JPH0657147B2 - ヒトリンホカイン活性化キラー細胞の製法 - Google Patents

ヒトリンホカイン活性化キラー細胞の製法

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JPH0657147B2
JPH0657147B2 JP63101509A JP10150988A JPH0657147B2 JP H0657147 B2 JPH0657147 B2 JP H0657147B2 JP 63101509 A JP63101509 A JP 63101509A JP 10150988 A JP10150988 A JP 10150988A JP H0657147 B2 JPH0657147 B2 JP H0657147B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は養子免疫療法、特にかかる療法に用いられるヒ
トリンホカイン活性化キラー細胞を生体外で生成させる
方法に関する。
養子免疫療法は、或る形態の癌に対する臨床上有望な成
果を最近もたらしている。「Wall Street Journal」1987
年４月９日号及び「Time Magazine」1987年４月20日号に
おける記事を参照されたい。この療法には、患者から末
梢血液を取り出し、その血液から赤血球（RBC）を除去
して、リンパ球を含有する白血球（WBC）画分を得、こ
の血液画分をインターロイキン２（IL-2）とともに培養
基中でインキユベートして活性化されかつ腫瘍破壊性の
リンパ球（LAK細胞と呼ばれる）を生成させ、そしてこ
のLAK細胞及び付加的なIL-2を患者に注入することが包
含される。或る場合には、IL-2は、リンパ球の生成を刺
激せんがために、血液の取り出し前に患者に注入され
る。
養子免疫療法に対する一つの反対は、それが非常に高価
であることである。それが高価である一つの理由は、LA
K細胞を生成させる現在の操作が労力を要しそして時間
がかかることである。この操作は、ミユール（Muu1）ら
の「Journal of Immunological Methods」88：265〜275(1
986)：，Large scale prodnction of human lymphokine
activated killer cells for use in adoptive immuno
therapyに記載されている。ミユールらにより記載され
ているように、１回の治療に十分なLAK細胞を生成させ
るために約２×10個のリンパ球が末梢血液の１０回の連
続したロイカフエレシス（leukapheresis）により得ら
れた。各ロイカフエレシスにおいて、約10〜12の全血
を４時間かけて自動化細胞分離器で処理して400〜500ml
の白血球の画分を得た。この画分を２部の塩溶液で希釈
し、次に５０ml容の円錐形遠心分離管（４０ml／管、管
約30〜40本）に注入しそして１０mlのフイコール−ハイ
ペク（Ficoll-Hypaque）溶液を下に入れた。内容物を遠
心分離して、血小板に富む上澄み層、リンパ球に富む
層、フイコール−ハイペク層、顆粒球層及びRBC層に分
離させた。上澄み液を各管からとり出して捨てた。フイ
コール−ハイペク上に浮いているリンパ球に富む画分を
各管から取り出し、これらの画分を集め、塩溶液中に懸
濁させそして遠心分離することにより３回洗つた。これ
らの工程が各ロイカフエレシスについて繰返されねばな
らないので、300〜400本の管を１回の治療に取扱わねば
ならない。
ヘモネテイクス・コーポレーシヨン（Haemonetics Corp
oration）（マサチユーセツツ州ブレインツリー（Beain
tree））は、ヘモネテイクスV-50として知られている自
動化された血球分離器を市販しており、そこでは米国特
許第3,145,713号に記載されているボウルと同様の入口
２個を有する円錐形の遠心分離用ボウルが用いられてい
る。このV-50は、標準的なロイカフエレシス・プロトコ
ールに従つて又はサージ（Snrge）リンホサイトフエレ
シス（lymphocytopheresis）プロトコールに従つて操作
できる。米国特許第4,464,167及び4,416,654号に記載さ
れているような後者の操作には、予め分離された血漿を
用いる間欠的なエルトリエーシヨン（elutriation）が
包含され、そして標準的ロイカフエレシスにより達成さ
れうるよりも一層精密な血小板、WBC及びRBC画分が提供
されうる。これを以下エルトリエーシヨン・ロイカフエ
レシスと呼ぶ。
LAK細胞を得るための操作について、ヘモネテイクス社
は、主として血小板及びWBCよりなるバツフイ・コート
（Buffy coat）を分離するのにV-50を用い、次にこのバ
ツフイ・コートから単核性細胞（リンパ球及び単球）を
単離するために同じ遠心分離ボウル中でのフイコール−
ハイペク密度勾配を用いる二次分離を勧めている。この
操作はミユールらに記載された標準的フイコール遠心分
離よりも遥かに時間がかからずしかも労力を要しない
が、フイコール分離工程分のコストが付加されるしそし
てリンパ球の収量低下を生ずるので、該フイコール工程
を排除するのが望まれる。しかしLAK細胞を生成させる
のに使用できる程に十分にRBC及び顆粒球を含まないリ
ンパ球画分を得るためにはフイコール分離を行うことが
必須であるとこれ迄当業者には考えられてきた。RBC及
び顆粒球はリンパ球の活性化を不当に妨害するのではな
いかと考えられていた。
フイコール密度勾配遠心分離工程が、リンパ球活性化を
不当に妨害することなく排除できることを本発明者は見
出した。従つて本発明は、全血からRBCを除去して、リ
ンパ球を含みしかもWBCに富んだ画分を得、そしてこのW
BCに富んだ画分をIL-2とともに培養基中でインキユベー
トしてリンパ球を活性化することよりなる、生体外でLA
K細胞を生成させる方法の改良法である。本発明は、フ
イコール勾配でリンパ球及び単球の層の中間的な分離を
行うことなしに、リンパ球を含みしかもWBCに富んだ画
分を用いることよりなる。
本発明の方法において、RBCは種々の方法で除去されう
る。これらは標準的なロイカフエレシス、エルトリエー
シヨン・ロイカフエレシス及び遠心分離（フイコールの
使用なし）が包含される。フイコールは、合成の水溶性
多糖類であつて、約400,000の重量平均分子量を有しそ
して密度勾配の調製に広く用いられている。それは、登
録商標例えばフイコール−ペク（Paque）、フイコール
−ハイペク及びフイコール−イソペク（Isopaque）の名
の下に、それ自体及び他の物質との混合物として入手し
うる。ロイカフエレシスは、末梢血液を患者又はドナー
から取り出し、WBCに富んだ画分を分け取り、そして他
の血液画分（血漿，血小板及びRBC）を供給者に戻す方
法を指す。標準的に遠心分離を用いてドナーからの血液
を血漿、WBCに富んだ画分及びRBC画分に分離し、これら
を後の使用のために貯蔵する。（以下で用いられる「バ
ツフイ・コート」なる用語は詳細には標準的な遠心分離
により得られたWBCに富んだ画分を指すが、この用語は
又ロイカフエレシスにより得られる血小板に富みしかも
WBCに富んだ画分を指すのにも当業上用いられる。） RBCを除去する種々の方法により種々の量の残存RBC及び
種々の分画を有するWBCに富んだ画分が生成される。
（「分画」なる用語は、WBCに富んだ画分中のリンパ
球、単球及び顆粒球の総数に基づくこれら３種の細胞型
の％数を指す。）種々の画分の組成は供給源に応じて変
化しよう。例えば、IL-2を注入されていた患者は、非常
に高い数のリンパ球を有しよう、種々の方法により得ら
れるWBCに富んだ画分に関する代表的な範囲を、全血に
ついての代表的な範囲と比較して下記の表に示す。
上述の表から、本発明で使用しうるリンパ球を含みしか
もWBCに富んだ画分は、約0.2〜約300のRBC/WBC比そして
約１％〜約５０％の顆粒球含量を有することが分る。実
際問題として、バツフイ・コートは、患者がLAK細胞を
生成させうるかどうかを判定するスクリーニングに主と
して用いられよう。養子免疫療法に用いられるLAK細胞
を生成させるには、約１〜２０％のRBC容量％及び約0.2
〜250のRBC/WBCの比を有するロイカフエレシス生成物が
好ましい。
現在のところ、エルトリエーシヨン・ロイカフエレシス
生成物を用いるのが好ましい。何故ならこのものはRBC
及び顆粒球の両方の含量においてフイコールで分離され
た生成物とより近似しておりそれ故恐らく当業者により
比較的容易に受け入れられると思われるからである。さ
らに、エルトリエーシヨン・ロイカフエレシス生成物
は、ルーチン法基準で標準的なロイカフエレシス生成物
よりもやや高い細胞密度（例えば１×107／mlまたはそ
れ以上）で培養されうると思われる。上述の表から、エ
ルトリエーシヨン・ロイカフエレシス生成物は、代表的
には約0.2〜約50のRBC/WBC比、約１〜６のRBC容量％及
び１〜５の顆粒球含量を有することが分る。より代表的
な範囲は、RBC/WBC比約0.5〜25及びRBC容量％約２〜４
である。
標準的なロイカフエレシスは、ヘモネテイクス、フエン
ウオール（Fenwoll）及びコーブ（Code）を含む種々の
製造者から市販されている装置を用い、そして製造者の
指示に従つて行われうる。エルトリエーシヨン・ロイカ
フエレシスを行うのに現在入手しうる唯一の装置は、ヘ
モネテイクスV-50である。米国特許第4,464,167及び4,4
16,654号の教示又はヘモネテイクスにより提供される指
示に従つてこのV-50を、RBC及び顆粒球含量の低い、WBC
に富んだ画分を得るのに用いることができる。
WBCに富んだ画分の単球含量は、ロイカフエレシス生成
物をＬ−アミノ酸低級アルキルエステル又はその塩酸塩
例えばフエニルアラニン、グルタミン酸、グルタミン又
はチロシンのメチル、エチル、プロピル、イソプロピ
ル、ブチル、イソブチル又はｔ−ブチルエステルで処理
することにより表に示された数値より下まで低下させる
ことができる。フエニルアラニンメチルエステルが好ま
しい。これ以上の詳細は、下記の実施例に示される。
IL-2と一緒のインキユベーシヨンによるリンパ球の活性
化は、従来の技術と同じやり方で本発明において達成さ
れる。容器例えば従来のフラスコ及びローラー瓶が用い
られうるが、好ましい容器は、可撓性の共重合体状フイ
ルム材料から製造された0.2〜５容の組織培養バツグ
である。最も好ましいものは、９７モル％のエチレン及
び１−オクテンの共重合体から製造されたバツグであ
る。任意の好適な培養基が用いられうるが、好ましい培
養基は、血清を補給されたRPMI1640〔「Culture of Anim
al Cells」、フレツシユニー(Freshney)、72〜73、アラン
・アール・リス（Alan R.Liss）インコーポレーテツ
ド、ニユーヨーク、に記載〕である。エルトリエーシヨ
ン・ロイカフエレシス生成物については細胞約１×107
／mlまでの当初の細胞濃度が用いられ、そして標準的ロ
イカフエレシス生成物では細胞約１×107個／mlまでが
用いられうる。経済的な理由で少くとも細胞１×106／m
lの濃度が用いられるべきである。好ましい範囲は、エ
ルトリエーシヨン・ロイカフエレシス生成物については
細胞５×106〜107／mlでありそして標準的ロイカフエレ
シス生成物については細胞１〜５×106／mlであろう。
細胞は約35〜39℃好ましくは37℃で約２〜７日間好まし
くは約３〜５日間IL-2とともにインキユベートされる。
本明細書で用いられる「インターロイキン−２」（IL-
2）はヒトIL-2を意味する。このものには天然及び組換
えIL-2（rIL-2）及びその生物学的機能等価物、例えば
米国特許第4,518,584号に開示されたrIL-2ムテインが包
含される。IL-2は米国特許出願第825,133号（1986年１
月31日出願）に記載される主として水、rIL-2および場
合によりポリオールよりなるrIL-2組成物が好ましい。
培養基中のIL-2濃度は約５×102〜約５×104pMが好まし
く、最も好ましくは1000〜2000pMの範囲である。
本発明の方法により製造されたLAK細胞は、製薬上許容
しうる担体例えば食塩水、５％正常ヒト血清アルブミン
を含有する食塩水又はハンクスの平衡塩類溶液に懸濁し
て、腫瘍患者に注入できる組成物となされうる。患者
は、ローゼンバーグ（Rosenburg）らの「The New Engla
nd Journal of Medicine」313,1485〜1492(1985)により
記載されるようにしてrIL-2で同時治療される。この態
様においては、患者の血液を取り出し、ロイカフエレシ
スにかけ、採取した細胞を直ちに３日間培養してLAK細
胞を生成させる。次にLAK細胞を患者に注入する。代表
的には、約３×1010〜14×1010個のLAK細胞が４〜９回
注入される。インターロイキン−２は、体重１kg当り1
0,000、30,000又は100,000単位のような投与量で８時間
毎に投与される。この治療は、ロイカフエレシス及び再
注入からなる２週間療法および一般に第三週から始まる
繰返しよりなる。繰換えIL-2がこのLAK細胞組成物に含
まれうる。
細胞毒性（LAK）アツセイ 以下の実施例において、別の記載がない限り、４時間の
51Cr放出アツセイを用いて腫瘍細胞に対するLAK細胞の
細胞毒性を測定した（LAK活性）。１ml当り約２×106〜
10×106の濃度の腫瘍細胞を、トリス−燐酸塩緩衝食塩
水0.4ml中で100μCiのNa2 51Cr04と３７℃で１時間イン
キユベーシヨンした。この細胞を５％又は１０％のウシ
胎児血清（FCS）を含有するRPMI1640で３回洗い、そし
てRMPI-20%FCS又はRPMI-10%FCS中細胞105個／mlに再懸
濁した。エフエクター細胞（LAK細胞）を種々の濃度で
懸濁して、その0.1mlを丸底ミクロ滴定プレートのウエ
ルに加えた。51Crでラベルした標的細胞（0.1ml）をす
べてのウエルに加えた。３７℃で４時間インキユベーシ
ヨン後、プレートを遠心分離しそして得られた上澄み液
0.1mlを各ウエルから取り出してガンマ計数計で計測し
た。細胞溶解％は下記の式から計算する。
各数値は３回検査し、得られたデータを細胞溶解％とし
て表わす。この細胞毒性試験は、「Selected Methods i
n Cellular Immunology」ミシエル（Mishell）及びシイ
ギ（Shiigi）編、124〜137、W.H.フリーマン（Freema
n）アンド・カンパニー、サンフランシスコ（1980）、
に詳細に記載されている。
他の実験においては、アツセイの結果は「溶解単位」
（LU又はLU30）として表わされる。これはLAK細胞と標
的細胞とを一緒にして３７℃で４時間インキユベートし
た場合に標的細胞の３０％が殺された場合のエフエター
細胞100当りの標的細胞の数である。LUの計算は、プロ
ス（Pross）らの「Journal of Immunological Methods」
68、235〜249(1984)記載の方法に基づく。LUの数が大き
くなればなる程、LAK細胞調製物の効力が大きい。
本明細書に引用されたすべての特許及び他の印刷された
刊行物は、参考として本明細書に組み入れられ、特にエ
ルトリエーシヨン分離物として予め分離された血漿を用
いるエルトリエーシヨン・ロイカフエレシスによるWBC
に富んだ画分の生成に関する米国特許第4,464,167及び
4,416,654号の記述がそうである。
実施例１ 目的： 1)白血球を得るためにエルトリエーシヨン法を用いるヘ
モネテイクスV50から得られた細胞のLAK活性を研究する
ため。
2)ヘモネテイクスV50エルトリエーシヨン法で得られた
細胞のLAK活性に及ぼすフエニルアラニンメチルエステ
ル（φAla）処理及びフイコール処理の効果を研究する
ため。
細胞：ヒトリンパ球（V50エルトリエーシヨン法を用い
るヘモネテイクス・コーポレーシヨンから入手）。ラジ
（Raji）細胞。
材料： 1)細胞培養基（CCM）＝１０％FBS、Ｌ−グルタミン及び
ゲンタマイシンを添加したRPMI1640。
2)燐酸塩緩衝された食塩水（PBS）１×（Ca++及びMg++
なし）。
3)フイコール・ハイペク（フイコール） 4)φAla 5)WBC計測のためのウノペツト（Unopette）（登録商
標） 6)細胞培養用のエチレンブテン共重合体バツグ 7)T25細識培養フラスコ 8)１％NP40 9)２×TD緩衝液 10)51Cr（クロム酸ナトリウムとして） 11)組換えインターロイキン−２、0.5Ｍグルコース中１
０単位／ml（IL-2） 12)９６ウエル丸底組織培養プレート 13)SCS採取システム〔スカトロン（Skatron）〕 14)ベツクマン・ガンマ・4000・カウンター 15)トリパン・ブルー 操作： A)細胞の調製 1)米国特許第4,416,654及び4,464,167号に記載のエルト
リエーシヨン操作を用いて合計２５０mlの白血球画分を
ヘモネテイクスV50から集めた。
2)WBC数をウノペツトを用いて計測した。この画分はWBC
1.36×107個／mlを含有しておりそして約３容量％のRBC
を含有すると推定された。
3)細胞を次にWBC１×107個／mlの濃度にした（全容量＝
３４０ml）。
4)細胞４０mlは直接培養にかけた（下記参照）。
5)残りの３００mlをφAlaで処理した（下記参照）。
B)φAla処理 1)T150フラスコに細胞３００mlを入れる。
2)細胞に３０mlのφAlaを加える。
3)十分に混合する（穏やかに）。
4)４０分間室温でインキユベートする。
5)インキユベーシヨン後、血液を１６５mlずつに二分す
る。
a)部分１を培養する。
b)部分２の下にフイコールを入れ（下記参照）次に培養
する。
c)培養の実施 1)V50から直接の細胞（フイコールなし；φAlaなし） a)細胞４０mlを５０ml容の遠心分離管に入れる。
b)1200rpmで１０分間細胞を遠心分離する。
c)上澄みを捨てる。
d)CCMに細胞を再懸濁して総量４０mlとする。
e)所望量の細胞をT25フラスコに入れる。
f)CCMをフラスコに加えて白血球を所望の濃度とする。
g)５μｌのIL-2を各フラスコに加える（最終濃度１０単
位／ml）。
h)５％のCO2とともに３７℃のインキユベーター中にフ
ラスコを置く。
2)部分１→V50からの細胞（φAlaあり；フイコールな
し） a)１６５mlのφAla処理細胞を２５０ml容の遠心分離管
に入れる。
b)1200rpmで１０分間遠心分離する。
c)上澄みを捨てる。
d)５０mlのCCMに細胞を再懸濁する。
e)ウノペツトを用いて細胞の計測を行い、WBCの数は１m
l当り1.9×107であつた。
f)所望の細胞濃度に応じてバツグ及びフラスコ中に培養
物を入れる。
g)５％のCO2とともに３７℃のインキユベーターに培養
物を置く。
２種の培養物の調製： 3)部分２→V50からの細胞（φAla及びフイコールあり） a)４０mlのφAla処理細胞を４〜５０ml容遠心分離管に
入れる。
b)血液の下に１０mlのフイコールを入れる。
c)1900rpmで３０分間遠心分離する。
d)滅菌パスツールピペツトで界面の層を集めそして細胞
を滅菌した５０ml容遠心分離管に入れる。
e)PBSを用いて管中の容量を５０mlにする。
f)1200rpmで１０分間遠心分離する。
g)上澄みを捨てる。
h)５０mlのCCM中にペレットを再懸濁する。
i)1200rpmで１０分間遠心分離する。
j)５０mlのCCM中に再懸濁する。
k)トリパンブルーを用いて細胞の計測を行い、次に l)所望の細胞濃度に応じてバツグ及びフラスコに培養物
を調製する。
m)５％のCO2とともに３７℃のインキユベーターに培養
物を置く。
註：界面の層が工程３の後では生じなかつた。そのため
細胞を再懸濁し、再びフイコールを下に入れそして再び
遠心分離した。この後、界面における細胞を集めた。
３種の培養物の調製： D)LAKアツセイ 前記操作に従つて細胞を４日間培養した後に、LAKアツ
セイを行つた。
註：資料に含まれた赤血球が過剰なため、LAKアツセイ
前に３種の試料を溶解緩衝液により処理した。
溶解溶液：塩化アンモニウム0.83g 蒸留H2O ２００ml 1)１０mlの溶解溶液中に細胞ペレツトを再懸濁する。
2)室温で２０分間インキユベートする。
3)1200rpmで１０分間遠心分離する。
4)上澄みを捨てる。
5)１mlのCCMに再懸濁する。
6)細胞の計測を行う。
7)LAKアツセイ法に記載されるＥ：Ｔ比に調整する。
φAla処理用の細胞の調整（全細胞を細胞１×107／mlと
する） ４０mlを採りそして培養にかける。
残りの細胞に３０mlのφAlaを加えそして室温で４０分
間インキユベートする。
実施例２ プロトコール：下記フローチヤートにより本実施例に関
するプロトコールを要約する。
Ｆ＝T-25フラスコ Ｂ＝培養バツグ 操作： A)細胞の分離 1)細胞をヘモネテイクスV-50でのエルトリエーシヨン法
により集めた。
2)細胞の計測を行つた。＝細胞1.3×107／ml（４４２ml
中）。総細胞数5.8×109。
3)細胞を処理のため二分した。
B)LABフイコール 1)２２１mlの細胞をPBSと混合しそしてフイコール上に
置いた。
2)2000rpmで３０分間遠心分離した。
3)次に細胞を洗滌しそして計測した。
細胞２５６（生存能力あり） 生存可能性９９％ 生存能力のない細胞１ 細胞5.1×108／ml ２×109／40ml 4)１×106でLAKのための培養用に細胞を調製する。
5)これらフイコールに重ねた細胞の残りをφAla用に調
製した。
a)Ｖ１Ｃ１＝Ｖ２Ｃ２ （40ml）（5.1×107）＝Ｖ２（１×107） ＃合計ml＝Ｖ２＝２００ml ＃培地ml＝Ｖ２−Ｖ１＝１６０ ＃φAlaml＝Ｖ２／９＝２００／９＝φAla22.2ml b)４０分間インキユベートし次に洗滌する。
c)細胞の計測を行いそしてLAK用の培養物に細胞を入れ
る。
生存能力のある細胞＝２２９ 生存能力なし＝６ 生存可能性％＝９７％ 細胞／ml＝4.6×107 d)培養用に細胞を調製する。
c)V-50から直接のLAK 1)細胞の後半分をこのとき用いた。１×106、５×106及
び１×107の濃度で培養するのに必要な細胞量を用い、
残りの細胞を希釈しそしてフエニルアラニンメチルエス
テルで処理した。
D)フイコールなしのφAla はじめにフイコールでの分離を行うことのないφAla処
理細胞 Ｃ１Ｖ１＝Ｃ２Ｖ２ （２００ml）（1.2×107）＝(k)（１×107）＝ｘ＝260 ＃培地ml＝６０ml ＃φAlaml＝２９ml ４０分間インキユベート。
洗滌。
細胞の計測を行いそして培養物を調製する。
生存能力あり ２４０ 生存可能性％ ９３％ 細胞／ml＝4.8×107 合計＝1.9×109／40ml すべての培養物を３７℃及び５％CO2で３日間インキユ
ベートした。LAK-51Cr放出を検べた。下記の表におい
て、％RELは放出％を意味し、それは上記で説明したよ
うにして計算された細胞溶解％と同じである。Ｅ：Ｔは
エフエクター（LAK）細胞対標的（腫瘍）細胞の比を意
味する。
細胞の計測はすべての培養物について行われた。
実施例３ ５５０mlの抗凝固剤ACD-B中に集められた3600mlの全血
から調製された２２５mlのヒト白血球を含有する標準ロ
イカフエレシス生成物をBiological Specialty Corpora
tion（ペンシルバニア州ランスダール（Lansdale））か
ら得た。下記の方法をこの生成物に対して行つた。
1)ウノペツトでの計測（WBC）及び分画を調べた。
分画： ９０％リンパ球 ６％単球 ４％顆粒球 直接＝細胞１６５ 細胞3.3×107 細胞7.4×109／２２５ml 2)LAK用の培養物に細胞を調製する。
１×106＝細胞0.30ml＋培地9.70ml＋IL-2５μｌ ５×106＝細胞1.52ml＋培地8.48ml＋IL-2５μｌ １×107＝細胞3.04ml＋培地6.96ml＋IL-2５μｌ ４日間５％CO2、３７℃でインキユベートする。
3)次に細胞２０mlを残りの細胞から取り出しそしてCa++
及びMg++を含有しないPBS２０mlと混合した。この混合
物４０mlを４０mlのフイコールの上に重ねそして1/2時
間遠心分離した。単核性細胞層を取り出しこれらの細胞
を３回洗つた。９１分の単球接着を行つた。さらに２回
洗いそして細胞の計測を行い次にLAK用の培養物に入れ
た。これは標準サンプルである。
標準細胞数： 生存能力あり＝１５５ 生存能力なし＝１ 生存可能性％＝９９％ 細胞／ml＝3.1×107／ml 合計＝7.7×108／25ml １×106の細胞濃度に希釈＝細胞0.32ml＋培地9.68ml＋
５μｌ（IL-2）。
4)残りの細胞（200ml）を次に４６０mlのCCMにより希釈
して細胞の数を１×107／mlとし、そして７３mlのφAla
で処理した。４０分間室温でインキユベートした。イン
キユベーシヨン中に細胞は凝塊を形成した。凝塊しなか
つた懸濁液を出来る限り多く取り出し、洗滌しそしてWB
Cウノペツトにより細胞数を計測した。
２６細胞（生存能力あり） １細胞（生存能力なし） 生存可能性９６％ 細胞5.2×106／ml 細胞1.04×109／２００ml ５×106＝細胞４８ml＋培地２ml＋IL-2２５μｌでバツ
グ中に細胞を調製した。
LAKを生成させるために４日間３７℃、５％CO2でインキ
ユベートした。
5)インキユベーシヨン後の細胞数 Ｅ：Ｔ比 20：１、10：１、５：１、2.5：１ 希釈 ２×106 標準物 細胞0.41ml＋培地0.59ml 直接（１×106） 細胞0.38ml＋培地0.62ml 直接（５×106） 細胞0.95ml＋培地0.05ml 直接（11×107）細胞0.42ml＋培地0.58ml φAla 細胞0.53ml＋培地0.47ml ラジ 細胞0.12ml＋培地19.88ml 結果： 実施例４ ５２０mlの抗凝固剤ACD-B中に集められた3600mlの全血
から調製された２３０mlのヒト白血球を含有する標準ロ
イカフエレシス生成物をBiological Specialty Corpora
tionから得た。下記の方法はこの生成物について行われ
た。
1)細胞１０mlを取り出した。
A) 1)この血液の５mlを採りそして５mlのPBSと混合した。
2)１０mlのフイコールを下に入れた。
3)2000rpmで３０分間遠心分離した。
4)洗滌しそして計測した。
5)これは１０ml容フラスコ中における細胞1.5×106／ml
標準物であつた。
標準物 生存能力あり＝４９ 生存能力なし＝０ 生存可能性％＝１００％ 細胞／ml＝9.8×106／ml 合計＝1.96×108／20ml 希釈：細胞1.5ml＋培地8.5ml＋IL-2１μｌ B) 1)別の５mlを直接テストに用いた。
2)WBC（ウノペツトによる）及び分画を検べた。
3)WBC 4.5×107／ml 2.25×108／５ml 分画 ７２％リンパ球 ２２％顆粒球 ６％単球 4)次に細胞を１０ml容フラスコ中で、1.5×106／ml及び
５×106／mlで培養物に調製した。
1.5×106／ml＝細胞0.33ml＋培地9.67ml＋IL-2１μｌ ５×106／ml＝細胞1.11ml＋培地8.89ml＋IL-2１μｌ 細胞を４日間インキユベートした。クロム放出アツセイ
を行つた。
細胞の計測： 3)LAKアツセイ Ｅ：Ｔ比 40：１、20：１、10：１、５：１、2.5：
１、1.25：１ 細胞を４×106に希釈した。
ラジを１×105に希釈した。
希釈 標準物 細胞0.5ml＋培地0.5ml 直接1.5×106 細胞0.5ml＋培地0.5ml 直接５×106 細胞0.83ml＋培地0.17ml ラジ 細胞0.25ml＋培地19.75ml 結果： 実施例５ 材料： バツフイ・コート−血液５２ml 細胞数 細胞4.3×107／ml（全WBC） 好中球1.8×107／ml（４２％） （推定）リンパ球１〜２×107／ml（２０〜５０％） （推定）RBC５×109／ml （推定）単球0.5〜１×107／ml フイコール・ハイペク（フイコール） CCM−５％FCS-RPMI 操作： 1)フイコールなし a)10.5mlのバツフイ・コートに２１５mlのCCMを加え
る。細胞数２×106／ml（全WBC）。
b)10μｌmlのIL-2を加える。
c)フラスコに１１２mlの培養混合物を入れる。
d)バツグに１１２mlの培養混合物を入れる。
e)２０日間３７℃でインキユベートする。
f)細胞の計測及び51Cr放出（LAK）アツセイのために
３、６、１２、１７及び２０日にサンプルを採取する。
2)フイコール a)５０ml容遠心分離管に４２mlのバツフイ・コートを入
れる。
b)８００ｇで１０分間遠心分離する。
c)上澄みを捨て、フイコール層上に浮く単核性WBC層
（リンパ球及び単球）を回収し、３回洗う。300×106個
の総単核性細胞が単離される。
d)CCMを加えて単核性細胞濃度を２×106／mlとする。
e)フラスコに７５mlを入れる。
f)バツグに７５mlを入れる。
g)２０日間３７℃でインキユベートする。
h)細胞の計測及び51Cr放出（LAK）アツセイのため３、
６、１２、１７及び２０日にサンプルを採取する。
以上本発明を詳細に説明したが、本発明はさらに次の実
施態様によつてこれを要約して示すことができる。
1)全血からRBC及び血漿を除去して、リンパ球を含みし
かもWBCに富んだ画分を得、そしてこのWBCに富んだ画分
をIL-2とともに培養基中でインキユベートすることより
なる生体外でLAK細胞を生成させる方法において、RBC及
び血漿を除去し、そしてフイコール勾配でリンパ球を中
間分離することなしにこのWBCに富んだ画分を使用する
ことを特徴とする方法。
2)RBCがロイカフエレシスにより除去されそしてWBCに富
んだ画分中のRBCの容量％が約１〜２０の範囲内にある
前記1)記載の方法。
3)WBCに富んだ画分中のRBC/WBCの比が約0.2〜250の範囲
内にある前記2)記載の方法。
4)RBCがエルトリエーシヨン・ロイカフエレシスにより
除去されそしてWBCに富んだ画分中のRBCの容量％が約１
〜６の範囲内にある前記1)記載の方法。
5)WBCに富んだ画分中のRBC/WBCの比が約0.2〜50の範囲
内にある前記4)記載の方法。
6)WBCの分画が約80〜85％のリンパ球、約10〜20％の単
球及び約１〜５％の顆粒球である前記5)記載の方法。
7)WBCに富んだ画分中のRBCの容量％が約２〜４の範囲内
にあり、WBCに富んだ画分中のRBC/WBCの比が約0.5〜25
の範囲内にある前記6)記載の方法。
8)WBCに富んだ画分のインキユベーシヨンに先立ち単球
をフエニルアラニンメチルエステルで処理することによ
り欠失させる前記1)記載の方法。
9)WBCに富んだ画分中のインキユベーシヨンに先立ち塩
溶液で洗つて凝塊形成を阻止する前記2)記載の方法。
10)リンパ球を含みかつWBCに富んだ画分をIL-2とともに
培養基中でインキユベートすることによりLAK細胞を生
成させる方法において、RBC/WBCの比約0.2〜300、並び
にRBC容量％約１〜５０を有するものである、リンパ球
を含みしかもWBCに富んだ画分を用いることを特徴とす
る方法。
11)WBCに富んだ画分においてRBC/WBCの比が約0.2〜250
の範囲内にありそしてRBC容量％が約１〜２０の範囲内
にある前記10)記載の方法。
12)WBCに富んだ画分においてRBC/WBCの比が約0.2〜50の
範囲内にありそしてRBC容量％が約１〜６の範囲内にあ
る前記11)記載の方法。
13)WBCに富んだ画分の分画が、約１〜５％の顆粒球、０
〜２０％の単球及び約８０％より多いリンパ球である前
記12)記載の方法。
14)WBCに富んだ画分においてRBC/WBCの比が約0.5〜25の
範囲内にありそしてRBC容量％が約２〜４である前記13)
記載の方法。
15)患者から末梢血液を取り出し、その血液からリンパ
球を含みしかもWBCに富んだ画分を分離し、このリンパ
球を含みしかもWBCに富んだ画分をインターロイキン２
とともにインキユベートしてリンホカイン活性化キラー
細胞を生成させ、そしてこの活性化された細胞を患者に
再注入することよりなる養子免疫療法により癌患者を治
療する方法において、フイコール勾配を用いることなく
リンパ球を含みしかもWBCに富んだ画分を分離し、それ
によりWBCに富んだ画分中のRBCの容量％が約１〜２０の
範囲内にあることを特徴とする方法。
16)リンパ球を含みしかもWBCに富んだ画分をエルトリエ
ーシヨン・ロイカフエレシスにより分離し、それにより
WBC画分中のRBCの容量％が約１〜６の範囲内にある前記
15)記載の方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョーゼフ・ダーフイト・イル アメリカ合衆国デラウエア州（19711）ニ ユーアーク．ブライアーレイン386 (72)発明者 リーザ・ネイデイーン・ハルパーン アメリカ合衆国マサチユーセツツ州 （02161）ニユートンハイランズ．オール ドウインチエスターストリート17 (56)参考文献 Ｃａｎｃｅｒ Ｖｏｌ．55（1985） Ｐ．1327−1333 Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｅｄ ｉｎｇｓ Ｖｏｌ．44 Ｎｏ．５（1985) Ｐ．1688−7469

Claims (4)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】全血からRBC及び血漿を除去して、リンパ
    球を含みしかもWBCに富んだ画分を得、そしてこのWBCに
    富んだ画分をIL-2とともに培養基中でインキュベートす
    ることよりなる生体外でLAK細胞を生成させる方法にお
    いて、RBC及び血漿を除去し、そしてフイコール勾配で
    リンパ球を中間分離することなしにこのWBCに富んだ画
    分を使用することを特徴とする方法。
  2. 【請求項２】WBCに富んだ画分のインキュベーションに
    先立ち単球をフェニルアラニンメチルエステルで処理す
    ることにより欠失させる請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】WBCに富んだ画分をインキュベーションに
    先立ち塩溶液で洗って凝塊形成を阻止する請求項１記載
    の方法。
  4. 【請求項４】リンパ球を含みかつWBCに富んだ画分をIL-
    2とともに培養基中でインキュベートすることによりLAK
    細胞を生成させる方法において、RBC／WBCの比約0.2〜3
    00、並びにRBC容量％約１〜50を有するものである、リ
    ンパ球を含みしかもWBCに富んだ画分を用いることを特
    徴とする方法。
JP63101509A 1987-04-27 1988-04-26 ヒトリンホカイン活性化キラー細胞の製法 Expired - Lifetime JPH0657147B2 (ja)

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