JPH06510521A - 合成ＣＤｗ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ−１）ペプチド抗原 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】

合成ＣＤｗ５２　（ＣＡＭＰＡＴＨ−１）ペプチド抗原本発明は、ＣＤＷ５２抗 体のアッセイ、精製または誘導に使用できる合成抗原に関する。 モノクローナル抗体のＣＡＭＰＡＴＨ−１フアミリーは大多数のヒトリンパ球お よび単球上に発現される抗原を認識する［１−３．”ＣＡＭＰＡＴＨ−は登録商 標である］、第４回出血球ワークンｎツブにおいて、これらの抗体には暫定的な 名称、ＣＤｗ５２が与えられた〔４〕、この抗原は補体が媒介する攻撃の異常に 良好な標的である［＋、、５］、このような理由からＩｇＭ抗体、ＣＡＭＰＡＴ Ｈ−ＩＭはドナー骨髄から１９７１球を除去して移植片対宿主病を防止するため に広（使用されている［６．７］　。 ＣＤｗ５２抗原はリンパ球性腫瘍の大部分の症例で発現される［８．９］、した がって、ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体によるリンパ腸および白血病の血清療法が試み られてきた。補体および細胞媒介傷害の両者を活性化するラットＩｇＧ２ｂ。 ＣＡＭＰＡＴＨ−Ｉ　Ｇは、このセブティ人グにおいてかなり有効であることが 明らかにされている［９．１０］、最近になって、同じ特異性を有するヒトＩｇ Ｇｌ（ＣＡＭＰＡＴＨ−Ｉ　Ｈ）が遺伝子工学によって構築された［１１］　、 　これは長期にわたって投与することが可能で、むしろより良好な臨床結果を生 じた［１２］　。 すべての分化または腫瘍関連抗原が血清療法において同等に良好な標的ではない ことは明らかであり、何故にＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原がそれ程良好であるかの理 由はまだわかっていない、その豊富な発現［５］および修飾の欠如［２］が多分 関連する因子であろうが、その構造についての知識が有用な手がかりを与えるも のと考えられる。 ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原の約５０％は、グリコリルホスファチジルイノシトール （ＧＰＩ）−特異的ホスホリバーゼＣ（Ｂ、ｔｈｕｒｉｎ　１ｅｎｓｉｓから） による処置で末梢血リンパ球から除去できた［３］、これは、類似の部分抵抗が 他のＧＰＩ一連結抗原でも観察されていることから、その少なくとも一部の抗原 は、多分そのすべてが、ＧＰＩによって繋留されていることを示している［１３ ．１４］　。 ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原は細胞上モジネートからクロロオルム：メタノールー水 系の水相中に抽出することが可能で［３］、ウェスタンブロッティングにより見 掛けの分子量２１〜２８ｋＤの広いバンドとして検出できる。Ｎ−グリカナーゼ 処置により見掛けの分子量は約６ｋＤＩｍ減少するが、抗原性は低下しない、こ の分子は特異性の狭いプロテアーゼの処置には抵抗するが、特異性の広いプロテ アーゼでは抗原性に実質的な影響を与えることなくその見掛けの分子量は減少す る。しかしながら、この抗原は緩和なアルカリによる処置にきわめて高い感受性 を示す［３］ ヒト肺臓からクロロ士ルム／メタノールで抽出した抗原は、ＣＡＭＰＡＴＨ−１ 抗体を用いるアフィニティークロマトグラフィーによってさらに精製できた。 本発明者らは、この精製抗原を研究の出発点として用いて、ＣＤＷ５２抗原のペ プチド骨格の一次構造の特徴を明らかにした。ＣＤｗ５２抗原のペプチド骨格の アミノ酸配列を有する合成ペプチドまたはその抗原性フラグメントはＣＤｗ５２ 抗体のアッセイ、精製または誘導に使用することができる。 したがって１本発明は、配列番号１〜７に掲げたアミノ蟹配列を有するペプチド またはそのペプチドの抗原性フラグメントを提供する。抗原性フラグメントは２ 〜６アミノ酸残基長、たとえば２，３．Ａ、５または６アミノ酸残基長でよい。 このペプチドまたは抗原性フラグメン）・は合成抗原を構成する。このペプチド またはそのフラグメントは、単一のアミノ酸からおよび／または２もしくは３個 以上のアミノ酸残基の予め形成されたペプチドから化学的に合成できる。固相ま たは溶液法が使用できる。 合成抗原は、Ｆ１１単で信額性のあるｓ［ｆアッセイに使用できる。多くのタイ プのアッセイの使用が可能で、たとえば、抗原をプラスチックのミクロタイター プレートにカノブリノグし、抗体の結合を酵素標識抗グロブリンを用いて測定で きる。 合成抗原に甚づくアッセイは、抗体の製造時における品質管理試験に、また患者 血清中のＣＡＭＰＡＴＨ−１抗体レベルの測定に有用である。 したがって２本発明はさらにサンプル中のＣＤｗ５２抗体のアッセイ法において 、サンプルを本発明のペプチドまたはそのフラグメントと接触させ、ついで抗体 が上記ペプチドまたはそのフラグメントに結合したか否かを測定することからな る方法を提供する。この方法は、サンプル中のＣＤｗ５２抗体の検出またはその 抗体量の半定量的もしくは定置的測定に使用できる。 サンプルは血清サンプルでよい、ペプチドまたはそのフラグメントは固体支持体 上に固定化することができる。ＣＤｗ５２抗体のペプチドまたはそのフラグメン トへの結合は、標識抗グロブリンたとえば酵素標識抗グロブリンを用いて測定で きる　この場合、ｅ素の基質の添加が必要になる。アッセイは同時または連続ア ッセイとすることができる。 本発明はさらに。 （ａ）本発明のペプチドまたはそのフラグメント；および（ｂ）使用時に７サノ ブル中のＣＤｗ５２抗体がペプチドまたはそのフラグメントに結合したか否かを 測定するための手段からなる。このようなアッセイへの使用に適当な試験キット を提供する。 他の態様においては１本発明はＣｒｒＷ５２抗体をその粗ブレバレーン１ンから 精製する方法において１本発明のペプチドまたはそのフラグメントを保持する固 体支持体上に粗ブレバレー／Ｗンを通過させ、上記支持体に結合したＣＤｗ５２ 抗体を溶出することからなる方法を提供する。 合成抗原はしたがって、ＣＤｗ５２　（ＣＡＭＰＡＴＨ−１）抗体のアフィニテ ィー精製に使用することができる。たとえば、それを固体支持体上にカップリン グさせ、粗抗体プレバレーシ讐ノをその上に通過させる。抗体のみが結合し、そ れは条件を変えることによりたとえばｐＨのシフトで、溶出させることができる 、したがって、この合成抗原は、より高い親和性を有するＣＤＷ５２　（ＣＡＭ ＰＡＴＨ−１）の変異体の選択に使用できる。２つの相補型のアプローチが予想 できる。いずれも、多数の遺伝子変異体を作成するための多（の様々な系の任意 のものを用い、それらを発現させることによって実現できる。第一に、この新し いアッセイ方法は、母体の抗体が限界の結合を与える条件下低親和性のフラグメ ントを用いて、優れた結合活性をもつ変異体を確認することができる。第二に、 そのアフィニティーカラムであれば、より高い親和性の抗体変異体を発現する細 胞または微生物の直接選択に使用できる。 本発明は、哺乳類動物を本発明のペプチドまたはそのフラグメントで免疫するこ とからなるＣＤｗ５２抗体の製造法を提供する。 さらに、哺乳類動物を本発明のペプチドまたはそのフラグメントで免疫し、免疫 された哺乳類動物からのリンパ系起源の細胞を不死化細胞系の細胞と融合させ。 不死化されたＣＤｗ５２抗体を産生ずる細胞を選択することにより、モノクロ− ナルＣＤｗ５２抗体産生不死化細胞系が１本発明によってａ製される。この選択 されたＣＤｗ５２抗体度生不死化細胞系を増殖させれば、モノクローナルＣＤｗ ５２抗体が得られる。 ペプチドまたはそのフラグメントは、そのペプチドまたはそのフラグメントがた とえばそのアミノ産残基の一つの側鎖を介して適当な担体にカップリングした接 合体として投与することができる。担体分子は通常、生理的に許容される担体で ある。このような接合体も１本発明にその一部として包含される。 抗血清またはモノクローナル抗体の製造には慣用方法が使用できる（Ｘｏｈｌｅ ｒ　＆Ｍｌ　１ｓｔｅｌｎ、Ｎｉ１ｕｒｅ、　２５６．４９５−４９７．１９） ５）、モノクローナル抗体を産生ずるハイブリドーマ細胞は、免疫動物からの肺 臓細胞と腫瘍細胞を融合させることにより製造できる。免疫する哺乳類動物はラ ットまたはマウスでよい、ハイブリドーマは。 培養液中で増殖させるか、腹水を形成させるために腹腔内に、または同種宿主も しくは免疫弱体化宿主の血流に注射することができる。ヒト抗体はヒトリンパ球 のペプチドまたはそのフラグメントによるｉｎ　ｖＨｒｏ免疫、ついでエプスタ イン−パールウィルスてのリンパ球形質転換によって製造できる。 ついで抗体を単離できる。医薬的に許容される担体または希釈剤と、活性成分と しての本発明によって製造された（Ｄｗ５２抗体からなる医薬組成物を処方する ことができる。 たとえば高い親和性を有する抗体変異体はＰｒｏｅ、　Ｎａ１ｌ＾ｅａｄ、Ｓｃ １．ＵＳＡ、８６．５７２８−５７３２、１９８９および５ｃｉｅｎｃｅ、　２ ４６．１２７５−１２８１．１９８９に記載された技術を用いて製造できる。ｍ ＲＮＡは、ＣＤｗ５２抗体を産生ずる哺乳類動物のＢ細胞集団、たとえば肺臓ま たはリンパ節から単離される。＋１１乳類動物はラット、マウスまたはヒトでよ い１重および軽鎖免疫グロブジンｃＤＮＡ発現ライブラリーは、バクテリオファ ージラムダベクター・中に創製する。ライブラリーは１重および軽鎖の二相性発 現について、別個にスクリーニングまたは交差スクリーニングする。宿主たとえ ば大腸薗に感染後、ラムダまたは切断プラスミドライブラリーをＣＤｗ５２に特 異的な抗体分子についてスクリーニングする。 配列表には、配列番号１〜１３を掲げる。これらは、以下の説明および請求の範 囲で引用される。 以下の実施例は本発明を例示するものである。添付した図面中。 図１には、ＣＡＭＰＡＴＨ−１ｃＤＮＡの制限ＩＩｌ素地図および配列決定の戦 略を示す、制限酵素地図上の点を打った部分および暗影部分はそれぞれ／グナル ペプチド配列およびＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原の蛋白コード領域である。各ｃＤＮ Ａ挿入体の−および相対的な長さは実線で示す、矢印は決定された配列の方向お よび相対的な長さを示す、黒色の三角はｐｃＡＭｌのｃＤＮＡ挿入体におけるヌ クレオチド置換部分を指示する。 Ｋ樵興 １、杯社旦主旦麦迭 抗体および細胞 ＣＤｗ５２ラットモノクローナル抗体Ｃ’ＡＭＰＡＴＨ−ＩＭおよびＣＡＭＰＡ ＴＨ−ＩＧは、最初、ヒトＴリンパ球で免疫したラットからの肺臓細胞と、骨髄 腫細胞系Ｙ３／Ａｇ１．２．３の融合で作成されたハイブリドーマクローンＹＴ Ｈ６６，９（ＩｇＭ）およびＹＴＨ３４，５（ＩｇＧ２ａ）に由来する変異体で あった［１］、Ｙ３軽鎖を失ったＹＴＨ６６，９の変異体がＣＡＭＰＡＴＨ−Ｉ ＭＴあり、同じ＜Ｙ３軽鎖を失ったＹＴＨ３４，、−５のＩｇＧ２ｂスイッチ変 異体がＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＧである［＋６］　、抗体は、腹水または培養上演か ら硫安沈殿によって精製した。に４４細胞系はＭ、　Ｊ、　Ｓ、　Ｄｙｅｒ博士 により恵与された。これは５％ウシ胎児血清含有１ｓｅｏｖｅ改良Ｄｕｌｂｅｃ ｃｏ培地中で培養した。ヒト肺臓組織はＰ　Ｆｒｌｅｎｄ氏（Ｄｅｐａｒｔｍｅ ｎｔ　ｏｆ　Ｓｕｒｇｅｒｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｒ　Ｃａｍｂｒｉｄｇ ｅ）によって供給された。 ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原の抽出および精製ガングリオンドの抽出に元来考案され た方法［１フコが、この抗原の初期精製にきわめて有効であることがわかった。 操作は室温で実施した。新鮮なまたは凍結したヒト組織を３容の水とホモジナイ ズしｔ−（ｇでの組織重量を１での１容とした）、ホモジネートを、攪拌しなが ら１１容のメタノールに加え、ついで５．４容のクロロオルムを加えた。３０分 間攪拌したのち、混合物をＷｈａｔｍａｎ　１１３Ｖｉ１紙で濾過し、残留物は 捨てた。ついで３．５容の水を加え、混合物を１重分間攪拌し、ついで少なくと も１時間、２相に分離するまで放置した。上相（水相）を集め、ロータリーエバ ポレーターを用いて４０℃で蒸発乾固した（別法として、数日間室温で換気機に 放置して溶媒をビーカーから蒸発させても、同様に満足できることがわかった） 、残留物を水に再懸濁し、水に対して透析して低分子量の夾雑物を除去した。こ の濃縮肺臓粗抽出物をアフィニティー精製または他の解析に使用した。 ＣＡＭＰＡＴＨ−Ｉ　Ｇ　（ラットＩｇＧ２ｔ＋）を３ｇのＣＮ　Ｏｒ−活性化 ５ｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｅｌａ）に、メーカーの説明書に従い 膨潤ゲル１１あたり蛋白質５〜＋３＋＋ｇの割合でカップリングした。肺臓抽出 物はリン酸緩衝食塩溶液中２％デオ牛シフール酸ナトリウムに溶解し、無関係な 抗体を結合した５ｅｐｈａｒｏｓｅで前処置したのち、１０１のＣＡＭＰＡＴＨ −Ｉ　Ｇ結合５ｅｐｈａｒｏｓｅと室温で２時間（または４℃で１６時間）穏や かに攪拌して混合した。ついで５ｅｐｈａｒｏｓｅをカラムに充填し、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム含有ＰＢＳで完全に洗浄し、０．５％デオ牛ノンコ ール酸ナトリウム含む５０■ＭジエチルアミンｐＨ１１，５で溶出した、溶出液 を集め。 ＋（ＣＩで中和し、ＰＢＳおよび水に対して透析した。 ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原の酵素連結アッセイ抗原サンプルのメタノール倍加希釈 を平底マイクロタイタープレー）　（ＦａＩｃｏｎ）中で行い、３７°Ｃに放置 して溶媒を蒸発させた。プレートを、２％ラウン清アルブミン（ＢＳＡ）、２０ ％熱不活性化正常ウサギ血清および００２％ナトリウムアジド（遮断剤）を含有 するＰＢＳＧ、１ｍｌにより−４℃で一部ブロックした。ビオチン化ＣＡＭＰＡ ＴＨ−Ｉ　Ｍ　（２００μｓ／ｍｌで５０μ謁）を加え、室温で３０分間インキ ュベートした。プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳで洗浄し、つ いで０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中に１・５００に希釈したストレプトアビノンと ビオチン化西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の複合体５０μｌ とともに３０分間インキコペートした６　プレートを再び洗浄し、０−フェニレ ンジアミンで発色し、　４９５ｎｓで測定した。 細胞のＰＩ−ＰＬＣ処理 ０、　Ｉｌｌ／冒ｌのＢ、　Ｉｈｕｒｌｎｇｉｅｎｓｉｓホスファチジルイノン トールー特異的ホスホリパーゼＣ（Ｐ　Ｉ−ＰＬＣ）　（ＩｃＮ）をプロテアー ゼカクテル、すなわちＯ，ＳｓＭ　ＥＤＴＡ。 ５０μｇ／ｍｌ　ＰＭＳＦ、５μｇ／−１ベブスクチン、５Ｉ１ｇ／ｍ１ロイペ プチンおよび５μｇ／■ｌア／チパイノとともに含有するＰＢＳ最終容１１５０ μｌ中、約４　ｘ１０６に４２２細胞を３７℃で９０分間インキュベートした。 対照細胞はＰＩ−ＰＬＣを含まないほかは同一条件でインキュベートした。処置 後、細胞を、０．１％ＢＳＡおよび００２％ナトリウムアット含有ＰＢＳで洗浄 し１次に様々なモノクローナル抗体、ついでＦＩＴＣ−１ｍ抗−（ラットＩ　ｇ ）を用いて免疫蛍光分析［１］を行った。細胞をホルムアルデヒドで固定し、サ イトフルオログラフで分析した（Ｏｒｔｈｏ　５（ＩＨ型）　。 精製抗原のＮ−グリカナーゼ消化 ペプチド：Ｎ−グリコシダーゼＦ　（Ｇｅｎｚｙｓｅの゛Ｎ−グリヵナーゼ゛） を、プロテアーゼカクテルも含有させたほかはメーカーの説明書にほぼ従って使 用した。精製したＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原のサンプルをまずＯ，１Ｍ２−メルカ プトエタノール含宵０５％ＳＤＳ中で３分間煮沸した。Ｎ−グリカナーゼによる 消化はｏ、１７％ＳＤＳ。 １２５％ＮＦ４０．１０−Ｍｌ、ｌＯ−フェナンスロリンハイドレート、上記イ ンヒビターカクテル、および５Ｕ／ｍ１Ｎ−グリカナーゼを含有する０、　２Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８，３，２７５μｌ中、３７℃で実施した。様々な 時間にサンプルを採取し、凍結保存して、ＳＤＳゲル電気泳動およびウェスタン ブロッティングまたはＥＬ　Ｉ　ＳＡによって分析した。 抗原のアルカリ処理 肺臓抽出物を０．０５Ｍ　ＮａＯＨ中３７’Ｃでインキユベートした。様々な時 点でサンプルを採取し、４Ｍ酢酸を加えて中和し、ついでＳＤＳゲル電気泳動お よびウェスタンブロッティングまたはＥＬＩＳＡによって分析した。 ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウエスタンプロッティング抗原サ ンプルを、　Ｌａｅｍｓｌｌの方法［１８］によりＳＤＳポリアクリルアミドゲ ル上、１１気泳動に付した。還元剤（２−メルカプトエタノール）を常にサンプ ル緩衝液に加えたが、それを除いても差はなかった。ゲルは染色せず、直ちに、 ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）またはナイロン移送膜を用いてウェス タンブロッティングを行った。１ａ気泳動移送は、半乾燥プロ、ト装置を用い、 　３９ｍＭグリシン、４ｋＭ　）リス、および４％メタノールを含有する緩衝液 中、ｉｔ流重密度０８胃Ａｒｃｍ２で、少なくとも１時間行った。免疫染色は以 下のように実施した。最初に膜を、ブロック緩衝液で２時間ブロックした。つい で（ＡＭＰＡＴＨ−ＩＧ　（ブロック緩衝液中１００μｇ／ｍｌ）中に３０分間 浸漬し、０１％ＢＳＡ含有ＰＢＳで洗浄し。 ベルオキシダーゼ結合抗−（ラットＩｇ）と３０分間インキコペートした。再び 洗浄し、酵素の基質を添加した（５０Ｂのジアミノベンチジン、　３０■ｇの硫 酸アンモニウムニッケル、　３０ｍｇの塩化第−コバルト、および３０１の３０ ％過酸化水素を含有するＦ　Ｂ　Ｓ　ｌｏｏｍｌ）　発色したならば直ちに膜を すすいで乾燥した。 蛋白質配列決定のための脱グリフンル化抗原の単離には、Ｎ−グリカナーゼ処理 抗原を１５％ゲル上で電気泳動し、３層の膜を使用したほかは上述のようにして 移送した。３番目の膜（ゲルから最も遠いＩＩ）はナイロンとした。これにより 。 ２枚のＰＶＤＦ膜を通過した物質の検出も可能になった。この膜を免疫染色して 始めの２層における抗原の位置を明らかにし、それらから適当な領域を切り取っ て配列分析に使用した。 ！匡１監１１Ｅ　Ｗｌｌ因塞 ＰＶＤＦ膜に電気プロットした抗原およびアフィニティー精製物質の蛋白賀配列 分析はＡｐｐｌｉｅｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ　４７７＾覆パルス液体蛋白質シーケン サ−を用いて実施した。 アフィニティー精製抗原（約８０ｐ謹０１．凍結乾燥）は１１５μｍのトリフル オロ酢酸に再溶解し、メーカーの説明書に従って、プレサイクルしたＢｌｏｂｒ ｅｎｅコートガラス繊維フィルターに適用した。結合抗原を担う非染色ＰＶＤＦ 膜の細片をメスの刃で「フェザ−コシ、ンーケンサーの反応カートリフジ中、プ レサイクルしたＢｌｏｂｒｅｎｅガラス繊維ディスクの頂部に単層として置いた 。配列分析は切断時間を５００ｓの標準値に上昇させた改良ＮＯＲＭＡＬ−１サ イクルを用いて実施した。フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）−アミノ酸の同 定はオンライン１２０型ＰＴＨ−アミノ酸アナライザーによった。 ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ） ポリメラーゼ連鎖反応はＭＯＰＡＣ（ＤＮＡの混合オリゴヌクレオチドプライム 増幅）法［１９］によって行った。 ｃＤＮＡを増幅するための混合オリゴヌクレオチドブライマーは決定されたアミ ノ酸配列に従い、自動ＤＮＡ７ノ七サイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ　３Ｍ１皇）によって合成した。プライマーＡ（配列番号８　）　ＣＧ（ ＧＡＴＣ）ＣＡ（ＡＧ）＾Ａ　（ＴＣ）　ＧＡ　（ＴＣ）ＡＣはＮ−末端アミノ 酸配列ＧＱＮＤＴをペースにした。プライマーＢｌ（配列番号９）ＧＡ（ＴＣ） ＡＣ（ＧＡＴＣ）ＴＣ（ＧＡＴＣ）ＣＡ（八Ｇ）八〇、およびプライマーＢ２（ 配列番号１０）　０Ａ（ＴＣ）ＡＣ（ＧＡＴＣ）ＡＧ（ＴＣ）ＣＡ（ＡＧ）ＡＣ は残基４−８　（ＤＴＳＯＴ）をベースにした。４つのＳｅｒコドン（ＴＣＧ。 ＴＣ＾、　ＴＣＴ、丁ＣＣ）および２つのＳｅｒフドノ（八ＧＴ、　ＡＧＣ）を それぞれプライマーＢｌおよびＢ２の設計に使用した。これらのプライマーそれ ぞれは、順次オリゴ（ｄＴ）プライマー（配列番号ＩＩ）　ＧＡＣＴＣＧＡＧＴ ＣＧＡＣＡＧＣＴＧＣＡＧ（Ｔｈ７とともに使用した。これはＸｈｏｌ。 ５ａ１１．ＰｖｕｌｌおよびＰｓｔｌ制限酵素部位を含有する。 ヒトＢ細胞系に４２２からの総ＲＮＡを３分間６５℃に加熱し、第−鎖ｃＤＮＡ を。 オリゴ（ｄＴ）プライマーを使用して合成した０反応混合物には、総容量５０μ ｍ中に。 ＳＯＩＭ　トリス塩酸塩ｐＨ８，３，７５ｍＭ　ＫＣＩ、ｌｄ　ＤＴＴ、ｉ！＋ ＋＋ＭＭｇＣ１２，１ｍＭの各ｄＮ　Ｔ　Ｐ　、　４００μｇのオリゴ（ｄＴ） 、Ｋ４２２細胞からの総ＲＮＡ　ｚｏμｇ、リボヌクレアーゼインヒビターＲＮ ａｓｉｎ　５単位および逆転写酵素４０単位を含有させた。この混合物を４２℃ で２時間インキコベートし、ついでｍＲＮＡ　：　ｃＤＮＡ二Ｉ［ＩＩをエタノ ール沈殿で回収した。 第−鎖ｃＤＮＡは、プライマーＡおよびオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いたＰＣ Ｈによって、　１０ｗ＋Ｍ）リス塩酸塩ｐＨ８，３，ＳＱｍＭ　Ｋ　ＣＩ、　１ ．５ｄ　ＭｇＣｌ２．０．０１％ゼラチン、　０．２ｍＭの各ｄＮ　Ｔ　Ｐ　、 　１００ｐｓｏｌ　プライマーＡ、　１２０μｍｏｌ　オリゴ（ｄＴ）プライマ ーおよびすべての第−鎖ｃＤＮＡを含有する１００μｌの反応容量中で増幅した 。　９５℃で２分間加熱したのち、８単位のＴａｑポリメラーゼ（Ｅａｃｈ　Ｌ ｉｇｈｔ）を加え、混合物を３０ラウンドの温度サイクルに付した。各サイクル は９５℃でＺＯｓ、　３７℃で３Ｏ５および７２℃１分とした。最後に混合物を ５０℃で１０分間インキュベートした。増幅されたＰＣＲ産物をプライマーから ＱＩＡＧＥＮチブブによって分離し、オリゴ（ｄＴ）プライマーをプライマーＢ ｌまたはＢ２のいずれかとともに用いて再増幅した。 ＰＣＲ産物の半分を、上述の場合と同じ条件下最終容量１００μｍで９反応混合 物に加えた。ただし各反応混合物の５０μｌのみを温度サイクリングに付し、残 部は対照として使用した。増幅ＰＣＲ産物は２％アガロースゲル電気泳動によっ て分析した。 ｃＤＮＡクローニノグおよびヌクレオチド配列決定プライマーＡとオリゴ（ｄＴ ）プライマーを用いたＰＣＨによって増幅された３５０ｂｐＤＮＡフラグメント を２％アガロースゲルから単離し、フレノウフラグメントでＬ１Ｍ復した　精製 後、ＤＮＡフラグメントをＸｈｏｌ　［オリゴ（ｄＴ）プライマーはＸｈｏｌを 有するコで消化し、　Ｐ　ＨＳ　Ｇ３９７　［２０］の旧ｎｃｌｌ−Ｘｈｏ１部 位に導入した。１つの陽性クローンが得られ、ｐＣＡＭ−ＰＣＲＡと命名した。 ラムダ−ｇＬｌｏクローニングベクターとに４２２細胞からのポリ（Ａ　）”Ｒ Ｎ　Ａを使用して、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。約８　Ｘ　ｔｏ’個の独 立したプラークを。 ｐｃＡＭ−ＰＣＲＡからの３２ｐ、ｌｊ識３ＳＯｂｐ　Ｈｌｎｄｌｌｌ−Ｘｈｏ ｌフラグメントを用いてスクリーニングした。ハイブリダイゼーンロンは５０％ ホルムアミド、　０．９Ｍ　ＮｍＣｌ。 ５０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７，４，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　１０ｘＤｅｎｈａ ｒｄｔ溶液、０１％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡを含む 溶液中４２℃で４０時間行った。フィルターをｌＸ５ＳＣにより６５°Ｃで洗浄 した。陽性プラークを同じ条件下に精製しｔこ。 陽性クローンからのファージＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、ｃＤＮＡ挿入体をプ ラスミドベクターＰＵＣ１８にサブクローニングした。ヌクレオチド配列は、ｐ ｕｃ１８、Ｐ　Ｕ　Ｓ　Ｇ　３９６　［２０］および／またはＭ　１３ｍ　ｐ　 １８を用いたジデオキシチェーンターミネーンッ７法によって決定した。ｐｃＡ ＭｌおよびｐＣＡＭ２の欠失変異体をエキノヌクレアーゼ■法［２１］によって 構築し、ヌクレオチド配列決定のためにＥｃｏＲｌ−Ｒｓａｌ、Ｒｓａｌ−Ｐｖ ｕｌｌ、Ｐｖｕｌｌ−ＥｃｏＲｌおよびｐｖｕｌｌフラグメントをプラスミドベ ク９−ＰＨ５Ｃ，３９６にサブクローニングした。 ＲＮＡ精製およびノーザンプロット分析総ＲＮＡは塩化グアニジニウム法［２２ ］でに４２２１１１胞から単離した。ポリ（Ａ）”ＲＮ　Ａ　ヲＰｏ１ｙ（Ｕ） Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ上アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。ノ ーザンプロットには、１０ｐｇの総ＲＮＡおよび０５ｐｇのポリ（Ａ）４′を１ ５％アガロース／ホルムアミドゲルを通して電気泳動を行い、ナイロン膜に移し た。 ＲＮＡフィルｙ−を”Ｐ−標！ｉＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原ｃＤＮＡ　（ｐＣＡＭ ２）　とハイブリダイズし、６５℃においてＱ、　ＳＸ　Ｓ　Ｓ　Ｃ７０，１％ ＳＤＳで洗浄した。 ２　仇Ｉ ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原の精製およびその抗原エピトープの性質に関する研究非 望的な実験ではＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原は単一のヒト肺臓（重量約２１０ｇ）か ら抽出し、ＣＡＭＰＡＴＨ−１結合５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ｌＯ＊＋からなるアフ ィニティーカラムに３回通して精製した。ＥＬＩＳＡアブセイの阻害［２３］に よって評価した抗原の総収量は約４０＋ｖｏｌで、細胞あたり約５Ｘ１０’抗原 分子［５］およびＩｇあたり約５ＸＩＯ’のリンパ球があるとして期待された収 量の約ＩＱＯｎｍｏｌによく合致する。 精製抗原の熱安定性は、水に溶解したサンプルを１００℃に２０分間加熱するか または１２１℃で１５分間オートクレーブ処理したのち、水上で急速に冷却して 試験した。いずれの処置もＥＬｒＳＡアッセイによって検出される抗原性に影響 しなかった　影響があれば９％、処理抗原の力価は非処理対照に比較して増大し た。 神職からのアフィニティー精１ｃＡＭ）’ＡＴＨ−１抗原のサンプルをＮ−グリ カナーゼで２０時間まで消化して、ＳＤＳゲル電気泳動およびイムノプロブティ ングで分析した。非処置サンプルにおける約２１〜２８ｋＤの広いバンドは直ち に、実質的な量の中間体橿の出現はなく、はるかに小さいがなお見掛は上異種の 約６ｋＤのバッドに変換した。この結果は、酵素切断の速度に実質的に関連する ２もしくはそれ以上の部位の可能性はあるとしても、Ｎ−グリカナーゼに感受性 のグリフ／レーシヲン部位は１個のみ存在することを示唆している。 平行した実験で、ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原のサンプルを５０ｍＭＮａＯＨで２６ 時間まで処理し、同様に分析した。この場合は、抗原活性は時間とともに失われ 、小さなフラグメントはイムノプロブティングで検出されなかった。インキュベ ーン３２時に２Ｍのホウ水素化ナトリウムをインキュベーンラン液に加えても同 じ結果が得られた。これらの結果は、抗原エピトープが、ホウ水素化物の存在に よってアルカリ剥離反応から保護されてもこれらのアッセイにより検出されない 〇一連連結オリササ１カライド部分であるとすれば説明が可能であろう、しかし ながら、他のアルカリに不安定な構造の可能性も排除できない。 Ｌ…遡胞からのＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原：肺臓細胞からの抗原との比較およびＰ Ｉ−ＰＬＣに対する感受性 非ホジキンリンパ腫麿者から確立された細胞系に４２２はＣＡＭＰＡＴＨ−１抗 ［の実質量を発現することが見出された［１５］　、これにより、ｃＤＮＡライ ブラリーの構築を含む多くの実験に有用な可能性が出てきた。以下の実験は、こ の抗原が正常リンパ球によって発現される抗原と同一か否かを調べるために行わ れた。 ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原は約２　Ｘ　ｌＯ”Ｋ　４２２細胞からクロロホルム／ メタノールで抽出した　収量は正常リンパ球からの場合に匹敵するものであった 。抽出物のサンプルはＳＤＳゲル電気泳動およびイムノプロブティングによる分 析で、同一であることがわかった。 末梢血リンパ球上のＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原は、ＰＩ−ＰＬＣによって部分切断 できることが以前に明らかにされている［３］、類似の実験を、Ｋ４２２細胞を 用い、とくにＰ　Ｉ　ＰＬＣのプロテアーゼ夾雑によるアーティファクトの可能 性を回避することに注意して実施した。　Ｋ４２２細胞をプロテアーゼインヒビ ターのカクテルの存在下に酵素でまたは緩衝液単独で処理し、ついでＣＡＭＰＡ ＴＨ−１゜ＣＤ４ＳまたはＣＤ５９抗体を用いる間接免疫蛍光によって分析した 。ＣＤ４５抗原は。 慣用の蛋白質アンカーを有することが知られていること、またＣＤ４ＳＲエビト −ブが蛋白分解的切断にとくに感受性が高いこと［２４］から、陰性対照として 選択された。ＣＤ５９抗原は、既知のＧＰＩアンカー蛋白質であること［２ｓ］ およびに４２２細胞上で発現されることから陽性対照に選択された。 ＣＡＭＰＡＴＨ−１およびＣＤ５９抗体の結合はいずれも、完全にではないが。 有意に低下し、一方、（０４５およびＣＤ４ＳＲ抗体の結合は影響されず、わず かに増加さえすることが見出された。この結果は、ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原の少 な（とも一部（多分すべて）かに４２２細胞中でＧＰＩに撃留されていることを 意味する。 ＣＡＭＰＡＴＨ−１１ｉ蛋白　の蛋白　配列アフィニティー精製ＣＡＭＰＡＴＨ −１抗原から以下のＮ−末端配列が得られた。 Ｇｌｙ−（ｉｌｎ−７−＾５ｐ−Ｔｈｒ−３ｅｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−５ ｅｒ−Ｐｒｏ　（配列番号１２）数回のンーケンサーの試行で一致した結果が得 られた。２０までの分解サイクルを実施したが、　Ｐｒｏ−１１の後に他のアミ ノ酸が検出された場合はなかった。ＥＬＩＳＡアブセイの阻害で評価して、Ｎ− 末端グリシンの量（Ｓ５ｐｍｏｌ）は配列決定に使用した抗原の置（８ｏｐ■ｏ ｌ）に一致した。還元ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原のヨード酢酸によるアルキル化で はサイクル３において！’ＴＩＩ−ＣｍＣｙｓシグナルの発生を見なかったこと がら残基３は／ステイノではなかった。 第三残基がＮ一連結グリコンレーン冒ン部位である可能性を検討するために。 アフィニティー精！ＩＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原をＮ−グリカナーゼで２２時間処 理し。 ＳＤＳゲル電気泳動で分離し、ＰＶＤＦＩＩＩに移し、二重膜の免疫染色により 位置を決定した。見掛けの分子量は２１〜２８ｋＤから約６ｋＤに実質的に低下 した。脱グリコ／ル化抗原を念む瞑に５サイクルのニドマフ分解を行りたところ 、第三の残基が＾ｓｐであったほかは同じ配列が認められた。Ｎ−グリカナーゼ 処理はＡｓｎとＮ−アセチルグルフサミンの間のＮ−グリフンド結合を加水分解 することから、残基３〜５は＾ｓｎ−＾５ｐ−Ｔｈｒで、これがＮ−グリコリル 化部位を形成するものと確信する。 この段階では、Ｐｒｏ−Ｉｌの後にどんな配列が存在するかについて確信できな かつた。ニドマノ分解の結果は、アミノ酸のバックグランドレベルは低く、ゾア ノーゲ／プロミド処理によって新たなＮ−末端は得られなかったことから、ペプ チドの末端に到達していることを強く示唆した。 ポリメラーゼ連鎖反応を用いたｃ　ＤＮＡの増幅１１アミノ酸のＮ−末端配列に は３個のセリン残基があって、それぞれが６つのＤＮＡフドンのいずれにも相当 できるので、この情報によって作成されるオリゴヌクレオチドは縮重性がきわめ て高＜、ｃＤＮＡのスクリーニングには貧弱なプローブなることがある。配列の 最善の領域は、それによって３２−倍縮型の１４−マー（プライマーＡ）が作成 された残基ｌ〜５　（ＧＱＮＤＴ）からであった、これをハイブリダイゼーンフ ンプローブとして使用してｃＤＮＡクローンを単離する試みは成功しなかったの で、所望のｃＤＮＡを増幅するためポリメラーゼ連鎖反応を使用する別のアプロ ーチを採用した。特異的プライマーは配列の一端についてのみ利用可能であった ので、３°末端におけるオリゴ（ｄＴ）プライマーを使用せねばならなかった。 無関係な配列の増幅の機会を最小限にするため、残基４〜８　（Ｄ丁５ＱＴ）に 基づく別の５゛プライマーを用いる第二ラウンドの増幅を導入した。プライマー Ｂｌには４つのＳｅｒコドンを、プライマーＢ２には２つのフドンを用いたので 、それぞれＢ４および３２の翼なる１４−マーから構成された。 以後のポリメラーゼ連鎖反応に用いる第−鎖ｃＤＮＡの合成鋳型としてに４２２ 細胞からの総ＲＮＡを使用した。最初のＥ’ＣＲ増幅［プライマーＡおよびオリ ゴ（ｄＴ）１後の２％アガロースゲル電気泳動により４つの主要バンド（ＳｌＯ ｂｐ、　４７０ｂｐ。 ４４０ｂｐ、　３ＳＯｂｐ）が観察された　プライマーを除去し、ＰＣＲ産物を 再び、プライマーＢｌまたはプライマーＢ２のいずれかとオリゴ（ｄＴ）を用い て増幅した。得られた産物は最初の反応の産物とは最小のバンド（３ＳＯｂｐ） のみで異なり、これはプライマー８２の増幅産物中には存在したが、Ｂｌの場合 には存在しなかった。 ＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原に刺する独特の配列プライマーはプライマーＡおよびプ ライマーＢｌまたはＢ２のいずれかく両者ではない）中に包含されたことから。 他の３つのバンドは非特異的プライミングによって生じたアーキテクトの可能性 が強いが、　３ＳＯｂｐＰ　ＣＲ産物は信ずべきｃ　ＤＮＡと結論された。 プライマーＡおよびオリゴ（ｄＴｌで増幅されたｌ５Ｑｂｐフラグメントはアガ ロースゲルから単離し、ＰＨ９Ｇ３９フクローニングベクターにクローン化した 。陽性クローンｐＣＡＭ−ＰＣＲＡの挿入フラグメントのヌクレオチド配列を両 端から部分的に決定した。プライマーＡ結合部位の下流の推定６アミノ酸残基は 蛋白質配列データと完全に一致した　このフラグメントをついでハイブリダイゼ ーンＷンブローブとして使用して、に４２２ｃＤＮＡライブラリーからクローン を単離した。 ｃＤＮＡクローンのｍｕおよび配列分析に４２２細胞系から構築したｃＤＮＡラ イブ５１Ｊ−を、ｐＣＡＭ−ＰＣＲＡからの３２ｐ−標識３５０ｂｐフラグメノ トでスクリーニングした。６つの陽性クローンを単離し、これらの挿入体をｐｕ ｃ＋ａおよびＭ１３ｍｐ１８のＥｅｏＲＩ部位にサブクローニングした。これら のクローンのヌクレオチド配列を両端から部分的に決定した。それらの長さおよ び全体の配列決定戦略は図１に示す。 ｐｃＡＭｌおよびｐＣＡＭ２のｃＤＮＡ挿入体の全ヌクレオチド配列を決定し。 それらの長さはそれぞれ、　４４３ｂｐおよび４３３ｂｐであることを見出した 。ｃＤＮＡを約ｏＯｂｐのＲＮＡ分子に７−ザノブロノト分析によってハイブリ ダイズした。したがって、ｖ、ｃＤＮＡ配列は全ＲＮＡの約１６％を占める。 ｐＣＡＭ２のｃＤＮＡ挿入体のヌクレオチド配列は配列番号１３に示す、ポリア デニル化シグナル＾ＡＴＡＡ＾は、ヌクレオチド位置４１７〜４２２に位置する 。２つの長いオープンリーディングフレームが、ヌクレオチド位置１−２２１お よび１−２１．６に観察できる。Ｎ−末端Ｇ１ｙは、その前の残基２４および９ に位置するＭｅｔ残基をもつこれらのリーディングフレームの２番目に見出され る。最初のＮｅｔはもっともらしい開始部位であり１本発明のｃＤＮＡクローン によってコードされるＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原は３フアミノ酸残基からなり、そ の２４アミノ酸残基はリーダー配列とυわれる。このリーダー配列は典型的な疎 水性アミノ酸からなり、もっともらしい切断点で終わる Ｎ−末端６Ｉｙで始まる３７残基ベプヂドは、　２０残基の親和性領域とそれに 続＜１７残基の疎水性領域からなる。可能性ある２つのｒｔ＋一連結グリコシル 化部位（ＮＤＴおよびＮｌ５）が親和性領域に、また〇一連結グリコシル化部位 となりうるＳｅｒおよびＴｈｒ残基が見出される。Ｃ−末端領域はα−へソック スを極めて形成しやすい疎水性残基からなり、ＧＰＩ−７ノカー蛋白賃のＣ−末 端から切断される膜貫通ドメインにｆｆ似する。 ｐ　ＣＡ　Ｍ　ＩおよびｐＣＡＭ２の開、ｐ（ＡＭＩがＳｅｒ−Ｍｅｔをコード する配列へ〇Ｃ＾ＴＧを、一方ｐ　ＣＡ　Ｍ　２がＡｓｎ−１１ｅをコードする ＡＡＣＡＴ＾を有する位置＋５１−１５６の間に２つのヌクレオチド置換が見出 された。ＣＤＮＡクローンの一つ（ｐＣＡＭ７）は５°末喝が切断され配列の一 部を欠くが、Ｉｔｈの３つのクローン（ｐＣＡＭｓ。 １）　ＣＡ　Ｍ　６およびｐｃＡＭｌｌ）、ならびにＰＣＲ産物から得られたク ローン（ｐＣＡＭ−ＰＣＲＡ）　はｔべてｐＣＡＭ２を直線に並べる。これらの 置換はクローニングアーナイフ１クトの可能性があるが、そうでなければ、ｐ（ ＡＭＩによってコードされる蛋白質変異体は、影響される領域がＮ一連結グリコ シレーンロン部位の可能性があること、ならびにＧＰＩアンカーの結合が期待で きる部位に極めて近接していることから、何らかの１！義をもっことが考えられ る。 ｐＣＡＭ２またはそれから帰納されるＣＡＭＰＡＴＨ−１抗原のアミノ酸配列と 有意なオモロノーを有する他のＤＮＡまたは蛋白質配列は見出されていない。 １９９１年１月にその時点のバージランのＥＭＢＬ、　ＧＥＮＢＡＮＫおよびＮ ＢＲＬＤ　Ｎ　Ａデータベース、ならびにＤｏｏｌｉＬＬｌｅ、　ＰＩＲ，Ｐｓ ｅｑｌＰおよび５ｔｆｓｓ−Ｐｒｏｔ蛋白質データベースを。 ＦＡＳＴＡ解析プログラム［２６］を用いてｆｌｌｉｆ＃シた。 １、Ｒａ１ｅ、Ｇ、、　８ｒｉｇｈｔ、Ｓ、、Ｃｈｕｓｂｌｅｙ、Ｇ、　、Ｉｌ ｏａｎｇ、丁、Ｍｅｔｃａｌｆ、Ｄ、、Ｍｕｎｒｏ、＾、ＪA、Ｗａｌｄｓａｎ ｎ。 Ｈ１旧μ可１９８３．６２．８７３ ２、Ｒａ１ｅ、Ｇ、、Ｈｏａｎｇ、Ｔ、、Ｐｒｏｓｐｅｒｏ、Ｔ、、Ｗａｔｌ、 Ｓ、Ｍ、　＆　Ｗａｌｄｓ＋ａｉｎ、Ｈ，、Ｍｏ１．Ｂｉｏ戟AＭｅｄ １９０、１．３０５ ３、Ｈａｔｅ、Ｇ、、Ｘ＋ａ、Ｍ−Ｑ、、Ｔｉｇｈｅ、Ｈ，Ｐ、、Ｄｙｅｒ、Ｍ 、Ｊ、Ｓ、＆　１ａｌｄｓａｎｎ、Ｈ，、Ｔｌ５ｓｕｅ　Ａ獅狽戟@ｅｌＩｓ １９９０、３５．１１８ ４、Ｓｃｈ＊ｉｄｔ、Ｒ，Ｅ、、Ｌｅｕｃｏｃ　ｔｅ　Ｔ　ｉｎ　ＩＶ　（にｎ ａｐｐＪ、、Ｄｏｒｋｅｎ、Ｂ、、Ｇ１１ｋｓ、Ｗ、ＲらＩh）。 ＯＵＰ刊１９８９．ｐ　５Ｉ７ ５、Ｂ４ｎｄｏｎ、Ｃ，１，、Ｈａｌｅ、Ｇ、＆　Ｗａｌｄｍａｎｎ、Ｉｌ、、 Ｅｕｒ、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．１９８８．１８．１５０？。 ６、　ｌｌａｌｄｍａｎｎ、　）１．　、Ｏｒ、　Ｒ，、Ｒａｒｅ、　Ｇ、　、 　Ｗｅｉｓｓ、　Ｌ、　、　Ｃ１ｖｉｄａ　ＩＩ　１．　ＧA　、　Ｓａｗｕｅ ｌ、　Ｓ、　、　Ｍａｎｏｒ、　Ｄ、　。 Ｂｒａｕｔｂａｒ、Ｃ，、Ｐｏ１１ｉａｃｋ、＾　、Ｒａｅｌｖｉｌｅｖｉｔｚ 、Ｅ、＾、＆　５ｌａｖｉｎ、Ｓ、、Ｌａｎｃｅｔ　１９８S．２、 ？、　ｌ１ａｌｅ、　Ｇ、　、　Ｃｏｂｂｏｌｄ、　Ｓ、　、　Ｗａ　Ｉｄｍａ ｎｎ、　Ｉｌ、　、　Ｔｒａｎｓ　ｌ　ａｎｔａｊ　ｉｏｎA　１９８ｇ、　４ ５．７５３ ８、　Ｈａｔｅ、　Ｇ、　、　Ｓｖｉ　ｒｓｋＬ　ｏ、　、　ｌｌａｌｄｍａｎ ｎ、　ＩＴ、　＆　Ｃｈａｎ、　Ｌ、　Ｃ，、８ｒｉ　Ｌ、@Ｊ、　Ｈａｅｗａ ｔｏｌ　、　１９ｇ５．６０．４１゜９、Ｄｙｅｒ、Ｍ、Ｊ、Ｓ、４ａｌｅ、Ｇ 、、Ｍａｒｃｕｓ、Ｒ，＆　Ｗａｌｄｍａｎｎ、Ｈ，、Ｌｅｕｋａｅｓｉａ　ａ ｎｄ　Ｌ　＊　ｈ盾高■ １９９０、２．１７９゜ １０、Ｄｙｅｒ、Ｍ、Ｊ、Ｓ、、ｔｌａｌｅ、Ｇ、、Ｈａｙｈｏｅ、Ｆ、ｆｌｉ 、ｉ　＆　ｆａｌｄｍａｎｎ、Ｈ，、ｐｌｏｏｄ　１９８ＢA７３．１４３＋。 １１Ｒｉｅｅｈｍａｎｎ、Ｌ、、ＣＩａｒｋ、Ｍ、Ｒ，、Ｗ＋ｌｄｍｉｎｎ、Ｉ ｌ、＆　Ｆｉｎｔｅｒ、Ｇ、、ＮａＬｕｒｅ　１９８Ｌ３３Q．３２３゜ １２、　Ｂａ１ｅ、　Ｇ、　、　Ｄｙｅｒ、　Ｍ、　Ｊ、　Ｓ、　、Ｃ１ａｒｋ 、　Ｍ、　Ｒ，、Ｐｈ１ｌｌ　ｉｐｓ、　Ｊ、　Ｍ、　、Ｍ≠窒モ浮刀A　Ｒ， 、Ｒｌｅｅｈｍａｎｎ、　Ｌ、　。 １１ｉｎｔｅｒ、Ｇ、＆　１ｌｉｌｄｓｉｎｎ、）１．、Ｌａｎｃｅｔ　１１８ ８．２．１３９４゜＋４．Ｆｅｒｇｕｓｏｎ、Ｍ　＾、＆　Ｗｉｌｌｉａｍｓ、 ＾　Ｆ　、＾ｎｎｕ、Ｒａｙ、Ｂｌｏｅｈｅｔ　、１９８ｇ、５７，４９７゜＋ Ｓ、Ｄｙｅｒ、Ｍ、Ｊ、Ｓ、、Ｆｌｓｈｃｅｒ、Ｐ、、Ｎａｅｈｅｖａ、Ｅ、、 Ｌａｂａ＠ｔｌｄ＠、Ｗ、　＆　Ｋａｒｐａｓ、Ａ、、Ｂ撃盾盾п@１９９０ ７５．７０９゜ １６、ｌｆｌ　ｅ、Ｇ、、Ｃｏｂｂｏｌｄ、Ｓ、Ｐ、、Ｗａｌｄｓａｎｎ、Ｈ， 、Ｅａｓｔｅｒ、Ｇ、、Ｍａｔｅｊ　ｔｓｅｈｕｋ、Ｐ、＆@Ｃｏｏｍｂｓ、Ｒ 。 Ｒ＾　、Ｊ、１ｍｍｕｎｏ１．Ｍｅｔｈ、１９０．１０３．５９１７、Ｓｖｅｎ ｎｅｒｈｏｌｍ、Ｌ、＆　Ｆｒｅｄｍａｎ、Ｐ、、ＢｉｏｅｈｉｔＢｉｏ　ｈ　 ｓ、Ａｃｔａ　１９８０．６１１．９７１９０．２３９．１２０ ２０、　Ｔａｋｅｓｈ　Ｈａ、　Ｓ、　、　５ａｌｏ、　Ｍ、　、　Ｔｏｂａ、 　Ｍ、　、　Ｍｓｓａｈａｓｈｉ、　Ｗ、　＆　１ｌａｓｈ@１ｓｏｔｏ−Ｇｏ ｔｏｈ、　Ｔ、　、　Ｇｅｎｅ１９８７、６１．６３ ２１　＾５ｕｂｅ１．　Ｆ、　Ｍ、　、　Ｂｒａｎｔ、　Ｒ，、Ｈｎｇｓｔｏｎ 、　Ｒ，Ｅ、　、　Ｍｏｏｒｅ、　Ｄ、　Ｄ、　、　５ｅｉр唐≠氏A　Ｊ、　 Ｇ、　、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｊ、＾＆　５ｌｒｕｈ１．に、　（ｌｉ）、　Ｃｕｒ ｒｅｎｔ　ＰｒｏｔｏｅｏｌＬＩｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏ　、Ｗｉ ｌｅｙ刊、１X８８゜ ２２、　Ｃｈｉｒｇｖｉｎ、　Ｊ、　Ｊ、　、　Ｐｒｚｂｙｌａ、＾ε、Ｍａｃ Ｄｏｎａｌｄ、Ｒ，Ｊ、　＆　Ｒｕｔｔｅｒ、１．Ｊ、、虹I±明」１μ ｍ９７９．１８．５２９４ ２３、Ｘｉａ、Ｍ−Ｑ、、Ｍ、Ｐｈ１ｌ　Ｄｉｓｓｅｒｔａｌｉｏｎ、Ｕｎｉｖ ａｒｓｉｔｙ　ｏｆ　ＣａｍＢｒｉｄｇｅ、１９８９２４、ＩＩａｌａ、Ｇ、、 Ｂｕｃｋｉｅ、Ｃ，、Ｌｏｖａｔ、Ｐ、、Ｐｒｏｓｐｅｒｏ、Ｔ、＆　Ｗａｌｄ ｍａｎｎ、Ｒ，、Ｌｅｕｅｏｃ　狽■@Ｔ　１ｎ Ｉ１１．Ｗｈｌｌｅ　ｅｅｌｌ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉＮｉｏｎ　ａｎｔｉ　ｅ ｎｓ　（ＭｃＭＩｃｈａｅｌ、＾Ｊ、＠）　ＯυＰ、Ｏｘｆ盾窒■ １９ｇ？、　ｐｐ３１１ ２５、　Ｄａｖｉｅｓ、＾、Ｓ１ｍｗｏｎｓ、Ｄ、Ｌ、、Ｈａｌｅ、Ｇ、、Ｈａ ｒｒｉｓｏｎ、Ｒ＾、、ＴＩｇｈｅ、Ｈ，、Ｌａｃｈｓ＋ｉ獅氏AＰ、Ｊ、　＆ １１ａｌｄ＋＋ａｎｎ、Ｒ，，Ｌ工旦五Ｐ−ｙ！旦、１９８９．１７０，６３７

【配列表】

配列番号＝１ （１）　配列特性 ａ）配列の長さ：１２ ｂ）配列の型二アミノ酸 （１１）　配列の種類二合成ペプチド （ｆｉｌ）　配列：配列番号Ｉ Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　５ｅｒ配列番号：２ Ｎ）　配列特性 ａ）配列の長さ＝１３ ｂ）配列の盟二アミノ酸 （ｉｉ）　配列の種類二合成ペプチド （Ｉｌｌ）　配列：配列番号２ Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　 Ｓａｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ＾１ａ１Ｏ 配列番号：３ （＋）　配列特性 ａ）配列の長さ＝１４ ｂ）配列の型二アミノ酸 （Ｉｉ）　配列の種類１会成ペプチド （ｉｉｉ）　配列：配列番号３ Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　５ｅｒＳ　１Ｇ 配列番号：４ （＋）　配列特性 ａ）配列の長さ：１Ｓ ｂ）配列の型二アミノ酸 （ｉｉ）　配列の種ｆｉ＝合成ペプチド（Ｉｌｌ）　配列：配列番号４ Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　ＳｅｒＳｅｒ 配列番号＝５ （１）　配列特性 ａ）配列の長さ：１６ ｂ〉配列の型・アミノ酸 （１１）　配列の種類二合成ペプチド （Ｉｌｉ）　配列：配列番号５ Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ＾ｌａ　５ｅｒＳ　１０ Ｓｅｒ　Ａｓｎ 配列番号：６ （１）　配列特性 ａ）配列の長さ：１７ ｂ）配列の型、アミノ酸 （１１）　配列のｐ１！ｌｉ：合成ペプチド（１目）　配列：配列番号６ Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ１Ｏ Ｓｅｒ　Ａｓｎ　ＩＩｅ 配列番号ニア （１）　配列特性 ａ）配列の長さ＝１８ ｂ）配列の型二アミノ酸 （ｉｉ）　配列の種類二合成ペプチド （Ｈｉ）　配列：配列番号７ Ｇｌｙ　Ｇｌｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｒ＾Ｉａ　ＳｅｒＳｅｒ　Ａｇｎ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ 配列番号：８ （ｉ）　配列特性 ａ）配列の長さ：１４塩基 ｂ）配列の盟：ヌクレオチド （ＩＩ）　配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉＤ　配列：配列番号８ ＧＧＮＣＡＲ＾＾ＹＧ　ＡＹＡＣ 配列番号＝９ （ｉ）　配列特性 ａ〉配列の長さ：１４塩基 ｂ）配列の型：ヌクレオチド （ｉｌ）　配列の種類：　ｃＤＮＡ （ｆｉｌ）　配列：配列番号９ ＧＡＹＡＣＮＴＣＮＣＡＲＡＣ 配列番号：ｌ。 （＋）　配列特性 ａ）配列の長さ：１４塩基 ｂ）配列の型：ヌクレオチド （ＩＩ）　配列の種類：ｃＤＮＡ （ｉｉｉ）　配列：配列番号１０ ＧＡＹＡＣＮＡＧＹＣＡＲＡＣ 配列番号＝１１ （Ｄ　配列特性 ａ）配列の長さ：３８塩基 ｂ）配列の型：ヌクレオチド （１１）　配列の橿＠：　ＣＤＮＡ （Ｈｉ）　配列：配列番号１１ ＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＧＡＣＡＧＣＴＧＣＡ　ＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴ　ＴＴＴＴ ＴＴＴＴ配列番号゛１２ （１）　配列特性 ａ）配列の長さ：１１残基 ｂ）配列の型二アミノ酸 （ＩＩ）　配列の種類：ペプチド （ｉｌｌ）　フラグメントの種類：Ｎ−末端（ＩＶ）　配列：配列番号１２ ０１ｙ　Ｇｉｎ　Ｘａａ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ｐｒ。 ５　１Ｇ 配列番号：１３ （１）　配列特性 １）配列の長さ：４３３塩基お及び６１残基ｂ）配列の型：　ＣＡＭＰれｈ−ｓ 抗原ｃＤＮＡのヌクレオチドおよび帰納されるアミノ酸配列 （１１）　配列の橿１ｉ：ｃＤＮＡ （１！ｉ）　特徴 １〜１１残基　Ｎ−末端蛋白質配列はエドマン分解で決定１５２および１５６塩 基　クローンＩＩＣＡＭ１（Ａ〜Ｇ）におけるヌクレオチド置換位置 ４１７〜４２２塩基　ポリアデニル化シグナル３残基　（＾５ｎ−３）　Ｎ−グ リコリル化部位１６残基　（＾１ｎ−１６）　Ｎ−グリフンル化部位の可能性１ ２４．　＋４．　Ｉｓ、　１８残基　（Ｓｅｔ−１２，５ｅｔ−１４，５ｅｔ− １５および５ｅｔ−１８）　Ｎ−グリコリル化部位の可能性 ＋２−＋５残基　（Ｓｅｒ−１？−５ｅｒ−１５）　Ｇ　Ｐ　Ｉ−アンカーの結 合に適当な部位 く目）　配列：配列番号１３ ＴＧＣＴＡＣＣＡＡＧ　ＡＣＡＧＣＣＡＣＧＡ　ＡＧＡＴＣＣＴＡＣＣＡＡＡ　 ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＣＧＣＴＴＣＣＴＣ丁ＴＣ５１Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｐｈ ｅ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＣＴＣＣＴＡ　ＣＴＣＡＣＣＡＴＣＡＧＣＣＴＣＣＴＧ　Ｇ ＴＴ　ＡＴＯＧＴＡ　ＣＡＧ　ＡＴＡ　ＣＡＡ　ＡＣＴ　ＧＧＡ　９９Ｌｅｕ　 Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ｌｉｅ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖｉｌ　Ｍｅｔ　 Ｖｓｌ　Ｏｌｎ　Ｉｌｅ　Ｇｉｎ　Ｔｈｒ　ＧｌｙＣＴＣＴＣＡ　ＧＧＡ　ＣＡ Ａ　ＡＡＣＧＡＣＡＣＣＡＧＣＣＡＡ　ＡＣＣＡＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＡ　ＧＣ Ａ　ＴＣＣ１４７Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｉｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　 Ｓｅｒ　Ｇｌ＋＋　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｓｅｔ　Ａｌｉ　５ｅ■ Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　ｌｉｅ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　 Ｐｈｅ　Ｐｈｅ　ＶａＩ　＾１暑＾ｓｎ＾１ｍ　Ｉｌｅ！５　２０　２５　Ｓ。 ＡＴＣＣＡＣＣＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＣＡＧＴ　ＴＧＡＧＧＴＧＡＣＡ　Ｃ（ｉ ＴＣＴＣＡＧＣＣＴＴＡＧＣＣＣＴＧＴ　２４６１１ｅ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ｐｈ ｅ　Ｃｙｇ　Ｐｈｅ　ＳｅｒＧＣＣＣＣＣＴＧＡＡ　ＡＣＡＧＣＴＧＣＣＡ　Ｃ ＣＡＴＣＡＣＴＣＧ　ＣＡＡＧＡＧＡＡＴＣＣＣＣＴＣＣＡＴＣＴ　ＴＴＧＧＧ ＡＧＧＧf　２９６ ＴＴＧＡＴＧＣＣＡＧ　ＡＣＡＴＣＡＣＣＡＧ　ＧＴＴＧＴＡＧＡＡＧ　ＴＴＧ ＡＣＡＧＧＣＡ　（ｉＴＧＣＣＡＴＧＧＧ　ＧＧＣＡＡＣＡfＣＣ３４６ ＡＡＡＡＴＡＧＧＧＧ　ＧＧＴＡＡＴＧＡＴＧ　ＴＡＧＧＧＧＣＣＡＡ　ＧＣＡ ＧＴＧＣＣＣＡ　０ＣＴＧＧＧＧＧＴＣＡＡＴＡＡＡＧＴＴ`　３９６ ＣＣＣＴＴＧＴ　４３３ 国際調査報告 …卿−−＾−−…−瓶）、ｒ／ＧＢ　９２１００７０５国際調査報告 フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｐ　２１１０８　 ８２１４−４ＢＧＯＩＮ　３３１５３　Ｄ　８３１０−２Ｊ／／（Ｃ１２Ｐ　２ １１０８ Ｃ１２Ｒ１：９１） ＣＯ７Ｋ　９９：００ （７１）出願人　クサイア、メン　−　クイイギリス国シービー２１キユーピー 　ケンブリッジ、テニス　コート　ロード（番パートメント　オブ　パソロジイ 気付 （７２）発明者　ヘイル、ジエフリー イギリス国シービー２１キユーピー　ケＩ （７２）発明者　トネ、マサヒデ イギリス国シービー２１キユーピー　ケンブリッジ、テニス　コート　ロード（ 番地なし）、イミュノロジイ　ディビジョン、ケンブリッジ　ユニバーシティ　 ディパートメント　オブ　パソロジイ気付 （７２）発明者　クサイア、メン　−　クイイギリス国シービー２１キユーピー 　ケンブリッジ、テニス　コート　ロード（番地なし）、イミュノロジイ　ディ ビジョ

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．配列番号１〜７に掲げたアミノ酸配列を有するペプチドまたはそのペプチド の抗原性フラグメント。
2. ２．ペプチドまたはそのフラグメントを化学的に合成することからなる「請求項 １」に記載のペプチドまたはそのフラグメントの製造方法。
3. ３．サンプル中のＣＤｗ５２抗体のアッセイ法において，サンプルを「請求項１ 」に記載のペプチドまたはそのフラグメントと接触させ，ついで抗体が上記ペプ チドまたはそのフラグメントに結合したか否かを測定することからなる方法。
4. ４．（ａ）「請求項１」に記載のペプチドまたはそのフラグメントおよび（ｂ） 使用時に，サンプル中のＣＤｗ５２抗体がペプチドまたはそのフラグメントに結 合したか否かを測定するための手段，からなる試験キット。
5. ５．（ｂ）は標識抗グロブリンである「請求項４」に記載のキット。
6. ６．ＣＤｗ５２抗体をその祖ブレバレーションから精製する方法において「請求 項１」に記載のペプチドまたはそのフラグメントを保持する固体支持体上に粗ブ レバレーションを通過させ，上記支持体に結合したＣＤｗ５２抗体を溶出するこ とからなる方法。
7. ７．哺乳類動物を「請求項１」に記載のペプチドまたはそのフラグメントで免疫 することからなるＣＤｗ５２抗体の製造方法。
8. ８．モノクローナルＣＤｗ５２抗体を産生する不死化細胞系の調製方法において ，哺乳類動物を「請求項１」に記載のペプチドまたはそのフラグメントで免疫し ，免疫動物からのリンパ腫起源の細胞を不死化細胞系の細胞と融合させ，ついで ＣＤｗ５２抗体を産生する不死化された細胞を選択する方法。
9. ９．モノクローナルＣＤｗ５２抗体の製造方法において，ＣＤｗ５２抗体を産生 し「請求項８」に記載の方法によって調製される，選ばれた不死化細胞を増殖さ せる方法。
10. １０．医薬的に許容される担体または希釈剤と，活性成分として「請求項７また は９」に記載の方法によって製造されたＣＤｗ５２抗体からなる医薬組成物。
11. １１．「請求項１」に記載のペプチドまたはそのフラグメントを生理的に許容さ れる担体とカップリンケしてなる接合体。