JPH0660197B2 - タンパク質の不溶性凝集物または複合体からのタンパク質の可溶化、精製および特性決定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、一般に、不溶性複合体（ｃｏｍｐｌｅｘ）ま
たは凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）の中に存在するタン
パク質の精製に関する。とくに、本発明は、解離濃度段
階勾配（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒ
ａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ ｇａｒａｄｉｅｎｔ）、例え
ば、尿素濃度勾配を使用して複合体または凝集物の中の
タンパク質を選択的に可溶化しかつ分離しならびに前記
タンパク質を特性決定することに関する。さらに、本発
明は、本発明の方法に従ってタンパク質凝集物から可溶
化されかつ精製された１種または２種以上のタンパク質
からなる組成物に関する。本明細書における本発明の実
施例は組み換え単純性疱疹ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓ
ｙｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）Ｉ型の糖タンパク質Ｄ（Ｈ
ＳＶ ｇＤ−１）の精製に関するが、本発明はそれに限
定されず、一般に不溶性のタンパク質の複合体または凝
集物からタンパク質を可溶化しかつ精製すること、なら
びにそれから誘導される組成物に関する。さらに、本発
明の目的によって、タンパク質凝集物はタンパク質複合
体を包含しかつタンパク質複合体と同一と考えられる。

組み換えＤＮＡ技術の出現は、なかでも、微生物系を通
して、従来不可能でありおよび／または生産が費用の面
から禁止的であった、商業的に意味のある量でタンパク
質を生産することを約束するようになった。結局、多数
の研究所において、組み換えＤＮＡ技術を用いて特定の
ヒト、バクテリア、ウイルスまたは他のタンパク質の合
成を命令することのできる発現ベクターが生産されてい
る。非常に頻繁に、これらの組み換えＤＮＡ誘導タンパ
ク質は宿主微生物系の中に不溶性凝集物を形成する。
［ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）、Ｔ．Ｊ．Ｒ．、“大腸菌中
の真核生物の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｕ
ｋａｒｙｏｔｉｃ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ）”、遺伝子工
学（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、Ｖｏ
ｌ．４、ウイルアムスン（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ）、
Ｒ．（編）、（英国、ロンドン、アカデミック・プレ
ス）、１２７−１８３ページ；ウイルアムス（Ｗｉｌｌ
ｉａｍｓ）、Ｄ．Ｃ．ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）２１５、６８７（１９８２）；チェング（Ｃｈｅｎ
ｇ）、Ｙ−Ｓ．Ｅ．、バイオケミカル・アンド・バイオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケイションズ（Ｂｉｏ
ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）、
III、１０４（１９８３）；およびウェッツェル（Ｗｅ
ｔｚｅｌ）、Ｒ．およびゲッデル（Ｇｅｄｄｅｌ）、
Ｄ．Ｖ．、“組み換えＤＮＡ法によるポリペプチドの合
成（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄ
ｅｓ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ ｍｅｔ
ｈｏｄｓ）”、ザ・ペプリド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ
ｓ）”、Ｖｏｌ．５（アカデミック・プレス・インコー
ポレーテッド、１９８３）１−６４ページ。］ 組み換ＤＮＡ発現ベクターの使用から得られるタンパク
質凝集物の加えて、多数の生物学的系に普通の天然に産
出する凝集物タンパク質複合体が存在する。［スコープ
ス（Ｓｃｏｐｅｓ）、Ｒ．Ｋ．、“沈殿および粒状物質
の分離（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｅｃｉｐｉ
ｔａｔｅｓ ａｎｄ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ｍａｔ
ｅｒｉａｌ）”、タンパク質の精製の原理および実際
（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）”、キャ
ンター（Ｃａｎｔｏｒ）、Ｃ．Ｒ．（編）、（スプリン
ジャー・アドバンスド・テキスツ・イン・ケミストリー
（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｅｘｔｓ
ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１９８２）３−８ペー
ジ。］ こうして、このような凝集物の一部である特定のタンパ
ク質および特定のタンパク質類の回収および精製は、こ
の分野において実施する者が直面する共通のかつ実質的
な問題である。不溶性凝集物として存在する１種または
２種以上のタンパク質からなるワクチンおよび組成物の
生産は、また、意味のある問題である。

不活性化病原体に対する尿素の使用か記載された。［ヒ
ルマン（Ｈｉｌｌｅｍａｎ）、Ｍ．Ｒ．ら、ジャーナル
・オブ・インフェクション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｎ）、７、Ｓｕｐｐ．１、３（１９８
３）；ダーニック（Ｄｅｒｎｉｃｋ）、Ｒ．“ポリオウ
イルスの抗原構造（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｓｔｒｕｃｔ
ｕｒｅ ｏｆ ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ）”、インターナ
ショナル・シンポジウム・オン・リアセスメント・オブ
・インアクチベイテッド・ポリオミエリチス・ワクチン
（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ
ｏｎ Ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｎａｃｔｉ
ｖａｔｅｄ Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ Ｖａｃｃｉ
ｎｅ）、ビルソウベン（Ｂｉｌｔｈｏｖｅｎ）、１９８
０、生物学の標準化における発展（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔｓ ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒ
ｄｉｚａｔｉｏｎ）、４７、３１９、［Ｓ．カーゲル
（Ｋａｔｇｅｌ）、バーゼル、１９８１］；およびテイ
バー（Ｔａｂｏｒ）、Ｅ．ら、ジャーナル・オフ・メデ
ィカル・ヴィロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒ
ｏｌｏｇｙ）（Ｕ．ＳＡ．）、１１、１（１９８
３）。］さらに、複合体分子を解離するめの尿素の使用
は、また、報告された。［シュレヒト（Ｓｃｈｌｅｃｈ
ｔ）、Ｓ．およびバトナガー（Ｂｈａｔｎａｇａｒ）、
Ｎ．ゼンタル・バクテリオル・ミクロビアル・ハイジー
ン（Ｚｅｎｔａｌ Ｂａｋｔｅｒｉｏｌ Ｍｉｋｒｏｂ
ｉｏａｌ Ｈｙｇ．）、（西ドイツ）、２５１（１）、
１９６（１９８１）；レーラー（Ｌｅｈｒｅｒ）、Ｓ．
Ｂ．ら、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊｏｕｒｎ
ａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）（Ｕ．Ｓ．Ａ．）
１１４（１）、３４（１９７５）；デイレン（Ｄａｌｅ
ｎ）、Ａ．Ｂ．、アクタ・パソロジカ・ミクロビロロジ
カ・スカンジナビカ（Ａｃｔａ Ｐａｔｈ． Ｍｉｃｒ
ｏｂｉｏｌ． Ｓｃａｎ．）、節Ｂ（デンマーク）、８
３、５６１（１９７５）；ヘンチング（Ｈｅｌｔｉｎ
ｇ）、Ｔ．Ｂ．およびブラッコルブ（Ｂｌａｃｋｋｏｌ
ｂ）、Ｆ．”ボルデラ・ペルツシスから抽出され保護さ
れた抗原を調製するために有効手順（Ａｎ ｅｆｆｅｃ
ｔｉｖｅ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｆｏｒ ｐｒｅｐａｒ
ｅｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ
ａｎｔｉｇｅｎ ｆｒｏｍ Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐ
ｅｒｔｕｓｓｉｓ）”、ザ・サード・インターナショナ
ル・シンポジウム・オン・ペツシス（Ｔｈｉｒｄ Ｉｎ
ｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ ｏｎ
Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ナショナル・インスチチュート
・オブ・ヘルス、部６、３３１−３３７（１９７
８）。］尿素をＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓｅｐｈａ
ｄｅｘ）クロマトグラフィーと組合わせて使用すること
［キタ（Ｋｉｔａ）、Ｅ．ら、ミクロバイオロジカル・
イムノロジー（Ｍｉｃｒｏｂ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、
２７、７（１９８３）］および尿素をＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲルの電気泳動と組合わせて使用すること
［ケウ（Ｋｅｗ）、Ｏ．Ｍ．ら、ジャーナル・オブ・ヴ
ィロロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ）、３３、２５６（１９８０）］は知られている。し
かしながら、変化する濃度の解離溶液によりタンパク質
凝集物を沈殿させ、タンパク質を可溶化し、精製しかつ
特性決定する方法は未知であり、そして新規である。

したがって、本発明の目的は、細胞抽出液の中に不溶性
凝集物として存在するタンパク質分子を可溶化しかつ精
製する方法を提供することである。さらに詳しくは、本
発明の目的は、純粋でない場合、比較的純粋な可溶性タ
ンパク質を不溶性凝集物から生産する方法を提供するこ
とである。

とくに、本発明の他の目的は、単一の工程で不溶性凝集
物からタンパク質を可溶化し、部分的に精製し、そして
特性決定する方法を提供することである。

なおさらに、本発明の目的は、従来不溶性凝集物として
存在した１種または２種以上のタンパク質からなるワク
チンのような組成物を提供することである。

本発明の新規な方法は、タンパク質の凝集物を可溶化す
る化合物（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎ
ｄ）の溶液の２種または３種以上の濃度の段階勾配（ｓ
ｔｅｐ ｇｒａｄｉｅｎｔ）の上に層状に重ね（ｌａｙ
ｅｒ）、前記勾配を遠心し、次いで得られた勾配を分別
して問題の可溶化されたタンパク質を捜し出す（ｌｏｃ
ａｔｅ）することからなる。本発明の新規な方法は、タ
ンパク質の凝集物を可溶化する化合物の溶液の１または
２以上の濃度を同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）し、次いでこ
れを、引続く段階勾配を使用しないで、凝集物からタン
パク質を可溶化するために用いることができる。

本発明に従い不溶性凝集物から可溶化され、そして精製
されたタンパク質は、従来の方法で、前記タンパク質か
らなるワクチンおよび他の組成物の製造に使用される。

本発明の新規な方法は、その本質的寄与として、遠心の
間にタンパク質凝集物の成分を可溶化しかつ部分的に精
製し、ならびにタンパク質凝集物の溶解を特性決定する
能力を有する。密度段階勾配によるタンパク質凝集物の
可溶化および同時の沈殿を達成するために、尿素段階勾
配をここでは用いる。

段階勾配における尿素の使用は、新規な系である組合わ
された密度および解離勾配を提供する。タンパク質凝集
物の沈降および解離の性質を利用して、このような凝集
物の構成成分のタンパク質を分別し、これにより精製す
る。グアニジンＨＣｌまたはドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）の使用は、ある種のタンパク質、例えば、注
射用物質として使用されるもののための可溶化に許容さ
れうる手段ではない。なぜなら、グアニジンＨＣｌはタ
ンパク質の免疫原性に悪影響を及ぼし、そしてＳＤしゃ
タンパク質に強く結合するからである。尿素はグアニジ
ンＨＣｌおよびＳＤＳの使用が生ずる問題を阻止せず、
そして、さらに、尿素は遠心および分画の後、透析によ
り定量的に除去することができる。

本発明によれば、適当な緩衝液中の２種または３種以上
の変化する濃度の尿素溶液を、互いに重なるようにし
て、遠心管の中に濃度が減少する方法で層状にする。こ
の層状化は段階勾配を形成する。タンパク質凝集物は、
適当な緩衝液、例えば、リン酸塩緩衝化生理的食塩水
（ＰＢＳ）の中に懸濁され、勾配の上部に層状化され、
そしてこの勾配を遠心する。遠心の間、尿素の濃度が凝
集物を可溶化する濃度になるまで、凝集物は尿素を通し
て沈殿する。

本発明に新規な面、さらに詳しくは、新規な尿素の段階
勾配は、凝集物のタンパク質を可溶化し、かつ部分的に
精製する上で多数の機能をはたす。尿素の低い濃度（す
なわち、勾配の上部）は非特異的に結合した汚染性タン
パク質を除去を促進する。尿素で可溶化されたタンパク
質は、それが可溶化される尿素の濃度にとどまる。さら
に、用いる尿素のすべての濃度において不溶性である汚
染性成分は、遠心管の底に沈殿する。さらに、問題のタ
ンパク質を可溶化することのできる尿素の濃度が段階勾
配の使用によりいったん決定されると、その段階勾配を
使用しないで決定された濃度を用いて直接の可溶化を実
施することができ、次いで問題ではない不溶性物質を沈
殿させる遠心を実施することができる。

本発明は、一例として、単純性疱疹ウイルスＩ型の組み
換え糖タンパク質Ｄを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｌｉ）の全体の細胞抽出液の凝集物から精製しかつ
可溶化するために、この新規な方法を使用することを記
載する。一例として、それには限定されないが、本発明
の方法は、Ｂ型肝炎の表面抗原のタンパク質凝集物、ポ
リオウイルスタンパク質および成長ホルモンの凝集物に
適用することができる。凝集物の特定のタンパク質の精
製に用いるべき本発明の方法に必要なこのような変更
は、ここに含まれる開示を用いると、当業者にとって自
明であろう。しかしながら、この方法は、同様な性質の
異なる凝集物タンパク質を、本発明ん範囲を逸脱しない
で、用いる緩衝液の尿素濃度、pH、塩およびイオン濃度
および遠心条件を変化させることによって精製するよう
に変更することができるが、ただし凝集物は尿素の段階
勾配の使用のために少なくとの高いモル濃度の尿素中で
可溶性でなくてはならない。他の段階勾配、例えば、グ
アニジンＨＣｌを適当ならば本発明の範囲を逸脱しない
で使用することができる。用いる遠心速度は、凝集物の
沈降速度ならびに凝集物の大きさに依存するであろう。
適当な遠心速度の決定は、当業者に知識の範囲内であ
る。

本発明の１つの実施態様において、尿素の段階勾配は７
Ｍ（モル）、６Ｍ、５Ｍ、４Ｍおよび３Ｍの尿素の濃度
からなる。他の実施態様において、尿素の段階勾配は８
Ｍ、７Ｍ、６Ｍ、５Ｍおよび４Ｍからなる。このような
実施態様において、勾配は少なくとも約１１３，０００
×ｇ（ｒ最大）で約４℃〜約１５℃の温度において約１
時間遠心することができる。

本発明の好ましい実施態様において、尿素の濃度は５０
ｍＭ（ミリモル）のＴＲＩＳ（トリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン）、１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジア
ミン四酢酸）および１ｍＭのＤＴＴ（１，４−ジチオス
レイトール）、pH９．０、からなる緩衝液の中において
調製される。このような好ましい実施態様のタンパク質
凝集物は、０．８ｍＭのリン酸ナトリウム、二塩基性、
２．３ｍＭのリン酸カリウム、一塩基性、および０．１
５Ｍの塩化ナトリウムからなるＰＢＳの中に懸濁され
る。前記好ましい実施態様において用いる尿素の濃度は
７Ｍ、６Ｍ、５Ｍ、４Ｍおよび３Ｍであり、およびタン
パク質凝集物を含む勾配を約４５分間約１１３，０００
×ｇ（ｒ最大）で約１０１０℃において遠心する。

段階勾配の遠心後、勾配を分別する。１つの分別の方法
は、勾配管の底に沈殿物の側において孔を開けることで
ある。次いで、分画を底から集める。

次いで、前述のように集めた分画を問題のタンパク質の
存在についてアッセイする。例えば、分画からの試料を
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動またはこの
分野においてよく知られた他の手段によりアッセイする
ことができる。このようにして、問題のタンパク質を含
有する分画を確認することができる。

次いで、前述のように決定して、分画の中に含有される
タンパク質は、この分野においてよく知られた技術を使
用して、必要に応じてさらに精製および／または濃縮す
ることができる。このような技術は、イオン交換クロマ
トグラフィー、透析および限外濾過を包含する。

次いで、本発明の方法に従って可溶化および精製された
タンパク質を用いて従来法に従い組成物、例えば、ワク
チンを調製することができる。例えば、タンパク質を水
酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムまたはた他の製
薬学的に許容されうるジュバントまたは担体へ結合させ
ることができる。

次いで、上のように調製されたワクチンを、この分野に
おいてよく知られた単位の投与量を決定して、それぞれ
の病原体に対して慣用法で用いてワクチン接種する。タ
ンパク質はワクチンの単一の投与後に引き出されること
ができ、あるいは数回のブースター投与を必要とするこ
とがある。ワクチン組成物は、１種または２種以上のタ
ンパク質に加えて、免疫学的に許容されうる希釈剤およ
び担体ならびに普通に用いられるアジュバント、例え
ば、みょうばん、フロインド完全アジュバント、サポニ
ンなどを含むことができる。本発明のワクチン組成物は
単独で投与することができ、あるいは、免疫学的に許容
されうる場合、他のワクチンと組合わせて投与すること
ができる。

ｇＤ−１（ｐＥＨ １０２）の主要部分について暗号を
指定する（ｃｏｄｅ ｆｏｒ）組み換えプラスミドを含
有する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）
（ＮＦ１８２９）株からの組み換え糖タンパク質Ｄ−１
（ｇＤ−１）の精製に適用する本発明の方法を、下に記
載する。組み換えプラスミドｐＥＨ １０２を含有する
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（ＮＦ１
８２９）株［レーサン・リージョナル・リサーチセンタ
（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｓｅａｒｃ
ｈ Ｃｅｎｔｅｒ）にＮＲＲＬ Ｂ−１５９１６で受託
された］ならびにこれにより生産される糖タンパク質Ｄ
−１は、ロージャー（Ｒｏｇｅｒ）Ｊ．ワトソン（Ｗａ
ｔｏｓｏｎ）、ジョン（Ｊｏｈｎ）Ｈ．ウェイス（Ｗｅ
ｉｓ）およびリン（Ｌｙｎｎ）Ｗ．エンクイスト（Ｅｎ
ｑｕｉｓｔ）の米国特許出願、第７６，５３８号に開示
されている。これにより生産される組み換ｇＤ−１タン
パク質は、大きさがほぼ４５Ｋ（すなわち、分子量がほ
ぼ４５，０００）である。したがって、組み換えタンパ
ク質ｇＤ−１タンパク質を以後４５Ｋまたは４５Ｋタン
パク質と呼ぶ。４５Ｋタンパク質の精製に適用する方法
の説明は、例示であり、そして本発明を後述する特定の
精製法にいかなる方法でも限定するものではない。

実施例１ 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮＦ１８
２９（ｐＥＨ １０２）株の１０１のバッチの部分から
得られた４５Ｋタンパク質の精製 細胞の溶解および初期の凝集物の精製 ＮＦ１８２９（ｐＥＨ １０２）株の発酵から回収され
たバクテリア細胞の沈殿物の３８．２ｇ（湿潤重量）の
部分を、２０ミリモル（ｍＭ）のリン酸ナトリウム／カ
リウム、１０％のグリセロール、０．５％のＮＰ４０
［ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、ベセスダ・
リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）］および１．
０ｍＭのＥＤＴＡからなるバクテリア細胞抽出緩衝液の
中に１８０mlの合計体積に再懸濁した。この混合物を約
３０分間４℃において時々混合しながらインキュベーシ
ョンした。次いで、３６．０mgのリゾチームを前記バク
テリア細胞懸濁液に添加し、そしてこの懸濁液を時々混
合しながら４℃のいて１時間インキュベーションした。
４５０mgの量のＺ３−１４粉末［ツウィッタージェント
（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）３−１４、カルバイオケム
−ベーリング・コーポレーション（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅ
ｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）］を上
の懸濁液に混合しながら添加した。次いで、この懸濁液
を時々混合しながらほぼ３０分間４℃でインキュベーシ
ョンすると、粘度の劇的な増加が起こった。バクテリア
のリゼイトをヒート・システム（Ｈｅａｔ Ｓｙｓｔｅ
ｍ）Ｗ−３７５ソニケーター［ウルトラソニック・イン
コーポレーテッド（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｉｎ
ｃ．）］により、１分のバーストで、２分間激しく超音
波処理し、次いで６５×ｇ（ｒ最大）（５００ｒｐｍ、
ＲＦ−６０００遠心機（インターナショナル・イクウィ
プメント・カンパニー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔｏ Ｃｏ．））の２５９ローター］
において４℃で５分間遠心した。上澄み液の上部の粘稠
な泡をＳＷ２７、ポリアルロマー（ｐｏｌｙｌａｌｌｏ
ｍｅｒ）２．５４cm×８．８９cm（１″×３．５″）遠
心管［ベックマン・インスツルメンツ・インコーポレー
テッド（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉ
ｎｃ．）］、各々３．０mlの４０ｗ／ｖ％のスルロー
スを含有する、へ移した。管をバクテリア細胞抽出緩衝
液で均衡させ、ＳＷ２７ローターに入れ、そしてＬ２−
６５超遠心機［ベックマン・インスツルメンツ・インコ
ーポレーテッド（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎ
ｔｓ Ｉ ｎｃ．）］により１１３，０００×ｇ（ｒ最
大）（２５，０００ｒｐｍ）において４℃で１時間遠心
した。懸濁液の分画（スクロースを含む）を集め、−７
０℃で貯蔵した。得られる沈降物をＰＢＳ（０．８のリ
ン酸ナトリウム、二塩基性、２．３のリン酸カリウム、
一塩基性および０．１５モルの塩化ナトリウム）の中に
懸濁させ、前述のように超音波処理し、次いで−７０℃
で貯蔵した。

懸濁したペレットを含有する遠心管を融解し、次いで２
５０mg／管のＺ３−１４粉末を添加することによって、
不溶性４５Ｋタンパク質をさらに精製した。管の内容物
を渦形成し、そしてヒート・システム（Ｈｅａｔ Ｓｙ
ｓｔｅｍ）の標準マイクロチップ（ｍｉｃｒｏｔｉｐ）
で短時間（１５〜３０秒間）超音波処理し、次いでバク
テリア抽出緩衝液で５０mlの容積にし、そして再び渦形
成した。等体積の再懸濁した沈殿物混合物を６本のＳＷ
２７遠心管に分配し、前記管の各々は１のＥＤＴＡ（Ｐ
ＢＳ−ＥＤＴＡ）を含有する前述のような滅菌濾過した
リン酸ナトリウム／カリウム緩衝化生理的食塩水中の１
０mlの新しく調製した４０％（ｗ／ｖ）のスクロースを
含有した。これらの管にバクテリア細胞抽出緩衝液を充
填し、そしてＬ２−６５超遠心機により１１３，０００
×ｇ（ｒ最大）（２５，０００）において４℃で１時間
遠心した。各管からの上澄み液およびスクロースのカッ
ト（ｃｕｔ）を集め、別々にプールすると、沈殿した凝
集物が残った。これらの凝集物を滅菌濾過したＰＢＳ−
ＥＤＴＡの中に再懸濁し、そしてプールした。これらの
管を追加の緩衝液で洗浄し、そして洗浄液をプールした
凝集物に添加し、これらを前述のように６０秒間超音波
処理した。次いで、この懸濁液を４℃で貯蔵した。

尿素段階勾配縁の調製 ３．０２８５ｇのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タン（ＴＲＩＳ）、１４６．１mgのエチレンジアミノ四
酢酸（ＥＴＴＡ）および７７．１mgの１，４−ジチオス
レイトール（ＤＴＴ）を含有する約４００mlの蒸留水中
に２４０．２４ｇの尿素を溶解することによって、８モ
ル（Ｍ）の原溶液を調製した。この溶液を塩酸でpH９．
０の調節し、容積を蒸留水で５００mlにし、そしてこの
溶液をナルゲン（Ｎａｌｇｅｎｅ ）０．２μｍのフィ
ルター［ナルゴ・カンパニー（Ｎａｌｇｏ Ｃｏ．）、
シブロン・コーポレーション（Ｓｙｂｒｏｎ Ｃｏ．）
のディビジョン（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、ロチェスター、
ＮＹ １４６０２］に通して濾過した。得られる溶液
（緩衝液Ａ）は８Ｍの尿素、５０ｍＭのＴＲＩＳ ＨＣ
ｌ、１ｍＭのＥＤＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴからなる。

また、尿素を含まない原緩衝液溶液（緩衝液Ｂ）を前述
の方法で調製し、これは５０ｍＭのＴＲＩＳ、１ｍＭの
ＥＤＴＡおよび１ｍＭのＤＴＴからなり、塩酸でpH９．
０に調節した。

前述の原溶液を利用して、下表Ｉに示す尿素溶液の４８
mlを調製した。

この系列の６つのＳＷ２７遠心管に、次の尿素濃度の各
々の６．０mlを互いの上に下降する濃度で積重ねて添加
した：７Ｍ、６Ｍ、５Ｍ、４Ｍおよび３Ｍ。

試料の調製 １８．０mlの量の先行する４５Ｋ凝集物溶液（５０．０
ml）を１８．０mlの緩衝液Ｂと合わせかつ混合した。次
いで、段階勾配の３Ｍ層の上に６．０mlの調製した試料
を重ねた。

尿素段階勾配物の遠心および精製 勾配管をＳＷ２７ローターに入れ、そして約１０℃およ
び約１１３，０００×ｇ（ｒ最大）（２５，０００）に
おいてＬ２−６５遠心機内で約４５分間遠心した。残留
沈殿側に針で孔を開けて、勾配分画を管の底から集め
た。７Ｍ、６Ｍ、５Ｍ、４Ｍおよび３Ｍの濃度の個々の
分画を別々の遠心管内に集め、これらを分画中の尿素の
モル濃度に従ってラベルを付した。分画間の界面におい
て明らかな黄色の帯は、収集を促進した。また、分画の
収集は管中の形態の上表面に空気圧を加えることによっ
て促進された。これは緊密な栓を管の上部に取り付ける
ことによって達成された。栓を上部から取り付け、１８
ゲージの注射針をその中央に通し、栓の底から丁度突出
させた。針を５０mlの注射器へある長の小さい孔の圧力
管で接続した。注射器のプランジャーを押下げると、圧
縮された空気は液体の上表面に対して向けられ、これに
より分画の収集をコントロールした。

前述のように集められた勾配の１つの尿素勾配の分画
を、バイオーラド・プロテアン（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ Ｐｒ
ｏｔｅａｎ ）二重スラブセル装置［バイオーラド・イ
ンコーポレーテッド（Ｂｉｏ−Ｒｅｄ，Ｉｎｃ．、カリ
フォルニア州 ９４８０４、リッチモンド、ライト・ア
ベニュー２２００］を使用して３８Ｖで１６〜１８時
間、ドデシル硫酸ナトリウム ポリアクリルアミドゲル
の電気泳動）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、ここでラエン
ムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ），Ｕ．Ｌ．，ネイチャー（Ｎａ
ｔｕｒｅ）（ロンドン），２２７，６８０（１９７０）
の手順に従い、直線の５〜２０％（ｗ／ｖ）のポリアク
リルアミド勾配を含有する不連続の緩衝液を使用した。
このゲルを５０％（ｖ／ｖ）のメタノールおよび７％の
酢酸中に０．５％（ｗ／ｖ）のクーマッシーブルーＲ２
５０（バイオーラド）を含有する溶液中で着色した。５
％のメタノールおよび７％の酢酸中で洗浄することによ
り、過剰の染料を除去した。結合しない染料を除去した
後、湿潤ゲルの写真を撮った。このゲルは尿素溶解タン
パク質が７Ｍ、６Ｍ、５Ｍ、４Ｍおよび３Ｍの分画中に
存在することを示した。次いで、６つの勾配の各々から
７Ｍ、６Ｍ、５Ｍ、４Ｍおよび３Ｍの尿素の分画（合計
２４ml）をプールして１４４mlを得た。

イオン交換クロマトグラフィー 可溶性４５Ｋを含有するプールした分画（１４４ml）を
４５mlのＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）ビ
ーズ［ファーマシア・ファイン・ケミカルス（Ｐｈａｒ
ｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）ＡＢ、ス
ウェーデン、ウップサラ］と混合した。前記ビーズは前
もって緩衝液Ａ中の０．５モルの塩化ナトリウムと平衡
化し、次いで塩化ナトリウムを含まない緩衝液Ａで平衡
化されている。ビーズをプールした混合物と回転振盪器
上で４℃において４８時間反応させた。

次いで、４５Ｋタンパク質溶液およびビーズを［バイオ
ーラド・ラボラトリーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒ
ａｔｏｒｉｅｓ）リッチモンド、カリフォルニア州 ９
４８０４］からの４８mlのエコノ＝カラム（Ｅｃｏｎｏ
−Ｃｏｌｕｍｎ）（１．５×３０cm）の中にゆっくり挿
入した。次いで、このカラムを５０mlの緩衝液Ａで洗浄
し、そして溶離液の４．０mlの分画の収集を開始した。
次いで、タンパク質の溶離を０．５Ｍの塩化ナトリウム
を含有する緩衝液Ａをカラムに通し手流すことによって
開始した。４．０mlの分画の収集を続け、分画をＳＤＳ
−ＰＡＧＥゲルの電気泳動により４５Ｋタンパク質の存
在について監視した。

溶離液の分画１１〜３４の内容物を、硫酸ナトリウム、
二塩基性０．８３ｇ／Ｌ、リン酸カリウム、一塩基性
０．１１３ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム８．５０ｇ／Ｌおよ
び２％のナトリウムチメロサルから構成された緩衝液に
対して透析した。シドニー（Ｓｈｉｄｎｅｙ）Ｐ．コロ
ウィッチ（Ｃｌｏｗｉｃｈ）およびネイサン（Ｎａｔｈ
ａｎ）Ｏ．カプラン（Ｋａｐｌａｎ）、酵素学の方法
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），Ｖ
ｏｌ．III、（アカデミック・プレス・インコーポーレ
ーテッド、１９５７）、４４７ページに報告されている
ロウリー（Ｌｏｗｒｙ）のタンパク質アッセイの修正法
に従い、タンパク質の定量を透析した分画について実施
した。

さらに、分画３９〜５０を前述の５〜２０％のＳＤＳ−
ＰＡＧＥゲルを使用する電気泳動により個々にアッセイ
した。タンパク質の定量の結果および電気泳動により、
４５Ｋタンパク質はカラムから０．５Ｍの塩化ナトリウ
ムの存在下にゆっくり溶離されることが示された。

残りのカラム結合４５Ｋタンパク質をＤＥＡＥ−セファ
セルのビーズから溶離するために、１Ｍの塩化ナトリウ
ムを含有する緩衝液Ａの溶液を調製した。この溶液をカ
ラムに通過させ、そして溶離液の４．０mlの分画の収集
を続けた（分画５１〜７９を含む）。個々の分画を前述
のようにＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析すると、タンパク
質の溶離は最終の溶離液において本質的に完結されたこ
とが示された。

分画５１〜５８および５９〜６６を別々にプールし、そ
して前述のように透析すると、それぞれ３３．０mlおよ
び３２．０mlが得られた。プールした分画の合計のタン
パク質含量は、ロウリーの手順により、それぞれ１０．
８２mgおよび１１．６４mgであることが決定された。２
つの容積を合わせ、そしてＰＭ−１０膜を取り付けた５
０mlのアミコン（Ａｍｉｃｏｎ ）濾過装置（アミコン
・コーポレーション、マサチュセッツ州、デンバース）
により２．８kg/cm²（４０ｐｓｉ）の窒素ガスを使用し
て４０．０mlに濃縮した。濃縮した濾液をロウリーのタ
ンパク質アッセイにより評価し、そしてカラムに装填し
た合計のタンパク質の７３．５％（０．４１２９μｇ／
ml）が回収されたことが示された。

次いで、前述にような５〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲ
ルのゲル電気泳動により、２．５および５．０μｌのア
リコートの濃縮物をゲルに適用し、そしてタンパク質を
高分子量のタンパク質マーカー（ｍａｒｋｅｒ）（ＨＭ
Ｗ）および１．０μｌのアリコートの４５Ｋのプールし
た凝集物と尿素段階勾配により遠心前に比較することに
よって、４５Ｋタンパク質の濃縮物を評価した。第１図
を参照。

第１図は、次の成分の位置を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの写
真である：ゲルスロット２におけるＨＭＷマーカー；ゲ
ルスロット４における２．５μｌのアリコートの精製さ
れた４５Ｋの濃縮物；ゲルスロット６における５．０μ
ｌのアリコートの精製された４５Ｋの濃縮物；およびゲ
ルスロット８における１μｌのアリコートの４５Ｋのプ
ールされた凝集物。

６１０ｎｍの波長におけるＣＡＭＡＧデンシトメーター
ＴＬＣスキャナー［ＣＡＭＡＧ、ムッテンズ（Ｍｕｔｔ
ｅｎｚ）、スイス］を使用する「湿潤ゲル」について実
施した作濃度測定反射率分析、カラムから回収した合計
のタンパク質の８３．４〜１００％が４５Ｋタンパク質
であることを示した。

可溶性４５Ｋの生体内試験 本発明の方法に従い製造された可溶性４５Ｋタンパク質
は、単純性疱疹ウイルス２型との足の対抗（ｆｏｏｔｐ
ａｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対するマウスの保護を提
供する。ｇＤ関連組み換えタンパク質で免疫化した後、
単純性疱疹ウイルス２型（ＨＳＶ−２）との足の対抗に
対するマウスの保護を決定するように案出した試験にお
いて、おすのＢａｌｂ／ｃマウスを使用する。６〜１０
匹のマウスの群を試験するワクチンの各々について使用
し、対照として１０匹の免疫化しないマウスを使用し
た。試験したワクチンは次の通りである：ＰＢＳ中の４
５Ｋ凝集物；ＰＢＳ中の可溶性４５Ｋ；水酸化アンモニ
ウムに結合した可溶性４５Ｋ；そして水酸化アンモニウ
ムに結合した自然ｇＤ−１（ＨＳＶ−１）。また、ＰＢ
Ｓおよび水酸化アンモニウムの賦形剤を別々に評価し
た。

マウスに０．２mlのワクチンまたは賦形剤を第０日に筋
肉内に接種した（第１回の免疫化）。免疫化後第２１日
に、動物に０．２mlのワクチンまたは賦形剤を筋肉内に
接種した（免疫化）。組み換えタンパク質を１００μｇ
／マウスの合計（５０μｇ／マウス／免疫化）で与え、
そして自然ｇＤ−１を６μｇ／マウスの合計（３μｇ／
マウス／免疫化）で与えた。第１免疫化後第２８日に、
マウスをレトローオービタル放血（ｒｅｔｒｏ−ｏｒｂ
ｉｔａｌ ｂｌｅｅｄｉｎｇ）により放血させた。次い
で、第３０日に、マウスにＨＳＶ−２株１８６、対抗ウ
イルス、を接種した。マウス当りに接種したＨＳＶ−２
株１８６の投与量は、≧３２ ＰＤ_５０を有すると計算
された。１ＰＤ_５０は接種したマウスの５０％において
麻痺を起こすウイルスの投与量である。対抗投与量は、
０．０３mlのウイルスを各マウスの右後足の中に接種す
ることによって投与した。次いで、ウイルスの対応から
５０日の観測期間を開始した。

生体内試験の結果を下表IIに記載する。可溶性４Ｋ５−
Ａｌ（ＯＨ₃）を用いる免疫化は、すべてのマウスを麻
痺および／または死から保護した。

可溶性４５Ｋの生体外試験 可溶性４５Ｋを後述する微量中和アッセイ（ｍｉｃｒｏ
ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）に従い生
体外で試験した。９６ウェル（ｗｅｌｌ）の組織培養板
に、ベイビー・ハムスター・キドニー（Ｂａｂｙ Ｈａ
ｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ）（ＢＨＫ）細胞を、５％の
牛胎児血清（ＦＣＳ）および０．１％のゲンタマイシン
を含有するイーグルの最小必須培地（ＥＭＥＭ）中の
４．５×１０⁴細胞／ウェルで接種した。次いで、板を
５％のＣＯ₂インキュベーター中で細胞が全面生長する
まで、３７℃でインキュベーションした。次いで、対照
または免疫化マウスからの実験用血清の系統的２倍希釈
物を、９６ウェルの希釈板（ウェルＧ〜Ａ）においてＥ
ＭＥＭを希釈剤として使用して調製した。列Ｈに１５μ
ｌ／mlの希釈剤を与え、そしてこれは血清不含対照を表
わした。列Ｇを使用して最初の３０μｌの血清試料の
１：３希釈物を調製した。系統的２倍希釈物を列Ｇ〜列
Ａにおいて調製した。最終の希釈は１：６〜１：３８４
の範囲であった。

単純性疱疹ウイルス１型（ＨＳＶ−１）株ＭｃＩｎｔｙ
ｒｅまたは２型（ＨＳＶ−２）株野性（ｓａｖａｇｅ）
のストック（ｓｔｏｃｋ）を、３０％の熱不活性化（５
６℃、３０分）ＦＣＳおよび１０％のモルモットの補体
を含有するＥＭＥＭ中に希釈した。１５μｌが６０プラ
ーク形成単位（ＰＦＵ）のウイルスを含有するように、
最後のウイルスの希釈物を調製した。１５μｌのアリコ
ートの適当なウイルス型および希釈物を、９６ウェルの
希釈板（上を参照）中に１５μｌの血清希釈物の各々に
添加した。板を３７℃で６０分間インキュベーション
し、次いで２５μｌのアリコートを各ウェルから取り出
し、そしてＢＨＫ細胞の全面生長した単層を含有する新
しく評価した９６ウェルの組織培養板の対応するウェル
に移した。細胞培養物を３７℃で９０分間インキュベー
ションし、次いで１．５％のメチルセルロース、５％の
ＦＣＳおよび０．１％のゲンタマイシンを含有する２０
０μｌのＥＭＥＭを各ウェルに添加した。板を３７℃で
一夜、あるいはウイルスのプラークが光学顕微鏡により
決定して発現するまで、インキュベーションした。プラ
ークを計数し、そして中和タイター（ｔｉｔｅｒ）を５
０％のプラークの減少を生ずる最高血清希釈として表わ
した。

微量中和アッセイの結果を上の表IIに血清中和として示
す。可溶性４５Ｋで免疫化したマウスからの血清は、高
い血清中和を示す。可溶性４５Ｋ−Ａｌ（ＯＨ）_３で免
疫化したマウスからの血清は、自然ｇＤ−１で免疫化し
たマウスからの血清に匹敵する血清中和を示す。

実施例２ 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｌｉ）ＮＦ１８２
９（ｐＥＨ １０２）株の１０１のバッチの発酵の部分
から得られた４５Ｋタンパク質の直接の可溶化および精
製 上の実施例１に記載するような新規な方法は、４５Ｋタ
ンパク質が６Ｍ尿素中で凝集物から可溶性であることを
示した。４５Ｋタンパク質の可溶特性に基づき、次に記
載する６Ｍの尿素を使用する大規模精製法を実施した。

細胞の溶解および初期の凝集物の精製 ＮＦ１８２９（ｐＥＨ １０２）株の発酵から回収され
たバクテリア細胞の沈殿物の７２．５５ｇ（湿潤重量）
の部分を、実施例１に記載するバクテリア細胞抽出緩衝
液の中に３２５mlの合計体積に再懸濁した。この懸濁液
をよく混合し、１２mg/mlのリゾチームの６ml（７２m
g）を添加した。このリゾチームを含む懸濁液を４℃で
１時間ローター上でインキュベーションした。インキュ
ベーション後、１８．４mlの１０％のＺ３−１４粉末
［ツウィッタージェント（Ｚｗｉｔｔｒｅｇｅｎｔ）３
−１４、カルバイオケムーベーリング・コーポレーショ
ン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｃｏｒｐ
ｏｒａｔｉｏｎ）］を添加し、よく混合し、そしてイン
キュベーションをローター上で１５分間実施した。３０
mlのアリコートを実施例１に記載するように超音波処理
してリゼイトの粘度を減少させた。超音波処理後、３０
mlのアリコートを６mlの４０％（ｗ／ｖ）のスクロース
の上に層に添加し、１１３，０００×ｇ（ｒ最大）（２
５，０００ｒｐｍ）でＬ２−６５超遠心機［ベックマン
・インスツルメンツ・インコーポレーテッド（Ｂｅｃｋ
ｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）］により
ＳＷ２７ローター上で４℃において４５分間遠心した。
上澄み液およびスクロースの分画を廃棄し、そして沈殿
物を合計２４０mlの容積のＰＢＳ中に超音波処理により
再懸濁させた。次いで、０．２４mlの０．１Ｍのフッ化
フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を懸濁液に添加
し、そしてこの懸濁液をローター上で４℃において一夜
インキュベーションした。

一夜のインキュベーション後、懸濁液を前述のように再
びスクロースを通して遠心した。もう一度、懸濁液およ
びスクロースの分画を廃棄し、そして沈殿物をＰＢＳ中
で超音波処理（４５〜６０秒間）により再懸濁した。

同様に、同一発酵からの７２．４１ｇおよび７２．２６
ｇの部分のバクテリア細胞を処理し、そして得られた沈
殿物を、スクロースを通す遠心後、上の懸濁液とともに
プールして、最終体積２５０mlの４５Ｋタンパク質の凝
集物のＰＢＳ中の懸濁液を得た。この懸濁液を２つの１
２５mlの部分に分割し、そして−７０℃において凍結し
て貯蔵した。

尿素の可溶化および遠心 貯蔵した４５Ｋ凝集物を融解し、そして４４．４mlのア
リコートの１２５mlの部分を実施例１に記載する１７
７．６mlの緩衝液Ａとよく混合した。この混合物を６本
のＳＷ２７遠心管（３７ml／管）の中に分配し、そして
前述のように約１１３，０００（ｒ最大）で遠心した。
１つの沈殿物をアッセイのため実施例１に記載するよう
にＰＢＳ中にＳＤＳ−ＰＡＧＥにより再懸濁した。

融解した４５Ｋ凝集物の懸濁液の残りの１２５mlの部分
をＰＢＳで希釈した。次いで、５２mlの懸濁液を前述の
ように緩衝液Ａと混同した。懸濁液の残りの１９８mlの
部分を、実施例１に記載するように、尿素段階勾配遠心
（８Ｍ〜２Ｍの勾配）にかけた。溶液中の４５Ｋタンパ
ク質を含有する尿素段階勾配分画を約１１３，０００
（ｒ最大）および約１０℃で再遠心し、そしてすべての
懸濁液をプールし、合計４００mlの容積が得られた。

イオン交換クロマトグラフィー ４５Ｋタンパク質を含有するすべての尿素溶液をプール
し、そして容積を緩衝液Ａで１５００mlに調節した。各
々２２５mlの６つのアリコートを３３．３mlの実施例１
に記載したように平衡化したＤＥＡＥ−セファセルのビ
ーズの７７．８％のスラリーと混合した。４５Ｋタンパ
ク質の残りの溶液（１５０ml）を２５．９mlの同一のＤ
ＥＡＥ−セファセルのスラリーと混合した。次いで、こ
の溶液＋ビーズをローター上で室温において１時間イン
キュベーションした。

ビーズをＰＲ−６０００遠心機（インターナショナル・
イクウィプメント・カンパニー）により定速（６００ｒ
ｐｍ）で５分間２回沈殿させた。タンパク質を次のよう
にしてビーズから溶離した。２本の２５０mlの遠心管の
中の結合タンパク質を含有するビーズのほぼ１００mlを
用い、１００mlの溶離用緩衝液を添加した。懸濁液を室
温で８分間インキュベーションし、次いで１０℃で６０
０ｒｐｍで５分間遠心した。上澄み液を除去し、−７０
℃で貯蔵し、そして次の溶離用緩衝液をビーズと混合し
た。次いで、この方法を各溶離後の上澄み液を保存しな
がら反復した。

前述の手順を使用して、次のＮａＣｌ濃度を有する緩衝
液Ａを次に示す順序で用いた：（１）０ＭのＮａＣｌ、
（２）０ＭのＮａＣｌ、（３）０．２ＭのＮａＣｌ、
（４）０．４ＭのＮａＣｌ、（５）０．６ＭのＮａＣ
ｌ、（６）０．８ＭのＮａＣｌ、（７）１．０ＭのＮａ
Ｃｌ、（８）１．０ＭのＮａＣｌ。最後の溶離用緩衝液
（８）は一夜インキュベーションした後遠心した。

４５Ｋタンパク質の回収を増加するために、ＤＥＡＥ−
セファセルビーズとの初期の反応後の上澄み液中の残留
タンパク質を再びビーズと混合し、そして溶離した。し
たがって、ビーズを２時間室温においてローター上で残
留４５Ｋタンパク質を含有する上澄み液と反応させた。
ビーズを前述のように沈殿させ、前述のように、緩衝液
Ａで洗浄し、そして６回溶離したが、ただし最初の３回
の溶離に１０ｍＭのＮａＣｌ緩衝液を使用しかつ最後の
３回の溶離に０．８ＭのＮａＣｌ緩衝液を使用した。次
いで、最後の溶離を１．０ＭのＮａＣｌの添加により実
施し、ローター上で室温においてインキュベーション
し、次いでビーズを沈殿させた。

ビーズから溶離した４５Ｋタンパク質溶液を無菌のピロ
ゲン不含ＰＢＳ、pH７．０に対して透析し、透析液を３
回交換し、これにより溶液の尿素の濃度はほぼ０．００
７９２Ｍに減少した。しかしながら、４５Ｋタンパク質
の濃度は大き過ぎて透析後にタンパク質を溶液に維持す
ることができないことに注意すべきである。この問題を
排除するために、溶液を透析前に希釈することができ
る。透析の間に沈殿が起こる場合、沈殿を緩衝液Ａ中に
再溶解し（これはまた希釈を起こす）再び透析すること
ができる。４５Ｋタンパク質について、約４mg/mlより
大きい濃度は尿素の除去時に沈殿する生ずることがわか
った。

次いで、タンパク質溶液はこのような限外濾過の分野に
おいて知られている技術に従い濃縮して溶解を制限する
ことができる。

第２図は、実施例１に記載するような、次の成分につい
てのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す：（Ａ）合計の細胞
抽出物、（Ｂ）４５Ｋ凝集物、（Ｃ）凝集物の尿素溶解
および限外濾過後の濃縮した沈殿物の試料、（Ｄ）凝集
物の尿素溶解および遠心後の上澄み液の分画、および
（Ｅ）ＤＥＡＥ−セファセルの溶離後の可溶性４５Ｋ。
また、第２図は分子量マーカー（ＭＷ）を含み、そして
第２図の左側の数は分子量×１０⁻３に相当する。

【図面の簡単な説明】

第１図は、次の成分の位置を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥの結
果を示す図である：ゲルスロット２におけるＨＭＷマー
カー；ゲルスロット４における２．５μｌのアリコート
の精製された４５Ｋの濃縮物；ゲルスロット６における
５．０μｌのアリコートの精製された４５Ｋの濃縮物；
およびゲルスロット８における１μｌのアリコートの４
５Ｋのプールされた凝集物。 第２図は、次の成分についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果
を示す図である：（Ａ）合計の細胞抽出物、（Ｂ）４５
Ｋ凝集物、（Ｃ）凝集物の尿素溶解および限外濾過後の
濃縮した沈殿物の試料、（Ｄ）凝集物の尿素溶解および
遠心後の上澄み液の分画、および（Ｅ）ＤＥＡＥ−セフ
ァセルの溶離後の可溶性４５Ｋ。また、第２図はを分子
量マーカー（ＭＷ）を含み、そして第２図の左側の数は
分子量×１０⁻３に相当する。

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】タンパク質の凝集物または複合体の懸濁液
   を、２種またはそれ以上の異なる濃度の密度勾配を有す
   るタンパク質凝集物または複合体を可溶化する化合物の
   溶液の上に層状に重ね、ともに遠心し、そしてタンパク
   質が可溶化している濃度の１またはそれ以上の段階を同
   定することを特徴とするタンパク質の凝集物または複合
   体からのタンパク質の可溶化、精製及び特性決定方法。
2. 【請求項２】濃度段階の同定が、遠心後の段階勾配を分
   画し、そしてその分画または分画試料を電気泳動するこ
   とを特徴とし、さらに可溶性タンパク質をクロマトグラ
   フィーにかけ、そのクロマトグラフィーにかけた可溶性
   タンパク質を透析し、そして溶液中のタンパク質を濃縮
   することを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方
   法。
3. 【請求項３】可溶化しているタンパク質を含有すると同
   定された濃度でタンパク質の凝集物または複合体を可溶
   化し、その溶液を遠心して不溶性物質を除去し、可溶性
   タンパク質をクロマトグラフィーにかけ、そのクロマト
   グラフィーにかけたタンパク質を透析し、そして溶液中
   のタンパク質を濃縮することをさらに特徴とする特許請
   求の範囲第１項記載の方法。
4. 【請求項４】タンパク質の凝集物または複合体を可溶化
   する化合物が尿素である特許請求の範囲第２項記載の方
   法。
5. 【請求項５】タンパク質の凝集物または複合体を可溶化
   する化合物が尿素である特許請求の範囲第３項記載の方
   法。
6. 【請求項６】タンパク質が単純疱疹ウイルスＩ型の糖タ
   ンパク質Ｄ−１の少なくとも一部であるとして特徴づけ
   られ、そしてタンパク質の凝集物または複合体が大腸菌
   （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮＦ１８２９
   （ｐＥＨ １０２）株により生産された凝集物または複
   合体である特許請求の範囲第４項記載の方法。
7. 【請求項７】タンパク質が単純疱疹ウイルスＩ型の糖タ
   ンパク質Ｄ−１の少なくとも一部であるとして特徴づけ
   られ、そしてタンパク質の凝集物または複合体が大腸菌
   （Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＮＦ１８２９
   （ｐＥＨ １０２）株により生産された凝集物または複
   合体である特許請求の範囲第５項記載の方法。