JPH06510363A - 磁気性粒子を使用する生物学的材料の単離 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 磁気性粒子を使用する生物学的材料の単離本発明は、磁気標識を利用して生物学 的材料を分離し、そして、単離するための方法と組成物に関する。標識されるへ き材料は、支持体に可逆的につなぎとめてから標識される。考慮の対象になる磁 気的標識は、例えば染色体、ミトコンドリア、集録体、ゴルジ装置のような顕微 鏡的範囲における生物学的材料を分離し、そして単離するのに適切であるだけ十 分に小さい。核酸のプローブ、または抗体のような結合組成物は、標識複合体の 一部を形成する。支持体から遊離された後、標識された材料は、磁場によって選 別することによって単離される。

生物学的材料は、不均質な成分からなるシチューであり、多くの検討と操作手順 に先立って、成分の部分に分ける必要かある。分離方法は、分離されるべき材料 の給体的及び相対的大きさ、そして達成されるべき純度に応じて変化する。比較 的大きな材料、すなわち、シチューの”肉”を分離するためには、遠心分離、濾 過、及び密度勾配沈降法は、適切な比較的大ざっばな方法の中のいくつかの方法 である。小さくて微細な成分、例えば染色体のような“スパイス′を分離するた めには、フローサイトメトリーが主要な方法となっている。例えば、ゴルジ装置 のようなある種の材料は、個別の、手つかずの細胞成分としては、いかなる手段 によっても首尾よく分離されたことはない。

フローサイ１−メトリーのテーマについては多くの変法があるか、この方法の基 本的な原理は、細胞の材料、例えば染色体をそのＤＮＡ含量にしたがって標識す ることであり、ＤＮＡ含量は、一般的にはその大きさと相関しており、ＤＮＡ含 量を定量的に測定するレーザー光線によって、材料を補集チューブの中に分離す ることである。

ヒトの染色体のフロー分離は、染色体２３対のうちの若干を分離するのにある程 度成功しているが、例えば、ヒト染色体２２−２２とＹの若干の凝集か起きると いう結果になっている。したがって、この方法の作用性は限られている。小さい 生物学的材料、例えば０．２から１０μの範囲にある染色体、またはβ−染色体 、ミニ染色体及びダブルマイニュート染色体のように、さらにもっと小さな材料 の分離のための現在の方法は不適切であり、手に入れられない。フローサイトメ トリーは、小さい個別の成分の分離を保証できる程鋭敏ではなく、細胞破片がま ざって選別されることか多い。体細胞法（ハイブリッド形成、ミクロセルフュー ジョン）は、染色体を単離することかできるか、この方法は労力を要し、結果を 予告できない。必要とされるのは、大きさの違いだけに依存するのではなく、分 離されるべき材料の他の内在的特性にも関連しているある種の分離法である。

単離と分離の方法の主要標的である細胞成分は染色体である。染色体の正しい数 からのずれは、通常表現型の異常を産出するので、細胞、細胞系、組織、または 生物の染色体の成分を分析することが出来ることは重要である。表現型は、遺伝 的相補体と環境の相互作用の結果生ずる。染色体の構造的異常も、遺伝的バラン スが破壊されるならば、異常を生ずることがある。染色体異常は、個々の細胞に おける染色体の顕微鏡写真が分析される標準核型分析によって検出されることが ある。検出のもう１つの方法は、フローサイトメトリー（Ｇｒａｙ、　１９９０ 　）によって多数の細胞から染色体を選別し、結果を標準パターンと比較するこ とである。

他の目的には、同一の染色体の群を単離することが望ましい。例えば、染色体２ １１の異数性が、ダウン症候群の原因である。この臨床的に重要な染色体の特性 を研究するには、多数のＮｏ、２１染色体を他の染色体から分離するか、または 別の種からの染色体の背景中に個々の２１の染色体を単離することが作用である 。前者は、また、フローサイトメトリーによって、後者は例えば体細胞ハイブリ ッド形成技術によって達成することができる。

ある程度作用てはあるか、時間と費用、予測不能、汚染による不正確、及び処理 工程中の破壊と変化によって、染色体の単離と各染色体の選別のための現在の技 術には深刻な限界かある。

１染色体は、中期において顕微鏡的に決定された大きさの順に、通常慣習的に番 号かつけられている。

フローサイトメトリーの技術は、生物学的材料と細胞の分析と選別のために使用 されている（ＤａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚとＣｒｉｓｓｍａｎ、　＋　９９０　 ）。

現在では、フローサイトメトリーは、特定の染色体の精製のための主要な方法で ある。しかし、その効率は、単一染色体の多量の選別に必要となる時間（数時間 、または数日さえも）によって制限を受けている。その上、ＤＮＡの内容量か同 様である異なる染色体を、信頼できる程度に分離することは未だ出来ない。同じ ような大きさの染色体の相互の混入が若干ある。その」二、その核型か同様な大 きさをした末端部末端体動原体体（これらは、−次くびれをもった染色体、すな わち、動原体が一方の端に位置した染色体である）からなるマウスのような品種 においては、ＤＮＡの含量だけによって個々の染色体を分離することは不可能で ある。このような場合には、その場合、与えられた染色体か、骨を折って、遺伝 学的に異なる背景において細胞融合及び選別によって単離することか出来る体細 胞ハイブリッド形成か、または、大きさと非転座染色体からのアーム−比か異な る単回のロバ−１−ソニアン転座（全腕融合）を運んでいるマウスの系統におい て見出されるような一様でない核型をもった細胞型を使用することができる。

特定の染色体を単離し、選別する能力は、正常及び悪性細胞の両方の過程を研究 する上で有用であり、クローニングのための染色体−特異的ライブラリーを作る 上での必須の第一段階である。例えば、特異的染色体のフロー選別が、見かけ上 平衡転座染色体（Ｃｏｏｋｅら、１９８９）における欠失を検出するために使用 された。欠失転座は、その成分部分の定量的和ではないので、見つからない部分 は推論することができると考えられる。フローサイトメトリーもまた、２つの癌 遺伝子が定量的に検出てきる変化である癌関連転座（Ｈａｒｒｉｓら、１９８６ ）の染色体の誘導体に転座した家族性の腎臓癌の症例において例証されるような 悪性の状態と関連した、遺伝学的変化を検討するのに使用さＭ。

これまでの用離及び選別方法で、ある程度の成功をみたが、これらは、未だ、労 力を要し不確実であった。最終的には、フロー選別調製物中の細胞の破片の混入 や相互混入は、この方法の作用性を減じている。したがって、単一染色体の調製 物を信頼性をもって短時間に発生させる方法があれば、ライブラリーの構築、ク ローニング、及び癌において起るような遺伝学的変化の分析において、多くの応 用面か開かれるであろう。

Ｃ，［ｎ　５ｉｔｕハイブリツド形成 放射活性のプローブを使用する、中度、または高度のＤＮＡの繰返し配列のｉｎ 　５ｉｔｕでのハイブリッド形成は、この分野の技術に熟達した人々にとって、 利用出来るようになってから久しい（ＰａｒｄｕｅとＧａ１ｌ、ｌ　９７０）。

もっと最近では、非放射性プローブでの標識は、ハイブリット形成プローブの位 置を検出するのに好んで用いられた。条件が適切であれば、ハイブリッド形成は 相補的核酸配列の間で起る。この分野の技術に熟達した人々にとってはよく知ら れているように、ハイブリッド形成条件、すなわち、“ストリンジエンシー”は 、種々の百分率の相補性の断片の間のハイブリッド形成ができるように制御され ると考えられる。ハイブリッド形成は、例えば、高度または中度の繰返しの配列 からシングルコピーのＤＮＡに至るまでの、異なる大きさのプローブと断片の間 で起ると思われる。ハイブリッド形成は、プローブと核酸を含むいかなる細胞成 分の間ても起ると考えられる。染色体−特異的な反復配列プローブが存在する（ Ｍｏｙｚｉｓら、１９８７）。

放射活性ではなく蛍光性のプローブも存在するが、小さい標的からのシグナルが 弱いために、シングルコピーのＤＮＡ配列のための蛍光シグナルの検出に問題が ある。

例えば、シグナルそれ自体の強度を強めることによって、シグナルの増幅の方法 も検討され、この分野の技術に熟達した人々にとってはよく知られている。シグ ナル検出の増強は（例えば、ディジタルイメージの増強、Ｖｉｅｇａｓ−Ｐｅｑ ｕｉｇｎｏｔら、＋　９８９）　、もう一つの方法である。

懸濁した全染色体についての１ｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成を行うことか試み られた。この企てが成功すれば、染色体の選別のための蛍光活性化細胞選別機（ ＦＡＣ８）の工程が容易になるであろう。

Ｍａｎ旧ｎｇら（１９７５）は、ポリテン染色体にハイブリッドを形成したビオ チン結合核酸プローブに結合しているアビジンポリマースフイアに基づく走査電 子顕微鏡１ｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成法を報告した。

Ｄｕｄｉｎら（１９８８）は、フローサイトメトリー用の如くに調製した染色体 の懸濁物についての１ｎ−ｓｉｔｕハイブリット形成を行った。ニックトランス レーションによってビオチン化されたヒトの遺伝子ＤＮＡを使用して、懸濁液中 の１ｎ−ｓｉｔＵハイブリッド形成によってヒト染色体を標識するために使用し た。著者らは、５ｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎが共存結合によって磁気性ビーズの 表面に結合され、これらは、ハイブリッドを形成された染色体とともにインキュ ベートされた。チャイニーズハムスター×ヒトハイブリット細胞系からのヒトの 染色体は、ビオチン−５ｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ複合体を通じて磁気ビーズに 結合され、簡単な永久磁石によって非標識のチャイニーズハムスターの染色体か ら分離された。ハイブリッド形成は、ヒト染色体に結合した空席のビオチン化ヒ トＤＮＡに、さらなるアビジン−ＦＩＴＣ（フルオレッセイン）の結合によって 可視化された。これらの実験においては、大きな磁気ビーズ（４μｍ）が使用さ れた。

これらの著者らは、染色体の高純度選別のために、不均一性の凝集、この場合に は、ヒト染色体が混ったハムスターの染色体、及び開期の核が存意に減少または 除去されるに違いないことを認めた。彼等は、好ましくは、磁気分離の前に１ｇ の沈降がこれらの問題を解決する手段であることを示唆した。これらの研究者が 遭遇したもう１つの問題は、多数の染色体／磁気ビーズが使用されたとき、重度 の塊が形成されることであった。全体的には、この方法は、二次的に吸着された 混入物、そして、手順中に溶液を変えるために必要とされる遠心分離のステップ 中における染色体の凝集と損失の問題のために、あまり成功とは言えなかった。

その上、染色体の懸濁液を調製するために使用したヘキシレングリコールのよう な緩衝液の成分は、染色体の過剰の凝縮を起し、その結果、凝縮した染色体の構 造内の配列への接近性の喪失を起した。この感受性の減少は、配列の検出にとっ て明らかに好ましくない。その上、中期（−３−４μ）の若干の染色体位の大き さである使用された大きな磁性粒子は、恐らく標的への接近性に限りがあるため に標識の効率が低いので収率が減少している。最後に、再現性がないことは、懸 濁物の１ｎ−ｓｉｔｕでのハイブリッド形成か、染色体のフロー選別の問題の解 決とはなり得ないことを意味大きな常磁性粒子は、現在、ＤＮＡ診断と細胞の分 離とともに使用されている（　Ｋｖａｌｈｅｌｍら、１９８７）　、磁気アフィ ニティークロマトグラフィーも、生物学的構造体を精製する実行できる代替的方 法となった（Ｍｅｎｚら、＋９８６）。特異的親和性カップルを有する磁気性の 固型支持体は、細胞、細胞小器官、及び微生物を分離するために使用される（Ｄ ｕｄｉｎら、１９８８における序論を参照のこと）。アフィニティーカップルの １つのメンバーは、通常磁気ミクロスフイア−に共有結合で結合されるか、物理 的に吸着された抗体である。使用されるこれらの若干は、酸化第二鉄（ＰｅＪｔ ）粒子を含むポリスチレンビーズである（　Ｌｅａら、１９８５　；　Ｈｏｗｅ ｌｌら、１９８８による総説を参照のこと）。

磁気ビーズは、本来はイムノアッセイのために開発された。それらは、ＤＮＡと ＲＮＡを分離するためにも使用された（Ｕｈｌｅｎ、　ｌ　９８９　）。アクリ ルアミドとアガロースを常磁性物の存在で重合させることによって作られた元の 磁性粒子の若干は、大きさと磁気の含量が不均質であった。今では、大きさ、密 度及び磁性物質の量がもっと均質である親水性ビーズが開発された。このような ビーズは、磁場の中で均質に沈降する。粒子の表面の化学構造を変化させて、生 体分子の付着のためのフレキシブルなシステムを提供することかできる。

細胞表面の特異的マーカーによる多数の細胞の分離のための磁気細胞選別システ ムが、Ｍｉｌｔｅｎｙｉらによって報告された（＋９９０）。細胞は、順次、ビ オチン化抗体、フルオロクローム−結合アビジン、そしてスーパー常磁性ビオチ ン化された微粒子で標識された。これらの細胞は、次に高グレーディエンド磁気 （ＨＧＭ）カラム上で分離された。保持された細胞は、次にカラムから溶出され た。拳法は、分離された細胞の蛍光顕微鏡分析、またはフローサイトメトリ− いるといわれた。Ｍｉｌｔｅｎｙｉら（１９９０）は、ＭｏｌｄａｙとＭｏｌｄ ａｙによる示唆を実行し、小さいスーパー常磁性、微粒子と高グレーディエンド 磁場（ＨＧＭ）を組合せて細胞を分離した二彼等は、これをＭＡＣＳと呼んてい る。

Ｅ，可逆的固定化 最近、生物学的構造の固定化のための様々な方法が開発された。これらは、例え ば分子生物学において様々な応用を見出した。酵素のような生物学的活性な構造 を生化学的触媒の研究において使用するためにシリカのような基質上に固定化し た（ＷｕとＷａｉｔｅｒｓ．　１　９　８　８　）Ｏ現在では、すりゴヌクレオ チドは、制御された多孔性のガラスの支持体（　Ｄａｍｈａら、１９９０）、種 々の精製法とＤＮＡの捕集法は、興味のある分子の固体の支持体（Ｂｅｂａｅと Ｇｅｂｅｙｅｌｌｕ，　ｌ　９　９　０　）上への固定化に依存している。バイ オセンサーとモニターリングシステムも、固定化した生体分子を使用して企画さ れた（　Ｌｅｈｍａｎ．　１９９０）。

固定化の方法は、開裂可能な、及び不可能な、様々な架橋体（Ｓｔａｒｏｓ．　 １　９　８　２）を利用することかできる。

したがって、必要に応じて固定化は可逆的であることも非可逆的であることもで きる。しかし、これらの方法は、生物学的材料を、単離したり選別したりするこ とに応用されたことがない。本発明における方法の組合せは、小さい生物学的材 料の分離と単離に取組む。

本発明は、生物学的材料の分離と単離の方法に関する。

この方法における一般的ステップは、生物学的材料を支持体につなぎ止め、それ を固定化し、それに対して結合することができる結合組成物で生物学的材料を標 識することである。標識の目的は、結合材料と複合体を形成することに関する生 物学的材料における本質的な差を利用し、後には分離に対する基礎を作ることで ある。生物学的材料−結合組成物も磁性粒子に付着される。これらの磁気化され た複合体は、次に、磁場において分離されることができる。

もっと具体的には、ここに記述される本発明は、小さい生物学的材料を、分離す る、及び単離する方法に関する。これは、以下によって達成される。ｌ）染色体 やその断片、Ｂ−染色体、ミトコンドリア、葉緑体、及びゴルジ装置のような生 物学的材料の可逆的不動化、に続いて、材料内のＤＮＡまたはＲＮＡに対して相 補的な核酸プローブ、または、例えば材料内の、またはその表面に露出している 蛋白質に対する抗体で標識すること：２）標識された材料を磁気粒子標識と組合 せること：そして、３）生物学的材料の個々の成分、または組の成分を固定化の スチップの逆と磁場に暴露することによって単離すること。

本発明の重要てユニークな面は、材料は、それらが固形の支持体につなぎとめら れている間に、標識されることであり、そして、次に、選別を容易にするために 遊離されることである。もう１つの面は、使用される磁性粒子か生物学的材料に 較へて小さいので、その結果、立体障害が問題でなく、交差凝集か最小となり、 生物学的材料の構造が保存され、シグナル／標的の分離が改善される。

生物学的材料は、支持体に対して、付着され、固定化され、そしてつなぎ止めら れる。付着した材料の完全性に悪影響を及はさない、化学的交差架橋剤と結合す ることかでき、ぞして、結局、生物学的材料の分離を達成するために操作するこ とができるいかなる固形の支持体も、本発明の目的に対して有用である。支持体 のより好ましい管線は、カバースリップか、または制御された多孔性ガラスピー ズまたはポリマービーズの形のガラスである。

、：れらの支持体は、同様な材料のより大きなシートを用いることによって、規 模を拡大することか可能である。

本発明の方法は、それらが小さい細胞の成分と分子については最もずＶ益である けれども、いかなる生物学的材料に対しても応用することができる。これらの例 は、染色体、またはそれらの断片、ダブルマイニュート染色体、ミトコンドリア 及びゴルジ装置、シナブトネマ構造、微小管オーガナイジングセンター、空胞な どの細胞構造体である。

ゴルジ装置は、原形質膜系の一部である細胞小器官である。ゴルジ装置は充填さ れた嚢の構造を有し、分泌の過程において機能する。

ダプルマイニュート染色体は、光学顕微鏡下で観察されるドツト−棟構造てあり 、これらは、例えば、薬剤及び化学療法剤に暴露された後の細胞中において観察 される。それらは、このようなストレスに対する細胞の応答から生ずるよってあ り、遺伝子の増幅、すなオ）ち、細胞内の単一遺伝子の多くのコピーの産生と関 連している。

“染色体”という言葉は、正常な手つかずの染色体、及び異常が自発的であるが 、環境作用体によって誘発されたかどうかに関係なく異常な染色体、そして、そ れらの部分か断片のことを意味している。

多くの源からの細胞が、本発明の生物学的材料を提供するために使用される。例 としては、ＨｅＬａ細胞のような癌細胞、ヒトＬＡＫ細胞（リンホカイン活性化 キラー細胞）、ＰＨＡて刺戟されたヒト末梢血の細胞、骨髄細胞、植物カルス細 胞、植物葉緑体などが含まれる。多数の分裂中の細胞を生ずることができる細胞 がより好ましい。

本発明は、小さい生物学的材料にとって、格別に作詞である。例えば、染色体は 約０．　５　−　１　０μｍの大きさであり、ミドコン］・リアは５−２０μｍ ，葉緑体は５−１００μｍである。あとに続く磁性粒子の大きさについての考察 から明らかになるように、この発明の側面は、５０口ｍ−１０μｍのオーダーの 、より好ましくは５０ｎｍ−２，０μｍの小さい磁気微粒子を標識として、これ らの小さい材料を標識するのに用いることである。これらの小さい粒子の選択に より、分離が改善される。

生物学的材料かつなぎ止められる支持体は、一般的に、開裂可能な架橋−結合剤 であり、放出剤であるシランで処理される。ガラスの表面をホモ２官能基性架橋 結合剤ＤＴＳＳＰで処理することは固定化の方法の態様であるけれども、染色体 を固形の支持体に可逆的につなぎとめるためのへテロ２官能基性の架橋結合剤の 使用のような、他の計画案がより好ましい。これらは、５ＰＤＰのようなヘテロ ２官能基剤を含む。長鎖のアルキルアミンリンカ−の腕を付けた場合と、付けな い場合の制御された多孔性のガラスＣＣＰＧ’）ビーズの使用が、支持体として 好まれる。泡沫様の構造とＣＰＧの比較的少い量の利用できる外側の表面によっ て、より少い架橋結合剤を通じてそれらの表面への染色体の付着か許され、その ため、結合の開裂の後の収率を改善する。単離された染色体を攻撃し得るアミノ 基で、末端にあるオリゴペプチドで誘導体とされたポリマービーズに可逆的に架 橋結合させることも可能である。この方法は、固相ペプチド合成のプロトコール を、上述した技術を組合せ、オリゴペプチドか、例えば強い内部剛性、及び種々 の長さにまで注文に応して作ることかできるので、魅力的である。したがって、 生物学的材料の最大限の捕集と、架橋結合を逆戻りさせた後の放出のためのこの ようなリンカ−分子の特性を最適化することができる。その上、平なガラス表面 の代りに、懸濁物において操作することができるミクロビーズ支持体の使用によ り、反応性の効率が改善されると考えられる。いかなる可逆的固定化手順の効率 も、架橋剤と、制御可能な反応を有することに依存する。ガラスのような支持体 のあらかじめの処理は、両端の支持体との反応のため、生物学的材料との反応の リンカ−の部分を利用できなくする可能性があるけれとも、例えばＤＴＴＳＰの ようなホモ２官能基性架橋結合剤は、この発明の目的のために上首尾である。こ の問題は、Ｎ−サクシニミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（Ｓ ＰＤＰ）のようなヘテロ２官能性架橋結合剤の使用によって克服された。支持体 は、それらが架橋結合剤の一方の端とだけ反応し、他の端を生物学的材料と反応 するために遊離のままにしておくように改変されているので、このような化合物 の使用により、もっと制御が容易な、もっと効果的に可逆的な固定化の手順が行 われるようになる。放出剤の例は、ジスルフィド結合を開裂するジチオトレイト ール（ＤＴＴ）である。

上に記述された固定化の手順は、標識化反応を懸濁物で行うことと関連した損失 と凝集か起ることなしに、分離のために生物学的材料を効率的に標識することが 可能になる。その上、細胞の破片と混入物は、固定化調製物から容易に洗い出す ことが出来る。固定化のステップの逆の工程によって、次に、標識材料が選別の ために回収されることが出来るようになる。

つなぎ止めた生物学的材料は、それに対して、結合する組成物と接触される。結 合組成物の選択は、選別した材料を何のために使用するかにかかっている。染色 体の場合には、考慮されるゴールには、染色体の特異的ライブラリーの産生、及 び生理学的に無傷の染色体の産生があげられる。

最初の応用については、染色体のＤＮＡが、単離手順の標的であるので、より好 ましい結合組成物は、核酸のプローブである。例えばプローブは、特異的な動原 体の領域の繰返しに対する、全染色体に対する、あるいは、シングル遺伝子コピ ーに対する。典型的な態様においては、特異的な染色体が回収できるようにする 通常長さが５００ｂｐ−５ｋｂのニック−トランスレイテッドプラスミドである 。２番目の応用においては、より好ましい結合組成物は、例えば、ヒストン（Ｈ ｌ）のような染色体内に含まれている蛋白質に対する抗体であり、その結果、無 傷の染色体が細胞成分の混合物から回収される。この２番目の応用の別の面は、 ＤＮＡ配列ではなく、染色体蛋白質に基いて特異的な染色体蛋白質を単離するこ とである。これらの手順はすべて間期の染色体、ならびに中期の染色体、そして 染色体の部分にも適用できる。核酸プローブ、または特異的蛋白質に対する抗体 も、ミトコンドリアや葉緑体のような細胞小器官、及び他の小量の生物学的材料 のためにも育用な標識である。

結合組成物は、一般的に標識される。例証となる態様においては、標識は、フル オレセインをもったビオチン−アビジンてあった。この場合には、増強された蛍 光デジタル−造影顕微鏡測定法が蛍光標識を検出するのに使用される（Ｖｉｅｇ ａｓ−Ｐａｑｕｉｇｎｏｔ　ら、１９８９）。

“ハイブリッド形成カクテル”、すなわち同じ染色体の異なる部分とハイブリッ ドを形成するＤＮＡの調製物は、全染色体を覆い、磁気粒子と結合するのに使用 され、磁力が適用されるとき、非標識染色体から標識染色体の分離を容易にする と考えられる。全体の特異的染色体に“ペイントする”それらを標識したプロー ブでコートする方法も開発された。０ｎｃｏｒ　（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、 　ＭＯ）は、報告によれば、ヒトのすへての動原体を検出する動原体のプローブ カクテルを発売している。

ニック−トランスレイテッドビオチン化ＤＮＡプローブは、非放射性ｉｎ　ｓｏ ｕハイブリッド形成によって、染色体上の遺伝子の位置のマツピングに日常的に 使用される。ビオチン化されたプローブは、ビオチンに対して高親和性をもって いる蛋白質（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ウサギの抗−ビオチン） と反応することによって局在化し、光学顕微鏡用に蛍光性マーカー、または電子 顕微鏡用にコロイド状金に結合させることによって可視化される。これらの反応 は、両方ともシグナルの物理的表面積を増大する。市販のコロイド状金（Ａｕｒ ｏｐｒｏｂｅ、　ｌ　Ｏｎｍ）は、２つのストレプトアビジン分子を吸収するこ とかできる。ビオチン化酸化第二鉄粒子（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ ｅａｒｃｈ、Ｉ　０００　ｎｍ　）は、コロイド状金と反応して、その際、染色 体を結合した鉄の量に比例して磁気的に反応性とする。これらの反応のｋｍ値は 、＋ｏ−１！からｔｏ−１６の範囲にある。磁性粒子の大きさは、好ましくは、 小さな希土類磁石、例えば、ネオジミウム−鉄−硼素に対し、（−１）ｌＯｇの 吸引力を保持するべきである。

裸の磁性（酸化第二鉄）微粒子は、例えば１）　ＴｅｒｒＦｌｕｉｄｓ　（Ｎａ ｓｈｕａ、　Ｎ、　Ｈｌ）＋　２）　Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ（ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、　Ｍ ａｓｓ、）　：及び３）　Ａｌｆａ　Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ　（Ｄａｎｖｅｒｓ、 　Ｍａｓｓ、）のような、市販の提供者から購入することができる。これらの裸 の酸化第二鉄の市販の調製物は、粒子と粒子の凝集物の大きさか変動する。これ らの調製物は、粒子の大きさと粒子の凝集物の大きさに関して不均質である。本 発明のために、これらの調整物を使用するためには、それらは、もっと正確な粒 子のクラスに分画しなければならない。典型的な分画実験においては、密度沈降 カラム（ｌ−２メーター）と電磁尺を使用して種々の大きさのクラスを集めるの に使用した。粒子は、酸化を避けるために１００％のエタノール中に懸濁させた 。スラリーをカラム中に入れ、２４時間放置した。この時間の終りに、密度勾配 が形成され、凝集体か上に、重い粒子は下になった。特異的磁石をカラムに対し て残すことが出来た。そして、他の粒子は、すすぎ流された。採取の方法のため に、これらの粒子は、定義によって磁場に応答性であった。

これらの粒子を大きさによって分けた後、電子ＩＩ徴鏡中で精査すると、以下の ことが明らかになった。

＋０００−５００ｎと５００−＋０００ｎｍの大きさのクラスの２つの型の粒子 があった。固体のシングル粒子とはるかに小さい粒子（約１０１０−２０ｎの凝 集物であった。これらの凝集物は、電子Ｉｆｆ微鏡中て、ブドウの形をした房状 に見えた。密度沈降によって再沈降させると、凝集物は固型の粒子から更に分か れた。

磁性粉子に付着して、それらの融通性を増強するところの１つの型の材料は蛋白 質である。蛋白質を酸化第二鉄に付着させる２つの方法は、＝１）直接吸着；２ ）シランを通しての共有結合による結合である。いかなる蛋白質も、磁性粒子に 共有結合でつながる潜在力がある。より好ましいシランは、Ｎ−（２−アミノエ チル）−３−アミノプロビルトリメトキソシラン（Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃ ａｌＣｏ、　）である。二のシランは、グルタルアルデヒドによって活性化され 特定の蛋白質に結合する官能性アミノ基を提供する。

Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈは、共有結合で結合した抗体を もった磁性粒子を市販している。この会社は、ビオチン化した微粒子ら販売して いる。これらの調製物の透過電子顕微鏡における精査によって、裸の酸化第二鉄 について」−ユ述したものを思い出させる２つのクラスの粒子が明らかになった 。すなわち、シングル粒子と凝集物（ブドウ様房状）である。

本発明の目的のためには、生物学的材料はブドウ様の酸化第二鉄で標識されるの かより好ましい。酸化第二鉄は、磁気的に反応性であるので、標識された生物学 的材料も、磁気的に反応性である。

Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（５０ｎｍ）によって産生されたよう なより小さい磁性粒子は、より大きなものより利点かある。結合反応かより早く 、標識における定量的差は容認出来る程度てあり、ビーズは相互に凝集せず、滅 菌することか容易である。不利な点は、固装的な幾何学的磁場においては、小さ な磁気モーメントは、分離の時間が余計にかかることである。とにかく、本発明 の方法を使用する分離は、数分て達成することができる。市販で手に入る永久磁 石（１００−１０００ガウス）によって提供される比較的低い磁場は、カラムか ら染色体のような材料を除去するのに適切である。希土類の磁石は、それらか強 い磁場（Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）をもっているのでより好まし い。

本発明の１つの面は、それらか単離され、そして／または選別され得るように、 標識生物材料を遊離させることである。この過程により、該材料の精製、すなわ ち、特別なりラスの構造について豊富にされた懸濁物を得ることか可能になる。

例えば、材料か染色体であれば、Ｎｏ。

２１のクラスの染色体を回収することができる。研究室での簡単な使用について は、１０ｍ１のピペットが分離カラムとして使用された。一連の磁石をピペット の外側に置いた。そして、緩衝液中の小さい磁性粒子をピペットを通して重力に よって落下させた。これらの粒子は、磁石の隣の内側に付着した。

もし材料を、プローブと磁石の粒子が望ましくないその後の応用に使用しようと するならば、これらは、フェノール抽出、複合体を約５０゛Ｃの温度で融解させ ること、界面活性剤、高塩類濃度、あるいは蛋白質分解酵素で処理することによ って生物学的材料から除去することができる。例えば、パパイン消化か抗体のヒ ンジ領域を開裂し、したかって、鉄を除去するのに使用することかできる。代替 として、他のプロテアーゼも使用されるかもしれない。磁性粒子、そして／また は結合組成物を除くための、そしてその後の応用のために生物学的構造に悪影響 を及はさない他の如何なる方法も、本発明の範囲内である。

１つ以上のプローブか染色体に適用されることかある。

もしすべてのプローブか同じ染色体とハイブリッド形成を行うとすれば、これは 、より強いシグナルを与えることによって選別を増強することかできる。もしプ ローブが異なる染色体に対するものであれば、それらは、染色体か磁場によって 分離できるように、何らかの方法で区別され得るに違いない。

１−）Ｊｕ上の染色体を選別するためには、染色体は、置換か異ったＤＮＡプロ ーブで標識される。これらの各々は、大きさが異なる、モして／または、量が異 なる磁気粒子で標識される。離脱の後、標識された調製物は弱い磁石に暴露し、 多量の粒子で標識された材料を単離し、その後て強い磁石に暴露して、より小さ い粒子で標識した染色体を単離する。グレーディエンド磁場を、異なる仕方で標 識した染色体の同時分離のために使用することができる。もし染色体が、架橋結 合の開裂前にフルオロクロームで標識されるならば、ＦＡＣ３を使用することが できる。したがって、現在利用できる複数の蛍光検出物は、異なる標識をもった 生物学的材料を選別するために活用することができる。

生物学的材料が標識された後、リンカ−が開裂され、磁力が磁性粒子を吸引し、 そして精製されるべき付着物質が、例証となるべき１つの態様においては、染色 体または小さい細胞小器官が管壁に付着するか、捕集用の溜に入る。例証となる １つの態様においては、標識された材料は、ミクロタイターウェル中でペレット にされ、上清からＩｇの遠心によって精製することが出来る。望ましくない微粒 子は懸濁液中か、または捨てるべき容器の底に残る。Ｂｉｏ　Ｍａｇ分離器（Ａ ｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ、　Ｉｎ５）のような磁石は、磁気分離の ための力を提供する。または、平板組織培養の容器のために、平板磁性分離器（ Ａｄｖａｎｃｅｄ　Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ）がある。

ビオチン−アビジン結合は、標識システムの一例である。非共有結合性のビオチ ン−ストレプトアビジンの相互作用は、強くて安定である（ＫＭ＝４０〜１３） 。染色体上の標識部位からのシグナルを増幅するために、方法か開発されている 。ゴールは、遺伝子を１ｎ−ｓｉｔｕにおいて検出すること、すなわち、それら の染色体上の位置を決めることができることである。コロイド状の金を使用する この工程は、電子顕微鏡のレベルで、染色体上の遺伝子の物理的マツピングのた めに使用された。

コロイド状の金は、標準電子顕微鏡法１ｎ−ｓｉｔｕの反応において、抗体カッ プリング反応がストレプトアビジン−ビオチンの親和性のいずれかによって、標 識ＤＮＡプローブの位置を決めるために使用されるのが普通である。

コロイド状金は高価ではなく、種々の大きさの粒子に容易に調製できる：それは 、電子に対して極度に不透明であり、クロマチンや染色体に副次的に結合しない 。例えば、磁性ビーズが、関心がある部位に特異的に結合することを証明するこ とが必要である場合のように、それは特定の適用についてのみ有用であると考え られるけれども、それは磁気粒子と共に、ブリッジとして使用するこＯＲ）か、 標識手順の分離性を明確にするために使用された。この領域は、１８．　＋２８ ．のリポソームのＲＮＡ遺伝子のうち、約４５０のコピーを含んでいる。１０− ２０倍はどより大きな２番目のＮＯＲの外に、このＮＯＲ染色体を含むＸ、１ａ ｅｖｉｓの細胞系において、両方のＮＯＲ染色体を磁性粒子で標識した。このよ うにして、ここに記述されたプロトコールを使用して、核酸−磁気微粒子複合体 は、マウスの動原体のサテライトＤＮＡのような、典型的な、高度に繰返された 配列に加えて、典型的な中程度の繰返し遺伝子の房を検出することができる。

本発明の迅速で効果的な選別法が利用できると、多くの応用か考えられる。それ によって、ライブラリーの構築やクローニングのような種々の目的のために、大 量の純粋な染色体の産生かできるようになる。それ自体では、正常及び異常な細 胞の過程の両方の解明が容易になる。

本発明の方法によって、ミトコンドリア、葉緑体、及びゴルジ装置のような小さ い細胞小器官を、生化学的解析のために選別することもできるようになる。これ らの材料の宿主細胞、またはベクター中へのＤＮＡの取込みによる形質変換も容 易になる。形質変換には、宿主に、商業的にまたは臨状的に望ましい形質を伝達 することによる重要な応用がある。

本発明の主要な面は、固型の支持体に対するつなぎとめか可逆的なことである。

この面には、それ自身重要な使用法がある。細胞小器官のための可逆的な固定法 は、つなぎとめられた小器官の生化学的活性が保存されれば、商業的応用がある と考えられる。すなわち、センサーのデザインエネルギー細胞、欠失細胞小器官 の置換のための補綴デザイン（例えば、ある神経筋の疾患は、ミトコンドリアの 欠失のためである。適切な固型支持体が利用できれば、スケールを大きくするこ とも可能である。染色体の場合には、この系は、固相の染色体系として考えるこ とができる。そして、それ自体、染色体の選別以外の適用を受けることが出来る 。それは、指示された染色体の修飾のための媒体として使用されることが可能で ある。本質において、それは、染色体が種々の明確化された操作にかけ、次に、 さらなる分析のために回収することを可能にするからである。例えば、修飾され た染色体全体は、細胞の形質変換、そして望ましい形質の導入、または真核細胞 における関心のあるＤＮＡの機能検定として使用されるかもしれない。これは、 分子生物学において未だ満たされたことがない大変重要なニーズである。

改変された染色体は、人工的染色体の構築に使用されるかもしれない。

本発明のその他の目的及び利点は次の詳細な記載を読み、次の図面を参照すれば 明らかになる：図１は染色体とガラス片、例えばカバーグラスのような支持体と の間の可逆的結合を示したものである。

図２は染色体と調整多孔質ガラスピーズ（ＣＰＧ）支持体との間の可逆的結合を 示したものである。

図３は標準の１ｎ−Ｓｉｔｔ＋反応である０、１％グルタルアルデヒドで固定化 し、遊離試薬であるＤＴＴの５０ｍ＋ｎで還元した後の、ガラス固相支持体から 単離、遊離された染色体を示すものである。

図４は０．０３％グルタルアルデヒドで固定化された以外は図面３と同しである 。

図５は０．０１％グルタルアルデヒドで固定化された以外は図面３と同じである 。

図６は、ビオチニル化したＤＮＡプローブ、ストレプトアビジン及びコロイド金 により結合した染色体ＤＮＡと酸化第二鉄間（Ｉ　ＯＯＯｎｍ）間の結合を図式 的に示したものである。

図７はコロイド金で標識した染色体を示す（後述する実施例１の表１に記載され ている反応１を参照）。

図８は図７に示されているように、染色体の中で酸化鉄粒子がコロイド金に結合 している様子を示したものである（表１の反応２参照）。

図９はシグナルが増幅されている染色体を示す。

図１Ｏｉｌｌｌ：？Ｉｌｔ子顕微鏡写真的染色体調製物の１ｎ＝ｓｉｔｕハイブ リット形成法を図式的に示したものである。

図ＩＩは脱離剤、例えばＤＴＴによって支持体から脱離された磁気標識生物学的 材料をペレット化化し、洗浄し、そして精製（選別）する工程を示すものである 。

図１２は磁気標識生物学的材料を採集するのに使用する磁気アフィニティ力ラム を分解して部分的に分けたものを図式的に示したものである。

図１３は種々の量の磁気で標識された染色体を分離採集するために用いられる装 置を具体化したものの断面図である。

図１４はペレット化した生物学的材料を分離するために用いる磁気遠心機、マグ ナフユージである。

図１５は反応３（後述する実施例１の表１）から得られた非反応性染色体につい て行ったエネルギー分散Ｘ線マイクロアナリシスの結果を説明するグラフである 。

図１６は鉄のＫ　及びにβビーク（図面１５参照）をα 説明する反応染色体のエネルギー分散Ｘ線マイクロアナリンスの結果を説明する グラフである。

図１７は本発明に引用された生物学的材料のクラスの１つ、すなわち染色体の大 きさと内部組成を説明するものである　（Ａ）は染色分体の中心軸から放射する ループ状クロマチンファイバーを見せるようにした昆虫（Ｏｎｃｏｐｅｌｔｕｓ ）のを糸分裂染色体の単一染色分体の電子顕微鏡写真である。また（Ｂ）は中期 染色体か高濃度に濃縮される原因と考えられる多くの整列した染色体バッキング を図式に説明したものである。

本発明は種々の変更型及び代りの方式か可能であるが、それらの特定の実施態様 は図面中の実施例によって示されており、またここに詳細に記述する。しかしこ れは本発明を記述された特定の方式に限定するものではなく、反対に、添付の特 許請求に定義されているごとき本発明の精神及び範囲に入るすへての変更、同等 物及び選択物をカバーすることを意図したものであることを理解すべきである。

本発明は非アイソト−プ標識したプローブを１０−５ｉｔｕハイブリツド形成法 に用いて、電子１３１１微鏡レヘルて、種種の配列をを椎動物の中期染色体へ局 在化させるために元来開発された技術（Ｎａｒａｙａｎｓｗａｍｉ　ら、＋９８ ９）を本発明の目的に沿うよう修正したちのである。本発明はこ第１らの技術を 、可逆的固定化、粒子の常磁性標識及び磁力による分離等に基づいて少量の生物 学的材料を分離・単離する新規の方法と結び付けたものである。本発明か適用し 得る生物学的材料としては例えば、染色体、染色体断片、ミドコンドリヤ、葉緑 体、ゴルジ装置及びこれに類したものなとかある。

固定化した調製物を十分洗浄することによって汚染度を減少させることか出来る ことは、懸濁液で行う現在の１ｎ−ｓｉｔｕハイブリット形成法に勝る重要な長 所である。

付着の可逆性はもう一つの重要な態様である。固着することにより、生物学的材 料の内部凝集及びその他の好ましくない相互作用による問題か減少する。

支持体は染色体や染色体断片あるいは小さなオルガネラを固着させることかでき る試薬で処理して調製した。

、−れらの生物学的材料を種々の可逆的架橋結合で被覆したガラス表面に付着さ せ、１ｎ−ｓｉｔｕｚｓイブリット形成反しち形成−、その後強力な還元剤で支 持体から遊離させる（図面ｌ及び２）。

図面ｌは染色体とガラス片、例えばカバークラスの支持体との間の可逆的結合を 示したものである、ＬＹＳは染色体中のりジン残基からの遊離アミン（ＮＨ，） を示す。

Ｓ−８結合はこの説明では、両端て遊離のアミン（ＮＨ２）を認識するＤＴＳＳ Ｐで示されている。シランはガラスの固体支持体に遊離のアミンを与え、Ｓ１０ ．の結合どして示されている。

図面２は染色体と調整多孔質ガラスピーズ（ＣＰＧ）の支持体との間の可逆的結 合を示したものである。Ｌ　ＹＳは染色体中のりジン残基によって供給される遊 離アミノ基（ＮＨ２）を示している。Ｓ−８結合はこの図においては、一端てＳ Ｈを他端て遊離のアミンを認識する５ＰＤＰによって与えられる。このバンドは 遊離剤（例えば５０ｍＭ　ＤＴＴ）によって遊離可能な開裂性ジスルフィド結合 である。遊離アミン（ＮＨ，）はＴｒａｕｔ試薬によってスルフヒドリル基へ変 換される。ＬＣＡＡは支持桁へ遊離のアミンを供給する長鎖のアルキルアミンを 示す。調整多孔質ガラスピーズ（ＣＰＧ）の固体支持桁は５ｉｎｓの結合として 示されている。

還元剤は反応した生物学的材料から標識したプローブを分離しない。可逆的クロ スリンカ−（ＤＴＴＳＰ／５ＰＤＰ）は染色体をガラス支持体に固着させるため に使用される。固着した染色体は変性剤による分解から守るために固定されなけ ればならない。グルタルアルデヒドのような非可逆的クロスリンカ−が生物学的 材料の安定性を増す為に陽性固定液として一般に用いられている、染色体の場合 には、後−固定によって導入される架橋結合の数か本方法を実施中の染色体の結 合性の維持に直接関係していることか判明した。種々の異なった生物学的材料に 対する可逆的クロスリンカ−及び非可逆的後−固定液の反応時間及び濃度を最適 にするために一連の滴定を行う。

０．１％、０．０３％及び０．０１％のグルタルアルデヒドでの後−固定、標準 １ｎ−ｓｉｔＵ反応、及び遊離剤である５０ｍｍ　ＤＴＴで還元後にガラス固相 支持体から単離・遊離された染色体の形態を図面３−５に示す。染色体は形態学 的に０．１％グルタルアルデヒドで後−固定を行うのが最適である。

！ｎ−５ｉｔｕハイブリッド形成反応時に平面ガラスを固体支持相として染色体 の可逆的付着に使用することは、染色体の選別及び単離においである程度使用が 制限される。

染色体より孔径か小さい調整多孔質ガラスピーズは、染色体の支持体との接触表 面積が少なく、したかって脱離剤、例えば染色体を分離するのに必要なりＴＴの 反応時間及び濃度か少なくてすむので好ましい。細孔の存在はまた試薬が架橋へ 接近し易くするのかも知れない。

染色体の調製はＮａｒａｙａｎｓｗａｍｉら（１９８９）の方法にわずかに変更 を加えて行った。これらの方法はまたＭｉｌｌｅｒ　（１９６９）によって提案 された方法を改変したものてあった。１例の実施例においてはマウスのＬ９２９ 細胞を５０−８０　ｎｇ／ｍｌのコルセミド（Ｇｉｂｃｏ）で−晩増殖を停止さ せた。有糸分裂周期の中期にある細胞を培養基の底部へ振り落して集め、０．５ ％Ｎｏｎ１ｄｅｄ　ｐ４０の存在て細胞を溶解した。室温で１分後、染色体懸濁 液は１５ｍ１のファルコンチューブのキャップ中、ｐＨ約８で１Ｍシュクロース 上に層をなした。キャップには、あらかじめシラン化され（次の項参照）そして チオール開裂性架橋試薬ジチオビスースルファサクシンイミジルブロピオネー１ −　（ＤＴＴＳＰ）で前固定されたガラスのカバーグラス含んでいた。調製物を Ｎａｒａｙａｎｓｗａｍｉら（１９８９）の方法にしたがって遠心した。カバー グラスをマイクロ遠心機から取り出し、０．４％Ｋｏｄａｋ　Ｐｈｏｔｏｆｌｏ 　２００（ｐＨ約８．５）で短時間洗浄した後、クロスリンカ−を除去するため に、２ＸＳＳＣ１１５０ｍＭグリシンで約５分間洗浄した。調製物は使用溶液で 湿めらせた状態で保存した。

２、細胞オルガネラ 細胞オルガネラの単離は、細胞溶解液を調製し、これを磁気粒子上へ固定化した 適当な同族体抗体（すなわち葉緑体の膜蛋白）と反応させ、磁界でオルガネラを 回収する。

オルガネラを集めるためには、細胞またはプロトプラストを物理的破壊又は等張 破壊によって単離用バッファー中へ溶解する。このバッファーはオルガネラ及び 細胞の種類にしたかって適当なものを選択する。葉緑体分離用の適切なバッファ ーの一例はＧｒｕｉｓｓｅｍら（１９８３）によって記載されている。オルガネ ラの粗調製物は分画遠心によって調製することができる（　Ｃａｓｈｍｏｒｌら （１９８４）参照）。粗オルガネラベレットを、１５ｍ１のファルコンチューブ のキャップ中に入れた当該オルガネラに適切になるように調整された濃度のパー コール液のクッション上に層状となる。キャップにはガラスのカバーグラスがシ ラン化され、ＤＴＳＳＰで前固定されたものが含まれており、遠心するとオルガ ネラはガラスの表面に固定される。

カバーグラスのシラン化及び前固定 典型的な実施例においては支持体はカバーグラスであった。直径約１ｍｍの酸洗 浄した円型のガラスのカバーグラスを、その表面にアミノ基を付けるために、Ｎ −（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトオキシシラン（Ｐｉｅｒ ｃｌ）で処理した（図面ｌ）。カバーグラスを室温で１時間、新らしく調製した １ｍＭ　ＤＴＳＳＰ（Ｐｉｅｒｃｌ）　、’　２　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃで前固定した 。（方法の項参照） 染色体の固定化（固着） 生物学的材料を可逆的に固定あるいは固着させるために、支持体を可逆的クロス リンカ−で処理した。説明するための実施例ではＰｉｅｒｃｌ社の明細書にした がって、ガラス表面をＮ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメト オキシシランで被覆した。シランは官能アミノ基を与え、これはチオール開裂性 架橋剤ジチオビスースルホサクシンイミジルブロビオン酸（ＤＴＴＳＰ）による 反応を受けることができる。（Ｓｔａｒｏｓ、ｌ　９８２）（図面１）。細胞溶 解物からの染色体は標準的な方法（Ｒａｔｔｎｅｒ　ａｎｄ　Ｈａｍｋａｌｏ、 １９７８　）によってスクロースでペレット化され、染色体蛋白のアミノ基と結 合したＤＴＳＳＰとの反応によってこれらの調製された表面へ付着する。染色体 が分解しないようにグルタルアルデヒドでの後−固定か必要であったが、１ｎ− ｓｉｔｕハイブリッド形成反応をビオチニル化プローブを用いてこれらの調製物 上で実施しく図面６）、目的とする配列の検出は標準抗体サンドイッチ増幅法（ Ｎａｒａｙａｎｏｗａｍｉら、１９８５）、続いてコロイド金（を子穎微鏡の場 合）（図面７）、又は磁場での選別の場合には磁気的に反応するビオチニル化酸 化第二鉄粒子（図面８）で行った。シグナルは増幅された（図面９）。

図面６はビオチニル化（Ｂ）ＤＮＡプローブ７２、ストレプトアビジン（Ｓ　Ａ ）及びコロイド金（ＡＵ）による染色体ＤＮＡ７０と酸化第二鉄７４（ｌｏｏｏ ｎｍ）間の結合を図式的に示したものである。これらの反応のｋｍは１０−１２ 〜１ｏ−１５の範囲内である。

図面７にはコロイド金で標識した染色体が示しである（後述する実施例１の表１ 中の反応ｌを参照）。標識７６はセントロメア領域に見られる（セントロメアは 各染色体の一次狭容である）。この位置は核酸プローブのハイブリッド形成特性 と一致する。

図面８には、図面７で説明したように染色体中で酸化鉄粒子かコロイド金７８に 結合している状態か示しである（表１の反応２参照）。

図面９はシグナルか８０倍に増幅された染色体を示している。セン１−ロメア領 域での組成物の析出によって正の反応か証明される。この反応（表１の４を参照 ）は立体障害の問題を提出した。

標識染色体は、クロスリンカ−中に存在するジスルフィド結合を開裂する５０ｍ Ｍ　ＤＴＴとインキュベ−１・することにより固体表面から遊離され、電子顕微 鏡によりこれらは形態学的に無傷であり、特異的に標識されていることか判明し た。酸化第二鉄標識染色体はその後磁界において選別された。これらのメカニズ ムは図面ｌＯ１尼子顕微鏡写真染色体調製物の１ｎ−ｓｉｔｕハイブリット形成 反応の図式的説明に図式的に示されている。スライド板上のす・＼ての全中期染 色体がビオチニル化ＤＮＡプローブ９２とハイブリットを形成した。プローブの 検出は一次抗ヒオチン抗体１００、続いてコロイド金に結合した二次抗体又は磁 性粒子１０２に結合した二次抗体で行−）だ、マウスサテライトＤＮＡ９０はビ オチン−ｄＵＴＰ９２によって標識ＤＮＡ９４を生成するように翻訳されたニッ クであった。このＤＮＡは電子顕微鏡グリッド９６十でマウス染色体調製物とハ イブリッｌ−を形成した。

その結果−組の標識染色体９８を生成した。ハイブリッド形成ビオチン標識プロ ーブを次にウサギ抗ビオヂン［ｇＧ（抗体）に結合させた。電子Ｗｉ微鏡で見え るようにするため、コロイド金を、ハイブリッド形成ビオチン−マウスサテライ トＤＮＡ　Ｉ　０２の部位でウサギ抗体に結合する二次抗体（ウサギに対して免 疫したヤギ又はヒツジ）で標識した。代りにコロイド金は標識Ｆｅ５０４１　ｏ 　２て置換された。これは申請した本発明か理論通りに反応したことを示すもの である。

１ｎ−３ｉｔｕハイブリッド形成法 １ｎ−ｓｉｔｕハイブリッド形成は染色体についてＮａｒａｙａｎｓｗａｍｉら （１９８９）か報告した方法に基本的には従かって行った。染色体か付着してい るカバーグラスを２ＸＳＳＣ中０．１％グルタルアルデヒドで２０分間室温で固 定し、続いてｐＨ１２の２ＸＳＳＣ中で約１０分間変性させた。実施例の１例で は、調製物のハイブリッド形成は次の組成のハイブリッド形成用バッファー中で ３０°Ｃ，１晩行った、すなわち５０％ポルムアミド、１０％デキストランサル フエ１へ、１　ｍＭ　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　Ｎａ　２塩、１０ｍＭトリス（約ｐＨ７ ，６）、０．２％フィコール、１ｍｇ／ｍ１ＢＳＡ、４０　ｕ　ｇ／ｍｌ　Ｅ、 　ｃｏｌｉ　ＤＮＡ、０．６　Ｍ　ＮａＣ１，４ｎｇ／ｍｌ変性ビオチニルマウ スサテライトＤＮＡを含むハイブリット形成用パンファーを使用した。ハイブリ ットを形成しなかったプローブは調製物を２ＸＳＳＣ中で各２０分間ずつ室温で ３回洗浄して除去した。

表１　（下記の実施例１）は本発明者らか、８つの別々の反応で実施した団−５ ｉｔｕハイブリット形成反応の一例を示したものである。プローブはすへて細胞 系Ｌ９２９からのものであり、ビオチニル化したサテライトＤＮＡであった。Ｄ 　Ｎ　Ａに共存結合した蛋白は右欄に記載されビオチニル化酸化第二鉄粒子て標 識する前に調製物を順次、ウザギ抗ビオチン抗体（ＥＮＺＯＢｉｏｃｈｅｍｉｃ ａｌｓから購入）、ビオチニル化ヤギ抗ウサギ抗体（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎ ｏｒｅｓｅａｒｃｈから購入）、及び２μｇ／ｍｌストレブトアヒシン（Ｂ　Ｒ Ｌ　）とインキュへ一トシた。抗体インキュベーションはＰＢＳ、０．５　Ｍ　 ＮａＣ１，２ｍｇ／ｍｌヌクレアーゼ不含ＢＳＡ　（ＢＲＬ）中で、湿った大気 中３７°Ｃ１２時間行った。ストレプトアビジンインキュベーションも同一バッ ファー中で実施したが、室温て２時間であった。調製物は酸化第二鉄、コロイド 金、又は両者で標識された。コロイド金と酸化第二鉄の両者で標識された調製物 については、最終のストレプトアビジン中でのインキュベーションの代りに、Ｎ ａｒａｙａｎｓｗａｍｉら（１９８９）によって報告されているように、ストレ プトアビジン−２０ｎｍコロイド金中でｌ晩インキュへ−１−シた。その後１記 に示すように酸化第二鉄で標識した。一部の少数の調製物は２０ｎｍのコロイド 金のみて標識した。この標識は、ハイブリットを形成した調製物を最初にウサギ 抗ヒオチン抗体と上述のように３７°Ｃて４時間反応させ、次いて２０ｎｍヤギ 抗ウサギコロイド金で１晩標識することによって行った。生物学的物質は下記の ようにして支持体から分離した。

磁気粒子での標識 生物学的材料を標識するためにビオチニル化第二酸化鉄粒子を使用した。これら 粒子の平均直径は５０．５μｍで、平均直径３μｍの市販の磁気粒子より小さく 、また、Ｄｕｄｉｎ　（＋　９８８）が用いたものより小さかった。

Ｂａｎｇｓ社のこの大きさの小さな粒子を販売している。この小さなサイズがよ り接近しゃすくし、したがって大きい粒子より標識をより効果的にした。マウス のＬ９２９細胞の染色体をマウスセン１−ロメアサテライｌ−Ｄ　Ｎ　Ａで標識 した実験において、小さな粒子で標識された染色体の割合をコロイド金で標識さ れた割合と比較した。本発明者らは磁気標識はコロイド金標識の８０％になるこ とを発見した、したかって磁界での分離によって調製物がら当該生物学的材料の がなりの部分を回収することが可能である。

■実施例においては常磁性標識をするために酸化第二鉄粒子を使用した。ビオチ ニル化した酸化第二鉄粒子懸濁液１０ｍ１を使用前４８時間転倒させ、４°Ｃで 粒子を沈降させた、平均直径０．５７１ｒｎの粒子を含む上部２ｍｌの懸濁液を 採り、ＰＢｓノリファーで２倍（＋／２）に希釈した。多ウェル組織培養板（Ｆ ａｌｃｏｎ２４ウェル組織培養プレート、１ｎｔｅｒ　ｌｉｄ、　Ｂｅｃｔｏｎ 　−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ　Ｃａｔ　＃　３０４７）の１個のウェルに１ｍｌずつ の酸化第二鉄懸濁液を入れて、その中にカバーグラス１個ずつを入れた。カバー グラスとほぼ同じ直径の円型磁石（Ｓｏｕｍａｉｕｍコバルト）を各調製物の下 に置き、酸化鉄粒子をカバーグラスに均一に被覆させた。磁石をその場において 調製物を室温で１晩インキユベートした。翌日、カバーグラスから不結合の酸化 第二鉄を除くため磁石を調製物の上部に置いた。

カバーグラスを多ウェル板から取り出し、不結合酸化第二鉄を除去するため、Ｐ ＢＳ中で、室温で各２０分間ずつ３回洗浄した。

染色体の分離 酸化第二鉄標識調製物を室温で２〜３時間５０ｍＭＤＴＴ、２ＸＳＣＣ中てイン キュベートした。実施例では染色体をピペットで強く吸い上げで分離し、上清は 回収し、染色体は４０×接眼レンズと位相差顕微鏡を用いて、あるいは電子顕微 鏡（ＥＭ）で観察した。電子顕微鏡を使用する場合には、分離した染色体をＮａ ｒａｙａｎｓｗａｍｉら（１９８９）の方法にしたがって、１Ｍスクロースクッ ションを通してＥＭのグリッド上に遠心するか、又は染色体は酸化第二鉄て標識 されているので磁石でペレット化した（図面１１．１２）。電子顕微鏡法はＪＥ ＯＬ　１００Ｃ電子顕微鏡を用い８０ＫＶて操作した。

磁気ラベルした生物学的材料を脱離剤、例えばＤＴＴｌｏｏを用いて支持体から 分離した後、これをペレット化、洗浄、精製（選別）の操作の各段階を図面１１ に示す。磁気ラベルした生物学的物質をペレット化するために、マイクロ滴定ウ ェル１１４の下に磁石１１２を置く。

上清１１６は取り除く、ベレット１１８はその後は容易に再懸濁され易くなる。

磁界での選別 図面１２．１３は磁性化した生物学的材料を選別するために使用するカラムを示 したものである。（図面２は少量に適した方法を示したものである）。図面１２ は磁気ラベルした生物学的物質を採集するのに使用される磁アフィニティ力ラム を分解して部分的に分けた図を図式的に示したものである。洗浄バッファーを漏 斗２ｏ及びチューブ２２に通す。ペレット化した生物学的材料３４をバッファー を満したカラム２８の上端に置く。わずかに磁性化した粒子でもカラム２８を通 って移動し、磁石３０に隣接したカラムの内面に付着することができるように、 バッファーの流れをクランプ２４及び皮下注射用針２６で、ゆっくりと流れるよ うに調節する。磁石３０はチューブ２８の外側に付ける。非磁性粒子がカラムを 通過した後、磁石を取りはずし、磁気ラベルした画分を３２にあるチューブから 洗い出して採集する。

図面１３は磁気ラベル量の異なる染色体を分離採集するために使用する装置を具 体化したものの断面図である。

銅線を付けたドーナツ型の電磁石があり、チューブの各下降段階で誘導される磁 界に比例して回転する。磁性化した生物学的物質を含む懸濁液の流れる方向は上 方４８である。磁界は〔■〕　（示されておらず）に取り付けた調製可能な変圧 器（Ｖａｒｉａｃ電力供給）によって調製可能である。磁界の上部と下部にねじ ４９で固定したジヨイント４２かある。これらのジヨイントは採集スクリーン４ ４に接近できるようになっている。採集スクリーン４４が各磁化率レベルにある 数本で採集チューブ４６の内側を通っている。少なくても１本は通す積りである 。これらのスクリーンはステンレスであり、そのため磁性を帯びる。ステンレス 製採集バスケット（本発明の範囲内に入る、スクリーンの好ましい実施態様は２ ０００μｍのステンレスかＦｅＯ２網である。採集用管材料はシリコン化されて いるか又は粘着性を防止する処理かなされている。■はｖａｒｉａｃ付属品を示 す（示されておらず）。

図面１４はマグナフユージの図を示しており、これはペレット化された生物学的 物質を分離するのに使用する磁気遠心機である。時計の逆廻りをする銅線５０は 「レール・ガン効果」を生じ、ｖａｒｉａｃ−バスケット（Ｖ）によってコント ロールされた誘導磁界に比例した力によって染色体をペレット化する。バスケッ ト上部の寸法は採集スクリーン４４（図面１３）を支えるように作られる。

磁性化される生物学的材料は５２へ脱離され、磁力が切られた後に細孔５４を通 って出てくる。移動方向は下向実施例１：マウス染色体の固定と単離 マウスＬ９２９細胞系からは多量の染色体が容易に得られるので、この細胞の染 色体系を固定化法の効果を評価する実験に使用した。マウスサテライトＤＮＡを 試験配列として、標識法の効果を調べるために使用した。その理由はＹのセント ロメアを除いてマウスのセントロメアはすべてこのプローブで強くラベルするか らである（Ｐａｒｄｕｌ、　Ｇａ１ｌ、ｌ　９７０　）。

マウス染色体からのセントロメアサテライドＤＮＡを、種々の磁性粒子の結合能 力を調へるための一連の反応においてプローブとして使用した。表１の一連の反 応結果か各種の磁性粒子組成の結合能力を示している。

表１．１ｎ−Ｓｉｔｕハイブリッド形成実験１、Ｌ９２９　ｓａｔ　ＤＮＡ−ビ オチン−３ｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ　ｇｏｌｄ　（１０ｎｍ）２、　Ｌ９２９　 ｓａｔ　ＤＮＡ−〃−ＳＡ　ｇｏｌｄ　（１０ｎｍ）−ｂｉｏｔｉｎｂｉｏｔｉ ｎ　ＦｅＪａ ４、Ｌ９２９　ｓａｔ　ＤＮＡ−ビオチン−Ｒ（ＺＲ−ｂｉｏｔｉｎ−ＳＡ　（ ｎａｋｅｄ）−ｂｉｏｔｉｎ　Ｆｅ５０４ ５、　Ｌ９２９　ｓａｔ　ＤＮＡ−〃−Ｒαｂｉｏｔｉｎ−ＧａＰ　ｇｏｌｄ　 （１５ｎｍ）６、　Ｌ９２９　ｓａｔ　ＤＮＡ−〃−Ｒａ　ｂｉｏｔｉｎ−Ｇ（ ＺＲｇｏｌｄ　Ｐｅ５ｏ４７、　Ｌ９２９　ｓａｔ　ＤＮＡ−〃−Ｒａ　ｂｉｏ ｔｉｎ−Ｇａ　ｂｉｏｔｉｎ−Ｒαｂｉｏｔｉｎ−ＧａＰ　Ｆｅａｓ４ ８．　Ｌ９２９　ｓａｔ　ＤＮＡ−〃　−Ｒα　ｂｉｏｔｉｎ−Ｇ（ＺＲ−ｂｉ ｏｔｉｎ−ＳＡＧαＲｂｉｏｔｉｎ−Ｒα　Ｆｅ５Ｏ４Ｇａ　＝　Ｇｏａｔ　ａ ｎｔｉ− すべての染色体のセントロメアでシグナルが現われ、低周波の場合の検出を可能 にした。染色体スプレッドを調製するためにコルヒチン処理したマウス上９２９ 細胞を使用した（これはＭｉｌｌｅｒ　（１９６９）によって報告された方法の 染色体を変更するものである；　ＨａｍＫａｌｏら、１９７８も参照のこと）。

対照として反応Ｉ　（表１）がコロイド金反応を目に見えるようにするために注 目された（図面７参照）。反応２は酸化鉄粒子をコロイド金に結合させたか（図 面８参照）低周波ててあった。反応４はシグナル増幅に用いられるスキムであり 、立体障害について問題を提出している。すなわちり　、５００ｎｍ（０，５ミ クロン）　Ｆｅａｒ４粒子によって検出されるためにシグナルは増幅される必要 かあるか：２）シグナルの増幅はシグナルの周波数を増加するか、ｌ）に対する 答えはノーである。２）に対する答えはイエスである、正の増幅された反応生成 物かセン１−ロメア領域で観察された（図面９）。

反応生成物はエネルギー分散Ｘ線マイクロ分析によって鉄であることか明らかに 判明した。図面１５は反応３（表１）の反応しなかった染色体について行ったエ ネルギー分散Ｘ線マイクロ分析の結果を示したグラフである。この分析において 電子線か分子と相互反応し分子に特徴的なＸ線を発する。Ｌ及びＫは電子殻を示 す。Ｌα、Ｌβビーク（左側）及びにα、にβ（右側、共に肩になっている）は 金（Ａｕ）に対するものであり、ＥＭグリッドから検出される。鉄は存在しない 。金に対するＬα、Ｌβビーク（左側）及びにα、にβ（右側で共に肩）はＥＭ グリッドから検出される。検出可能な鉄は存在しない。図面１６は反応した染色 体のエネルギー分散Ｘ線マイクロ分析の結果を示すグラフであり、鉄のにα及び にβのピークを示している（図面１５も参照）。したかって磁性粒子ての標識は 達成された。

超コイル染色体構造に基づいて予期された立体障害の証拠は認められなかった（ 図面１７）。図１７は本発明に関係する生物学的材料のクラスの１つ、すなわち 染色体の大きさと内部組成を示すものである・（Ａ）はループ状条色質繊維を現 わすように処理した昆虫（Ｏｎｃｏｐｅｌｔｕｓ）からの分裂染色体の単一染色 分体の電子マイクログラフであり、染色分体の中心軸から発する。（Ｂ）は高密 度中期染色体のちととなると予想される多くの染色体バッキングの目を図式的に 示したものである。ＤＮＡ二重らせんの短い領域か１２０に説明されており、「 ストリング上のヒース」　１２２に詰まっている。３０μｍの染色質繊維は詰ま った染色休校１２４から成っている。伸びた型１２６では、染色体は長いひも状 に見え、中期に密集しており光学顕微鏡１３０て見える。（Ａｌｂｅｒｔら１９ ８９を改良）。

実施例２．マウス−ヒトハイブリッド細胞系からヒト染色体の分離、選別 特定の染色体を選別し、そして選別された調製物の純度を測定するために、マウ スーヒ１−ハイブリット細胞系を用いた。この系は天然の単一ヒト染色体Ｎｏ、 　Ｉを含んでいる。細胞は分裂か停止にしており、中期細胞を選択的脱離によっ て採集し、染色体調製物を実施例１と同様にして固定した。固定後染色体をヒト サテライｌ−１１１に対するプローブ（Ｃｏｏｋ、　Ｈｉｎｄｌｅｙ、ｌ　９７ ９　）でラベルした。

これは染色体Ｎｏ、　ｌの９アーム上、中心周囲の位置に大きな塊りとしてあら れれる。サテライトＩＩ＋自身はいくつかの染色体に存在するか（Ｃｏｏｋ　ａ ｎｄ　Ｈｉｎｄｌｌｙ、　＋　９７９　）、染色体Ｎｏ、　Ｉのセントロメア領 域に特異的にハイブリッドするアルフィーイトの繰り返しが確認されており（Ｗ ａｙｅら、１９８７、及びＮａｒａｙａｎｓｗａｍｉら、未発表）１したがって 細胞ハイブリット及び二倍体ヒ１〜組織からの染色体Ｎｏ、　１の選別か可能に なる。磁気的に分離した調製物中のバイブリア＋−は抗体サンドイツチ法の後ビ オチニル化酸化鉄との反応によって検出された。染色体は図面１１に示すごとく 磁界中で選別された。選別された染色体について形態学的な変化及びマウス染色 体による汚染（形態か異なるので容易に区別できる）かないかとうかについて光 学顕微鏡により検査した。染色体ＤＮＡの分子量を測定するためにゲル電気泳動 を用いた。最後に、ヒト染色体Ｎｏ、　Ｉか選別されたことを確認するため、選 別染色体からのＤＮＡをプロッティング及び適当なプローブ（すなわちサテライ １−１ｎとのハイブリッド形成試験にかけた。

この実施例は磁性粒子をラベルして染色体Ｎｏ、　Ｉを単離する選別の容易さを 示すものである。

実施例３：磁性粒子による葉緑体の分離葉緑体ポリペプチドは抗イデオタイブ抗 体と容易に反応し、集録体を異なる蛋白組成によって区別する標識を与える（Ｐ ａｉｎら、Ｉ　９８８）。葉緑体は、染色体に用いられた方法と類似の方法で磁 気をラベルすることができる。最初に葉緑体を支持体に固着させて固定し、次に 抗イデオタイブ抗血清及び５０ｎｍ磁性粒子に結合したヤギ抗ウサギ［ｇＧとイ ンキュへ−１〜する。固定した葉緑体を５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ，ｐＨ７ ，７，０，６６Ｍソルビトールと４°Ｃて１分間インキュベートし、次に同じバ ッファー中で４°Ｃ１３０分間水冷アルデヒド固定液（０，０５％グルタルアル デヒド＋２５％パラホルムアルデヒド）とインキュへ−１・する。ｌ　ＯｍＭ　 Ｎ８４Ｃ１を含むバッフ−ｒ−Ａ　（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ，ｐＨ７， ７，０，３３Ｎ１ソルピ１−−ル、４０ｍＭＫＯＡ、２　ｍＭ　Ｍｇ（ＯＡＣ） ２）及びバッファーＡ＋２％ＢＳＡ　（ウシ血清アルブミン）で洗浄した後、ザ ンブルを脱補体抗イデオタイブウサギ抗血清（１：５００）とバッファーＢ（バ ッファーＡ１１％ＢＳＡ、１ｍＭフェニルメチルスルホニルフロライＦ（ＰＮ５ Ｆ）中で室温で２時間インキュベートし、洗浄後バッファーＢ中でヤギＩｇＧ（ １００μｌ−１）とインキュベートする。サンプルを上記と同様に洗浄し、必要 ならばコロイド金に結合したヤギ抗ウサギＩｇＧ　（Ｉ　ＯｎｍＳｌ　：５０、 Ｊａｎｓｓｅｎ）とインキュベートする。サンプルをバッファーＡで洗浄し、０ ．３３Ｍソルビトールを含むｋａｒｎｏｖｓｋｙのアルデヒド固定液に１時間浸 し、オスミウム酸で１時間染色し、ウラニル酢酸で２時間染色後、報告（Ｋａｎ ｗｏｒ、Ｙ、Ｓ、ａｎｄ　Ｆａｒｇｕｈａｒ、Ｍ、Ｇ、、Ｊ、Ｃｅ１１．　Ｂｉ ｏｌ、。

８１　：１３７−１５３　（１９７９））のようにエタノール濃度を順次高めて 脱水する。

葉緑体を物理的に粉砕して、単離用バッファー（Ｇｒｕｉｓｓｅｍら、１９８３ 、又は５ｃｈｒｅ　ｉ　ｌ　ｉｅｒら、１９８８）中へ溶解する。葉緑体の単離 はＧｒｏｓｓｍａｎら（Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２５７：１５５８〜１５６３．１９８２）によって確立された修件及 び本出願に記載された磁気免疫沈澱法にしたかって行う。選別は磁界で行うこと ができる。

実施例４：ミトコンドリアまたはゴルノ装置の単離。

一般に実施例３の手法に従うが、標識にはゴルノの外側膜蛋白又は膜内外の蛋白 に対する抗体を使用する。

以下は本発明の特異的態様のより詳細なプロトコール！、　好ましくは丸い、そ して直径約１ｃｍのガラス製カバースリップを酸、通常は塩酸中で洗滌した。つ いてカバーグラスを蒸留水で十分に洗滌し乾燥した。

２、　カバーグラスをＰｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ、の方法に従ってシラン 処理した（８１節参照）。

３、　シラン処理したカバーグラスを風乾して使用時まで室温で乾燥した。

４、　カバーグラスをベトリ皿中室温で１時間、１ｍＭジチオビスーサルファサ クシニミジイルブロビオン酸（ＤＴＳＳＰ）（ＺＸＳＳＣ中新規に調製）中、各 カバーグラスをインキュベートすることによって前固定した。ＤＴＳＳＰ溶液は 一般にパスツールピペットでカバーグラスの頂上表面だけに置いた。他の可逆的 クロススリンカー、たとえば５ＰＤＰで置き換えてもよい。カバーグラスか前固 定されている間に組織培養容器がら存糸分裂細胞を収穫した。

Ｂ、染色体調製 ■、　細胞の２Ｔ７５組織培養フラスコを、標準手順、たとえばＬ９２９株でイ ニシエートした。これは約８個カバーグラスを調製するのに十分である。より多 くの細胞が必要なときは４Ｔ７５フラスコを装備してもよい。

フラスコ中の細胞の増殖が約５０％集密化したとき（１００％集密化とは細胞か 増殖して培養容器の底表面全体を覆うことである）、細胞分裂を止めるためにコ ルセミド（５０−８０ｎｇ／ｍｌ　Ｇ　：　ｂｃｏ）を添加し、ついで終夜ある いは２４時間まで３７℃でインキュベートした。

２、　中期２細胞を撹拌してフラスコの底から離して採取した。３回激しく揺す ると通常すべての中期細胞を底面から離すのに十分である。

３、　中期細胞を遠心（２００Ｏｒｐｍ、約１０分）してペレットにし、同じ培 養培地約１ｍｌ巾約２５℃で再懸濁した。この量は経験的に決め、正確さは必要 としない。

４、　カバーグラスを１時間固定してのち（ステップλ４参照）微小遠心チャン バーを装備した。１５ｍ１フアルコンチユーブの透明なキャップを約８．５のｐ Ｈで約１ｃｍの深さまでＩＭのスクロースで満たした。カバーグラスを　−前固 定した側を上にしてスクロース中に浸しチャンバーの上にあげた中央部分の上に 置かねばならない。カバーグラスの上に２〜３ｎｍのスクロースがなくてはなら ない。

この量は経験的に決めればよく正確である必要はない。

５、細胞を約１％Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ　−４０（界面活性剤）中Ｉ＋８８．５付 近で溶解した。パスツールピペットを用いて、約５滴の細胞をガラス試験管中に 置いた。界面活性剤、Ｎｏｎ１ｄｅｔ　Ｐ　−４０の５滴を添加し、細胞と静か に混合させ、ついで室温で１時間インキュベートした。溶解産物をチャンバー中 のスクロースクッション上に層化させ、５ｏｒｖａｌｌ　Ｇ　Ｌ　Ｃ−２８遠心 器またはこれと同等のものの中で、５０ｍ１の揺れるバケツ中室温で３２００ｒ ｐｍ（２５００ｇ）で５分間遠心した。

６、　時計屋の鉗子を用いてカバーグラスをチャンバーから取り去り、スクロー スを取り除くためにｐ）（８，５付近で０．４％ｋｏｄａｋ　ｐｈｏｔｏｆｌｏ ２００中てよく洗った。ＤＴＳＳＰを取り除くためにビーカー中２ＸＳＳＣ，１ ５０ｍＭグリシン（５０−１００ｍ１ｓ緩衝液）中で５分間簡単に洗った。この 時点でカバーグラス上の染色体を４０倍の位相差顕微鏡を用いてしらべた。これ を行うのに、ガラスを覆うのに十分な２ＸＳＳＣ（２〜３滴）をスライド上のカ バーグラス上に置いた。この時点以降ずっとカバーグラスを湿潤状態に保った。

２、“中期”とは染色体が分離可能なように十分明瞭（濃縮化）である細胞周期 のすべてのフェーズを指す。

通常これは前中期から後中期までを指す。

１、Ｎａｒａｙａｎｓｗａｍｉ、　ｅｔ　ａｌ　（１９８９）に従ってハイブリ ット形成用緩衝液を調製した。望みのプローブ（たとえば、ビオチニル化マウス サテライトＤＮＡ）を４μｇ／ｍｌまで添加し、プローブを変性するために１０ ０°Ｃ１たとえば沸騰水中で約５分間加熱した。混合物を氷上で約２分間急速冷 却し、ついで微小遠心器で簡単に遠心して濃縮緩衝液はとんなものでもチューブ の側に持っていくようにした。遠心した緩衝液は使用時まで氷上で保存した。カ バーグラスごとに５０μｌの緩衝液を調製した。

２、　カバーグラスを２ＸＳＳＣ中、新たに調製した０゜１％グルタルアルデヒ ド（ＥＭグレード、Ｐｏ１ｙｓｃｉｅｎｅｅｓ）中て室温で２０分間固定した。

カバーグラスをＯ−１％グルタルアルデヒド、２ＸＳＳＣの２〜３滴で覆い、つ いてペトリ皿中に置いた。

３、　カバーグラスを２ＸＳＳＣ中で簡単に洗った。

４、　カバーグラスをｐＨ１２で２ＸＳＳＣＸＳＳＣ中度０（５０ｍｌの２ＸＳ ＳＣ中１０ＭのＮａＯＨの約１２ｍ）Ｉ、、フォトフロー中で洗い、このあと清 潔なガラススライド上に置いた。

５、　変性したプローブを含むハイブリッド形成用緩衝液５０　Ｉｔ　Ｉを各カ バーグラス上に迅速にピペットで置いた。カバーグラスを湿った箱（湿った紙タ オルを含み、ふたのついた）に移し、終夜（１２−１５時間）３０’Ｃてハイブ リッド形成させた。

６、　カバーグラスをビーカー中のラック内に置いた。

ハイブリッド形成しなかったプローブを取り除くために、２ＸＳＳＣ中（約１０ ０ｍ１容を用いて）室温で約２０分間、それぞれを３回洗った。

Ｄ、ハイブリッド検出 ■、　以下の抗体インキュベーションは、とくに言及しない限り湿った筒中、ペ トリ皿中で、３７°Ｃ２時間ＢＲＬからの２　ｍｇ／ｍ［Ｂ　Ｓ　Ａ　（ウシ血 清アルブミン）　、　０．５Ｍ　ＮａＣｌ、生理的緩衝液、たとえばＰＢＳ中で 実施した。

ストレプトアビジンとのインキュベーションは上述とは異なり室温で実施した。

２、　ビオチン結合酸化第一鉄粒子で標識するために、カバーグラスを１１５０ ０ウサギ−抗−ビオチン中、ついで１　／　５００ビオチン結合ヤギー抗−ウサ ギ抗体、ついて２μｇ／ｍｌストレプトアビジン（ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａ ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で順次インキュベートした。

各インキュベーションのあと、結合していない抗体をすべて除去するために、カ バーグラスを、ビーカー中のラック内で、Ｐ　Ｂ　Ｓ、　０．５　ＭＮａＣ１中 、室温でそれぞれを約１０分間、３回洗った（１回の洗滌に約１００ｍ１ｓ容量 ）。

３、　コロイド状金のみて標識するために、調製物をまず１１５００ウサギ−抗 −ビオチン中で３７°ｃ４時間インキュベートし、ついでＤ２で述べたように洗 滌した。

この手順のあと１／７ヤギー抗−ウサギ−２０ｍｍコロイド状金中で終夜インキ ュベートした。カバーグラスをそれぞれ１％ＢＳＡ緩衝液（１％ＢＳＡ、画分Ｖ ＳＳｉｇｍａ　。

０．９％ＮａＣ１，０，０２Ｍアジドナトリウム、２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ。

ｐＨ８，２）巾で約２０分間３回洗い染色体をＦ節で述べたようにして分離した 。

４、ｍ製物をコロイド状金と酸化第二鉄両方で標識すべきときは、ストレプトア ビジン培養の代わりにストレプトアビジン２Ｏｎｍ金中の終夜標識を行う。つい でカバーグラスを上述のように１％ＢＳＡで洗い、そのあと８節て述へたように 酸化第二鉄中で標識する。染色体をＦ節て述へたようにして分離する。

１、　平均直径約５０ｎｍから２μのビオチン結合酸化第二〇鉄粒子を使用前４ ８時間に約１０ｍ１ｓの緩衝懸濁液を転化して調製しその調製液を４°Ｃて放置 した。懸濁液のＬ部２ｍｌを標識のために使用した。この層をピペットマンて除 去した。

２、醇化第二鉄を使用直面にＰＢＳ中２倍に希釈した。

３、　各カバーグラスを細胞培養ブレート（Ｆａｌｃｏｎ）の月−穴中の酸化第 一鉄懸濁液１ｍｌ中またはふた付きの２４−多重弁穴組織培養プレート（＃　３ ０４７　Ｂｅｃｔｏｎ　−Ｄｉｅｋｉｎｓｏｎ）中に置いｔ、−。プレートをそ のふたで覆った。

４、　小さな丸い磁石を酸化第二鉄粒子かカバーグラスを均等に覆うように弁穴 の下に置いた。ここでの原理は磁気ヒーズと染色体上のストレプトアビジンを磁 石を用いて強制的に接触させて、これら２つのものを結合させるというものであ る。磁石をその場所に残し、カバーグラスを終夜室温に保った。

５、　磁石を井戸式下部から除去して、カバーグラスを含む弁穴−ヒ、プレート のふたの上に置いた。非結合酸化第二鉄を調製物から遊離し、プレートが開かれ たときカバーグラス上の上澄をピペットで除去して棄てた。酸化第二鉄を１　２ ｍＩＰＢＳを有する弁穴中に再び置き、カバーグラスを除去し、つぎにビーカー 中のラッカ内で室温、ＰＢＳ中でそれぞれ約２０分間３回洗った（上述の■、　 カバーグラスをペトリ皿中、室温で２ＸＳＣＣ中５０ｍＭジチオスレイトール（ ＤＴＴ）中で２．５時間インキュベートした。なるべくなら、ＤＴＴの２〜３滴 をカバーグラス上に置く。

２、　支持体から染色体を取りはがすのにパスツールピペットによるはげしい吸 い取り法を用いた。関連する染色体を含む」１澄を除去した。脱離は位相差ＩＩ Ｉ微鏡を用いて４０倍接眼鏡レンズ下でモニターした。電子顕微鏡（ＥＭ）［察 のためにはＲａｔｔｎｅｒ　ａｎｄ　Ｈａｍｋａｌｏ（１９７８）に記載された ように、１Ｍスクロースを通じて染色体を格子上に遠心させるのがよい。

１　制御ボアガラスＬＣＡＡｉの一級アミンを活性スルフヒドリルに変換する。

２、！初の固定化で可逆的クロスリンカ−（Ｓ　ＰＤＰ）のＣＰＧ−ＬＣＡＡ− ＳＨへのカップリングが達成される。

ＳＣｋｍｍｆｆｒｒＵＳＥＤＴｏＧＪＡＶ五ＴｍＥＬＢＪＫＡＯ１Ｅこの連鎖を 切断するのに５０ｍｙｎＤＴＴが使用された５ＰＤＰ反応は染色体を一定数のク ロスリンカ−に結合させ、リンカ−は低濃度のＤＴＴで容易に切断することがで き、したがって染色体の回収はより高くなり、染色体の一体性か保持される。

Ｈ１生物学的材料として染色体を用いるＤＴＴＳＰ反応１、　カバーガラスのシ ラン処理 ａ、ＩＭ）（ＣＩで洗滌 す、蒸留水で洗滌−約３回 Ｃ１乾燥アセトンで洗滌−約３回 ｄ、約２時間還流−Ｐｉｅｒｃｅ＃　８０３７９て終夜Ｎ−（２−アミノエチル ）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン； これを乾燥アセトン中で２５％（Ｖ／Ｖ）に調製する ｅ、乾燥アセトンで洗滌−約３回 ｆ９品質保証のための遊離アミンの検出は１％フルオールアルデヒド〔これはＯ −フタルアルデヒド−Ｐｉｅｒｃｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　＃　２６０１ ５　）を用いて蒸留水中で実施し蛍光計で読み取る。

２、　遊離アミンを下に図示したようにガラス（およびＰｅ５ｏ４粒子）に供給 される： ３、　遊離アミンを提供するデリバタイズされたガラスを以下のようにＤＴＳＳ Ｐと反応させる：本発明は種々の修飾および代わりの形（こすること力（できる が、それらの特異な態様は図の中の例とし）う方法で示されており、そこで詳細 に記載されている。しかし、本発明を開示された特定の形に限定しようと意図し ているのではなく、反対に、本発明は添付した特許請求の範囲により定められる 発明の精神と範囲内に入るすべての修飾、同等のもの、および代わりのものをカ バーすべきものであることを理解すべきである。

浄書（内容に変更なし） 染色体 の　の　Ｃ／）Ｃ／）　の　の ）”　）−：＞　）−）−）− 一一一一一 ガラス 染色体 Ｃ１１の　の　の　の　の　の　の ＞＞＞　Σ　と　＞　＞　Σ −−−」−一一」 制御ボアーカラスビーズ 圃り。・ど（ 特表千６−５１０３６３　（１９） 「吻。ｙ 「５回。ａ 圃かっ 圃り。羽 Ｆ物。柵 「駒。詣 は吻啄３ 補正書の写しく翻訳文）提出書（曲法第１８４条の８）平成　５　年　４　月　 ３０　８目

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．以下のことから成る生物学的原料の分離のための方法： 支持体に生物学的材料をつなぎとめる；上述の原料に結合可能な生物学的材料結 合組成で生物学的材料を標識する； 生物学的材料結合組成物を磁性粒子と結合させる；標識した、磁化生物学的材料 を支持体から遊離させる；そして 遊離させた材料に磁力を適用する。
2. ２．そこでの生物学的材料が染色体またはそのセグメントから成る、請求項１の 方法。
3. ３．そこでの生物学的材料が細胞オルガネラから成る、請求項１の方法。
4. ４．そこでの細胞オルガネラが葉緑体から成る、請求項３の方法。
5. ５．そこでの生物学的材料に結合可能な組成物が核酸プローブから成る、請求項 １の方法。
6. ６．そこでの生物学的材料がポリペプチドから成り結合組成物がポリペプチドに 対する抗体から成る、請求項１の方法。
7. ７．そこでのつなぎとめが生物学的材料と支持体の間の二機能性の化学的クロス ーリンクから成る、請求項１の方法。
8. ８．そこでの支持体が生物学的材料を支持体に取り付けるシラン処理表面、生物 学的材料と支持体間をクロスリンクする切断可能なクロスーリンク剤、および磁 気的に標識した生物学的材料を支持体から離す遊離剤から成る、請求項７の方法 。
9. ９．シランＮ−（２−アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン 、チオール−切断可能クロスーリンク剤ジチオビス−サルファサクシニミジルプ ロピオン酸（ＤＴＳＳＰ）、および遊離剤ジチオスレイトール（ＤＴＴ）から成 るものとしてさらに定義された請求項８の方法。
10. １０．そこでのチオール−切断可能クロスーリンク剤がＳＰＤＰから成る、請求 項９の方法。
11. １１．そこでの支持体がガラス製カバーガラスから成る、請求項１の方法。
12. １２．そこでの支持体が制御ポアーガラスビーズ（ＣＰＧ）から成る、請求項１ の方法。
13. １３．そこでの制御ポアーガラスビーズが長鎖アルキルアミンリンカーアームに 付著している、請求項１２の方法。
14. １４．そこでの支持体がポリマービーズから成る、請求項１の方法。
15. １５．そこでのポリマービーズがオリゴペプチダーゼで処理され、そのオリゴペ プチダーゼはそれぞれ切断可能なアミノ基中で終わる、請求項１４の方法。
16. １６．そこでの結合組成が標識体から成る、請求項１の方法。
17. １７．そこでの標識体がビオチン結合蛍光マーカーから成る、請求項１６の方法 。
18. １８．そこでのプローブが特定の染色体の動原体領域のユニークな繰り返し配列 にハイブリッド形成することができる、請求項５の方法。
19. １９．そこでの磁性粒子が酸化第二鉄粒子から成る、請求項１の方法。
20. ２０．そこでの磁性粒子の直径が５０ｎｍから１０μである、請求項１９の方法 。
21. ２１．そこでの粒子の直径が５０ｎｍから２μである、請求項２０の方法。
22. ２２．そこでの磁性粒子がコロイド状金から成る、請求項１の方法。
23. ２３．以下のことから成る、小さな生物学的材料を分離する方法： 支持体上の、小さな生物学的材料を生物学的材料に付着し得る結合組成で標識す る； 標識した材料を磁性粒子標識物と結させる；そしてその結果結合した材料を磁気 的に分離する。
24. ２４．そこでの生物学的材料が染色体から成り結合する組成物が核酸プローブか ら成る請求項２３の方法。
25. ２５．そこでの生物学的材料が蛋白質から成り結合する組成物がその蛋白質に対 する抗体から成る請求項２３の方法。
26. ２６．そこでの小さな生物学的材料がその材料を可逆的クロスリンカーによって シラン処理支持体上に乗せるという方法で支持されている請求項２３の方法。
27. ２７．以下のことから成る、生物学的材料を支持体に可逆的に付着させる方法： 支持体をヘテロな二機能剤で処理する；生物学的材料をヘテロな二機能剤にリン クさせる；そして 生物学的材料を二機能荊間の結合を切断する。
28. ２８．そこでの生物学的材料が染色体から成る、請求項２７の方法。
29. ２９．そこでの生物学的材料が細胞オルガネラから成る、請求項２７の方法。
30. ３０．そこでの細胞オルガネラが葉縁体から成る、請求項２９の方法。
31. ３１．精製懸濁液を得るための染色体選別の方法で、この方法は以下の操作から 成る： 可逆的リンカーの方法により染色体を支持体につなぎとめる； 染色体と結合可能な組成物と支持体上の染色体をハイブリッド形成させて複合体 を作る； その複合体と磁性粒子を接触させる；染色体複合体を支持体から離す；そして磁 力によって遊離した染色体を選別する。
32. ３２．そこでの結合組成が核酸配列プローブから成る、請求項３１の方法。
33. ３３．そこでの結合組成物が抗体から成る、請求項３１の方法。
34. ３４．そこでの抗体がヒストンに対するものである、請求項３３の方法。
35. ３５．染色体を可逆的に支持体につなぎとめるための方法で、その方法は以下の ことから成る：支持体を調製する； そこで染色体が分離可能な有糸分裂周期の一時期中にある細胞を採取する； 細胞を破壊して細胞性および核の環境から染色体を遊離させる；そして 可逆的クロスリンカーによって染色体を支持体につなぎとめる。
36. ３６．そこでの支持体の調製が支持体をヘテロな二機能性クロスリンク剤で処理 するものとしてさらに定義される、請求項３５の方法。
37. ３７．そこでのクロスリンク剤がシランとしてさらに定義される、請求項３６の 方法。
38. ３８．そこでのシランがＳＰＤＰから成る、請求項３７の方法。
39. ３９．そこでの支持体がガラスから成る、請求項３５の方法。
40. ４０．染色体の標識のための磁性粒子を調製する方法で、その方法は以下のこと から成る： 磁性粒子の懸濁液を層中へ遠心させ、その層は粒子の大きさによって決められる ； 最小の直径をもつ粒子を含む層を除去し；そしてその粒子を緩衝液と接触させる 。
41. ４１．そこでの粒子の直径が約５０ｎｍ−１０μｍである、請求項４０の方法。
42. ４２．そこでの粒子の直径が約５０ｎｍ−２μｍである、請求項４１の方法。
43. ４３．そこでの磁気的粒子が酸化第二鉄から成る、請求項４０の方法。
44. ４４．そこでの磁性粒子がビオチンから成る、請求項４０の方法。
45. ４５．磁性粒子で標識され支持体から遊離したのち磁力によって選別された染色 体またはセグメント。
46. ４６．磁性粒子で標識され、支持体から遊離してのち磁力によって選別された細 胞オルガネラ。
47. ４７．磁性粒子、核酸プローブまたは抗体、および可逆的クロスリンク系から成 る複合体。
48. ４８．懸濁液中の磁気的に標識された生物学的材料を通過させるカラムから成る 装置、上述の生物学的材料を生物学的材料と会合させた磁性粒子を用いてカラム の部分に付着させる方法、および磁化した材料を採取する方法。
49. ４９．懸濁液中の標識した生物学的材料を通過させるセグメントカラムから成り 、磁石の大部分は異なる濃度でカラムの外側に付着して異なる磁場強度から成る 装置、磁気的に標識した生物学的材料が付着しているそれぞれの濃度での採取方 法、および上述の材料を採取する方法から除くための方法。