膜を取り出す。皮質の灰色物質を吸引に よって取り出し、次いで、１ｍｍ未満の細切れにする。細切れにした灰色物質を 、次いで、振盪する水浴中、３７℃にて、０．５％ディスベイス（ｄｉｓｐａｓ ｅ）　（ＢＭＢ、インジアナポリス、シリノイ州）と共に３時間インキュベート する。３時間の消化に続き、混合物を遠心（１０分間の１０１０００Ｘによって 濃縮し、次いで、１３％デキストランに再懸濁し、５８００ｘｇで１０分間遠心 する。上澄みの脂肪、細胞夾雑物およびミニリンを捨て、粗製微小血管ベレット を１ｍｇ／Ｉのコラゲナーゼ／ディスペイス中に再懸濁し、振盪する水浴中３７ ℃で５時間インキュベートする。５時間の消化の後、微小血管懸濁物を予め確立 した５０％パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）グラジェントに適用し、１１００Ｏｘ で１０分間遠心する。精製された内皮細胞を含有するバンド（グラジェントの頂 上から第２番目のバンド）を取り出し、培地（５０％ＭＥＭ１５０％Ｆ−１２栄 養物ミックス）で２回洗浄する。後の使用のため、細胞を２０％ＤＭＳＯおよび １０％ウシ血清を含有する培地中に凍結する（−８０℃）。

単離の後、はぼ５Ｘ１０’細胞／ｃｍ’を、培養皿上または、ラット・コラーゲ ンおよびフィブロネクチンで被覆した５−１２μｍのポアサイズのポリカーボネ ート・フィルター上で平板培養する。細胞を接種した１０〜１２日後、細胞単層 を顕微鏡によって密集性につき調べる。

これらの細胞の形態学的、組織化学的および生化学的特性の特徴付けは、こ第１ らの細胞が血液脳関門の顕著な多くの特徴を保有することを示した。これらの特 徴は、密な細胞間接合、膜孔（ｉｅｗｂｒａｎｅ　ｆｅｎｅｓｔｒａｔｊｏｎ） の欠落、低レベルのピノ±イトーンス活性、ならびにガンマグルタミルトランス ペプチダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、および■因子抗原活性の存在を包 含する。

培養した細胞は、ボラライズド（ｐｏｌａｒｉｚｅｄ）結合または輸送用のモデ ルが必要とさ第１る広範囲の実験で使用できる。細胞をマルチ−ウェルプレート 中で培養することによって、大小両分子の受容体および非受容体結合を行うこと ができる。

経内皮細胞フラックス測定を行うため、ポーラスなポリカーボネート膜フィルタ ー上で細胞を増殖させる（ヌクレオボア（Ｎｕｃｌｅｏｐｏｒｅ）、プレザント ン（ｔ’１ｅａｓａｎｔｏｎ）、カリフォルニア州））。大きなポアサイズのフ ィルター（５〜１２１１ｍ）を用いてフィルターが分子フラツクスに対して律速 となる可能性を回避する。これらの大きなボアのフィルターの使用はフィルター 下での細胞増殖を許容せず、細胞単層を目で観察できるようにする。

細胞が密集に到達すれば、サイド・パイ・サイド（ｓｉｄｅ−ｂｙ−ｓｉｄｅ） 拡散細胞装置（クラウン・グラス（Ｃｒｖｏｎ　Ｇｌａｓｓ）、シマービル（Ｓ ｏｍｍｅｒｖｉｌｌｅ）、ニューシャーシー州）に入れる。フラックスの測定に ついては、拡散細胞のドナーチャンバーにテスト物質をパルス付与し、次いで、 該パルスに続き種々の時点でパルス例与し、一部を分析用容器チャンバーから取 り出す。放射能活性または蛍光標識物質は分子フラックスの信頼性ある定量を可 能とする。スクロースまたはインスリンのごとき輸送できないテスト物質の添加 によって、単層を一体として、同時に測定し、統計的有意性を確実とするために 、少なくとも４回の繰り返しにて測定する。

実施例１６ ＩＧＦ類のカルボキシ末端線状ペプチド誘導体が、皮質神経細胞の生存を促進し うるかどうかを調べるために、ラット・胚皮質解離培養物を調製し、ペプチドの 存在下また（謔不存在下でインキュベーションした後存在する生存細胞総数を調 べた。皮質をＥ１８ラット・胚から切除し、酵素消化または機械的解離により解 離させ、１００μＭのペプチド存在下または不存在下において成分の分かってい る無インスリン／血清培地（ボッテンシュタイン（Ｂｏｔｔｅｎｓｔｅｉｎ）お よびサトー・（Ｓａｔｏ）　、　ＰＮＡＳ、第７６巻、５１．４〜５１．７頁（ １９７９年））に６．２５Ｘ１０４細胞／ｃｍ２の密度で機種した。４日後に残 存する細胞総数を、６μＭの生体染色用のカルセイ：／−ＡＭ　（ｅａｌｃｅｉ ｎ−＾ＩＮ）とともに培養することにより調べた。

この化合物はすべての細胞に取り込まれるが、生細胞のみによって蛍光物質に変 換される。得られた相対蛍光値が生細胞総数を反映する。細胞数と相対蛍光値の 関係は直線的であり（図１３）、本分析は細胞数の相対的相違を調べるのに有用 であることを示す。分析すべきカルボキシ末端線状ペプチド誘導体を、ＩＧＦ− ■のアミノ酸領域５５〜７０およびＴＧＦ−ＩＩＩの相当部位（配列番号：４） ならびに１．ＧＦ−ｉＩの相当部位（アミノ酸５４〜６７（配列番号：３））か ら誘導した。ペプチドＩＧＦ−ＩＮ（５４〜６７）（配列番号：３）、ＴＧＦ− ＩＩ（５８〜６７）（配列番号、２）（実施例１９）、ＴＧＦ−１（５５〜７０ ）（配列番号：４）（実施例２１）、ＩＧＦ−ＩＴ　（５４〜６７；ｎ　Ｙ）（ 配列番号・４５）（実施例２４）　、Ｉ　ＧＦ−ＩＩ　（５８〜６７：。−Ｙ） （配列番号：４６）（実施例２３）、アミノ酸配列ＥＰＹＣＡＰＰＡＫＳＥ　（ 配列番号：５）（実施例２２）およびアミノ酸配列ＴＹＣＡＰＡＫＳＥ　（配列 番号：１、実施例２０）は、ペプチド無添加でインキュベージ５ンした対照培養 物と比較すると、Ｅ１８皮買神経細胞解離調製物中の生存細胞総数を増加させた ことが分かった（図１４）。

同じ方法を異なる一連のペプチドについて繰り返した場合、ペプチドＥＡＬＬＥ ＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ　（配列番号：　３６）　、ＡＬＬＥＫＹＣＡＫＰＡＫＳ Ｅ（配列番号　３７）、ＩＧＦ−ＩＩ　（６８〜６５）（配列番号：５１）、Ｉ ＧＦ−ＩＩ（５６〜６３）（配列番号＋５２）、ＩＧＦ−ＩＩ（６０〜６７）（ 配列番号：５３）　、ＴＤＹＣＡＰＡＫＳＥ（配列番号＋　５０）　、ＹＣＡＰ Ａ、ＫＳＥ（配列番号＝５４）　、ＹＣＡＰＡ　（配列番号　５５）　、ＴＹＣ ＡＰＡ　（配列番号：５６）、ＣＡＰＡＫ、ＳＥ　（ｌＥ配列番号　２４）　、 ヨウ素化ＴＹＣＡＰＡＫＳＥ　（配列番号・２５）およびＡＰＳＴＣＥＹＫＡ　 （配列番号：３８）（表３および４参照）も、ペプチド無添加でインキュベーシ ョンした対照培養物と比較すると、Ｅ１８表皮神経細胞解離調製物中の生存細胞 総数を増加させたことが分かった（図１４８）。

真皮細胞生存活性を示す全てのペプチド（図１４または１４ａ参照）はまた、以 下に説明するように、神経突起の成長を示した（実施例１８）。

これらの知見は、ＩＧＦ類内の新規領域を定義し、生物学的機能を有する新規配 列を特異的に同定するという理由で重要である。実施例２２および２３のペプチ ドは、ＩＧＦ−、ＩＩのアミノ酸５４〜６７または５８〜６７の５９番目の位置 にチロノンのＤ異性体（ｐ−Ｙ）を含む修飾ペプチドである。これらの修飾を行 って、ＩＧＦ−１１（５４〜６７）および（５８〜６７）のアミノ末端がら６０ 番目の位置にかけての酵素分解によるペプチド結合の切断を防止した。無変性分 子ザイズ排除りロマトグラフィー法を用いて、細胞とともにインキュベーション する前後に、ペプチドＩＧＦ−ＩＩ（５４〜６７）およびＩ　ＧＦ−ＩＩ　（５ ８〜６７）の完全性を調べた。図１５は、細胞とともにインキュベーションした 場合、。−Ｙ修飾ペプチド結合Ｆ−４Ｉ（５４〜６７）（配列番号、４５）が分 解に対して安定化されることを示す。

割１ｕユ カルボキノ末端ペプチドの潜在能力を調べるために、ペプチドが細胞生存を促進 する能力を調べた。基本的な対照培養物と比較して、皮質神経細胞培養物中の生 存細胞総数を調べた。図１６は、ペプチドＴＹＣＡＰＡＫＳＥ　（配列番号　１ ）に関する濃度一応答関係を示し、このペプチドは、投与量依存的に皮質神経細 胞の生存を促進することを示す。試験したすべてのペプチドは、蛍光生存試験に おいて、マイクロモラーの濃度範囲において有効である。

実施例１８ ＩＧＦ類のカルボキン末端線状ペプチドが、皮質神経突起再生を促進しつるかど うかを調べるために、Ｅ１８ラット・皮質解離調製物を、１００μＭのペプチド （ＴＧＦ−ＩＩ（５４〜６７）（配列番号：３）　、ＩＧＦｉ　（５５〜７０） （配列番号＝４）、ペプチドＴＹＣＡＰＡＫＳＥ　（配列番号：１）、ペプチド ＥＰＹＣＡＰＰＡＫＳＥ　（、配列番号：５）、ＩＧＦ−１１（５４〜６７：。

−Ｙ）（配列番号：４５）およびＩＣＦ−１１（５８〜６７）（配列番号＝２） ）の存在または不存在下におい又、成分の分かっている無インスン／血清培地で 培養した。ペプチドに接触させてから９６時間後、培養物を観察し、顕微鏡写真 を取った。図１７に示したように、ペプチド処理培養物は、無処理の基本的対照 培養物よりも、神経突起の成長を伴う多くの細胞が見られた。同様な神経突起再 生応答が、この実施例のすべてのペプチドについて観察された。これらの結果は 、ＩＧＦ類のカルボキシ末端線状ペプチド誘導体および新規アミノ酸配列が、生 存促進効果のみならず、皮質ニコーロンに対する軸索再生効果をも有することを 示す。

実施例１９ 化合物ＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ　（ＩＧＦ−ＩＩ　（５８〜６７））（配列番号・ ２）を、ミリゲン・パイオサーヂ（ｌｌｉｌｌｊｇｅｎ　ＢｉｏＳｅａｒｃｈ） 社製９６００型ペプチド合成装置を用いた固相ペプチド合成法により調製した。

その一般的方法は、ハドソン（１’１ｕｄｓｏｎ）　（ハドソン、ジャーナル・ オブ・ケミストリー（Ｊ、Ｃｈｅｌｌ、　）　、第５３巻、６１７〜６２４頁（ １９８８年）に記載されている。

１グラムのＦｍｏｃ−Ｇｌｕ　（ｔ−ブチル）−ｐ−アルコキシベンジルアルコ ール樹脂（ミリケン／バイオサーチ社製）を反応容器に入れ、ついで、１１のジ メチルホルムアミド（ＤＭＦ）／ジクロロメタン（ＤＣＭ）中で、ベンゾトリア ゾール−１−イルオキシトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロ ホスフェート（ＢＯＰ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ） をカップリング試薬として用いて、 １）Ｆｍｏｃ−Ｌ−セリン−１−ブチルエーテル２）と−１−ブチルオキシカル ボニル−Ｆｍｏｃ−Ｌ−リジン３）Ｆｍｏｃ−アラニン ４）Ｆｍｏｃ−プロリン ５）Ｆｍｏｃ−スレオニン−１−ブチルエーテル５）Ｆｍｏｃ−アラニン ７）Ｓ−トリフェニルメチル−Ｆｍｏｃ−システィン８）Ｆｍｏｃ−チロノン− １−ブチルエーテル９）Ｆｍｏｃ−ステオニシーｔ−ブチルエーテルの１．５ｍ Ｍ溶液と反応させた。個々のカップリングの後、樹脂をＤＭＦ、ついでＤＭＦ／ ＤＣＭにて連続的に洗浄した。ＤＭＦおよびトルエンの１：１溶液（７０％）中 のピペリジン（３０％）溶液を用いてＦｍｏｃ−基を除去し、樹脂゛　をＤＭＦ ／ＤＣＭで繰り返し洗浄した。最終的に、１０ｍＬの脱ブロッキング混合液（９ ０％トリフルオロ酢酸、５％チオアニソール、３％エタンジチオールおよび２％ アニソール含有）で処理することにより、１．４１　ｇの樹脂から粗ペプチドを 除去した。得られた溶液を１０倍容のエーテル中に注ぎ、沈澱した固体を濾別し 、エーテルで洗浄した。

得られた粗ペプチドは０．３５０　ｇであった。その１００ｍｇを、２−メルカ プトエタノール（２０μｌ）を含有する０、５ｍＬのメタノール溶解して二量体 化を抑制した。該溶液を１５部に分けて、ヒユーレット・パラカード（Ｈｅｖｌ ｅｔｔＰａｃｋａｒｄ）社製１０５０型ＨＰＬＣシステムに装備したウォーター ズ（Ｗａｔｅｒｙ）社製Ｃ８ボンダバック（Ｂｏｎｄａｐａｋ）　ｖＲ製用カラ ム（２５Ｘ１．００ｍｍ）に注入した。

溶媒グラジェントは、０１％トリフルオロ酢酸含有水中アセトニトリル５％から ６０％（４０分）とし、流速は毎分９．０ｍｌとした。溶出した溶媒を、２］５ ｎｍにおける紫外線検出機によりモニターした。

９回の同じ注入を行い、１０分で溶出するピークを集めた。合一した溶出物を同 体積の水で希釈し、凍結乾燥して２５ｍｇの精製ＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ　（配列 番号・２）を得た。

該ペプチドの同一性を、高速原子衝撃質量スペクトル分析（ＦＡＢ−ＭＳ）によ り確認した。

Ｍ十Ｈ（計算値）　１０７０．３２ Ｍ＋Ｈ（実測値）　１０７０．００ アミノ酸分析。

計算値　実測値 グルタミン酸　１．０　１．１０ セリン　１．、ＯＯ，９２ スレオニン　２．０　２．０４ アラニン　２．０　１．９４ プロリン　１．０　０．８５ チロシン　１．０　０．８７ ンステイン　１０　（検出せず） ペプチド含量は８４．５％と算出。

実施例２０ 先の実施例と同様の方法により、ペプチドＩＧＦ−１１（５８〜６７　デススレ オニン６２）ＴＹＣＡＰＡＫＳＥ　（配列番号：１）を、０　、５　ｇ　（７） 樹１１ｍ（実施例１に用いたのと同じ）およびアミノ酸誘導体路１ミリモルから 調製した。得られた１２５ｍｇの粗ペプチドのうち９５ｍｇを、メルカプトエタ ノール（４０μｍ）を含有する０、６ｍＬの水に溶解した。同じＨＰＬＣシステ ムに装備したビダック（Ｖｙｄａｃ）社製０１８半調製用カラムを用い、溶媒グ ラジェントは、５％がら６０％アセトニトリル（４０分）、流速は毎分３．５ｍ Ｌとした。１０回の同じ注入を行い、９５分て溶出するピークを集め、凍結乾燥 して２４．５ｍｇのペプチドＴＹＣＡＰＡＫＳＥ　（配列番号・１）を得た。

生成物の同一性を高速原子衝撃質量スペクトル分析（ＦＡＢ−ＭＳ）により確認 した。

Ｍ＋Ｈ（を算値）　９６９．１９ Ｍ＋Ｈ（実測値）　９６９．００ アミノ酸分析： 計算値　実測値 グルタミン酸　１．０　１．０７ セリン　１．０　１．．０］ スｌノオニン　１．０　］、、０７ アラニン　２．０　２．２１ プロリン　１．．０　１．０８ チロシン　］、、０　］、、、００ ｒノジン　１．０　０８２ ンステイン　］、、０　（検出せず） ペプチド６量は８２．０％、と算出。

実施例２１ ベブ−ｆＦＲＲＩ、ＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡ　（ＩＧＦ−１（５５〜７０） （配列番号・４））を、０．５ｍｇのＦｍｏｃ−Ａ　ｌ　ａ−ｐ−フルコキ／ベ シ’；ル樹脂（ミリダン２／パイオサー千社製）およびアミノ酸誘導体路１ミリ モルがら、実施例１９記載の方法により調製した。得られｊこ２１０ｍｇの粗ペ プチドのうぢ１００ｍｇを、アセトニトリル１５％から２５％（３１）の溶媒グ ラジェントを用いた精製に用いｔこ。条件およびＨＰＬＬＣシステムは実施例２ と同じである。

１４５分で溶出するピークを集めて２１ｍｇのペプチドＲＲＬＥＭＹＣＡＰＬＫ ＰＡＫＳＡ　（配列番号：４）を得た。

生成物の同一性を高速原子衝撃質量スペクトル分析（ＦＡＢ−ＭＳ）により確認 した。

Ｍ＋Ｈ（計算値）　１８３４．４７ Ｍ＋Ｈ（実測値）　１８３４．００ アミノ酸分析・ 計ＩＩＬ値　実沖ｊ値 グルタミン酸　１．０　１．１３ セリン　１．０　０．８９ アルギニン　２．０２゜２７ アラニン　３．０　２．８８ プロリン　２．０　１．７５ チロシン　１．．０　０．９０ メチオニン　１．０　０．８３ ０イシン　２，０２．０３ 、／スティン　１０　（検出せず） ペプチド含量は７１．４％と算出。

実施例２２ 実施例】９と同様の方法により、ペプチドＥＰＹＣＡＰＰＡＫＳＥ　（ＩＧＦ− ＩＩ（５８および６２番目にＰｒｏを有する５７〜６７））（配列番号：５）を 、１．０ｇの同じ樹脂およびアミノ酸誘導体各１ミリモルから調製した。得られ た１　１０ｍｇの粗ペプチドのうち８０ｍｇを、アセトニトリル１０％から３０ ％（４０分）の溶媒グラジェントでの精製に用いた。条件およびＨＰＬＣシステ ムは実施例１と同じである。１０．７分で溶出するピークを集めて８．３ｍｇの ペプチドＥＰＹＣＡＰＰＡＫＳＥ　（配列番号：５）を得た。

生成物の同一性を高速原子衝撃買置スペクトル分析（ＦＡＢ−ＭＳ）により確認 した。

Ｍ＋Ｈ（計算値）　１１９１．３３ Ｍ＋Ｈ（実測値＞　１１９２．００ アミノ酸分析： 計算値　実測値 グルタミン酸　２．０　２．１４ セリン　１．０　０．７８ アラニン　２．０　２．１３ プロリン　３．０　３．０１ チロシン　１．０　０．９７ リジン　１．０１．０９ システィン　１．０（検出せず） ペプチド含量は７３．３％と算出。

実施例２３ ペプチドＴ、、ＹＣＡＴＰＡＫＳＥ　（ＩＧＦ−ＩＩ（５９番目にＤ−Ｔｙｒを 有する５８〜６７）（配列番号＝４６）を、１．０ｇの同じ樹脂から実施例１９ 記載の方法により調製した。粗ペプチド（６０ｍｇ）を、アセトニトリル５％か ら３０％（４０分）の溶媒グラジェントで精製した（条件は実施例２と同じ）。

１７．３分で溶出するピークを集めて６．５ｍｇのペプチドＴｅＹＣＡＴＰＡＫ ＳＥ　（配列番号・４６）を得た。

生成物の同一性を高速原子衝撃質量スペクトル分析（ＦＡＢ−ＭＳ）により確認 した。

Ｍ＋Ｈ（計算値）　１０７０．３２ Ｍ＋Ｈ（実測値＞　１０７１．００ アミノ酸分析： 計算値　実測値 グルタミン酸　１．０　１．００ セリン　１．０　０．９７ スレオニン　２．０　２．０２ アラニン　２．０２．２０ プロリン　１．０　１．０４ チロシン　１．０　０．９７ システイン　１０　（検出せず） ペプチド含量は８８．０％と算出。

実施例２４ ペプチドＡＬＬＥＴｔ、ＹＣＡＴＰＡＫＳＥ　（ＩＧＦ−ＩＩ　（５９番目にｏ −Ｔｙｒを有する５４〜６７）（配列番号：４５））を、実施例２３の合成に用 いた樹脂０４３ｇから調製した。粗ペプチド（１００ｍｇ）を、実施例２３と同 じＨＰＬＣシステムで、アセトニトリル１５％から２５％の溶媒グラジェントで 精製した。１３５分で溶出するピークを集めて１８．９ｍｇのペプチドＡＬＬＥ ＴＤＹＣＡＴＰＡＫＳＥ　（配列番号：４５）を得た。

生成物の同一性を高速原子衝撃質量スペクトル分析（ＦＡＢ−ＭＳ）により確認 した。

Ｍ＋Ｈ（計算値）　１４９７．０ Ｍ＋Ｈ（実測値）　１，４６９．５ アミノ酸分析・ 計算値　実測値 グルタミン酸　２．０　２．０８ セリン　１．０　０．９４ スレオニン　２．０　２．１３ アラニン　３．０　３．１２ プロリン　１，０　０゜９５ チロシン　１．０　０．９７ ０イシン　２．０　２．０８ リジン　１．００．９２ システィン　１．０（検出せず） ペプチド含量は９３．０％と算出。

実施例２５ 実施例２０と同様の方法により、ペプチド・デスＴｈｒ６２−Ｄ−Ｔｙｒ５９Ｉ ＣＦ−ＩＩ　（５８〜６７）Ｔ、−ＹＣＡＰＡＫ、ＳＥを、Ｆｍｏｃ−チロシン −ｔ−ブチルエーテルの代わりにＦｍｏｃ−Ｄ−チロシン−１−ブチルエーテル を用いる以外は、実施例１で用いたのと同じ樹脂０５ｇおよびアミノ酸誘導体各 １ミリモルから合成することができる。得られた粗ペプチドを、ＨＰ　Ｌ　Ｃに より精製し、Ｔ、−ＹＣＡＰＡＫＳＥ　（配列番号＝５０）と確認することがで きる。

第１部： ＣＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号：６）の合成化合物ＣＡＬＬＥＴ ＹＣＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号：６）を、ミリゲン・バイオサーチ（Ｍｉｌｌ ｉｇｅｎ　ＢｉｏＳｅａｒｃｈ）社製９６００型ペプチド合成装置を用いた固相 ペプチド合成法により調製した。

０、５　ｇ　（０，４６ｍＭ／　ｇ）のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ　（Ｓ−トリフェニル メチル）−ｐ−アルコキシベンジルアルコール樹脂（アドバンスト・ケムテック （ＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈ）社製）を反応容器に入れ、ついで、ＤＭ Ｆ／ＤＣＭ　（１：　１）中で、ＢＯＰおよびＨＯＢＴをカップリング試薬とし て用いて（実施例１９参照）、１）Ｆｍｏｃ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエ ステル２）Ｆｍｏｃ−セリン−ｔ−ブチルエーテル３）ε−ｔ−プチルオギシ力 ルボニルーＦｍｏｃ−リジン４）Ｆｍｏｃ−アラニン ５）Ｆｍｏｃ−プロリン ６）Ｆｍｏｃ−スレオニン−ｔ−ブチルエーテル７）Ｆｍｏｃ−アラニン ８）Ｓ−アセトアミドメチル−Ｆｍｏｃ−シスチン９）Ｆｍｏｃ−チロシン−１ −ブチルエーテルＩＱ）Ｆｍｏｃ−スレオニン−ｔ−ブチルエーテル１１）Ｆｍ ｏｃ−グルタミン酸−γ−ｔ−ブチルエステル１２）Ｆｍｏｃ−ロイシン １３）Ｆｍｏｃ−ロイシン １４）Ｆｍｏｃ−アラニン １５）Ｓ−トリフ護ニルメチルーＦｍｏｃ−システィンの１．０ｍＭ溶液と反応 させた。最終的に、粗ペプチドＣＡＬＬＥＴＹＣ（Ａｃｍ）ＡＴＰＡＫＳＥＣ（ 配列番号＝６）を、１０ｍＬの脱ブロッキング混合液（９０％トリフルオロ酢酸 、５％チオアニソール、３％エタンジチオールおよび２％アニソール含有）で処 理することにより樹脂から除去した。４．５時間撹拌後、該混合物を濾過し、ア ルゴンを用いて濾液を乾燥させ、無水エーテルを用いて沈澱させた。得られた粗 ペプチドは０．３４ｇであった。

第２部； ＣＡＬＬＥＴＹＣ（Ａｃｍ）ＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号：６）の環化該粗ペプ チド（０，３ｇ）を水（１０００ｍＬ）に溶解し、水中５０％水酸化アンモニウ ムにてｐＨを８．４に調整する。うす黄色が消えなくなるまでフェリンアン化カ リウムの希薄溶液（０，０ＩＮ）を滴下する。２時間撹拌した後、氷酢酸にてｐ Ｈを４．６に調整することにより反応を停止する。過剰のフェロおよびフェリン アンイオンを、アニオン交換カラムを通すことにより除去する。鎖中のＣｙｓか らアセトアミドメチル（Ａｃｍ）保護基を除去するために、水／酢酸（１，：１ ）中の０．２Ｍ酢酸水銀（ＩＩ）溶液（４ｍＬ）を添加し、該反応物を１時間撹 拌する。得られた混合物を脱塩し、上記のごと＜ＨＰＬＣにより精製する。

実施例２５−Ｂ 環状ＴＹＣＡＰＡＫＳＥ　（配列番号、１）の合成環状ＴＹＣＡＰＡＫＳＥ　（ 配列番号：１）を、ミリテン・バイオサーチｆｆｉｌｌｉｇｅｎ　ＢｉｏＳｅａ ｒｃｈ）社製９６００型ペプチド合成装置を用いた固相ペプチド合成法により調 製した。

０．７９ｇ　（０，９７ｍＭ／ｇ）のｐ−アルコキシベンノルアルコール樹脂（ バケム・バイオサイエンス（Ｂａｃｈｅｍ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）社製）を反 応容器に入れ、ついで、ＤＭＦ／ＤＣＭ　（１，＋　１．）中で、［２−（ＩＨ −ベンゾトリアゾール−１−イル）　−１，、１，３，３−テトラメチルウロニ ウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）およびＨＯＢＴをカップリング試薬と して用いて、１）Ｆｍｏｃ−グルタミン酸−γ−ベンジルエステル２）Ｆｍｏｃ −セリン−０−ベンジルエーテル３）ε−ペンジルオキシカルポニルーＦｍｏｃ −リジン４）Ｆｍｏｃ−アラニン ５）Ｆｍｏｃ−プロリン ６）Ｆｍｏｃ−アラニン ７）Ｓ−アセトアミドメチル−Ｆｍｏｃ−システィン８）Ｆｍｏｃ−チロシン− 〇−ベンジルエーテル９）Ｆｍｏｃ−スレオニン−〇−ベンジルエーテルの３． ０ｍＭ溶液と反応させた。実施例１９記載のごとく、各カップリング段階を行っ た。粗ペプチド（０，８４ｇ）を、脱ブロッキング混合物（ＴＦＡ１５ｍＬ、Ｄ ＣＭＩＯｍＬおよび水０．５ｍＬを含有）で処理することにより１．８２ｇの樹 脂から除去した。

ペプチドを３０ｍＬのＤＭＦに溶解し、Ｎ−メチルモルホリン２ｍＬおよびンフ ェニルホスホラジン２．５ｍＬを含有する１０１００ＯのＤＭＦ溶液に、１時間 にわたり添加した。−晩撹拌した後溶媒を減圧除去し、粗生成物を酢酸エチル（ ２００ｍＬ）に溶解し、該溶液を２％クエン酸、水、そして３％重炭酸ナトリウ ムで洗浄した。溶媒を減圧除去した後得られたペプチドを、酢酸エチルを溶媒と して用い、活性炭上１０％Ｐｄを用いて１時間水素化した。酢酸水１　（ＩＩ） を用いてペプチドからＡｃｍ基を除去し、上記のごと＜ＨＰＬＣを用いて精製し た。

表１に示したように、ヒト・ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−１１およびＩＧＦ−ＩＩＩを 、市販品から得た。

ＩＧＦ−Ｔ、ＩＧＦ−ＩＩおよびＩＧＦ−ＩＩＩの活性を、１４．５日間培養し たラット・胚を髄神経の解離培養物において測定した。胚からを髄を除去し、ダ ルベツコ（Ｄｕｌ、ｂｅｃｃｏ）のリン酸緩衝化セイライン（ＤＰＢＳ）中の０ ．０５％トリプシン中で解離させた。解離した細胞を、９６ウエルマイクロタイ タープレート中のポリ−１−オルニチン基質上に、０．０５％ウシ・血清アルブ ミン含有無血清無インスリンＮ２培地（上記ボッテンシュタインおよびサトー（ １９７９年））２００μｍ中２Ｘ１０’細胞／ウエルとなるよう撒いた。ｃｏｔ ｓ％、空気９５％の湿潤雰囲気下、３７℃で４８時間インキユベーンヨアンた後 、フオンナム（Ｆｏｎｒ＋ｕ■）（フォンナム、ジャーナル・オブ・ニューロケ ミストリー（Ｊ、　Ｎｅｕｒｏｃｈｅ■、）、第２４巻１４０５〜４０９頁（１ ９７５年））記載の方法の変法（マクマナンマン（Ｍｃｉｌａｎａｎｍａｎ）ら 、ディベロップメンタル・バイオロジー（Ｄｅｖ、　Ｂｆｏｌ、　）　、第２５ 巻、３１１〜３２０頁（１９８８年））により、培養物のコリンアセチルトラン スフェラーゼ活性を測定した。

この分析において、ＩＧＦ−１，ＩＧＦ−ＴＩおよびＩＧＦ−ＩＩＩはすべて、 実際的かつ投与量依存的なコリナセチルトランスフエラーゼ活性の上昇が見られ た（図１８）。ＩＧＦ結合蛋白濃度が低いと期待できるこれらの無血清条件下で は、ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−ＩＩＩは、同様の有効性プロフィールを示したが 、ＩＧＦ−ＩＩは、僅かに劣っていた（図１８）。ＩＧＦ−１，ＩＩは、ＩＧＦ −１に見られる３つのＮ−末端アミノ酸（グリノン、プロリンおよびグルタミン 酸）が存在しないため、血清中に見られるＩＧＦ結合蛋白に実際上結合しないの で、血清含有培地においてＩＧＦ−１と比べてより強力なＣｈＡＴ上昇能を示す （図１９）。

さらに、これらの結果は、ＩＧＦ−１，ＩＩおよびＩＩＩが、を髄の生存および ／または神経伝達物質合成能を劇的に増強させるという証拠を提供する。

実施例２７ ＩＣＦ−１およびＩＧＦ−ＩＩのニューロン生存促進活性を、ラット・胎児皮質 神経細胞培養物物を用いて測定した。大脳皮質を１８日目の胚のラット・胎児か ら除去した。皮質を細断し、中性プロテアーゼ（デイスバーゼ（Ｄｉｓｐａｓｅ ）、コラボレイティブ・リサーチ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒ ｃｈ）社製）で処理して解離細胞調製物を得た。細胞を低密度（５Ｘ１０３細胞 ／ウエル）で、ポリーＬ−オルニチンおよびラミニン被覆した１／２エリア９６ ウエルのプレートに、０，０５％ＢＳＡおよび１０　ｔｔ　Ｍロインン含有無血 清無インスリンＮ２培地５０μｌに入れてブレーティングする。ＩＧＦ−１また はＴＧＦ−ＩＩを、機種の時から存在させた。対象の培養物には成長因子を添加 しなかった。培養物を、ｃｏｔｓ％、空気９５％の雰囲気下、３７℃で２４時間 インキュベーションした。２４時間後、［３Ｈ］ロイシンを、さらに改変Ｎ２培 地５０μｍに入れて添加して、最終濃度１２．５μＣｉ／ｍｌとした。［３Ｈ］ ロイシン添加２４時間後、培養物を取り、１０％トリフルオロ酢酸にて濾紙上で 蛋白を沈澱させ、濾紙を乾燥し、液体シンチレーションカウンターで計測した。

取り込まれた［３Ｈ］ロイシンのカウント数が、同一培養物中の細胞について顕 微鏡計数により測定した生存細胞数と直接的相関関係があったという理由で、細 胞中への［３Ｈ］ロイシンの取り込みは、細胞生存を正確に反映していた。

ＩＧＦ−１およびＴＧＦ−ＩＩは両方とも皮質ニューロン生存を促進し、ＩＧＦ −■が僅かに強力であった（図２０）。

実施例２８ を髄のみならず神経系の他の領域において、ニューロンは、発育中に過剰生産さ れ、分娩の前に自然に起こる細胞死の段階を経てＥＩＯにおいて完結する（オッ ヘンハイム、アール・ダブリユウ（Ｏｐｐｅｎｈｅｔｍ、　Ｒ，？、　）　（１ ９９１年）、アニコ・レビュ・ニューロサイ（＾ｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｎｅｕｒ ｏｓｃｊ、　）　、第１４巻、４５３〜５０１頁に論評）。この期間中、約５０ ％の運動ニューロンが再生せずに死ぬ。この期間中に外部から適用されたある種 の向神経性薬剤は、この形態のニューロン化を防止または遅延させる（例えば、 部分精製された筋肉抽出物および毛様体向神経性因子は、ニワトリ・胚における 運動ニューロン化を減少させた（マクマナマン（ｌＩｃＭａｎａｍａｎ）ら、（ １９９０年）、ニューロン（Ｎｅｕｒｏｎ）　、第４巻、８９１〜８９８頁、オ ッペンハイム（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ）ら、（１９９１年）、サイｘ　ンス（Ｓｃ ｉｅｎｃｅ）。

第２５１巻、１６１．６〜１６１７頁参照）。

ＩＧＦ−１のみならず数種の変種（（デス１〜３１　１０Ｆ−１，ＩＧＦ−１１ およびＲ，”ＴＧＦ−１，Ｎ−末端に１３個のアミノ酸の伸長ペプチドを付加す ることならびに天然のＩＧＦ−１配列の３番目の位置のＧｌｕをＡｒｇに置換す ることにより分子工学的に作られたＩＧＦ−１アナログ）も、このモデルにおけ る発違約に調節された運動ニューロン化を部分的に防止した。ＩＧＦ類を、胚日 数Ｅ６からＥ９までの間、卵の殻にあけた小さな窓を通して漿尿膜から毎日投与 した。

対照の胚は、等体積の担体（リン酸緩衝化セイライン）のみを与えた。ＥＩＯに おいて胚を除去し、と殺し、を髄を細分する。運動ニューロン（銀染色細断片に おいて形態学的に同定）を、処理胚および対照胚双方から得られた一連の細断片 において計数する。図２１に示すデータは、ＩＧＦ類の適用が、運動ニューロン の生存率を、無処理の対照よりも１７％から２５％増加させたことを示す。用い たＩＧＦの相違により得られた効果の相違は、統計学的に有意ではなかった（ス チューデントのｔ試験でＰ＜０．０５）。

他の具体例は以下の請求の範囲に包含される。

配列表 （１）一般的情報： （ｉ）出願人：セフ７０ン、インク（Ｃｅｐｈａｌｏｎ、　Ｉｎｃ、　）（ｊ　 Ｄ発明の名称：インスリン様成長因子およびアナログの適用による疾患の治療 （ｉ　＋　ｉ）配列の数：５６ （ｉｖ）連絡先； （Ａ）宛名：フィッシュ・アンド・リチャードソン（Ｆｉｓｈ　＆　Ｒｉｃｈａ ｒｄｓｏｎ）（Ｂ）通り名・２２５　フランクリン・ストリート（Ｆｒａｎｋｌ ｉｎ　５ｔｒｅｅｔ）（Ｃ）都市名：ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）（Ｄ）州名、マ サチューセッツ（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）（Ｅ）国名：アメリカ合衆国 （Ｆ）郵便番号＋０２１１０−２８０４（Ｖ）コンピューター・リーダプル・フ オーム：（Ａ）媒体形態：３．５インチディスケット、１．４４Ｍｂ（Ｂ）　コ ンピューター＋ＩＢＭ　ＰＳ／２　モデル５ｏｚまたは５５ｓＸ（Ｃ）オペレー ティングシステム：ＭＳ−ＤＯ３（バージョン５．０）（Ｄ）ソフトウェア　ヮ ードパーフェクト（ｆｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔ）　（バージョン５．１）（ｖｉ） 現在の出願データ； （Ａ）出願番号： （Ｂ）出願日： （Ｃ）分類： （ｖｔｉ）優先権データ： （Ａ）出願番号＋０７／３６１．５９５（Ｂ）出願日：１９８９年６月６日 （Ａ）出願番号：０７１５３４．１３９（Ｂ）出願日：１９９０年６月５日 （Ａ）出願番号：０７／８６９．９１３（Ｂ）１９９２年４月１５日 （Ａ）出願番号０７／９５８，９０３ （Ｂ）出願日：１９９２年１０月７日 （ｖ　ｉ　ｒ　ｉ）代理人等の情報： （Ａ）氏名、クラーク、ポール・ティー　（Ｃ１ａｒｋ、　Ｐａｕｌ　Ｔ、　） （Ｂ）登録番号：３ｏ、１６２ （Ｃ）代理人等における処理番号：　０２６５５／’００３ＷＯ４（ｉｘ）テレ コミュニケーションの情報：（Ａ）電話番号＋　（６１７）５４２−５０７０（ Ｂ）ファックス番号コ　（６１７）５４２−８９０６（Ｃ）テレックス・２００ １５４ （２）配列番号　１に関する情報： （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ　９ （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｃ）鎮の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載　配列番号：１： （２）配列番号　２に関する情報 （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１０ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （ｘ　ｉ）配列の記載：配列番号；２：Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈ ｒ　Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ”　５　１０ （２）配列番号：３に関する情報： （Ｄ配列の特徴； （Ａ）配列の長さ：１４ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ＞鎖の数・Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載：配列番号、３： Ａｌａ　Ｌａｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　 Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ１５１゜ （２）配列番号　４に関する情報： （Ｄ配列の特徴： （Ａ）配列の長さ、１６ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー・Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載、配列番号・４： Ｓｅｒ　Ａｌａ （２）配列番号・５に関する情報・ （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ、１１ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （ｘｌ）配列の記載：配列番号：５二 （２）配列番号　６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・１６ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー・Ｎ／Ａ （ｘＤ配列の記載：配列番号・６： （２）配列番号　７に関する情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ・１２ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）　！１１の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロンー：　Ｎ／Ａ （Ｘｌ）配列の記載　配列番号　７ （２）配列番号　８に関する情報・ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１３ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝８・ （２）配列番号、９に関する情報＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１１ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・Ｎ／Ａ （ｐ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載：配列番号、９： （２）配列番号、１０に関する情報： （ｉ）配列の特徴・ （八）配列の長さ・１１ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載：配列番号・１０：（２）配列番号、１１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ、１５ （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （Ｘｌ）配列の記載、配列番号、１１：（２）配列番号・１２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・１８ （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・Ｎ／Ａ （Ｄ）＋−ボロンー：　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載・配列番号・１２゜（２）配列番号　１３に関する情報 （］）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ　１４ （Ｂ）配列の型−アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・Ｎ／Ａ・ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （Ｘｌ）配列の記載　配列番号　１３ （２）配列番号　１４に関する情ｉＦ′ｌｉ：（ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ、１１ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎮の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （ｘ　Ｄ配列の記載：配列番号　１４：（２）配列番号；１５に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：２０ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー・Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載　配列番号：１５゜（２）配列番号：１６に関する情報 （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ・１２ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｃ）鎮の数・Ｎ／Ａ （Ｄ）　ｌ−ボロジー　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載　配列番号　１６・（２）配列番号：１７に関する情報・ （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ＝７０ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）輪の数・Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （ｘ　ｉ）配列の記載：配列番号：１７：（２）配列番号、１８に関する情報・ （１）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ：１３ （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （Ｘり配列の記載：配列番号　１８゜ （２）配列番号：１９に関する情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ、１０ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）蛸の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載、配列番号：１９：ＣＹＳ　Ａｓｐ　Ｌａｕ　Ａｒｑ　Ａｒ ｇ　Ｌａｕ　Ｇｌｕ　Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　ＣＹＳ（２）配列番号、２０に関する情 報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ、１５ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｃ）鏑の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載・配列番号・２０：（２）配列番号＝２１に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ、１９ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数＋　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：２１：Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ （２）配列番号：２８に関する情報＝ （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ、１３ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （Ｘｌ）配列の記載：配列番号：２８；（２）配列番号　２９に関する情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ　１１ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｃ）鎖の数−Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （ｘｌ）配列の記載：配列番号・２９：（２）配列番号・３０に関する情報。

（１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：１９ （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （ｘ　ｉ）配列の記載：配列番号・３０；Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ （２）配列番号＝３１に関する情報・ （Ｄ配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・６７ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎮の数＋　Ｎ／Ａ （Ｄ）　トポロジー　Ｎ／Ａ （Ｘｌ）配列の記載：配列番号：３１・（２）配列番号　３２に関する情報・ （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１３ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｃ）鎮の数・Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー＋　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３２：（２）配列番号・３３に関する情報： （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ、１０ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー・Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３３−（２）配列番号＝３４に関する情報： （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ：１５ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｃ）饋の数・Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （Ｘｌ）配列の記載・配列番号　３４ ＣＹＳＣｙｓ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌ、ｅｕ　Ａｌａ　 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｉｌ　５　１０　１５ （２）配列番号　３５に関する情報 （１）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ　１７ （Ｂ）配列の型・アミｈ酸 （Ｃ）娘の数　Ｎ　、／Δ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載　配列番号・３５゜１ｕ （２）配列番号＝３６に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・１５ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 ぐＣ）鎖の数二Ｎ／Ａ （Ｄ）　ｌ−ポロジー：　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３６：（２）配列番号：３７に関する情報； （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１４ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｃ）蛸の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー＋　Ｎ／Ａ （ｘｌ）配列の記載：配列番号　３７゜（２）配列番号：３８に関する情報： （１）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ・９ ＣＢ）配列の型・アミノ酸 （Ｃ）鎮の数・Ｎ／Ａ （Ｄ））−ポロジー　Ｎ／Ａ （Ｘｌ）配列の記載：配列番号・３８：（２）配列番号・３９に関する情報： （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・１５ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：３９・（２）配列番号　４０に関する情＠； （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１０ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｃ）鎮の数・Ｎ／Ａ （Ｄ）＋−ボロン−・Ｎ／Δ （ｘｉ）配列の記載２配列番号・４０・Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｒｑ　Ｐｒ ｏ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ（２）配列番号　４１に関する情 報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１８ （Ｂ）配列の型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数　Ｎ／八 （Ｄ）トポロジー・Ｎ／八 （ｘ　ｉ）配列の記載・配列番号・４１ｙｓ （２）配列番号・４２に関する情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：１２ （Ｂ）配列の型；アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：４２：（２）配列番号、４３に関する情報： （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ：９ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （Ｘｌ）配列の記載、配列番号　４３：（２）配列番号　４４に関する情報 （ｉ）配列の特徴・ （Ａ）配列の長さ・１６ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数　Ｎ／Ａ （×１）配列の記載、配列番号、４４；（２）配列番号＝４５に関する情報： （１）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・１４ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎮の数　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （ｉｘ）他の情報：ＸａａはチロシンのＤ−異性体を表す。

（ｘｉ）配列の記載：配列番号、４５：（２）配列番号、４６に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・１０ （Ｂ）配列の型、アミノ酸 （Ｃ）鎖の数　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （ｉｘ）他の情報：ＸａａはチロシンのＤ−異性体を表す。

（ｘｉ）配列の記載・配列番号：４６゜（２）配列番号・４７に関する情報・ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　１６ （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｃ）鎖の数　Ｎ／Ａ （Ｄ）　ｌ−ボロジー　Ｎ／Ａ （１ｘ）他の情報：ＸａａはチロシンのＤ−異性体を表す。

（ｘＤ配列の記載：配列番号：４７： （２）配列番号：４８に関する情報； （ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ、１２ （Ｂ）配列の型・アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー・Ｎ／Ａ （ｉｘ）他の情報　ＸａａはチロシンのＤ−異性体を表す。

（ｘｌ）配列の記載：配列番号：４８：（２）配列番号　４９に関する情報： （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ　１１ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 ＜ｃ）１にの数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （ｉｘ）他の情報・ＸａａはチロシンのＤ−異性体を表す。

（Ｘｌ）配列の記載・配列番号：４９：（２）配列番号・５０に関する情報・ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ　９ （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｃ）鎮の数：Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー・Ｎ／Ａ （１ｘ）他の情報：ＸａａはチロシンのＤ−５％性体を表す。

（ｘｌ）配列の記載：配列番号：５ｏｚ（２）配列番号・５１に関する情報： （Ｄ配列の特徴： （Ａ）配列の長さ・８ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数・Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載・配列番号：５１：（２）配列番号：５２に関する情報。

（１）配列の特徴。

（Ａ）配列の長さ　８ （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｃ）輪の数　Ｎ／Ａ （Ｄン　トポロジー・Ｎ／Ａ （Ｘｌ）配列の記載　配列番号　５２；（２）配列番号　５３に関する情報 （１）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ・８ （Ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー　Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載：配列番号＝５３ （２）配列番号二５４に関する情報＝ （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：８ （Ｂ）配列の型　アミノ酸 （Ｃ）鏑の数　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー・Ｎ／Ａ （ｘｉ）配列の記載：配列番号：５４・（２）配列番号・５５に関する情報。

（ｉ）配列の特徴： （Ａ）配列の長さ、５ ＣＢ）配列の型二アミノ酸 （Ｃ）鎖の数Ｉ　Ｎ／Ａ （Ｄ）トポロジー：　Ｎ／Ａ （ｘ　ｉ）配列の記載　配列番号：５５・Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ａ ｌａユ５ （２）配列番号　５６に関する情報 （ｉ）配列の特徴； （Ａ）配列の長さ・６ ＦＩＧ　４　１ＧＦ−１（μ９） ＦＩＧ　５　処理 ＦＩＧ　６　脳鎖域 Ｇ７ Ｇ８ ＦＩＧ　９ ＩＧ１０ Ａ：２ｎＭＮＧＦ 細胞数 ｌＧ１３ ＩＧ１４ （琲甫菖丑） 某藁 ＦＩＧ。１７ａ ＦＩＧ、１７ｂ 仔０６ ／　１ｒｘＱ／ＷｄＯ フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃ０７Ｋ　９９：２６ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＰＴ、ＳＥ） 、　ＣＡ、ＪＰ（７２）発明者　スミス、ケビン・アールアメリカ合衆国ペンシ ルベニア州１９３６５、パーケスバーブ、エイ・フォース・アベニュー４２３番 （７２）発明者　カリソン、キャスリーン・ブイアメリカ合衆国ニューシャーシ ー州０８１０９、マーチヤントビレ、プリマス・ブレイス１２１番 Ｉ （７２）発明者　ボールディノ、フランクアメリカ合衆国ペンシルベニア州１９ ３５０、ランデンバーグ、ミドルトン・ロード２４番（７２）発明者　ネフ、ニ コラ アメリカ合衆国ペンシルベニア州１９０８６、ウォーリングフォード、タツドモ ーデン・ドライブ５９番 （７２）発明者　イクバル、モハメッドアメリカ合衆国ペンシルベニア州１９３ ５５、マルバーン、グラブ・ロード図番

Claims (36)

【特許請求の範囲】
1. １．ＩＧＦ−ＩＩ（５８〜６７）（配列番号：２）のアミノ酸配列からなる実質 的に純粋なペプチド。
2. ２．該ペプチドのチロシン−５９がＤ−アミノチロシンである請求項１記載のペ プチド（配列番号：４６）。
3. ３．アミノ酸配列ＴＹＣＡＰＡＫＳＥ（配列番号：１）からなる実質的に純粋な ペプチド。
4. ４．アミド結合の形成により環化している請求項３記載の実質的に純粋なペプチ ド。
5. ５．該ペプチドのチロシン−５９がＤ−アミノチロシンである請求項３記載のペ プチド（配列番号：５０）。
6. ６．該ペプチドのチロシン−５９がチロシンのＤ−異性体であるペプチドＩＧＦ −ＩＩ（５４〜６７；Ｄ−Ｙ）（配列番号：４５）からなる実質的に純粋なペプ チド。
7. ７．インスリン様成長因子−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩＩ（５８〜６７：Ｄ−Ｙ（配列番 号：４６））の断片のアナログおよび医薬上許容される希釈剤からなる治療用組 成物。
8. ８．哺乳動物において死滅する危険性のあるニューロン細胞の生存促進用の、あ るいは哺乳動物の頭部もしくは脊髄の損傷の治療用の、哺乳動物の神経突起の再 生促進用の、または卒中、癲癇、年令に関連したニューロン損失、筋萎縮性側索 硬化症もしくはパーキンソン氏病からなる哺乳動物のニューロン細胞に影響する 疾患の症状の治療用のインスリン様成長因子ＩＩアナログＩＧＦ−ＩＩ（５８〜 ６７；Ｄ−Ｙ）。
9. ９．インスリン様成長因子−Ｉ誘導体（ＩＧＦ−Ｉ（５５〜７０）（配列番号： ４））および医薬上許容される希釈剤からなる治療用組成物。
10. １０．哺乳動物において死ぬ危険性のあるニューロン細胞の生存促進用の、ある いは哺乳動物の頭部もしくは脊髄の損傷の治療用の、哺乳動物の神経突起の再生 促進用の、または卒中、癲癇、年令に関連したニューロン損失、筋萎縮性側索硬 化症もしくはパーキンソン氏病からなる哺乳動物のニューロン細胞に影響する疾 患の症状の治療用のインスリン様成長因子−Ｉ誘導体１ＧＦ−Ｉ（５５〜７０） （配列番号：４）。
11. １１．ＩＧＦ−Ｉ（５５〜７０）のアミノ酸配列ＲＲＬＥＭＹＣＡＰＬＫＰＡＫ ＳＡ（配列番号：４）からなる実質的に純粋なペプチド。
12. １２．アミノ酸配列ＥＰＹＣＡＰＰＡＫＳＥ（配列番号：５）からなる実質的に 純粋なペプチド。
13. １３．治療に用いる請求項１〜６、１１または１２いずれか１に記載のペプチド 。
14. １４．哺乳動物において死ぬ危険性のあるニューロン細胞の生存を促進するため の、あるいは哺乳動物の頭部もしくは脊髄の損傷を治療するための、哺乳動物の 神経突起の再生を促進するための、または卒中、癲癇、年令に関連したニューロ ン損失、筋萎縮性側索硬化症もしくはパーキンソン氏病から選択される哺乳動物 のニューロン細胞に影響する疾患の症状を治療するための請求項１〜６、１１ま たは１２いずれか１に記載のペプチドの使用。
15. １５．アミノ酸配列ＣＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号：６）、アミ ノ酸配列ＣＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号：７）、アミノ酸配列ＣＥＰＹＣ ＡＰＰＡＫＳＥＣ（配列番号：８）およびアミノ酸配列ＣＴＹＣＡＰＡＫＳＥＣ （配列番号：９）からなる群より選択される配列よりなり、Ｎ−末端システイン がＣ−末端システインと共有結合により結合している実質的に純粋なペプチド。
16. １６．Ｎ−末端システインがＣ−末端システインと共有結合により結合している アミノ酸配列ＣＡＬＬＥＴＤＹＣＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号：４７）、アミノ 酸配列ＣＴＤＹＣＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号：４８）およびアミノ酸配列ＣＴ ＤＹＣＡＰＡＫＳＥＣ（配列番号：４９）からなる群より選択される配列よりな る実質的に純粋なペプチド。
17. １７．アミノ酸配列ＣＴＹＴＡＰＡＫＳＥＣ（配列番号：１０）、アミノ酸配列 ＣＡＬＬＥＴＹＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号：１１）、アミノ酸配列ＣＲＲＬＥ ＭＹＣＡＰＬＫＰＡＫＳＡＣ（配列番号：１２）、アミノ酸配列ＣＧＹＧＳＳＳ ＲＲＡＰＱＴＣ（配列番号：１３）、アミノ酸配列ＣＹＦＮＫＰＴＧＹＧＣ（配 列番号：１４）、アミノ酸配列ＣＹＦＮＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＲＡＰＱＴＣ（配 列番号：１５）およびアミノ酸配列ＣＫＰＴＧＹＧＳＳＳＲＣ（配列番号：１６ ）からなる群より選択される配列よりからなり、Ｎ−末端システインがＣ−末端 システインと共有結合により結合している実質的に純粋なペプチド。
18. １８．アミノ酸配列ＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣ（配列番号：１９）、アミノ酸配列Ｃ ＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣ（配列番号：２０）、アミノ酸配列ＣＣＦＲＳＣ （配列番号：２２）およびアミノ酸配列ＣＦＲＳＣ（配列番号：２３）からなる 群より選択され、その２残基間の共有結合により環化されている実質的に純粋な ペプチド。
19. １９．実質的にアミノ酸配列ＣＧＣＥＬＶＤＡＬＱＦＶＣ（配列番号：１８）お よびＣＣＦＲＳＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣ（配列番号：２０）からなり、２残基間に おける少なくとも１つの共有結合からなる実質的に純粋な環化ペプチド。
20. ２０．アミノ酸配列ＣＧＣＥＬＶＤＡＬＱＦＶＣ（配列番号：１８）、アミノ酸 配列ＣＤＬＲＲＬＥＭＹＣＣＰＬＫＰＡＫＳＥ（配列番号：２１）、アミノ酸配 列ＣＧＰＥＴＬＣ（配列番号：２６）、アミノ酸配列ＣＧＹＧＳＳＳＲＲＣＰＱ ＴＧＩＶＤＥＣ（配列番号：２７）アミノ酸配列ＣＧＤＲＧＦＹＦＮＫＰＴＣ（ 配列番号：２８）、アミノ酸配列ＣＣＰＬＫＰＡＫＳＡＣ（配列番号：２９）お よびアミノ酸配列ＣＤＬＲＲＬＥＭＹＡＰＬＫＰＡＫＳＡＣ（配列番号：３０） からなる群より選択される配列よりなり、Ｎ−末端システインがＣ−末端システ インと共有結合により結合している実質的に純粋なペプチド。
21. ２１．アミノ酸配列ＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣ（配列番号：３２）、アミノ酸 配列ＣＣＦＲＳＣＤＤＬＡＬＬＥＴＹＣ（配列番号：３４）からなる群より選択 され、２残基間の共有結合により環化している実質的に純粋なペプチド。
22. ２２．実質的にアミノ酸配列ＣＧＧＥＬＶＤＴＬＱＦＶＣ（配列番号：３２）お よびＣＣＦＲＳＣＤＬＣＬＬＥＴＹＣ（配列番号：３９）からなり、２残基間に おける少なくとも１つの共有結合からなる実質的に純粋な環化ペプチド。
23. ２３．アミノ酸配列ＣＤＬＣＬＬＥＴＹＣ（配列番号：３３）、アミノ酸配列Ｃ ＤＬＣＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ（配列番号：３５）、アミノ酸配列ＣＣＹＲ ＰＳＥＴＬＣ（配列番号：４０）、ＣＲＰＣＳＲＶＳＲＲＳＲＧＩＶＥＥＣ（配 列番号：４１）、ＣＧＤＲＧＦＹＦＳＲＰＣ（配列番号：４２）、ＣＣＴＰＡＫ ＳＥＣ（配列番号：４３）およびＣＤＬＣＬＬＥＴＡＴＰＡＫＳＥＣ（配列番号 ：４４）からなる群より選択される配列よりなり、Ｎ−末端システインがＣ−末 端システインと共有結合により結合している実質的に純粋なペプチド。
24. ２４．アミノ酸配列ＴＹＣＡＴＰＡＫ（配列番号：５１）、ＬＥＴＹＣＡＴＰ（ 配列番号：５２）、ＣＡＴＰＡＫＳＥ（配列番号：５３）、ＹＣＡＰＡＫＳＥ（ 配列番号：５４）、ＹＣＡＰＡ（配列番号：５５）、ＴＹＣＡＰＡ（配列番号： ５６）、ＣＡＰＡＫＳＥ（配列番号：２４）、ＥＡＬＬＥＴＹＣＡＴＰＡＫＳＥ （配列番号：３６）、ＡＬＬＥＫＹＣＡＫＰＡＫＳＥ（配列番号：３７）および ＡＰＳＴＣＥＹＫＡ（配列番号：３８）からなる群より選択される配列よりなる 実質的に純粋なペプチド。
25. ２５．５ないし４０個のアミノ酸を有する請求項１５、１６、１７、２０または ２３記載のペプチド。
26. ２６．ヨウ素化されている請求項２５記載のペプチド。
27. ２７．該アミノ酸配列を挟む残基が、天然に存在するＩＧＦ−Ｉの配列または天 然に存在するＩＧＦ−ＩＩの配列と相同である請求項２５記載のペプチド。
28. ２８．環状ペプチドである請求項１３または１４記載のペプチド。
29. ２９．ヨウ素化されている請求項２８記載のペプチド。
30. ３０．実質的に５ないし４０個のアミノ酸残基からなる請求項２８記載のペプチ ド。
31. ３１．実質的に６〜２５個のアミノ酸残基からなる請求項３０記載のペプチド。
32. ３２．レトローインベルソ・ペプチドである請求項１３または１４記載のペプチ ド。
33. ３３．該レトローインベルソ・ペプチドがＩＧＦ−Ｉまたはその断片と相同であ る請求項３２記載のペプチド。
34. ３４．該レトローインベルソ・ペプチドがＩＧＦ−ＩＩまたはその断片と相同で ある請求項３２記載のペプチド。
35. ３５．治療に用いる請求項１５〜２７のいずれか１に記載のペプチド。
36. ３６．哺乳動物において死ぬ危険性のあるニューロン細胞の生存を促進するため の、あるいは哺乳動物の頭部もしくは脊髄の損傷を治療するための、哺乳動物の 神経突起の再生を促進するための、または卒中、癲癇、年令に関連したニューロ ン損失、筋萎縮性側索硬化症もしくはパーキンソン氏病から選択される哺乳動物 のニューロン細胞に影響する疾患の症状を治療するための請求項１５〜２７のい ずれか１に記載のペプチドの使用。