JPH0655084A

JPH0655084A - 免疫測定用反応容器

Info

Publication number: JPH0655084A
Application number: JP20992692A
Authority: JP
Inventors: Akihiro Nanba; 昭宏南波; Takeo Takahashi; 威夫高橋
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 1992-08-06
Filing date: 1992-08-06
Publication date: 1994-03-01

Abstract

(57)【要約】【目的】比較的少ないサンプルおよび試薬を用いて、よ
り高感度でかつ効率よく免疫測定を行うことができる免
疫測定用反応容器を提供する。【構成】免疫測定用反応容器は、反応部１２と複数の反
応部１２を保持する移動体からなる。反応部１２は、２
枚の平板部２１，２２を、平板部２１，２２の両縁部に
配置された２つのスペーサー部２３，２４を介して互い
に対面させて、毛管現象によりサンプルおよび試薬を吸
引および保持し得る間隙２５が形成されてなる。反応部
１２は、平板部２１に対面するように移動体に保持され
て移動させられる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、免疫測定用反応容器に
関する。

【０００２】

【従来の技術】従来、免疫測定用反応容器としては、例
えば、米国特許 4,303,616号に記載されているようなマ
イクロプレ−トが用いられている。マイクロプレートを
用いた免疫測定は、まず、ウエル底部に、測定しようと
する抗体に対応する抗原、抗原に対応する抗体を固相化
した後、測定しようとする抗体または抗原を含むサンプ
ルを添加して、抗原抗体反応を起こさせる。ついで、標
識抗原または標識抗体を添加し、Ｂ／Ｆ分離を行った
後、基質液を添加して、酵素基質反応を起こさせて、こ
のとき発生する酵素活性を測定することにより抗原また
は抗体を定量する。

【０００３】酵素活性の測定は、一般に、発光基質また
は発色基質を用いて、酵素標識抗体と基質との酵素基質
反応を捉えることにより行なうことができる。化学的に
発光する発光基質を用いる場合には、ウエルの開放部の
上方に光受容器（例えば、フォトマルチプライヤー等）
を設置して、反応部からの化学発光の強度を測定する。
また、化学的に発色する発色基質を用いる場合には、免
疫反応を行ったサンプルの吸光度を測定して行なうこと
ができる。

【０００４】また、免疫測定用反応容器としては、特開
昭第６２−１６９０５４号公報および特開昭６２−１６
９０５５号公報には、内径が２mm以下の細管状の形状か
らなる反応容器を用い、内壁に抗原又は抗体を固相化し
て、また、細管内に抗原又は抗体を固相化した粒子を入
れ、抗原又は抗体を含むサンプルを加え、抗原抗体反応
を起こさせることにより免疫測定を行なうことが記載さ
れている。

【０００５】また、本出願人は、２枚の平板の間隙に、
毛管現象によってサンプルを吸引・保持できるサンプル
導入路および反応部が形成された、免疫学的な凝集反応
を利用して免疫測定を行う反応容器を提案している（特
願平２−４１８９７８号および特願平２−４１８９７９
号）。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述の
マイクロプレートでは、ウエルの底部に、被測定物質に
対応した抗体または抗原（以下、特異的反応物質と記
す）を固相化している。免疫反応が起こるためには、被
測定物質と特異的反応物質が互いに出会うことが必要で
ある。しかし、マイクロプレートでは、特異的反応物質
がウエル底部だけに固相化されているため、サンプルの
上方に浮遊している被測定物質は、特異的反応物質と結
合する可能性が低い。このため、インキュベーションの
時間を長くする必要がある。また、測定に必要なサンプ
ルや試薬も余分に消費する。

【０００７】また、酵素活性を化学発光を測定して捉え
る場合に、化学発光の発光強度は弱いため、光検出器を
サンプルの液面にできる限り近づけて測定感度を向上さ
せる必要がある。しかし、マイクロプレートでは、構造
の都合上、光検出器をあまり液面すれすれに近づけるこ
とができず、高感度な測定を達成できない。

【０００８】また、上述の細管状の免疫測定用反応容器
は、特異的反応物質を内壁面に固相化した場合に、内径
が比較的小さいので、被測定物質と特異的反応物質が出
会う機会が増大し、サンプルや試薬の使用量を低減でき
る点では優れている。しかし、化学発光の発光強度を光
検出器によって測定する場合に、反応容器の内径が２mm
以下であり、発光が起きているサンプルの表面積に対し
て光検出器の受光面が大きすぎる。このため、測定信号
に対してノイズを多く拾ってしまい、Ｓ／Ｎが著しく低
下して、高感度な免疫測定を行なうことができない。

【０００９】さらに、上述の免疫学的な凝集反応を利用
した免疫測定に用いる免疫測定用反応容器では、凝集反
応により生じた粒子を沈殿させるのに必要な時間を短縮
させるために反応部の面積を狭くしている。しかし、反
応部の面積を狭くすることは、このような反応容器を化
学発光を利用した免疫測定に用いた場合には測定感度を
低くするため好ましくない。また、マイクロプレートや
細管状の反応容器は構造上洗浄が困難であり、洗浄に特
別な洗浄器が必要である。以上、化学発光を測定して免
疫測定を行う場合について説明したが、従来の免疫測定
において発色反応を利用して免疫測定を行う場合にも同
様の問題がある。

【００１０】本発明は、かかる点に鑑みてなされたもの
であり、比較的少ないサンプルおよび試薬を用いて、よ
り高感度でかつ効率よく免疫測定を行うことができる免
疫測定用反応容器を提供するものである。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、サンプル中の
被測定物質と特異的反応物質との反応を測定するための
免疫測定用反応容器であって、２枚の平板部を該平板部
の両縁部に配置された２つのスペーサー部を介して互い
に対面させて、毛管現象により前記サンプルおよび試薬
を吸引および保持し得る間隙が形成されてなる反応部
と、前記反応部を一方の平板部に対面するように保持
し、前記反応部を移動させる移動体とを具備することを
特徴とする免疫測定用反応容器を提供する。ここで、移
動体は、反応部の移動方向と異なる方向に該反応部の開
放端部が位置するように前記反応部を保持することが好
ましい。

【００１２】また、移動体は、無端状に形成された反応
ラインに沿って前記反応部を移動させ、前記反応部内を
透過した光が前記反応ラインの内側に導かれるよう構成
されていることが好ましい。

【００１３】

【作用】本発明の免疫測定用容器によれば、２枚の平板
部および２つのスペーサー部によって、比較的薄くかつ
広い平板状の反応部が構成されている。これにより、反
応部の内部で起きた化学発光および化学発色を光透過性
の平板部を介して測定できる。このため、光検出器の受
光面を平板部に比較的近くに配置できるので、少量のサ
ンプルでも十分な受光量または透過光量が得られる。ま
た、光検出器の受光面と平板部の面積を適合させること
ができるのでＳ／Ｎを高くできる。

【００１４】また、間隙の厚さが極めて薄いので、反応
容器の内壁面に特異的反応物質を固相化した場合にサン
プル中の被測定物質と特異的反応物質とが接触する機会
が増大し、免疫学的反応を短時間で行わせることができ
る。また、サンプルや試薬を毛管現象により反応部の内
部に吸引および保持しているので、サンプル等の供給や
反応部の洗浄を容易に行なうことができる。また、反応
部を移動体に保持させているので、免疫測定の自動化が
より容易になる。

【００１５】

【実施例】以下、本発明の実施例を図面を参照して詳細
に説明する。

【００１６】図１は、本発明の免疫測定用反応容器の一
例を示す説明図である。図中１１は、略長方体状の移動
体である。移動体１１は、長手方向に沿って移動自在で
ある。移動体１１の側面部には、６個の反応部１２が所
定の間隔をおいて保持されている。

【００１７】反応部１２は、図２に示すように、略長方
形状の２枚の平板部２１，２２を、両縁部に配置された
略角柱状のスペーサー部２３，２４を介して、互いに主
面が向き合うように略平行に配置してなる。平板部２
１，２２およびスペーサー部２３，２４は、例えば接着
剤で互いに接着されている。このような構成により、反
応部１２の内部には間隙２５が形成されている。

【００１８】ここで、平板部２１，２２の大きさおよび
間隔は、サンプルや試薬が毛管現象によって間隙２５を
効率よく移動するように設定される。平板部２１，２２
の大きさは、一片が１０〜５０mmの範囲内が好ましく、
１０〜３０mmの範囲内が特に好ましい。また、平板部２
１，２２の間隔は、例えば、０．１〜１mmの範囲内が好
ましい。本実施例では、反応部１２として、平板部２
１、２２が２５mm×２５mm×１mmであり、それらの間隔
が０．３mmである反応部を使用した。このような反応部
１２の上方の開放端部１２ａに、サンプルや試薬をピペ
ット等で供給すると、毛管現象によってサンプル等が間
隙２５に吸引・保持される。

【００１９】反応部の変形例としては、図３（Ａ）に示
すように平板部およびスペーサー部を一体に成形した反
応部３１や、図３（Ｂ）に示すように平板部の下側が半
円形にした反応部３２を例示することができる。特に、
後者は、通常円形となっている光検出器の受光面の形状
とよく適合し、効率良く発光の検出を行なうことができ
る。さらに、図４に示すように、反応部４１の端部の両
縁部に、足部４２，４３を夫々取り付けても良い。反応
部４１は、測定操作中に足部４２，４３を下にして作業
台等の上に載置することにより、反応部４１の端部を作
業台から浮かせて載置できるので、間隙に保持させたサ
ンプルや試薬が流れ出ることがない。

【００２０】また、免疫測定を化学発光を測定すること
により行う場合、平板部２１，２２の少なくとも一方
は、例えば、ガラス、ポリスチレン、塩化ビニルのよう
な光透過性材料で構成される。また、発光の測定感度を
より高めるために、他方の平板部を、例えばアルミニウ
ムのような光反射性材料で構成するか、他方の平板部の
外面または内面に、例えばアルミニウム等を蒸着させる
ことが好ましい。さらに、複数のサンプルまたは測定項
目を同時または連続して分析するために、複数の反応部
をスペ−サ−を挟んで連結したものを作製して使用して
も良い。

【００２１】上述のような反応部１２は、図５に示すよ
うに、平板部２１，２２の一方と移動体１１の主面とを
互いに向き合うようにして保持されている。反応部１２
の開放端部が、移動体１１の移動方向に対して略直角方
向を向くように保持されるている。

【００２２】この際、上述のように平板部２１，２２の
いずれかが光反射性材料で構成されているか、光反射性
材料が蒸着されている場合には、この光反射性の平板部
を移動体１１の主面とを互いに向き合わせ、光透過性の
平板部がフォトマルチプライヤー５１の方向を向くよう
に保持させる。

【００２３】移動体１１は、フォトマルチプライヤー５
１の受光面に対して、反応部１２の主面が略平行になる
ように配置され、移動体１１の長手方向に沿って移動
し、反応部１２を順次フォトマルチプライヤー５１の前
方の検出位置に移動させる。

【００２４】反応部の保持は、図６（Ａ）に示すよう
に、非光透過性の移動体６１の所定領域に透光窓６２を
形成し、移動体６１の一方の主面に反応部６３を光反射
層６４を外側にして保持させ、移動体６１の他方の主面
側にフォトマルチプライヤー６５を配置することもでき
る。また、図６（Ｂ）に示すように、非光透過性の移動
体６６の所定領域に、光透過性材料からなる透光部６７
を設け、移動体６６の一方の主面に、光反射層６９を有
する平板部６８を、光反射層６９を外側にし、かつ、透
光部６７から所定の間隔をおいて平板部６８と透光部６
７の間に毛管現象によりサンプル等を吸収・保持できる
間隙６８ａが形成されるように配置し、移動体６６の他
方の主面側にフォトマルチプライヤー６５を配置するこ
ともできる。この場合、平板部の一方を透光部６７で兼
用させるため、材料を節約することができる。なお、透
光窓６２および透光部６７は、フォトマルチプライヤー
６５の受光面の形状に相似した形状に形成されている。

【００２５】このように、反応部とフォトマルチプライ
ヤー６５とが移動体６１，６６を境にして反対側に設け
られている場合には、サンプルや試薬を反応部の上方の
開放端部６３ａ，６８ａに自動的に供給する場合に、サ
ンプルや試薬の供給手段の配置および動作がフォトマル
チプライヤー６５に邪魔されないで済む。次に、このよ
うな構成からなる免疫測定用反応容器１０を用いて、化
学発光反応による測定を実行した場合について説明す
る。

【００２６】まず、平板部２１，２２の内側表面に、抗
体または抗原のような特異的反応物質を物理吸着等によ
り固相化する。次に、反応部１２の内部にサンプルを注
入する。この後、インキュベーションを行ない、サンプ
ル中の被測定物質と特異的反応物質とを反応させて、被
測定物質を特異的反応物質に結合させる。次いで、緩衝
液で反応部１２の内部を洗浄する。

【００２７】洗浄後、酵素標識抗体または酵素標識抗原
を添加し、インキュベーションを行ない、再び緩衝液で
洗浄する。この後、化学発光基質を加えてインキュベー
ションを行なう。そして、酵素と化学発光基質との反応
による発光強度を測定する。発光強度の測定は、図７に
示す光検出装置７０により行う。すなわち、光検出器７
１（例えば、図５に示すフォトマルチプライヤー５１）
から得られる光電子パルスを増幅器７２で増幅した後、
ディスクリミネーター７３に通し、予めセットされた基
準電圧と比較し、あるレベルの範囲内のパルスを出力さ
せて、波高弁別する。そして、ディスクリミネーター７
３による出力パルスを波形整形回路７４に通して波形整
形を行ない、カウンター７５に導いてフォトン・カウン
トを行なう。そして、例えば１秒当たりのパルス数を計
数し、測定値として表示またはプリントする。ここで、
免疫測定用反応容器１０を、光検出装置７０に着脱自在
にして交換可能にする。

【００２８】化学発光によるアッセイは、移動体１１を
移動させて、順次、反応部１２を光検出器７１の前方に
移動し、各反応部１２に保持されたサンプルについて連
続的に行う。このようにして測定された発光強度は、被
測定物質の濃度に依存するため、サンプル中の被測定物
質の濃度を発光強度から定量的に求めることができる。

【００２９】上述の免疫測定方法に従って、各種濃度の
マウスＩｇＧ抗原を含有するサンプル１００μｌについ
て測定して得た検量線を図８に示す。ここで、２ステッ
プサンドイッチ法を用いた。また、標識試薬としては、
アルカリフォスフォターゼ標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体
を使用し、化学発光基質としては、ＡＭＰＰＤ（ジオキ
セタン誘導体）を用いた。また、抗原抗体反応を第１の
インキュベーションが６０分間、第２のインキュベーシ
ョンが６０分間、酵素基質反応を２０分間、夫々室温で
行なった。

【００３０】また、比較例として、同じサンプル１００
μｌについて、従来のマイクロ・タイタープレートを用
いた他は、本実施例と同様の方法でマウスＩｇＧ濃度を
測定して得た検量線を図９に示す。

【００３１】これらの結果から、免疫測定用反応容器１
０は、上述したような簡便な操作性を有し、効率の良い
分析が行える上に従来のマイクロプレートによる測定方
法と同等の感度が得られることが確認された。

【００３２】また、図１０に、免疫測定用反応容器１０
を使用して同様の測定条件で、ＨＢｓ抗原を測定した検
量線を示す。なお、ＨＢｓ抗原は、トリス緩衝液（ｐＨ
７．６）により種々の濃度に希釈した。固相用、標識用
の抗体は、いずれもマウス抗ヒトＨＢｓ抗体である。こ
の場合には、１〜１０ｎｇ／ｍｌの高感度な検出を実現
できることが確認された。

【００３３】以上説明しように、免疫測定反応容器１０
によれば、反応部１２の内部で起きた化学発光を平板部
２１，２２を介して測定できる。このため、光検出器７
１の受光面を平板部２１，２２に比較的近くに配置でき
るので、少量のサンプルでも十分な受光量または透過光
量が得られる。また、光検出器７１の受光面と平板部２
１, ２２の面積を適合させることができるのでＳ／Ｎを
高くできる。

【００３４】また、間隙の厚さが極めて薄いので、平板
部２１，２２の内側表面に特異的反応物質を固相化した
場合にサンプル中の被測定物質と特異的反応物質とが接
触する機会が増大し反応を短時間で行わせることができ
る。

【００３５】また、サンプルや試薬を毛管現象により反
応部１２の内部に吸引および保持しているので、サンプ
ル等の供給や反応部１２の洗浄を容易に行なうことがで
きる。さらに、反応部１２を移動体１１に保持させてい
るので免疫測定の自動化がより容易になる。

【００３６】次に、移動体の他の実施例について説明す
る。まず、図１１に示すように、略円筒形の移動体７６
であって、外側面に所定の間隔をおいて反応部７７を保
持するものが挙げられる。移動体７６は、中心軸を中心
として回転し、反応部７７を円周方向に移動させる。こ
の場合、上述のように移動体７６に透光窓や透光部を設
けて、移動体７６の内側にフォトマルチプライヤーを配
置することにより、装置全体を小型化できる利点があ
る。

【００３７】このような移動体７６を用いて、実際に、
サンプルを保持させた場合について説明する。ここで、
反応部７７としては、例えば、厚さ１mm、２５mm四方の
ポリスチレン製平板部を約０．３mmの間隔を設けて対向
させたものを使用した。サンプルとしては、トリス緩衝
液に０．３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加した
溶液（ｐＨ７．４）１００μｌを用いた。まず、サンプ
ルを滴着用ピペットを用いて反応部７７の上側の開放端
部に滴下して、サンプルを反応部７７に保持させた。こ
の後、移動体７６を徐々に回転数を上げながら回転させ
て、サンプルの保持状態を観察した。この結果、毎分１
５００回転までサンプルの飛散が発生しないことが判明
した。ただし、サンプルの保持能力は、平板部の材質や
間隙距離、移動体の傾斜角または移動速度によって異な
るので、これらの条件やサンプル等の供給手段や光検出
器の配置を適宜変更することが好ましい。

【００３８】また、図１２に示すように、無端帯状の移
動体８１であって、その外側面上に反応部８２を保持
し、かつ、反応部８２を横方向に移動させるものであっ
ても良い。この場合、移動体８２の開放端部８２ａ，８
２ｂが水平方向を向いているので、開放端部８２ａ，８
２ｂのどちらからでもサンプル等を供給できる。

【００３９】また、図１３に示すように、円盤状の移動
体９１であって、その周縁部に反応部９２を所定間隔で
配置したものでも良い。ここで、反応部９２の開放端部
は、夫々移動体９１の中心および外周を向くように配置
されている。移動体９１は、回転軸９３を中心として回
転し、反応部９２を円周方向に回転させる。この場合、
上方にマルチプライヤーを配置して受光することがで
き、上下方向に巾を取らない点で好ましいので、上方ま
たは下方のフォトマルチプライヤーを配置しても、さほ
ど装置を大型化しない。また、免疫反応測定用容器１０
に試料を分注する分注手段（図示せず）と光検出器を移
動体９１の上側または下側に夫々異なる方に配置すれ
ば、互いに動作を邪魔されないレイアウトに設定でき
る。

【００４０】このような図１３に示す構成では、まず、
比較的緩慢な速度、例えば１分当たり０．２〜２．０
回、移動体９１を回転させて、サンプルを分注する位置
において所定量のサンプル、試薬または洗浄液が分注手
段により各反応部９２に順次連続して分注される。次
に、所要時間インキュベートされた後、回転速度を上げ
て反応部９２の外周側の端部から排水して図示しない排
液収容部へ排液処理される。なお、図１３のように、反
応部９２を平板部が水平になるように配置した場合に
は、移動体９１の下側に配置して、分注手段のピペッタ
ーの先端部から反応部９２の隙間にサンプルを注入また
は点着することができる。さらに、移動体９１の上面お
よび下面を共に反射性表面とし、平板部を水平にした反
応部９２を上下両面に配列させれば処理能率が倍化す
る。

【００４１】さらに、図１４に示すように、円盤部１０
１の周縁に外側に傾斜した傾斜部１０２を設けてなる移
動体１００であって、傾斜部１０２の内面に反応部１０
３を放射状に配置したものでも良い。ここで、反応部１
０３の開放端部は、夫々移動体１００の中心および外周
を向くように配置されている。傾斜部１０２反応部１０
３に対応する領域には、透光領域１０４が形成されてい
る。透光領域１０４は、図６（Ａ），（Ｂ）に示す透光
窓６２や透過部６７のいずれであっても良い。また、傾
斜部１０２の傾斜角は、反応部１０３の内部に保持され
たサンプル等が液だれするのを防止するために、サンプ
ル等の重力と移動体１００の回転による遠心力の均衡が
保たれるように設定する。この場合、円盤部１０１の中
心に回転軸１０５を介して駆動手段１０６が接続され、
さらに駆動手段１０６に回転制御手段１０７が電気的に
接続される。また、傾斜部１０２の下方にマルチプライ
ヤー１０８が配置される。回転制御手段１０７により駆
動手段１０６を制御して、一定速度で移動体１００を回
転させて、マルチプライヤー１０８の受光面の上を反応
部１０２を順次通過させることができる。

【００４２】ここで、サンプルの保持状態はサンプルの
容量や粘度、平板部の間隔、傾斜部１０２の傾斜角によ
って異なるので、これらの条件やサンプル等の供給手段
や光検出手段の配置に応じて回転数を適宜変更すること
が好ましい。

【００４３】

【発明の効果】以上説明したように、本発明の免疫測定
用反応容器によれば、微量のサンプルや試薬を用いて、
高感度にかつ効率良く免疫測定を行うことができる。こ
れにより、例えば、患者から採取するサンプル量を少な
くできるので患者に与える苦痛も軽微にできる。特に乳
児から血液を採取する場合に好ましい。また、反応部を
移動体に保持させているので、免疫測定の自動化が容易
であるので、多量のサンプルを短時間で処理できる等効
果を奏する。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の免疫測定用反応容器の一例を示す説明
図。

【図２】同実施例の免疫測定用反応容器の反応部の一例
を示す説明図。

【図３】（Ａ）および（Ｂ）は反応部の他の実施例を示
す説明図。

【図４】反応部の他の実施例を示す説明図。

【図５】本発明の免疫測定用反応容器を用いた化学発光
の測定を示す説明図。

【図６】（Ａ）および（Ｂ）は、本発明の免疫測定用反
応容器を示す説明図。

【図７】本発明の免疫測定用反応容器を用いた免疫測定
に用いる光検出装置を示すブロック図。

【図８】本発明の免疫測定用反応容器を用いて求めたマ
ウスＩｇＧ抗原の検量線を示す特性図。

【図９】従来のマイクロプレートを用いて求めたマウス
ＩｇＧ抗原の検量線を示す特性図。

【図１０】本発明の免疫測定用反応容器を用いて求めた
ＨＢｓ抗原の検量線を示す特性図。

【図１１】本発明の免疫測定用反応容器の移動体の他の
実施例を示す説明図。

【図１２】本発明の免疫測定用反応容器の移動体の他の
実施例を示す説明図。

【図１３】本発明の免疫測定用反応容器の移動体の他の
実施例を示す説明図。

【図１４】本発明の免疫測定用反応容器の移動体の他の
実施例を示す説明図。

【符号の説明】

１０…免疫測定用反応容器、１１…移動体、１２…反応
部、２１，２２…平板部、２３，２４…スペーサー部、
２５…間隙。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】サンプル中の被測定物質と特異的反応物
質との反応を測定するための免疫測定用反応容器であっ
て、２枚の平板部を該平板部の両縁部に配置された２つ
のスペーサー部を介して互いに対面させて、毛管現象に
より前記サンプルおよび試薬を吸引および保持し得る間
隙が形成されてなる反応部と、前記反応部を一方の平板
部に対面するように保持し、前記反応部を移動させる移
動体とを具備することを特徴とする免疫測定用反応容
器。
【請求項２】移動体が、反応部の移動方向と異なる方
向に該反応部の開放端部が位置するように前記反応部を
保持することを特徴とする請求項１記載の免疫測定用反
応容器。
【請求項３】移動体が、無端状に形成された反応ライ
ンに沿って前記反応部を移動させ、前記反応部内を透過
した光が前記反応ラインの内側に導かれるよう構成され
ていることを特徴とする請求項１記載の免疫測定用反応
容器。