JPH0653079B2

JPH0653079B2 - 尿素の酵素的測定法

Info

Publication number: JPH0653079B2
Application number: JP3624186A
Authority: JP
Inventors: 律子中村; 俊郎菊地; 重典愛水
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1986-02-20
Filing date: 1986-02-20
Publication date: 1994-07-20
Anticipated expiration: 2009-07-20
Also published as: JPS62195298A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は一般に診断様測定法、さらに詳しくは液体、特
に血液及び尿中の尿素を定量的に測定する方法に関す
る。

（従来の技術）尿素はヒト及び他の哺乳動物における蛋白質代謝の主な
最終生成物である。この生成物は肝臓中で形成され、血
液中に入り、腎臓を通って尿中に排泄され、尿中で存在
する有機物質の主成分の一つである。窒素血症と言われ
る血中尿素が過剰に存在する状態はほとんど常に腎臓機
能を損なう。血中尿素測定は最も普通に行われる臨床化
学試験の一つである。尿素「クリアランス」又は腎臓に
よる血液からの尿素の除去率は尿中の尿素濃度によって
測定され、糸球体過速度の尺度として使用される。

生物学的液体中の尿素濃度を測定するため使用される常
用の臨床化学的方法は測定しうる色原体を形成しうる適
当な試薬と尿素との縮合による直接法、又は尿素に対し
てウレアーゼを作用させて生じる生成物としてのアンモ
ニアの測定による間接法として分類される。

ジアセチルモノオキシムを使用する直接法は人為操作及
び自動操作により通常の臨床化学に広く適用されてき
た。しかし、シトルリン、アラントイン及び他の体液成
分との妨害反応により特異性に問題があること、又、感
光性により色が急速に消失することなど多くの欠点を有
する。

間接法は下記の式によるウレアーゼ（尿素アミドヒドロ
ラーゼ、ＥＣ３．５．１．５）による尿素のアンモニア
への酵素変換に基づくものである。その中で最も普及し
ている方法はアンモニアイオンがアルカリ性媒体中でフ
ェノール及び次亜塩素酸と反応して青色染料であるイン
ドフェノールを生成するベルテロート（Berthelot）反
応に基づくものである。

一方、紫外部にて測定する方法グルタメートデヒトロゲ
ナーゼ法も使用されている。その方法では式：により、ウレアーゼとの酵素反応から誘導されるアンモ
ニアイオンを酵素であるグルタメートデヒドロゲナーゼ
（GlDHと略する）で測定し、還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨと略する）の吸光度の低
下を３４０nm付近の波長で測定する方法である。

最近、特開昭60-54699号公報では尿素アミドリアーゼ、
ピルビン酸キナーゼ、ピルビン酸オキシダーゼを用いる
尿素の測定法が報告されている。該方法は式：により、尿素を測定する方法である。この方法は尿素ア
ミドリアーゼ中のＡＴＰ分解酵素（ＡＴＰアーゼと略す
る）の除去が問題となり臨床検査薬の分野で実施に到っ
ていない。

尿素アミドリアーゼはＥＣ３．５．１．４５のことであ
り、さらに前段酵素、ウレア：二酸化炭素リガーゼＥＣ
６．３．４．６）と後段酵素、アロファネートアミドハ
イドロラーゼに分けられる。

しかしながら、尿素アミドリアーゼは副反応として、Ａ
ＴＰアーゼ活性も有しており、上述の組成系では呈色が
安定せず、自然増色する結果となる。つまり、尿素アミ
ドリアーゼの副反応であるＡＴＰアーゼによりＡＴＰが
ＡＤＰに非共軛的に分解され、さらに生成したＡＤＰが
ホスホエノールピルべートの存在下ピルビン酸キナーゼ
によりピルビン酸に変換する。さらに生成したピルビン
酸はピルビン酸オキシダーゼにより過酸化水素を生成
し、発色指示薬を呈色させることになる。反応式で示す
と下記の通りである。

つまり、(1)の反応は(1)′の副反応を伴なうので、徐々
に増色する現象が起こり実際上試薬ブランクが増色し、
正確な測定値を得ることが出来ない。

（問題点を解決するための手段）本発明者らはこの副反応を如何にしたら防止、又は軽減
させることが出来るか種々検討した結果、本発明に到達
することが出来た。

すなわち本発明は液体試料中の尿素にアデノシン３リン
酸、重炭酸塩、２価陽イオン、１価陽イオン及びアルコ
ール類の存在下、尿素アミドリアーゼを作用させ、生成
するアデノシン２リン酸、無機リンまたはアンモニアを
測定することを特徴とする尿素を酵素的に測定する方法
である。

生成するアデノシン２リン酸を測定する系においては、
更にホスホエノールピルペート、チアミンピロリン酸及
び発色指示薬の存在下、ピルビン酸キナーゼ及びピルビ
ン酸オキシダーゼを作用させることにより発色させ光学
的に測定する方法である。又、生成するアデノシン２リ
ン酸を測定する系は、ホスホエノールピルべート、ニコ
チンアミドアデニンジホスフェート（ＮＡＤ）の存在
下、ピルビン酸キナーゼ及び乳酸デヒドロケナーゼを作
用させ、還元型ニコチンアミドアデニンジホスフェート
（ＮＡＤＨ）の生成を光学的に測定する方法もある。

生成した無機リンを測定する系においては更にピルビン
酸、チアミンピロリン酸及び発色指示薬の存在下、ピル
ビン酸オキシダーゼを作用させることにより発色させ光
学的に測定する方法である。

尿素アミドリアーゼは種々の微生物から得られる。調製
法はジャーナルオブバイオロジカルケミストリー(Journ
al of Biological Chemistry)294,4107-4113,(1972)を
参考にした。

尿素アミドリアーゼの使用量は0.01〜10u／mlで好まし
くは0.1〜0.3u／mlである。他の酵素類は市販品を使用
出来る。

２価の陽イオンとして、Mg⁺⁺又はMn⁺⁺を使用しうるが、
Mg⁺⁺が好ましい。１価陽イオンはＫ^＋、NH₄ ⁺、Ｒｂ^＋又
はＣｓ^＋の群から選択される。Ｋ^＋が好ましい。重炭酸
イオン源として任意の適切な可溶性の重炭酸塩、例えば
アルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩を使用すること
が出来る。重炭酸ナトリウム又はカリウムが好ましい。
濃度は0.1〜１００ｍＭ好ましくは１〜５０ｍＭ。

発色指示薬系は過酸化水素とペルオキシダーゼを介して
発色する物質を言い、例えば０−ジアニシジン、ロイコ
染料、４−アミノアンチピリン、３−メチルベンゾチア
ゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）及びフェノール又はそ
の誘導体を言う。

アルコール類の添加は尿素アミドリアーゼと高濃度に接
触させたのち、すぐに利用する方法が一番有効である
が、添加順序は問わない。

本発明で使用するアルコール類とは脂肪族低級一価アル
コールであり、メチルアルコール、エチルアルコール、
ｎ−プロピルアルコール、ｎ−ブチルアルコール、アリ
ルアルコール、アルミアルコールなどやそれらの誘導体
をいう。添加濃度は0.01〜５０％（Ｖ／Ｖ）であり、好
ましくは１〜２０％（Ｖ／Ｖ）である。

（発明の効果）上記測定系にアルコール類を含有させることにより、意
外にも副反応のＡＴＰアーゼのみが抑制され、尿素アミ
ドリアーゼの活性には殆んど影響がなかった。

これは、実際の利用面で非常に有効な手段となる。つま
り、試薬の混合液の自然発色が抑制されることにより、
用手法においても、自動分析機への適用においても経時
的変化を苦慮する必要がなく、尿素の正確な測定が出来
る様になる。

（実施例）以下、実施例を用いて本発明を説明する。

実施例１下記の組成の反応混液を調製した。

トリス塩酸緩衝液（pH7.5）５０ｍＭＫＨＣＯ_３１０ｍＭＭｇＳＯ_４１０ｍＭホスホエノールピルべート 1.5ｍＭチアミンピロリン酸 0.5ｍＭ４−アミノアンチピリン 0.01％フェノール 0.02％リン酸１ｍＭＦＡＤ１０μＭＡＴＰ 2.0ｍＭペルオキシダーゼ５ｕ／ml ピルベートキナーゼ３ｕ／ml ピルベートオキシダーゼ３ｕ／ml 上記反応混液2.5mlに尿素溶液0.2ml（最終0.17ｍＭ）を
加えた後、３７℃、５分間予備加温した。なおブランク
（盲検）は尿素溶液の代りに蒸留水とした。

次いで尿素アミドリアーゼ溶液（１５％エチルアルコー
ル添加又は無添加）0.3ml（最終0.1u／ml）を加え、３
７℃、３０分間反応させ、分光光度計の５００nmの波長
で吸光度を経時的に記録した。その結果を第１図に示
す。尿素アミドリアーゼ溶液に１５％エチルアルコール
を加えている方が呈色安定性は無添加に比べ著しく優れ
ていた。

実施例２実施例１の反応溶液2.5mlにエチルアルコールを0.3ml
（最終１０％）を加え、引き続き尿素溶液0.1ml（最終
0.17ｍＭ）を加えた後、３７℃、５分間予備加温した。
ブランクは尿素溶液の代りに蒸留水とした。尿素アミド
リアーゼ溶液0.1ml（最終0.1u／ml）を加え、３７℃、
３０分間反応させ、その間分光光度計の５００nmの波長
で吸光度を経時的に記録した。その結果を第２図に示
す。呈色安定性はエチルアルコール無添加に比べ添加し
た方が著しく優れていた。

実施例３下記の組成の反応混液を調製した。

トリス塩酸緩衝液pH7.5 ５０ｍＭＫＨＣＯ_３１０ｍＭＭｇＳＯ_４１０ｍＭピルビン酸ナトリウム５ｍＭチアミンピロリン酸 0.5ｍＭ４−アミノアンチピリン 0.01 フェノール 0.02 ＦＡＤ１０μＭＡＴＰ 2.0ｍＭペルオキシダーゼ５ｕ／ml ピルベートオキシダーゼ３ｕ／ml 上記反応混液2.5mlに尿素溶液0.2ml（最終0.17ｍＭ）を
加えた後、３７℃、５分間予備加温した。なお、ブラン
クは尿素溶液の代りに蒸留水とした。尿素アミドリアー
ゼ溶液（１５％エチルアルコール添加又は無添加）0.3m
l（最終0.1u／ml）を加え、３７℃、３０分間反応さ
せ、その間分光光度計の５００nmの波長で吸光度を経時
的に記録した。その結果を第３図に示す。呈色安定性は
エチルアルコール無添加に比べ添加した方が著しく優れ
ていた。

実施例４実施例１で示した反応混液2.5mlに尿素溶液0.2ml（最終
0.17ｍＭ）を加えた後、３７℃、５分間予備加温した。
なお、ブランクは尿素溶液の代りに蒸留水とした。尿素
アミドリアーゼ溶液（各アルコール：濃度１５％）0.3m
l（最終0.1u／ml）を加え、３７℃、３０分間反応さ
せ、その分光光度計の５００nmの波長で吸光度を読ん
だ。その結果を第１表に示す。エチルアルコール、メチ
ルアルコールで特に効果があった。

実施例５実施例１で示した反応混液2.5mlに尿素溶液0.2ml（最終
0.17ｍＭ）を加えた後、３７℃、５分間予備加温した。
なお、ブランクは尿素溶液の代りに蒸留水とした。尿素
アミドリアーゼ溶液（エチルアルコール各濃度）0.3ml
（最終0.1u／ml）を加え、３７℃、３０分間反応させた
のち、分光光度計の５００nmの波長で吸光度を読んだ、
その結果を第４図に示す。１４〜１８％の濃度が最も有
効であった。

実施例６実施例１で示した反応混液2.6ml人血清0.1mlを加えた
後、３７℃、５分間予備加温した。なお、ブランクは人
血清の代りに蒸留水とした。尿素アミドリアーゼ溶液
（１５％エタノール含有）0.3ml（最終0.1u／ml）を加
え、３７℃、３０分間反応させ、分光光度計の５００nm
の波長で吸光度を経時的に記録した。その結果を第５図
に示す。エタノール無添加に比べ呈色安定性は添加した
方が著しく優れていた。

【図面の簡単な説明】

第１図〜第４図は尿素溶液を加えた反応混液に尿素アミ
ドリアーゼ溶液を加えた場合の呈色安定性を示す。第５図は人血清を加えた反応混液に尿素アミドリアーゼ
溶液を加えた場合の呈色安定性を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】液体試料中の尿素にアデノシン３リン酸、
重炭酸塩、２価陽イオン、１価陽イオンおよび低級アル
コールの存在下、尿素アミドリアーゼを作用させ、生成
するアデノシン２リン酸、無機リンまたはアンモニアを
測定することを特徴とする尿素の酵素的測定法。
【請求項２】生成するアデノシン２リン酸をホスホエノ
ールピルベート、チアミンピロリン酸および発色指示薬
の存在下、ピルビン酸キナーゼおよびピルビン酸オキシ
ダーゼを作用させることにより、発色させ、光学的に測
定することを特徴とする特許請求項第１項記載の尿素の
酵素的測定法。
【請求項３】生成する無機リンをピルビン酸、チアミン
ピロリン酸および発色指示薬の存在下、ピルビン酸オキ
シダーゼを作用することにより発色させ、光学的に測定
することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の尿素
の酵素的測定法。