JPH06510671A - キメラ抗体の製造−組合せアプローチ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 キメラ抗体の製造−組合せアプローチ 本発明は抗体の製造に関する。より詳しくは、本発明は、同一抗原に特異的な親 の抗体よりも増加されたヒトの特性を有する抗体の製造に関する。

ハイブリドーマ技術を使−っで多数の舊歯類モノクローナル抗体力）単離されて おり、ヒトにａいて生体内での治療目的や診断目的（こ使われている。例えば、 それらのマウスモノクローナル抗体の初期の適用は腫瘍を抹殺するためまたは画 像診断するための標的剤としててあッｆ二（Ｆ、Ｈ，Ｄｅｌａｎｄおよびり、Ｍ 、　Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、　１９８２．−Ｒａｄｉｏ−ｎｕｃｌｉｄｅ　１ｍ ａｇｉｎｇ−Ｄ、ε、　Ｋｕｈ１編、　２８９−２９７頁、　Ｐｅｒｇａｍｏｎ 、　Ｐａｒｉｓ　ＩＲ，ＬｅｖｙおよびＲ，Ａ、　Ｍｉｌｌｅｒ、　Ａｎｎ、　 Ｒｅｖ、　Ｍｅｄ、’、１９８３．３４．　１０７−１１６頁）。しかしながら 、そのような抗体の生体内使用は問題を引き起こし得る。外来の免疫グロブリン は抗グロブリン応答を管起せしめ（ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答として知 られる）、該応答（よ療法を妨害しくＲ，Ａ、　Ｍｉｌｌｅｒら、　１９８３． 　Ｂｌｏｏｄ、　６２．９８８−９９５）またにアレルギー性過敏症もしくは免 疫複合体過敏症を引き起こし得る（Ｂ、Ｒａｔｎｅｒ、１９４３．　八ｌｌｅｒ ｇｙ、Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ　ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ。

Ｗｉｌｌｉａｍｓ　ａｎｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ、　Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）　６それ らの問題を解決するために、Ｗｉｎｔｅｒと同業者（ＧＢ　２１８８６３８Ｂ） は、そのような抗体をヒト化する、即ち「再構築する（ｒｅｓｈａｐｉｎｇ）　 」方法を開発した。抗原結合部位を含んで成るマウス抗体の相補性決定領域（Ｃ ＤＲ）をヒトのフレームワーク領域中に挿入し、それ（＝よってＣＤＲ配列のみ か元のマウス抗体に由来する抗体を作製する。

これは、ｒＣＤＲ移植ｊまたはｒＣＤＲ刷り込みＪとして知られる技術である。

そのような１つの再構築された抗体ＣＡＭＰＡＴＨ−１（Ｌ。

Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、　＋９８８．　Ｎａｔｕｒｅ　３２２．３２３−３２７ 頁）かＢ細胞リンパ腫（Ｇ、　Ｈａｌｅら、　１９８８．　Ｌａｎｃｅｒ　２． １３９４−１３９９頁）、脈管炎（Ｐ、　Ｗ。

！１ｉａｔｈｉｅｓｏｎら、　Ｎｅｗ、　Ｅｎｇｌ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、、　１９ ９０．３２３．２５０−２５４頁）および慢性関節リウマチ（Ｖ、　Ｋｙｌｅら 、１９９１．　Ｊ、　Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、１８．　１７３７−１７３８頁）の 治療において好結果に使われている。これは癌マーカー、例えばインターロイキ ン−２レセプター（Ｃ０Ｑｕｅｅｎら、　１９８９゜Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　８６．１００２９−１００３３頁）：表皮増 殖因子レセプター（Ｃ，Ａ、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、＋９９１．　Ｐｒ ｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇ、４．　７７３−７８３頁；　Ｐ、　Ｃａｒｔｅｒら、１９ ９２．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８９゜４２８５− ４２８９頁）および癌胎児抗原（Ｋ、　Ｂｏｓｓｌｅｔら、　１９９２．　Ｂｒ １ｔ。

Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　６５．２３４−２３８頁）に対して向けられた治療目的の 多数の抗体のヒト化を促した。感染性ウィルスに対して向けられた多数の抗体、 例えばＲＳウィルス（Ｐ、Ｒ，Ｔｅｍｐｅｓｔら、’　１９９１．　Ｂｉｏ／Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９、２６６−２７１頁）：単純ヘルペスウィルス（Ｍ、Ｓ、 　Ｃｏら、　１９９１．　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８８．２８６９−２８７３頁）お よびヒト免疫不全ウィルス（Ｈ９Ｍａｅｄａら、　１９９１．　Ｈｕｍａｎ　Ａ ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　ａｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　２゜１２４−１３４頁） に対して向けられた抗体もヒト化されている。ヒト化された抗体は、放射性同位 体で標識後、腫瘍の画像診断にも使われている（Ｖ、　Ｈｉｒｄら、　１９９１ ．　Ｂｒ１ｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　６４．９１１−９１４頁）。

好結果の再構築は、各ドメインのβ−ソートの方向および重鎮と軽鎖の一緒の詰 め込みの両方か構造的に保持されている翼歯頚とヒトのフレームワーク領域に依 存する。超可変性ループが抗原との接触の大部分を行っており、該ループは基礎 をなすβ−シートフレームワークにより同様な方法で保持される。それらの条件 は幾つかの抗体には正しいらしいか、成る抗体ではループとフレームワークとの 鍵状接触の回復か必要なことかわかり、これは分子モデル作製（Ｒｉｅｃｈｅｍ ａｎら、　１９８８．前掲、Ｔｅｍｐｅｓｔら、　１９９１．前掲）や−次配列 の相違を最少にするような署歯類とヒトのフレームワーク領域の組織的合致（Ｑ ｕｅｅｎら、　１９８９．前掲；　Ｇｏｒｍａｎら、　１９９１．前掲：　Ｍａ ｅｄａら、前掲）により支持された。重鎮および軽鎖可変ドメインの両方のＣＤ Ｒの基礎をなす“Ｖｅｒｎｉｅｒ“帯に多数の残基があり、この“Ｖｅｒｎｉｅ ｒ”帯かＣＤＲ構造を調整しそして抗原と合うように微調整し、よって親和性と 特異性に強力な効果を及ぼし得ることか研究により示されている（Ｊ、　Ｆｏｏ ｔｅおよびＧ、　Ｗｉｎｔｅｒ、　１９９２．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ。

２２４、４８７−４９９）。このアプローチの変形は、埋没するアミノ酸残基は マウス抗体に由来しそして露出するアミノ酸は相同のヒトフレームワークに由来 するというヒト／マウスキメラフレームワーク上にマウスＣＤＲを転移せしめる ことである（Ｅ、Ａ、　Ｐａｄｌａｎら、１９９１゜Ｍｏ１．　１ｍｍｕｎｏ１ ．２８．４８５−４９８　）。

ＣＤＲ移植の過程は、非ヒト（動物）抗体からヒト抗体への抗原結合部位の転移 を含む。はとんどの場合、重鎮と軽鎖の両方からの３つのＣＤＲ全でが動物抗体 から１つのヒトフレームワークに移植されている。幾つかのＣＤＲは抗原への結 合に関与しないことかあり、また異なる配列を有するＣＤＲか同じ折りたたみを 有することができる（従って異なる配列にもかかわらず抗原から主鎖への接触か 保持され得る）ため、常に全てのＣＤＲを移植する必要はないと予想される。実 際、単一のドメイン（Ｗａｒｄら、　１９８９．　Ｎａｔｕｒｅ　３４１゜５４ ４−５４６頁）または単一のＣＤＲでさえも（Ｒ，Ｔａｕｂら、　１９８９．　 Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２６４．２５９−２６５頁）それだけで抗原結合活性 を有することかできる。しかしながら、ＣＤＲの全部を移植するにせよ幾つかだ けを移植するにせよ、ＣＤＲ移植の意図は、同じまたはほとんど同じ抗原部位を 動物抗体からヒト抗体に移植することである。

構造的には、最も単純な抗体（ＩｇＧ）は４本のポリペプチド鎖、即ちジスルフ ィド結合によって相互に連結された２本の重（Ｈ）鎖と２本の軽（Ｌ）１を含ん で成る（図１参照）。軽鎖はカッパ（に）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの 異なる形態で存在する。各鎖は定常領域（Ｃ）と可変領域（Ｖ）を有する。各鎖 は一連のドメインに編成される。軽鎖は２つのドメインを有し、一方がＣ領域で 他方かＶ領域に相当する。重鎮は４つのドメインを有し、１つはＶ領域に相当し 、３つのドメイン（１，２，３）はＣ領域にある。抗体は２本のアーム（各アー ムはＦａｂ領域である）を有し、その各々は互いに結合されたｖＬ領領域ｖ８領 域を育する。■領域のこのペア（Ｖ　ＬとＶＭ）は抗体ごとに異なっており（ア ミノ酸配列変化のため）、−緒になって抗原を認識しそして抗原結合部位（ＡＢ Ｓ）を提供する原因となる。更により詳しくは、各Ｖ領域は、４つのフレームワ ーク領域（ＰＲ）により隔てられた３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）から構成さ れている。ＣＤＲは可変領域の最も可変的な部分てあり、それらは重要な抗原結 合機能を果たす。ＣＤＲ領域は、組換え、突然変異および選択を含む複雑な過程 を経て多数の潜在的生殖細胞系列配列から誘導される。

抗原を結合する機能が完全抗体の断片により果たされ得ることは証明されている 。例えば結合性断片は、（１）ＶＬ、ｖＨ，ＣＬおよびＣ，１ドメインから成る Ｆａｂ断片；　（ｉｉ）ＶＨドメインとＣ，ｌ　ドメインとから成るＦｄ断片； 　（ｉｉｉ）抗体の一本のアームのＶ、ドメインとＶ。ドメインとから成るＦｖ 断片＋（ｔｖ）Ｖｏ　ドメインから成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ、　Ｅ、　Ｓ、ら 、　Ｎａｔｕｒｅ　３４１．５４４−５４６．１９８９　）　；　（ｖ）単離さ れたＣＤＲ領域、並びに（ｖｉ）ヒンジ領域のところでジスルフィド結合によっ て連結された２つのＦａｂ断片を含んで成る二価断片であるＦ　（ａｂ’　）２ 断片である。

Ｆｖ断片の２つのドメインは別の遺伝子によってコードされるけｎとも、それら を単一タンパク質鎖〔一本ｊＪＦｖ　（ｓｃＦｖ）として知して生産できるよう にする合成リンカ−を組換え法により作製することか可能であると判明した。

モノクローナル抗体のヒト化を使った経験により、それらの分子か治療と診断に 非常に有益なものとなり得ることか示されている。

しかしながら、マウスモノクローナル抗体の元の特性を保持または改善するもの を得るために多数のヒト化された抗体誘導体をモニタリングすることかできるた めの必要条件がある。更に、迅速且つ簡便な方法によってそのような分子を作製 するための必要条件かある。

用語法 この章で説明する用語のほとんどは適宜明細書中に言及されているものである。

複製可能な遺伝表示パッケージ（Ｒｇｄｐ）これは、複製能力をもった粒子を提 供する遺伝情報を育する生物学的粒子を言う。該粒子はその表面上にポリペプチ ドの少なくとも部分を表示することかできる。該ポリペプチドは、該粒子にとっ て生来である遺伝情報および／または該粒子中もしくはその祖先中に人工的に置 かれた遺伝情報によりコードされ得る。表示されるポリペプチドは、特異的結合 ペアのいずれかのメンバー、例えば免疫グロブリン分子を基にした重鎮もしくは 軽鎖ドメイン、酵素またはレセプター等であることかできる。

該粒子はウィルス、例えばｆｄまたはＭ１３といったノ１クテリオファこれは、 前記粒子か特異的結合ペアのメンバーをその表面上に表示している複製可能な遺 伝表示パッケージを言う。該パッケージはその表面上に抗原結合性ドメインを表 示するバタテリオファージであることかできる。この盟のパッケージはファージ 抗体（ｐＡｂ）と呼これは、天然に産生されるにせよ部分的または完全に合成に より製造されるにせよ免疫グロブリンを言う。この用語は免疫グロブリン結合性 ドメインに相同である結合性ドメインを有する任意のタンパク質をも包含する。

それらのタンパク質は天然源から誘導されるか、または部分的にもしくは完全に 合成により製造されてもよい。

例となる抗体は免疫グロブリンイソタイプおよびＦａｂ、　Ｆ（ａｂ’　）２゜ ５ｃＦｖ、　Ｆｖ、　ｄＡｂ、　Ｆｄ断片である。

抗体ポリペプチドニ量体 抗体ポリペプチドニ量体は、抗原を結合することができる、抗体の２本のポリペ プチド鎖の会合体である。それは重鎮と軽鎖とから成る抗体の一本のアームであ ってもよく、ＶＬ　、Ｖ１２．ＣＬおよびＣＨＩ抗体ドメインから成るＦａｂ断 片、ｖＬ　ドメインと■。ドメインとから成るＦｖ断片、または合成リンカ−に よってＶ。ドメインに連結された■、ドメインから成る５ｃＦｖ（ｒ一本＠Ｆｖ 　Ｊ　）断片てあってもよい。５ｃＦｖ断片は、合成リンカ−によって結合され た抗体の２つのポリペプチド鎖成分から成り、抗原を結合することかできるため 、「抗体ポリペプチドニ量体」の定義の中に含まれる単一ポリペプチド鎖である 。

免疫グロブリンスーパーファミリー これは、ポリペプチドのファミリーであって、そのメンバーか免疫グロブリン分 子の可変または定常領域の構造に関連した構造を育する少なくとも１つのドメイ ンを有するものを言う。該ドメインは、２つのβ−ソートと通常は１つの保存さ れたジスルフィド結合を含む（Ａ、Ｆ、　Ｗｉｌｌｉａｍｓ２６よびＡ、Ｎ、　 Ｂａｒｃｌａｙ、　１９８８．　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、Ｉｍｍｕｎｏ１６、３８１ −４０５を参照のこと）。

免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの例は、ＣＤ４、血小板由来増殖 因子レセプター（ＰＤＧＦＲ）、細胞間接着分子（ＩｃＡＭ）である。異なって 指図されない限り、本明細書中ての免疫グロブリンおよび免疫グロブリン同族体 への言及は、免疫グロブリンス−パルファミリーとその同族体のメンバーを包含 する。

同族体 この用語は、それらの−次、二次または三次構造において対応位置に同一のまた は保存された残基を有するポリペプチドを指摘する。

この用語は同族のポリペプチドをコードする２以上のヌクレオチド配列にも及ぶ 。

同族のポリペプチドの例は免疫グロブリンイソタイプである。

遺伝学上多様な集団 抗体またはそれのポリペプチド成分との関連において、この用語は細胞または生 物体の自然集団中に存在し得る多様性だけてなく、試験管内または生体内での人 工的突然変異によって生じ得る多様性も指している。

試験管内突然変異誘発は、例えば、変えたいと思う配列のランダム変異を有する オリゴヌクレオチドを使ったランダム突然変異誘発を含むことかできる。生体内 突然変異誘発は、例えば、ＤＮＡを導入するのに宿主微生物の変異株を使うこと かできる（例えば鶴９２１０１０４７の実施例３８を参照のこと）。「ユニーク 集団」という用語は、遺伝学上多様でない、即ち全て同一である、複数の例えば ポリペプチド鎖を表示するのに使う。限定集団は、多様であるか動物の全レパー トリ−よりもずっと少ない集団である。多様性は例えば抗原結合特異性を使った 予備選別により減少させておくことができる。

ドメイン ドメインは、それ自体の中で且つ同一タンパク質の他の部分とは無関係に且つ相 補的結合メンバーとは無関係に折りたたまれるタンパク質の部分である。

折りたたみ単位 これは、α−へリックスおよび／またはβ−ストランドおよび／またはβ−ター ン構造の特定の組合せである。ドメインおよび折りたたみ単位は、−次構造では 近位てないアミノ酸を一緒にする構造を含有する。

遊離形 これは複製可能な遺伝表示パッケージによって表示されないポリペプチドの状態 を言う。

条件的に欠損のある これは、成る設定条件下では特定のポリペプチドを発現しないが、別の設定条件 下では該ポリペプチドを発現する遺伝子を言う。−例は、それぞれ非抑制性また は抑制性宿主において発現されるアンバー変異を含む遺伝子である。

あるいは、遺伝子は、成る設定条件下では欠損かあるが別の設定条件下では欠損 かないタンパク質を発現することがある。その例は温度感受性変異を有する遺伝 子である。

抑制性翻訳終結コドン これは、成る設定条件下では該コドンの下流のヌクレオチド配列の翻訳を許容す るが、別の設定条件下では該コドンのところで翻訳か終結するコドンを言う。抑 制性翻訳終結コドンの例は、アンバー、オーカーおよびオパールコドンである。

変異誘発株 これは、該株内で複製さｎたＤＮＡを親のＤＮＡに関して突然変異させる遺伝的 欠損を有する宿主細胞である。変異誘発株の例はＮＲ９０４６ｍｕｔＤ５および ＮＲ９０４６ｍｕｔＴ１である（ＷＰ　９２１０１０４７の実施例３８を参照の こと）。

ヘルパーファージ これは、欠損性ファージゲノムを含む細胞を感染せしめるのに使われ該欠損を補 完する機能を持つファージである。欠損性ファージゲノムは、遺伝子配列をコー ドする成る種の機能か除去されているファージまたはファジミドであることがで きる。ヘルパーファージの例はＭ１３ＫＯ７、Ｍ１３ＫＯ７遺伝子ｎ［Ｎｏ、３ 　、およびキャプシドタンパク質と融合した結合性分子を表示またはコードする ファージである。

ベクター こｎは、宿主生物体内で複製することかできるＤＮＡ分子であって、組換えＤＮ Ａ分子を作製するためにその中に遺伝子か挿入されるＤＮＡ分子である。

ファージベクター これは、バクテリオファージの複製開始点を含むかプラスミドの複製開始点は含 まない、ファージゲノムの変更によって誘導されたこれは、バクテリオファージ の複製開始点とプラスミドの複製開始点とを含む、プラスミドゲノムの変更によ って誘導されたベクタこれは、ｒｇｄｐまたはｒｇｄｐ上に表示されたポリペプ チドと会合する分子を言い、ここで該ポリペプチドおよび／または該分子は細胞 のザイトゾルの外部て折りたたまれ且つバラケーンか構築される。

再配列された免疫グロブリン遺伝子のレパートリ−動物中で発現される免疫グロ ブリン遺伝子をコードする天然に存在するヌクレオチド、例えばＤＮＡ配列の収 集物。それらの配列は、Ｈ鎖については例えばＶ、　ＤおよびＪセグメント、Ｌ 鎖については例えばＶおよびＪセグメントの生体内再配列によって作製される。

あるいは、該配列は、試験管内で免疫処置した細胞系からおよび免疫処置に応答 した再配列が細胞内で生じるような細胞系から作製してもよい。「レパートリ− 」という語は遺伝学的多様性を示すために使われる。

ライブラリー クローン内部のヌクレオチド（例えばＤＮＡ）配列の収集物：ポリペプチドまた は特異的結合ペアメンバーの遺伝学的に多様な収集物：あるいは、個々のポリペ プチドもしくはｓｂｐメンバーまたはポリペプチドもしくはｓｂｐメンバーの混 合集団を提供するために選択もしくはスクリーニングすることのできるｒｇｄｐ 上に表示されたポリペプチドもしくはｓｂｐメンバーの遺伝学的に多様な収集物 。

人工的に再配列された免疫グロブリン遺伝子のレパートリ−動物由来の再配列さ れた免疫グロブリン配列以外の源から全体的にまたは部分的に誘導されたヌクレ オチド（例えばＤＮＡ）配列の収集物。例として、再配列されていないＶセグメ ントをＤおよびＪセグメントと組合せることによるｖ８　ドメインをコードする ＤＮＡ配列、並びにＶセグメントとＪセグメントを組み合わせることによるｖＬ 　ドメインをコードするＤＮＡ配列を挙げることができる。

該ＤＮＡ配列の部分または全部をオリゴヌクレオチド合成によって誘導すること ができる。

分泌リーダーペプチド これは、ポリペプチドのＮ末端に結合しておりサイＩ・ゾルの外側−２の該ポリ ペプチドの移動を指令するアミノ酸配列である。

溶離剤 これは、２分子間の結合を破壊するのに使われる溶液である。結合は非共有結合 または共有結合であることかできる。前記２分子はｓｂｐのメンバーであること かできる。

誘導体 これは、選択したｒｇｄｐの中のＤＮＡによりコードされるポリペプチドから誘 導した物質である。誘導体ポリペプチドは、アミノ酸の付加、欠失、置換もしく は挿入により、またはコードされるポリペプチドへの他の分子の結合により、コ ードされるポリペプチドとは異なることができる。それらの変更はヌクレオチド レベルまたはタンパク質レベルで行われ得る。例えばコードされるタンパク質が Ｆａｂ断片であり、次いでそれが別の源からのＦｃテールと結合されてもよい。

あるいは、酵素、フルオレセイン等といった標識物質を例えばＦａｂ断片、５ｃ Ｆｖ断片に結合してもよい。

本発明の一観点によれば、着目の抗原に特異的な抗体ポリベブチドニ量体の製造 方法であって、該方法は次の段階を有する・（ｉ）　複製可能な遺伝表示パッケ ージ（ｒｇｄｐ）の成分を使ってパッケージングすることのできる核酸発現ベク ターを提供し：（ｉｉ）（ａ）各々ヒト抗体の第一の抗原結合部位構成部分をコ ードする核酸配列の遺伝学上多様なレパートリ−を（ｂ）前記着目の抗原を結合 することが知られている非ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成部分のユニーク集 団または遺伝学上多様な集団をコードする核酸と組合せ、抗体ポリベブチドニ量 体をコードする前記発現ベクター上の核酸配列のライブラリーを形成せしめ、こ こで前記二量体は各々第一のポリペプチド鎖成分と第二のポリペプチド鎖成分と から成り、前記第一の抗原結合部位構成部分と前記第二の抗原結合部位構成部分 とは組み合わせると抗原ポリペプチドニ量体の抗原結合部位を形成し： （ｉｉｉ）組換え宿主生物細胞において前記ベクターから前記ライブラリーを発 現せしめ、ここで前記第一のポリペプチド鎖成分の各々は、前記第一のポリペプ チド鎖成分をｒｄｇｐの表面に表示するｒｇｄｐの成分との融合体として発現さ れ、： （１ｖ）前記発現されたライブラリーから、前記着目の抗原に対する結合特異性 を有する前記抗体ポリベブチトニ量体のユニーク集団または限定集団を抗原への 結合により選択し、ここで各選択された抗体ポリペプチドニ量体がその各々のｒ ｇｄｐの中てそれの前記第一の抗原結合部位構成部分をコードする核酸と関連づ けられる。

抗体ポリベブチドニ量体は本明細書中のいずれかの箇所に定義される。該用語は 抗体のＦａｂ、Ｆｖおよび５ｃＦｖ断片並びに抗体の完全なアームを包含するほ ど広い意味である。

「抗体−抗体結合部位の構成部分」は、ポリペプチド鎖成分、例えばＶ。または ｖＬ　ドメインであるかまたはそれに相当する。しかシナカラ、そｉはｃＤＲ， ＶＬ配列＋Ｖ）Ｉ　（”ＣＤＲ，Ｖ、配列＋ｖＬのＣＤＲ，Ｖ、＋ＣＤＲのみを 欠くｖＬ配列、等であってもよい。

前提条件は、抗体の抗原結合部位の第一および第二の構成部分が組み合わせると （−緒になって）抗原結合部位を形成しなげればならないことである。よって、 もし着目の抗原に特異的な非ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成部分かＣＤＲで あるならば、ヒト抗体の第一の抗原結合部位構成部分は、抗原結合部位を形成す るのに必要とされるＶｌ、ｌおよびＶ、領域の残部〔会合した抗体定常領域を有 するかまたは育さない（Ｆａｂ型）、あるいはリンカ−ペプチド配列を有するか または有さない（Ｆｖ型）〕を含んで成るだろう。（ｓｃＦｖＹでは、リンカ− ペプチドか軽鎖ドメインと重鎮ドメインとを連結する。）非ヒト抗体の第二の抗 原結合部位構成部分は、ｖＬ　ドメイン＋Ｖ１．ｌ　ドメインの一部分を含んで 成り、該部分は１または複数のＣＤＲ，例えばおそら＜ＣＤＲ３であろう。その ような場合、ヒト抗体の第一の抗原結合部位構成部分は、第二の抗原結合部位構 成部分と組み合わせると抗原結合部位を形成するＶ。配列の残部を含んで成るだ ろう。もちろん逆の状況も適用でき、当業者は一緒になって抗原結合部位を形成 する第一の構成部分と第二の構成部分の他の組合せを想像することかできるだろ う。

段階（１ｖ）において選択された抗体ポリペプチドニ量体を変更して非ヒト特性 を除去または削減するという追加の段階（Ｖ）か存在してもよい。この変更は二 量体またはその成分を遺伝子的に変更することによるものであることかできる。

この遺伝子変更は、突然変異、点変異、挿入または欠失、例えば特に非ヒト残基 、特に非ヒト／ヒトハイブリット抗体ポリペプチドニ量体をヒトに投与する時に 抗イデイオタイプ免疫応答を引き起こし得るそれらの残基を除去または隠蔽（マ スキング）するためのものであることができる。

段階（ｖ）の変形は、 ＋ａ＋　段階（１ｖ）において選択された前記第一の抗原結合部位構成部分をコ ートする核酸のユニーク集団または限定集団を、各々ヒト抗体の第二の抗原結合 部位構成部分をコードする核酸配列の遺伝学上多様なレパートｌ）−と組合ぜ、 抗体ポリペプチドニ量体をコートする核酸配列の第二のライブラリーを形成せし めることを含んで成り、ここで各抗体ポリベブチトニ量体は、ｒｇｄｐの一部分 を使ってパッケージングすることかできる核酸配列から発現される第二の抗体ポ リペプチド鎖成分を含んで成り、前記第二の鎖成分は、それによってｒｇｄｐの 表面に前記第二の鎖成分を表示するｒｇｄｐの成分との融合体として発現され、 その結果、前記着目の抗原との結合によって前記第二のライブラリーから前記着 目の抗原に特異的な抗体ポリペプチト二量体を選択することが可能である。ここ で各抗体ポリペプチドニ量体は、そのｒｇｄｐにおいてそれの第二のポリペプチ ド成分をコートする核酸と関連づけられる。

選択された抗体ポリベブチドニ量体は、可溶性ポリペプチドとしてまたは遊離形 において発現させることができる。

説明したように、前記非ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成部分は、抗原と接触 する抗体領域であることができ、該領域はおそらく相補性決定領域（ＣＤＲ）で あろう。

前記非ヒト抗体の第二の構成部分は、抗体の第二のポリペプチド鎖成分であるこ とかできる。

各々前記非ヒト抗体の第二の抗原接合部位構成部分をコートする配列は、拳法の 段階（ｉｉ）における前記組合せの前に遺伝子的に変更してヒト抗体の第二の構 成部分との相同性を増加させることができる。

抗体ポリベブチドニ量体の前記ライブラリーのいずれかの各抗体ポリペプチドニ 量体は、単一ポリペプチド鎖として（これは好ましくは５ｃＦｖ断片であること かてきる）発現せしめることかできる。

５ｃＦｖ断片は抗体ポリペプチドニ量体の定義の必要条件を満たしている。

他方、抗体ポリベブチトニ量体の前記ライブラリーのいずれかの各抗体ポリベブ チドニ量体は、２本のポリペプチド鎖として、好ましくはＦｖまたはＦａｂ断片 として発現せしめることかできるだけでなく、おそらく抗原結合部位の形成を許 容するフンホメーションにおいて共有結合的または非共有結合的のいずれかで可 変ドメインと相互作用してそちを固定するだろう追加の非抗体ドメインを育する ポリペプチドとしても発現せしめることかできる。

本発明の別の観慨によれば、着目の抗原に特異的なヒ）・抗体ポリペブチトニ量 体の製造方法が提供され、該方法は、次の段階を含んで成る （ｉ）各々ヒト抗体の第一のポリペプチドｆｆｌの可変ドメインを含んで成るポ リペプチドの多様性集団（集団Ａ）を、各々前記抗原に特異的な非ヒト抗体の第 二のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んて成るポリペプチドのユニーク集団ま たは限定集団（集団Ｂ）と組合＋士、それによって各々ヒト抗体の第一のポリペ プチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドと非ヒト抗体の第二のポリペ プチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドとから成る抗体ポリベブチト ニ量体のライブラリーを形成せしめ：（目）　ｊｉｉｒ記ライグライブラリ−前 記抗原に対する結合特異性を有する前記抗体ポリペプチドニ量体のユニーク集団 または限定集団（集団Ｃ）を選択し。

（ｉｉｉ）各々ヒトの第一のポリペプチド鎖を含んで成る段階（ｉｉ）において 選択されたポリペプチトニ量体から誘導したポリペプチドのユニーク集団または 限定集団（集団Ｄ）を、各々ヒト抗体の第二のポリペプチド鎖の可変ドメインを 含んで成るポリペプチドの多様性集団（集団Ｅ）と組合せ、それによってヒト抗 体ポリペプチド鎖二量体のライブラリーを形成せしめ、そのライブラリーから、 前記抗原に特異的なヒト抗体のポリペプチドニ量体のユニーク集団または限定集 団（集団Ｆ）か選択可能である。

この観点の好ましい態様では （ａ）　Ｒ記集団Ａのポリペプチドか、組換え宿主生物細胞において、ｒｇｄｐ の第一集団においてｒｇｄｐの表面上に前記ポリペプチドを表示する複製可能な 遺伝表示パッケージ（ｒｇｄｐ）の成分との融合体としてベクター（Ｘ）から発 現され、。

（ｂ）　前記ｒｇｄｐ成分を使って前記ベクター（Ｘ）の核酸をパッケージング することかでき、それによって前記ｒｇｄｐの遺伝物質か前記集団Ａのポリペプ チドをコードし、その結果、集団Ｃの抗体ポリベブチドニ量体かそれら各々のｒ ｇｄｐ中でヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変領域を含んで成るポリペプチ ドをコードする核酸と関連づけられ： （Ｃ）　前記集団Ｅのポリペプチドの各々か、組換え宿主生物細胞において、ｒ ｇｄｐの第二集団においてｒｇｄｐの表面上に前記ポリペプチドを表示するｒｇ ｄｐの成分との融合体としてベクター（Ｙ）から発現され。

ｆｄ）　前記ｒｇｄｐ成分を使って前記ベクター（Ｙ）の核酸をパッケージング することかでき、それによって、ｒｇｄｐの第二集団中の前記ｒｇｄｐの遺伝物 質か前記集団Ｅのポリペプチドをコードする。

前記集団Ａが前記集団Ｅと同じベクターから発現されてもよく、またはそれらの 集団か同じベクターから発現されなくてもよい。前記集団りと前記集団Ｅとが同 じベクターから発現されてもよく、またはそれらの集団りとＥか同じベクターか ら発現されなくてもよい。

言い換えれば、この方法は二元的組合せ方式であるかもしれないしそうでないか もしれないか、明細書中のとこかに記載されるように、他の可能性かある中でも 特に、恐らくは階層方式であろう。

前記抗体ポリペプチドニ量体ライブラリーのいずれかの各抗体ポリベブチドニ量 体は単一ポリペプチド鎖として発現されてもよく、５ｃＦｖ断片であってもよい 。

前記抗体ポリペプチドニ量体ライブラリーのいずれかの各抗体ポリペブチトニ量 体は、本発明の別の観点に関連して上記に既に述べたように、２本のポリペプチ ド鎖、好ましくはＦｖｅたはＦａｂ断片として発現されてもよい。

前記集団Ｂのポリペプチドは、各々か（非ヒト、例えば径歯類の可変ドメインと 一緒に）ヒト抗体定常ドメインを含んて成るキメラであることかてきる。

前記集団Ｅのポリペプチドは、各々か前記抗原に特異的な非ヒト抗体からの領域 を含んで成ることかでき、前記領域は抗原と接触するもの、例えば相補性決定領 域（ＣＤＲ）　、特にＣＤＲ３である。

前記第一のポリペプチド鎖は抗体軽鎖であることかてき、前記第二のポリペプチ ド鎖は抗体重鎮であることができ、またはその逆も可能である。

前記抗原に特異的なヒト抗体ポリベブチトニ量体の前記集団Ｆを選択する追加の 段階か存在してもよい。

前記集団ＣとＦのいずれか一方を前記抗原との結合によって選択してもよい。

本発明はまた、末法のいずれかにおいて使用されるベクターと試薬を含んで成る キットも包含する。本発明は更に、末法のいずれかによって製造されるライブラ リーと抗体または抗体断片にも及ぶ。

抗体ポリペブチトニ量体のいずれかの選択されたポリペプチド成分をコートする 核酸、または選択された抗体ポリペブチトニ量体をコードする核酸を使って、組 換え宿主生物体中で前記ポリペプチド成分もしくはポリペプチドニ量体またはそ の誘導体を発現せしめる方法も本発明に包まれる。本発明の方法を使って製造さ れたライブラリーからのいずれのポリペプチドまたは二量体でも、改変してその 誘導体を製造することができ、または治療用もしくは予防用薬品または診断用製 品の調製に用いることかできる。

着目の抗原に対して向けられた抗体または抗体の集団の抗原結合部位からの配列 を使うことによって抗体を製造する新規方法かここに提案される。

これは、定義された抗原結合活性を有する動物抗体をヒト化する別の手段を提供 する。例えば単一の翼歯類抗体については、該抗体の抗原結合部位の一部分を含 んで成る配列を、組み合わせると完全な抗原結合部位を形成することかできるヒ ト抗体の配列の多様性レパートリ−と組合せることかできる。元の舊歯類（およ びヒト）配列は完全な鎖または鎖の一部分を含んで成ることかできる。例えば、 薩歯類抗体の軽鎖をヒト重鎮可変ドメインのレパートリ−と組み合わせることが でき、または薩歯類抗体の重鎮の第三ＣＤＲを、重鎮可変ドメインの残部をコー トするヒト重鎮のレパートリ−とヒト軽鎖可変ドメインのレパートリ−と組み合 わせることかできる。次いでそれらの配列を含んで成る抗原結合部位を抗原への 結合について選択する。

抗原結合部位の一構成部分を含んで成る配列は、抗原結合に関与すると一般に思 われる一次配列の部分、例えば１もしくは複数のＣＤＲ１またはＣＤＲのループ の先端の残基であることができる。

あるいは、該配列は、例えばＸ線結晶学もしくはＮＭＲによって解析された抗原 −抗体複合体の構造から決定されたように、または抗体の部位特異的突然変異誘 発から決定されたように、抗原と接触することが知られている抗体の配列である ことができる。

この方法によって作製された抗原結合部位は、元の醤歯類抗体の配列の部分のみ か同様な方法で抗原と接触するらしいという点で、ＣＤＲ移植により作製された ものとは異なっている。選択されたヒト配列は配列が異なるらしく、元の結合部 位のものに代わる方法で抗原と接触するらしい。しかしなから、抗原への元の配 列の部分の結合により課せられる束縛並びに抗原およびそれの抗原結合部位の形 状は、抗原の同一領域またはエピトープに対するヒト配列の新たな接触を指令す るらし２い。従って本発明者らはこの方法を「エピトープ刷り込み選択（ＥＩＣ ）Ｊ　と名付けた。

動物抗体から出発して、１つの方法は部分的にヒト抗体である抗体の選択をもた らした。そのような抗体は、そのまま直接にまたは幾つかの重要な残基の変更後 に療法利用することかできるはと十分に、配列がヒト抗体に類似しているだろう 。例えば、門歯類抗体からのＶ、−ＣＤＲ３領域も含んで成るヒト重鎮および軽 鎖可変ドメインを使って作製された抗体は、ヒト抗体と門歯類抗体の両ＣＤＲ３ 領域か高度に可変的であるため、真のヒト抗体に非常に似ているだろう。同様に 、幾つかの門歯類抗体の軽鎖はヒト抗体の軽鎖と配列が非常に類似し得る。よっ て、ヒト重鎮のレパートリ−と組み合わせてそれらの門歯類軽鎖から作製した抗 体は、ヒト抗体に密接に類似するだろう。選択した抗体の門歯類成分とヒト配列 との配列の相違は、ヒト配列の残基と異なるそれらの残基を、例えば個々の残基 の部位特異的突然変異誘発によってまたはループ全体のＣＤＲ移植によって置換 することにより、最少にすることができる。動物抗体から出発する代わりに、動 物抗体由来の遺伝子操作された抗体を使って出発することも可能であるだろう。

操作された出発抗体は、例えばヒトフレームワーク領域とマウス相補性決定領域 とを育するＣＤＲ移植抗体（例えばＧＢ２１８８６３８Ｂに記載されたようなも の）かもしれない。あるいは、操作された出発抗体は、ヒト抗体との配列相同性 を最大にするために残基か変更されている重鎮または軽鎖を含んで成ることもて きる。

しかしながら、本発明は、完全にヒトの配列を存する抗体を作製することも可能 である。例えば、ヒト重鎮と非ヒト（例えばマウス）軽鎖を有する部分的にヒト の抗体から出発して、非ヒト軽鎖をヒト軽鎖のレパートリ−により置き換えるこ とができる。こうし、で、選択された抗体の配列は完全にヒトであり、しかもま だ抗原結合部位は抗原の同一エピトープに向けられるだろう。従って１１．Ｉｓ は、それぞれ動物の抗体または部分的にヒトの抗体と同じエピトープに結合する 部分的にヒトのまたは完全にヒトの抗体を作製する方法を提供する。

ＣＤＲ移植では抗原結合部位全体が移植されるため、通常は抗原への結合につい て１個だけまたは数個の抗体を試験することが必要である。しかし、ＥＩＳは、 非常に多数の抗体のスクリーニングの必要がある場合に、ヒト配列の恐らくは非 常に多数のレパートリ−と組み合わせて抗原結合部位の一部のみを使うことかで きる。実際に好ましい態様では、抗体断片のレパートリ−が糸状ファージの表面 上に表示され、そして抗原への該ファージの結合によって抗原結合活性を有する 断片をコードする遺伝子が選択される。抗体断片をファージ上に表示できること 、それらが抗原を結合するだろうこと、そしてそれらを選択できることは、特許 出願ＷＯ９２１０１０４７に開示されている。Ｗｏ　９２１０１０４７に記載さ れたようなファージ上への表示の使用により提供される抗体選択能力は、制限部 位におけるＣＤＲの挿入を使ってまたは試験管内突然変異誘発技術（Ｒｉｅｃｈ ｍａｎｎら。

１．９８８．前掲、ドイツ国特許第２１８８６３８Ｂ号）においてまたはＰＣＲ 技術（Ｂ、Ｌ、　Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、１９９１．　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ 　Ｒｅｓ、１９．２４７１−２４７６頁）を使って作製することができる多数の ヒト化された抗体誘導体の迅速スクリーニングを可能にする。Ｗｏ　９２１０１ ０４７では、１つの抗体重鎮または軽鎖可変ドメインか一定に保持され、そして 抗原に結合する相手の選択のため相補鎖の可変ドメインのライブラリーを有する ファージ上に表示されるという、分類体系的（ｈｅｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ）ラ イブラリーの作製か記載されている。そのようなアプローチは重鎮と軽鎖の可変 ドメイン組合せの高多様性プールをもたらし、そこから抗体特異性を選択するこ とかできる。例えば、更にハブテン結合性抗体の相補鎖の軽鎖および重鎮結合相 手を得るため（Ｃ１ａｃｋｓｏｎら。

１９９１、　Ｎａｔｕｒｅ　３５２．６２４−６２８）または高親和性ヒト抗体 を作製するために（Ｊ、Ｄ、　Ｍａｒｋｓら、＋９９２．　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎ ｏｌｏｇＹ　１０．７７９−７８３）　、鎖入替えか適用された。それらの場合 、新たな結合相手鎖は、元の組合せにおいて見つかるものと配列か非常に関連し ていた。

それらの実施例では、異なる種の鎖は組み合わされなかった。しかしなから、ハ プテンに対して向けられたマウス抗体の重鎮をヒト軽鎖のレパートリ−（マウス 軽鎖のレパートリ−とも同様に）と組合せ、そして二口トセルロースフィルター を使って抗原への各クローンの結合についてスクリーニングする試みについての 報告はある。

ただ、結合体は検出されなかったし、マウス抗体を「ヒト化する」手段としての 方法は提案されなかった（Ａ、Ｓ、　’Ｋａｎｇら、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　１９９１．８８．１１１２０−１１１２３　 ）　、この著者らは、「体細胞変異された鎖と生来の結合相手との組換えによる 抗体の再設計は難しい方法であるかもしれない」と結論づけた。従って、ＥＩＳ の使用（異なる種からの鎖を使った鎖入替えにより例示されるような）は新規の 概念であると思われる。更に、Ｋａｎｇら、　１９９１．前掲からの例を考慮す ると、マウス抗体からの鎖を免疫処置されていないヒト起源の鎖のレパートリ− と組み合わせることによって抗原結合性組合せ体を製造できることは驚くべきこ とである（下記実施例１に記載）。

本発明の方法の利用形態は広範囲にわたる。例えば、（１）　細菌中ての発現ま たは糸状ファージ上での表示には、Ｆｖ、−重鎖ＦｖおよびＦａｂ断片の使用が 好ましい（Ｆａｂ断片については実施例１と２を参照のこと：５ｃＦｖについて は実施例３と４を参照のこと）。最も好ましくは、抗体断片は糸状ファージ上に 表示され、そして該ファージか抗原結合について直接選択される。それらの手順 によって選択さｎた抗体はそのまま利用することかでき、または追加のコード配 列、例えばヒト定常領域と融合せしめ、ヒトエフェクター機能を有する抗体分子 を作製することができる。可変ドメインを酵素または毒素分子をフードする配列 と融合せしめ、特定の細胞型に薬剤まＴこは毒素を標的指向させることに向けら れる抗体とすることかできる。

（２）　ヒト鎖のレパートリ−は、■鎖の幾つかの可能なレパートリ−から、例 えば免疫処置されていないヒトの再配列されたＶ遺伝子（Ｍａｒｋｓら、　１９ ９１．　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　２２２．５８１−５９７頁、および実 施例１）から、または免疫処置されたヒトから、または合成Ｖ遺伝子レパートリ −から提供することができる。例えば、ヒトＪ領域と単離された抗体特異性とを 組み込んだ合成ＣＤＲ３領域を使って、ヒト生殖細胞系列（ｇｅｒｍ　１ｉｎｅ ）の重鎖および軽１ｖ遺伝子のライブラリーを作製することができる（　Ｈｏｏ ｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、　１９９２．　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、、　２２７．３８１−３８８頁）。更に、マウス抗体の重 鎖と配列か密接に関連している（おそらく最も相同である）ヒトＶ遺伝子のレパ ートリ−（例えば合成的に製造されたもの）を使うことも可能である（実施例５ を参照のこと）。

（３）元の抗体の重鎮と軽鎖は、それらがコードするＶ遺伝子（例えばＰＣＲに より単離されたもの、０ｒｌａｎｄｉ　ら、　１９８９）によって提供してもよ い（実施例１．２および３を参照のこと）。しかしながら、好ましくは免疫処置 によって惹起されたマウス鎖のレパートリ−を使って開始することも可能である （実施例４）。例えば、マウス重鎮のレパートリ−をマウス軽鎖と組合せ、そし て結合について選択することかできる（Ｃ１ａｃｋｓｏｎら、　＋９９１．前掲 、のように）。次いて選択さｒた対合頑のレパートリ−を相補的ヒトｉｌのレバ ー１−　ＩＪ−て組み換えて無理やり新しい対合をっくることかできる。あるい は、免疫処置されたマウスのｍＲＮＡからのマウス鎖のレパートリ−を単純に相 補的ヒト鎖のレパートリ−と組み合わせることができる。

（４）「鎮の入替えＪ法におけるように完全な重鎮および軽鎖可変ドメインを使 う二とかでき、または例えばＭａｒｋｓら、　！９９２．前掲のように、成る抗 体の軽鎖と！鎖のＣＤＲ３を保持する（そしてこの配列を、重鎮可変ドメインＣ ＤＲＩおよび２の残部を含んで成る鎖の１ツバ−トリーど組み合わ４士る）こと により、鎖の構成部分を使うことが可能である。実施例２と３により例示される 本発明の一態様は、トド鎖またはヒト抗体の抗原結合部位の構成部分を使って入 れ替える時に、元の親の非ヒト抗体からの少なくとも１つの領ｆｔＣ（該領域は 抗原と接触する）を保持することを含む。この領域はＣＤＲである二とかでき、 その場合、この方法はｒ　ＣＤ　Ｒ！Ｉノリ込み選択ノである。

実際、実施例２と３において、元のマウス重鎮のＣＤＲ３を保持し、そしてマウ スＣＤＲ３を組み込んでいるプライマーを使ったヒト重鎮可変ドメインのレパー トリ−のＰＣＲ増幅により、ヒト重鎮可変ドメインのレパートリ−と組み合わせ た。重鎮のＣＤＲ３はしはしば抗原結合にとって最も重要であるという屯で、マ ウスｖ、−ＣＤＲ３の保持か特に有利だろう。

この理論は、再配列されたマウスＶ８遺伝子をヒトＪ。プライマー（正プライマ ー）とヒトＶＨフレームワーク３プライマー（逆プライマー）を使って増幅せし めることによりマウスＣＤＲ３レパートリ−に拡張することかできる。それらの プライマーは、マウスＶ遺伝子とヒトＶ遺伝子の両方に対して相同性を育するよ うに設計しなければならない。次いてマウスＣＤＲ３の増幅ＤＮＡレパートリ− をヒト重鎮遺伝子のレパートリ−と共にＰＣＲにより構築することかできる。

（５）鎖の入替えは、２つのレプリコンを使って、例えばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ら、　１９９＋、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　１９． ４１３３−４１３７頁に記載されたような二元的組合せ法を使って実施すること ができる。この場合は、実施例１に例示されるように、一定に保持すべきほうの 鎖を１つのレプリコン（例えばファージ）中でクローニングし、次いて別のレプ リコン（例えばプラスミド）中でもう１つの鎖のレパートリ−と組み合わせる。

高い効率で両方の鎖を同一レプリコン上でクローニングできるようにする別法も 発明された。それらも同じく重鎮遺伝子と軽鎖遺伝子を別々のレプリコン上でク ローニングすることに頼っているが、今度は両方の鎖が同一レプリコン上に置か れるように２つのベクター間の組換えを促進することを目指している。そのよう な系の一例はコリファージＰ１のｌａｘ　Ｐ／Ｃｒｅレコンビナーゼ系（Ｈｏｅ ｓｓおよびＡｂｒｅｍｓｋｉ、　１９９０．　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ　ａ ｎｄ　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”、　Ｅｅｌｃｓｔｅｉｎおよび！、 １ｌｌｅｙ纏、第４巻、　９９−１０９頁、　Ｓｐｒｉｎｇ６ｒ−Ｖｅｒｌａｇ 、　Ｂｅｒｌｉｎ、　Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）に基づく。二元的組合せ法では、 抗体はＦｖ断片としてまたはＦａｂ断片として発現させることができる（実施例 １のように）。Ｆａｂ断片の場合、重鎮のＶ。ＩＣ，１部分が１つのレプリコン （例えばファージ）上に発現され、モして軽鎖が別のレプリコン（例えばプラス ミド）上に発現される。入替え法において新規特異性の入手源として使う予定の Ｆａｂ断片のＶドメインは、所望により、クローン化されたヒトドメイン、例え ばＣ１０およびＣにドメインと融合されてもよい。（Ｖドメインは、ヒト抗体ｍ ＲＮＡレパートリ−から直接増幅せしめることによってＣ８Ｌ　ＣにまたはＣλ ドメインと直接融合させることができる。）あるいは、鎖入替えは、Ｃ１ａｃｋ ｓｏｎら、　１９９１．前掲に記載のようなＰＣＲ構築法を使って、または元の 構成物中（例えば−末鎖Ｆｖのリンカ−＠域中）に組み込よねている適当な部位 での制限断片のライブラリーの連続クローニングにより、単一のレプリコンにお いて実施することかできる。

本発明は、２段階の入替えによる両方の鎖の置換を包含し、−態様では非ヒト抗 体、例えば冨歯類抗体と同様のまたは改善さｎた特性を有するヒト抗体の開発を 包含する。この態様では、親の例えば径歯類抗体か「ファージ抗体」にされるだ ろう。ファージ抗体（ｐＡｂ）は、その表面上に抗体、抗体誘導体もしくは抗体 断片、例えばＦ　ａｈ。

Ｆｖ、５ｃＦｖ等、または免疫グロブリンドメインに相同なドメインを表示する バクテリオファージウィルス粒子として定義される　Ｗ０９２１０１０４７を参 照のこと。一本の鎖か、ヒト免疫グロブリンレパートリ−から誘導された鎖のレ パートリ−１例えば成人リンパ球集団からまたは胎児由来の源もしくは人工的に 誘導された源から誘導された鎖のレパートリ−で置換されるだろう。このファー ジの混合集団を抗原への結合によって選択し、元の抗原に結合するか一本の例え ば薩歯類抗体鎖と一本のヒト抗体鎖とから新たに成るファージ抗体の集団を誘導 せしめることかできる。残りの謀歯類鎖は、最初の入替えの時に使ったものと同 しまたは異なる源のヒトレパートリ−により置換することかできる。また抗原を 結合する抗体の集団を選択した後、２本のヒト抗体鎖を含有する抗体から成る集 団が得られる。

こうして、元の舊歯類抗体が同一抗原を結合するヒト抗体に変換された。

本発明の方法による多数のヒト化された抗体の作製は、所望の親和性と特異性を 存する抗体の選択を可能にすること以上の利屯を有することかできる。ヒト化さ れた抗体を療法においてヒトに利用する時、抗イデイオタイプ応答を引き起こす 可能性かある。単離された抗体を生体内に投与する時の抗イデイオタイプ応答に ついて調査することかでき、そして最も低い応答を有するものを選択することか できる。あるいは、抗イデイオタイプ応答が検出されるまで１つの抗体を療法的 に投与し、検出された時点で、使用抗体を異なるイディオタイプの第二の同等に 有効な抗体にスイッチすることができる。

本発明を使って得ることかできるヒト化された抗体は、多分それらがずっと抗イ デイオタイプ応答を引き起こしにくいだろうという意味において、従来のＣＤＲ 移植によりヒト化された抗体よりも優れているようだ。

本発明の方法によって選択された抗体は、−木調ＦｖまたはＦａｂ形態て直接使 用することかできる。あるいは、可変ドメインを追加のコード配列、例えばヒト 定常ドメインと融合せしめて、例えばヒトエフェクター機能を有する抗体分子を 作製することができる。可変ドメインを酵素または毒素分子をコードする配列と 融合せしめて、特定の細胞型に薬剤または毒素を標的投与することに向けられた 抗体にすることが可能である（それらの分子がヒト起源のものでないなら、ヒト 化することの利点の幾つかは失われている）。

抗原結合についての選択による抗体の単離は、各段階でファージ表示を使って実 施できるけれども、鎖の入替えがＰＣＲ構築または制限断片の挿入によって行わ れる場合、特に数が減少してしまった時には、フィルターアッセイ（Ａ、　５ｋ ｅｒｒａら、　１９９１．　Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ。

１９６、　１５１−１５５　；　Ｍ、Ｌ、　Ｄｒｅｈｅｒら、１９９１．　Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　１３９゜１９７−２０５　；　ＰＣＴ／Ｇ Ｂ９０１０１４７６）を使って抗体を抗原結合についてスクリーニングすること かできる。それらの方法は、ファージ表示を使って処理することができる数に比 へて比較的少数のクローンの場合に効果的であろう。

本発明のｖｌりお誹び態様を下記実施例により更に説明することにする。それら は限定を伴わずに本発明を例証する。本明細書中に記載された文献に加えて、Ｗ ｏ　９２１０１０４７に注意を向けられたい。そこには本明細書中で使用する材 料と方法の多くか記載されている。Ｗ０９２１０１０４７の開示は本明細書中に 参考として組み込まれる。抗体ポリベブチトニ量体を含む抗体および抗体断片の ｒｇｄｐ上への機能的表示の詳細と説明については、ＷＯ９２１０１０４７を調 へることを本文書の読者に勧める。明細書を通じて図面への参照か行われる。こ こで、図１はエピトープ刷り込み選択（Ｅｐｉｔｏｐｅ　Ｉｍｐｒｉｎｔｅｄ　 ５ｅｌｅｃｔｉｏｎ）の理論を示す。

図２はベクターｐＵｃ１９−ｐｅｌＢ−ｍｙｃのポリリンカー領域（配列番号１ ２６）を示す。

図３はＦａｂ断片を表示しているファージのＥＬＩＳＡの結果を示し、ここで一 方の鎖はｇ３ｐ融合体としてファージ上に表示され（ｆｄ−、、。

により示されている）他方の鎖は分泌される可溶性鎖パートナ−として提供され る。

図４は、元のＭａｂ３２抗体並びにマウス（ｓｃＦｖ−Ｍａｂ３２）およびヒト （他の５ｃＦｖ）抗体の領域の特異的ＥＬＩＳＡを示す。

図５は、Ｍａｂ３２のＶ遺伝子のヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列を示す。

ＣＤＲ領域は大活字体である。（重鎮ヌクレオチド　配列番号２．軽鎖アミノ酸 　配列番号３：軽鎖ヌクレオチド　配列番号４）。

図６は、ヒトＴＮＦに結合する抗体断片のＶ　Ｉ＋およびｖＬ抗体遺伝子の推定 タンパク質配列を示す。

（軽鎖：　Ｍａｂ３２配列番号１１０　、　Ｖ　λｌ−１１配列番号１１１　； ＶλＡＺ配列番号＋１２；ＶλＣ４配列番号１１３；ＶλＤｌ配列番号１１４゜ 重鎖　Ｍａｂ３２配列番号１１５　；　ＤＰ−５１配列番号１１６　；　Ｖ、Ｐ ｌ配列番号＋１７　；　Ｖ、Ｐ２配列番号＋３３　；　Ｖｌ、ｌＰ３配列番号１ ３４　；　ＤＰ−４６配列番号１１８　；　Ｖ、ＬＭ２配列番号１３５　；　Ｖ 、ＬＭ８配列番号１４１）。

図７は、ＦａｂＭａｂ３２と一本鎖Ｆｖ断片との間の競合ＥＬＩＳＡの結果を示 す。

図８は、二元的組合せ法を用いてＣＤＲ刷り込み選択を使ってマウス抗体をヒト 化するための計画の一例を示す。

図９は、単一レプリコン、一本ＩＦｖ形式において組合せライブラリーを用いて ＣＤＲ刷り込み選択を使ってマウス抗体をヒト化するための計画の一例を示す。

図１０は、ＣＤＲ刷り込み選択により選択された５ｃＦｖ断片を使って得られる 相対的ＥＬＩＳＡシグナルを元のＰ５８−重鎮Ｆｖ断片に比較して示す。

図１１は、元のＦ５８重鎮および最も密接に関連したヒト生殖細胞系列Ｖ８遺伝 子に比較した、選択された重鎖Ｇｒａｆｔ／２７．　Ｇｒａｆｔ／２゜Ｇｒａｆ 　ｔ／Ｈ３およびＧｒａｆ　ｔ／Ｈ９の推定アミノ酸配列を示す。

（Ｖ、６　：Ｆ１ａ　配列番号１２７　；　ＤＰ−７４配列番号１２８　；　Ｇ ｒａｆｔ／２７配列番号１３６　；　Ｇｒａｆｔ／２　配列番号１３７　：　Ｇ ＲＡＦＴ／Ｈ３配列番号１３８゜ＧＲＡＦＴ／Ｈ９配列番号１３９゜Ｖｌ、ｌｌ ：Ｆ１ａ　配列番号１２９　；　ＤＰ−２配列番号１３０　；　Ｇｒａｆｔ／２ ０　配列番号１４０）。

図１２は、ベクターｐＣＡＮＴＡＢ３−ｍｙｃ並ひにクローニング部位の領域中 のＤＮＡ配列とアミノ酸配列（配列番号１３１）を示す。

図１３は、ベクターｐＣＡＮＴＡＢ５−ｍｙｃ並びにクローニング部位の領域中 のＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す（配列番号１３２）。

図１４は、再配列されたＶＷ遺伝子の構築を示す。

表１は本明細書中に言及されるオリゴヌクレオチドブライマーとペプチドの一覧 である。本文書の読者は、それらのオリゴヌクレオチドとペプチドに関する配列 情報については、表中に配列番号を完備した表１に注意を向げられたし）、。

表１−使用するオリゴヌクレオチド ブライマー　配列 配列番号５　ＭＯＪＫＬＦＯＲＮＸ　５’　−ＣＣＧ　ＴＴＴ　ＧＡＴ　ＴＴＣ ＣＡＧ　ＣＴＴＣＣＴ　Ｇに−３゛ 配列番号９　ＶＨＩＦＯＲ−２５°−ＴにＡ　ＧＧＡ　ＧＡＣＧＧＴ　ＧＡＣＣ ＧＴＧＧＴ　ＣＣＣＴＴＧ　ＧＣＣＣＣ−３゜配列番号１４ＭＶＫＢＡＡＰＡ　 ５°−ＣＡＣＡＣＴ　ＣＣＡ　ＣＴＣＧＡＣＡＴＴＧＡＧ　ＣＴＣＡＣＣＣＡＧ 　τ（Ｔ　ＣＣＡ−３“配列番号ｔｏ”　Ｖ！−１１９ＡｃＫＡＰＡ　５・−Ｃ ９工にＡＣＣＡ。、Ｃ７６゜、。８゜ＧＴ’：　ＭＡＲＣＴＣ；　ＣＡＧ　ＳＡ Ｇ　Ｔ（ＷＧＧＪ。

配列番号１６　＠ＣＭＬＦＯ５°−τＣＣＡＡＣＡＧＧ　ＣＡＣにＴＴ　ＣＴＴ ＴＴＣττＴ−３゛ 配列番号１７　ＨＵＣＬこ”、Ｓ　５　’　−ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＴＴＣＴにＴ　 ＡＣ；Ｇ　Ｃ；にＣＣＡＣＴＣ；Ｔ　ＣＴＴ−３’ 配列番号１８　阿ＩＪＣＫＣＹＳ　５°−ＡＣＡ　ＣＴＣτＣＣＣＣＴ　ＧＴＴ 　ＧＡＡＣＣτ　ＣＴＴ−］。

配列番号１９　北−りＣＲ−巳ＡＣＫ　５−ＧＣＣＡＴＣ；　ＧＴＴ　ＧＴＴ　 ＧＴＣＡＴＴにＴＣＣＣＣ−３゜ 配列番号２０　５ｄ−５ＥＱＬ　５’−ＧＡＡ　ＴＴＴτＣＴ　ＧＴＡ　ＴＧＡ 　ＧＧ−３′ ＴＣＴ　ＣＴＣＴＴＧ　ＡｃＧ　ＣＡＧ　ＣＣＧＣＣ−コ。

Ｃ；ＧＴ　ＣＡＣτにＴ−］。

配列番号２９　ＨｕＪＨ４ＦＯＦ！５ｃｌｌＩ　５°−ＣＧＡＧＧＡＴＣＣＡＣ ＴＴにＴＣＣＡＣＡＣＧｃＴＣＡＣＣＡＧ−コ９ ヒトＶイ逆プライマー ヒトＩｇＭ定常領域プライマー ヒトに定常領域プライマー 配列番号３７　ＨｕＣｇＦＯＲ５°−ＡＧＡ　ＣＴＣＴＣＣＣＣＴ　ＧＴＴ　Ｇ ＭＧＣＴ　ＣＴＴ−３゜ ヒトγ定常領域プライマー 配列番号３８　ＨｕＣ／、ＦＯＲ５’−ＴＣ；Ａ　ＡＧＡ　ＴＴＣτにＴ　ＡＧ Ｇ　ＣＧＣＣＡＣＴＣＴ　ＣＴＴ−３’ ＡＰＡ　Ｌ＋部位を育するｖ）ｌ逆プライマーＧＧ−コ□ ＧＧ−３゜ ＧＧ−３’ ＣＣ−３゜ Ｃ；に−３’ ＳＦ１部位を有するλ逆プライマー ＣＣ−３゜ ＣＣ−３“ ＣＣ−］。

配列番号５７　ＨＵＶＬ４ＢＡＳＦン５°−ＣＴＣＣＴＣＧＣＡ　ＡＣＴ　ＧＣ Ｃｓ　ＧＣＣＣＡＧ　ＣＣＣＧＣＣＡＴＧ　ＧＣＣ（ＡＧＣＴＴ　ＡＴＡ　Ｃ’ Ｔに　ＡＣＴ　ＣＡＡ　ＣＣＧＣＣＪ’ τＣ−３” ＣＡ−３“ ＳＦＩ部位を育するに逆プライマー ＡＴＣＣＡＧ　ＡＴＧ　ＡＣＣＣＡＧ　ＴＣＴＣＣ−３’ ＧＴＴ　ＧＴＣＡＴに　ＡＣＴ　ＣＡＧ　ＴＣＴＣＣ−３’ Ｃ０−３“ ＣＣ−３゜ ＡｃＧ　ＡＣＡ　ＣＴＣＡＣＣ；　ＣＡＧ　ＴＣＴＣＣＪ’ ＣＣ−３’ 配列番号６８　ＨｕｃＫｒｏｐｓ：ａ　５゛−Ａｃｘ　ＣＴＣＴＣＣＣＣＴ　Ｔ ＴＴ　ＧＡＡＧＣＴ　ＣＴＴ−コ。

配列番号６９　ＨＵＣＬＦＯＲ５ＥＲ５’　−ＴＧＡ　ＡＧＡ　ＴＴＣＴＧＴ　 ＡＧＧ　ＧＧＣＣＡＣＴＧＴ　ＣＴＴ−３゛ ヒトＶに逆プライマー 配列番号７３　ＨｕＶｋ２ａＢＡ（Ｋ　５　’　−ＧＡＴ　ＣＴＴＣＴＩＩＩ； 　ＡＴＧ　ＡＣＴ　ＣＡＧＴＣＴ　ＣＣ−３゜ ［；トλ逆ブラｒマー 配列番Ｊｉｊ　７３　！（ｕｉＬ：ＩＡｃＫ　５　’−ＣＡＧτＣＴ　にＴＣＴ ＴＧ　ＡＣＧ　ＣＡＧＣＣＣＣＣ−３□ 配列番号７９　Ｈｕ入ＢＡＣＫ　５’−ＣＡＣ；　ＴＣＴ　ＧＣＣＣＴＣＡＣＴ 　ＣＡＧＣＣＴ　ＧＣ−コ゛ 配列番号８Ｑ　Ｈｕん３ａ８ＡＣＫ　５’−ＴＣＣ”、ＡＴ　ＧＴＣ；　ＣＴＣ ；　ＡＣＴ　ＣＡＧＣＣＡ　ＣＣＪ。

配列番号３１　ＨＩＪ入３ｂＢＡＣＫ　５゛−ＴＣＴ　ＴＣＴ　ＧＡＣＣＴＧ　 ＡＣＴ　ＣＡＧＣＡＣＣＣ−３’ 配列番号８２　１（ｕ入４ＢＡＣＫ　５’　−ＣＡＣにＴＴ　ＡＴＡ　ＣＴＣ； 　ＡＣＴ　ＣＡＡｃｃｃ　ｃｃ−コ゛ 配列番号８３　Ｈｕ入５ＢＡＣＫ　５°−ＣＡＧ　ＣＣＴ　ＣＴＣ；　ＣＴＣＡ ＣＴ　ＣＡＧＣｃＣτＣ−コ。

配列番号３４　Ｈｕ入６ＢＡＣＫ　５’−ＡＡＴ　ＴＴＴ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　Ａ ＣＴ　ＣＡＧＣＣＣＣＡ−３゜ ＡＰＡ　Ｌ１部位を有するλ逆プライマーＡＰＡ　Ｌ＋部位を育するに逆プライ マーＧＧ−３゜ ＧＯ〜２゛ Ｇに−３゜ 下記実施例は本発明の方法の実施態様を例示する。

実施例１に記載の実験では、ＴＮＦのエピトープに対して向けられたマウス抗体 をファージ上での表示のためＦａｂ断片としてクローニングし、そして重鎮をヒ ト軽鎖のレパートリ−と組み合わせることにより（または実際には軽鎖をヒトを 鎖のレパートリ−と組み合わせることにより）、１本かマウス鎖で１本かヒト鎖 であるＦａｂ断片を産生するファージを選択することが可能であった。それらの 抗体断片は元のマウス抗体と同じＴＮＦエピトープに結合した。次いで新たなヒ トｉ！（重鎮または軽鎖）をヒト相手鎖のレパートリ−と組み合わせて、同−Ｔ 　Ｎ　Ｆエピトープに結合する完全にヒトの抗体Ｆａｂ断片を作製した。

実施例２は、二元的組換え方式におけるＣＤＲ刷り込み選択を例示する。エピト ープ刷り込み選択により元のマウス重鎖ＣＤＲ３を保持したままで抗ＨＩＶ　ｇ ｐ１２０抗体をヒト化した。マウス抗体のｖ８およびＶＬドメインをマウスＣ１ ，ｌｌおよびＣに鎖との融合体としてクローニングした。得られた重１ｖ□Ｃ， ■断片を、ファージベクターからｇ３ｐ融合体として発現されたヒト軽鎖のレパ ートリ−と組み合わせてファージ上に表示せしめた。ファージ上に表示されたヒ ト軽鎖を選択し、そして選択された鎖を、元のマウス重鎮のＣＤＲ３を含むよう に増幅されｇ３ｐ融合体として発現されたヒト生来の重鎖Ｖ８Ｃイ１断片のライ ブラリーと組み合わせてファージ上に表示せしめた。

実施例３は単一レブリコン一本ｔｌＦｖ形式におけるＣＤＲ刷り込み選択を例示 する。エピトープ刷り込み選択により元のマウス重鎮のＣＤＲ３を保持したまま て抗ＨＩＶ　ｇｌ）１２０抗体をヒト化した。−重鎖Ｆｖライブラリーをファー ジ上に表示せしめ、元のマウス軽鎖と重鎖のＣＤＲ３とを含んでいるか軽鎖の残 部はヒト起源のものである断片を、ヒト生来の重鎮のライブラリーから誘導した 。次いて選択されたファージの重鎮可変ドメインをヒト軽鎖可変ドメインのレパ ートリ−と組み合わせて、ファージ上に５ｃＦｖライブラリーを作製した。この ライブラリーから選択されたファージは、マウス重鎖のＣＤＲ３の保持を除いて 可変ドメインか完全にヒト起源のものである５ｃＦｖ断片を表示した。

実施例４は、免疫処置されたマウスの免疫レパートリ−から誘導したヒト抗体の 単離を例示する。ＴＮＦで免疫処置されたマウス由来のマウス重鎖および軽１ｖ 遺伝子のレパートリ−を一本１ＪＩＦｖ断片としてファージ上に表示せしめ、Ｔ ＮＦへの結合についてファージ選択した。この選択されたマウス集団由来のＶ。

遺伝子を、一本ｌＦｖ断片としてヒト生来のライブラリーから誘導した■、遺伝 子と組み合わせ、そしてファージ選択した。選択さｎた半ヒト化抗体ポリペプチ ドニ１体を、ヒトｖＬをヒト生来のライブラリーからのヒトＶ。と対合すること により、完全にヒト化した。次いて得られたライブラリーからＴＮＦに特異的な 完全にヒト化された抗体ポリベブチトニ量体を選択する、二とかできる。

実施例５は合成ライブラリーの作製を例示する。

本発明者らは、二回の鎖入替えによるヒト化のための標的抗体として、ヒトＴＮ Ｆに対して向けられたマウスモノクローナル抗体を選択した。抗体Ｍａｂ３２　 （ＩｇＧ２ｂクラス、／Ｃ）　（Ｄ、　Ｒａｔｈｊｅｎら、１９９］。

Ｍｏｉ、１ｍｍｕｎｏ１．　２８．　７９頁；　Ｄ、Ｒａｔｈｊｅｎら、１９９ ２．　Ｂｒ１ｔ、Ｊ、Ｃａｎｃｅｒ６５、８５２−８５６頁、オーストラリア国 特許出願第７．５７６号、欧州特許第４８６．５２６号）は、ＴＮＦの細胞溶解 作用を阻害しない（おそらくそれかＴＮＦレセプターへのＴＮＦの結合を阻害し ないため）けれども、サイトカインの生体内抗癌作用と抗ウィルス作用を増強す る。

坑原結合部位はＴＮＦの最初の１８残基を包含するＴＮＦ−三量体の領域中に位 置している。この実施例は、ヒトＴＮＦ−α上のこの同一、１ビトーブを特異的 に認識するヒト抗体を作製するのに利用することができる。

実験と結果 使用する一般的方法はこの章の最後に与える。

１、Ｍａｂ３２のＶ遺伝子のクローニングとファージ上への表示Ｍａｂ３２のＶ 遺伝子のクローニング：本質的には記載された通り（Ｃ１，ａｃｋｓｏｎら、　 １９９１．前掲、　Ｃ１ａｃｋｓｏｎら、”ＰＣＲ：　ａ　ｐｒａｃｔｉｃａｌ 　ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｍｒ　Ｐｈｅｎｏｘ　ら編、ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ。

０ｘｆｏｒｄ、　１８７−２１４頁）のＰＣＲにより、Ｖ、遺伝子用のプライマ ーＶＨＩＢＡＣＫとＶＨＩＦＯＲ２、Ｖ、遺伝子用のプライ７−　ＶＫ２ＢＡＣ ＫとＶＫ４ＦＯＲ１並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；Ｒ，に、　５ａｉｋ ｉら、　１９８５゜５ｃｉｅｎｃｅ　２３０．１３５０頁）を使って、マウスＭ ａｂ３２抗体の遺伝子を救済した。マウスｖＨ遺伝子とＶに遺伝子を、ｓｃＦｖ 断片としての発現に向けてＰＣＲ構築により構築し、ＶＨＩＢＡＣＫＳｆｉおよ びＶＫＦＯＲ４ＮＯＴを使って増幅せしめ、５ｆｉｌ−Ｎｏｔｌ切断制限断片と してファジミドｐＨＥＮＩ（Ｈ，Ｒ，Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ　ら、１９９１．　 Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１９．　４１３３−４１３７頁）中に連結せし め、そしてＥ、コリＨＢ２１５１細胞中にエレクトロポレーションした。ＥＬＩ ＳＡにより分析した９６個のクローンのうち（下記参照）、９個がＴＮＦ結合性 可溶性５ｃＦｖ断片を分泌した。配列決定によると、全てのクローンでファミリ ーＩ［ＢのマウスＶＨとファミリー■のマウスＶにを示した（Ｅ、Ａ、　Ｋａｂ ａｔら、　１９９１．５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、　ＵＳ　Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌ ｔｈ　５ｅｒｖｉｃｅｓ）。

９つの配列を比較することによっておそら＜ＰＣＲによって導入されたであろう ヌクレオチド変異を検出し、そして「共通」配列および結合活性を有するクロー ン（ｓｃＦｖ−Ｍａｂ３２）を更なるクローニング実験のため選択した（図５） 。

可溶性発現のためのＭａｂ３２　Ｖ遺伝子の再りローニング：マウスＶ遺伝子を 重８３Ｉ（Ｆｄ、Ｖ、Ｃ，ｌ）または軽鎖の可溶性発現のために、継ぎ合わせ重 複伸長（ｓｐｌｉｃｅ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）によりマウスＶ 遺伝子をヒトＣ，ｌ　（μイソタイプ）またはヒトＣに遺伝子とそれぞれ連結す ることにより再クローニングした。オリゴヌクレオチドＭＯ，］ＫＩＦＯＬＮＸ 　（Ｖ遺伝子のＪ領域中に結合する。この実施例において使用する全オリコヌク レオチドは表１に与えられている）とＶＶＫＢＡＳＦ［（５’領域中に結合し、 Ｓｆ百制限部位を付加する）を使って、ｓｃＦｖ−Ｍａｂ３２　Ｄ　Ｎ　Ａから マウス■に遺伝子を増幅せしめた。

一方で、Ｃ１ａｃｋｓｏｎら、　＋９９１に記載の通り、２断片構築法を使って 、オリゴヌク１ノ不チトへｔＯＶＫ−ＨＵＣＫ−ＢＡＣＫ　（ヒトＣにの５′に 結合し、そしてマウスＪに１領域と部分的に相補的である）とＨＵＣＫＮＯＴ１ ６ＮＯＭＹＣ（ヒトＣにの３′末端に位置し、末端のンステインを保持し、Ｎｏ ｔｌ制限部位の上に標識を付ける）を使ったマウス−ヒトキメラ軽鎖遺伝子（Ｈ ｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、　１９９１．前掲中に記載されたＮＱＩｏ、　１２．５ の遺伝子）からのＰＣＲにより、ヒトＣにを得た。ＤＮＡ断片の連結のため、２ つのＰＣＲ断片を混合し、ＭＶＫＢＡＳＦＩとＨＵＣＫＮＯＴ１６ＮＯＭＹＣを 使って増幅せしめた。次いで、軽鎖の可溶性発現のためｐｅｌＢシグナルペブチ ト配列と適当なりローニング部位とを含むＩ］ＵＣＩ９誘導体（ｐＵＣ１９−ｐ ｅ＋ｅ−ｍｙｅ、図２）中に５ｆｉｌ−ＮｏｔＩ断片としてキメラｖにＣに遺伝 子をクローニングした。同様に、重複発現ＰＣＲによる継ぎ合わせにより、マウ スｖ１．ｌ遺伝子（ＬＭＢ３とＶＨＩＦＯＲ−２を使ってｓｃＦｖ−Ｍａｂ３２ から増幅したもの）をヒトμｍＣｏ１ドメインＣＭｏ−ＶＨ−Ｈｕ−ＣＨＩとＨ ＣＭＩＦＯＮＯを使ってヒト［ｇＭ由来のｃＤＮＡ　（Ｍａｒｋｓら、　＋９９ １．前掲およびＷＯ９２１０１０４７）から増幅したもの〕と組合せ、そして標 識鎖の可溶性発現のためｐＵＣＩ９−ｐｅｌＢ−ｍｙｃ中に５ｆｉｆ−Ｎｏｔｌ 断片としてクローニングした。

ファージ上へのＭａｂ３２抗体の表示 ＨＵＣＫＣＹＳＮＯＴとλ＋ＶＫＢＡＡＰＡを使ってマウス／ヒトキメラ鎖を再 増幅せしめ、そしてＡｐａＬｌ−〜ｏｔｌ断片としてｆｄ−ｔｅｔ−ＤＯＧＩ中 にクローニングすることにより、キメラ軽鎖をファージｆｄ上に表示せしめた。

重鎮Ｆｄ鎖遺伝子を存するプラスミドを含有する細胞を、ＡＭＰ−ＧＬＩＪ　（ １％）を含む２×ＴＹ中で対数期（０，５のＯＤ、。。）まで増殖させ、そして ２０倍過剰の軽鎖表示ファージにより感染せしめた。２×ＴＹ、アンピシリン（ １００μｇ／ｙＪ）　、グルコース１％培地中て振盪せずに３７°Ｃにて４５分 間そして振盪しなから３７°Ｃにて４５分間後、５０倍容の予熱した（３７°Ｃ ）２ＸＴＹ、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）およびテトラサイクリン（１５ μｇ／−）中に希釈し、３７°Ｃにて１時間、次いて３０°Ｃにて一晩（攪拌し なから）試料を増殖せしめた。そのような培養物の上清から収集したファージ粒 子は、それらの表面上に軽鎖を通して固定されたＴＮＦ結合性Ｆａｂ断片を表示 した。

同様にして逆の配置のものを作製した。まず重鎖■。Ｃ，１断片をｆｄ−ｔｅｔ −ＤＯＧＩ中にクローニングしくＶＨＩＢＡＣＫＡＰＡとＨＣＭＩＰＯＮＯを使 ってマウス／ヒトキメラ構成物からのＦｄ鎖遺伝子を増幅せしめた後）、そして ファージを使って可溶性軽鎖を産生ずることのできる細胞を感染せしめた。その ような細胞の上清から収集したファージ粒子は、それらの表面上に重鎖Ｖ。Ｃ， １を通して固定されたＴＮＦ結合性Ｆａｂ断片を表示した。

ファージ上に表示されたＭａｂ３２断片の性質ハイプリドーマＶ遺伝子を増幅せ しめ、上記のごとく■。遺伝子とＶに遺伝子をｓｃＦｖ断片としてファジミドＩ ＩＨＥＮＩ中にクローニングすることにより、マウス抗体Ｍａｂ３２のＶ遺伝子 をクローニングした。ＴＮＦに結合する抗体５ｃＦｖ断片をＥＬＩＳＡにより同 定した（詳細については下記を参照のこと）。マウスＶ。遺伝子はヒトμｍＣＨ １に結合したマウスＶ８として可溶性発現させるためにｐＵＣ１９−ｐｅｌＢ− ｍｙｃ　（図２）中で再クローニングし、一方軽鎖は　−との融合体としてヒト Ｃにドメインを有するベクターｆｄ−ｔｅｔ−ＤＯＧＩ中で再クローニングした 。重鎮構成物を含有する細胞を、軽鎖を育するｆｄソファノにより感染せしめる と、Ｆｄ重鎖と会合した軽鎖−ｇ３ｐを担持しているファージ粒子か出現した。

実際、マウス−ヒトキメラＦａｂを表示しているファージを使ったＥＬＩＳＡに より評価すると、ＴＮＦと３０１ペプチドへの結合は保持された。このファージ ＥＬＩＳＡにおいては、軽鎖のみを担持しているファージのバックグラウンドシ グナルは野生型ｆｄ−ｔｅｔ−ＤＯＧＩ　ファージよりもわずかに高かったか、 Ｆａｂを表示しているファージを使って得られたシグナルよりも常に低かった。

同様にして、ファージ上に固定された重鎖Ｖ。Ｃ，１断片と可溶性断片として提 供された軽鎖とを使ってＴＮＦ結合性ファージを作製した。ゆえに、Ｍａｂ３２ は、両方の表示方向での二元的組合せ方法において機能的である。

本質的にはＭａｒｋｓら、　１９９１．前掲に記載された通りに、２人の健康な 提供者の末梢血リンパ球から調製したｍＲＮＡから、に、λ軽鎖およびμ特異的 ｃＤＮＡを調製した。μ特異的、λおよびにライブラリーそれぞれに対してオリ ゴヌクレオチドＨＣＭＩＦＯ，ＨＵＣＬＣＹＳおよびＨＬＩＣＫＣＹＳを使って 、第−鎖ｃＤＮＡ合成を行った。このｃＤＮＡから、オリゴヌクレオチドＨＣＭ ＩＦＯと６つのファミリー特異的ＶＨＢＡＣＫプライマー　（Ｍａｒｋｓら、　 １９９１．前掲に記載）を使ってＶ、Ｃ，Ｉレパートリ−を増幅せしめ、Ｎｏｔ Ｉ標識された正プライマー（ＨＣＭＦＯＮＯ）とＡｐａ　Ｉｆｆ　ｍ　Ｌ　ｆ： 　ＶＨＢＡＣＫブライ７−　（ＨｕＶＨＩＢＡＡＰＡカラＨｕＶＨ６ＢＡＡＰＡ ４　”７：（０６つのプライマー：表１）とを使って再増幅せしめた。同様に、 Ｍａｒｋｓら、　１９９１．前掲およびＰＣＴ／ＧＢ９１１０１１３４　（Ｗｏ 　９２１０１０４７）に記載されたＨＵＣＬＣＹＳまたは間ＣＫＣＹＳ正ブライ ツプライマーＶλＩＢＡＣＫからＨｕＶλ６ＢＡＣＫまでまたはＨｕＶｋｌＢＡ ＣＫからＨｕＶｋ６ＢＡＣＫまての逆プライマーとを使って、軽鎖レバートリー を増幅せしめた。この項目に記載される各場合において、重鎖およびに鎖可変レ パートリ−は別々に増幅せしめた。増幅されたレパートリ−を、ＡｐａＬｌおよ びＮｏｔｌ標識されたそれらのオリゴヌク１ノオ千ドの変形（それぞれＨｕＶλ ＩＢＡＡＰＡからＨｕＶλ６ＢＡＡＰＡまでまたはＨｕＶｋｌＢＡＡＰＡからＨ ｕＶｋ６ＢＡＡＰＡまでの１３個の逆プライマー、および２個の正ブライ７−　 ＨｕＣＬＣＹＳＮＯＴとＨｕＣＫＣＹＳ−ＮＯＴ）を使って再増幅せしめた。３ つのレパートリ−全てをＡｐａＬＩ　−Ｎｏｔ　１断片としてｆｄ−ｔｅｔ−Ｄ ＯＧＩ中にクローニングし、そしてＥ、コリＭＣｌ０６１細胞中にエレクトロポ レーションし、ＶλＣλについては１．０ＸＩＯ７個のクローン、ＶＫＣににつ いては１．４　ＸＩＯ’個のクローン、そしてＩｇＭ由来のＶ＋ＣＨ１について は５　ＸＩＯ”個のクローンを得た。

挿入断片の存在を確認すると、該ライブラリー中の挿入断片の頻度は３つの場合 の全てにおいて９５％よりも高いことがわかった。

マウスＶ□　ドメインをドツキング鎖として使ったヒトｖＬの選択エピトープ刷 り込み選択を使って鎖を入替える時、マウス■遺伝子か第１回の選択の際に一定 に保持されることに依存して、マウスからヒト抗体への２つのルートがある（図 １参照）。抗原結合に対するマウス重鎮および軽鎖の影響並びに元のエピトープ 上へのヒト相手鎖のドツキングに対するそれらの影響は、おそらくドメインが抗 原結合性接触のほとんどを形づくることに依存して、抗体間で相当具なるだろう 。

図１は、出発にマウス抗体を使って例示されるような、エピトープ刷り込み選択 の理論を示す。白い長方形は元のマウス抗体の■８ドメインと■、ドメインを表 す。影を付けた長方形はヒトのｖｌ、ｌ　ドメインとｖＬ　ドメインを表す。最 後の行の左側に示されるヒト抗体誘導体は、次の段階を含む手順によって作製さ れる：ｆａ）　（ｉ）元のマウスＶ、を保持し、ヒトＶ、ドメインのライブラリ ーと組合せ、次いて抗原への結合により選択する。

ｆａ）　（ｉ　ｉ　）それらの選択されたヒトｖＬ　ドメインをヒトＶＨドメイ ンのライブラリーと組合せ、次いて抗原への結合により選択する。

最後の行の右側に示されるヒト抗体誘導体は、別の経路に由来する （ｂｌ　（ｉ）元のマウスＶＬを保持し、ヒトＶ。ドメインのライブラリーと組 合せ、次いて抗原への結合により選択する。

ｔｂ）　（ｉ　ｉ　）それらの選択されたヒトＶ。ドメインをヒトＶ、ドメイン のライブラリーと組合せ、次いで抗原への結合により選択する。

最後の行の中央に示されるヒト抗体は、次の手順により誘導される ｆｃ）　（ａ）　（ｉ　）において誘導した選択されたヒトＶＬ鎖を、（ｂ）　 （ｉ　）において誘導した選択されたヒトＶ。鎖と組合せ、次いて抗原への結合 により選択する。

（ｂ）（ｉｉ）において誘導したＶ、鎖を（ａｌ　（ｉ　ｉ　）において誘導し たＶｔＨと組み合わせることかでき、またその逆も可能である。この章は手順（ ａ）を説明し、次の章は手順（ｂ）と（Ｃ）を説明する。この実施例は二元的レ プリコン、二元的組合せ方式を使った手順を説明するか、この方法は単一レプリ コン、一本＠Ｆｖ方式にも同様に適用することか可能である。

第１回の鎖入替え実験において、ｐＵｃ１９−１）ｅｌＢ−ｍｙｃから発現され たマウスＶ）ｌ（ヒトＣＨ１ドメインに結合されている）を、Ｆａｂ断片として １０７の異なるヒトＶλＣλドメインのライブラリーと対合せしめた。該抗体断 片を表示しているファージを、ＴＮＦがコーティングされた試験管上での連続選 別にかけた。溶出したファージの力価を追跡することにより選択の程度をモニタ リングすることかできる。

４回の選択後（溶出ファージの力価か１００倍増加する）、２８個の各クローン のうち２４個か、Ｆａｂ断片（全てマウスＶ１４−ヒトＣＨ１を育する）を発現 しているファージを使ったＥＬＩＳＡにおいて、ＴＮＦに結合することかわかっ た。選択されたヒトＶλＣλドメインのみを表示しているファージは、キメラマ ウスＶに一ヒトＣにのみを表示しているファージと同様なバックグラウンドを与 えた。第１回の選択後に取った１６個のクローンは陰性であることかわかった。

２４個の結合体の中で３種類だけの異なるＢｓ　ｔＮ　［フィンガープリントか 検出され、ｌパターンか優位を占めていた（２１／２４　’）。軽鎖ＶＡＡ２． ＶλＣ４およびＶλＤ４がぞれぞれ２１／２４．２／２４および１／２４の頻度 で見つかった。配列決定により、３つの軽鎖が全て同じ生殖細胞系列遺伝子、即 ちヒトＶλ１−１−１に由来することが明らかになった。クローンＶλＣ４は１ 個、クローンＶλＤＩは２個、そしてクローンＶλＡ２は７個の生殖細胞系列と のアミノ酸残基の相違を有した（図６）。しかしながら、クローンＶλＡ２は、 関連するＶλｌの生殖細胞系列配列と一層類似しているフレームワーク−１領域 、ｈｕｍｖｌｌ１７を使用しており、従ってこれは組換えの結果であるかもしれ ない。３つのクローン間での配列中の変異が最少で且つ長さの変化が全くないと いうそれらクローンの生殖細胞系列特性は、ＣＤＲ３配列中にも認められる。と うやら、非常に類似した配列を有する非常に限定された数の遺伝子のみか緊縮条 件（マウスｖ１．Ｉと適合して抗原結合ペアを形成すること）を満たすらしい。

１つの驚くへきことは、■遺伝子をコードするヒト生殖細胞系列がそれらの条件 を満たすドメインを供給できることである。しかしながら、このライブラリーの 出発材料は別の実験で非常に多様であることか証明された。例えば、同じ２人の 提供者から作製した免疫処置されてぃない５ｃＦｖライブラリーから、本発明者 らは既知の生殖細胞系列遺伝子に比較して成る程度のヌクレオチド変異を存する 多数の異なるλ鎖を誘導した（Ｍａｒｋｓら、　＋９９Ｌ　前掲）。その上、同 一提供者から誘導した軽鎖遺伝子を親和性成熟のため鎖入替え実験において使用 し、そして多数の変異を存する軽鎖変異体（全て■λ１）を単離した（Ｍａｒｋ ｓら、　１９９２．前掲）、。

３つの選択されたＶλ遺伝子をＶλＣλ鎖としての可溶性発現のためｌｌＵｃ１ ９−ｐｅｌＢ−ｍｙｃ中で再クローニングした。３つの軽鎖プラスミドを含存す るＥ、コリ細胞を混合し、ヒトＶ、Ｃ，１遺伝子のファージライブラリーにより 感染せしめ、前に記載したｆｄ−ｔｅｔ−ＤＯＧＩライブラリーから発現させ、 そして該ライブラリーをＴＮＦがコーティングされた免疫試験管上での連続選別 にかけた。５ラウンド後、溶出ファージの力価が１００倍に増加した時、クロー ンを採取した。ＤＮＡ挿入断片のＢｓｔＮｌフィンガープリントにより分析した ２０個のクローンのうち１５個が２パターンのうちの１つを使用した（はぼ゛同 じ頻度で）。それらの重鎖Ｖ、ＣＨ１断片をＶλＡ２軽鎖と組み合わせた時の１ ５個のクローンは、Ｖλｃ４またはＶλＤｉ軽鎖と組み合わせた時よりも強いフ ァージεＬＪＳＡシグナルを与えた（図３）。重鎖Ｖ、ＣＨＩ断片のみを表示し ているファージを使って得られたパックグラウンドシグナルは、マウスｖＨ−ヒ トｃＨ１のシグナルと同様であった。

配列決定により、この２パターンは３つのユニークヒトｖｌＩ配列（りＣ１−ン Ｖ、Ｐ１／２／３、りｃｔ−ンＶＨＰ　Ｉは’；Ｉｏ−ンＶ、Ｐ２（Ｄものとほ ぼ同しＢｓ　ｔＮ　ｌ　フィンガープリントを有する）に帰することができるこ とが明らかになった。選択された軽鎖遺伝子と同様、選択された重鎮遺伝子は同 じ生殖細胞系列■。遺伝子（■８３ファミリーの生殖細胞系列ＤＰ−５１ＳＴｏ ｍｌｉｎｓｏｎら、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２２７．７７６−７９８、 １９９２　；図６）に由来し、最少の残基相違を有する。図６は、ヒＩ−ＴＮＦ に結合する抗体断片のｖ８およびＶ、抗体遺伝子の推定タンパク質配列を示す。

選択されたヒト■遺伝子をそれらの最も近い生殖細胞系列同族体と整列させた。

選択された遺伝子中の同一残基はハイフン（−）により表される。Ｖ）ｌ遺伝子 のフレームワーク４は第４残基のところで切り取られている。クローンＶ、Ｐ１ はおそら＜　ＤＰ−５１と関連生殖細胞系列ＤＰ−４７との間の組換え体であろ う。

３つの選択されたＶ、遺伝子は全て、比較的短いＣＤＲ３ループ（８，９および １０残基）を有するが、この配列の相同性はほとんどない。Ｖ、−ＣＤＲ３は本 来６つの抗体可変性ループ全ての最大多様性領域であるので、その領域中に共通 配列を有するクローンを選択する機会は実際には非常に小さい。

選択されたＶ遺伝子対の結合の特異性 Ｍａｂ３２および可溶性５ｃＦｖ断片を使った多数の抗原に関する特異的ＥＬＩ ＳＡは、元のＭａｂ３２抗体、その５ｃＦｖ誘導体および３種のヒト化されたＴ ＮＦ結合体（５ｃＦｖ断片として）が特異的にＴＮＦに結合することを示した（ 図４）。アオガイヘモシアニン、オボアルブミン、チトクロムＣ、ウシ血清アル ブミン、ヒトチログロブリンまたは２−フェニルオキサゾール−５−オン−ＢＳ ＡかコーティングされたＥＬＩＳＡプレートにもプラスチックだけにも全く有意 な結合が得られなかった。ヒト化された抗体が同一エピトープに結合するという 証拠は、ペプチド３０１がコーティングされたプレートと、元のマウス／ヒトキ メラＦａｂ断片またはヒト化されたＦａｂ断片を表示しているファージとを使っ たファージＥＬ［ＳＡから最初に得られた（このアッセイは可溶性５ｃＦｖ断片 の検出を可能にするほど十分には感受性でない）（図３）。図３は、一方の鎖か ｇ３ｐ融合体としてファージ上に表示され（ｆｄ−、、、により示される）、そ して他方の鎖か分泌された可溶性相手鎖として提供された、Ｆａｂ断片を表示し ているファージのＥＬＩＳＡの結果を示す。クローンは次の鎖の組合せを表示す る。

ｆｄ−ＤＯＧＩ　（抗体なし）、軽鎖・マウスＭ　ｏ　Ｖ、（Ｍａｂ３２由来） 、ヒトＶλＡ２およびＶλＣ４（マウスＶ。を使って選択されたもの）：重鎖： 　７　ウスＭ　ｏ　Ｖ　Ｈ（Ｍａｂ３２由来）、ヒトＶ、　ＰＩ、２．　３　（ １ニドｖλＡ２．ＶλＤＩ、ＶλＣ４を使って選択されたもの）、ヒトＶ、ＬＭ ２、ＶＨＬＭ８　（、マウスＶＬを使って選択されたもの）。

Ｖλ鎖はＶ、として示される。ペプチド３０１とＴＮＦの両方に結合する完全に ヒト化されたクローンが得られた。

加えて、ヒト５ｃＦｖ断片がＴＮＦへの結合を目当てに元の抗体と競争すること を示すために、本発明者らは、Ｍａｂ３２のタンパク質分解的開裂により誘導さ れたＦａｂ断片を使った競合ＥＬＩＳＡにおいて５ｃＦｖ構成物の結合を分析し た。一本ｔｌ　Ｆ　ｖ断片を、ＴＮＦかコーティングされた表面上で増加する量 のＦａｂ断片と共にインキュベートし、そして結合した５ｃＦｖの量をＥＬＩＳ Ａにおいて検出した（図７）。

元の５ｃＦＶ　−Ｍａｂ３２とヒト化された５ｃＦｖ断片の両方を含む５ｃＦｖ 断片の各々か、ＴＮＦへの結合を目当てにＦａｂ　Ｍａｂ３２と競争する。

かくして、ヒト化過程を通じてＴＮＦのペプチド３０１に対するＭａｂ３２の微 妙な特異性が保持される。

選択された■遺伝子ペアの結合親和性 マウスＭａｂ３２抗体、並びに精製された単量体形の組換えマウス５ｃＦｖ　− Ｍａｂ３２並びにヒト５ｃＦｖ抗体Ｖ、、、Ｐｔ−ｖλＡ２　、Ｖ、Ｒ２−■λ Ａ２およびＶ、Ｐ３ＶλＡ２を、ＴＮＦに対する相対親和性の測定のため競合Ｅ ＬＩＳＡにかけた。ＴＮＦコーティングされた表面上で増加する量の可溶性ＴＮ Ｆの存在下で抗体をインキュベートした。

全てのクローンが同範囲の増加するＴＮＦ濃度に渡りほぼ同様なＥＬ（ＳＡシグ ナルの減少を示した（１０　ｎＭ　〜１００　ｎＭ範囲にＩＣ５，を有する）。

親のＭａｂ３２はより強力に結合すると報告されているけれども（ヒトＴＮＦへ の結合親和定数８．７７　ＸＩＯ’　Ｍ−’）　、これは５ｃＦｖ断片のｍ個性 に比へて完全抗体分子の二価性を反映している。

Ｍａｂ３２およびＶ、Ｒ３ＶλＡ２断片をＰｈａｒｍａｃｉａ　ＢＩＡｃｏｒｅ を使った結合特性についても分析した。ＴＮＦを直接表面上に固定化し、抗体の 結合をモニタリングした。元のマウス抗体の特性はＭａｂ３２の２つの単量体形 を分析した。ＴＮＦ表面上では、タンパク質分解的開裂によるＭａｂ３２のＦａ ｂ断片と５ｃＦｖ　Ｍａｂ３２とが非常に類似した急速なオフ速度を示した（約 １０−”　ｓ−’）。ヒトＶＨＰ３−ＶλＡ２抗体は元の５ｃＦｖ　−Ｍａｂ３ ２と同範囲にオフ速度を有する。抗体タンパク質相互作用のオン速度は、他のタ ンパク質とそのレセプターとの相互作用について検出される範囲であり、１０４ 〜１０”　Ｍ−’　ｓ−’の１００倍範囲に及ぶ（Ｍａｓｏｎ　Ｄ、Ｍ、および Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　Ａ、Ｆ、、　１９８６．　Ｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｏｆＡｎｔ ｉｂｏｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　 Ｃｅ１ｌ　５ｕｒｆａｃｅ　Ａｎｔｉｇｅｎｓ。

Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ、　０ｘｆｏｒｄ　；　Ｐｅｃｈｔ、　１．１９９２．５ｅ ｌａ、　Ｍ、　＆ｉ、　ＤｙｎａｍｉｃＡｓｐｅｃｔｓ　ｏｆ　Ａｎｔｉｂｏｄ ｙ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋ。

第６巻、　１−６８頁）。抗体ＴＮＦ相互作用のオン速度が抗体タンパク質相互 作用に特有であると仮定すれば、ＢＩＡＣＯｒｅ分析により誘導されるオフ速度 は競合ＥＬＩＳＡにより示される親和性（Ｋ　ｄ＝　１０−”〜１０−”Ｍ）と 一致する。

従って、それらの測定値は、同様な親和性を有する５ｃＦｖ　Ｍａｂ３２および ヒト化された５ｃＦｖクローンＶ、Ｒ３−ＶλＡ２と一致し、よってエピトープ 刷り込み選択による親和性並びに特異性の保持とも一致する。

エピトープ刷り込み選択の別経路によるヒト化された抗体の選択。

更に別経路を使ってヒト鎖を選択することができるかどうかの疑問に答えるため に、本発明者らはまず、刷り込み鎖としてマウス■。

ドメインを使ってヒトＶ１．Ｉを選択した。４回の選別後、２つのヒト■８　ド メイン（Ｖ、−ＬＭ２．！：Ｖ、−ＬＭ８）が集団の優位を占メタ。

両Ｖ、遺伝子とも、Ｖ、３フアミリーに属する生殖細胞系列（ＤＰ−４６）と比 較すると最少の相違を示した。Ｖ、Ｐｌ、２および３配列と比較すると、Ｖ、− ＬＭ２とＶＨＬＭ８は同　（Ｖ１１３）７７　ミ’Ｊ−の生殖細胞系列を使用し 、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２に同一の標準的ループ構造を共有する（ＬＭ、　ｉｏ ｍｌｉｎｓｏｎら、　１９９２．前掲；Ｃ，Ｃｈｏｔｈｉａら、１９９２．　Ｊ 、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　２２７．７８９−８１７頁）。しかしながら、クロ ーンＶ、　ＬＭ２とＶ、−ＬＭ８１；！、Ｖ１４Ｐ１，２および３配列ニ比べて 長いＶｌ、ｌ−ＣＤＲ３（それぞれ８．　９．１０残基に比べて１８および１４ アミノ酸残基）を使用し、そしてそれらの各々の生殖細胞系列が１５アミノ酸残 基異なっている。（相補的性質ではなくて）相違に関して選択されたそれらの鎖 の相補性を試験するために、Ｖ、−ＬＭ２ドメインをファージ上のＦａｂとして または５ｃＦｖ配置においてのいずれかでヒトＶλＡ２ドメインと組み合わせた 。共に結合性組合せ体を生じた（図３、結果は示してない）。加えて、マウスＶ ＬはヒトＶ、Ｐ３と組合せると（ファージ上のＦａｂ断片として）比較的弱い結 合体を形成した。

可溶性発現のための抗体鎖をコードするプラスミドを含有するＥ。

コリ細胞を、１００μｇ／ｍ／アンピシリンと１％グルコースを含む１０ｍ７の ２ＸＴＹ中て３７°Ｃにて０．５の０Ｄｓｏｏまで増殖させた。元のライブラリ ーから調製した（１５μｇ／ｍ／のテトラサイクリンを含む２ＸＴＹ中て３７゛ Ｃにてライブラリーを増殖させそして２回のＰＥＧ沈澱によってファージを収集 することにより）　１０”形質転換単位（ＴＵ）をまたは選別実験からの溶出物 １ｍ／（様々な力価）を、３７°Ｃにて振盪せずに４５分間そして振盪しながら ４５分間インキュベートすることにより、細胞に感染せしめた。次いでアンピシ リン（１００μｇ／−）とテトラサイクリン（１５μｇ／−）を含む予熱した培 地５００ｒｎｌ中に細胞を接種し、３７°Ｃにて１時間増殖させた後、−晩のイ ンキュベーションのため３０°Ｃの振盪器に移した。２回のＰ　Ｅ　Ｇ−ＮａＣ １沈澱によりファージを調製し、選択前に約１０”ＴＵ／−になるように水に再 懸濁した。

結合体の選択 ５０ｍＭ炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９，６）中１０μｇ／ｒｎＩのＴＮＦ溶液２− を使って免疫試験管（Ｎｕｎｃ）を−晩コーティングした。ファージとのインキ ュベーション、洗浄および溶出条件はＭａｒｋｓら、　１９９１により記載され た通りであった。可溶性相補鎖を発現しているＥ、コリ細胞に溶出ファージを感 染せしめ、そして選択されたファージ集団の増幅（上述）に向けてテトラサイク リンを含む２ＸＴＹ培地中で増殖−重鎖ファージ原株を調製し、そしてこのファ ージを使って相手鎖をコードする遺伝子（クローンを選択するのに使ったもの） を含む細胞を感染せしめることにより、個々のクローンを結合についてファージ ＥＬＩＳＡにおいて分析した。上述のような一晩培養物（２１ｎＩりから調製し たＦａｂ断片を表示しているファージを、ＰＥＧ沈澱により１０倍濃縮し、５０ μｌをＥＬＩＳＡてアッセイした。組換えヒトＴＮＦ−α（酵母産物、比活性３ ．２Ｘ１０単位／■、Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、５０　ｍＭ 炭酸水素塩緩衝液（ｐＨ９，６）もしくはＰＢＳ中１０μｇ／−において５０μ ｌ／ウエルで、室温で一晩プラスチック製平底マイクロタイタープレー）　（Ｆ ａｌｃｏｎ　３９１２　）上にコーティングした。ＰＢＳで洗浄し、２％乾燥脱 脂粉乳（Ｍａｒｖｅｌ）で２時間ブロックした後、ウェルあたり５０μｌのファ ージを５０μｌの４％Ｍａｒｖｅｌに添加し、その後で記載された通り（Ｍａｒ ｋｓ　ら、　１９９１及びＰＣＴ／ＧＢ９１１０１１３４）抗フアージ抗血清を 使ってＥＬＩＳＡを続けた。Ｍａｂ３２エピトープへの結合の検出のため、ＰＢ Ｓ中１０μｇ／ｒｒｄ！のペプチドを１００μｌ／ウェル使って室温で一晩イン キユベートすることにより、３０１−ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙから提供、配列Ｈ−ＶＲＳＳＳＲＴＰＳＤＫＰＶＡＨＶＶＡ−ＯＨ配列 番号１１９）をコーティングした。３％ＢＳＡによりウェルを２時間ブロックし 、上記と同様に（Ｍａｒｖｅｌとのインキュベーションを使って）ＥＬＩＳＡを 続けた。

あるいは、選択した鎖を１つのプラスミド中で再クローニングしく　５ｃＦｖ断 片として）、適当な株中で発現を誘導し、そしてＥ　コリ培養上溝中の結合した 抗体断片を抗ｍｙｃ−ｔａｇ抗体によって検出することにより、可溶性抗体断片 を調製した。精製された単量体５ｃＦｖ断片（精製については下記参照）を競合 ＥＬＩＳＡ実験と結合特異性を調べるためとに使った。特異的ＥＬＩＳＡのため に、記載の様々なタンパク質（Ｍａｒｋｓら、　１９９１．前掲およびＷｏ　９ ２１０１０４７）でプレートをコーティングした。

競合ＥＬ［ＳＡには、Ｍａｂ３２　（Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙか ら提供）のタンパク質分解的開裂により誘導されたＦａｂ断片と、９Ｅ１０−プ ロティンＡ精製済マウス５ｃＦｖ　−Ｍａｂ３２かプロティンＡ精製済ヒト５ｃ Ｆｖ断片（Ｖ、Ｐ　１／２／３−　Ｖ　λ２）　（７）とちらかを使ツタ。ＴＮ Ｆかコーティングされたプレーｈ　（ＰＢＳ中３％ＢＳＡでプロ・ンクしたもの ）に、４つの５ｃＦｖ断片の各１つと増加する量のマウスＦａｂ断片（総量１０ ０μｌで、１■／艷溶液を１．２μｆ、４μｌおよび１０μｌ）との混合物を添 加した。２時間のインキュベーション後、プレートを洗浄し、そして抗体９Ｅ１ ０　（これは５ｃＦｖ断片のＣ末端のｍｙｃ−ｔａｇを認識する；　Ｍｕｎｒｏ およびＰｅｌｈａｍ、　１９８６．　Ｃｅ１ｌ　４６．２９１−３００　）とペ ルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体（Ｆｃ特異的）とを使って、結合した５ｃ Ｆｖを検出した。負の対照として、同じ抗体を使って増加する量のＦａｂ断片の みを検出した〔抗マウス（Ｆｃ特異的）抗体はマウスＦａｂと弱く交差反応する 〕。ある範囲の濃度の５ｃＦｖ断片（２５０μｇ／−まで）を使って実験を行い 、競合が目に見える５ｃＦｖの最少検出可能量を確立した（過剰量の５ｃＦｖを 使った時、競合は全く目に見ＴＮＦ−ＥＬＩＳＡにおいて陽性のファージクロー ンのＶ遺伝子ＤＮＡをＤＮＡフィンガープリント法（Ｃ１ａｃｋｓｏｎら、　１ ９９１．前掲）により分析した。簡単に言えば、ｆｄ−ＰＣＲ−ＢＡＣＫと重鎮 にはｆｄ−ＳＥＱＩまたは軽鎖にはＨ［ＪＬＡＭＢＤＡＳＥＱとを用いて該遺伝 子を２５サイクル増幅せしめ（９４°Ｃで１分：５０°Ｃで１分そして７２°Ｃ で２分）、次いでＤＮＡをＢｓｔＮＩで切断した。アガロースゲル電気泳動によ る消化物の分析は、陽性クローン間の主な相違の同定を可能にした。シークエナ ーゼキット（ＵＳＢ）と適当な配列決定用プライマーを使って、ジデオキシチェ ーンターミネーション法（Ｆ、　Ｓａｎｇｅｒら、　１９７７、　Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７４．５４６３−５４６７頁）により、選択さ れたＶ領域の核酸配列を決定した。ｐＨＥＮＩ中でクローニングされたマウスＶ 遺伝子はｐＨＥＮ−ＳＥＱとＬ＋ＮＫＳＥＱを使って配列決定し、ヒトｖＨ遺伝 子はヒトＣ，１（μ）領域中に位置するプライマー（Ｈｕ−ＭＣＨＩＦＯＲＳＥ Ｑ２）を使つて配列決定し、一方ヒト■λ遺伝子にはＨＵＬＡＭＢＤＡＳＥＱを 使った。

可溶性発現に向けての選択された鎖の再クローニング１１ＵＣ１９−ｐｅｌＢ− ｍｙｃ中へのクローニングのため、選択された軽鎖をＳｆｉ［ｆｆ識逆プライマ ーとＮｏｔｌ標識正標識イプライマーて増幅せしめた。ヒｈ軽ＭＶλＡ２．Ｖａ ＤｉおよびＶλＣ４をＨｕＶＬＩＢＡＣＫＳＦ［とＨｕＣＬＩＦＯＲＡＭＢＮＯ Ｔを使ってｆｄから増幅せしめ、無標識軽鎖としての可溶性発現（非抑制株中で の）に向けてＩ）ＵＣｌ３−ｐｅｌＢ−ｍｙｃ中でクローニングした。

あるいは、選択されたＶ遺伝子を、本質的には記載された通りに（Ｃ１ａｃｋｓ ｏｎら、　１９９１．前掲；　Ｍａｒｋｓら、　＋９９１．前掲およびＷＯ９２ １０１０４７）　、Ｍａｒｋｓら（１９９１，前掲およびＷＯ９２１０１０４７ ）　＋：：記載のオリゴヌクレオチドを使って５ｃＦｖ遺伝子として構築し、そ してＣ末端ｍｙｃ−ｔａｇを有する可溶性５ｃＦｖ断片としてのＥ、コリＨＢ２ １５１細胞中での発現に向けてｐＨＥＮｌ　（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、　１９ ９１．前掲）中でクロー〇末端ｍｙｃ−ｔａｇを有する元のマウスｓｃＦｖ−Ｍ ａｂ３２−ｃ１４断片は、９Ｅ１０−プロティンＡアフィニティーカラム（Ｃ１ ａｅｋｓｏｎら、　１９９１．前掲に記載）を使ってＥ、コリ上清から精製した 。ヒト５ｃＦｖ断片（全てＶイ３遺伝子を有する）はプロティンＡ−セファロー スカラム（Ｈ，Ｒ。

ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＧ、　Ｗｉｎｔｅｒ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ 、　２２７．３８１−３８８頁。

１９９２）上で精製した。どのタンパク質もゲル濾過（５ｕｐｅｒｄｅｘ−７５ ゜Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使って更に精製し、Ｂ［ＡＣＯｒｅ分析用に単量体画 分を取った。

標準的ポリメラーゼ連鎖反応 ポリメラーゼ連鎖反応用の標準的反応混合物は、５μｌの鋳型ＤＮＡ：２０ピコ モルの逆プライマー：２ｏピコモルの正プライマー：１０ｍＭ　ＫＣＩ　；　ｌ Ｏｄ　（ＮＨ４）２ＳＯ，；　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，８）　 ；　２ｍＭＭｇＣ１ｚ　：　１００　μｇのＢＳＡ／−および１単位のＴａｑ　 ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ）であった。この 反応混合物の上に鉱油を重層させ、Ｔｅｃｈｎｅ熱循環器（Ｄｕｘｆｏｒｌｄ、 　Ｅｎｇｌａｎｄ　）を使って３０サイクルの増幅にかけた。１サイクルは９４ °Ｃで１分（変性）、５５°Ｃで１分（アニーリング）および７２°Ｃで１．５ 分（伸長）であった。その他のＰＣＲ条件は本明細書中または参考文献中に与え られている。

ＤＮＡ生成物の精製 生成物は、アガロースゲル電気泳動後にＧｅｎｅｃｌｅａｎ　（Ｂｉｏｌｏｌ） を使って、または電気溶出とエタノール沈澱（Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋら、　１ ９８９゜Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　 Ｍａｎｕａｌ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　ＮＹ、　）により 精製した。

制限酵素消化 制限酵素消化は製造業者（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ、　ＣＰ　 Ｌａｂｓ。

Ｂ１５ｈｏｐｓ　５ｔｏｒｔｆｏｒｄ　）の指示に従って実施した。連結はＳａ ｍｂｒｏｏｋら（１９８９，前掲）に従って実施した。

結論 本発明者らは、エピトープ刷り込み選択（ＥＩＳ）方法によりマウス抗体を同じ 特異性を持つヒト抗体に再構築できることを証明した。

ヒト軽鎖のライブラリーをマウスＶ。ドメインと組合せ、結合性の組合せを選択 し、次いでヒトｖＨ遺伝子のライブラリー用の「ドツキングドメイン」として２ 回目の入替えに使った。そのような「真の」ヒトライブラリーから完全にヒトの 抗体を単離した。該抗体は結合特異性を保持していることが示された。あるいは 、マウスＶ、をヒトｖＨ相手鎖を選択するためのドツキング鎖として使った。

そのようなりＨドメインはヒトＶ、遺伝子を見つけるのに使うことかてき、ある いはまた、マウスＶ。ドメインを使って選択されたヒト■、ドメインと組み合わ せることができる。実際、独立的に選択された２つのＶ遺伝子を組み合わせるこ とによって結合活性が得られた。これはＥＩＳ法の潜在的付加能力を示している 。

ＣＤＲ移植（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、　１９８８．前掲）方法はしばしば抗体の 三次元構造の詳しい知識を必要とするため、ＥＴＳアプローチの方かＣＤＲ移植 よりも迅速に抗体をヒト化するのに役立つことかできる。しかしながら、ＥＩＳ 法は、例えば免疫処置した冨歯類からのファージ選択により得られた抗体レパー トリ−に拡張することができる。抗原での免疫処置後、高い親和性と特異性を有 するＶ遺伝子のレパートリ−を選択し、次いでエピトープ刷り込み選択（実施例 ４参照）に使用し、高い親和性を有し且つ所望の特異性が富化された成る範囲の ヒト抗体を産生ずることができる。

多組合せ抗体ライブラリーとＣＤＲ刷り込みを使った誓言類抗体のヒト化 重鎮のＣＤＲ３は、全ＣＤＲのうち長さと配列に関して最も可変的であることか 通常認められ、そして抗原との重要な接触を行うことかできる（Ｗｉｎｔｅｒ、 　Ｇ、およびＭｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ，、“Ｍａｎ−ｍａｄｅ　Ａｎｔｉｂｏｄ −ｉｅｓ”、１９９１．　Ｎａｕｒｅ　３４９．２９３−２９９頁）。これは、 ＣＤＲ移植（ドイツ国特許明細畜ＧＢ２１８８６３８Ｂ）によるにせよ鎖入替え を使って本明細書に記載の通りにしてにせよ、ヒト化する時に重要な事柄である 。

署歯頚抗体のＶ、ＣＤＲ３配列がヒトＶ８セグメント上に刷り込まれる鎖入替え 法によるヒト化に多組合せアプローチを適用することか有利かもしれない。多組 合せアプローチでは、ｌ断片例えばＶ、Ｃ。

ｌかファージベクターからの融合体としてファージ上に表示され、そして他方の 断片例えば軽鎖が例えばプラスミドから可溶性断片として発現される。Ｆａｂ断 片としてファージ上に両断片を表示せしめるためにファージによる重感染か用い られる。

この実験では、マウス抗ＨＩＶ　ｇｐ１２０モノクローナル抗体をヒト化した。

このマウス抗体のｖＨドメインをヒトＣγドメインと融合せしめ、そしてｐＵｃ １９ｓｆｉ／Ｎｏｔ／ｐｏｌｙｍｙｃ中にクローニングした。

ｆｄ−ＤＯＧ−１（Ｗｏ　９２１０１０４７のｆｄ−ＣＡＴ−２としても知られ る）中にｇ３融合体としてクローニングした生来のヒト軽鎖のレパートリ−を、 キメラ重鎖を担持する細胞中に感染せしめ、抗原に関してファージ選択した。フ ァージゲノムは軽鎖だけをコードするが、それらのファージはその表面上に重鎮 と軽鎖の両方を育する。重鎮だけが提供されたものであるためこれは問題ではな い。

こうして選択された軽鎖を、次いでヒト抗体のＣＤＲ３が元のマウス重鎮のもの で置換されるようなやり方でＰＣＲ増幅させた生来のヒトｖＨドメインのライブ ラリーと対合させる。

項目（ａ）は、マウスＦ５８のＶＨおよびＶ、ドメインがヒトＣ，１およびＣに 配列に融合されたキメラＦａｂ断片の作製を扱う。このクローンを抗体の早期特 徴付けに使い、その後の重鎮のＰＣＲ増幅のための鋳型として働いた。これを次 いでＰｓｔｌ−Ｎｏｔｌ断片としてｐＵｃ１９５ｆｉ−Ｎｏｔ　ｐｏｌｙｍｙｃ 中にり０−ニングした（項目（ｂ））、項目（Ｃ＋はｆｄＤＯＧ中でのヒト軽鎖 レパートリ−の作製を記載しており、このヒト軽鎖レパートリ−を次いでｐＵｃ １９上にキメラ重鎖を含む細胞に感染せしめた（項目（ｄ））。生じたファージ をペプチドに対して選択しく項目（ｅ））、選択された軽鎖をＰＣＲ増幅せしめ 、モしてキメラ重鎖と並んでＡｓｃ［−ＮｏｔＩ断片としてクローニングしく項 目げ））　、ＥＬｒＳＡにより抗原への結合能力についてアッセイした（項目（ ｇ））。選択された軽鎖をｐＵＣ中で再クローニングしく項目−）、生来のヒト ｖＭドメイン上にＦ１ａ　ＣＤＲ３配列を刷り込む変異原性プライマーを使って 該ヒトＶ１．ｌ　ドメインを増幅せしめ、そして得られた断片をファージ中でク ローニングした（項目（ｉ））。次いでこの刷り込まれた重鎮ファージのレパー トリ−を使って、ｐＵＣ上に選択された軽鎖を担持している細胞を感染せしめ、 得られたファージを抗原に関して選別した。最後に、選択された重鎮と軽鎖を同 一レプリフン上で一緒にクローニングし、そして抗原への結合についてアッセイ した（項目（ｊ））。

５ｍｌの培讐ハイブリドーマ細胞（約２ＸｌＯ’細胞）をＰＢＳ中で洗浄し、ペ レット化し、２００μｌの０．１％ジエチルピロカーボネート／水に再懸濁し、 すぐに５分間煮沸した。遠心分離後、「煮沸物」の上清６８ｕｌを反応混合物２ ８１１１に添加し、１４０ｍＭ　ＫＣＩ、　５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（４ ２°ＣでｐＨ８，１）　、　８ｍＭ　ＭｇＣ１，、１０ｍＭ　ＤＴＴ、　５００ μＭデオキシチミジン三リン酸、５００μＭデオキシシチジン三リン酸、５ｏＯ μＭデオキシアデニン三リン酸および５００μＭデオキシグアニン三リン酸ヌク レオチド三リン酸（５００μＭ　ｄＮＴＰｓ）　、　１６０単位のヒト胎盤ＲＮ アーゼ阻害剤並びに１０ピコモルの正プライマーを含有する反応混合物９６μｌ を得た。４μｌ　（１００単位）の鳥類骨髄芽球症ウィルス（ＡＭＶ）逆転写酵 素を添加し、反応液を４２“Ｃにて１時間インキュベートし、１００°Ｃに３分 間加熱し、氷上で急冷し、５分間遠心した。次いで、上清をすぐにＰＣＲに使っ た。

重鎮と軽鎖には別々のＰＣＲ増幅を実施した。ｃＤＮＡ合成からの上清５　ｕ　 ｌ　、　２５０μＭ　ｄＮＴＰｓ、　５０ｍＭ　ＫＣＩ、　１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ −ＨＣＩ（ｐＨ８，３）。

１、５ｍＭ　Ｍｇｃ１２．　１７５μｇ／ｍｌＢ　Ｓ　Ａ、各２０ピコモルの適 当な正および逆プライマーの混合物（Ｃ１ａｅｋｓｏｎ、　Ｔ、ら、　１９９１ ．前掲）並びに１μｌ（５単位）のテルムス・アクアチフス（Ｔａｑ）　ＤＮＡ ポリメラーゼ（Ｃｅｔｕｓ、　Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を含有する５０μ ｍの反応混合物を調製した。この反応混合物の上にパラフィン油を重層させ、Ｔ ｅｃｈｎｅ　ＰＨＣ−２熱循環器を使って３０サイクルの増幅にかけた。ｌサイ クルは９４°Ｃで１分（変性）、５５°Ｃで１分（アニーリング）そして７２° Ｃで１分（伸長）であった。５μｌを２％アガロースゲル上で展開することによ り生成物を分析した。残りはエーテルで２回、フェノール／クロロホルムで１回 抽出し、エタ、ノール沈澱せしめ、そして５０μｍの水に再懸濁した。

（ｉｉ）　増幅させたｖＨおよび■にＤＮＡのクローニングと配列決定増幅させ たＶ。ＤＮＡをＰｓｔ［とＢｓｔＥＩＩで消化し、２％低融点アガロースケル上 テ精製し、そしｒＰｓｔｌとＢｓｔＥｒｌｔ’消化したＭ１３ＶＨＰＣＲ１（Ｏ ｒｌａｎｄｉ、　Ｒ，、Ｄ、Ｈ，Ｇｕｓｓｏｗ、　Ｐ、Ｔ、　Ｊｏｎｅｓおよび Ｇ、　Ｗｉｎｔｅｒ　（１９８９）Ｃ１ｏｎｉｎｇ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌ ｉｎ　ｖａｒｉａｂｌｅ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｆｏｒ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｂ ｙｔｈｅ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｅｔｉｏｎ”、　Ｐｒｏ ｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ。

８６（１０）、　３８３３−７）中に連結せしめた。増幅させたＶにＤＮＡをＰ ｖｕ■とＢｇｌＩ［で消化し、そしてＰｖｕＭとＢｃｌ　Ｉで消化したＭ１３Ｖ ＫＰＣＲ１中に連結せしめた。連結混合物を使ってコンビプントＴＧＩ細胞を形 質転換せしめた。別々の増幅からの２つのクローニンを、デオキシヌクレオチド チェーンターミネーション法を使って各々のＶ。鎖と■に鎖について配列決定し た。

（ｉｉｉ）　Ｅ、　コリ中での発現用のＦａｂ構成物の作製定常ドメインを含む ベクター中にＦ１ａのＶドメインを連結せしめることにより、Ｆ５８可変ドメイ ンとヒト＋ｇＧＩＣイ１およびＣにドメインとを含有するキメラＦａｂを作製し た。Ｆ１ａのｖＨを含有するＭ１３ＶＨＰＣＲ１をＰｓｔＩとＢｓｔＥＩ［で消 化した。生じたＦ５８ＶＨ断片を次いで１．５％アガロースゲル上で精製し、Ｇ ｅｎｅｃｌｅａｎを使ってゲルから単離し、そしてＰｓｔ［とＢｓｔＥＩＩで消 化したｐＪＭ−ＩＦａｂＤｌ、３　（ＰＣＴ／ＧＢ９１１０１１３４）中に連結 せしめた。二の連結混合物を用いてコンピテントＥコリＮ４８３０−１細胞（Ｇ ｏｔｔｅｓｍａｎ、　Ｍ、Ｅ、、　Ａｄｈｙａ、　Ｓ、およびＤａｓ、　Ａ。

（１９８０）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１４０．５７−７５頁〕を形質転 換せしめ、ＲＦ　ＤＮＡの制限分析によりＦ５８Ｖ１．ｌを含むクローンを同定 した。プライマーＶｋ２ＢＡＣＫとＶｋ３ＦＯＲ２（Ｃ１ａｃｋｓｏｎ、　Ｔ、 ら、　１９９１．前掲）を使い、鋳型としてＦ５８Ｖにを含むＭ１３ＶｋＰＣＲ を使って、ＰＣＲによりＦ５８Ｖにを増幅せしめた。ＰＣＲ生成物を５ａｃｌと Ｘｈｏｌで消化し、１．５％アガロースゲル上で精製し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎを 使ってゲルから単離し、モしてＦ５８Ｖ、を含有する５ａｃＩとＸｈｏ　［で消 化したｐＪＭ−Ｉ　Ｆａｂベクタ中に連結せしめた。この連結混合物を用いてコ ンピテントＥ、コリＮ４８３０−１細胞を形質転換せしめ、ＲＦ　ＤＮＡの制限 分析によりＦ５８Ｖにを含むクローンを同定した。

（ｂｌ　Ｆ５８キメラ重鎖のＰＣＲとクローニング上述の通り誘導したＦ５８キ メラ重鎖を、プライマーＶＨＩＢＡＣＫＳＦ１１５とＨＵＣＨＩＦＯＲＡＳＣＮ ＯＴ　（表１）を使ってＦ１ａのＦａｂクローンＤＮＡから増幅させた。得られ た約７００　ｂｌｌの断片をＰｓｔＩとＮｏｔＩで消化し、そして標準法（Ｓａ ｍｂｒｏｏｋ、　Ｊ、ら、　１９８９．前掲および実施例１）を使ってＰｓｔＩ とＮｏｔＩて切断されたＩ）ＵＣ１９Ｓｆ　ｉ／Ｎｏｔ／Ｐｏｌｙｍｙｃプラス ミド適当なファミリーに基づく逆プライマーと正プライマー（表１）の等モル混 合物を使って、に鎖遺伝子とλ鎖遺伝子を別々に増幅せしめた。に鎖遺伝子は、 ＨＵＣＫＦＯＲプライマーを使ったｃＤＮＡ合成物から、ＨＵＣＫＦＯＲ３ＥＲ プライマーと共に６つのＨＵＶＫＢＡＣＫ　１ａ−６ａプライマーの等モル混合 物を使って増幅させた。λ鎖遺伝子は、ＨＵＣＬＦＯＲプライマーを使ってｃＤ ＮＡ合成物から増幅させ、そしてＨＵＣＬＦＯＲＳＥＲプライマーと共に７つの ＨＵＬＢＡＣＫ　１−６プライマーの等モル混合物を使って増幅させた。各場合 とも、適当なｃＤＮΔＤＮＡ合成上清５μ！、２０ピコモルの合計濃度の逆（Ｂ ＡＣＫ）プライマー、２０ピコモルの合計濃度の正（ＦＯＷＡＲＤ）プライマー 、２５０μＭ　ｄＮＴＰｓ、　１０ｍＭ　ＫＣＩ、　１０ｍＭ（ＮＨ，）２ＳＯ ，、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，８）、　２．０ｍＭ　ＭｇＣ１， 、１００ｍｇ／ｍＪ　ＢＳＡおよび１μＩ！（１単位）のＶｅｎｔ　ＤＮＡポリ メラーゼ（ＮｅｗＥｎｇ　１ａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を含有する反応混合物５０ μｌを調製した。この反応混合物の上に鉱油（パラフィン油）を重層し、Ｔｅｃ ｈｎｅ熱循環器を使って３０サイクルの増幅にかけた。１サイクルは９４゛Ｃで １分（変性）、５７°Ｃで１分（アニーリング）そして７２°Ｃで２．５分（伸 長）であった。生成物を２％アガロースゲル上で精製し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ　 （Ｂｉｏ−１０１）によりゲルから単離し、そして２５μｌのＨＪに再懸濁した 。

２つの軽鎖調製物の各々において２つの異なる危機脱出（ｐｕｌｌｔｈｒｏｕｇ ｈ）反応を実施した。に鎖遺伝子は、ＨＵＣＫＦＯＲＳＥＲＮＯＴと一緒に６つ のＨＵＶＫＢＡＡＰＡプライマーの等モル混合物を使って２反応において増幅さ せた。λ鎖遺伝子もＨＵＣＬＦＯＲ３ＥＲＮＯＴと一緒に７つのＨＵＶＬＢＡＡ ＰＡプライマーの等モル混合物を使って２反応において増幅させた。危機脱出条 件は、２５サイクルの増幅を使うこと以外は最初の軽鎖ＰＣＲについてと同様で あった。

標準法を使ってＰＣＲ生成物をＡｐａＬＩとＮｏｔｌで消化し、そして実施例１ に記載の通りＡｐａＬＩとＮｏｔｔで切断されたｆｄ−ＤＯＧ中にクローニング した。実施例１に記載の如くライブラリークローンからファージを調製し、重鎮 を含む細胞を感染せしめるのに使った（下記参照）。

（ｄ）　入替えられたＦａｂファージの生産Ｆａｂキメラ重鎖を含有する細胞を ２ＹＴＡＧ中で３７°Ｃにて一晩増殖させ、５００μｌを３７°Ｃに予熱された 三角フラスコ中の新鮮な２ＹＴＡｍｐ培地５０ｍ１に添加した。振盪させながら 細胞を約０．５のＯＤ、。。まで増殖させた後、軽鎖レパートリ−から合計１ｏ １１個のファージを添加した。

培養物を振盪させながら３７″Ｃに４５分間置き、次いで３７°Ｃで更に４５分 間激しく振盪させた後、テトラサイクリンを１５μｇ／−になるように加え、− 晩振盪させた。

上述したように（実施例１）培養上清のＰＥＧ沈澱によってファージを収集し、 選択実験に使った。

（ｅ）　入替えられたＦａｂファージの選別これは前に記載した通り（Ｍａｒｋ ｓ、　Ｊ、ら、　１９９１．前掲）にｍａｘｉｓｏｒｂプレート上で実施した。

ただし、１０μｇ／−に溶解させたＨｌｖ−１単離物１１［Ｂのｅｎｖ　ｇｌ） １２０　Ｖ３ループペプチドにより試験管をコーティングした。このペプチドは ＡＩＤＳ管理用プログラム（貯蔵番号口ＡＤＰ７３７）から得られ、配列：　Ｃ ＴＲＰＮＮＮＴＲＲ３ＩＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧＮＭＲＱＡＨＣＮ 　（配列番号１２０）を有する。試験管から溶出させたファージを使って、Ｆ５ ８キメラ重鎖を含む新鮮な細胞を再感染させ、そしてこの選別／再感染操作を更 に３回繰り返した。

（ｆ）　選択された軽鎖の再クローニング選択された軽鎖を、プライマーＧ３Ｌ ＡＳＣＧＴＢＡＣＫとＨυＣＬＦＯＲ３ＥＲＮＯＴまたはＨ［、ＩｃＫＦＯＲｓ ＥＲＮＯＴとを使ってｆｄ−ＤＯＧ軽鎖ＤＮＡからＰＣＲ増幅せしめた。Ｇ３Ｌ ＡＳＣＧＴＢＡＣＫプライマーはｆｄ中のｇ■の翻訳開始シグナルの上流にアニ ールし、そしてＡｓｃ　Ｉ部位とリポソーム結合部位（ＲＢＳ）を提出する。そ れらの断片をＡｓｃ　ＩとＮｏｔ　Ｉで消化し、そして可溶性Ｆａｂの生産を可 能にするシストロンを造るようにＡｓｃ　ＩとＮｏｔＩで切断されたｐＵｃ１９ Ｆ５８プラスミド（図８に示す）中にクローニングした。これをペプチド結合に ついてＥＬＩＳＡで分析し、軽鎖の末端のｍｙｃ　ｔａ、ｇペプチドによって、 結合した抗体を検出した。

（ｇ）　ＥＬＩＳＡ ＥＬＩＳＡは下記のように実施した。

１、　１００μｌの２ＸＴＹ、１００μｇ／−アンピシリン、１％グルコースを ９６ウエルプレート（ｃｅｌｌ／ｌａｂウェル、　Ｎｕｃｌｏｎ）上に接種し、 そして振盪させながら（３００ｒｌ）［Ｉ］）　３７°Ｃにて一晩増殖させる。

２．９６ウエルの移動装置を使ってこのプレートから１ウエルあたり２００μＥ の新鮮な２ＸＴＹ、１００μｇ／−アンピシリン、０．１％グルコースを含む第 二の９６ウエルプレートに小接種材料を移す。３７℃で振盪させなからＯＤ、。

。、が約０．９になるまで（約３時間）増殖させる。元のプレートのウェルにｌ ウェルあたり２５μｌの６０％グリセロールを加え、−７０°Ｃで保存する。

３、２５μｆ（７）２ＸＴＹ：１００　μｇ／ｍＪ７：ｚピシリン、９ｍＭ　Ｉ ＰＴＧ　（最終濃度　１ｍＭ　（ＰＴＧ）を添加する。３０’Ｃで更に１６〜２ ４時間連続振盪培養する。

４、　４，０００　ｒｌ）ｍで１０分間遠心し、１ｏｏμｌノ上清をＥＬＩＳＡ 　！：使う。

５、　プレート（Ｆａｌｃｏｎ　３９１２）を１０μｇ／−のペプチド水溶液！ ５０ａｌ／ウェルでウェルをコーティングする。

６、ＰＢＳＣ’３回洗浄し、２００　μｉ／ウーＴＪＬの１％ＢＳＡ／ＰＢＳで ３７゛Ｃにて１時間ブロックする。

７、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで全ウェルに２５μｌの６％ＢＳＡ／ＰＢＳを添 加する。

８、　適当なウェルに可溶性Ｆａｂを含む培養上清ｌｏｏμｌを添加する。

混合し、室温で１．５時間放置する。

９、試験溶液を捨て、ウェルをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０で３回、次 いでＰＢＳで３回洗浄する。２％ＭａｒｖｅＩ／　Ｐ　Ｂ　Ｓ中の４ａｇ／−の 精製９Ｅ１０抗体１００μｌを各ウェルにピペットで加える。室温で１．５時間 インキュベートする。

１０、９Ｅ１０抗体を捨て、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０で３回、次い でＰＢＳでウェルを３回洗浄する。抗マウス抗体（ペルオキシダーゼ接合抗マウ ス免疫グロブリン、　Ｄａｋｏｐａｔｓ／［ＣＮ、またはペルオキシダーゼ接合 抗マウス［ｇＧ、　Ｆｃ特異的、　Ｓｉｇｍａ　Ａ−２５５４）の１５００希釈 液１００μｌをピペットで加える。室温で１．５時間インキュベートする。

１１、第二抗体を捨て、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０で３回、次いでＰ ＢＳてウェルを３回洗浄する。

１２、　１０■のＡＢＴＳ（２，２’−アジノビス〔３−エチルベンズチアプリ ン−６−スルホン酸、ジアゾニウム塩〕錠剤１錠を２０−の５０ｍＭクエン酸緩 衝液、ｐＨ４，５に添加する。（５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ４゜５は、同容 量の５０ｍＭクエン酸三ナトリウムと５０ｍＭクエン酸を混合することにより作 製する。） １３、分配を行う直前に３０％過酸化水素２μｌを上記溶液に添加する。

１４、各ウェルに上記溶液１００μ！を添加する。室温で２０〜３０分間置く。

１５、３．２　ｒｎｇ／ｒｒｄのフッ化ナトリウム５０μｌを加えることにより クエンチングする。４０５　ｎｍで読む。

注１　あるいは、形質転換プレートからのクローンを９６ウエルプレート（“ｃ ｅｌｌ　ｗｅｌｌ″、　Ｎｕｃｌｏｎ　）中の１００μｆの２ＸＴＹ、１００μ ｇ／ｍＡ’アンピシリン、０．１％グルコース中に接種し、００．。。。、か約 ０．９になるまで（約６時Ｍ）３７°Ｃで振盪しながら（３００ｒ、　ｐ、　ｍ 、　）増殖させる。段階３を続ける。

注２：この方法はＤｅＢｅｌｌｉｓ、　Ｄ、およびＳｃｈｗａｒｔｚ、　１．１ ９９０．　Ｎｕｃｌ。

Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１８．１３］１頁に基づいており、そして誘導物質（Ｉ ＰＴＧ）を添加する時までに出発培地中に存在する低レベルのグルコースか代謝 されることに頼っている。

注３　：　”Ｍａｒｖｅｌ”は乾燥粉乳である。ＰＢＳは１！中５．８４　ｇ　 ＮａＣ１゜４．７２　ｇ　ＮａＪＰＯ４および２．６４　ｇ　ＮａＨｚＰＯ４・ ２＋（２０，ｐｆ（７，２である。

ＢＳＡはウシ血清アルブミンである。

卸　選択された軽鎖のサブクローニングＨＵＣＬＦＯＲＳＥＲＡＳＣＮＯＴと共 に７つのＨＵＶＬＢＡＳＦ　［プライマーの等モル混合物またハＨＵＣＫＦＯＲ ＳＥＲＡＳＣＮＯＴと共ｆ：６　ツノＨ［ＪＶＫＢＡＳＦｒプライマーノ等モル 混合物を使って、選択されたクローンのＤＮＡから軽鎖をＰＣＲ増殖させた。反 応条件は、２５サイクルの増幅を使うこと以外は、最初のＰＣＲ反応について記 載した条件と同じであった。ＰＣＲ断片を５ｆｉ（とＮｏｔ［で切断し、そして ５ｆｉｌとＮｏｔ［で切断されたｐＵＣ１９Ｓｆｉ／Ｎｏｔ／ｐｏｌ）’ｍｙＣ 中にクローニングし、これを用いてＴＧＩ細胞を形質転換せしめた。

上述の選別／感染法を事実上再び繰り返したが、今度は重鎮と軽鎖の位置が逆で あった。

（ｉ）　ＣＤＲ刷り込み用Ｖ。

後述のようにして調製しプールした最初のＰＣＲ材料からＶ、ドメインを増幅さ せた。

ＰＣＲ増幅させたＶ□遺伝子の２つの調製物を作製した。画調製物ともＨＵＪＨ ＦＯＲプライマー（表１）の等モル混合物を使い、一方の調製物では、ＨＵＶＨ ＢＡＣＫプライマー（表１）の各々を個別に使って６つの別々のＰＣＲ増幅を実 施し、他方では、６つのＨＵＶＨＢＡＣＫプライマー全ての等モル混合物を使っ てＰＣＲ反応を実施した。７種のＰＣＲ全てについて、ＨＵＩＧＭＦＯＲプライ マーを使ったｃＤＮＡ合成からの上溝５μｆ１合計濃度２０ピコモルの逆（ＢＡ ＣＫ）プライマー、合計濃度２０ピコモルの正（ＦＯＷＡＲＤ）プライマー、２ ５０　ｕＭ　ｄＮＴＰｓ、　１０ｍＭＫＣｌ、　１０ｍＭ　（ＮＨ４）２ＳＯ４ ，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ８，８）、　２．ＯｍＭ　ＭｇＣＩｚ。

１００ｍｇ／−のＢＳＡおよび１μｆ　（１単位）のＶｅｎｔ　ＤＮＡポリメラ ーゼ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　ＢｉｏＪａｂｓ）を含有する反応混合物５０μ ｍ２を調製した。この反応混合物の上に鉱油（パラフィン油）を重層し、Ｔｅｃ ｈｎｅＰＨＣ−２熱循環器を使って３０サイクルの増幅にかけた。１サイクルは ９４°Ｃで１分（変性）、５７°Ｃで１分（アニーリング）そして７２°Ｃで１ 分（伸長）であった。生成物を１．５％アガロースゲル上で精製し、Ｇｅｎｅｅ ｌｅａｎ　（Ｂｉｏ−１０１）によりゲルから単離し、そして２５μ！の８．０ に再懸濁した。

変異原性Ｆ５８ＧＲＡＦＴＪＨ４ＳＡＬプライマーとＨＵＶＨＢＡＡＰＡ　１６ プライマーの各々を個別に使って６つの別々の刷り込み反応を実施した。

刷り込み反応はプライマーＨＵＶＨＢＡＡＰＡ　（全部で６つのプライマーの等 モル混合物）とＨＵＪＨＦＯＲＳＡＬ　（全部で４つのプライマーの等モル混合 物）を使って設定された。前の段階からのプールしたＰＣＲ生成物５μｌを含有 する反応液５０μ！を、２５サイクルの増幅を使いアニーリング温度が４５°Ｃ であること以外は最初のＰＣＲと同じ条件下で増幅させた。

得られたＶＭ断片プールし、標準条件下でＡｐａＬＩと５ａｉｌで切断し、そし て標準的プロトコールを使ってＡｐａＬ［とＸｈｏｌで切断されたｆｄ−ＤＯＧ −ＧＩＣＨＩ中にクローニングした（ＳａｌｌとＸｈｃｙｌは適合性ＣＴＡＧ突 出末端を生成する）。このライブラリーから上述の如くファージを調製し、今度 は重鎮ファージを使って、ｐＵＣ１９Ｓｆ　ｉ／Ｎｏｔ／ｐｏｌｙｍｙｃ中で発 現させた選択された軽鎖を担持してる細胞を感染せしめた。

（ｊ）　最後の重鎖−軽鎖組合せ体のスクリーニングこの方法の最終結果は、選 択された重鎮のプールと選択された軽鎖のプールである。それらをここで無作為 に組み合わせる。

Ｈ［ＪＣＨＩＦＯＲＡＳＣＮＯＴト−４ｆニ６　ツノｔ（ＵＶＨＢＡＣＫＳＦＩ プライマー全ｍの等モル混合物を使って実施例１に記載の手順を用いて重鎮クロ ーンをＰＣＲ増幅せしめる。それらの断片を５ｆｉＩとＡｓｃ　Ｉで切断し、標 準手順（実施例１）を使ってゲル精製し、次いで上記段階（ｆ）から作製したＡ ｓｃ　Ｉ　−Ｎｏｔ　Ｉで切断された軽鎖および以前に作製した５ｆｉＩ　−Ｎ ｏｔ　Ｉで切断されたｐＵｃ１９ｓｆ　ｉ／Ｎｏｔ／Ｉ）ｏｌｙｍｙｃベクター の等モル量と連結せしめる。あるいはそれらのＳｆｉ　Ｉ　−Ａｓｃ　Ｉ断片を 、図８（Ａ）の最後に示した構成物中のＦ５８重鎮と置換する。次いでそれらの 構成物を用いてＴＧＩを形質転換せしめ、上述の如＜　ＥＬＩＳＡによりペプチ ド結合活性について分析する。

最終産物は、親の醤歯類抗体と同じまたは類似した抗原特異性を有する完全にヒ トのＦａｂ断片である。

実施例３ 無作為組合せファージ表示ライブラリーとＣＤＲ移植（ＣＤＲ刷り込み選択）を 使った醤歯類抗体のヒト化この実施例に記載の実験では、図９に図解されるよう にしてマウス抗ＨＩＶ−１ｇｐ１２０モノクローナル抗体Ｆ５抗体上５８した。

Ｆ１ａのＶにドメイン、一本＠Ｆｖリンカ−およびＸｈｏ　Ｉ制限部位を有する ヒトｖＨフレームワーク４の最初の残基を含有してるベクター（ｐＨＥＮＭＢＦ ５８ＶＬ）を作製した。このベクターは、Ｎｃｏ　Ｉ　−Ｓａｌ　Ｉ断片として のｖ８レパートリ−のクローニングを可能にし、完全な５ｃＦｖを与える。各重 鎮が元のマウスのａｒａｂ　Ｆ１ａのＣＤＲ３とヒトフレームワーク４とを含む ような方法でヒトＶＨレパートリ−をＰＣＲにより増幅せしめ、そして最後にｐ ＨＥＮＭＢＦ５８ＶＬ中にクローニングした。

５ｃＦｖライブラリーをＨＩＶ−１ｇｐ１２０由来のペプチドへの結合について スクリーニングした。次いで選択された５ｃＦｖからの重鎮可変ドメインをＰＣ Ｒ構築によりヒト軽鎖可変ドメインのレパートリ−と組合せて完全にヒト化され た５ｃＦｖを与え、そして抗原結合について再び選択した。従って、ここに説明 される手順はＣＤＲ移植と組合せファージ表示ライブラリーの合成である。

１、Ｆ５８可変ドメインのＰＣＲ増幅、クローニングおよび配列決定これは実施 例２に記載した。標準的ＰＣＲ条件は実施例１のものと同じである。

２、Ｆ５８ｓｃＦｖの作製 上記で特徴付けたＶｌ、ｌおよび■、ドメインを、基本的にはＣ１ａｃｋｓｏｎ ら、１９９１．前掲に記載の通りに構築して５ｃＦｖ断片を形成させた。

２．１章において言及するプライマーの配列は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（前掲 ）に記載されているＶＨＩＢＡＣＫＳｆ　ｉを除いてＣ１ａｃｋｓｏｎら（１９ ９１，前掲）に与えられている。

Ｆ１ａのｖ８を含むＭ１３ＶＨＰＣＲ１（Ｏｒｌａｎｄｉ　ら、　１９８９．前 掲）約ＩＢおよびＦ１ａのｖにを含むＭ１３ＶｋＰＣＲ（Ｏｒｌａｎｄｉ　ら、 　１９８９．前掲）Ｉｎｇを、２つの別個の（循環条件の点では同一の）ＰＣＲ 増幅における鋳型として使用した。上述の鋳型のいずれかｌｏｇ、２０ピコモル のＶＨＩＢＡＣＫと２０ビニ＋モルノＶＨＩＦＯＲ−１（ＶＬを増幅するニハ２ ０ピコモルノＶＫ２ＢＡＣＫと２０ヒコモル＋７）ＶＫ４ＦＯＲ）　、２５０　 ｔｔＭ　ｄＮＴＰｓ、５．ｃｌｌ）ｔ。

ＸＶｅｎｔポリメラーゼ反応緩衝液（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ から得られる）および２単位のＶｅｎｔＤＮＡポリメラーゼを含有する２つの５ ０μ！反応液を調製した。２５サイクルのＰＣＲにより増幅を実施した（９４° Ｃて１分、５５℃で１分、７２℃で２分）。

同様にブライ７−　Ｌ　［ＮＫＢＡＣＫとＬＩＮＫＦＯＲ（Ｃ１ａｃｋｓｏｎら 、　１９９１．前掲）を使って約１ｎｇの鋳型ＤＮＡ　ｐｓＷ２ｓｃＤ１．３　 （ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、　Ｎａｔｕｒｅ３４８、５５２−５５４．１９９０ ）からリンカ−ＤＮＡを増幅させた。

ゲル精製後、Ｖ９とＶに生成物の各々１μｇを、プライマーを含まないＰＣＲ混 合物２５μｌ中の３００　ｎｇのリンカ−と混合し、そして７回循環させ（９４ °Ｃで２分、７２°Ｃで４分）両断片を連結せしめ、次いで■ＨＩＢＡｉｌ、に とＶＫ４ＦＯＬＲプライマー各々２５ピコモルを使って２０サイクル（９４°Ｃ で１．５分、７２°Ｃで２．５分）増幅させた。最後に、構築産物をゲル精製し 、プライマーＶＨＩＢＡＣＫ−Ｓｆ　ｉ　ＩとＶＫ４ＦＯＲ−Ｎｏ　ｔ　Ｉを使 って再増幅させて制限部位を付加した（ＶＫ４ＦＯＲとＶＫ４ＦＯＲ−Ｎｏｔ　 ｒは４つの異なるプライマーの等モル混合物である）。次いでＦ１ａ　５ｃＦｖ を５ｆｉｌとＮｏｔＩて消化し、そして同様に消化したベクターｐＵＣ１１９Ｓ ｆｉ−Ｎｏｔｐｏｌｙｍｙｃ中にクローニングした。その後、ＤＮＡ配列決定に より組換え体を確認した。

３、　ベクターｐＨＥＮＭＢＦ５８ＶＬの作製上記で単離されたクローンから精 製したｐＵＣ１１９Ｆ５８ｓｃＦｖ　ＤＮＡ　１０ｎｇを、プライ７−　ＨｕＶ ＨＬＢＡＣＫ−Ｘｈｏ　ＩとＶＫ４ＦＯＲ−Ｎｏ　ｔ　Ｉを使った標準的ＰＣＲ 増幅において鋳型として使った。ＰＣＲ産物を精製し、Ｘｈｏ　ＩとＮｏｔｌで 消化し、そして同様に消化したベクターｐＨＥＮｌ中にクローニングして新規ベ クターｐＨＥＮＭＢＦ５８ＶＬを作製した。

手順は、ＭａｒｋＳら、　１９９１．前掲およびＷＯ９２１０１０４７により記 載されたＩｇＭ定常定常領域ラプライマーって実施例２（ａｌ（ｉ）に記載した 通りであった。

４．２重鎮可変ドメインのＰＣＲ 重鎮可変ドメインを増幅せしめるための６つの別個の反応液は、他のものは標準 的ＰＣＲ混合物中の各々２μｌの上記ｃＤＮＡ合成物、２０ピコモルの各ＨＵＶ ＨＢＡＣＫＳｆ　ｉプライマーと２０ピコモルのＦ５８ＧＲＡＦＴＳＡＬプライ マーを含んだ。プライマーＦ５８ＧＲＡＦＴＳＡＬは６つのヒトｖＨファミリー のフレームワーク３領域にアニールしなければならないので、ＰＣＲ循環のアニ ーリング温度を４５°Ｃに下げた。

ＰＣＲを２５サイクル行い（９４°Ｃで１分、４５°Ｃで１分、７２°Ｃで１分 ）、その後生成物をゲル精製した。次のクローニング段階用に多量の材料を得る ために、同シリーズのＨｕＶＨＢＡＣＫＳｆ　ｉプライマーとＨｕＪＨ４ＦＯＲ −Ｓａｌｌプライマーを使って２回目のＰＣＲを行った。その条件はアニーリン グ段階が４５°Ｃの代わりに５２°Ｃであること以外は上記と同じであった。

上記からのＰＣＲ生成物を各々等量プールし、Ｎｃｏ　Ｉと５ａｌＩて消化した 。この材料ｌμｇを３μｇのＮｃｏＩ／５ａｌＩで消化したベクタｐＨＥＮＭＢ Ｆ５８ＶＬ中に連結せしめた。この連結反応物を処理し、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ら（前掲）とＷＯ９２１０１０４７に記載されたようなＴＧＩ細胞の形質転換に 使った。

６、抗原結合についての５ｃＦｖライブラリーの選択ヘルパーファージＶＣ３Ｍ １３を使ったＴＧＩ中のライブラリーの感染およびその後の連続選択へ向けての ファージのプロセシングは記載の通り行った（　Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、　１ ９９１およびＷＯ９２１０１０４７）　、各選択のために、８ウエルのＭａＸｉ ＳＯｒりプレート（Ｎｕｎｃ）に３μｇ／−のペプチド水溶液５０μ！を接種し た。該ウェルを一晩完全に乾燥させ、１％ＢＳＡ／ＰＢＳを使って室温で３０分 間ブロックし、最後にＰＢＳで２回洗浄した。各ウェルに５０μｌのファージと １５０μｌのＴｒｉｓ−ＨＣＩ。

ｐＨ８，３，０，５Ｍ　ＮａＣ１，４％ＢＳＡを添加した。２時間後、ウェルを Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、　ｐＨ８，３，０，１Ｍ　ＮａＣ１で３回、次いでＴｒｉｓ −ＨＣｌ、　ｐ）Ｉ　８．３．０．５ＭＮａＣｌで３回洗浄した。結合したファ ージの溶出とＴＧＩ細胞の感染は記載の通り行った（Ｗｏ　９２１０１０４７） 。簡単に言えば、ウェルあたり５０μｌの１００ｍＭ　トリエチレンアミンを使 って１０分間ファージを溶出させた。次いで溶出した材料を即座に１７２容のＩ Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ、　ｐＨ７，４で中和し、そして対数関数的に増殖してい るＴＧＩ細胞に感染せしめるのに使った。

ペプチド抗原はＩ（ＩＶ−１単離物１１１ｒＢのｇｐ１２０　Ｖ３ループに相当 し、これはＭＲＣのＡＩＤＳ管理プログラム（貯蔵所番号ＡＤＰ７３７）から得 られた。

配列ｉｔ　ＹＣＴＲＰＮＮＮＴＲＲ３［ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＩＧＮ ＭＲＱＡＨＣＹ　（配列番号１２１）である。

７、　選択された５ｃＦｖの分析 ３回の選択後、溶出したファージの了りコートを使ってＨＢ２１５１ｍ胞を感染 せしめ、可溶性５ｃＦｖの発現に備えた。Ｆａｂ断片よりむしろ５ｃＦｖ断片を 調製したこと以外は実施例２において上述した通りに、ペプチドＥＬ［ＳＡによ り個々の結合性クローンの同定を行った。

分析したクローンの約１５％がこの段階で陽性と記録され、同じプレート上で対 照として行った元のＦ５８ｓｃＦｖに関して得られたシグナルの５０％〜１５０ ％のＥＬＩＳＡシグナルを与えた（図１０参照）。陽性５ｃＦｖはいずれもプラ スチック、ニワトリ卵白リゾチームまたはヒトチログロブリンと反応しなかった 。

ヌクレオチド配列分析は、陽性クローンがＶ８ファミリーｌおよび６の生殖細胞 系列遺伝子に由来する体細胞変異されたヒトＶＨ遺伝子を含むことを明らかにし た（［Ｕ参照）。

ペプチドＥＬＩＳＡにおいて活性であることが示されたプールしたクローン約１ ０　ｎｇを鋳型として５０μ！の標準的ＰＣＲ増幅において使用し、選択された 重鎮可変ドメインを得た。プライマーとして各々２０ピコモルのＬＭＢ３とＨｕ ＪＨ４ＦＯＲＡＳＳＸｈｏ　［を使った。鋳型として５０　ｎｇのＤＮＡを使っ て標準的ＰＣＲ反応においてプライマーｆｄｓＥＱ１とＨｕＶＨＬＢＡＣＫを使 ってｒｇ　Ｇ　−５ｃＦｖライブラリー（ＷＯ９２１０１０４７の実施例４２） からヒト軽鎖可変ドメインを増幅させた。重鎮と軽鎖の両増幅産物をゲル精製し 、本質的には上述した通りに７サイクルに渡りＰＣＲ構築に使用した（各Ｉμｇ ）。循環条件は９４℃で１分、５５℃で１分そして７２゛Ｃで２分であった。構 築反応が完結した後、プライマーＬＭＢ３とｆｄｓＥＱｌを加え（各２０ピコグ ラム）、更に２０サイクルに渡りＰＣＲを続けた。構築産物をゲル精製し、Ｎｅ ｏ　ＩとＮｏｔＩで消化した。最後に、切断した５ｃＦｖ　１Ｍｇを３μｇのＮ ｃｏ　Ｉ　／Ｎｏｔ　Ｉ消化された吐ＥＮＩ中に連結せしめた。得られたライブ ラリー５ｃＦｖを上記の通り（段階６）選択した。最後に、上述した通り（段階 ７）個々のクローンをｖ３ループペプチドへの結合についてスクリーニングした 。

最終産物は、親のマウス抗体Ｆ５８と同じまたは非常に類似した特異性を有する 完全にヒトの５ｃＦｖ断片であり、即ちそれらはｇｐ１２０　Ｖ３ループに結合 するが非相同タンパク質には結合しない。

実施例４ 免疫処置マウスの免疫レパートリ−から誘導されたヒト抗体の、エピトープ刷り 込み選択による単離 この実施例は、免疫処置マウスから誘導されたマウス抗体の元のライブラリーか らの、連続する鎖入替えによるＴＮＦ−α特異的ヒト抗体の作製を説明し、本発 明の更なる態様を例示する。この方法は、一方の鎖かマウスでありそして他方が ヒトである場合、中間体Ｖ、／Ｖ、組合せは、元のマウスｖ、／ｖＬ対が向けら れる抗原性エピトープに結合するという事実に基づく。

この実施例では、マウスライブラリーを抗原への結合について予備選択すること により、マウスライブラリー中の抗原（ここではＴＮＦ−α）に対する抗体の頻 度を増加させることが好ましい。次いてマウス抗体のこの集団を鎖入替えにより ヒト化することができる。選択されたマウス集団からのＶ。！ＪＩを一定に維持 し、そして生来のヒトライブラリーからの一組のヒトｖＬ鎖を使って構築する。

次いてこのマウスＶ、／ヒトＶ、ライブラリーを着目の抗原への結合についての 連続選択にかける。それらのヒトＶＬを生来のヒトライブラリーから同様に誘導 したヒトＶＮと対合させることにより、この選択された半分ヒト化された抗体の 集団を完全にヒト化する。

生じたライブラリーを抗原に特異的な結合体について選択することができる。逆 に、最初の時点でマウスＶ、＠を固定し、そしてヒトＶ、＠を使って構築し、そ して抗原への結合について選択した後、単離したヒトＶ、＠を生来のヒトライブ ラリーからのｖＬと対合させることにより、完全にヒト化することもできる。

ＴＮＦ−αで高度免疫処置したマウスの牌臓から調製したリンパ球からＲＮＡを 抽出する。重鎮と軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲにより増幅さ せ、そしてＷＯ９２１０１０４７に記載した通りに一本鎖Ｆｖ断片として構築し た。制限エンドヌクレアーゼＡｐａＬＩとＮｏｔＩのための部位を５′末端と３ ′末端に組み込む。ＡｐａＬＩとＮｏｔＩでの消化後、構築したＤＮＡをＡｐａ ＬＩ／Ｎｏｅｆ消化した９ＣＡＮＴＡＢ３−ｍｙｃ（図１２）中に連結せしめ、 Ｅ、コリＴＧＩ細胞中にエレクトロポレーションし、そしてアンピシリン選択培 地上に塗抹する（下記プロトコールロを参照のこと）。

Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーフアージでの重感染によりファジミドを救援し、モして１ １５容の２０％ポリエチレングリコール／２．５Ｍ　ＮａＣ１を使って沈澱させ る。ＴＮＦ−αでコーティングした免疫吸着試験管上でファージ抗体（１ｍ７． ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）を選別し、そして１ｍｔ’の１００ｍＭ　トリエチル アミンを用いて５分間溶出せしめ、次いで０．５−のＴＲｌ５　（ｌ　Ｍ、　ｐ Ｈ７，４＞で中和することにより、選択されたＴＮＦ−α結合性ファージ抗体の 集団を調製する。

溶出させた）７−ジを使って対数増殖期にある１０Ｔｒｄ！のＴＧＩ細胞を３７ °Ｃにて３０分間感染させ、アンピシリン耐性コロニーについて平板培養する。

生じたコロニーを２ＹＴ培地中に掻き取り、Ｍ１３ＫＯ７を使って救援する。上 記と同様にＴＮＦ−αによりコーティングした免疫吸着試験管上で再びファージ 抗体を選択する。溶出したファージを使ってＥ　コリＴＧＩ細胞を感染させ、平 板培養し、アンピシリン耐性コロニーを２ＹＴ培地中に掻き取り、１５％までグ リセロールを添加し、そして−７０″Ｃて保存する。この段階で、選択された集 団中のＴＮＦ結合性クローンの頻度を実施例１に記載のようなＥＬＩＳＡにより 調べる。

免疫処置さねていないヒトのＶ遺伝子に由来する５ｃＦｖ断片をコートするライ ブラリーをベクターｐＨＥＮｌ中で作製した（Ｗｏ　９２１０１０４７゜実施例 ４２）。

ＤＮＡ調製 ２回目の選択のコロニー（マウスＤＮＡ）と生来のヒトライブラリー（ヒトＤＮ Ａ）から、アルカリ溶解によりＭｉｎｉｐｒｅｐ　ＤＮＡをｍ製した。

グリセロール原株からの約５Ｘ１０７個の細胞を、　１００ｕ、ｇ／−アンピシ リン、２％グルコースを含有する２ＹＴ培地１０ｄ中で３０″Ｃにて一晩増殖さ せる。遠心分離（３５００ｒｐｍ、　１５分間）により細胞をペレット化し、市 販のキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使ったアルカリ溶解により該細胞ペレットから ＤＮＡを調製する。

４、鎖入替えした５ｃＦｖ断片をコードするＤＮＡの調製法のプライマーを使用 する ＬＭＢ３　５’　ＣＡＧ　ＧＡＡ　ＡＣＡ　ＧＣＴ　ＡＴＧ　ＡＣ３’　配列番 号１２２ＦＤＴＳＥＱＩ　５’　ＧＴＣＧＴＣＴＴＴ　ＣＣＡ　ＧＡＣＧＴＴ　 ＡＧＴ　３’　配列番号１２３ＰＣＲＨＬＩＮＫ　５’　ＡＣＣＧＣＣＡＧＡ　 ＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＣ３°　配列番号１２４Ｌ＋ＮＫＰＣＲＬ　５’　ＧＧ ＣＧＧＡ　ＧＧＴ　ＧＧＣＴＣＴ　ＧＧＣＧＧＴ　３’　配列番号１２５ＬＭＢ ３とＦＤＴＳＥＱＩはそれぞれ、ｐｃＡ１１１ＴＡＢシリーズのベクターの抗体 クローニング部位の５′および３′隣接配列にアニールする。

ＰＣＲＨＬＩＮＫとＬＩＮＫＰＣＲＬは（ｇ　１ｙ４ｓｅｒ３）ペプチドリンカ −をコードする配列とアニールする。ブライ１−をＬＭＢ３／　ＰＣＲ）ＩＬ　 ＩＮＫおよびＦＤＴＳＥＱＩ／ＬＩＮＫＰＣＲＬのベアでＰＣＲ増幅に使うと、 相補的３’１５’末端を有し且つ５１　／　３１末端に制限認識部位を有する重 鎮および軽鎖断片が作製されるだろう。

この手順では、Ｍａｒｋｓら、　１９９１　（前掲）により記載されたヒトライ ブラリーが、重鎮および軽鎖可変ドメインをコードするＤＮＡの源として使われ る。各々の入替えには下記の鎖入替えプロトコールを使用する。それは例えばヒ ト生来の軽鎖可変ドメインをマウス重鎮可変ドメインと一度組み合わせ、次いで ヒト生来の重鎮可変ドメインを有する選択されたヒト軽鎖可変ドメインと再び組 み合わせることに従う。この手順により製造された入替えられた５ｃＦｖ断片を コートするＤＮＡを、マウスＶＭ遺伝子とヒトｖＨ遺伝子のいずれかの入替えに 使われたかに応じて、それぞれｐＣＡＮＴＡＢ３−ｍｙｃまたは１）ＣＡＮＴＡ Ｂ５−ｍｙｃ　（図１３）中に挿入する。

（ａ）　−次ＰＣＲ 次の反応液中で最初の重鎮および軽鎖産物を調製する：重鎖　軽鎖 Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ＤＮＡ　２　ｎｇ　Ｍｉｎｉｐｒｅｐ　ＤＮＡ　２　ｎｇ（ 例えばマウス）　（例えばヒト） ＬＭＢ３プライマー　ＦＤＴＳＥＱＩプライマー（１０ピコモル／μｌ’ｌ　２ ．５μ！　（１０ピコモル／μＩｔ）２．５μ１ＰＣＲＨＬ　ＩＮＫプライマー 　ＬＩＮＫＰＣＲＬプライマー（１０ピコモル／μｍ）２．５μＩ！（１０ピコ モル／μｆ）２．５μ１１０ＸＰＣＲ反応緩衝液＋５．Ｏｕｌ　ｌｏＸＰＣＲ反 応ａｉｒ液’５．Ｏｕｆ！５ｍＭ各ｄＮＴＰ　２．５ｕｌ　５ｍＭ各ｄＮＴＰ　 ２．　ｓｕ　１Ｔａｑポリメラーゼ　Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／ｕｌ）　０． ３ａｌ　（５Ｕ／μＩり０．３ｔｔｌ水　３７μｌ　水　３７μｌ 「反応緩衝液ＪはｌｏＸＰＣＲ反応緩衝液、０、ＩＭ　ＴＲｌ５　ｐ）］　８． ３．０１５ＭＫＣｌ、　１５ｍＭ　Ｍｇｃ１２．０．１％セラチンである。

ＰＣＲ条件ハ９４°Ｃて１分、６０°Ｃて１分、７２°Ｃｔ’２分ノ２５サイク ルテあり、最後の１０分は７２°Ｃである。

（ｂｌ　生成物の精製 一次ＰＣＲ生成物をアガロースゲル上で精製し、５μｌの「グラスミルクＪ　Ｃ Ｇｅｎｅｃｌｅａｎ、　Ｂｊｏ　２０１）を使って各’ｒ　ｌＯａ　ｌの水の中 で２回溶出させることにより精製する。

（ＣＩＰＣＲによる構築 構築は次のようにして実施する 精製した重鎮　２．５μ！ 精製した軽＠　２．５μ！ １０×反応緩衝液　２μｌ ５ｍＭ　８ｄＮＴＰ　１．Ｏａ　１ Ｔａｑポリメラーゼ　０．２μｌ 水　３７　μ１ ＰＣＲ条件ハ９４°ｃで１分および６５°Ｃで４分の２５サイクルの後、７２° Ｃで最後の１０分である。−次ＰＣＲについて与えられたＰＣＲ条件も機能する だろうが、結合反応には６５°Ｃが好ましい。

（ｄｌ　二次ＰＣＲ 二次ＰＣＲは（Ｃ１からの結合材料１μ！を鋳型として使用する。反応液は次の ように設定する： 結合したＰＣＲ生成物　１μｌ ＬＭＢ３プライマー （１０ピコモル／μＩ！’）　２．５μ１ＦＤＴＳＥＱＩプライマー （１０ピコモル／μｌ）　２．５μノ １０ＸＰＣＲ反応緩衝液　５．０μｌ ５ｍＭ各ｄＮＴＰ　２．５　ｕ　Ｉ！ Ｔａｑポリメラーゼ （５Ｕ／μｌ）　０．３μｌ 水　３７　μ！ ＰＣＲ条件は９４℃で１分、６０゛Ｃで１分および７２℃で２分の２５サイクル の後、７２℃で最後の１０分である。

（ｅ）　二次ＰＣＲ生成物（挿入断片）の消化二次ＰＣＲ生成物をフェノール： クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱せしめてＴａｑポリメラーゼを除 去する。ＰＣＲ生成物を２７０μｍの水に溶かし、３０μｌの１０×反応緩衝液 を加える。５０単位のＮｏｔＩを添加し、３７°Ｃで３時間消化する。フェノー ル：クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱せしめる。ペレットを２７０ μｍの水に再懸濁し、３０μｍのＩＯＸ反応緩衝液を加える。使用したｖＨかヒ トであるなら５ｆｉＩ　（５０単位）を使用して５０″Ｃで一晩消化し、一方■ ８がマウスであるならＡｐａＬｌ　（５０単位）を使用して３７°Ｃて一晩消化 する。

１０　Ｘ　ＡｐａＬｌ緩衝液　０．５Ｍ酢酸カリウム、０．２Ｍ　ＴＲｌ５酢酸 塩、１００ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ｍＭジチオトレイトール（２５℃にてｐ Ｈ７，９）。

１０ＸＮｏｔｒ緩衝液：　１．５Ｍ　ＮａＣ１，１００ｍＭ　ＴＲ［５−ｔ（Ｃ １，１００ｍＭ　ｈｃｌｔ。

０．１％：　Ｔｒｉｅｏｎ　Ｘ−１００（２５℃にてｐＨ７，９）。

！ｏｘｓｆｉ　Ｉ　１１ｍ液：　０．５Ｍ　ＮａＣｌ。１００ｍＭ　ＴＲｌ５− ＨＣＩ、　１００ｍＭ　ＭｇＣ１□。

１０１１１Ｍジチオトレイトール（２５°ＣＬ、テｐＨ７，９）。

げＭｌ！ｌ化生成化生成製 消化物をフェノール、クロロホルムで処理し、エタノール沈澱せしめ、２０μｌ の水に溶かす。該生成物を１．５％アガロースゲル上で展開し、約７５０　ｂｌ ｌのバンドをゲルから切り出し、Ｇｅｎｅｃｌｅａｎキットを使って精製する。

最終容量１０〜１５μｌの水の中にＤＮＡを溶出させ、クローニングの準備をす る。

５、　ベクターＤＮＡの調製とクローニングベクターＤＮＡの調製 アルカリ溶解法によりプラスミドＤＮＡを調製し、塩化セシウム遠心分離によっ て精製する。精製ＤＮＡを、製造業者の指示に従っテ（Ｓｆ１工ニツイテハ５０ ′ｃ、便利＋：は一晩）１００μｇ／ｍ＃）ＤＮＡ１１度を使ってＳｆｉ　Ｉ　 （ｐＣＡＮＴＡＢ５−＋ｎｙｃの場合）または°ＡｐａＬＩ（ｐＣＡＮＴＡＢ３ −ｍｙｃの場合）で消化し、次いでＮｏｔＩで３時間消化する。消化生成物を直 接Ｃｈｒｏｍａｓｐｉｎ　１０００カラム上に負荷して原料断片を除去し、そし て卓上遠心機中で２２００　ｒ、　ｌ）、　０１．で３分間遠心分離する。次い でフェノール：クロロホルム抽出し、使用に向けて１００μｇ／＋ｎｉに溶がす 。

連結と形質転換 連結は次のようなＡｍｅｒｓｈａｍ連結キットを使って行う。

ベクターＤＮＡＩ　ｕ　ｌ　（１００ｎｇ）挿入断片ＤＮＡ　２　ｕ　ｌ　（１ ０〜５０　ｎｇ　）１０ｍＭ　ＭｇＣ１ｔ、　２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｐＨ７， ４３ｕ　ｌ緩衝液Ａ　２４μｌ 緩衝液８　６μｌ １６°Ｃにて３０〜６０分間インキュベートする。ライブラリーの調製には、上 記に示した量の５倍を使用する。連結生成物を濃縮し、Ｇｅｎｅ−ｃｌｅａｎを 使って精製し９．そして１０〜５０μｌの容量の水の中に溶出させる。これをエ レクトロコンピテントＴＧＩ細胞中に導入する。この場合の典型的形質転換効率 は次のようである。

ｐＵｃ１１９　１．６Ｘ　１０’形質転換体／μｇ挿入断片を持つ連結ベクター 　１．０Ｘ１０”形質転換体／μｇ挿入断片なしの連結ベクター　２．０Ｘ１０ ’形質転換体／μｇ６、鎖入替えされたクローンの選択 各々の鎖入替え操作の後、ＴＮＦ−αに結合するクローンを、マウス抗体ライブ ラリーからの選択について上記２に記載した手順により選択し、モしてＥＬＩＳ Ａにより結合アッセイする。

７、　追加の入替え 例えばヒト生来の軽鎖可変ドメインを使ったマウス重鎮可変ドメインの選択集団 の最初の入替えの後、この最初の入替えからの選択されたクローンをｍ１ｎｉｐ ｒｅｌ）　ＤＮＡの源として使用し、例えばＷ０９２１０１０４７の実施例４７ において誘導されたライブラリーのヒト生来の重鎮可変ドメインを用いて、上記 ４と５に記載した鎖入替え操作とクローニング操作を繰り返す。次いでこの２回 目の入替えライブラリーにおいて選択を実施し、このレパートリ−刷り込み選択 法により誘導されるＴＮＦ−α結合性の完全にヒト化された抗体を単離する。

糸状ファージの表面上への抗体レパートリ−の表示と抗原によるファージの選択 により１、免疫選択を模倣することができ２２そして免疫処置されていない提供 者の再配列されたＶ遺伝子からヒト抗体を製造することができる４゜本発明者ら はここで限定されたＶ遺伝子要素からの合成によりヒト抗体を製造した。４９個 のヒト生殖細胞系列Ｖ４遺伝子セグメントのレパートリ−を、５つの無作為アミ ノ酸残基の合成「Ｄセグメント」とＪセグメントに連結することによって試験管 内で再配列させ、８残基を有する合成第三相補性決定領域５　（ＣＤＲ）を作製 した。再配列されたＶイ遺伝子をヒトｖλ３軽鎖と共に一本鎖Ｆｖ断片としてフ ァージ表示用にクローニングした。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に接合した２ −フェニル−オキサゾール−５−オン（ｐｈＯｘ）ハブテンを使って１０７フア ージのライブラリーを選別し、そしてマイクロモルレベルにおいてｐｈＯｘ−Ｂ ＳＡに対する特異的結合活性を有し且つｐＨ０ｘ−γ−アミノ酪酸（ｐｈＯｘ− ＧＡＢＡ）に対する親和性を有する断片をコードするファージを単離した。ユニ ーク配列を有する２１個のクローンの比較は、該ハブテンに対する試験管内「免 疫応答」が、ＣＤＲ３の残基９８に不変の芳香族残基（Ｔｙｒ、　Ｐｈｅ、　Ｔ ｒｐ）を有するＶ、２６セグメント（Ｖ１４３７７ミリー）１に大きく制限され たことを示した。試験管内で再配列されたＶ遺伝子の使用は、既知構造の抗原の 結合のほうに偏らせた抗体ライブラリーの設計を可能にし、免疫原性が低下され た治療用ヒト抗体の作製を可能にするだろう。

抗体可変ドメインは、超可交配列またはＣＤＲ’の３つのループを有するβ−シ ートフレームワークから成る。このループは、平らな表面７からポケット８まで に及ぶ様々な形状の抗原結合部位を造る。ヒト重鎮については、最初の２つのＣ ＤＲの配列多様性は約５０の生殖細胞系列Ｖ。セグメントのレパートリ−によっ てコードされる（ｔ、Ｍ、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、前掲）。３番目のＣＤＲは約 ３０のＤセグメントと６つのＪセグメントとの組換えから生じ１、そしてその配 列は非常に可変的であるが、しばしばループのＡｓｐｌｏｌから’７［／−ムヮ ークのＡｒｇ９４への塩橋を含んでいる１０゜最初の２つのＣＤＲの構造と長さ は制限されているか”　”　、ＣＤＲ３のそれは大きく異なり、長さは４〜２５ 残基に及んている５゜ ＡｓｐｌＯｌを含む８残基のＣＤＲ３を有する再配列されたＶＨ鎖を単一のＶλ （参考文献１２）軽鎖と組み合わせてライブラリーを作製した。ヒトＶＨレパー トリ−の大部分をコードする４９の生殖細胞系列ｖＨ上セグメント　Ｔｏｍｌｉ ｎｓｏｎら、前掲）を、−緒になって８残基のＣＤＲ３ループをコードする合成 りセグメント（ＶＷ上セグメント３′末端の１５塩基のランダム配列）とＪセグ メントを導入するオリゴヌクレオチドブライマーを用い、ポリメラーゼ連鎖反応 ＋２を使って増幅せしめた（図１４）。再配列されたセグメントをプールし、フ ァージ表示のためヒトＶλ３軽鎖と共にクローニングし、１０”のファージクロ ーンの合成ライブラリーを作製した。免疫系と同様に、１０７フアージクローン の合成ライブラリーは可能な多様性のうちの小部分のみを採り出すことかできる 。よって多様性は潜在的に４９×３２’　＝１．６　ＸＩＯ’種頚ノヌクレオチ ド配列、また１ｔ４９Ｘ２０’　＝１．６Ｘ　１０”種類のアミノ酸配列である 。

該ライブラリーをｐｈＯＸ−ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）がコーティングされ た試験管上での４回の増殖と選別にかけ、可溶注目一本鎖Ｆｖ断片＋５１１　と してｐｈＯｘ−ＢＳＡへの結合活性についてＥＬＩＳＡ’によりクローンをスク リーニングした。３回目および４回目の後、それぞれ１４／９６および６１／９ ６のクローンかｐｈＯｘ−ＢＳＡへの結合活性を有すると同定され、そしてそれ らの（試験した２９個の）うち１つも他のタンパク質には結合しなかった（表４ 参照）。更に、ｐｈｏｘ−ＢＳＡがコーティングされたプレートへのそれらの結 合は、可溶性ハブテンと競合できなかった（表４）。

配列決定により、ｐｈＯＸ結合体の多数（２１／２９）がユニークであり、８残 基ＣＤＲ３を有し、そしてＶ。４フアミリーからのセグメントかまたはＶ。３フ アミリーからの３セグメントのうちの１つを使用することが明らかになった（表 ４）。それらのセグメントは一緒になって、ヒトＶ、−１？グメントの最初の２ つの超可変ループに利用可能である７つの「規準的」折りたたみのうちの３つを 使用する（Ｃ，Ｃｈｏｔｈｉａら、前掲）。ユニーククローンの大部分（１６／ ２１）　ハＶ、２６セグメント６に由来し、そして３番目の超可変ループ中に関 連配列を斉する。このグループでは、第一残基は分岐した脂肪族側鎖を有する傾 向があり（１５／１６）　、第二残基はリジンまたはアルギニンである傾向があ り（１１／１６）　、第四残基は常に芳香族残基（最も頻繁にはチロシン）であ る。

ｐｈＯｘ−ＧＡＢＡに対する２つの強力な結合体（Ｏｘ−１３と０ｘ−３１，表 ４）の親和性（Ｋ、）は、蛍光消光滴定１７によりそれぞれ３．１±０．２μＭ と６．７±０．７μＭと測定された。合成抗体ライブラリーは多様なＶ。

−ＣＤＲ長さと生体内で産生される抗体の種々の軽鎖を欠いているけれとも、ｐ ｈＯｘ−ＧＡＢＡに対する親和性は、免疫処置されていないヒト提供者から作ら れた（ファージ）抗体の０．５μＭ４、またはマウス−次免疫応答からの数個の ハイブリドーマの１４Ｍ”に匹敵する（表３の凡例の注を参照のこと）。

理論上、試験管内で再配列されたＶ遺伝子のファージ表示ライブラリーの使用は 、生体内で再配列されたものの興味ある代替物を提供する６゜第一に、該ライブ ラリーから作製した合成ヒト抗体の重鎮と軽鎖の両方のフレームワーク領域と最 初の２つの超可変ループは本質的に生殖細胞系列である。これは、体細胞変異の 程度が広範囲に異なる、生体内で再配列されたヒトｖ遺伝子から採った「−次」 ファージ抗体４と対照的である。多形性は別にして、ＶＨ遺伝子セグメントは異 なる個体で同一であり、合成抗体は潜在的に免疫原性が低い。重鎮と軽鎖のＣＤ Ｒ３ループの長さと配列を変更することにより、または他のＣＤＲループ中に最 少の変異を置くことにより、または合成「生殖細胞系列」軽鎖を使って入れ替え ることにより１９２０それらの生殖細胞系列の特性を保持したままでそれらの親 和性を高めることが可能であるかもしれない。

第二に、両方の種類のライブラリーは高度に偏っている。「天然の」ライブラリ ーでは、偏りは制御外であり、例えば対立遺伝子変異、欠失多形性および自己反 応性クローンの欠失によって付与される。合成ライブラリーでは、偏りを組織的 に導入することができる。

ここでは例えば、全てのＶ□遺伝子セグメントを選択し、それによって第一と第 二の超可変ループの折りたたみが固定され、Ｖ、−ＣＤＲ３および軽鎖の長さと 多様性も固定された。多様性合成ライブラリーを作る幾つかの方法が提案されて いるけれども２、コードされる構造に設計理論を組み入れることも可能であるだ ろう。もし抗原の形状が既知であったら、限定された■遺伝子要素を使っておお よそ相補的な結合部位のエンベロープを設計・構築できるかもしれない。そのよ うな「設計者」ライブラリーの使用は、より高い親和性を有する抗体の単離に有 利であろう。

表３ ファミリー　遺伝子　ｖＨセグメント°　ライブラリーの数　サイズＸｌ０−＠ （％） Ｖ、１　１４　１−５．７，８，１０．１２１４．１５．２０，２］、、２５　 ２．３　（２０）Ｖ、２　１　２７　１．０（９） Ｖ、３　２３　２９−３３．３５．３８−４０４２．４４−５４．５８，５９　 ２．１　（１９）Ｖ、４　９　６３−７１　２．６　（２３）Ｖ）１５　１　７ ３　１．４（１２） Ｖ、６　１　７４　１．９（１７） 合計　４９　１１．３　（１００） °簡素化のためＶ、セグメントはＴｏｍｌ　１ｎｓｏｎら、前掲のＤＰ命名法に 従って記載した。

表３−合成ライブラリーの組成 ４９のヒトＶ８セグメント（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、前掲）を使い、Ｖ、２゜Ｖ 、５およびＶ、６遺伝子フアミリーの各々については１つ、そしてその他の３つ のファミリーについては複数のセグメントを使い、ファミリーに従ってクローニ ングした。各ファミリーのＶ。セグメントからのクローン（図１の説明文を参照 のこと）を挿入断片の存在（平均８５％）について検査し、そして表４のような 単一の大きなライブラリーの中にプールし、成る遺伝子ファミリーへの（制御さ れた）偏りを生ぜしめた。それによってＶ、２．Ｖ、５およびＶ、６フアミリー からのセグメントは他のファミリーからのセグメントに関Ｉノで「過度に代表さ れる（ｏｖｅｒｐｒｅｓｅｎｔｅｄ）　」。未選択のライフ゛う１ノーからの３ ５個のクローンの配列決定は、各ファミリーからのＶ。セグメントが存在するこ と、およびＤセグメント中には予想の比率でヌクレオチドか存在するがＣへのわ ずかな偏りを有すること（各コドンの最初の位置と２番目の位置てはＡ　２１． ３％；Ｇ　１７．９％：Ｃ３３，７％および７　２７．１％、３番目の位置では Ｇ　４２．６％およびＴ５７．４％である）を確証した。抗体断片の発現レベル も調へると、■。

セグメントは検出可能な発現レベルでクローン中に同定された。例、ｔハＶ　、 　１　（ＤＰ−７）、　Ｖ　、　２　（ＤＰ−２７）、　Ｖ、　３　（ＤＰ−２ ９，３５，３８，４４，４７，５１，５３）。

Ｖ、４　（ＤＰ−６３，６９）、　Ｖ、５　（ＤＰ−７３）　オヨびＶ　Ｈ６（ ＤＰ−７７）。

方法 オリゴヌクレオチドＬＭＢ３とｐＨＥＮ−ＳＥＱＩ　（参考文献４）を使ったｒ ＰｃＲスクリーニング２ＩＪにより、クローンを挿入断片の存在について調べ、 そしてオリゴヌクレオチドＬＩＮＫＳＥＱ　（５−ＣＧＡ　ＴＣＣＧＣＣＡＣＣ ＧＣＣＡＧＡ　Ｇ−３°）を使ったジデオキシチェーンターミネーション法２２ により二本鎖ＤＮＡから配列決定した。（表中の数字は挿入断片について補正さ れている）。可溶性５ｃＦｖ断片の発現は、Ｅ、コリＨＢ２１５１　（参考文献 １４）中の誘導−晩培養物の上清１０μｌをスロツトプロット装置（Ｍｉｎｉｆ ｏｌｄＩ［、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　５ｃｈｕｅｌｌ）を使ってニトロ セルロースフィルター上にスポットし、そして９Ｅ１０抗体２３とペルオキシダ ーゼ標識抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ）を使って、結合したペプチド標識５ｃＦｖ 断片を検出することにより調べた。

表４ クローン　ファミリー　生殖細胞　規準的　ｒＣ５゜系列遺伝子°　ループ構造 。

０Ｘ−３１ＶＨ２ＤＰ−４２１−１２６＊　Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、前掲、　Ｃ ｈｏｔｈｉａら、前掲。

Φ　ｐｈＯｘ　−ＧＡＢＡを使った競合ＥＬＩＳＡに従う（μＭ表示）。

！５　ＦＲ３におけるＶ　６７Ａ変異を示す。

１　測定せず。

表４−合成ライブラリーから単離されたｐｈｏｘ結合体ＶＣＳ−Ｍ１３を用いた 救援によりライブラリーからファージを単離し、そして参考文献４に記載のよう なｐｈｏｘ−ＢＳＡコーティング試験管中ての連続選別にかけた。ｐｈＯｘに結 合する２１個のファージの配列は、４つの生殖細胞系列ｖ１．Ｉセグメント、即 ちＤＰ〜４２．４５．４７　（Ｖ、３フアミリー）およびＤＰ−６７（Ｖ　、　 ４フアミリー）を示した。ＤＰ−４７はＶｌ、２６と同一であり（参考文献６、 参考文献２４て修正）、一方ＤＰ−４２，ＤＰ−４５およびＤＰ−４７は１個ま たは２〜３＠のフレームワーク残基だけがそれぞれ８−ＩＢ　（参考文献２５） 　、　６５−２　（参考文献２６）またはＶ　、４．２２（参考文献２７）と異 なっている。ＤＰ−４７のＶ。セグメントを使用しモしてＣＤＲ３の特徴的パタ ーンを欠いている未選択のライブラリーからのクローンはｐｈＯｘに結合しなか った。試験した２１のｐｈＯｘ結合体の１つも、ＢＳＡ　、　ＮＩＰ−ＢＳＡ　 、プラスチック、キモトリプシノーゲンＡ、チトクロムＣ、ウシチログロブリン 、アオガイヘモシアニンまたは七面鳥卵白リゾチームに結合しなかった。ＢＳＡ に結合した（　ｐｈＯＸには結合しなかった）４つのクローンは夾雑物であるこ とがわかった（αＢ５Ａ３クローン、参考文献４から）。

方法 参考文献４の通りである。５ｃＦｖ断片の相対親和性は阻害ＥＬ（ＳＡ”により 測定した。６〜４００μＭの範囲の濃度を有する４−γ−アミノ酪酸メチレンー ２−フェニル−オキサゾール−５−オン（ｐｈｏｘ　−ＧＡＢＡ）の系列希釈液 を４％Ｍａｔｖｅｌ−ＰＢＳ中に調製し、そして５ｃＦｖ上溝を添加した。ｐｈ Ｏｘ−ＢＳＡへの結合のシグナルの５０％減少を引き起こすｐｈＯｘ−ＧＡＢＡ の濃度（１−ｏ）を記録した。ｐｈＯｘ−ＧＡＢＡに対するクローン０Ｘ−１３ と０ｘ−３１の親和性は、ｃ−ｍｙｃ　ｔａｇによって精製された５ｃＦｖ断片 を使った蛍光消光滴定（参考文献４）により測定した。理想的には、ｐｈＯｘ− ＢＳＡ接合体に対するまたはｐｈＯＸ−カプロン酸に対する親和性が直接測定さ れているが、ここでは参考文献１８のハイブリドーマデータとの比較を可能にす るためにｐｈ（ｌｘ−ＧＡＢＡを使用した。ｐｈｏｘ接合体またはｐｈＯｘ−カ プロン酸に対する抗体の親和性は、おそらくｐｈｏｘ−ＧＡＢＡについて測定さ れるものよりも良いだろう。

図１４−再配列されたＶＨ遺伝子の構築（本文参照）合成オリゴヌクレオチド５ ＹＮＬＩＢＩ　５’　ＧＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＴ　ＣＧＡ　ＧＡＣＧＧＴ　ＧＡ ＣＣＡＧ　ＧＧＴ　ＡＣＣＴＴＧ　ＧＣＣＣＣＡ　ＡＴＡ　ＧＴＣＡＡＡ　（［ Ａ／Ｃ］ＮＮ）ｓ　ＴｃＴＴＧＣＡＣＡ　ＧＴＡ　ＡＴＡ　ＣＡＣＧＧＣＣＧＴ 　ＧＴＣ３’　（配列番号１０９　、表１参照）は、４９のヒトＶＨ生殖細胞系 列セグメント（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、前掲）の各々の３′末端に、５残基ラン ダムアミノ酸配列を存するＤセグメント、ＪセグメントおよびＸｈｏＩ制限部位 を導入した。該プライマーを、Ｎｃｏ　１部位を組み込むＶ８ファミリーベース の逆プライマー　（Ｖ）（ＢＡＣＫ）　’　と共にポリメラーゼ連鎖反応＋２に おいて使用した。

各Ｖ８セグメントクローン（Ｍ１３ベクター中の一本鎖鋳型として提供）を個別 ニ９４°Ｃで１分、５ｏ″Ｃて１分そしテア２°ｃで１．５分を２５サイクルに 渡りＰＨＣ−３熱循環器（Ｔｅｃｈｎｅ）上で増幅せしめた。各増幅をアガロー スゲル電気泳動により確認し、そして同ファミリーのＶ。セグメントからの同等 量のＤＮＡをプールし、Ｎｃｏ　ＩとＸｈｏ　Ｉで消化し、そしてＢＳＡに結合 する５ｃＦｖ断片４から取った再配列されたＶλ３軽鎖可変ドメイン（［ＧＬＶ ３Ｓ１　：参考文献１２）を担持しているベクター　ｐＨＥＮｌ　（参考文献１ ４）中にクローニングした。

ランダムオリゴヌクレオチドの代わりに、例えば門歯類のＣＤＲをコードするオ リゴヌクレオチドを使用すると、これは合成ヒトライブラリー生成物上に前記非 ヒトＣＤＲを刷り込むだろう。

実施例５て言及した参考文献 １、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ、　Ｊ、、　Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、　Ａ、Ｄ、、　Ｗ ｉｎｔｅｒ、　Ｇ、　＆　Ｃｈｉｓｗｅｌｌ。

２、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ１（１９９０）　Ｐｒｏｃ　ＲＳａｃ　Ｌａｎｄ　 Ｂｉｏｌ、　２３９．１−１６゜３、Ｗｉｎｔｅｒ、　Ｇ、　＆　Ｍｉｌｓｔｅ ｉｎ、　Ｃ，（１９９１）　Ｎａｔｕｒｅ、　３４９．２９３−２９９゜４、　 Ｍａｒｋｓ、　Ｊ、Ｄ、ら（１９９１）　Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ、　２２２．５ ８１−５９７゜５、Ｋａｂａｔ、　Ｅ、Ａ、、　Ｗｕ、　Ｔ、Ｔ、、　Ｒｅｉｄ −Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｍ、、　Ｐｅｒｒｙ、　Ｈ，Ｍ、　＆Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ、 　Ｋ、Ｓ、　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｏｆ　ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｉｃａ１６、Ｍａｔｔｈｙｓｓｅｎｓ、　Ｇ、　＆　Ｒａｂｂｉｔｓ、 　Ｔ、Ｈ，（１９８０）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　ＡｃａｄＳｃｉ　ＵＳＡ、　７ ７、６５６１−６５６５゜７、Ａｍ１ｔ、　Ａ、Ｇ、、　Ｍａｒｉｕｚｚａ、　 Ｒ，Ａ、、　Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、　Ｓ、Ｅ、＆　Ｐｏ１ｊａｋ。

９、Ｉｃｈｉｈａｒａ、　Ｙ、、　Ｍａｔｓｕｏｋａ、　Ｈ，＆　Ｋｕｒｏｓａ ｗａ、　Ｙ、　（１９８８）　Ｅｍｂｏ　Ｊ。

７、４１４１−４１５０゜ １０、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃ，＆　Ｌｅｓｋ、Ａ、Ｍ、（＋９８７）　Ｊ　Ｍｏｌ 　Ｂｉｏｌ、１９６．　９０１−９１７゜ １１、　Ｃｈｏｔｈｊａ、　Ｃ，ら（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ、　３４２．８ ７７−８８３゜１２、　Ｆｒ１ｐｐｉａｔ、　Ｊ、Ｐ、ら（１９９０）　Ｎｕｃ ｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１８．７１３４゜１３、５ａｉｋｉ、　Ｒ， に、ら（１９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ、　２３０．１３５０−１３５４゜１４、 　Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、　Ｈ，Ｒ，ら（１９９１）　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、　１９．４１３３−４１３７゜ １５、　Ｈｕｓｔｏｎ、　Ｊ、Ｓ、ら（１９８８）　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃ ａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ、　８５゜５８７９−５８８３゜ １６、　Ｂｉｒｄ、　Ｒ，Ｅ、ら（１９８８）　５ｃｉｅｎｃｅ、　２４２．４ ２３−４２６゜１７、Ｅｉｓｅｎ、Ｈ，Ｎ、（１９６４）　Ｍｅｔｈ　Ｍｅｄ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１０．　１１５−１２１゜＋８．　Ｆｏｏｔｅ、　Ｊ、　＆ 　Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、　Ｃ，（１９９１）　Ｎａｔｕｒｅ、　３５２．５３０− ５３２゜１９、Ｃ１ａｃｋｓｏｎ、Ｔ、、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｈ，Ｒ，、Ｇ ｒｉｆｆｉｔｈｓ、Ａ、Ｄ、＆　Ｗｉｎｔｅｒ。

Ｇ、（１９９１）　Ｎａｔｕｒｅ、３５２．　６２４−６２８゜２０、　Ｒｏｂ ｅｒｔｓ、　Ａ、Ｊ、ら（１９９２）　Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、印刷中 。

１７．４０００゜ ２４、　Ｃｈｅｎ、　Ｐ、Ｐ、、　Ｌｉｕ、　Ｍ、Ｆ、、　５ｉｎｈａ、　Ｓ、 　＆　Ｃａｒｓｏｎ、　Ｄ、Ａ、　（１９８８）２８、　Ｒａｔｈ、　Ｓ、、　 ５ｔａｎｌｅＹ、　Ｃ，Ｍ、　＆　Ｓｔｅｗａｒｄ、　Ｍ、Ｗ、　（１９８８） ヒト抗体 ｃｏＲＩ ＴＮＦまたは３０コーペプチドに対するファージＥＬ　Ｉ　５ＡＥＬＩＳＡシグ ナル（００−４０５） △ Ｉｅｉｉｏ口［１［［凹 ｄ＠　８ｒ　日％３　を３冨　グ七ご伍葺ＷＨ属な（ε　（１８←−←−ロ　喝 　←　ｈ ヨ３Ｈヨ″−葺ζ■■　票８　Ｌ　ｅ　８’；　！：（ｊ３Ｅ　”ｂＶ葺遺コ七 基妊Ｅ　２Ａ連３Ｉ肥■臣ミと’Ｅ　Ｅ＋ｌ贅ミ臣ミ葺缶　葺なＨ目下を石■■ 討ＩにミＩ目下　葺なＨｔ葺「革占 葺な甚＝コ］障ミしリョ　耗卦Ｑ’５　ｙｉ　Ｈ旨番壬ご芸は８】証ミ討ｆｊ５ ａ　”ｊｃＡ　ｅＬＱ−ペー　Ｃ３＞（−←ν　に− ”４”−Ｉｆｆ目芝にビ閤■　ｔミニ５３１藁ヨ菅 マ感染 マ　抗原結合体について選択 マ 可溶性発現について確認□ マ感染 可溶性Ｆａｂ発現のだめのクローニング１　Ｆ５８重鎮を置換するための マロＵＣ１９中へのクローニング マ 可溶性発現について確認 １、ｐＨＥＮＭＢＦ５８ＶＬの作製 ２、ｃｏＲ３移植ヒトＶＨレパートリ−のクローニングファージライブラリーの 選択 ３、ｉ！！択されたＶＨとヒトＶＬレパートリ−のＰＣＲ構築遊択されたＶＨド メイン 構築生成物のｐＨＥｌｌ中へのクローニング４、ファージライブラリーを選択し 個々の結合体をＥＬ　Ｉ　ＳＡにより同定するＣＤＲ３ＦＲ４ 国際調査報告 フロントページの続き （３１）優先権主張番号　９２０６３１８．９（３２）優先日　１９９２年３月 ２４日（３３）優先権主張国　イギリス（ＧＢ）（３１）優先権主張番号　９２ ０６３７２．６（３２）優先日　１９９２年３月２４日（３３）優先権主張国　 −イギリス（ＧＢ）（３１）優先権主張番号　ＰＣＴ／ＧＢ　９２１００８８３ （３２）優先日　１９９２年５月１５日（３３）優先権主張国　イギリス（ＧＢ ）（８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＰＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＥ、ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、ＳＥ）、０Ａ （ＢＦ、ＢＪ、ＣＦ、ＣＧ、ＣＩ、　ＣＭ、　ＧＡ、　ＧＮ、　ＭＬ、　ＭＲ， ＳＮ、　ＴＤ、　ＴＧ）、　ＡＴ、　ＡＵ、　ＢＢ、　ＢＧ、　ＢＲ，ＣＡ、　 ＣＨ，Ｃ３゜ＤＥ、ＤＫ、ＥＳ、ＦＩ、ＧＢ、ＨＵ、ＪＰ、ＫＰ、ＫＲ，ＬＫ、 　ＬＵ、　ＭＧ、　ＭＮ、　ＭＷ、　ＮＬ、　Ｎｏ、　ＰＬ、　ＲＯ，ＲＵ、　 ＳＤ、　ＳＥ、　ＵＳ（７２）発明者　ホーヘンボーム、ヘントリクス　レネル スヤコブス　マチウス イギリス国、ケシブリッジ　シービー２５ジェイエイチ、リトル　シェルフオー ド、ホークストン　ロード　１ （７２）発明者　バイエル、ミヒャエルイギリス国、ケンブリッジ　シービー１ ４テイーニス、プリンコ　グローブ　３６（７２）発明者　イエスパース、ロー レント　ステファンアン　テレス イギリス国、ケンブリッジ　シービー４１ジェイディー、ハシバーストーン　ロ ード　１７ （７２）発明者　ウィンター、グレゴリ−ポールイギリス国、ケンブリッジ　シ ービー１４ニーテイー、カベンディッシュ　アベニュ６４

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. １．着目の抗原に特異的な抗体ポリペプチド二量体の製造方法であって、次の段 階： （ｉ）複製可能な遺伝表示パッケージ（ｒｇｄｐ）の成分を使ってパッケージン グすることができる核酸発現ベクターを提供し；（ｉｉ）（ａ）各々ヒト抗体の 第一の抗原結合部位構成部分をコードする核酸配列の遺伝学上多様なレパートリ ーを、（ｂ）前記着目の抗原を結合することが知られている非ヒト抗体の第二の 抗原結合部位構成部分のユニーク集団または遺伝学上多様な集団をコードする核 酸と組み合わせ、前記発現ベクター上に抗体ポリペプチド二量体をコードする核 酸配列のライブラリーを形成せしめ、ここで前記二量体は各々第一のポリペプチ ド鎖成分と第二のポリペプチド鎖成分とから成り、前記第一の抗原結合部位構成 部分と前記第二の抗原結合部位構成部分は一緒になって抗原ポリペプチド二量体 の抗原結合部位を形成し； （ｉｉｉ）組換え宿主生物細胞において前記ベクターから前記ライブラリーを発 現せしめ、前記第一のポリペプチド鎖成分の各々が、前記第一のポリペプチド鎖 成分をｒｄｇｐの表面に表示するｒｇｄｐの成分との融合体として発現され； （ｉｖ）前記発現されたライブラリーから、前記着目の抗原に対する結合特異性 を有する前記抗体ポリペプチド二量体のユニーク集団または限定集団を抗原との 結合により選択し、各選択された抗体ポリペプチド二量体が各々のｒｇｄｐ中で それの前記第一の抗原結合部位構成部分をコードする核酸と関連づけられるを含 んで成る方法。
2. ２．前記抗体ポリペプチド二量体が段階（ｉｖ）での選択後に可溶性ポリペプチ ドとして発現される、請求項１に記載の方法。
3. ３．前記段階（ｉｉ）での組合せの前に、各々前記非ヒト抗体の第二の構成成分 をコードする配列を遺伝子的に変更してヒト抗体の第二構成部分との相同性を増 加させる、請求項１または請求項２に記載の方法。
4. ４．前記段階（ｉｖ）において選択された抗体ポリペプチド二量体を遺伝子的に 変更して非ヒト特性を除去または削減する追加の段階（ｖ）を有する、請求項１ 〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. ５．前記段階（ｖ）が、 （ａ）段階（ｉｖ）において選択された前記第一の抗原結合部位構成部分をコー ドする核酸のユニーク集団または限定集団を、各々ヒト抗体の第二の抗原結合部 位構成部分をコードする核酸配列の遺伝学上多様なレパートリーと組合せ、抗体 ポリペプチド二量体をコードする核酸配列の第二のライブラリーを形成せしめ、 ここで各抗体ポリペプチドニ量体は、ｒｇｄｐの一成分を使ってパッケージング することができる核酸配列から発現される第二の抗体ポリペプチド鎖成分を含ん で成り、前記第二の鎖成分は、それによってｒｇｄｐの表面に前記第二の鎖成分 を表示するｒｇｄｐの成分との融合体として発現され、その結果、前記着目の抗 原との結合によって前記第二のライブラリーから着目の前記抗原に特異的な抗体 ポリペプチド二量体を選択することが可能であり、各抗体ポリペプチドニ量体が そのｒｇｄｐ中でそれの第二のポリペプチド成分をコードする核酸と関連づけら れることを含んで成る、請求項４に記載の方法。
6. ６．前記非ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成成分が抗原との接触を行う領域で ある、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. ７．前記領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）である、請求項６に記載の方法。
8. ８．前記非ヒト抗体の第二の抗原結合部位構成成分が一抗体の第二のポリペプチ ド鎖成分である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
9. ９．前記抗体ポリペプチド二量体のライブラリーのいずれかの各抗体ポリペプチ ド二量体が一本のポリペプチド鎖、好ましくはｓｃＦｖ断片として発現される、 請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. １０．前記抗体ポリペプチド二量体のライブラリーのいずれかの各抗体ポリペプ チド二量体が二本のポリペプチド鎖、好ましくはＦｖまたはＦａｂ断片として発 現される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
11. １１．着目の抗原に特異的なヒト抗体ポリペプチド二量体の製造方法であって、 （ｉ）各々ヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペ プチドの多様性集団（集団Ａ）を、各々前記抗原に特異的な非ヒト抗体の第二の ポリペプチド鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドのユニーク集団または 限定集団（集団Ｂ）と組合せ、それによって各々ヒト抗体の第一のポリペプチド 鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドと非ヒト抗体の第二のポリペプチド 鎖の可変ドメインを含んで成るポリペプチドとから成る抗体ポリペプチド二量体 のライブラリーを形成せしめ：（ｉｉ）前記ライブラリーから、前記抗原に対す る結合特異性を有する前記抗体ポリペプチド二量体のユニーク集団または限定集 団（集団Ｃ）を選択し； （ｉｉｉ）各々ヒトの第一のポリペプチド鎖を含んで成る段階（ｉｉ）において 選択されたポリペプチド二量体から誘導したポリペプチドのユニーク集団または 限定集団（集団Ｄ）を、各々ヒト抗体の第二のポリペプチド鎖の可変ドメインを 含んで成るポリペプチドの多様性集団（集団Ｅ）と組合せ、それによってヒト抗 体ポリペプチド鎖二量体のライブラリーを形成せしめ、そのライブラリーから、 前記抗原に特異的なヒト抗体ポリペプチド二量体のユニーク集団または限定集団 （集団Ｆ）を選択することが可能であることを含んで成る方法。
12. １２．（ａ）前記集団Ａのポリペプチドが、組換え宿主生物細胞において、それ によってｒｇｄｐの第一集団においてｒｇｄｐの表面上に前記ポリペプチドを表 示する複製可能な遺伝表示パッケージ（ｒｇｄｐ）の成分との融合体としてベク ター（Ｘ）から発現され、（ｂ）前記ｒｇｄｐ成分を使って前記ベクター（Ｘ） の核酸をパッケージングすることができ、それによって前記ｒｇｄｐの遺伝物質 が前記集団Ａのポリペプチドをコードし、その結果、集団Ｃの抗体ポリペプチド 二量体がそれら各々のｒｇｄｐ中でヒト抗体の第一のポリペプチド鎖の可変領域 を含んで成るポリペプチドをコードする核酸と関連づけられ； （ｃ）前記集団Ｅのポリペプチドの各々が、組換え宿主生物細胞において、ｒｇ ｄｐの第二集団においてｒｇｄｐの表面上に前記ポリペプチドを表示するｒｇｄ ｐの成分との融合体としてベクター（Ｙ）から発現され；そして （ｄ）前記ｒｇｄｐ成分を使って前記ベクター（Ｙ）の核酸をパッケージングす ることができ、それによって、ｒｇｄｐの第二集団の中の前記ｒｇｄｐの遺伝物 質が前記集団Ｅのポリペプチドをコードする請求項１１に記載の方法。
13. １３．前記集団Ａが前記集団Ｂと同じベクターから発現されず；そして前記集団 Ｄが前記集団Ｅと同じベクターから発現されない、請求項１１または請求項１２ に記載の方法。
14. １４．前記集団Ａが前記集団Ｂと同じベクターから発現され；そして前記集団Ｄ が前記集団Ｅと同じベクターから発現される、請求項１１または請求項１２に記 載の方法。
15. １５．前記抗体ポリペプチド二量体のライブラリーのいずれかの各抗体ポリペプ チド二量体が一本のポリペプチド鎖、好ましくはｓｃＦｖ断片として発現される 、請求項１４に記載の方法。
16. １６．前記抗体ポリペプチド二量体のライブラリーのいずれかの各抗体ポリペプ チド二量体が二本のポリペプチド鎖、好ましくはＦｖまたはＦａｂ断片として発 現される、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
17. １７．前記集団Ｂのポリペプチドが各々ヒト抗体定常ドメインを含んで成るキメ ラである、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
18. １８．前記集団Ｅのポリペプチドが、各々前記抗原に特異的な非ヒト抗体からの 領域を含んで成り、前記領域が抗原との接触を行う領域である、請求項１１また は請求項１２に記載の方法。
19. １９．前記領域が相補性決定領域（ＣＤＲ）である、請求項１８に記載の方法。
20. ２０．前記ＣＤＲがＣＤＲ３である、請求項１９に記載の方法。
21. ２１．前記第一のポリペプチド鎖が抗体軽鎖であり、前記第二のポリペプチド鎖 が抗体重鎖である、請求項１１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
22. ２２．前記抗原に特異的なヒト抗体ポリペプチド二量体の前記集団Ｆを選択する 追加の段階を含んで成る、請求項１１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. ２３．前記集団ＣとＦのいずれか一方が前記抗原との結合により選択される、請 求項１１〜２２のいずれか一項に記載の方法。