JPH06510660A

JPH06510660A - 生物学的防除剤

Info

Publication number: JPH06510660A
Application number: JP4506403A
Authority: JP
Inventors: ケイリー，パトリシア　ジェーン; スチュワート，ローナ　メリー　ディエット; ポッシー，ロバート　デビッド; ファーバー，ミゲル　ロペツ
Original assignee: ロウセル　−　ウクラフ; ナチュラル　インバイルンメント　リサーチ　カウンスル
Priority date: 1991-03-22
Filing date: 1992-03-20
Publication date: 1994-12-01
Also published as: MX9201212A; TW205569B; RU2156300C2; OA09816A; GB9106185D0; US5770192A; WO1992016637A1; TR27322A; KR100238924B1; AU675408B2; BR9205803A; HU217569B; HUT66757A; EP0505207A1; AU1549692A; CA2106587A1; HU9302666D0

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的防除剤本発明は、バキュロウィルス殺虫剤に関連する。

昆虫に特異的なバキュロウィルスは、農業において、害虫の防除における化学薬剤の使用の代替法を用意する。

これらは、この目的のために多年にわたり使用されている。バキュロウィルスは、標的生物に関して選択性であり、環境に対して汚染を起さないという利点を存する。

それらの圃場における害虫防除プログラムにおいての使用は安全であると考えられている（ＷＨＯＳ　ｌ　９７３）。

それらの主要な欠点は、標的昆虫を殺すのに比較的時間がかかり、そのため、昆虫による食害の速やかな停止を起すことかできないということである。バキュロウィルスの遺伝操作技術の到来により、これらの作用体の効果は、宿主の中に昆虫−特異的トキシン、ホルモン類、または酵素を発現することによって改善され、このようにして、昆虫を殺すのに要する時間を減少させ、または少くとも食作用を防ぐかもしれないことか示唆される。

バキュロウィルス殺虫剤の効果を修飾するための企ては、これまで成功例には限りがあった。Ｃａｒｂｏｎｅ　Ｉら（１９８８）は、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ＮｕｃｌｅａｒＰｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　Ｖａｉｒｕｓ　（Ａ　ｃ　ＭＮ　Ｐ　Ｖ　）を用いて、Ｂｕｔｈｕｓ　ｅｕｐｅｕｓからのサソリの昆虫特異的トキシンを発現したか、組換え体トキシンの生物学的活性を検出する入し、宿主を殺すのにかかった時間を２０％だけ減少させた。Ｈａｍｍｏｃｋら（１９９０）は、ポリへドリンー陰性ＡｃＭＮＰＶを使用して、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉの幼虫において、幼若ホルモンエステラーゼを発現して、ウィルスの多量投与において有意な体重増加の減少を検出した。

最後に、Ｍｅｒｒｙ　Ｗｅｔｈｅｒら（１９９０）とＭａｒｔｅｎｓら（１９９０）は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓδエンドトキシンの遺伝子を、ＡｃＭＮＰＶに挿入し、本物のバクテリアトキシンを産生じた。このものは、それ自体昆虫の幼虫に対して毒性を示したが、ウィルスの効果を修飾しなかった。

我々は、組み換え体ＡｃＭＮＰＶにおいて、バキュロウィルスのプロモーターの制御の下に、昆虫特異的トキシンをコートしている合成遺伝子を導入した。我々は、トキシンをコードしている配列を、蛋白質の分泌を媒介するシグナルペプチドをコードしている配列と融合させたならば、昆虫に対する病原性の顕著な増加が起ることを見出した。この知見は一般に適用できる。

したかって、本発明は、それで感染した昆虫細胞において、トキシン、またはその誘導体か、昆虫の細胞から分泌されるシグナルペプチドを供給された殺虫性トキシンからなる外来蛋白質を発現する。組み換え体バキュロウィルスを供給する。

本発明は、昆虫を現場において防除する方法で提供する。本方法は、本発明によれば組み換え体バキュロウィルスの効果的な量を提供することからなる。昆虫は、組み換え体バキュロウィルスを摂取し、ウィルスＤＮＡは昆虫の体内で増殖し、トキシンか分泌されて昆虫を殺す。

殺害は、分泌シングル配列が提供されていない組換え体バキュロウィルスの使用よりももっと速やかに起る。これには、害虫によって、それらか死ぬ前に起る作物の被害の量を減少させるという重要な特典かある。

本発明は、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｉｄａｅ科の、例えばＢａｃｕ　ｌｏｖ　ｉ　ｒｕｓ属のとんな適切なバキュロウィルスにも適用できる。したかって、組み換え体バキュロウィルスは、閉塞バキュロウィルスであってもよい。バキュロウィルスは、核性多角体病ウィルス（ＮＰＶ）　、例えば、Ａ　ｃ　ＭＮ　Ｐ　Ｖ。

よれは、組換え体のＮＰＶのゲノムには、機能的ポリヘトリン遺伝子か含まれる。したかって、ポリヘトリン蛋白質の発現は、典型的には、天然のバギュロウイルスボリヘ１−リンプロモーターによって駆動される。組換え体バキュロウィルスか環境において機能するためには、ウィルスは生きていなければならず、そして、その防御コートを作る能力かなけれはならない。

該組み換え体ゲノムはまた、殺虫性トキシン、またはそれらの官能基誘導体、及び該組み換え体バキュロウィルスで感染した昆虫細胞からの構造遺伝子の分泌を媒介するシグナルペプチドをコードしているキメラ遺伝子を含む。したかって、組み換え体バキュロウィルスのゲノムは、その中に、キメラ遺伝子、及びそのための転写と翻訳を制御する要素か挿入されている野生型のゲノムから成立っていてよい。一般的に、野生型のゲノムの遺伝学的機械装置は、その制御配列を伴ったキメラ遺伝子の添加によっては影響を受けない。野生−型ゲノムによって自然にコードされた蛋白質の発現は変化を受けない。

この方法で、生存性の、安定な、感染性のバキュロウィルスが提供される。

トキシンは、神経毒素であることかあり、一般的に、細胞イオンチャンネルに影響する。適切なトキシンは、正常にトキシンを産生する細胞によって分泌されるトキシンである。典型的には、トキシンは、毒性動物、または微生物のポリペプチドトキシンであり、均一まで精製したとき、注射によって昆虫に毒性かあるのか適切である。より好ましくは、トキシンは昆虫に対して選択的に作用し、動物に対して作用かあってはならない。組み換え体バキュロウィルスは、２つ以上のトキシンを発現し、分泌することかある。

より好ましいトキシンは、細胞から分泌されるポリペプチドであり、動物内の細胞で合成され、毒液嚢に運ばれ、かみついたり刺したりすることによってトキシンはそこから別の動物に注入される。該トキシンは、サソリの１−キシン′、クモのトキシン、Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａの他の科や目からのトキシン、または、微生物起源の１−キシンてあってよく、特にサソリのトキシン、またはクモのトキシンである。したか−って適切なトキシンは：Ｎｅｔ−Ｃｙｓ−Ｍ＠ｔ−Ｐｒｏ −Ｃｙｓ−Ｐｈ＊−τｌ’１ｒ−Ｔｈｒ−Ａｒ９−Ｐｒｏ−Ａｊｐ−如ｔ−＾１ａ−Ｇｌｎ−に１ｎ−Ｃｙｓ−＾ｒｇ−Ａｌａ−ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｐｈ・−ＧＩＹ−ｐｒｏ−Ｇｌｎ−ＣｆＩＩ−Ｌ＠ｕ−Ｃ７＠弓ＩＹ−ＴＹｒ−ＡｍｐＡｍｐ−Ａｓｎ−人＠ｐ−Ｘ１ａｕ−ｅｙＩｓ−人ａｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ｅｙｓ−Ｌｙｓ−？ｙｒ−↑ｙｒ−Ｇｌｙ−＋１：ｌｙ−＾５ｎ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ神経化学における道具としてのＩａＡトキシン、ｗａｔｔｅｒｄｅ　Ｇｒｕｙｔｅｒ、　Ｂｅｒｌｉｎ　＆　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　１９８３．２９１−３０９．　ＥｄｓＨｕｃｈｏ、　Ｆ、　ａｎｄ　０ｖｃｈｉｎｎｉｋｏｖ、　Ｙ、　Ａ。

Ｍａｔ−Ｃｙｓ−Ｍｓｔ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−Ｐｈ＊−τｈｒ−Ｔｈｒ−＾５ｐ− Ｐｒｏ−人ｊｌｎ−Ｍ＠を一人１ａ−Ｌ＋ｙｓ−Ｌｙ＊−ｃｙｓ−＾ｒｇ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｍ−Ｃｙｓ−Ｐｈ・＜１ｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｉａｕ−Ｃｙｓ−人ｓｎ−＾ｒ９アミノ酸配列をもった２つの他の昆虫特異的トキシンがこの種から単離された、すなわち、Ａ　ａ　ＨＴ　Ｔ　ｌとＡａＨＩＴ２である（Ｌｏｒｅｔ、　１９９０　）。

ＩＪｕ−ｔｈ＠−Ｇｌｙ−Ａｍｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ｌ、ｙｓ −Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｙｅ−８ｔｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−ｊｌｙ−Ｂ＠ｒ−Ｔｙｒ −Ｇｌｙ−Ｔ’ｆｒ−ＣＹｍ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｉｊｌｕ−ＡＬａ−ＣｙｌＩ−丁ｒｐ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌａｕ−ｐｒｏ−人ｓｐ＜１ｕ−Ｌｙｅ−丁ｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−８＠ｒ−Ｇｌｕ−’ｒｈｒ−Ａｓｎ− Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ（Ｚｌｏｔｋｉｎ、　Ｅ、、にａｄｏｕｒｉ、　Ｄ、、　Ｇｏｒｄｏｎ、　Ｄ、、　Ｐｅ１ｈａｔｅ、　Ｍ、。

Ｍａｒｔｉｎ、　Ｍ、　Ｆ、、　Ｒｏｃｈａｔ、　Ｈ，、Ａｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｙｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ。

このトキシンは、Ｉｌｅを１５位に含むイソフオームｌとＶａｌを含むイソフオーム２かあることが見出された。

（Ｌｅｓｔｅｒ、Ｄ、、Ｌａｚａｒｏｖｉｃｉ、Ｐ、、Ｐｅ１ｈａｔｅ、Ｍ、、Ｚｌｏｔｋｉｎ。

λ膠Ｐ”１Ｍ−ＴＹｒ−Ｘｌ＊−Ｌｙｅ−人ｒ９−Ａｒｇ−＾５ｐ−６１ｙ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−＾ｒｑ−ｃｙｓ−ＸＡｕ−Ｘ　ｌ＠＜１ｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｃｆ　ｍ−Ａｊｐ−ＬｙＩＳ　弓１ｕペア５−Ｌｙ虐−＾１ｍ−Ｔ＞τ− Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−１５・ｒ−Ｔ７ｒ−Ｇｌｙ−Ｑｒ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ− 丁ｒｐ−Ｇｌｙ−Ｌａｕ−人１ａ−Ｃｙｍ−Ｔｒｐ−Ｃｙｍ−Ｇｌｕ−Ｃ１ｙ− Ｌａｕ−Ｐｒｏ→ｎｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−５ｓｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−人ｓｎ−丁ｈｒ−ｃｙｓ−ｃｌｙ（Ｌａｚａｒｏｖｉｃｉ、Ｐ、、Ｙａｎａｉ、Ｐ、、Ｐｅ１ｈａｔｅ、Ｍ、、Ｚｌｏｔｋｉｎ。

Ｎａｋａｊａｉｍａ、Ｔ、、Ｐｅ１ｈａｔｅ、Ｍ、、Ｙａｓｕｈａｒａ、Ｔ、、Ｃｏｍｐ。

Ａｓｐ−Ｃｙｓ−ｅｙｅ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔ７ｒ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−人５ｎ− Ｃｙｓ４＊ｒ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−Ｌａｕ−Ｃｙ８＋＾ｒｇ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ＋曲２Ａｌ　ａ−Ａｓｐ−ｅｙｓ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇ　１ｙ−Ｇ　１　ｎ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−＾１ｍ−ｂｐ−Ｔｒｐ− Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｃ’ｙｓ−Ｃｙｓ−５ｓｒ−Ｃ１ｙ−Ｔｙｒ −Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−５＠ｒ−Ｃｙｍ−Ａｒｇ−４＠ｒ−）ｌｌ＠ｔ−Ｐｒｏ−Ｑｒ−Ｃｙｓ−＾１”９−Ｃ’ｆｍ−Ａｒ９−５＠！ｒ−触ｐ−８＠ｒ−冊２Ｔ− ＸＸＸ位置９におけるＬｙｓに対してＡｒｇ位置１４におけるＰｈｅに対してＡｌａ（Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ、　Ａ、、　Ｂｌａｎｋｅｎｓｈｉｐ、　Ｄ、　Ｔ、　Ａｃｋｅｒｍａｎｎ、　Ｂ、Ｌ、。

Ｃｈｅｎ、　ＴＭ、、　Ｇｏｒｄｅｒ、　Ｇ、　Ｗ、、　Ｍａｎｌｅｙ、　Ｇ、　Ｄ、　Ｐａｌｆｒｅｙｍａｎ。

Ｍ、Ｇ、Ｃｏｕｔａｎｔ、Ｊ、Ｅ、、Ｃａｒｄｉｎ、Ａ、Ｄ、、Ｊ　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ。

（Ｉｌｍｇｄｉａｖ、Ｈ，ＺＨ，、Ｖａｌｉ＊ｖａ、Ｌ、＾＠＃　ＩＣ０ｒｒ１＠＠Ｖｚ　入Ｊ、、！Ｉａｄｙｋｃｎ〜Ａ、轟＠、８ａｌｉｋｈｏｖ、ＳＲ＋１．、！ｌｉｏｏｒｇ　Ｋｈｉｍ　Ｑ、ｌｏｔコ、１９０〕）Ｍｅｇａｓｃｏｌｉａ　ｆｌａｖｉｆｒｏｎｓは昆虫を麻痺させる成分を含んでいることが示された（Ｐｉｅｋ、　Ｔ、、　Ｈｕｅ、　Ｂ、、　Ｍｏｎｙ、　Ｌ、。

Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、　ｂｅｒｌｉｎｅｒ　１７１５Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　８７Ｃ，２８７，１９８７；　Ｐｉｅｋ、　Ｔ、、　）ｌｕｅ、Ｂ、。

Ｐｅ１ｈａｔｅ、Ｍ、、Ｍｏｎｙ、Ｌ、、Ｃｏｍｐ、／　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｐｈｙｓｉｏｌ、８７Ｃ，２８３，１９８７）。

トキシンは、昆虫に毒性がある微生物によって産生される。天然に存在するトキシンの中には、鱗翅目に対して活性であるＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒにｕｒｓｔａｋｉ　と、れた。Ｂ、　ｔ、　Ｖａｒ　１ｓｒａｅｌｅｎｓｉｓと、Ｂ、　５ｐｈａｅｒｉｃｕｓは双翅目に対して活性である。他のトキシンにはＢｅａｕｖｅｒｉａｂａｓｓｉａｎａのポーヴエリンとＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ　ＳＳＰ、のデストラキシンのような昆虫に対して病源性のカビのトキシンが含まれる。

微生物によって生産されるトキシンは、昆虫内への注入によって毒性を示すためには、処理を必要とするトキシンの前駆体、またはプロフオームであることがある。

多くのバクテリアからのトキシンの結晶に対する遺伝子か単離され、配列か決定された。これらには以下が含まＢａｃｉｌｌｕｓ　ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　ｖａｒ、ｍｏｒｒｉｓｏｎｉ伝子を運ぶプラスミドから分離することができる。Ｕ、　Ｓ。

含まれている。

殺虫性トキシンの機能誘導体は、組み換え体バキュロウィルスによって発現することかできる。トキシンの“機能誘導体”は、トキシンの生物学的活性と本質的には変らない生物活性（機能的または構造的）をもっている。“機能誘導体”の発現は、分子の“断片”、“変形体”、“類縁体”、または“化学的誘導体”を含むものとして理解されるへきである。

トキシンのような分子の断片とは、その分子のポリペプチド断片すへてのことである。トキシンのような分子の変形体という用語は、それが、両分子が事実上同じ構造であるとき、そして／または、それが同様な活性を示すとき、両方の分子か事実上同じバイオバリアントを有するとき、たとえ１つの分子の構造が他の分子に反映されていなくても、またはアミノ酸配列が同一ではないときに、構造と機能において事実上類似した分子のことを指している。トキシンのような分子の °゛類縁体”とは、全分子または断片に対して、機能において本質的に同様な分子を意味する。本節または今後において、ある分子か正常には該分子の一部をなしていない、さらなる化学的両分を含んでいるときは、別の分子の化学的誘導体と考えられる。

シグナルベブチトは産生細胞からトキシンが分泌できるようにする。シグナル配列は、哺乳動物、または昆虫細胞から蛋白質の分泌を媒介することができる配列と考えられる。したかって、それは、インターロイキン２＜　ｒ　ｘ−−−２）のためのシグナル配列のような哺乳動物の配列、または幼若ホルモンのエステラーゼ脱輛ホルモン、または駐匣１す」Ａの角皮の蛋白質の分泌シグナル配列のような昆虫配列であってよい。ｇｐ６７蛋白質の分泌シグナル配列のようなバキュロウィルスシグナル配列は、特に１Ｔ用である。したがって、適切なシグナル配列は以下のようになる１）　Ｍ＠ｔｌａ−ｕＶａｌＡｓｎＧｌｒＬＳ＊ｒＨ１ｍＧｌｎＧＩＹＰｈ＠ＡｓｎＬｙｓＧｌｕＨ１ｍ笥ｒｓ＠ｒＬｙ襲Ｍ＊ｔＬｙｓｘｌ＠ＬａｕＬａｕＡｌａｌｌ＊入１ａｔａｕＭ＊ｔｌａｕＳｅｒ’ｒｈｒＶａ１ＭｅｔＴｒｐＶａｌＳ＊ｒτｈｒ５１　ＭｅｔＸ１＠ＴｈｒＡｒｇＰｒｏ１１＠ｘｌｅＩａｕＶａｌＩｌ＊ＬａｕＣｙｓηｒ＾１ａＩｌ＊ＬａｕＭ＊ｔＸｌｓＶａｌＧｌｎｓ＠ｒＰｈｌｌＶｉｌｌＰｒＯＬｙｉｌＡｌａＶａｌｌｌａＩＪｕ７）　Ｍ＊ｔＰｈ＠ＬｙｓＰｈ＠Ｖａ１Ｍ＊ｔＩｌ＠ｘＪｕＡ１ｍＶａｌＶａｌＧ１ｙＶａｌＡ１ａＴｈｒＡｌａ１）　）！＠ｔＬＹｓＰｈｌ！ＩＡｕＬ＠ｕＩＪｕＰｈ＠ＩＪｕＶｌｌｌＶｍｌＬａｕＰｒＯ工１ｅＪ＊ｔＧｌｙＶｍｌＬａｕｃｌｙ参考文献１９９０゜Ｆ）　Ｃｅｃｒｏｐｉｎ　Ｂ　ｏｆ　Ｈｙａｌｏｐｈｏｒａ　ｃｅｃｒｏｐｉａ、ｖａｎＩＩ）　０ｘｙｔｏｃｉｎ　ｏｆ　ｒａｔ、　１ｖｅ１１．　Ｒ，ａｎｄ　Ｔｉｃｈｔｅｒ、　Ｄ、、　１９８４゜ソダナルベプチ１−は、トキシンか分泌できるようにトＶ−ノンから開裂てきる。したかって、シグナルベブチトは、トキノンのＮ−木端、またはＣ−木端に、直接、まＩ−はリンカ−配列を経て融合することかできる。リンカ−配列は、例えは、ｌから５の残基のように、１からｌＯまでのアミノ酸残基をも−）ことかできる。

本発明の組み換え体バキュロウィルスは、以下によって調製する、二とかできる。

（１）Ｉ・キ、ノン、またはその機能的誘導体、そして、−シグナルベプチトをコートするキメラ遺伝子を、昆虫細胞において外来蛋白質の発現を指令することかできるプロモーターのド流の制限酵素部位においてクローニングを行い、そして、（１１）バキュロウィルスに感受性である細胞に、ステップ（１）からの組み換え体トランスファーベクターと無傷の野生型バキュロウィルスのＤＮＡをコトランスエフエクトすること。

相同な組み換えか起り、その結果、プロモーターに操作が行えるように結合したキメラ遺伝子を宿している組み換え体バキュロウィルスを生ずる。典型的には、キメラ遺伝子か分離されてクローニング段階（１）において使用される。組換え体バキュロウィルスは、発現できるポリヘトリン遺伝子も含むことかできる。これは、段階（１１）において、このような遺伝子を組み込む野生型バキュロウィルスを利用することによって達成することができる。代替法として、ポリへドリンプロモーターに操作か行えるように結合したポリヘトリンをコードする配列をさらに含むトランスファーベクターを、段階（１）において使用することかできる。その場合には、発現できるポリへトリンを欠いている野生型バキュロウィルスを、段階（ｉｉ）において使用することかできる。したがって、好ましくは、組換え体バキュロウィルスは、天然のポリヘトリン遺伝子を組み込む。言いかえれば、ポリヘトリンをコートする配列とポリへドリンプロモーターは、組み換え体バキュロウィルスにとって天然のものである。

キメラ遺伝子は、トキシン、またはその機能的誘導体に対するコーディング配列を含んている。このコード配列、または全キメラ遺伝子は合成することができる。全体として望ましい配列に相当する配列は、合成され、アニールされる。この目的のためには、コーディング配列か挿入されるへきである特別のバキュロウィルスへのコドンの優先性か選択されることが好ましい。コーディング配列、または全構造的遺伝子は、グリシンに対する、さらなる３′−末端コドン、または翻訳後に、アミノ基へ改変できる等価の配列をつけて合成されることができる。翻訳停止コドンも用意されている。本技術分野で利用できる技術を使用してトキシン遺伝子をクローニングすることができる。トキシン遺伝子が単独で合成されるならば、それは適切なコーディング配列につなげられる。

分泌ソゲナル配列が、本発明の組換え体バキュロウィルスで感染させた昆虫の細胞から分泌されることを確実にするために存在している。候補のシグナル配列は、組み換え体バキュロウィルスを形成すること、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を、それて感染させて、感染Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞からの上清を分泌トキシンについて試験することによって試験することができる。代替法としては、組み換え体バキュロウィルスで感染した昆虫から血リンパを回収し、感受性の昆虫に注射し、毒性を評価することかできる。トキシンは、幼虫または成虫に注射することかできる。双翅目に対して活性なトキシンについては、試験昆虫は、Ｍ、　ｄｏｍｅｓｔｉｃａであってよい。必要ならば他の適切な昆虫か、他のトキシンについての試験種として選ばれてよい。

キメラ遺伝子は、プロモーターを始めとして転写及び翻訳制御作用かそなわっている。プロモーターは、組み換え体バキュロウィルスで感染した細胞における蛋白質の発現を指令することができるように選ばれる。したがって、プロモーターは、１つのバキュロウィルスプロモーター、例えば、感染細胞においてのウィルス遺伝子発現の４つのフェーズから選ばれたバキュロウィルスのプロモーターてあってよい（ＢｌｉｓｓａｒｄとＲｏｈｒｍａｎｎ、Ｉ　９９０）：フェーズｌ　（直接的早期遺伝子プロモーター）。正接早期遺伝子Ｉ、２．直接早期遺伝子Ｎフェーズ２．（遅延早期遺伝子プロモーター）１．３９に遺伝子フェーズ３．（後期遺伝子プロモーター）、１．ｇｐ６７遺伝子、２．　塩基性蛋白質遺伝子、３．キャプシド蛋白質遺伝子フェーズ４．（極めて後期の遺伝子プロモーター）、■。

ポリヘトリン遺伝子、２．ＰＩＯ遺伝子、好ましくは、バキュロウィルスプロモーターは、感染性ウィルス粒子の形成には必須ではない遺伝子に対するプロモーターであるが、必須遺伝子からのプロモーターのコピーも使用されることがある。我々は、ＰＩＯプロモーターか有用であることを見出した。プロモーターは、タンデムに用意することができる。

したかって、キメラ遺伝子とプロモーターは、キメラ遺伝子とプロモーターは、バキュロウィルストランスファーベクター中において供給される。発現可能なポリヘトリン遺伝子も含むこの型の適切なトランスファーベクターは、ｐ　Ａ　ｃ　ＵＷ　２　Ｂ　（Ｗｅｙｅｒら、１９９０）である。

このベクターは、ポリヘトリン遺伝子の完全なコピー、反対の方向にＰＩＯプロモーターとＳＶ４０の転写終止配列をもったＢｇｌＩ［クローニング部位を含んでいる。一般的には、２つのバキュロウィルスプロモーターが、遺伝子の発現について使用されている一連の適切なトランスファーベクターは、ＷＯ８９１０ｌ　５１８１ｍ開示されている。

バキュロウィルス感染に対して感受性な細胞は、キメラ遺伝子を組み込んだ組み換え体ベクターでトランスフェクトされ、そして、上記の段階（ｉｉ）において、野生型のバキュロウィルスで感染される。典型的には、感受性細胞は、昆虫細胞系の細胞であり、適切にはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞である。相同性組み換えが起った後、本発明による組み換え体バキュロウィルスを単離することかできる。

組み換え体バキュロウィルスは安定である。言い換えれば、組み換え体バキュロウィルスは、実際の使用に足るだけ安定である。ポリへドリンー陰性ＮＰＶは、実用に足るだけの安定性かない。組み換え体のバキュロウィルスも感染性である。組み換え体バキュロウィルスは、感受性昆虫のすへてに感染することかできる。トキシンを含む外来蛋白質は、昆虫の細胞内で発現され、それらから分泌される。トキシンは、昆虫の死の原因となる。

したかって、組み換え体バキュロウィルスを使用して害虫を防除する。効果的な量が、害虫に対する宿主として作用する作物、または雑草に対するような、そして、特に害虫の蔓延に悩む作物に対して現場で適用される。

代替法としては、組み換え体バキュロウィルスは、例えば、捕獲した、または研究室で育てた昆虫に適用することができ、次に、それらを現場に放ち、次世代の昆虫に感染させる。組み換え体ウィルスの投与水準は、典型的には１ニーカーあたり１０”からＩｏ１２のＰＴＢである。

適切なバキュロウィルスは、根絶させるべき昆虫に応じて選択される。組み換え体バキュロウィルスは、典型的には噴霧によって、しかし、餌、またはダストによっても適用される。組み換えバキュロウィルスは、昆虫の幼虫によって摂取される。したがって、昆虫の卵の４化が予測される期間に適切な場所に適用するべきである。この期間は、典型的には、２週間から４週間続く。ウィルスは、単独、または他の生物の防除剤、または化学殺虫剤と併用して使用することかできる。

選ばれたバキュロウィルスに応じて、この防除法は、以下の目からの昆虫に対して適用することができる：そして、特に鱗翅目である適切なバキュロウィルスの選択によって、以下を含む多くの重要な作物と森林の害虫を、この方法を用いて制御することができる。すなわち、本発明の組み換え体のバキュロウィルスは、当然ながら、それ自体で未修飾の天然のウィルスを使用することかできる。すなわち、ウィルスによる感染に対して感受性である昆虫の場所に効果的な量を適用することによる一般的な方法て、殺虫剤として使用することができる。

組み換え体ウィルスは、繁殖、致死的蔓延とトキシンポリペプチドの発現のための天然ＤＮＡ配列を含むことによって、このような目的に答える生存性、及び能力かあることが見出されていた。組み換え体ウィルスは、２つ以上のトキシンを発現し、分泌するように構築することができる。

組み換え体バキュロウィルスを殺虫的に効果的な量を含む殺虫剤の組成物は、粘土、ラクトース、そして適用において助けとなる脱脂大豆粉のような蛋白質様物質、特に、摂食誘引剤であり、含まれているバキュロウィルスの安定性を増す蛋白質様の担体を含む。このような組成物は、ウィルスの保存を強化するために、低温、例えば１４°Ｃから一２０℃で貯蔵することが望ましい。

本発明によって提供される組成物は、その中で、バキュロウィルスか、粘土、そして／または、蛋白質のマトリックス中に確保されている多様な微粒子で構成されている粒子組成物であってよい。本節において使用されている　”確保”という用語は、マトリックス中に、バキュロウィルスを埋め込み、その一部が粒子の表面に露出していること、そしてまた、バキュロウィルスが、マトリックス中へ完全に包み込まれていることか含まれる。組成物中の粒子は、１５０ミクロンを超えない細かいサイズを特徴とし、またさらに、粒子のサイズが５から１００ミクロン、より好ましくは、５から５０ミクロン、特に５から２５ミクロンの首尾よい粒子が容易に産生され得ることか、本発明のさらなる特徴となっている。

マトリックスの物質は、バキュロウィルスの全重量の、を量による６５から９９．９％をしめており、本発明の組成物のこの様態における７１−リソクス物質は、より好よしくは、重量で８５％から９９％である。本組成物中に使用された粘土は、説明のための例として、Ｋａｏｌｉｎｅ粘土、０！ａｎｃｈａ帖」：、Ａｔｔａ、ｐｕｉｇａＳ粘土、及びＢｅｔｏｎｉｔｅ粘土をは（，７めとする、細かい、実質り粉末の性質の市販されている処理した粘土のいずねてあってもよい。より望より、い粘土は、０１ａｎｅｈａとＡｔｔａｐｕｌｓｉｔｅｓである。

マトリックス物質として使用される植物性蛋白質は、細い、事実上粉氷の形に処理された様な種類の蛋白源からのいず第１てあってもよい。材料は、好ましくは、脱脂してあり、さもなけれは、実質的に脂肪を含まない。説明のために述へられている植物蛋白質の資源には、大豆、綿実、ヒマワリの種、種々の酵母の抽出物か含まれる。より好ましい植物性蛋白質様物質は、大豆蛋白質とワタの種子の蛋白質であり、好ましくは、脱脂蛋白からのもの、より好ましくは、脱脂大豆蛋白質である。動物蛋白質の代表は、スキムミルク、カゼイン、及び卵のアルブミンである。天然資源から得た蛋白質様物質は、少なからぬ量の非−蛋白質用物質を含んでいることかあり、本発明において使用される　゛″蛋白質”、及び“蛋白質様物質”は、一般に重量で少くとも２５％の蛋白質を含む物質を考えている。より好ましい植物蛋白質物質は、通常、４０％から７５％の実際の蛋白質を含んている。

個々の粒子と全体的組成物は、比較的低濃度のバキュロウィルスを有していたか、組成物は、少くとも１．０μｇ／ｍｌのＬ　Ｉ）　５０の活性当量を含むことか、最小の実際的な見地から望ましい。組成物の力価は、適切に０゜００１μｇ／ｍｌから１．０μｇ／ｍｌの範囲であり、通常は、０．００３　ｔｔｇ／ｍ　Ｉから０．４　ｔｔ　ｇ／ｍ　Ｉ　ヘの範囲にある。使用され、引用された殺虫活性、または力価の測定は、３０°Ｃの温度で生育させた第１齢の幼虫の５０％にレベル用量を供給するのに必要とされる食餌の、ｍｌあたり（μｇ／ｍｌ）の μｇの報告されたＩ、Ｄ５０値の定量に基づいている。方法は、基本的にはＴｒｉｃｈｏｐｕｓｉａ　ｎｉ　Ｎ　Ｐ　Ｖ力価の算定と関連して、Ｊ。

Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ；　６．　７３７−４５　（１９６５）に、基本的に記述されている。

本発明によって提供される粒子の組成物は、望ましい量の殺虫力価を示し、光− 不活化と熱変性による力価の低減の抵抗性の改善が、一般的に特徴となっている。組成物の他の性質、特に物理化学的性質は、特にマトリックスに使用される物質をはじめとする種々の要因によって変動する。マトリックスか、粘土のみて成立っている組成物は、一般的に、湿潤性か優れているという特徴かあるか、粘着性が低く、ある場合には、よりやわらかい微粒子から成っていることかある。他方、マトリ・ソクスか、植物性蛋白質のみから成る組成物は、一般的に、粘着性と硬度か優れているという特徴かあるか、湿潤性かより低い傾向かある。動物性蛋白質の多量を含む組成物は、粘着性は良いか、湿潤性と硬度が乏しいという傾向かある。したかって、特に好ましいマトリックス物質は、植物性蛋白質、粘土とそれらの混合物からなる群から選はれる。マトリックスか、植物性蛋白質と粘土の両方の緊密な混合物からなる組成物は、良い湿潤性、粘着性、硬度、ならびに他の望ましい性質を提供するという利点を有する。したがって、本発明の特別に望ましい組成物は、マド・リックスか、植物性蛋白質と粘土の両者の混合物からなる。粘土に対する植物性蛋白質の重量による比は、重量による１部の粘度に対して、０．１から１０部の蛋白質の範囲であってよく、好ましくは、１部の粘土に対して植物性蛋白質の０．３から４部の範囲にあり、さらに好ましくは、重量において粘土１部に対して０．５から３部である。

本発明のバキュロウィルスは、例えば、アルギネートのＣｕｌｉｇｅｌ　（商品名）のような、生物分解か起るポリマー中に包み込むことかできる。紫外線遮蔽、そして／または摂取促進剤かポリマー中に組み込まれていてよい。

したかって、炭末、炭末をヘースとした染料、酸化アルミニウム、二酸化チタニウム、粘土、小麦粉、または蛍光性物質のような日光遮蔽剤か、ポリマー中に存在することかある。

以下の例は、本発明を説明する。添付されている図において。

図１は、ＡｃＭＮＰＶ　ｇｐ６７シグナル配列と、ＡａＨＩＴのコーディング配列を示す。ｇｐ１３７シグナルペプチドは下線か引かれ、２つの潜在翻訳開始コドンを太字タイプの字体で示しである。

図２は、ＡａＨＩＴ遺伝子の構築において使用された合成オリゴヌクレオチドの配列を示す。ヌクレオチド配列は、５’−３’の方向（ａｌ、ｂａ、ｃ５．及びｄ７）、及び３’−５’の方向（ａ２．ｂ４．ｃ６．ｄ８）で示されている。トキシン遺伝子のアセンブリーに重要な制限酵素部位か配列上に示しである。翻訳開始コドンは、下線か引かれてあり、そして、翻訳停止コドン（Ｔ　Ａ、　Ａ　）は、２番目のヌクレオチド上のアステリスクによって示されている。ＢａｍＨｌとＡｃｃ１部位の間の’５ｔｕｆｆｅｒ’領域か挿入され、構築に必要なこれらの２つの部位の二重消化を容易にした。オリゴヌクレオチドを、連続的にｐＵｃ１８のポリクローニング部位に挿入した。

ｄ　７／ｄ　８か、ｐＵＣ１８におけるＡｃｃｌとＸ　ｂａ　Ｉの部位の間に挿入され（挿入の際分解されるようにＡｃｃ１部位か構築された。）ｐＳＴＤが形成された。ｃ　５　／　ｃ　６は、ｐＳＴＤのＢａｍＨｌとＸ　ｂａ　１の部位の間に挿入され、ｐＳＴＤＣを形成した。これは、ＢａｍＨｌとＡｃｃｌで消化され、　“５ｔｕｆｆｅｒ’領域を放出させた。そして、ａｌ／ａ２を、これらの部位へクローニングしてｐＳＴＤＣＡを形成させた。これは、Ａｃｃｌて消化し、ｂ　３／ｂ　４を挿入し、ＰＬＳ−３Ｔを形成した。

図３ａは、ｐＡｃｓＴ−１の横築を示す。ＡａＨＩＴをコートしている合成オリゴヌクレオチドは、図２に記述されているように、ｐＵＣｌ　８の中に集められ、ｐＳＬ−３Ｔを誘導した。次に完全なＡａＨＩＴをコードしている領域を、ｐＬＳ−３Ｔから除去して、完全なＡｃＭＮＰＶポリヘトリン遺伝子の上流に位置しているｐｔＯプロモーターのコピーを含むバキュロウイルストランスファーヘクターであるｐＡｃＵＷ２ＢのＢｇｌＩＩ部位に挿入した。その結果上したトランスファーベクターｐＡｃＳＴ−１は、シグナルペプチドなしのＡａＨＴＴをコードしている完全な配列を含んでいる。

図３ｂは、ｐＡｃＳＴ　３の構築を示す。合成ＡａＨＩＴをｐＬＳ−３Ｔから除去し、ｐＡｃＡＴＭＩのＢａｍＨ１部位に挿入し、ｐＡｃＡＴＭ−１−３Ｔを誘導した。

特定部位の突然変異誘発を、ｇｐ６７分泌シグナルと、ＡａＨＩＴをコードしている領域の間の接合部上て行い、修飾プラスミドｐＡｃＳＴ−２内に、好ましいプロテアーゼ開裂部位を提供した。修飾したｇｐ６７−ＡａＨＩＴのコーディング領域を、ｐＡｃＳＴ−２から除去し、ｐ　Ａ　ｃ　Ｕ　’ｖＶ　２　Ｂ内に導入し、ｐＡｃＳＴ−３を誘導した。

図４Ａはｇｐ６７ノグナルペプチドコーデイング領域（２４６−３５９）と、ＡａＨＩＴのコーディング領域（３６０−５６９）に関連したＡｃＭＮＰＶｐｌＯプロモーター（１−２４０）のヌクレオチド配列を示す。ｐ１０プロモーターからの転写開始部位（位置＋６７−１７０　；　ＴＡＡＧ）は、太いタイプ字体で示されている。

シグナルペプチドとトキシンの間の接合部は、突然異誘発の前に示されている。

除去されたヌクレオチドは、より低いケースにおいて示されている。

図４ｂは、ｇｐ６７シグナルペプチドコーデイング領域とＡａＨＩＴコーディング領域との関連においてＡｃＭＮＰＶｐ　ｌ　Ｏ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列を示している。その配列の上には、組み換え体ウィルスを誘導するのに使用されたトランスファーベクター（ｐＡｃＳＴ３）のプラスミド制限地図がある。

図５は、ウィルス　感染Ｓ、　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞中の蛋白質の発現を示している。細胞を、Ａｃ５Ｔ−３、または野性型ウィルスで感染させ、方法において記述されたように感染後の種々の時点において３５８−システィンて１時間パルス標識した。蛋白質は、Ｘ−線フィルムに露出する前に、１０−３０％ポリアクリルアミドグレーディエントゲル上で分離した。ＡａＨＩＴとポリヘトリン蛋白質の位置か示しである。

図６は、トータルトキシンとＡｃ５Ｔ−３で感染した細胞の培地のＨＰＬＣ画分とイムノプロット分析の結果を示す。ＨＰＬＣからの両分２５−２８を、１０− ３０％ポリアクリルアミドグレーディエントゲル上で分離し、テキストに記述されているようにプロットした。ＢＳＡ（再懸濁緩衝液中に存在する）とＡａＨＩＴか示しである。

図７、金柑Ａ　ａ　Ｈ毒液、またはＡｃ５Ｔ−３で感染したＳｆ細胞からの培地を、ＨＰ　Ｌ　Ｃを使用して分画した（例１参照）。選ばれた両分の分析を、４ μｌを図８は、Ａ　ｃ　Ｓ　Ｔ−３とＡｃＭＮＰＶ（野生型）で感（−←した幼虫による局部的な梁の損傷を示す。

図９は、インターロイキン２ノグナルペプチトコーデイング領域と、ＡａＨＩＴココ−ィング領域と関連したＡｃＭＮＰＶｐ　ｌ　Ｏ遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列を示す。配列の上には、組み換え体ウィルスを誘導するのに使用された１−：）ンスファーベクター（ｐＡｃ　１１２ｓＴ）のグラスミ１−制限マツブがある。

図１Ｏは、幼若ホルモンエステラーゼのシグナル配列−１−１−をコートする領域と、Ａ　ａ　ＨＩ　Ｔをコートする領域と関連したＡｃＭＮＰＶ　ｐｌ、ｏの遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列を示す。配列の上には、組み換え体ウィルスを誘導するのに使用されたトランスファーベクター（ｐＡｃＪＨＥＳＴ）のプラスミド制限地図かある。

図１１は、ｐＡｃＳＴＳＴの制限地図、ｐｌｏプロモーター、Δａ　ＨＩ　ＴシグナルペプチドとＡａＨＩＴコーディング領域の配列を示す。

図１２は、ｐＡＣＣＰ２ＳＴ（７）制限地図とｐｌＯプロモーター、ＣＰＩ２ノグナルベプヂトとＡａＭＩＴコーディング領域の配列を示す。

図１３は、ｐＡｃＯＸＹｓＴの制限地図、及びｐｌ。

プロモーター、オキシトシンのシグナルペプチドとＡａＨＩＴコーディング領域の配列を示す。

図１４は、ｇｐ６７シグナルペブチトコーデイング領域とＡａＨＩＴコーディング領域ど関連してタンデムに配置されているＡｃＭＮＰＶ塩基性蛋白質遺伝子のプロモーターとｐＩＯの遺伝子プロモーターのヌクレオチド配列を示す。配列の上には、組み換え体ウィルスを誘導するのに使用されたトランスファーベクター（ｐＡｃＢＰＳＴ）のプラスミド制限地図かある。

図１５は、図５（ａ）ＡＣｌ　１２ＳＴ；（ｂ）ＡｃＪＨＥＳＴ　；　（ｃ）Ａｃ　ＢＰＳＴについて記述されたように、ウィルス感染Ｓｆ細胞中ての蛋白質の合成を示す。

図１６は、ＡｃＭＮＰＶ　ｇｐ６７のシグナル配列と５ｅｆｌＴのコーディング配列を示す。ｇｐ６７シグナルペプチドは、下線か引いてあり、２つの潜在性翻訳開始コ１ヘンは、タイプの太字体で示しである。

図１７は、５ｅｆｌＴ遺伝子の構築に用いられた合成オリゴヌクレオチドの配列を示しである。ヌクレオチドは、５’−３’の方向（Ｏ３３７１１）と、３’− ５’の方向（Ｏ３３７１２）で示しである。オリゴヌクレオチドの対のサブクローニングのために使用された制限酵素部位は、配列の下に示されている。翻訳開始コドンは下線か引かれてあり、翻訳停止コドン（ＴＡＧ）は、２番目のヌクレオチドの上のアステリスクによって示されている。アニーリングの後、オリゴヌクレオチドは、ｐＤＨ７内の５ｐｈｌとＢａｍＨ１部位の間に挿入された。ｐＤＨ７は、ＡｃＮＰＶ　ｇｐ６７の分〜・シグナルをポリリンカーの）（ｉｎｄｌ［の部位の代りに、」−二一りなりｇｌＩＩ部位と５ｐｈｌどの間にイ１゛シているｐＥＭＢＬ　Ｉ　９の誘導体である。

図１８は、ｇｐ６７ノグナルペプチドコーデイング領域（２４６−３５９）に関連するＡｃＭＮＰＶ　ｐｌｏのヌクレ十−ｆ−１’配列Ｃｌ−２４０）を示している。残りの配列は、５ｅｆｌ”ｐに対するコーディング領域である。

ｇｐ６７領域中と、Ｓｅ目目頭領域間の接合部の突然変異誘発後の配列か示さ１１でいる。

図１９は、ｇｐ６７シグナルペプチドのコーディング領域ど５ｅｆＴＴのコーディング領域と関連したＡｃＭＮＰＶ　ｐｌＯ遺伝子プロモーターのヌクレオチド領域を示す。、二の配列の上には、組み換え体ウィルスを誘導するのに１重用されたトランスファーベクター（ｐＡｃｓｅｆｌＴ）のプラスミド制限地図かある。

ＡｃＭＮＰＶ　ｃ　６　（Ｐｏｓｓｅｅ、Ｉ　９８６）　Ｓ及びす”での組み換え体ウィルスは、５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（ＩＰＬＢ−３ｆ−２１）細胞（Ｖａｕｇｈｎら、＋９７７）中で、ペニノリシとストレプトマイシンの存在下て、５％、または１０％ウシ胎児血清（Ｆｅ２）を補充したＴＣｌｏｏて２８℃において繁殖させた。ウィルスの感染性は、ＢｒｏｗｎとＦａｌｋｎｅｒ　（１９７７）によって記述されたように、プラークアッセイを使用して評価した。

ウィルスの精製：ポリへトラをＨａｒｒａｐら（１９７７）によって記述されたように、ただし、すへての溶液に０゜１％（ｗ／ｖ）Ｓ　Ｄ　Ｓを添加して、感染細胞、または昆虫から精製した。ＳＤＳは、ポリへドラを精製の終了時に水で洗うことによって除去した。ポリへドラを、Ｗｉｇｌｅｙ（１９７６）のドライカウンティング法を使用して計数しｔこ。

ＡａＨＩＴの蛋白質配列を、ＡＣＭＮＰＶポリヘトリン（Ｉ（ｏｏｆｔ　ｖａｎ　ｌｄｄｅｎｋｉｎｇｅら、１９８３）　とｐｔ。

（Ｋｕｚｉｏら、＋９８４）遺伝子のより好ましいコドンバイアスを使用して、ヌクレオチド配列に変換した。予知されたＤＮＡ配列を、制限酵素部位を同定するために、５ｔａｄｅｎモレキユラーバイオロジープログラムを使用して、ＶＡＸマニフレームコンピューター上で分析した。これらを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ　ＡｕｔｏｍａｔｅｄＳｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ上で造り出された合成オリゴヌクレオチドの４つの相補的対をデザインした。配列はＡＴＧコドンの前の４つのヌクレオチドが、ＡｃＭＮＰＶポリヘトリン遺伝子のヌクレオチドに対応するようにデザインされ、このようにして、翻訳週辺区域の開始の完全性を保存した。翻訳停止コドンは、コーディング領域の３′末端に組み込まれた。適切な制限酵素部位か、合成オリゴヌクレオチドのｐＵｃ１８への挿入、そして、その後のマニピユレーションのためにＢａｍＨＩとＢｇｌＩＩをもった完全なＡａＨＩＴコーディング領域として、その後の切除を容易にするために組み込まれた。該オリゴペプチドを、標準プロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を使用して、ｐ　Ｕ　ＣＩ　８　（Ｙａｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎら、１９８５）内の完全ＡａＨ［Ｔコーディング配列中に集められた。この操作のさらなる詳細は、図２．３ａ、及び３ｂに関連して上に記述されている。最終プラスミド構築、ｐＬＳ−３Ｔ中のＡａＨＩＴコーディング領域を、その権威を確認するために、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネータ−法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７）を使用して配列決定を行った。

同様な方法において、Ｓｅｆ　ＩＴの蛋白質の配列を、ヌクレオチド配列情報に変換した。２つの相補的オリゴヌクレオチド、０３３７１１、と０８３７１２（図１７）を合成した。アニーリングの後、これらのオリゴヌクレオチドを、プラスミドｐＤＨ７に、ｓｐｈ　Ｉ　とＢａｍ旧部位の間において挿入した。ｐＤＨ７は、ＡｃＭＮＰＶの分泌シグナルを、ポリリンカーの旧ｎｄ　［ｒ［部位の代りに位置したユニークなりｇｌ　１１部位とｓｐｈ　Ｉの間に含んているｐＥＭＢＬ１９（Ｏｅｎｔｅら、１９８３）の誘導体である。プラスミド構築物、ｐＤＨ７−３ｅｆ　ＩＴにおけるＳｅｆ　ＩＴココ−ィング領域を、その権威を確認するために、上述の如く配列決定（ｉ’）　ｐＡｃＳＴ−１（比較）　実際的なウィルス殺虫剤を製造することは、ＡａＨＩ　Ｔコーディング配列を、機能的ポリヘトリン遺伝子を維持したバキュロウィルスに挿入することを必要とした。１ −ランスファーベクターｐＡｃＵＷ２Ｂ（Ｗｅｙｅｒら、＋９９０）は、この基準を満足する。それは、ＡｃＭＮＰＶ　ＥｃｏＲＩＩ断片に基づいており、ポリヘトリン遺伝子を網羅している。それは、ポリヘトリン遺伝子の完全なコピー、ｐｌＯプロモーターのコピー、及びＳＶ４０転写停止配列をもち、ポリヘトリンＡＴＧコドンから９０ヌクレオチド上流の部位に、そして、反対の方向に挿入されたＢｇｌ　ＩＩクローニング部位をもっている。

Ａａｆ（ＩＴココ−ィング領域をＢａｍ旧とＢｇｌ　ＩＩを使用してｐｔ、ｓ− ｓ’ｒから切除し、ゲル化温度が低いアガロースゲル中て分画した後精製され、トランスファーベクターｐＡｃＵＷ２Ｂ　（Ｗｅｙｅｒら、１９９０）のＢｇｌ　Ｉｆ部位へ挿入して、ｐＡｃＳＴ−１を誘導した（図３ａ）。

（ｉｉ）ｐＡｃＳＴ−２：潜在的にＡａＨＩＴを分泌することができると思われるウィルスを造り出すために、コーディング配列を、ポリへドリンプロモーターの後に、ｇｐ６７シグナルペプチド配列（Ｗｈｉｔｆｏｒｄ　ら、１９８９）のコピーをもったトランスファーベクターであるｐＡｃＡＴＭｌに挿入した。トキシンコーディング領域をＢａｍ旧とＢｇｌ　ＩＩでＰＬＳ−３Ｔから切除してｐＡｃＡＩＭｌ中のＢａｍ旧部位へ挿入し、トランスファーベクターｐＡｃＳＴ− ２を産生じた（図３ｂ　）　、　ｐＡｃＡＴＭｌは、Ｍｌ３へルバーファージ（Ｌｉｖｉｎｇ−ｓｔｏｎｅとＪｏｎｅｓ　１９８９）の使用を経て、一本＠ＤＮＡの産生を容易にするＭ１３遺伝子間領域を含むポリへドリンプロモーターに基づいたトランスファーベクターであるｐＡｃＣＬ　２９　（いｖｉｎｇｓｔｏｎｅとＪｏｎｅｓ　ｌ　９８９）の誘導体である。ｇｐ６７シグナル配列とＡａＨ［Ｔの間の接合部は、図４八に示されているＧＰ６７−３Ｃ，Ｔｏｘを使用して、Ｍ１３オリゴヌクレオチド志向突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ、ｌ　９８５　）を使用して修飾し、好ましいプロテアーゼ認識部位をコードする適切なりＮＡ配列を誘導した。本段階は、ＡａＨＩＴの元のＡＴＧ翻訳開始コドンも除去した。

ｇｐ６７接合部に対して行われた変化は、ｐ１０プロモーターの配列とともに図４Ａに示されている。

（ｉｉｉ）　ｐＡｃＳＴ−３（本発明）：ｇｐ６７シグナル配列とＡａＨ［ＴをＸｈｏ　Ｉｆ消化によってｐＡｃＳＴ−２から除去し、ｐＡｃＵＷ２Ｂ中のＢｇｌ　ＩＩ部位に導入し、ｐＡｃＳＴ−３を産生じた（図３ｂ）。

（ｉｖ）ｐＡｃｌ１２ｓＴ　（本発明）　、　Ａａｌ（ＩＴ合成コーディング領域を、Ｂａｍ旧／Ｂｇｌ　ＩＩ−消化ＤＮＡ断片として、ＢＬＵＥ−３ＣＲＩＰＴ　Ｍｌ　３フアーンミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のポリリンカー領域内のＢａｍ旧部位へ挿入した。コーディング領域の方向性は、制限酵素マツピングによって確認された。ＩＬ−２シグナルペプチドのコーディング配列（Ｔａｎｉｇｕｃｈｉら、１９８３）を、トキシン配列の翻訳開始コドンの上流にある１ＥｃｏＲＶ／Ｐｓｔ部位（複数）の間に挿入した。シグナルペプチドとトキシンをコードする配列との接合部は、オリゴヌクレオチド−志向突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ。

＋９８５）を使用して変更し、分泌ペプチドの開裂のための最適プロテアーゼ認識部位を提供した。配列は、チェーンターミネーション法を用いて確認した。シグナルペプチドとトキシンをコードする領域を含むＤＮＡ断片をＸｈｏ［［て切除し、バキュロウィルストランスファーベクターｐＡｃＵＷ２１のＢｇｌ　１１部位において挿入し、ｐＡｃ　Ｉ　１２ＳＴを誘導した。ｐＡｃＵＷ２１は、ｐＡｃＵＷ２Ｂからの発展であり、ポリヘトリン遺伝子とｐｌＯ遺伝子プロモーターに並ぶウィルス配列を減少させた。それは、Ｍｌ３　ＫＯ７で重感染した後、バクテリア中に一本鎖ＤＮＡ産生を可能にする適切な調節配列を有している。ｐＡｃＵＷ２１は、ｐＡｃＵＷ２Ｂから５４０８ヌクレオチドＤＮＡ断片を切除し、これを旧ｎｄ　ＩＩＩとＥｃｏＲ［で消化したｐＥＭＢＬ　Ｉ　９に挿入することによって構築した。連結の前に、コウシの腸のホスファターゼで処理し、ＤＮＡの末端をＤＮＡポリメラーゼで修復した。Ｉ　Ｉ−２のシグナルペプチドのコーディング領域の配列は、ＡａＨ［Ｔコーディング配列と関連して図９に示されている。

（ｖ）　ｐＡｃＪＨＥＳＴ　（本発明）：ＪＨＥシグナルペプチドをコードしている合成りＮＡを、２つの対の重複オリゴヌクレオチドをｐＥＭＢＬ　１９の修飾型のポリリンカーの（Ｉ（ｉｎｄ　Ｉｌｌの部位はＢｇｌ　ＩＩに変更されてあった）　Ｂｇｌ　１１の部位どＥｃｏＲＩの部位の間に挿入することによ−）で構築しｔ−０次に、このプラスミドをＢａｍｆ（ｌ（ＪＨＥ配列の３′領域内にある）で消化し、トキシンをコードしている領域を、Ｂａｍ　Ｈじ’Ｂｇｌ　ＩＩで消化したＤＮＡ断片として挿入した。ＪＨＥノグナルペブチトとトキシンをコード（７ている領域との間の接合部は、Ｆ述したオリゴヌクレオチド志向突然変異誘発を使用（、て変更された。次に、その配列は、Ｂｇｌ　ＩＩによる消化によって回収され、ｐＡｃｌＪＷ　２１内のＢｇ１部位において挿入され、ｐＡｃｌＨＥｓＴを誘導した。Ｊ　ＨＥのソゲナルペプチドをコートする領域の配列は、Ａａ旧Ｔのコーディング配列との関連において図１０に示されている。

（ｖｉ’）ｐＡｃＳＴＳＴ　（本発明）　天然ＡａＨＩＴ　（Ｂｏｕｇｉｓ、Ｐ。

Ｅ　、ら、Ｉ　９８９）に対するシグナルペプチド配列が５′に、そしてＢｇｌ　ＩＩ部位か両端にあるＡａ、ＨＩＴ遺伝子の＝１ピーを作るために、ポリメラーゼ連鎖反応か使用された。

５′−プライマーは・Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｐｈ−Ｌａｕ　ｌａｕ　ｔａｕ　Ｐｈｓ　Ｉａｕ　Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｌ＊ｕ’！’Ａ’ｆ’ＡＴＡＡＧＡＴＣ？　ＡＴＧ　ＡＡＡ　ｍ　ＣＴ’ ＣＣＴＡ　ＴＴＧ　Ｔ’Ｚ？　ＣＴＣＧＴＡ　ＧＴＣ０７？Ｐｒｏ工ｌ＠Ｋｓｔ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　ＧｌｙＣＱ　ＡＴＡ　ＡＴＧ　ＧＧＧ　ＧＴＧ　ＣＴＩ’　ＧＧＣＡＭ　ＭＡ　ＡＡＣ＜；ｃｃ　ＴＡＣＧＣＧ　ＧＴ！’　ＧＡＣＣＴＡＴＡＴＡＡＧＡＴＣＴ　ＴＴＡ　ＧＴＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＡＧＴ　ＡＧＴ　ＧＴＣてあった。

次に、Ｂｇｌ　ＩＩで消化された断片を、ユニークなりｇｌ　１１部位において、ｐＡｃＵＷ２１に挿入した。本ベクターを、ｐＡｃＳＴＳＴと名付けた。ＡａＨ［Ｔシグナルペプチド、及びＡａＨＩＴのコーディング領域の配列は、図１１に示しである。

（ｖｉｉ）　ｐＡｃＣＰ２ＳＴ　（発明）・本ベクターは、Ｄｒｏｓｏｐｈ　ｉ　ｌａｍｅｌｏｎｇａｓｔｅｒ　（Ｓｙｄｅｒ、Ｍ、ら、１９８２）からのＣＦ２に対するシグナルペプチド配列か、天然のＡａＨ［Ｔソゲナルペプチドの代りに加えられたことを除いて、ｐＡｃＳＴＳＴについてと同様に調製された。５′ プライマーは、Ｍ＠ｔ＾ｌａ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　ｔａｕ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｃｙｓ　Ｉａｕ　ｔａｕＴＡＴＡＴＡＡＧ入ＴＣＴ　ＡＴＧ　ＧＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴ　ＣＴＣＧＣＴ　ＴＧＣＴＧＣＣＴＧ　ＣＴＴＧｌｙ　Ｌａｕ　Ｌａｕ　入１ａ　Ｌａｕ　ＴＨｒ　Ｓ＠ｒ　ＡｌａＧＣＣＣＴＡ　ＣＴＧ　ＧＣＴ　ＣｒＧ　ＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＡＡ　ＡＡＡ　ＡＡＣＧＧＣＴＡＣＧＣＧ　ＧＴ？ＡＣＴＣてあり、ＴＡＴＡＴＡＡＧＡＴＣＴ　ＴＴＡ　ＧＴＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＡＧＴ　ＡＧＴ　ＧＴＣであった。

ＣＦ２−シグナルベプチトとＡａ、ＨＩＴコーディング領域は、ｌＡｌ２に示されている。

（ｖｉｉｉ）ｐＡｃＯＸＹｓＴ　（発明）　本ベクターは、天然ＡａＨ［Ｔソグナルペプチドの代りに、ラットからのオキトソンに対するソゲナルペプチド（Ｉｖｅｌｌ、　ＲとＴｉｃｈｔｅｒ、Ｄ、　。

＋９８４）か加えられたことを除き、ｐＡｃＳＴＳＴについてと同様に調製された。５′プライマーは、Ｍ＠ｔ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｐｈ＠Ｖａｌ　Ｍ＠ｔ　Ｘ１＠Ｉａｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｖａ１丁ＡＴＡＴＡＡＧＡＴＣＴ　ＡＴＧ　ＴＴｒ　ＡＡＡ　ＴｒＣＧＴＴ　ＡＴＧ　ＡＴｒ　ＣＴＡ　ＧＣＧ　ＧＴＴ　ＧＴ’ｌ ’Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　ＡｌａＧＧＣＧＴｒ　ＧＣＣＡＣＡ　ＧＣＧ　ＡＡＡ　入入＾　ＡＡＣＧＧＣτ入ｅ　ＧＣＧ　ＧＴｒ　ＧＡＣＴＣ。

ＴＡＴＡＴＡＡＧＡＴＣＴ　ＴＴＡ　ＧＴＴ　ＡＡＴ　ＡＡＴ　ＡＧＴ　ＡＧＴ　ＧＴＣテアッた。

士キノトキノンノグナルペプチドとＡａＨＩＴコーディング領域の配列は図１３に示されている。

（ｉｘ）ｐＡｃＵＷ２１８Ｐ　（本発明）、ＩｊＡ基性蛋白質遺伝子のプｒｒ　モーターをｐＡｃＭＰｌ　（Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓら、ｌ　９９０）からＡｓｐ　７１８とＢａｍＨｌて切除し、ｐＤＨ７の同し部位の間に挿入し、ｐ　Ｄ　Ｈ７Ｂ　Ｐを誘導した。次に、ポリメラーゼ連鎖方法を使用して、塩基性蛋白遺伝子プロモーターのコピーを作り、また、プロモーター断片の５′の端にＸｂａ　１部位も加えた。本断片は、次にｐＡｃＵＷ２１内のｐｌＯ遺伝子プロモーターの代りに挿入し、ｐＡｃｌＪＷ２１ＢＰと名付けた。

ｇｐ６７シグナルペブチトとトキシンコーディング領域を、Ｘｈｏ　ＩＩを使用してｐＡｃＳＴ−３から切除し、ｐＡｃＵＷ２１ＢＰのＢｇｌ　［１部位において挿入し、ｐＡｃＢＰＳＴを誘導した。ｇｐ６７とＡａ）Ｉ［Ｔコーディング領域との関連において、塩基性蛋白質とｐｌＯ遺伝Ｐプロモーターの配列は図１４に示しである。

（Ｘ）　ｐＡｃｓｅｆｌＴ　（本発明）：ｇｐ６７コーデイング領域を、上述したように、特定部位の突然変異誘発を使用して、５ｅｆｌＴ　ニア−ディング領域とともに（ｐＤＨ７−Ｓｅｆ　ＩＴにおいて）フレーム中に置いた。変化は、配列決定によって確かめられた。完全コーディング領域（ｇｐ６７とＳｅｆ［Ｔ　）を、１１ＤＨ７−３ｅｆ　ＩＴからＢｇｌ　ＩＩとＢａｍＨ（て切除し、ｐＡｃＵＷ２１のＢｇｌ　［１部位において挿入し、ｐＡｃｓｅｆ　ＩＴを誘導した。

５ｅｆｌＴコーデイング領域の配列は、ｇｐ６７シグナルペプチド領域とｐｌＯ遺伝子プロモーターとの関連において図１８と図１９に示されている。

胞を、ｐＡｃＳＴ−１とポリヘトリン陰性ＡｃＲＰ６−３Ｃ（Ｋｉｔｔｓら、１９９０）感染性ウィルスＤＮＡとて、カルシウムホスフェート法（Ｓｍｉｔｈら、＋９８３）を使用してコトランスフエクトした。組換え体ウィルスは、標準ブラークアッセイにおいて、ポリへドリンー陽性表現型として選択された。

（ｉｉ）ＡｃＳＴ−３（本発明）　：　ｐＡｃｓＴ−３をＡｃＲＰ６−３Ｃとともにリポフエクチン法（Ｆｅｌｇｎｅｒ　ら、１９８７　；　Ｇｒｏｅｂｅら、＋９９０）を使用してコトランスフェクトした。そして、ウィルスは前のコトランスフェクションについてのようにスクリーニングされた。

（ｉｉｉ）　Ａｃ１１２ＳＴ、　ＡｃＪＨＥＳＴ、　ＡｃＢＰＳＴ、　Ａｃ５ＴＳＴ、Ａｃ１１２ＳＴ。

Ａｃ０ＸＹＳＴ、Ａｃ５ｏｆｌＴ　（全部発明）　＋　Ａｃ５Ｔ−３について述べた如くである。

組み換え体ウィルスは、５回の連続のプラークアッセイによって精製し、ＡａＨ［Ｔ遺伝子に対して特異的な（３２Ｐ）放射標識オリゴヌクしオチドをプローブとして使用して、感染細胞からのＤＮＡのＥｃｏＲ消化物のササンハイブリッド形成によって確証した。

ウィルスで、細胞あたり１０ｐｆｕの感染の多重度（ｍｏｉ）で接種し、室温で１時間インキュベートした。接種物を除去し、２　ｍｌｓのＴＣ１００／１０％ＦＣ３て置換し、放射線標識前１５分まて、２８°Ｃてインキュベートした。

次に培地を除去し、０．５　ｍｉｓの飢餓培地（２９６透析ＦＣ８を含み、システィンを含まないＴＣ１００）を加え、プレートを２８°Ｃて１５分インキュベートした。この後、２０　μｃｉ　（３５Ｓ）システィンを補添した０、　５　ｍｌｓの飢餓培地を加え、１時間インキュベートした。変性１Ｏ−３０％ポリアクリルアミドグレーディエントゲル（Ｃｏｏｋら、＋９７９）中で、蛋白質の抽出物を分離し、次に、ゲルはクーマシーブルーて染色し、乾燥して、Ｘ線フィルムに暴露した。

非標識ウィルス感染細胞（上のＥ、または下のＧを参照）からの蛋白質抽出物を、ｌ　Ｏ−３０％の変性ポリアクリルアミドゲル中で分離し、Ｂｉｏ−Ｒａｄエレクトロプロット装置を使用して、トランスファー緩衝液として２５Ｍ−）リス、５．３Ｍ−グリシン、及び２０％メタノール中で、ｔｏｏｖで２時間ニトロセルローズフィルターにトランスファーした。フィルターを、３−５％の低脂肪粉ミルクを遮断剤として、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　−２０を含むＰＢＳ　（ＰＢＳＴ）中でインキュベートした。これは、室温において、１時間穏やかに振盪し、次に、ＰＢＳＴ中１／ｌ　０００に希釈した（同族ペプチドに対する間接的エリザにおいて、１：１０，０００を超える力価）合成ＡａＨＩＴに対して免疫したモルモットの血清とともに、さらに２時間インキュベートした。次に、ＰＢＳＴ中でフィルターを数回洗って非結合抗体を除去した。結合抗体は、抗モルモット［ｇＧ−アルカリホスファターゼ結合体を使用して検出された。

ｄｏｍｅｓｔｉｃａにおけるｉｎ　ｖｉｖｏアッセイ：注射による毒性凍結乾燥試料として、Ｓｉｇｍａから入手した全損ＡａＨ（１ｍｇ）を２０μｌＯＤＭＳＯ中に再懸濁させ、次に水で１００μｌに希釈した。沈澱した物質を、１５．０００ｇで５分間遠心分離することによって除去した。上清（２０μｍ）の精製を、スペクトロフロー７８３検出器を２８０ｎｍにセットして、ＬＣＤシステムを使用して、ＨＰＬＣによって行った。分離のためには、５ｐｈｅｒｉｓｏｒｂ、Ｃ３，５μｍの粒径、２５ｃｍのカラムか使用された。溶剤Ａは、ｐＨ２，７の０．１５Ｍアンモニウムホルメート、溶剤Ｂはアセトニトリルてあった。Ａ中１５％から４０％Ｂの線型グレーディエンドを、４０分間にわたって１ｍｌ／分の流速て行い、４０Ｘ１ｍｌの画分を集めた。両分を凍結乾燥して、アセトニトリルとアンモニウムホルメートを除去し、次に、水中０．１　ｍｇ／ｍｌのＢ５Ａ２００μｍに再懸濁させた。０．５μｍの各両分を１０匹のＭ、　ｄｏｍｅｓｔ　１ｃａ（雄と雌）の成虫に、２５ゲージの注射針を用いて注射した。

感染細胞からの上清の分析は、２皿の感染Ｓ、　ｆｕｒｇｉｐｅｒｄａからの上清を使用して行った（すなわち２　ｍ１ｓ）。これは、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濾過システムを使用し、５ｏｒｖａｌｌ　ＲＣ３遠心分離機上で、３時間、５０００Ｘｇにおいて遠心分離することによって４倍に濃縮した。濃縮した物質１００μ ｍを、ＨＰＬＣカラムにかけ、全毒液と同じように処理した。試料を、ＨＰＬＣ処理した後、両分を凍結乾燥し、１００μｌの０．１　ｍｇ／ｍｌ　Ｂ　Ｓ　Ａ中に再懸濁させた。各両分４μｌを使用して、た（Ｈｕｎｔｅｒら、１９８４）。アッセイはすへて、１度昆虫を通って通過させたポリへドラを使用して行った。初回通過のためには、第３齢のＴ、旧の幼虫は、感染細胞の粗抽出物を含んだ規定食プラグを消費し、その後は、幼虫を新鮮な規定食に移した。死の直後、昆虫を収穫し、プールした。ポリへトうを精製し、すべての他のアッセイのために使用した。

（１）感染した幼虫から回収した血リンパの生物活性トキシンの生物活性は、与えられた試料の連続希釈４μｍを、硬膜形成間のＭ、　ｄｏｍｅｓｔｉｃａの腹の側背領域に注射することによって評価した。ＡａＨの全毒液のＨＰＬＣから得たトキシンを含む両分を使用して、血リンパから回収したトキシンの量を算定するために、標準を作成した。両分を凍結乾燥して、９０１ｇ／１００μｍの濃度に再懸濁させた。これは、１８，９．４，５，２．２５゜または１．１２５ｎｇのトキシンを含む４μｍの注射に便利なように、ＰＢＳ中でさらに希釈した（１８ｎｇは、トキシンのＬＤ５０に対して過剰であることか示された）。

５０匹のＴ、ｎｉの第２齢幼虫（約０．６−０．７ｍｇ）を個別に、ミクロタイタープレート中、人工規定食の小さいプラグ上のウィルスのタイターの５回の連続希釈を与えた。理想的には、ウィルスの最大用量は９０％を越える死亡率を与えるはずであり、中間投与量は、１０％の死亡率を与える筈である。ＡｃＭＮＰＶの遺伝子操作を行わない株は、幼虫あたり１２０，６０，３０，１５．及び７．５ＰＴＢ’ｓてこれらの条件を満足した。幼虫は、２４時間以内に投与量を消費し、消費しなかった幼虫はアッセイから除外した。その他は、人工規定食の個別の容器に移し、暗いインキュヘーター中、２４時間飼育した。毎日幼虫を検査し、死体を除去し、スライド上に塗抹し、染色して検鏡し、死因を確認した。プロビット分析を使用して得られたデータを分析し、ＬＤ５０値を決定した（Ｆｉｎｎｅｙ、Ｉ　９７１　）。

（Ｋ）ＳＴ５０測定これらの研究に使用された新生幼虫を産生ずるために、産卵用のフィルターペーパーを含むケージの中で成虫を飼育した。卵かついているフィルターは表面殺菌し、プラスチックの容器の中に維持した。新生幼虫は、ふ化してから３−６時間餌を与えなかった後、様々なウィルス靜濁液の液滴を摂取さぜた。投与液か目視てきるように、５％青色食品着色料で懸濁液を着色させた。この懸濁液の小滴を集中リングとしてペトリ皿上に置いた。幼虫は、これら集中リングの中心部に導入され、その後は、皿の蓋まで這い上がる前に、液滴を通って動き、小容量の液体を摂取した。取扱い中に傷害をうけた幼虫は中央に残り、反復摂取と健康な幼虫の選択を行うことができた。

以前の研究から、この種の実験においては、Ｔ、旧の幼虫は０．００８７（±０．００２３）μｍを消費しく　ＨｕｇｈｅｓとＷｏｏｄ、ｌ　９８１　、　Ｈｕｇｈｅｓら、１９８６）、これらの５Ｔ５０アツセイにおいては、ウィルス懸濁液は、２×１０’のポリへドラ／ｍｌを含むことが分った。投与後、幼虫は人工規定食を入れた個別の容器中に維持した。２４時間後に幼虫をチェックし、死んだ幼虫はすべて除去した。これらの死は操作のためてあったからである。さらに４８時間経過後に、再び幼虫をチェックし、その後は頻繁にチェックを行った。

死んだ幼虫は除去し、外観と検鏡により死の原因を評価した。５Ｔ５０の計算は、Ｖｉｓｔａｔプログラムを使用して行った（Ｂｏｙｃｅ　ＴｈｏｍｐｓｏｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、１ｔＦｌａｃａ、−’−ニーヨーク）。

（ＰＩＢ’　ｓ）を接種した人工餌のプラグを個々に一夜給餌した。この高濃度の投与量は１００％の死亡か保証された。給餌後幼虫を、制御した環境で生育させたキャベツの葉で、５群に分けて囲った。給餌前に、葉を一夜浸漬して水分を飽和させた。給餌２日後に、葉の損傷を写真で評価した。

（Ａ）組換えウィルスによる蛋白質の合成ＡａＨＩＴは、７０アミノ酸（第一メチオニンを含む）から成る蛋白質配列をもち、推定分子量は８０００である。

Ａｃ５Ｔ　−１（分縮・シグナルのないＡａＨＩＴ　）またはＡｃ５Ｔ　−３リルアミトゲル中における抽出分析では、クーマシーブルーまたはンルハー染色のとちらによっても期待した大きさの特別の蛋白質を検出することに失敗した。ウィルス感染細胞を、次に、感染後の異なった時間ごとに、（”Ｓ）ノスティンで標識化した（図５）。これらの結果ては、ウィルスｐｌＯ蛋白質（ｐ１０蛋白質はソスティン残基か欠除している）の期待される位置の直下に移動した特別な蛋白質を示した。この推定ＡａＨＩＴの合成は、感染ｉ＆１８から３６時間の間か最大であった。蛋白質の組成は、合成ＡａＨＩＴに対し生じた抗血清によるＡｃ５Ｔ　−１またはＡｃ５Ｔ　−３感染細胞抽出物のウェスタンプロット分析を用いて確認した。

（Ｂ）　Ａａｉｌの全毒液と合成ＡａＨＩＴのＨＰ　Ｌ　ＣＨＰ　Ｌ　Ｃ記録では、Ａｃ５Ｔ　−３に感染した細胞の全毒液と培地中に存在する２　７／２８フラクシヨンの周辺の２８０ｎｍの光学密度の読みの位置にピークか出現したか、野生ヤウィルスの感染細胞には見られなかった。２５と２８の間のフラクションのウェスタンプロット分析では、素毒液の２７と２８のフラクションに、また、Ａｃ５Ｔ　−３に感染した細胞の上清の２６と２７のフラクションにＡａＨ［Ｔの存在を示した（図６）。

これらのフラクションのそれぞれの少量をＭ、　ｄｏｍｅｓ−ｔｉｃａに注射した結果、これらのフラクションに麻痺及び致死活性のあることを確認した。注射後一時間で、トキシンにより動けなくなり、注射後２４時間で死亡することか明らかになった（図７）。

（Ｃ）感染幼虫から回収したヘモリンパの生物活性生体内で、Ａｃ５Ｔ　−３感染細胞からのＡａＨＩＴの分泌物は、ウィルス感染Ｔ、旧幼虫からのへモリンパを回収し、そ染させた。注射７２時間後に、末端の前脚の上部を切断し、ヘモリンパを収集した（２０μｍ）。メラニン化を制限するため、ヘモリンパの全試料を集めるために用いるピペットは、フェニルチオウレア溶液で洗浄した。このヘモリンパ４μｌを、Ｍ、　ｄｏｍｅｓｔｉｃａの試験幼虫への注射に用いて毒性を評価した。その反応を、ＨＰＬＣて精製したＡａＨＩＴの全毒液を用いて作成した標準曲線と比較した結果を表２に示す。Ｍ、　ｄｏｍｅｓｔｉｃａの反応では、Ｔ、旧幼虫内のトキシンの濃度は、注射後７２時間で、ヘモリンパの約１．５−２．　Ｏｎｇ／μｌであることを示した。

表２　＋　Ａｃ５Ｔ　−３に感染した幼虫から回収したヘモリンパ投与量（ｎｇ）　Ａ　Ｂ　ＣＤ対照（ＰＢＳ）　１０　０　０１０１．１２５）　７　２　１　１０２．２５　）Ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ　２　５　３　１０４．５）ｏｆ　０　４　６　１０９．０　）ＡａＨＩＴ　Ｏ４６１０１８，０）　０　０　１０　１０ヘモリンパＡｃＮＰＶ　１０　０　０　１０ヘモリンパＡｃ５Ｔ−３０３７１０Ａ＝飛行力のある昆虫Ｂ−動けるが飛へない昆虫Ｃ＝動くことのできない昆虫Ｄ＝注射した昆虫数（Ｄ）組換えウィルスの生体内の活性組換えウィルスの生体内活性は、ＬＤ５０値の推定で評価した。Ｔ、旧の第２令幼虫を感染させた。反復個体に７．１５，３０．６０または１２０ＰＩＢ’　ｓの量を給餌した。その後の統計解析で、無修正ＡｃＭＮＰＶのＬＤ５０値は４４（９５％信頼限界は３５と５５）　、Ａｃ５Ｔ　−１は３８（９５％信頼限界は３１と４６）そしてＡｃ５Ｔ　−３（発明）は３１（９５％信頼限界は２７と３７）であった。ＡｃＭＮＰＶとＡｃ５Ｔ　−３のＬＤ５０値は、α＝０．０５で有意な差が認められる。ＬＤ５０値の相違は比較的小さく、１．４１９１の増加で、９５％信頼限界は１．０２６２１６−１．９８４６である。

新生虫の感染後の５Ｔ５０を評価した。しかしながら、５Ｔ５０データは、幼虫を殺すまでの時間を有意に減少させた。ＡｃＭＮＰＶの５Ｔ５０は、１１３．１（９５％信頼限界は１１２−１１５）、Ａｃ５Ｔ−１の値は１０９．２（９５％信頼限界は１０７−１１０）、そして、Ａｃ５Ｔ　−３（発明）は８５．８時間（９５％信頼限界は８５−８７時間）であった。Ａｃ５Ｔ　−３の結果は、分泌シグナルのない配列をコードするトキシンを含む無修正ウィルスまたはＡｃ５Ｔ１のそれとは有意な差がみられた（α＝０．０Ｏ０１）。

これは、Ａｃ５Ｔ　−３ウイルスがＡｃＭＮＰＶより少なくとも２５％早＜Ｔ、ｎｉを殺すことを意味する。これらの結果は表３に集約しである：ＡｃＭＮＰＶ　４４　（３５−５５）　１１３．１　（１１２−１１５）ＡｃＳＴ−１３８（３１−４６）　１０９．２　（１０７−１１０）ＡｃＳＴ−３３１（２７−３７）　”　８５．８　（８５−８７）”０　これは野生型ウィルスに関し、ＬＤ５０の統計的に有意な減少を表す（α＝０．０５）。

１　これは野生型ウィルスに関し、ＬＤ５０の統計的に有意な減少を表す（α＝０．０００１）。

（Ｅ）感染の病理ＡｃＭＮＰＶ、　Ａｃ５Ｔ　−１またはＡｃ５Ｔ　−３による感染後の病理もまた検査した。Ａｃ５Ｔ　−３に感染した幼虫は、Ａｃ５Ｔ　−１またはＡｃＭＮＰＶに感染した幼虫とは異なっていた。Ａｃ５Ｔ　−１またはＡｃＭＮＰＶによる感染では、大量のウィルスで、クリーム色に着色した幼虫の融解をもたらす組織の損傷を引き起こした。Ａｃ５Ｔ　−３の感染では、幼虫は、生体構造を完全に維持し、緑色のままであった。

（Ｆ）　Ａｃ５Ｔ　−３に感染した昆虫による給餌損傷の減少Ｔ、旧幼虫による作物の給餌損傷の減少に関するＡｃ５Ｔ−３組換えウィルスの効果は図８に示しである。

それぞれの組換えウィルス内に挿入した毒性遺伝子の発現は、５ｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させ、１時間間隔て定期的にそれぞれの培養皿を標識化することによって試験した。その結果は、図１５ａ、ｂに示しである。ＡｃＪＨＥＳＴは、感染後１２時間目にいくつかのトキシンを生し、１８ −３６時間の間に複合ピークを示した。

その後蛋白質生成の速度は減少した。このウィルスに感染した細胞中のトキシンの生成量はやや低いけれども、同じような結果かＡｃ１１２ＳＴ感染細胞に認められた。

（Ｈ）ハイブリッド遺伝子プロモーターをもつ組換えウィルスによる蛋白質の合成図１５ｃはまた、ＡｃＢＰＳＴ感染細胞中のサソリトキシン生成の動態を示す。

このウィルスは、感染後１２時間までにかなりの量でトキシンの生産を始めることは明らかである。生成量は、ｐｌＯ遺伝子プロモーターのみの制御下での毒性遺伝子をもつ組換えウィルスに感染した他のどの細胞よりも有意に高かった。ＡｃＢＰＳＴ感染細胞中でのトキシン生産は感染後４８時間まで続いた。

ウィルス感染Ｓｆ細胞の生長を支える培養液中に分泌したＡａＨＩＴの生物活性を表４に示す。培地はＭ、ｄＯｍｅＳｔｉＣａを用いて（Ｃ）に記載したように解析した。Ａｃ５Ｔ　−１は、培地中に活性トキシンを放出しないことは明らかである。

（Ｊ）別の分泌シグナルまたはハイブリッド遺伝子プロ各組換えウィルスのＬＤ５０値は、前に記載したように推定した（Ｄ）。これらの値は非常によく似ていた。

５Ｔ５０は、新生虫の感染後に評価した。Ａｃ５Ｔ　−３の５Ｔ５０は７１．４時間（９５％信頼限界は７０．６−７２゜２　）　、ＡＣＪＨＥＳＴは７７．７時間（９５％信頼限界は７６．７−７８．７　）　、Ａｃ［１２ＳＴは８７．２時間（９５％信頼限界は８６、　Ｉ　−８８，３）　、ＡｃＢＰＳＴは７３．１時間（９５％信頼限界は７１．８−７４．４）であった。

Ａｃ５Ｔ−３７１，４（７０，６−７２，２）ＡｃＪＨＥＳＴ　４６（３６−５９）　７７、７（７６、７−７８，７）Ａｃｌ１２ＳＴ　８７．２（８６，１− ８８，３）ＡｃＢＰＳＴ　５０（３６−６７）　７３．１（７１，８−７４，４）ＡｃＭＮＰＶ　４１（３４−４９）　１０８（１０６，９−１０９，１）れぞれ、受入番号ＮＣ［ＭＢ　４０３９３．　ＮＣ［ＭＢ　４０３９４及びＮＣ［ＭＢ　４０３９５で、１９９１年３月２２日にＧＢ。

アバディーンの国立産業及び海洋バクテリアコレクションに寄託した。

文献＾ｄａｃｈｉ、　Ｔ、、　Ｔａｋｉｙａ、　Ｓ、、　５ｕｚｕｋｉ、　Ｙ＋ｔ　ＩＶａ！ｌｉ、　Ｍ、、　ｙＪｗｌｋｌｌＪｌｌｉ。

Ａ、、　Ｔａｋａｈａａｈｉ、　Ｓ、Ｙ−、工５ｈｉｚａ）ｃｉ、　Ｔ１．、　Ｎａｑａｓａｖａ、　Ｈ，、ｇｕｚｕ３ｃｉ。

Ａ、　、　（１９８９）、　ａＤ！ｉＡ　５ｔｒｕｃｔｕｒ＠ａｎｄ　＠ｘｐｒｓｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｂａｔａｂｙｘｉｓ、　ａｎｉｎｓｕｌｉｎ−１ｉｋ＠　ｂｒａｉｎ　ｓ＠ｃｒｅｔａｒｙ　ｐｅｐｔｉｄｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｉｌｋｗｏｒｍｔｒａｒｕｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｍａｐｐｉｎｇ、　ａｎｄ　ｔ＠ｍｐｏｒａｌ　ｅｘｐｒｅｓｓｉ口ｎ　ｏｆ　ｔｈａ　ｇｐ６４＠ｎｖ＠１ｏｐｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｏｆ　ｔｈ＠　Ｏｒｇｙｉａ　ｐｓｓｕｄｏｔｓｕｇａｔａｍｕｌｔｉｃａｐｓｉｄ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈａｄｒｏｓｉｇ　ｖｉｒｕｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１７０：５コアー５５５゜Ｂｏｕｇｉｓ、Ｐ、！、、Ｒｏｃｈａｔ、Ｈ，，Ｓ＋ｍ１ｔｈ、Ｉｔ、八、（１９８９１，Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ　ｏｆＡｎｄｒｏｃｔｏｎｕｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ　５ｃｏｒｐｉｏｎ　ｎａｕｒｏｔｏｘｉｎｓ、　５ｔｒｃｕｔｕｒｅｓ　ｏｆｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓ、　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｏｕｔｃｏｍｅｓ、　ａｎｄ　ａ３１１Ｐｒａｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｔｏｘｉｎエエ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６４：１９２５９−１９２６５＋Ｂｒｏｗｎ、　Ｍ、、　Ｆａｕｌｋｎａｒ、　Ｐ＋（１９７７）　、　Ａ　ｐｌａｑｕｓｅ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｎｕｅｌａａｒｐｏｌｙｈ＠ｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　５ｏｌｉｄ　ｏｖｅｒｌａｙ、　Ｊ、　Ｇａｎ、　Ｖｉｒｏｌ、。

３６：　コロ１−３６４゜Ｃａｒｂｏｎ＠ｌｌ、　Ｌ、Ｆ、、　Ｈｏｄｇａ、　Ｍ、Ｒ，、Ｔｏｍａｌｓｋｉ、　Ｍ、Ｄ、、　Ｍｉｌｌａｒ、　Ｌ、Ｋ。

（１９８８）　、　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｇｅｎｅ　ｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ａｎ　１ｎｓｅｃｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｓｃｏｒｐｉｏｎ　ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ　ａｎｄ　ａｔｔｅｍｐｔｓ　セｏ　ｅｘｐｒｅｓｓ　ｉｔ　ｕｓｉｎｇｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｇａｎａ、７コ：　４０９−４１８゜ｃｏｏｋ、Ｒ，Ｆ、、Ａｖｅｒｙ、ＲｏＪ、、Ｄｉｍｏｃｋ、Ｎ−Ｊ、（１９７９）＋　工ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆｃｈｉｃｋｅｎ　ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔａｓ　ｗｉｔｈ　１ｎｆｌｕｅｎｚａ　ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｖｉｒｕｓｅｓ。

工ｎｆｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ１ｍ＋ｍｕｎｉｔｙ　２５：　３９６−４０２゜Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ、Ｊ、（：、（１９ｓ２１　、Ｆｉｓｌｄ　ｔｒｉａｌｓ　ｗｉｔｈ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓａｓ：ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｆｏｒｅｓｔ　１ｎｓｅｃｔ　ｐｅｓｔｓ＋　工ｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ　ａｎｄ　ｖｉｒａｌ工ｎ５ａｃｔｉｃｉｄｅｓ、ｐｐ、３３５−３８６．　Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｅ、Ｋｕｒｓｔａｋ、Ｍａｒｃ＠ＩＤｅｋｋｅｒ、　Ｎｎｗ　Ｙｏｒｋ。

Ｄｅｎｔ＠、Ｌ、、Ｃａ５ａｒ釦ｉ、Ｇ−、ａｎｄ　Ｃｏｒｔｅｓａ、Ｒ，（１９１１コ）　Ｎｕｃｌ、＾ａｉｄｓＲｅｓ、　Ｑ、　１６４５−１６５５．　ｐＥＭＢＬ：　ａ　ｎｅｗ　ｆａｍｉｌｙ　ｏｆ　ｓｉｎｇｌｅ　ｇｔｒａｒ＋ｄａｄｐｌａｓｍｉｄｓ。

Ｆａｌｇｎｅｒ、　Ｐ、Ｌ、、　Ｇａｄｅｋ、　Ｔ＋Ｒ，、ＨＯＩ町Ｍ、、　Ｒｏｍａｎ、　Ｐ＋、　Ｃｈａｎ。

Ｈ，Ｗ、、Ｗｅｎｚ、Ｍ、、Ｎｏｒｔｈｒｏｐ、Ｊ、Ｐ、、Ｒｉｎｇｏｌｄ、Ｇ、Ｍ、、Ｄａｎｉ＠１ｓｉｎ。

Ｍ、（１９８））、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ：　入ｈｉｇｈｌｙ　ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ、ｌｉｐｉｄ−ｍｄｉａｔｅｄＤＩ入−ｔｒａｎｌｌｆ＊ｃｔｉＯｎ　ｐｒｏｃ＠ｄｕｒｅ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、入ｃａｄ、Ｓｃｉ、（ｔＪｓＡ）。

８４：　７４１３−７４１７゜Ｆｉｎｎｅｙ、Ｄ、Ｊ、（１９）ｌ）、Ｉ’ｒｏｂｉｔ　Ａｎａｌｙｓｉｓ、コｒｄ　ｍ、ｅａｍｒｉｄｇｓｔｆｎｉｖａｒｓｉｔｙ　Ｐｒ＠ｓｓ、　Ｌｏｎｄｏｎ、　ＩＥｎｇｌａｎｄ。

ｃａｒｄｏｎ、　Ｊ、Ｄ−、Ｃａｒｓｔａｎｓ、　Ｅ、Ｂ、　（１９８４）、　Ｐｈａｎｏｔｙｐｉｃｃｈａｒａｃｔ＠ｒｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｐｈｙｓｉｃａｌ　ｍａｐｐｉｎｇ　ｏｆ　ａＶｉｒｏｌｏｇｙ、１３１１＝　６９−８１゜Ｇｒｏｔａｂ＊、Ｄ、Ｒ，、Ｃｈｕｎｇ、Ａ、Ｅ、、Ｈａ、Ｃ，（１９９０）、Ｃａｔｉｏｎｉｃｌｌｐｉｄ−ｍａｄｉａｔａｄ　ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　１ｎｓａｃｔ　ｃａｌｌｓ、　Ｎｕｃｌ、＾ａｉｄｓＲａｓ、、１８　（１３）＝　４０ココ。

Ｈａｍｍｏｃｋ、　Ｐ＋Ｄ−、Ｂａｎｎｉｎｇ、　Ｂ、Ｃ，、Ｐｏ５ｓｉａａ、　Ｒ，Ｄ−、Ｈａｎｚｌｉ）ｃ、　Ｔ−Ｎ、。

Ｍａａｄａ、　Ｓ−（１９９０）、　Ｅｘｐｒａｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｅｆｆａｃｔｓ　ｏｆ　ｔｈａ　ｊｕｖｅｎｉｌｅｈｏｎａｏｎａ　ａｓｔａｒａｓ＠　ｉｎ　ａ　ｂａｃｕｌａｖｉｒｕｓ　ｖｅｃｔｏｒ、Ｎａｔｕｒ＠、３４４二４５ｇ−４６１＋Ｈａｎｚｌｉｋ、Ｔ、Ｎ、、Ａｂｄ＠１−Ａａｌ、Ｙ、入、ニー、Ｈａｒｓ−ｎ、Ｌ、Ｇ、、Ｈａｍｍｏｃｋ。

Ｂ、Ｄ、（１９８９）、工ｇａｌａセｉｏｎ　ａｎｄ　ｓａｑｕａｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｃＤＮＡ　ｃｌａｎｇｓｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　ｊｕｖｅｎｉｌｅ　ｈｏｎａｏｎｅ　ａｓｔａｒａｓｅ　ｆａｎｓ　Ｈａｌｉｏｔｈｉｇｖｉｒｉｓｃｅｎｓ−Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、、　２６４：　１２４１９−４２４２５゜Ｈａｒｒａｐ、ｘ、入＋、Ｐａｙｎｅ、Ｃ，Ｃ，，Ｒｏｂａｒｔｓｏｎ、Ｊ、Ｓ、（１９７７）−艶ｅｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ　ｆｒｏｍ　ｃｌｏｓａｌｙ　ｒｅｌａｔａｄｈｏｓｔｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、フ９：　１４−３１゜Ｈｉｌｌ−Ｐｅｒｋｉｎｓ、　Ｍ、Ｓ、　ａｎｄ　Ｐｏ５ｓ＠ａ、　Ｒ，Ｄ、（１９９ｏ）、Ａ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖ＠ｃｔｏｒ　ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｃ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｏｆ　ΔＭ上≦とローｌ ηｈ轟　ｓｌ−−ＬＬ９ＩＩＬし；ａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈａｄｒｏｓｉｇ　ｖｉｒｕｓ、Ｊ。

ｑ＠ｎ、Ｖｉｒｏｌ＋　ヱＡ、９７１−９７６゜Ｈｏｏｆｔ　ｖａｎ　Ｉｄｄ＠ｋｉｎｇａ、　ＢＪ、Ｌ、、　Ｓｍ１ｔｈ、　Ｇ、Ｅ、、　Ｓｕｗａｒｓ、　Ｍ、Ｄ。

（１９８３）、Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｏｌｙｈ＠ｄｒｉｎ　ｇｅｎｅ　ｏｆＡｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｌｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ。

Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｌコ１：　５６１−５６５゜Ｈｏｒｏｄｙｓｋｉ、Ｆ、Ｍ、、Ｒｉｄｄｉｆｏｒｄ、Ｌ、Ｍ、、Ｔｒｕｍａｎ、Ｊ、Ｗ、、（１９８９）。

工５ｏｌａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｅｔａｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｃｌｏｓｉｏｎ　ｈｏｒｍｏｎ＠　ｇａｎｇｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｈｏｒｎｗｏｒｎ、Ｍａｎｄｕｃａ　５ｅｘｔａ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、８６：　８１２コー８１２７゜Ｈｕｑｂ軸、　Ｐ、Ｒ，、ｖａｎ　ｋ＊に、　Ｎ、＾、Ｍ、、　Ｗｏｏｄ、　ＨｏＡ、（１９ｅ６）、　Ａｍ０ｄｉｆｉｅｄ　ｄｒｏｐｌｅｔ　ｆｅｅｄｉｎｇ　ｍａｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｒａｐｉｄ　ａｓｓａｙ　ｏｆＢａｅｉｌｌｕｓ、　ｔｈｕｒｉｎｇｉ＠ｎ５ｇ１ｓ　ｙｍ　ｈａｃｕｌｃｙｖｉｒｕｍａｓ　ｉｎ　ｎｏｃｔｕｉｄｌａｒｖａ＠、　３．工ｒｒｖ＠ｒｔａｂ、　ｉ’ａｔｈｏ１．、４ｔｉ＝　ｚａ７−１’ ｊ２゜Ｈｕｑｂ・ｓｓ、　Ｐ、Ｒ，、１ｆｏｏｄ、　Ｂ、λ、　（１９１１１）、　Ａ　５ｙｎｃｈｒｏｎｏｕｓ　ｐａｒｏｖａｌｔａｃｂｎｉｑｕ＠ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｂｉｏａｓｓａｙ　ｏｆ　１ｎｓｅｃｔ　ｖｉｒｕｓｍ、　Ｊ、工ｒｒｖａｒｔａｂ。

Ｐａｔｈｏｌ、、ココ：　１５４−１５９Ｒｕｎｔ＠ｒ、　Ｆ、Ｒ，、Ｃｒｏｏｋ、　Ｎ、Σ、、　Ｅｎｔｖｉｓｔｌｅ、　ｐ、ｔ、　（１９８４１，ｖｉｒｕｓｅｓａｓ　ｐａｔｈｏｇａｎｓ＋　ｆｏｒ　ｔｈ＠ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　１ｎｓｅｃｔｓ、工ｎ　ＭｉｃｒｏｂｉａｌＭｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　ＥｒｒＶｉｒｏｎｍａｎｔａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＰＰ−３２３−３４７゜Ｅｄｉｔｅｄ　ｂｙ　Ｊ、Ｍ、　Ｇｒａｉｎｇａｒ　＆　Ｊ、Ｍ、　Ｌｙｎｃｈ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ　＆　Ｌｏｎｄｏｎ：入ｃａＪａｍｉｃ　Ｐｒ＠ｓｓ。

Ｉｖ＠ｌｌ、　Ｒ，、Ｒｌｃｈｔｅｒ、　Ｄ、　（１９８４１，５ｔｒｕｅｔｕｒ＠ａｎｄ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆｔｈ＠ｏｘｙｔｏｃｉｎ　ａｎｄ　ｖａｓｏｐｒ＠５ｓｉｎ　ｇａｎ＃Ａｓ　ｆｒｏｍ　ｒａｔ、　Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　！１１：　２００６−２０１０゜Ｋａｗａｋａｎｉ、　Ａ、、　Ｋａｔａｏｋａ、　Ｈ，、Ｏｋａ、　’！’、、　Ｍｉｚｏｇｕｃｈｉ、　Ａ、。

Ｋｉｍｕｒａ−Ｋａｗａｋａ！１１ｉ、Ｍ、、入ｄａｃｈｉ、Ｔ、、Ｉｗａｍｉ、Ｍ、、Ｎａｇａｓａｗａ、Ｈ，。

５ｕｚｕｋｉ、λ、、工５ｈｉｚａｋｉ、　Ｈ，、１９９０，Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅＢｏｍｂｉｘ　ｍｏｒｉ　ｐｒｏｔｈｏｒａｃｉｃｏｔｒｏｐｉｃ　ｈｏｒｏ＋ｏｎａ、Ｓｃｉ＠ｎｃｅ、２４フ：１コ３３ −１ココ５゜Ｋｉｔｔｓ、、ＰＪ、、λｙｒｅｓ、　Ｄ、、　Ｐｏ５ｓｅ＠、　Ｒ，Ｄ、（１９９０１，Ｌｉｎｅａｒｉｚａｔｉｏｎｏｆ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ　ｅｎｈａｎｃ＠ｓ　ｔｈｅ　ｒ＠ｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｒｅｃｏ！１１ｂｉｎａｎｔａｘ７ｒｅｓｓｉｏｎ　ｖ＠ｃｔｏｒｓ、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ、　Ｒａｓ、、　１８（１９）：　５６６７−５６７２Ｋｕｎｋｅｌ、Ｔ、Ａ、、（１り８５）、Ｒａｐｉｄ　ａｎｄ　ｅｆｆｉｃｉ＠ｎｔ　５ｉｔｅ　ｇｐａｃｉｆｉｃｍｕｔａｑ＠ｎｅｓｉｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｐｈ＠ｎｏｔｙｐｅ　５ａｌｅｃｔｉｏｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａセ１．Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（ＵＳＡ１．　８３：　４８Ｂ−４９２゜Ｋｕｚｉｏ、Ｊ、、Ｒｏｈａｌ、Ｄ、Ｚ、、Ｃｕｒｒｙ、Ｃ，Ｊ、、Ｋｒｅｂｓ、入、、Ｃａｒｓｔｓｎｓ。

Ｅ、Ｂ−、Ｆａｕｌ）ｃｎｅｒ、　Ｐ、（１９８４）、　Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈａ　ｐｌ。

ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　ｇ＠ｎｇ　ｏｆ　Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈａｄｒｏｓｉｇ　ｖｉｒｕｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、１コ９：　４１４−４１８＋Ｌｉｖｉｎｇｓセｏｎａ、Ｃ，、Ｊｏｎａｓ、Ｘ、（１９８９）、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｓ　ｗｉｔｈ　ｓｉｎｇｌｅ　５ｔｒａｎｄ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ、　Ｎｕｃｌ、　Ａｅｉｄｓ　Ｒｅｓ、。

１フ：　２コロ６゜Ｌｏｒａｔ、　Ｅ、Ｐ、、　Ｍａｎｓｕｅｌｌａ、　Ｐ、、　Ｒｏｃｈａｔ、　Ｈ−、Ｇｒａｎｉ＠ｒ、　Ｃ，（１９９０）−Ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎｓ　ａｃｔｉｖｅ　ｏｎ　１ｎｓｅｃｔｓ：　Ａｍ１ｎｏ　ａｃｉｄ　５ａｑｕａｎｃａｓ。

ｃｈａｍｉｃａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ、ａｎｄ　５ｅｃｏｎｄａｒｙ　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ　＠ｓｔｉｍａｔｉｏｎｓｂｙ　ｃｉｒｅｕｌａｒ　ｄｉｃｈｒｏｉｍ　ｏｆ　ｔｏｘｉｎｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　５ｃｏｒｐｉｏｎＡｎｄｒｏｃｔｏｎｏｕｓ　ａｕｓｔｒａｌｉｓ　Ｒｅｃｔｏｒ、飢ｏｃｈａｍｉｓｔｒｙ、　２９：　Ｘ４９２−１５０１Ｘａｍａ、　５．　（１９１５９）、工ｎｃｒａａｓｅｄ　１ｎｓａｃｔｉｃｉｄａｌ　ａｆｆｅｃｔ　ｂｙ　ａ１１７フーｉｌｌコ。

ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｉｎ　１ｎｓｅｃｔ　ｃ＠ｌｌｓ、　Ａｐｐ、　Ｅｎｖ、　Ｍｉｃｒｏｂ、、　５６：２フロ４−２フフＯ０Ｍａｔｓｕｕｒａ、　Ｙ、、　Ｐｏ５ｓａａ、　Ｒ，Ｄ、、　（Ｍｒｔｏｎ、　Ｈ，Ａ、、　Ｂ１５ｈｏｐ、　Ｄ、Ｈ，Ｌ。

（１９Ｂ？）、　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ：　ｔｈａ　ｒｎｑｕｉｒａｍ＊ｎｔｓｆｏｒ　ｈｉｇｈ　ｌ＠ｖｅｌ　ｅｘｐｒ＠５ｓｉｏｎ　ｏｆ　ｐｒｏｔａｉｎｓ、　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｇｌｙｃｏｐｒｏｔ＠ｉｎｓ、Ｊ、Ｇａｎ、Ｖｉｒｏｌ、、６Ｂ＝　１２ココ−１２５０゜Ｍ＊ｒｒｙｖ＠ａｔｈｅｒ、　Ａ、Ｔ、　Ｗｅｙｅｒ、　Ｕ、、　Ｈａｒｒｉｓ、　Ｍ、Ｐ、Ｇ、　Ｈｉｒｓｔ、　ｌ’ｉ、。

Ｂｏｏｔｈ、　Ｔ、、　Ｐｏ５ｓａａ、　Ｒ，Ｄ、（１９９０）、　Ｃｏｎ５ｔｒｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇ＠ｎａｔｉｃａｌｌｙｓｎｇｉｎａ＠ｒ＠ｄ　ｂａｅｕｌｏｖｉｒｕｓ　１ｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ　５ｕｂｓｐ、ｋｕｒｓｔａｋｉ　ＨＤ−フ３　ｄｅｌｔａ　＠ｎｄｏｔｏｘｉｎ、Ｊ。

Ｇａｎ、　Ｖｉｒｏｌ、、　７１：　１５３５−１５４４゜Ｎｏｊｉｒｉ、Ｈ，、ｌ５ｈｉｄａ、Ｘ、、Ｍｉｙａｓｈｉｔａ、Ｅ、、５ａｔｏ、Ｍ、、υｒａｎｏ、入、。

Ｄａｇｕｓｈｉ、Ｔ、（１９８７１，Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　５ｅｑｕ＠ｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｃＤＮＡｓｆｏｒ　ｎａｕｒｏｈｙｐｏｐｈｙｓｉａｌ　ｈｏｒｍｏｎｅｓ　ｖａｓｏｔｏｃｉｎ　ａｎｄ　ｍｅｓｏｔｏｃｉｎ　ｆｏｒｔｈｅ　ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ　ｏｆ　ｔｏａｄ、Ｂｕｆｏ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　８４：　３ｏ４３−３ｏａ６＋Ｐａ５ｓ＠ｓ、　Ｒ，Ｄ、（１９８６）、　Ｃｅ１ｌ−ｓｕｒｆａｃ＠＠ｘｐｒ＠５ｓｉｏｎ　ｏｆ　１ｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ　ｈａｗａｑｇｌｕｔｉｎｉｎ　ｉｎ　１ｎｓｅｃｔ　ｃａｌｌｓ　ｕｓｉｎｇ　ａ　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒ、Ｖｉｒｕｓ　Ｒａｓ＠ａｒｃｈ、５：　４３−５９゜５ａ！ＩＬｂｒｏｏｋ、Ｊ、、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、Ｅ、Ｆ、、Ｍａｎｉａｔｉｇ、丁、（１９ｇ９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　ＨａｖＹｏｒｋ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ。

Ｓａｎｇ＠ｒ、　Ｙ、、　Ｎｉｃ］ｃｌａｎ、　ｆ＞、、　Ｃｏｕｌｓｏｎ、λ −Ｒ，（１９７７）、　ＤＮＡ５＠ｑｕ＠ｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ− ｔ＠ｒｍｉｎａｔｉｎｇ　１ｎｈｉｂｉｔａｒｓ、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、（υ！９Ａ）、　７４：　５４６３−５４６７−５ｚｉｔｈ、　Ｇ、！、、　Ｆｒａｓａｒ、　Ｍ、Ｊ、、　Ｓｕｍａｒｉ、　Ｍ、Ｄ、（１９８３）、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ＠ｎｇｉｎｓｎｒｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ＾ｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈａｄｒｏｓｉｇ　ｖｉｒｕｓ　ｑ＊ｎｏｍｅ＝　ｄ＠１ｅｔｉｏｎｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈａ　ｐｏｌｙｈ＊ｄｒｉｎｇａｎｇ、Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、、４６：　５８４−５９３゜５ｎｙｄ＊ｒ、　Ｍ＋、　Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ、　Ｍ、、　Ｙｕｅｎ、　Ｄ、、　ｇｉｌｖａｒｔ、　Ｄ、。

Ｆｒｉｇｔｒｅｙｍ、　：ｆ、、　Ｄａｖｉｄｓｏｎ、　Ｎ、　（１９８２）、　Ｃｕｔｉｃｌｅ　ｐｒｏｔａｉｎ　ｇａｎｇｓ　ｏｆＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ＝　５ｔｒｕｃｔｕｒ＠、　ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ａｒｉｄ　＠ｖｏｌｕｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｏｕｒｃｌｕｓｔｅｒ＠ｄ　ｇａｎａｓｓ、　Ｃａ１ｌ、　２９：　１０２７−１０４０゜Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ、　？、、　Ｍａｔｓｕｉ、　Ｈ，、Ｆｕｊｉｔａ、〒、、　？ａｋａｏにａ、　Ｃｍ。

ｂｓｈｉｍｉａ、Ｎ−、Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ、Ｒ，、Ｈａｉａｕｒｏ、３．　（１９８コ）、５ｔｒｕｃｔｕｒ＋ａａｎｄ　＠ｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ａ　ｃｌｏｎａｄ　ｃＤＮＡ　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　１ｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２゜Ｎａｔｕｒｅ、３０２＝　３０５−３１０゜ｖａｎ　Ｈｏｆｓｔ＊ｎ、Ｐ−、Ｆａｙｓ、　工、、　ＫｏＣｋｕｍ、　Ｋ、、　ＩＡａ、　ｉｙ、ｙ＋１Ｘａｎｔｈｏｐｏｕｌｏｓ、　Ｋ、Ｇ、、　Ｂａｍａｎ、　１．Ａ、、　Ｂｏｍｎ、　Ｈ，Ｇ、、　Ｅｎｇｓｔｒｏｍ、？　、。

Ａｎｄｒｓｕ、　Ｄ、、　Ｍａｒｒｉｆｉ＠ｌｄ、　Ｒ，Ｂ、（１９８５１，Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ。

ｅＤＮＡ　ｓａｑｕａｎｃｉｎｇ、ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｃ命ｃｒｏｐｉｎ　Ｂ　ｆｒｏｍＨｙａｌｏｐｈｏｒａ　ｃ＊ｃｒｏｐｉａ、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）、　５１２＝２２４０−２２４コ。

Ｖａｕｇｈｎ、　Ｊ、Ｌ、、　Ｇａｏｄｗｉｎ、　Ｒ，Ｈ，、Ｔｏｍｐｋｉｎｓ、　Ｇ、Ｊ、、　ＭｃＣａｗｌｅｙ、　Ｐ。

（１９７７）、　Ｔｈｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｗｏ　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　１ｎｓｅｃｔＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ　（Ｌｅｐｉｄｏｐｔａｒａ：　Ｎｏｃｔｕｉｄａ＠）、工ｎ　ｖｉｔｒｏ。

１コニ　２１コー２１７゜Ｍａｙ＠ｒ、　Ｕ、、　）Ｃｎｉｇｈｔ、　Ｓ、、　Ｐｏ５ｓｅａ、　Ｒ，Ｄ、（１９９０）、　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆｖ＠ｒｙ　ｌａｔ＠ｇｅｎ＠ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂｙ　Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈａｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｅｘｐｒ＠５ｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ＋　Ｊ、Ｇａｎ、Ｖｉｒｏｌ、、７１：　１５２５−１５３４・Ｗｈｉｔｆｏｒｄ、　Ｍ、、　Ｓｔｓｗａｒｔ、　Ｓ、、　Ｋｕｚｉｏ、　３．、　Ｆａｕｌ）ｃｎａｒ、　Ｐ、（１９Ｂ９）。

Ｉｄａｎｔｉｆｉｃａｔｉａｎ　ａｎｄ　５ａｑｕ＠ｎｃａ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａ　ｇａｎ＠ｅｎｃｏｄｉｎｇｇｐ６７、ａｎ　ａｂｕｎｄａｎｔ　ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔ＠ｉｎ　ｏｆ　ｔｈ＠　ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ入ｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　Ｎｕｃｌａａｒ　Ｐｏ１ｙｈａｄｒｏｓｉｓ　Ｖｉｒｕｓ、Ｊ−Ｖｉｒｏｌ、、６３：　ｘｙ９コー１３９９゜ＷＨＯ，（１９）：Ｉ）、Ｔｈｅ　ｕｓｅ　ｏｆ　ｖｉｒｕｓ＠ｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　１ｎｓａｃｔｐａｓｔｓ　ａｎｄ　ｄｉｓａａｓａ　ｖｅｃｔｏｒｓ、ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　ａ　ｊｏｉｎｔ　ＦＡＯ／ＷＯｍｅｅｔｉｎｇ　ｏｎ　１ｎｓｅｃｔ　ｖｉｒｕｓｅｓ＋Ｗｏｒｌｄ　Ｈａａｌｔｈ　ＯｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎＴｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｐｌｉｎｔ　５ａｒｉａａ　Ｎｏ　５コ１．　Ｇｅｎａｖａ。

Ｗｉｇｌｅｙ、　Ｐ、Ｊ、（１９７６）、　Ｔｈｅ　ｅｐｉｚｏｏｔｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ａ　ｎｕｃｌ＠ａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｏｇｉｓ　ｖｉｒｕｓ　ｃ！１ｓｅａｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｗｉｎｔｅｒ　ｍｏｔｈ　Ｏｐａｒｏｐｈｔａｒａｂｒｕｍａｔａ　Ｌ、　ａｔ　Ｗｉｇｔｍａｎ’ｓ　Ｗｏｏｄ、　Ｄａｒｔｍｏｏｒ、　Ｄ、　Ｐｈ１１．　ｔｈｅｓｉｓ。

Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　０ｘｆｏｒｄ、Σｎｇｌａｎｄ。

Ｙａｎｉｓｃｈ−心ｅｒｒｏｎ、　Ｃ，、Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、　ａｎｄ　Ｍａｓｓｉｎｇ、　Ｊ、（１９８５）−１！１１ｐｒｏｖｅｄ　）１１３　ｐｈａｇａ　ｃｌｏｎｉｎｇ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｈｏｓｔ　５ｔｒａｉｎｓ：ｎｕｃｌ＠ｏｔｉｄｅ　５ａｑｕｔｎｃａｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｍｌコ　１ｐ１８　ａｎｄ　ｐυＣ１９ｖｅｃｔｏｒｓ。

Ｇｏｎｅ　ココ、１０３−１１９゜浄書（内容に変更なし）ＢａｍＨＩ　λｃｃＩ＆１・　ΩΔ工；；入入入Ｔ八へＧ入入入λ入入入入ｃｃｃｃＴ入ＣＧＣＧＧＴＴＧＡＣＴＣＧＴＣＧＧＧＣλ入ＡＧＣＣＣＣλＧ入入ＴΩF ＧＣＴ入ＣＴＧＴＴΩ工Ｒａｍ）ｒ工　入ｃｃ工　Ｘｂａ：Ｃ５，ＱΔ工；；ｋＣＧＴＧＸＣＧＴＱＸＳ工Δ；τ大入ＧＣＴＬ：ａＴτ入ＣＴＣＴτＴＴＧＧＣＣτ入λ入ＣＧＡ（ＪａＡＣＡ入λλλOＣ：τ Ｃ６・　Ｃエユ；Δ；工ΩＱＣ入ＧＡＴＧλＴＴＣＧλＣ入ＡτＧ入Ｃ入入入＾ｃｃｃｃ入ＴτＴＧＣτＧＣτａＴτττττ−ｄ７．　；工ΔΩｂ入入ＴＴＡＧＣＣＡＣＡＣＴＣＧＴ入入入入ＧＣＴＡＣＴＧＴｃＡＣＡＣＴＡＣＴＡＴＴＡＴＴ　入ＡＣτ入入−Ｂｑ１エエ入Ｃ；工と２ニーＬｉｄａ　、　ＴＴＴλ入ＴＣＧＣＴＧＴＧｋＧＣＡτＴＴＴＣＧＡτＧＡＣＡＣＴＧＴＣλτＧ入τ入入τ入入τＴＧＡＴＴＴＣＴＡ−ＡＣＣＳＣＥコポリヘトリン　ロコ　９ｐ６７分泌シグナル　□ＡｃＮＰＶ　配ダｊＣＡＴＴＣＴＣ；ＣＣＴＴＴＦ−Ｃに　大入ＡＡＡＡＡＡＣＧＧＣＴＡ　こ１３０　１４０　１５０　１６０　１７０　１ＥＩＱ［？′Ｖ　へ１　。

■ 〒（で　−一１−事件の表示生物学的防除剤６、補正により増加する発明の数７、補正の対象明細書、請求の範囲及び要約書翻訳文手続補正書（自発）１、事件の表示２、発明の名称生物学的防除剤３．１１正をする者事件との関係　特許出願人氏名（名称）　ロウセル　−　ラフラフ（ほか　１名）５、補正命令の日付６、補正により増加する請求項の数７、補正の対象図面の翻訳文８、Ｍ正の内容　別紙のとおり図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）、ｍｌＡ＋＋ｌＩ＋、＋＋Ｎ自ＰＣＴ／ＧＢ９２１００５０１フロントページの続き（５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／８６（７２）発明者　ケイリー、パトリシア　ジェーンイギリス国エイチピ−４２デイーワイハートフオードシヤー、パークハムステッド、レイジング　レーン（番地ない、ロウセル　ラフラフ　エンバイロンメンタルヘルス　気付（７２）発明者　スチュワード、ローナ　メリー　ディエツトイギリス国イージー１エイ　７ビーイーロンドン、バーソロミューズ　クロース５９、インペリアル　キャンサー　リサーチファント、ドミニオン　ハウス　気付Ｉ（７２）発明者　ボッシー、ロバート　デビットイギリス国オックスフォードシャー、オーエックス１３ニスアール、オックスフォード、マンスフイールド　ロード（番地なし）、エンイーアールシー　インスチチュート　オブ　ピロロシイ　アンド　エンバイロンメンタル　ミクロバイオロジイ　気付（７２）発明者　ファーバー、ミゲル　ロペツイギリス国オックスフォードシャー、オーエックス１３ニスアール、オックスフォード、マンスフイールド　ロード（番地なし）、エンイーアールシー　インスチチュート　オブ　ピロロシイ　アンド　エンバイロンメンタル　ミクロバイオロジイ　気付

Claims

【特許請求の範囲】

１．感染細胞に、殺虫性トキシンからなる外来蛋白質を発現させ；当該トキシン又はその機能的誘導体がシグナルペプチドによって昆虫細胞から分泌するようになる特性を備えた組換えバキュロウィルス。
２．組換えバキュロウィルスがＡｕｔｏｇｒａｐｈａＣａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ＭＮＰＶ，Ｂｏｍｂｕｘ　ｍｏｒｉ　ＮＰＶ，Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ　ＺｅａＮＰＶまたはＢｕｚｕｒａ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｕｒｉａ　ＮＰＶである請求の範囲第１項記載の組換えバキュロウィルス。
３．トキシンはサソリ毒又はクモ毒である請求の範囲第１項または第２項記載の組換えバキュロウィルス。
４．トキシンはＡａＨＩＴである請求の範囲第３項記載の組換えバキュロウィルス。
５．シグナルペプチドは、哺乳動物または昆虫の分泌シグナル配列である、前項クレームのどれにも記載する組換えバキュロウィルス。
６．シグナルペプチドは、バキュロウィルスシグナル配列である、請求の範囲第１項から第４項のどれにも記載の組換えバキュロウィルス。
７．シグナル配列は、ｇｐ６７シグナル配列である請求の範囲第６項記載の組換えバキュロウィルス。
８．製造方法が：（ｉ）殺虫性トキシンからなる外来蛋白質をエンコードするキメラ遺伝子を、バキュロウィルス転位ベクター内で、昆虫細胞に外来蛋白質の発現を可能にするプロモータの下流制限位置にクローニングする、そして（ｉｉ）（ｉ）の方法で得た組換え転移ベクターと元の野生型バキュロウィルスＤＮＡを、バキュロウィルス感染に感受性の細胞に同時移入させ；キメラ遺伝子が、トキシン又はその機能的誘導体からなる外来蛋白質と、外来蛋白質を昆虫細胞から分泌させるシグナルペプチドをエンコードする特性を備える、ことからなる組換えバキュロウィルスの製造方法。
９．不活性担体又は稀釈剤及び請求の範囲第１項から第７項のどれにも請求されている組換えバキュロウィルスからなる殺虫組成。
１０．当該方法が、請求の範囲第１項から第７項のどれにも請求されている組換えバキュロウィルスの有効量を遺伝子座に与えることからなる、遺伝子座で昆虫を制御する方法。
１１．請求の範囲第１項に定義するような外来蛋白質をエンコードする分離したキメラ遺伝子。