JPH06510986A - ピコルナウイルスプロテアーゼのインヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ピコルナウィルスプロテアーゼのインヒビター１五光■ 本発明は、ウィルス学およびプロテアーゼの分野に関する。

より特定すると、本発明は、ピコルナウィルスプロテアーゼ酵素のインヒビター として有用である低分子化合物、およびウィルス疾患の治療におけるそれらの使 用に関する。

ｌ胛旦背ｌ ピコルナウィルスは、非常に小型の、ＲＮＡ含有ウィルスであり、ヒトを含む広 い範囲の動物に感染する。ピコルナウィルス科は、とりわけ、ヒトポリオウィル ス、ヒトコクサソキーウイルス、ヒトエコーウィルス、ヒトおよびウシエンテロ ウィルス、リノウィルス、編心筋炎ウィルス、口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）、お よびＡ型肝炎ウィルス（ＨＡＹ）を包含する。

ピコルナウィルスは、ヒトに感染する酸に安定なウィルスである。このウィルス は、経口感染により入り込み、胃腸管内で増殖し、そして神経系に侵入する。ポ リオウィルスは、中枢神経系に達するまで神経繊維に沿って広がり得、その結果 、ポリオウィルスは、運動神経、を髄、および脳幹を攻撃する。感染が進行する と、麻痺を生じ得る。重症の感染は西洋世界では稀であるが、おりに触れてなお 生じる場合がある。

時期療法のみが現在用いられている。

コクサオキーウィルスおよびエコーウィルスは、種々の種類の疾患を引き起こす エンテロウィルスと関連があり、この疾患は、水庖性口峡炎、胸膜痛、無菌性髄 膜炎、心筋障害、急性出血性結膜炎、および急性下痢を包含する。無菌性髄膜炎 および心筋障害は、特に重病であり、致命的であり得る。

リノウィルスは、一般の風邪の最も重要な病因因子であり、はとんど全てのヒト に、その生涯のある時点で感染する。現在、承認された治療法はない。

ＨＡＹは、感染性肝炎の高度な伝染性を有する病因である。これはまれに慢性肝 炎をもたらすことがあるが、現在ワクチンまたは有効な治療法はない。

ＦＭＤＶは、家畜に影響する最も重大な１つの病原であるとみなされており、従 って市販される重要なウィルスである。これは高度な伝染性を有し、７０％程度 の高割合で致死に達し得る。米国におけるウィルスの規制では、一般に、全ての 感染動物を殺すか、またはワクチン注射して、全ての動物に３０日間徴候が現れ ないまで隔離することを指示している。この疾患は、接触によりヒトにうつり得 る。

感染の治療は、一般に、感染させる生物がその宿主とは別の代謝系を用いるとい う前提に依存する。従って、抗生物質は、バクテリウム属のライフサイクルのあ る局面を、特異的に（または選択的に）阻害するかまたは破壊するので、バクテ リアの感染と対抗させるために用いられる。バクテリアの酵素が真核生物（例え ば、ヒト）の酵素と構造的に異なるという事実により、原核生物の対となる一方 における好ましくない結果を生じることなく、バクテリアの酵素を不活性化させ るか、またはその能力を弱める化合物を発見することを可能にする。しかし、ウ ィルスは、大部分、在来の宿主酵素および代謝に依存する：従って、ウィルスが 宿主と顕著に異なる少数の標的に存在するために、ウィルス感染を治療すること は困難である。結果として、少数の抗ウィルス剤のみが現在使用可能であり、は とんどは重大な副作用を有する。

現在の抗ウィルス剤は（例えば、アンクロビルおよびガンシクロビル）、ウィル スポリメラーゼを標的する。これらの薬剤は、核酸類似体であり、そしてウィル スポリメラーゼが真核生物ポリメラーゼより識別力に劣るという事実に依存して いる：この薬剤はポリメラーゼにより複製するウィルスＤＮＡ中に取り込まれ、 次いで付加塩基を結合し得ない。よって、ウィルス複製は不完全であり、無効で ある。しかし、これらの薬剤は重大な副作用を有しており、現在はＡＩＤＳおよ びＡＩＤＳ関連感染（例えば、免疫無防備状態の患者でのサイトメガロウィルス 感染）の治療にのみ用いられている。

他の方法では、ウィルスが宿主細胞に侵入する手段をブロックする。ウィルスは 、典型的には、特定の細胞表面レセプターに結合し、宿主によるレセプターの内 在化または宿主との膜融合のいずれかにより、細胞に侵入する。従って、理論上 では、侵入に用いられるレセプターをブロックすることにより、ウィルスの侵入 （および従って複製および感染）を妨害し得る。このアプローチの例には、ＨＩ Ｍの侵入を阻害する可溶性ＣＤ４の使用がある。しかし、大多数のレセプターの ために、ウィルスにより用いられる全てのレセプターをブロックすることは困難 である。たとえ成功したとしても、このようなレセプターを阻害することにより 、レセプターの正常な機能を損なうために、別の不利な影響が生じ得る。

別の方法は、あるウィルスに特有なタンパク質発現系に依存する。あるウィルス では、完全なウィルスゲノムを１つの長い「ポリタンパク質」として発現し、次 いで構造ウィルスタンパク質および非構造ウィルスタンパク質に開裂する。この 開裂は、特異的なウィルスプロテアーゼまたは内在性宿主細胞プロテアーゼ、ま たはこの２つの組合せにより達成され得る。ウィルスプロテアーゼは、特定の１ 次構造（およびことによると２次構造）の形をとらねばならない、非常に特異的 な開裂部位を必要とし得る。従って、ウィルスプロテアーゼの開裂／認識部位に 擬似の化合物を設計することが可能であり得る。この化合物はこのプロテアーゼ を阻害し、ウィルス複製サイクルを妨害する。Ｍｏｌｌｉｎｇらのヨーロッパ特 許第３７３．５７６号は、旧Ｖプロテアーゼに対する認識部位に擬似するペプチ ド開示している。このペプチドは、ただ１つの非共通アミノ酸（５−オキソプロ リン）を含み、従っておそらく競合結合により作用する。

ペプチド内でプロテアーゼ認識部位を取り囲む残基は、通常、以下のように示さ れる： 、、、Ｐａ−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ＋−Ｐ＋−Ｐａｏ−Ｐ３°−１，。

ここで、開裂はＰＩとＰ＋°との間で起こる。低特異性を有するプロチアーゼは 、Ｐ＋位およびＰ１°位の残基の正体によってのみ強制され得、より除去された 残基に関わらず、そのジペプチドを含有する全てのポリペプチドを開裂する。し かし、はとんどの特異性プロテアーゼは、少なくとも残基Ｐａ−Ｐ４’のい（っ かが特定のアミノ酸（または特定のアミノ酸の小セット）に限定されることが必 要である。ピコルナウィルスシスティンプロテアーゼは、通常、Ｐ１位置にＧｉ ｎを必要とする。

プロテアーゼインヒビターの一般形は、阻害されるプロテアーゼへの結合を誘導 するのに充分なポリペプチド配列を含むが、ｈ−Ｐｘ’部分に対して電子アンカ リング基（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ　ｇｒｏｕｐ）を置換する。プロテアーゼによる 認識に際し、アンカー基は、活性部位中の必須残基（例えば、活性部位求核試薬 ）に結合し、さらなるタンパク質分解活性を阻害する。しかし、ＧｌｕまたはＧ ｌｎで終わるペプチドプロテアーゼインヒビターを調製することは、これらの残 基が、環状化し、アンカリング部分の濃度を低下させる（このことはプロテアー ゼへの結合を顕著に減少させる）傾向を有するので、困難である。

ｌ丑旦皿示 本発明は、ピコルナウィルス科（例えば、Ａ型肝炎ウィルス、リノウイルス、コ クサノキーウイルスなど）による感染の治療に有用である、特定のクラスの７ス テインプロテアーゼインヒビターに関する。Ｐ＋　Ｇｌｎ残基が、側鎖カルボニ ル基を保持するＧｌｎ類似体で、プロテアーゼ結合活性を保持したまま置換され 得ることが分かった。本発明のインヒビターは、式Ｉの化合物である： ここで、Ｒ＋は、−０Ｒ３または−ＮＲｉＲｔであり、ここでＲ３は低級アルキ ル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、またはアリール−低級アルキルであり、モし てＲ４は、Ｈまたは低級アルキルであり、Ｒ２は、Ｈまたは低級アンルであり； Ｘは、−ｃＨＯｌ−ＣＥＥＮ、−ＣＯＣＨ２Ｆ、−ＣＯＣＨ２Ｆ　Ｌ　−Ｃ０Ｃ Ｈ２Ｎ２、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ−Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ２、または−ＣＯＣＯＲｓ（ここ でＲ５は、低級アルキル、低級アルコキシ、低級アリール、アリール−低級アル キル、またはアリール−低級アルコキンである）からなる群から選択されるアン カー基であり；そして（ａａ）。は、選択された特定のプロテアーゼにより特異 的に認識される２〜４０個のアミノ酸のポリペプチドである。

本発明の他の局面は、有効量の式Ｉの化合物をそれらを必要とする被験体に投与 することにより、ピコルナウィルス感染を治療するための方法である。

本発明の池の局面は、式■の化合物を調製するための方法である。

（以下余白） 図面の簡単な説明 図１は、イア　ヒヒ９−Ａｃ−ＬＲＴＥ（ＯＭｅ）−ＣＨＯ，ＡＣ−ＴＰＬＳＴ Ｅ（ＯＭｅ）−ＣＨＯおよびＡｃ−ＬＲＴＱ（ＮＭｅ２）−ＣＩ（０に対するイ ンヒビター濃度の関数としての）ＩＡＶ　Ｃ３プロテアーゼの阻害を示すグラフ である。

λ粧乏尖上土玉Ｂ１ Ａ、定義 本明細書中で用いられる用語「低級アルキル」は、１個〜８個の炭素原子を有す る直鎖および分枝鎖の炭化水素基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプ ロピル、ｎ−ブチル、Ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシルな どをいう。

「低級アルコキシＪは、式−ＯＲの基をいい、ここでＲは上記で定義した低級ア ルキルである。　「アリール」は、１４個までの炭素原子を有する芳香族炭化水 素、好ましくはフェニルまたはナフチルをいう。　「アリール低級アルキル」は 、Ａｒ−Ｒ−の形の基をいい、ここでＡｒはアリールであり、そしてＲは低級ア ルキルである。

用語「低級アンル」は、式ＲＣＯ−の基をいい、ここでＲは、Ｈｌ　上記で定義 された低級アルキル、フェニルマタハヘンジルである。代表的な低級アンル基に は、アセチル、プロピオニル、ホルミル、ベンゾイルなどが包含される。

用語「ビコルナウイルスンステインプロテアーゼ」は、ピコルナウィルスのゲノ ム内でコードされた酵素をいう。この酵素はその酵素の活性部位内にシスティン 残基を含有している。このピコルナウィルスのシスティンプロテアーゼは、好ま しくほこのウィルスの複製および／または感染性に必須の酵素であり、特にこの ウィルスのポリタンパク質をその構成要素のタンパク質に開裂するプロテアーゼ である。

本明細書中で用いられる用語「アンカー」は、プロテアーゼの活性部位中に導入 されたとき、可逆的にまたは非可逆的にプロテアーゼに結合し、そしてこの酵素 のタンパク質分解活性を阻害する基をいう。ここで好適なアンカーには、アルデ ヒド（−ＣＨＯ）、ニトリル（−Ｃ＝Ｎ）、α−ケトエステル（−ＣＯＣＯＲｓ ）、ハローメチルケトン（−ＣＯＣＨ２Ｆ、−Ｃ０ＣＨ２Ｃ１）、ジアゾメチル ケトン（−ＣＯＣＨ２Ｎ２）、およびチオセミカルバゾン（−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨ− Ｃ（＝Ｓ）−ＮＨ２）が包含される。最も有効なアンカー基は、プロテアーゼか らプロテアーゼで相違し得る。

用語「有効量」は、検知し得る治療効果を示すのに十分な化合物の量をいう。治 療効果には、限定するものではないが、例えば、病原体の復製を阻害すること、 病原体による毒素の放出を阻害することまたは防くこと、病原体を殺すこと、お よび感染の定着を防ぐこと（予防）が包含され得る。被験体に対する正確な有効 量は、被験体の大きさおよび健康状態、病原体の性質、感染の重症度などに依存 する。したがって、前もって正確な有効量を特定することは不可能である。しか し、所定の状況の有効量は、本明細書に提供される情報に基づくルーチンの実験 によって決定され得る。

用語「薬学的に受容可能な」は、哺乳類に投与され得る、過度な毒性を有［、な い化合物および組成物をいう。代表的な薬学的に受容可能な塩類には、鉱酸塩類 （例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）；および有機酸の塩 類（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など）が包含さ れる。

用語「アミノ酸」は、一般的に、タンパク質およびペプチドの構成要素として通 常見いだされる天然に存在する以下のアミノ酸をいう：Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｌ −ンスティン（Ｃ）、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｌ−グルタミン酸（Ｅ）、１ ．−フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、Ｉ７−ヒスチジン（Ｉ］）、Ｌ −イソロイシン（１）、Ｌ−リジン（Ｋ）、し−ロイシン（Ｌ）、Ｌ−メチオニ ン（Ｍ）、Ｌ−アスパラギン（Ｎ）、Ｌ−プロリン（Ｐ）、Ｌ−グルタミン（Ｑ ）、し−アルギニン（Ｒ）、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｌ−）レオニン（Ｔ）、Ｌ−バ リン（Ｖ）、Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、およびＬ−チロシン（Ｙ）。しかし、 他の類似体化合物は、選択されたプロテアーゼによってインヒビターの認識に逆 の影響を及ぼさない場合には、置換され得る。代表的な類似体には、上記で挙げ られたアミノ酸のＤ−異性体、同族体、例エバ、ノルロインン、フェニルグリシ ン、Ｎ、Ｎ’−ジメチル−Ｄ−アルギニンなどが包含される。好適なアミノ酸は 、通常、天然に存在するアミノ酸である。

語句「特異的な阻害」および「特異的に阻害すること」は、選択されたプロテア ーゼのタンパク質分解活性の低減または妨害をいい、これは、異なる基質特異性 を有するタンパク質分解酵素に関して実質的な効果は有しない。したがづて、本 発明のプロテアーゼインヒビターは、好ましくは、特定する配列（代表的には、 開裂部位から４個〜７個のアミノ酸上流）を十分包含し、その結果、選択された ピコルナウィルスプロテアーゼのみが認識し、そしてこの化合物によって阻害さ れる。このことについて、　「認識する」は、プロテアーゼが特定のアミノ酸配 列を有するペプチドのみを結合し、そして開裂し得るという事実をいう：このよ うな配列を有するペプチドは、プロテアーゼによって「認識される」。

Ｂ、二股五亙五皿 本発明の実施には、一般的に、当該分野である、分子生物学、微生物学、組換え ＤＮＡ、および免疫学の通常の技法が使用される。このような技法は、文献にお いて十分に説明されている。例えば、Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋらの−Ｍｏｌｅｃ ｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ；　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ−（１ ９Ｂ９）；　−ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ−、１巻および１１巻（Ｄ、Ｎ　Ｇｌｏ ｖｅｒｉｉｌ、　１９８５）＋　−０１ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　５ｙｎｔ ｈｅｓｉｓ−（Ｍ、Ｊ。

Ｇａｌｔ編、１９８４）：　−Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｈｙｂｒｉｄｉｚａ ｔｉｏｎ−（Ｂ、Ｄ、　ＨａｌｅｓおよびＳ、Ｊ、　１１ｇｇ１ｎｓ編、１９８ ４）；　−Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ａｎｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ−（ Ｂ、Ｄ、　ＨａｌｅｓおよびＳ、Ｊ、　Ｈ４ｇｇｉｎｓ編、１９８４）；　−Ａ ｎｉｗ＋ａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ−（Ｒ，１，Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１ ９８６）；　−１ｇｕｏｂｉｌｉｚｅｄＣｅｌｌｓ　Ａｎｄ　Ｅｎｚｙｖｅｓ” （ＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、　１９８６）：　Ｂ、　Ｐｅｒｂａｌ、　−Ａ　Ｐｒａ ｃｔｉｃａｌ　Ｇｕｉｄｅ　Ｔｏ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ＋（１ ９８４）；　−ＭｅｔｈｏｄｓＩｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ−のンリーズ（Ａｃ ａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ、）：　−ＧｅｎｅＴｒａｎｓｆｅｒ　Ｖｅ ｃｔｏｒｓ　Ｆｏｒ　Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ−（Ｊ、Ｈ，Ｍｉｌｌｅ ｒおよびＭ、Ｐ、　Ｃａｌｏｓ編、１９８７．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；む」Ｌ■」１虹（１９８７）　１５４およ び居１（それぞれ、ＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎｗａｌ　およびｌＶｕｍ）　； 　ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編（１９８７）、−１＋ａｍｕｎｏｃｈｅｍｉ ｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｃｅ１ｌ　Ａｎｄ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ ｏｌｏｇｙ−（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、ロンドン）；　５ｃｏｐｅｓ、 −Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｅａｔｉ。

ｎ：　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　Ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ−１第２版（Ｓｐｒｉ ｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ。

Ｎ、Ｙ、、　１９ｇ？）：　および−Ｈａｎｄｂｏｏｋ　Ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍ ｅｎｔａｌ　１ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ″、第１−ＩＶ巻　（ＷｅｉｒおよびＢｌａ ｃｋｗｅｌ１編、１９８６）を参照のこと。

ビフルナウイルス基質のアミノ酸配列は、ウィルスゲノムの検査、およびウィル スタンパク貫末端の比較によって決定され得る。ゲノム核酸配列とウィルスタン パク質を並べることにより、推定される開裂部位を確かめ得る。これは、開裂部 位を含有するペプチドの合成およびウィルスプロテアーゼとのインキュベーショ ンによって確認され得る。一度本来の認識部位が確認されれば、インヒビターは 本明細書中に記載の方法によって調製される。インヒビターの（ａａ）。部分は 、活性を最適化するために系統的に改変され得る。最も有効なインヒビターは、 任意の変更は最小（アミノ酸３個未満の相違）であると予想されるが、本来の基 質と同一の配列を必ずしも示す必要はない。

ピコルナウィルスプロテアーゼは類似の基質配列要求性を持つことを見いだした 。一般的に、Ｐｌは、Ｇｌｎであるべきであり、モしてＰ４は、脂肪族（例えば 、Ｌｅｕ、　ｌｉｅ、　Ｖａｌなど）であるべきである。ＨＡＹ　３Ｃプロテア ーゼにおいて、Ｐ２は、ヒドロキシル側［ＵＩえば、５ｅｒＳＴｈｒ、ヒドロキ シプロリンなど）を有するべきである。Ｐ３およびＰ５残基は、プロテアーゼ特 異性に寄与するとは思えない。ピコルナウィルスプロテアーゼの最小の基質認識 部位は、一般にポリオ：　−ＡＬＦＱ（ＧＰＬ）　；ＨＲＶ　１４：　ＰＶＶＶ Ｑ（ＧＰ）；　ＨＡＹ：　ＬＲＴＱ（ＳＦＳ）Ｔあると考エラレテイる：ここで Ｐ、、ｌ’残基は括弧中に記載されている。

あるいは、インヒビターの「ライブラリー」は、米国特許第５．０１０．１７５ 号および同時係属出願ＵＳＳＮ　０７／６５２．１９４号（１９９１年２月１６ 日出願）に開示された方法に従って合成され得る。ここで両者は、本明細書中に 参考として全体が援用される。簡単には、ペプチドの混合物を調製し、次いで、 スクリーニングして、所望の活性を示すペプチドを決定する。°１７５の方法で は、適切なペプチド合成支持体く例えば、樹脂）が、適切に保護され、活性化さ れたアミノ酸の混合物に結合する。反応混合物中の各アミノ酸の濃度は、結合反 応速度に反比例して調節または調整される。その結果得られる生成物は、開始樹 脂に結合したアミノ酸の等モル混合物である。結合したアミノ酸は、次いで、脱 保護され、そして他の調節されたアミノ酸混合物と反応して、全ての可能なジペ プチドの等モル混合物を形成する。このプロセスは、所望の長さく例えば、６量 体）のペプチドの混合物が形成されるまで、繰り返される。

各工程において、全てのアミノ酸を含む必要はないことを注意すること：いくつ かの工程においては、１個または２個のアミノ酸のみが含まれ得る（例えば、こ こで、特定のアミノ酸が所定の位置に必須であることが知られている）。したが って、この混合物の複雑さが低減される。このような場合においては、追加の最 終アミノ酸は、Ｇｌｎ（Ｘ）チオエステル誘導体、例えば、Ｇｌｕ（ＯＭｅ）− チオエステルである。チオエステルのアルデヒドへの脱保護および変換後、イン ヒビターの混合物は、選択されたピコルナウィルスプロテアーゼに結合（または このプロテアーゼを阻害）についてスクリーニングされる。

十分な活性を示すインヒビターは、次いで、単離されそして配列決定される。

米国特許°１９４に記載されている方法は、本願の方法と類似している。しかし 、合成樹脂と活性化したアミノ酸の混合物とを反応させる代わりに、樹脂を２０ 個の均等な部分に分割しくあるいは、この工程で添加される異なったアミノ酸の 数に対応した数の部分に分割し）、そして、各々のアミノ酸を個別に樹脂の部分 に結合させる。複数の樹脂部分を次に、組合せ、混合し、そして再び複数の均等 な部分に分割し、第二のアミノ酸と反応させる。この方法では、各反応は容易に 進められ完了する。加えて、各工程で全ての樹脂を組み合わせるのでは無く、各 部分を平行して処理するごとで、独立した「サブプール」を維持し得る。こうす ると、どのインヒビターが、観察されるいずれの活性に対応するのかを調べる方 法が単純化される。

米国特許°１７５および°１９４に記載されている方法は、プロテアーゼに対す る天然の基質が未知あるいは未確認の場合にも使用し得る。候補インヒビターの 混合物は、天然の基質が存在しない条件下でプロテアーゼに対する結合に関ｌ、 てアッセイし得る。あるいは、米国特許゛１７５および°１９４に記載されてい る方法を用いて（即ち、全ての可能なオリゴマーの混合物を調製し、この混合物 を酵素と接触させ、そして、反応生成物をアッセイし、どのオリゴマーが開裂さ れたのかを調べることで）、基質を確認し得る。ウィルスプロテアーゼが確認さ れていないあるいは単離されていない場合にでさえも、特定のウィルスのインヒ ビターの確認に実際に、米国特許°１９４に記載されている方法を採用し得る。

この様な場合には、複数のウェル中の宿主細胞上でウィルスを培養し、そして、 例えば各々１−２．０００の候補を含むサブプールで処理する。陽性の結果を生 じた各サブプールを次に、例えば２０−１００個の候補を含む、より小さいサブ プール（サブ−サブプール）のグループに再合成し、そして、再アッセイする。

陽性のサブ−サブプールは、個々の化合物として再合成し、そして、活性なイン ヒビターを確認するために最終的にアッセイし得る。米国特許゛１９４に記載さ れている方法は、平行して行なわれる自動化技法により、この様なプールおよび サブプールの調製を、全ての合成および再合成が数日間で行われ得る様にする。

一般に、精製した形態のウィルスプロテアーゼを採用することが好ましい。この ようなプロテアーゼは、通常、関連文献で報告されていることが見いだされ得る 。

プロテアーゼインヒビターは、任意の利用できる方法を使用して、スクリーニン グされ得る。現在のところ、本明細書中に記載の方法が好ましい。一般に、その 酵素の天然の基質を模倣した基質が採用されるが、これは開裂した時に定量的に 検出可能な信号を与える。この信号は、比色的定量手段あるいは蛍光的定量手段 で検出し得るのが好ましいニ　しかし、ＨＰＬＣあるいはシリカゲルのクロマト グラフィー、ＧＣ−ＭＳ、核磁気共鳴、等の様な他の方法も有用で有り得る。基 質と酵素の最適濃度が決まれば、候補のプロテアーゼインヒビターを、ある範囲 の濃度で、反応混合物に添加する。このアッセイ条件は理想的には、ｉｎ　ｖｉ ｖｏでプロテアーゼが阻害される条件に類似していなければならない。即ち、生 理的な、ｐＨ，温度、イオン強度、等の条件下である。適切なインヒビターは、 被験体中で毒性の副反応を生じない濃度で、強いプロテアーゼ阻害を示す。プロ テアーゼの活性部位に対する結合に競合するインヒビターは、基質濃度と等しい かあるいは基質濃度より高濃度が必要とされ得る。一方、プロテアーゼの活性部 位に非可逆的に結合し得るインヒビターは、酵素濃度と同じ桁の濃度で添加され 得る。

（以下余白） 好ましくは、この基質と濃度を変えた候補インヒビターとを混合し、続いて、プ ロテアーゼを添加する。反応混合物のアリコートを定期的時点で反応停止し、基 質開裂の程度をアッセイした。好適な技法は、反応停止した溶液にＴＮＢＳ　（ トリニトロベンゼンスルホネート）を添加することであり、これは開裂によって 生じた遊離のアミンと反応して定量可能な黄色を生成する。

本発明のプロテアーゼインヒビターは、種々の方法、例えば、静脈内、経口、筋 肉内、腹膜腔内、気管支、鼻内、などで投与し得る。投与の好ましい経路は、イ ンヒビターの性質および治療される病原体に依存する。例えば、リノウィルス感 染の治療のために投与されるインヒビターは、最も好ましくは、鼻内投与される 。インヒビターは、良好に吸収され、食物摂取によって実質的に分解しないので あれば、しばしば、経口投与され得る。しかしながら、殆どのインヒビターは、 消化に感受性であると予想されるので、一般に、非経口的な経路で投与されなけ ればならない。このインヒビターは、薬学的に受容可能な賦形剤と組み合わせた 薬学的な組成物で投与され得る。そのような組成物は、水溶液、エマルション、 クリーム、軟膏、懸濁液、ゲル、リポソーム懸濁液などであり得る。従って、適 切な賦形剤は、水、塩水、リンガ−液、デキストロース溶液、および、エタノー ル、ブドウ糖、ショ糖、デキストラン、マンノース、マンニトール、ソルビトー ル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　、リン酸塩、酢酸塩、ゼシラン、コラ ーゲン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ”、植物油の溶液などを包含する。それは、さらに、 適切な保存剤、安定剤、酸化防止剤、抗菌剤、および緩衝剤、例えば、ＢＨＡ、 　ＢＩＴ、クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリンなどを含有し得る。製 剤中で有用なりリームまたは軟膏のベースは、ラノリン、　Ｓｉｌｖａｄｅｎｅ Ｏ（Ｍａｒｉｏｎ社）、Ａｑｕａｐｈｏｒ＠　（Ｄｕｋｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ社）などを含有する。他の局所製剤は、エアロゾル、バンデージ、徐放性 貼付剤などを含有する。あるいは、適切なポリマーマトリックスまたは膜中にイ ンヒビターを取り込み得、またはカプセル化し得、こうすることによって、局部 的に治療されるべき部位近くの移植に適した徐放性供給デバイスを与える。

他のデバイスは、内在するカテーテル、および例えばＡｔｚｅｕミニポンプなど のデバイスを包含する。さらに、固体形態、特に凍結乾燥された粉末として、イ ンヒビターを供給し得る。

凍結乾燥製剤は、代表的には、安定剤および増量剤、例えばヒト血清アルブミン 、ショ糖、マンニトールなどを含有スル。

薬学的に受容可能な賦形剤の完全な討論は、「勤１１」ｕ旦「」−Ｐｈａｒ＋＋ ａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　（Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ、　Ｃｏ、）　Ｊ で入手可能である。

Ｃ１実１Ｌ憇 以下に記載の本実施例は、当業者である実施者へのさらなる指針として提供され 、そしていかなる方法でも本発明を限定するとして解釈されるべきでない。

実１１１１ （グルタメートエステルアルデヒドインヒビターの合成）Ａ、　Ａｃ−ＴＰＬＳ ＴＥ　ＯＭｅ　−ＣＩＯ配列Ａｃ−Ｔ（ｔ−Ｂｕ）−Ｐ−Ｌ−Ｓ（ｔ−Ｂｕ）− Ｔ（ｔ−Ｂｕ）−０Ｈを有する保護ペプチドを、リンク（Ｒｉｎｋ）樹脂を支持 体として用いて、標準固相Ｆｍｏｅ法で合成した（Ｈ，Ｒｉｎｋ、　Ｔｅｔｒａ ｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔ　２ｇ巻＝３７８７頁（１９８７年））。コノヘブチド を、２時間、１０％Ｉ’１ＯＡｃ（７）ＣＨ２Ｃ１２溶液を用いて、樹脂から開 裂した。

市販のｔ−Ｂｏａ−グルタメートメチルエステル（２，５ｇ）を、トリエチルア ミ７（７，１当量、８．３９ｇ）およびＤＭＡＰ　（、０，１当量、０１４ｇ） の存在下、０°Ｃで１時間、エタンチオール（１０当量、７、　ｔａｇ）および エチルクロロホルメート（３，６当量、４．５ｇ）と反応させた。ｔ−Ｂｏａ保 護基を、２５％　トリフルオロ酢酸（”ＴＦＡ”）のＣＨ２Ｃｌ２溶液１００　 ｍＬで、３０分間室温で反応させることによって、除去し、エチルグルタメート チオエステルを得た。

ＤＭＦ　（１，１４ｍＬ）中でＨＯＢｔ　（３当量、７７　ｍｇ）およびＢＯＰ （３当量、２５２■ｇ）を用いて、保護ペプチド（４１，５Ｂ）をエチルグルタ メートチオエステル（，０７，５−ｇ１３当量）に結合した。

次に、ペプチド（２０■ｇ）を５０％ＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液で２時間、室温 で処理することによって、ｔ−ブチル保護基を除去し、ペプチドチオエステルを 得た。次いで、このペプチド（Ａｃ−ＴＰＬＳＴＥ（ＯＭｅ）−ＳＥＬ）を、Ｃ Ｈ２Ｃｌ２　（１ｗＬ）中で、ペプチド（２ｍｇ）をトリエチルシラン（４０当 量、７０　Ｉｌｇ）およびパラジウム（１，４当量、１３．９　ｍｇ）と１時間 室温で処理することによって、還元した。この生成物、Ａｃ−ＴＰＬＳＴＥ　（ ＯＭｅ＞−ＣＨｏを、セライトを通して濾過し、高真空下でロータリーエバポレ ーションによって、濃縮して揮発性物質を除去し、そしてＣ＋５−ＨＰＬＣで精 製した。このペプチドの構造は、’　Ｈ−ＮＭＲおよび質量分析法で確認した（ 計算値Ｍ＋Ｈ＝　６８７Ｊ、実測値＝　６８７．４）。

Ｂ、　Ａｃ−ＬＲＴＥ　ＯＭｅ　−ＣＩＯＡｃ−Ｔ（ｔ−Ｂｕ）ＰＬＳ（ｔ−Ｂ ｕ）Ｔ（ｔ−Ｂｕ）−０Ｈの代わりにＡｃ−ＬＲ（Ｐｍｃ）Ｔ（ｔ−Ｂｕ）−０ ）１を用いて、化合物Ａｃ−ＬＲＴＥ　（ＯＭｅ）−ＣＨＯを上記のＡ部分の化 合物と同様に調製した。生成物の構造を、’　Ｈ−ＮＭＲおよび質量分析で確認 した（計算値Ｍ＋Ｈ＝　５５８．３．実測値＝５５８５）。

Ｃ０池９アンカニ 他のアンカリング基を有するインヒビターを、上述のように：ＡＬｌだ。このと き、アルデヒドを標準化学技法によって改変した。例えば、−Ｃ）１０基はアミ ドに転換され、続いて脱水（例えば５ＯＣ１２を用いる）されて、ニトリルが得 られ得る。

α−ケトエステルは、アルデヒドをＫＣＮと処理してα−ヒドロキシ酸を形成し 、続いてエステル化することによって調製される。ジアゾメチルケト類似体は、 アルデヒドをアシル／％ライドに転換し、続いてジアゾメタンと反応させること によって、調製される。チオセミカルバゾンは、アルデヒドから単純添加によっ て、調製される。ノ１０メチルケト基は、Ｊ　ＭｅｄＣｈｅｍ、　Ｈ屈：　３９ ４−４０７頁（１９９０年）に記載された方法に従って調製される。

Ｌ血珂１ （グルタメートジアルキルアミンアルデヒドインヒビターの市販のｔ−Ｂｏａ− グルタメートα−０−ベンジルエステル（３ｇ）を、トリエチルアミン（１，１ 当量、Ｉｇ）の存在下、２時間室温で、ジメチルアミン・ＨＣＩ（２当量、１． ４６ｇ）およびＢＯＰ（１゜１当量、４．３３ｇ）と混合して、ｔ−Ｂｏｃ−グ ルタメート−ａ−０−ベンジル−χ−ジメチルアミドを得た。Ｍｅａｎ　（１９ ｍＬ）およびＨＯＡｃ　（１ｍＬ）中でＰｄ　（０，６９ｇ）上で水素添加分解 により、ベンジル基を除去して、ｔ−Ｂｏｃ−グルタメートγ−ジメチルアミド を得た。

１当量のｔ−Ｂｏｃ−グルタメートγ−ジメチルアミド（２００ｍｇ）を、トリ エチルアミン（３，６当量、２６６　Ｉｌｇ）およびＤＭＡＰ　（０，１当量、 ９　Ｂ）の存在下、ＥｔＳ）ｌ　（１０当量、４４０　Ｉｌｇ）およびエチルク ロロホルメート（３，６当量、２８５　ｍｇ）　と、１時間、０°Ｃで処理し、 続いてＴＦＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液（２５％、１００　ｍＬ）を用いて３０分間室 温で、ｔ−Ｂｏａ基を除去して、ｔ−Ｂｏｃ−グルタメートグージメチルアミド チオエステルを得た。

）１０Ｂｔ　（３当量、８５　ｍｇ）およびＢＯＰ（３当量、２７８　ｍｇ）を 用いて、Ａｃ−ＬＲ（Ｐｍｃ）Ｔ（ｔ−Ｂｕ）−０Ｈ（１７０Ｂ）を、ｔ−Ｂｏ ａ−グルタメートグージメチルアミドチオエステル（３当量、１３７１ｇ）ニ結 合した。Ｐｍｃおよびｔ−ブチル保護基を、ペプチド（５０ｍｇ）を５Ｏ％ＴＦ ＡのＣＨ２Ｃｌ２溶液（１００■Ｌ）で２時間室温で処理することによって、除 去し、ペプチドチオエステルを得た。次に、この２　■ｇを無水アセトン（１曽 Ｌ）中のトリエチルシラン（２０当量、７０　ｍｇ）およびＰｄ（０，６当量、 １６　ｍｕｇ）と１時間室温で処理することによって、還元してアルデヒドにし た。この粗生成物をセライトを通して濾過し、ロータリー二バポレーションによ り濃縮し、そしてＣ＋　５−ＨＰＬＣによって精製した。この生成物の構造、Ａ ｃ−ＬＲＴＥ　（ＮＭｅ２）−ＣＩＯを’　Ｈ−ＮＭＲおよび質量分析で確認し た（計算値Ｍ＋Ｅ・５７１．３．実測値＝　５７１．３）Ｌ血史−１ （プロテアーゼ阻害を示す実験） 実施例１および２で調製されたインヒビターのＨＡＹ　３Ｃプロテアーゼの阻害 のためのアッセイを、９６−ウェルマイクロタイタープレート上で行った。

０．６ｍＭ　アリコートのインヒビターを８つの６３μＬ　反応緩衝溶液（６■ Ｍクエン酸ナトリウム、９４ｍＭリン酸ナトリウム、２１Ｍ　ＥＤＴＡ、　３． ５１Ｍ基質ＬＩＩＴＥＳＦＳＳＰＨ７，６）に加えて、６０．２０、６．０．２ ．０．０．６．０．２．０．０６．および０．０２ＭＭ　の濃度のインヒビター を有する最終反応液容量８０μＬを得た。８μＬの精製　ＨＡＹ　３Ｃプロテア ーゼ（３，７ＨＭ）を加えて、反応を開始させ、室温でインキュベートした。８ μＬアリコートを各反応バイアルからマイクロタイタープレートウェルの中の５ ０μＬの停止溶液（０，２４Ｍホウ酸塩、０．１２５　Ｍ　Ｎａ０Ｈ）中に５分 間隔で移して、基質の開裂を止めた。

基質の開裂の程度を、得られた遊離のアミンとＴＮＢＳ　（）リニトロベンゼン 　スルホネート）との反応により決定した。

ホウ酸塩（０，２５Ｍ）中のＴＮＢＳ　（１０μＬ、３５　＋＊ｇ／■Ｌ）を各 ウェルに加えて２０分間インキコベートした。得られた黄色の生成物に２２５μ Ｌの亜硫酸ナトリウム（１９ｍｇ１５０　ｍＬ、０．４　Ｍ　Ｉ［Ｈ２ＰＯａ） を加えて安定化した。得られた溶液の吸光度は４０５ｎｍであった。

結果を以下の図１および表１に示す： 表土： 化合ｔ　氏注ユＬ料 Ａｃ−ＬＲＴＥ　（ＯＭｅ）　−ＣＨｏ　０．３Ａｃ−ＴＰＬＳＴＥ（ＯＭｅ） −ＣＩＯ０，３Ａｃ−ＬＲＴＱ（ＮＭｅ２）−ＣＨＯ０，３Ｉ　ｐＭ

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．選択されたプロテアーゼのタンパク質分解活性を特異的に阻害するのに有用 な式Ｉの化合物：▲数式、化学式、表等があります▼式Ｉここで、Ｒ１は、−Ｏ Ｒ３または−ＮＲ３Ｒ４であり、ここでＲ３は低級アルキル、ヒドロキシ、低級 アルコキシ、またはアリール−低級アルキルであり、そしてＲ４は、Ｈまたは低 級アルキルであり； Ｒ２は、Ｈまたは低級アシルであり； ｎは、２から４０までを含む整数であり；Ｘは、−ＣＨＯ、−Ｃ≡Ｎ、−ＣＯＣ Ｈ２Ｆ、−ＣＯＣＨ２Ｃｌ、−ＣＯＣＨ２Ｎ２、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｓ）Ｎ Ｈ２、または−ＣＯＣＯＲ５（ここでＲ５は、低級アルキル、低級アルコキシ、 低級アリール、アリール−低級アルキル、またはアリール−低級アルコキシであ る）からなる群から選択されるアンカー基であり；そして ａａは、アミノ酸を示し；ここで、（ａａ）ｎは、該選択されたプロテアーゼに より認識されるアミノ酸配列である。
2. ２．Ｒ１が−ＯＲ３である、請求項１に記載の化合物。
3. ３．Ｒ３がメチルである、請求項２に記載の化合物。
4. ４．Ｒ２がエチルである、請求項２に記載の化合物。
5. ５．Ｒ２がアセチルである、請求項１に記載の化合物。
6. ６．（ａａ）ｎがＬｅｕ−Ａｒｇ−Ｔｈｒを含む、請求項１に記載の化合物。
7. ７．（ａａ）ｎがＴｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒを含む、請求項１に 記載の化合物。
8. ８．以下を含有する、ウイルス感染を治療するための組成物： 有効量の式Ｉの化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼式Ｉここで、Ｒ１は、−ＯＲ３または−ＮＲ ３Ｒ４であり、ここでＲ３は低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、また はアリール−低級アルキルであり、そしてＲ４は、Ｈまたは低級アルキルであり ； Ｒ２は、Ｈまたは低級アシルであり； ｎは、２から４０までを含む整数であり；Ｘは、−ＣＨＯ、−Ｃ≡Ｎ、−ＣＯＣ Ｈ２Ｆ、−ＣＯＣＨ２Ｃｌ、−ＣＯＣＨ２Ｎ２、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｓ）Ｎ Ｈ２、または−ＣＯＣＯＲ５（ここでＲ５は、低級アルキル、低級アルコキシ、 低級アリール、アリール−低級アルキル、またはアリール−低級アルコキシであ る）からなる群から選択されるアンカー基であり；そして ａａは、アミノ酸を示し；ここで、（ａａ）ｎは、該選択されたプロテアーゼに より特異的に認識されるアミノ酸配列である；および 薬学的に受容可能な賦形剤。
9. ９．ウイルス感染の被検体を治療する方法であって、該ウイルスがシステインプ ロテアーゼを含有し、該工程は以下の工程を包含する； 該被験体に有効量の式Ｉの化合物を投与する工程；▲数式、化学式、表等があり ます▼式Ｉここで、Ｒ１は、−ＯＲ３または−ＮＲ３Ｒ４であり、ここでＲ３は 低級アルキル、ヒドロキシ、低級アルコキシ、またはアリール−低級アルキルで あり、そしてＲ４は、Ｈまたは低級アルキルであり； Ｒ２は、Ｈまたは低級アシルであり； ｎは、２から４０までを含む整数であり；Ｘは、−ＣＨＯ、−Ｃ≡Ｎ、−ＣＯＣ Ｈ２Ｆ、−ＣＯＣＨ２Ｃｌ、−ＣＯＣＨ２Ｎ２、−ＣＨ＝Ｎ−ＮＨＣ（＝Ｓ）Ｎ Ｈ２、または−ＣＯＣＯＲ５（ここでＲ５は、低級アルキル、低級アルコキシ、 低級アリール、アリール−低級アルキル、またはアリール−低級アルコキシであ る）からなる群から選択されるアンカー基であり；そして ａａは、アミノ酸を示し；ここで、（ａａ）ｎは、該選択されたプロテアーゼに より特異的に認識されるアミノ酸配列である。
10. １０．上記ウイルスが、Ａ型肝炎ウイルスである、請求項９に記載の方法。
11. １１．上記ウイルスが、ポリオウイルスである、請求項９に記載の方法。
12. １２．上記ウイルスが、リソウイルスである、請求項９に記載の方法。
13. １３．上記ウイルスが、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、エンテロウイ ルス、脳心筋炎ウイルス、および口蹄疫ウイルスからなる群から選択される、請 求項９に記載の方法。