JPH0657148B2 - クレアチン・アミジノ−ロラ−ゼの製造法 - Google Patents
クレアチン・アミジノ−ロラ−ゼの製造法Info
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- JPH0657148B2 JPH0657148B2 JP23416385A JP23416385A JPH0657148B2 JP H0657148 B2 JPH0657148 B2 JP H0657148B2 JP 23416385 A JP23416385 A JP 23416385A JP 23416385 A JP23416385 A JP 23416385A JP H0657148 B2 JPH0657148 B2 JP H0657148B2
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- enzyme
- amidinohydrolase
- creatine amidinohydrolase
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、アルカリゲネス属に属し、菌体外クレアチ
ン・アミジノヒドロラーゼ生産能を有する菌株を培養し
てクレアチン・アミジノヒドロラーゼを製造する方法に
関するものである。
ン・アミジノヒドロラーゼ生産能を有する菌株を培養し
てクレアチン・アミジノヒドロラーゼを製造する方法に
関するものである。
血清クレアチン濃度は原発性筋疾患、筋炎、筋萎縮、甲
状腺機能亢進症などで増加し、クレアチン尿をきたす。
従って、クレアチンの定量を行なうことは、臨床医学診
断上極めて重要である。そこで、クレアチン・アミジノ
ヒドロラーゼが、クレアチンを特異的に分解する性質を
用いクレアチンの酵素定量法に利用している。
状腺機能亢進症などで増加し、クレアチン尿をきたす。
従って、クレアチンの定量を行なうことは、臨床医学診
断上極めて重要である。そこで、クレアチン・アミジノ
ヒドロラーゼが、クレアチンを特異的に分解する性質を
用いクレアチンの酵素定量法に利用している。
クレアチン・アミジノヒドロラーゼ（ＥＣ３・５・３・
３）は公知の酵素であり、この酵素はクレアチンに作用
して尿素とサルコシン（Sarcosine）に加水分解する酵
素であり、その反応式は次の通りである。
３）は公知の酵素であり、この酵素はクレアチンに作用
して尿素とサルコシン（Sarcosine）に加水分解する酵
素であり、その反応式は次の通りである。
従来、クレアチン・アミジノヒドロラーゼは特開昭47-4
3281号公報及び特開昭55-34029号公報に示唆されている
ようにアルカリゲネス属に属する細菌に存在することが
知られている。
3281号公報及び特開昭55-34029号公報に示唆されている
ようにアルカリゲネス属に属する細菌に存在することが
知られている。
しかし、これらのアルカリゲネス属より得られるクレア
チン・アミジノヒドロラーゼはいずれも菌体内酵素であ
るため、この酵素を得るためには培養菌体を集菌して、
これを磨砕、超音波処理または溶菌処理して、酵素を分
離、抽出する操作を必要とするため、酵素精製操作が著
しく複雑化し、効率よく酵素を得ることができないとい
う問題点があった。
チン・アミジノヒドロラーゼはいずれも菌体内酵素であ
るため、この酵素を得るためには培養菌体を集菌して、
これを磨砕、超音波処理または溶菌処理して、酵素を分
離、抽出する操作を必要とするため、酵素精製操作が著
しく複雑化し、効率よく酵素を得ることができないとい
う問題点があった。
そこで、この発明は培養菌体より抽出操作過程を経ずと
も、一段操作で効率よく、クレアチン・アミジノヒドロ
ラーゼを得ることを目的として以下のような手段を講じ
た。
も、一段操作で効率よく、クレアチン・アミジノヒドロ
ラーゼを得ることを目的として以下のような手段を講じ
た。
すなわちこの発明は、アルカリゲネス属に属し、菌体外
クレアチン・アミジノヒドロラーゼ生産能を有する菌株
を培養し、培養液よりクレアチン・アミジノヒドロラー
ゼを分離、回収するものである。
クレアチン・アミジノヒドロラーゼ生産能を有する菌株
を培養し、培養液よりクレアチン・アミジノヒドロラー
ゼを分離、回収するものである。
この発明に使用される菌株としては、アルカリゲネス属
に属し、菌体外クレアチン・アミジノヒドロラーゼ生産
能を有する微工研菌寄第5071号菌株が挙げられる。
に属し、菌体外クレアチン・アミジノヒドロラーゼ生産
能を有する微工研菌寄第5071号菌株が挙げられる。
以下、この微工研菌寄第5071号菌株の菌学的性質につい
て述べる。
て述べる。
a)形態 幅0.5〜1.0μ、長さ1.5〜3.5μで単桿菌または
２連菌のように観察される。
２連菌のように観察される。
運動性：１本の鞭毛を有し、運動性あり。
グラム染色性：陰性。
抗酸性：陰性。
夾膜：なし。
b)各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養 28℃、48時間の培養で直径３〜５mmの隆起した円形コロ
ニー、表面はなめらかでつやのある周縁円形状の集落を
形成する。
ニー、表面はなめらかでつやのある周縁円形状の集落を
形成する。
肉汁寒天斜面培養 28℃、48時間の培養で拡幅状に生育する。コロニーの色
は半透明の乳黄土色で、表面はつやがあり、拡散性色素
を生成しない。
は半透明の乳黄土色で、表面はつやがあり、拡散性色素
を生成しない。
肉汁液体培養 静置培養では殆ど生育が認められない。
肉汁寒天穿刺培養 28℃、48時間の培養で表面及び穿刺穴に生育する。
肉汁ゼラチン穿刺培養 20℃、１〜14日間の培養で表面ないし上層部に生育する
が、液化は認められない。
が、液化は認められない。
リトマスミルク 培養とともにゆっくりアルカリ性となり、リトマスをわ
ずかに還元するが、液化、凝固はしない。
ずかに還元するが、液化、凝固はしない。
バレイショ寒天培地 28℃、48時間の培養で拡幅状によく生育する。コロニー
の色は半透明の乳白色あるいは灰白色で表面はなめらか
でつやがある。
の色は半透明の乳白色あるいは灰白色で表面はなめらか
でつやがある。
c)生理学的性質 硝酸塩の還元：なし。
脱窒反応（駒形らの方法）：陰性。
ＭＲテスト：陰性。
ＶＰテスト：陰性。
インドールの生成：生成せず。
硫化水素の生成：生成せず。
デンプンの加水分解：分解せず。
クエン酸の利用：利用する。
（Koser Citrate培地及びChristensen培地） 無機窒素源の利用（飯塚・駒形の方法） 硝酸塩：利用する。
アンモニウム塩：利用する。
色素の生成：ピオシアニン系色素を生成せず。
ウレアーゼ：生成する。
オキシダーゼ：生成する。
カタラーゼ：生成する。
生育の範囲：pH6.5〜9.5、至適pH8.0付近、温度20〜3
0℃、至適温度28℃、（培地は肉汁寒天培地使用）。
0℃、至適温度28℃、（培地は肉汁寒天培地使用）。
酸素に対する態度：好気性。
Ｏ−Ｆテスト（Hugh-Leifson試験）：酸化的にも醗酵
的にも糖を分解しない。
的にも糖を分解しない。
糖からの酸及びガスの発生：Ｌ−アラビノース、Ｄ−
キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、ショ糖、乳
糖、トレハロース、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、
イノシット、グリセリン、デンプンのいずれの糖からも
酸及びガスの発生は認められない。
キシロース、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フ
ラクトース、Ｄ−ガラクトース、麦芽糖、ショ糖、乳
糖、トレハロース、Ｄ−ソルビット、Ｄ−マンニット、
イノシット、グリセリン、デンプンのいずれの糖からも
酸及びガスの発生は認められない。
d)その他の性質 ガゼインのペプトン化：生成せず。
タマゴの消化：消化せず。
アルギニンの加水分解：分解せず。
フェニルピルビン酸テスト：陰性。
インドフェニル酸テスト：陰性。
アセトイン産生：産生せず。
グルクロン酸の酸化：酸化せず。
リジンの脱炭酸の反応：陰性（シモンズ・クエン酸培
地及びＬＩＭ培地）。
地及びＬＩＭ培地）。
β−ガラクトシダーゼ：生成する。
炭素化合物の利用：Ｌ−アラビノース、Ｄ−キシロー
ス、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｄ−ガラクトース、乳糖、麦芽糖。ショ糖、トレハ
ロース、ラフィノース、Ｄ−ソルビット、イノシット、
グリセリン、サリシン、α−メチルグルコシッド、イヌ
リン、デキストリン、デンプン、セルロース、Ｌ−ソル
ボース、セロビオース、グリコゲン、エリスリオール、
ピルビン酸、乳酸、マロン酸、シュウ酸、ｄ−酒石酸、
酪酸及びプロピオン酸を利用しない。
ス、Ｄ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−フラクトー
ス、Ｄ−ガラクトース、乳糖、麦芽糖。ショ糖、トレハ
ロース、ラフィノース、Ｄ−ソルビット、イノシット、
グリセリン、サリシン、α−メチルグルコシッド、イヌ
リン、デキストリン、デンプン、セルロース、Ｌ−ソル
ボース、セロビオース、グリコゲン、エリスリオール、
ピルビン酸、乳酸、マロン酸、シュウ酸、ｄ−酒石酸、
酪酸及びプロピオン酸を利用しない。
ラムノース、コハク酸、クエン酸、酢酸及びフェニルア
ラニンをそれぞれ資性化できる。
ラニンをそれぞれ資性化できる。
この発明に用いられた菌株の諸性質をBergey's Manual
of Systematic Bacteriology第１巻(1983年）の分類と
対比すると本菌株は、グラム陰性、好気性の桿菌で１本
の鞭毛を有し、運動性があること、カタラーゼ陽性、オ
キシダーゼ陽性、糖から酸及びガスの生成が認められな
いことより、アルカリゲネス属に属すると判定される。
of Systematic Bacteriology第１巻(1983年）の分類と
対比すると本菌株は、グラム陰性、好気性の桿菌で１本
の鞭毛を有し、運動性があること、カタラーゼ陽性、オ
キシダーゼ陽性、糖から酸及びガスの生成が認められな
いことより、アルカリゲネス属に属すると判定される。
上述の菌株を用いて、以下クレアチン・アミジノヒドロ
ラーゼの製造方法について述べる。
ラーゼの製造方法について述べる。
この発明に用いられるアルカリゲネス属菌株は、固型培
地を用いて培養することができるが、液体培地を用い、
振盪培養または通気攪拌深部培養を行なうのが望まし
い。
地を用いて培養することができるが、液体培地を用い、
振盪培養または通気攪拌深部培養を行なうのが望まし
い。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられる
ものが広く使用される。窒素源としては、利用可能な窒
素源であればよく、大豆粉、コーンスティープリカー、
種々の肉エキス、ペプトン、酵母エキスなどが使用され
る。炭素源としては、利用可能な炭素化合物であればよ
く、糖類、可溶性でんぷん、グリセリンなとが使用され
る。その他無機塩として、硝酸ナトリウム、塩化ナトリ
ウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、塩化カリ
ウム、硫酸第一鉄、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛な
どが必要に応じて使用される。また培地中にクレアチン
を添加すれば、培養液中へのクレアチン・アミジノヒド
ロラーゼの蓄積が増加する。その添加濃度は0.5〜1.0％
程度が好ましい。
ものが広く使用される。窒素源としては、利用可能な窒
素源であればよく、大豆粉、コーンスティープリカー、
種々の肉エキス、ペプトン、酵母エキスなどが使用され
る。炭素源としては、利用可能な炭素化合物であればよ
く、糖類、可溶性でんぷん、グリセリンなとが使用され
る。その他無機塩として、硝酸ナトリウム、塩化ナトリ
ウム、リン酸一カリウム、リン酸二カリウム、塩化カリ
ウム、硫酸第一鉄、硫酸銅、塩化マンガン、硫酸亜鉛な
どが必要に応じて使用される。また培地中にクレアチン
を添加すれば、培養液中へのクレアチン・アミジノヒド
ロラーゼの蓄積が増加する。その添加濃度は0.5〜1.0％
程度が好ましい。
培養温度は菌が発育し、菌体外にクレアチン・アミジノ
ヒドロラーゼを生産する温度範囲内ならばいかなる温度
でもよく、好ましくは約28℃である。培養時間は条件に
よって多少異なるが、通常２〜５日間である。そして、
培養液中のクレアチン・アミジノヒドロラーゼ生産量
が、最高に達する時期を見計らって適当な時期に培養を
終了すればよい。
ヒドロラーゼを生産する温度範囲内ならばいかなる温度
でもよく、好ましくは約28℃である。培養時間は条件に
よって多少異なるが、通常２〜５日間である。そして、
培養液中のクレアチン・アミジノヒドロラーゼ生産量
が、最高に達する時期を見計らって適当な時期に培養を
終了すればよい。
培養液よりクレアチン・アミジノヒドロラーゼを分離す
るには、まず過、遠心分離等により、菌体その他の固
形分を除去し、得られた粗製クレアチン・アミジノヒド
ロラーゼ含有液をさらに公知の蛋白質、酵素などの単
離、精製手段を用いることにより、精製されたクレアチ
ン・アミジノヒドロラーゼを得ることができる。たとえ
ば、粗製のクレアチン・アミジノヒドロラーゼに、必要
に応じて硫酸ストレプトマイシン水溶液、硫酸プロタミ
ン水溶液を加えて核酸などを除去し、これに硫酸アンモ
ニウムなどを加えて塩析させるか、アセトン・エタノー
ルなどの有機溶媒を加えて、分別沈殿させ、沈殿物を集
める。さらにこの沈殿物を精製するには、たとえば沈殿
物をトリス−塩酸緩衝液などの溶媒に溶解し、ジエチル
アミノエチル−セルロースイオン交換体、ジエチルアミ
ノエチル−デキストランイオン交換体、ジエチルアミノ
エチル−アガロースイオン交換体などの陰イオン交換体
を用いる吸着溶出法、デキストランゲル、ポリアクリル
アミドゲルなどのゲル過剤によるクロマトグラフ法、
ハイドロキシアパタイトによる吸着溶出法及びポリアク
リルアミドゲル等を用いる電気泳動法を行なえばよい。
るには、まず過、遠心分離等により、菌体その他の固
形分を除去し、得られた粗製クレアチン・アミジノヒド
ロラーゼ含有液をさらに公知の蛋白質、酵素などの単
離、精製手段を用いることにより、精製されたクレアチ
ン・アミジノヒドロラーゼを得ることができる。たとえ
ば、粗製のクレアチン・アミジノヒドロラーゼに、必要
に応じて硫酸ストレプトマイシン水溶液、硫酸プロタミ
ン水溶液を加えて核酸などを除去し、これに硫酸アンモ
ニウムなどを加えて塩析させるか、アセトン・エタノー
ルなどの有機溶媒を加えて、分別沈殿させ、沈殿物を集
める。さらにこの沈殿物を精製するには、たとえば沈殿
物をトリス−塩酸緩衝液などの溶媒に溶解し、ジエチル
アミノエチル−セルロースイオン交換体、ジエチルアミ
ノエチル−デキストランイオン交換体、ジエチルアミノ
エチル−アガロースイオン交換体などの陰イオン交換体
を用いる吸着溶出法、デキストランゲル、ポリアクリル
アミドゲルなどのゲル過剤によるクロマトグラフ法、
ハイドロキシアパタイトによる吸着溶出法及びポリアク
リルアミドゲル等を用いる電気泳動法を行なえばよい。
これらの手段は、適宜選択、組合わせて行ない、次いで
真空凍結乾燥などの手段により、乾燥して精製されたク
レアチン・アミジノヒドロラーゼ粉末を得る。
真空凍結乾燥などの手段により、乾燥して精製されたク
レアチン・アミジノヒドロラーゼ粉末を得る。
次に、この発明で得られたクレアチン・アミジノヒドロ
ラーゼの理化学的性質について述べる。
ラーゼの理化学的性質について述べる。
作用 この酵素はクレアチンを加水分解して、尿素とサルコシ
ンにする作用を有し、クレアチンに対するKm〔ミカエリ
ス(Michaelis)定数〕値は、4.83×10-3Ｍ（37℃ pH7.
8）である。
ンにする作用を有し、クレアチンに対するKm〔ミカエリ
ス(Michaelis)定数〕値は、4.83×10-3Ｍ（37℃ pH7.
8）である。
力価測定法 クレアチン0.1Ｍを含有した50mMリン酸緩衝液（pH7.8）
1.0ml、適当に希釈した酵素液0.1ml加え、37℃で10分間
反応させたのち、これにＰ−ジメチルアミノベンズアル
デビド溶液（2.0ｇのＰ−ジメチルアミノベンズアルデ
ビドを100mlジメチルスルホキシドに溶解させたのち、
濃塩酸15ml加えたもの）2.0ml添加し、25℃で20分間放
置する。酵素反応０分の時の試料を対照として分光光度
計により435nmにて吸光度（△ＯＤ）を測定し、次の通
り計算する。
1.0ml、適当に希釈した酵素液0.1ml加え、37℃で10分間
反応させたのち、これにＰ−ジメチルアミノベンズアル
デビド溶液（2.0ｇのＰ−ジメチルアミノベンズアルデ
ビドを100mlジメチルスルホキシドに溶解させたのち、
濃塩酸15ml加えたもの）2.0ml添加し、25℃で20分間放
置する。酵素反応０分の時の試料を対照として分光光度
計により435nmにて吸光度（△ＯＤ）を測定し、次の通
り計算する。
酵素液１ml中の酵素活性単位（Ｕ／ml）＝△ＯＤ×9.66
×酵素希釈倍率 ここで、クレアチン・アミジノヒドロラーゼ酵素活性は
上記の反応条件下で１分間に１μmol尿素を生成する酵
素量を１単位（１Ｕ）とする。
×酵素希釈倍率 ここで、クレアチン・アミジノヒドロラーゼ酵素活性は
上記の反応条件下で１分間に１μmol尿素を生成する酵
素量を１単位（１Ｕ）とする。
至適pH 至適pHは7.0〜8.0付近である。
使用した緩衝液はpH6.0〜8.0：リン酸緩衝液、pH7.0〜
9.0：トリス−塩酸緩衝液、pH8.5〜9.5：炭酸緩衝液で
ある。
9.0：トリス−塩酸緩衝液、pH8.5〜9.5：炭酸緩衝液で
ある。
pH安定性 各pHの緩衝液に酵素を加え、５℃にて48時間放置したの
ち、その残存活性を測定した。使用した緩衝液は前記の
ものと同様である。その結果、クレアチン・アミジノヒ
ドロラーゼはpH7.0〜8.5付近で安定であると認められ
る。
ち、その残存活性を測定した。使用した緩衝液は前記の
ものと同様である。その結果、クレアチン・アミジノヒ
ドロラーゼはpH7.0〜8.5付近で安定であると認められ
る。
熱安定性 クレアチン・アミジノヒドロラーゼの50mMリン酸緩衝液
溶液（pH7.5）1.0mlを各温度にて30分間処理したのち、
酵素の残存活性を測定した。その結果、クレアチン・ア
ミジノヒドロラーゼは40℃付近以下で安定であると認め
られる。
溶液（pH7.5）1.0mlを各温度にて30分間処理したのち、
酵素の残存活性を測定した。その結果、クレアチン・ア
ミジノヒドロラーゼは40℃付近以下で安定であると認め
られる。
至適温度 クレアチン・アミジノヒドロラーゼの反応の至適温度は
40℃付近であると認められる。
40℃付近であると認められる。
分子量 約50,000（ゲル過法により測定） 〔作用〕 この発明で用いる菌は、菌体外酵素生産能を有するの
で、酵素は培養液中に蓄積する。
で、酵素は培養液中に蓄積する。
したがって、菌体内酵素生産菌の場合のように、培養液
より菌体を分離し、これを磨砕、超音波処理または自己
消化等により酵素を分離、抽出する必要がない。
より菌体を分離し、これを磨砕、超音波処理または自己
消化等により酵素を分離、抽出する必要がない。
以下、この発明を実施例に基づきさらに具体的に説明す
る。
る。
実施例１ 可溶性でんぷん1.0%(w/v)、グルコース1.0%(w/v)、肉エ
キス0.75%(w/v)、ポリペプトン0.75%(w/v)、MgSO4・７H
2O 0.1%(w/v)、微量金属溶液(CuSO4・５H2O 10.0ｇ、Mn
Cl2・４H2O 10.0ｇ、ZnSO4・７H2O 100.0ｇを900mlの蒸
留水に溶かし、液が透明になるまで塩酸を加え、蒸留水
で１とする）0.1%(w/v)よりなる培地110ml(pH7.4)
を、500ml容の坂口フラスコに加え、120℃で20分高圧滅
菌後、微工研菌寄第5071号菌株を接種し、28℃で２日間
振盪培養して種菌を得た。次いでこの種菌をグルコース
20%(w/v)、大豆粉2.0%(w/v)、ポリペプトン0.2%(w/v)、
クレアチン0.5%(w/v)、NaNO30.2%(w/v)、KH2PO40.1%(w/
v)、MgSO4・７H2O 0.05%(w/v)、KCl 0.05%(w/v)、FeSO4
・７H2O 0.0001%(w/v)よりなる培地（pH8.0）５の入
った滅菌後の10容のジャーファメンターに移植し、28
℃で２日間、回転数400epm、通気量0.8l/minの条件下通
気攪拌培養した。
キス0.75%(w/v)、ポリペプトン0.75%(w/v)、MgSO4・７H
2O 0.1%(w/v)、微量金属溶液(CuSO4・５H2O 10.0ｇ、Mn
Cl2・４H2O 10.0ｇ、ZnSO4・７H2O 100.0ｇを900mlの蒸
留水に溶かし、液が透明になるまで塩酸を加え、蒸留水
で１とする）0.1%(w/v)よりなる培地110ml(pH7.4)
を、500ml容の坂口フラスコに加え、120℃で20分高圧滅
菌後、微工研菌寄第5071号菌株を接種し、28℃で２日間
振盪培養して種菌を得た。次いでこの種菌をグルコース
20%(w/v)、大豆粉2.0%(w/v)、ポリペプトン0.2%(w/v)、
クレアチン0.5%(w/v)、NaNO30.2%(w/v)、KH2PO40.1%(w/
v)、MgSO4・７H2O 0.05%(w/v)、KCl 0.05%(w/v)、FeSO4
・７H2O 0.0001%(w/v)よりなる培地（pH8.0）５の入
った滅菌後の10容のジャーファメンターに移植し、28
℃で２日間、回転数400epm、通気量0.8l/minの条件下通
気攪拌培養した。
次に得られた培養液を回転数3,500rpmで20分間冷却遠心
し、菌体その他の固形分を除き、粗製のクレアチン・ア
ミジノヒドロラーゼ含有液4050mlを得た。（クレアチン
・アミジノヒドロラーゼ酵素活性3888Ｕ） この粗製酵素液に硫酸アンモニウム2090gを添加して沈
殿物を回収した。この沈殿物を20mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.8)500mlに溶解して、同一緩衝液に対して一晩透
析後、この溶液20mlを20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
8）で平衡化したDE-AE−セルロース（ワットマン社製）
を充填したカラム（径３cm×21cm）にチャージし、0.15
M NaCl含有の同一緩衝液にて洗浄後、Nacl 0.15M〜0.7M
の濃度勾配で溶出し、活性画分を回収し、次にこの活性
画分を限外過器（東洋科学産業社製）を用いて濃縮し
た後、20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.8）に対して１晩
透析した後、この溶液を凍結乾燥してクレアチン・アミ
ジノヒドロラーゼの粉末（全活性1230Ｕ、蛋白質量350m
g、比活性3.5U/mg回収率32.2％）を得た。
し、菌体その他の固形分を除き、粗製のクレアチン・ア
ミジノヒドロラーゼ含有液4050mlを得た。（クレアチン
・アミジノヒドロラーゼ酵素活性3888Ｕ） この粗製酵素液に硫酸アンモニウム2090gを添加して沈
殿物を回収した。この沈殿物を20mMトリス−塩酸緩衝液
（pH7.8)500mlに溶解して、同一緩衝液に対して一晩透
析後、この溶液20mlを20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
8）で平衡化したDE-AE−セルロース（ワットマン社製）
を充填したカラム（径３cm×21cm）にチャージし、0.15
M NaCl含有の同一緩衝液にて洗浄後、Nacl 0.15M〜0.7M
の濃度勾配で溶出し、活性画分を回収し、次にこの活性
画分を限外過器（東洋科学産業社製）を用いて濃縮し
た後、20mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.8）に対して１晩
透析した後、この溶液を凍結乾燥してクレアチン・アミ
ジノヒドロラーゼの粉末（全活性1230Ｕ、蛋白質量350m
g、比活性3.5U/mg回収率32.2％）を得た。
以上に述べた如く、この発明によれば培養菌体より抽出
操作過程を経ずとも、一段操作で効率よく、クレアチン
・アミジノヒドロラーゼを得ることができる。
操作過程を経ずとも、一段操作で効率よく、クレアチン
・アミジノヒドロラーゼを得ることができる。
Claims (1)
- 【請求項１】アルカリゲネス属に属し、菌体外クレアチ
ン・アミジノヒドロラーゼ生産能を有する微工研菌寄第
5071号菌株を培養し、培養液よりクレアチン・アミジノ
ヒドロラーゼを分離、回収することを特徴とするクレア
チン・アミジノヒドロラーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23416385A JPH0657148B2 (ja) | 1985-10-18 | 1985-10-18 | クレアチン・アミジノ−ロラ−ゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23416385A JPH0657148B2 (ja) | 1985-10-18 | 1985-10-18 | クレアチン・アミジノ−ロラ−ゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6291182A JPS6291182A (ja) | 1987-04-25 |
| JPH0657148B2 true JPH0657148B2 (ja) | 1994-08-03 |
Family
ID=16966647
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23416385A Expired - Lifetime JPH0657148B2 (ja) | 1985-10-18 | 1985-10-18 | クレアチン・アミジノ−ロラ−ゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0657148B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3075390B2 (ja) * | 1996-02-13 | 2000-08-14 | 東洋紡績株式会社 | 新規なクレアチンアミジノヒドロラーゼ、その製法およびその用途 |
| JP2000157279A (ja) | 1998-11-25 | 2000-06-13 | Kikkoman Corp | クレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法 |
| JP3773160B2 (ja) * | 1999-01-01 | 2006-05-10 | キッコーマン株式会社 | 耐熱性クレアチンアミジノハイドロラーゼ及びその製造法 |
-
1985
- 1985-10-18 JP JP23416385A patent/JPH0657148B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6291182A (ja) | 1987-04-25 |
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