JPH06504431A - Ｃ型肝炎ウイルスアシアロ糖タンパク質 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 Ｃ型肝炎つィルスアシアロ糖タンパク質１皿立！ 本発明は、組換えタンパク質の発現およびウィルス学の一般的分野に関する。さ らに詳細には、本発明は、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）感染の診断、治療、およ び予防に有用な糖タンパク質、ならびにこのような糖タンパク質の生産方法に関 する。

１１茨血 非Ａ型、非Ｂ型肝炎（ＮＡＮＢＨ）は、ウィルスによって誘発されると考えられ ている伝染性疾患（あるいは疾患のファミリー）であり、Ａ型肝炎ウィルス（Ｈ Ａｖ）　、Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、デルタ肝炎ウィルス（■Ｄｖ）、サイ トメガロウィルス（ＣＭＶ）、あるいはエプスタインバーウィルス（ＥＢＶ）に 起因する肝疾患などの、他の形態のウィルス関連肝疾患とは区別されている。

伝染病学的証拠によりＮＡＮＢＨこは３つの型があることが示されている。すな わち、水に起因する伝染型；血液あるいは針に関連する型；および、散発的に発 生する集団獲得型。多くの原因因子は未知である。しかし最近、新種ウィルスで あるＣ型肝炎つイ／ｌ／Ｘ　（ＨＣＶ）が、血液に起因するＮＡＮＢＨ（ＢＢ− ＮＡＮＢＨ）の主要原因（もし唯一の原因でなければ）として同定された。

例えば、ＰＣＴ　ＷＯ３９１０４６６９９を参照のこと。Ｃ型肝炎は、アメリカ 合衆国、ヨーロッパおよび日本を含む多くの国あるいは地域で、輸血関連肝炎の 主要形態であるようだ。さらに、ＨＣＶに関連する肝細胞癌の誘発の証拠も存在 する。従って、ＨＣＶ感染の効果的な予防法および治療法の必要性が存在する。

ＨＣＶキャリア、およびＨＣＶに汚染された血液あるいは血液製剤をスクリーニ ングおよび同定するための鋭敏で特異的な方法の要求が高まっている。輸血後肝 炎（ＰＴＨ）が、輸血患者の約１０％に発生し、この場合の９０％まではＨＣＶ に起因する。この疾患の主要な問題は、慢性肝障害の常習的な進行である（２５ −５５％）。

患者の世話、ならびに血液および血液製剤による、あるいは患者との密接な接触 によるＨＣＶの伝染の予防には、ＨＣＶに関連する核酸、抗原および抗体の検出 のための信頼し得る診断ならびに予後手段が必要とされる。さらに、この疾患を 予防および／あるいは治療するための有効なワクチンおよび免疫治療的治療剤の 必要性が存在する。

ＨＣＶは、他の感染性ウィルスに比較して非常に低率で感染個体の血液中に存在 するようであり、このことはこのウィルスの検出を非常に困難にしている。この ウィルスが低率で存在することが、おそらく、長い間ＮＡＮＢ型肝炎の原因因子 が検出されなかった主な理由である。現在ではクローン化されてはいるが、いま だに培養および増殖は困難である。従って、診断／治療／予防用の■Ｃｖタンパ ク質を生産する組換え法の必要性が強い。

このように、ＨＣＶワクチンが非常に必要である。しかし、細胞系におけるＨＣ Ｖの培養には、非常な困難がある。したがって、組織／細胞の継代培養により弱 毒化ウィルス株を産生ずることは不可能であった。

ｌ囲立皿示 ２種のＨＣＶタンパク質、ＥｌおよびＥｌは、組換え系において発現されるとき には、膜結合のアシアロ糖タンパク質であるようであることが発見された。糖タ ンパク質は通常、哺乳類中ではマンノース末端形態ではなく、さらに他の炭水化 物で修飾されていて、マンノース末端化形態は、一般的には単に一過的なもので あるので、このことは予想外のことである。ＥｌおよびＥｌの場合（われわれの 系において発現されるとき）には、アシアロ糖タンパク質は、最終形態であるよ うだ。Ｅｌ（エンベロープタンパク質１）は、ｎｃｖゲノムの推定Ｅ１領域から 翻訳される分子量約３５ｋＤの糖タンパク質である。Ｅｌ　（エンベロープタン パク質２）は、ＨＣＶフラビウイルスモデルに基づく、ＨＣＶゲノムの推定ＮＳ Ｉ　（非構造タンパク質１）から翻訳される、分子量約７２ｋＤの糖タンパク質 である。ウィルス性糖タンパク質は、しばしば高免疫原性であるので、Ｅｌおよ びＥｌは、イムノアッセイおよび治療／予防ワクチンに使用されるのにまさに適 したものである。

ＥｌおよびＥｌがシアル化されていないことの発見は重要である。タンパク質の 特定の形態は、細胞が組換え発現用の適当な宿主として働き得るように指令する 。Ｅ、　ｃｏｌｉなどの原核生物は、タンパク質をグリコジル化せず、そして一 般的には、抗原としての使用のために糖タンパク質を産生ずるのには適していな い。その理由は、糖タンパク質はしばしば、タンパク質の完全な抗原性、可溶性 、ならびに安定性に対して重要であるからである。酵母ならびに真菌のなどの下 等真核生物は、タンパク質をグリコジル化するが、一般には、末端シアル酸を付 加して炭水化物複合体になし得ない。従って、酵母由来のタンパク質は、抗原と しての、それらの天然（組換え体ではない）のタンパク質とは区別され得る。組 換えタンパク質のグリコジル化は野生ウィルスタンパク質のグリコジル化に非常 に類似しているので、哺乳動物細胞での発現は、産生物の抗原性が重要である応 用に好ましい。

ＨＣＶウィルスが、肝細胞上に見い出されるアシアロ糖タンパク質レセプター、 あるいは肝門皮細胞およびマクロファージ（特に、クツペル（Ｋｕｐｆｆｅｒ） 細胞）上に見い出されるマンノースレセプターを介する感染中に、宿主細胞への 入口を得ることができるという新たな証拠が示された。驚くべきことに、天然の ＥｌおよびＥ２塊は、末端シアル酸残基を有さず、コアグリコジル化のみなされ ることが発見された。さらに少画分が末端Ｎ−アセチルグルコサミンを含む。従 って、本発明の目的は、全末端シアル酸残基あるいは実質的に全てのシアル酸残 基を欠く、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質を提供することである。

本発明の他の局面は、例えば、分泌または放出を促進する抗生物質を使用しての 酵母での発現、あるいは哺乳動物細胞における発現による、末端シアル酸付加を 阻害する条件下でアシアロＥ１あるいはＥｌを産生ずる方法である。

本発明のもう一つの局面は、末端マンノース残基あるいは末端Ｎ−アセチルグル コサミン残基に結合する、レクチンに対する親和性によるＥｌあるいはＥｌの精 製法である。

本発明のもう一つの局面は、免疫原性組成物であり、これは、薬学的に受容可能 な賦形剤と組み合わせた、ＨＣＶ　ＥｌおよびＥｌからなる群より選択される組 換えアシアロ糖タンパク質を含む。所望で有れば、必要に応じて、免疫学的アジ ュバントが含まれ得る。

本発明のもう一つの局面は、イムノアッセイ試薬であり、これは適切な支持体と 組み合わせた、ＨＣＹ　ＥｌおよびＥｌからなる群より選択される組換えアシア ロ糖タンパク質を含む。本発明の他のイムノアッセイ試薬は、適切な検出標識と 組み合わせた、ＨＣＶ　ＥｌおよびＥｌからなる群より選択される組換えアシア ロ糖タンパク質を含む。

本発明のもう一つの局面は、Ｅｌおよび／あるいはＥｌのダイマーおよび高次凝 集体（ｈｉｇｈｅｒ−ｏｒｄｅｒ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）に関する。

本発明の１種はＥ２複合体である。本発明の他の種は、Ｅｌ：Ｅ２ヘテロダイマ ーである。

本発明のもう一つの局面は、Ｅｌ：Ｅ２Ｎ集体および薬学的に受容可能なキャリ アを含むＩ（ＣＶワクチン組成物である。

本発明のもう一つの局面は、Ｅｌ：Ｅ２複合体の精製方法である。

本発明のもう一つの局面は、以下の（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の工程を包含す る、細胞培養物中でのＨＣＶの増殖の方法である：（ａ）マツノースレセプター およびアシアロ糖タンパク質レセプターからなる群より選択されるレセプターを 発現する細胞を供給する工程；（ｂ）細胞をＨＣＶで感染させる工程；および（ ｃ）感染細胞を培養する工程。好ましくは、細胞は組換えレセプターを発現する 。

用語「アシアロ糖タンパク質」とは、実質的にシアル酸成分を含まないグリコジ ル化タンパク質のことである。アシアロ糖タンパク質は、組換え、あるいは、細 胞培養または天然源からの精製により調製され得る。まさに、好ましいアシアロ 糖タンパク質は、１ｉｃｋ、好ましくは糖タンパク！ＥｌおよびＥｌ、最も好ま しくは組換えＥｌおよびＥｌ　（ｒＥｌおよびｒＥ２）由来である。シアル酸残 基の量が、実質的に糖タンパク質の、ＧＮＡのなどのマンノース結合タンパク質 への結合を阻害しない量であれば、この定義範囲内では、タンパク質は、シアル 酸を「含まない」。シアル化の程度は一般的には、全Ｎ結合炭水化物の約４０％ 未満がシアル酸であり、より好ましくは約３０％未満であり、より好ましくは約 ２０％未満であり、より好ましくは約１０％未満であり、より好ましくは約５％ 未満であり、最も好ましくは約２％未満である。

本明細書に使用されている用語ｒＥＩＪは、Ｉ（Ｃ’／ポリタンパク質の最初の ４００アミノ酸以内に発現されるタンパク質あるいはポリペプチドのことであり 、ときにはＥあるいはＳタンパク質と呼ばれる。これは、その天然形態において 、膜に強く結合されていることが見いだされる、３５ｋＤの糖タンパク質である 。

はとんどの天然のＨＣＶ株では、Ｅｌタンパク質は、ウィルスポリタンパク質中 でＣ（コア）タンパク質の後にフードされる。Ｅ１タンパク質は、ポリタンパク 質全長の約１９２アミノ酸から約３８３アミノ酸に広がる。本明細書に使用され ている用語「Ｅｌ」には、天然Ｅ１と免疫学的に交差反応性であるアナログおよ び先端切断型変異体もまた含まれる。

本明細書に使用されている用語「Ｅｌ」は、■Ｃｖポリタンパク質の最初の９０ ０アミノ酸以内に発現されるタンパク質あるいはポリペプチドのことであり、と きにはＮＳＩＳタンパク質ばれる。これは、その天然形態において、膜に強く結 合されていることが見いだされる、？２ｋＤの糖タンパク質である。はとんどの 天然のＨＣＶ株では、Ｅ１タンパク質はＥ１タンパク質に続く。

Ｅ２タンパク質は、約３８４アミノ酸から約８２０アミノ酸に広がる。

本明細書に使用されている用語「Ｅｌ」には、天然Ｅ２と免疫学的に交差反応性 であるアナログおよび先端切断型変異体もまた含まれる。

本明細書に使用されている用語「凝集体」とは、１つより多いＥｌあるいはＥ２ モノマーを含むＥｌおよび／またはＥｌの複合体のことである。Ｅｌ：Ｅ１ダイ マー、Ｅｌ：Ｅ２ダイマーならびにＥｌ：Ｅ２ヘテロダイマーは、すべてこの定 義内の「凝集体」である。

本発明の組成物はまた、より大きい凝集体を含み得、８００ｋＤを越える分子量 を有し得る。

本明細書に使用されている用語「粒子ｊとは、電子顕微鏡により見える、少なく とも２０　ｎｍの直径を有する、Ｅｌ、Ｅｌ、あるいはＥｌ／Ｅ２凝集体のこと である。好ましい粒子は、電子顕微鏡によってみとめられる、だいたい円形形状 で約４０ｎｍの直径を有する。

本明細書中でタンパク質に適用されている用語「精製された」とは、所望のタン パク質が、組成物中の総タンパク質成分の少なくとも３５％を含む組成物のこ七 である。所望のタンパク質は、総タンパク質成分の好ましくは少なくとも４０％ 、さらに好ましくは少なくとも約５０％、さらに好ましくは約６０％、さらに好 ましくは約７０％、さらに好ましくは約８０％、さらに好ましくは約９０％、お よび最も好ましくは約９５％を構成する。この組成物は、本明細書に使用されて る純度の決定に影響しない、炭水化物、塩、脂質、溶媒などの他の化合物を含み 得る。［単離されたＪ　）ＩＣＶアシアロ糖タンパク質とは、純度が少なくとも ３５％のＨＣＶアシアロ糖タンパク質組成物を意味する。

本明細書に使用されている「マンノース結合タンパク７１Ｊとは、レクチンある いはマンノース末端グリコジル化されたタンパク質（例えば、アシアロ糖タンパ ク質）に特異的に結合する他のタンパク質のことを意味し、これらの例には、マ ンノース結合レクチン、マンノース末端グリコジルに特異的な抗体、マンノース レセプタータンパク質（Ｒ，Ａ、Ｂ、　Ｅｚｅｋｏｗｉｔｚら、Ｌカ１１鯨（１ ９９０）　１７６：１７８５−９４）　、７７７　ロ糖タンパク質しセプタータ ンパク質（Ｈ，Ｋｕｒａｔａら、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ　（１９９０）　２６ ５：１１２９５−９８）　、血清７７／−ス結合タンハク質（１，５ｃｈｕｆｆ ｅｎｅｃｋｅｒら、Ｃｔｏ　ｅｎｅｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔ　（１９９１）　 ５６：９９−１０２：Ｌ　５ａｓｔｒｙら、Ｊ　Ｉｍｍｕｎｏｌ　（１９９１） 　ＬＬＺ：６９２−９７）　、血清アシアロ糖タンパク質結合タンパク質などが 含まれる。マンノース結合レクチンには、例えば、ＧＮＡ、　コンカナバリンＡ 　（ＣｏｎＡ）ならびに同様の結合性を有する他のレクチンが含まれる。

用ｉｉ　ｒ　ＧＮＡレクチン」とは、マンノース末端糖タンパク質に結合する市 販のレクチン、Ｇａ１ａｎｔｈｕｓ　ｎ１ｖａ　ｕｓアグルチニンのことである 。

本明細書に使用されている「組換え」糖タンパク質は、組換えポリヌクレオチド から発現される糖タンパク質であり、糟タンパク質をコードする構造遺伝子は、 天然ではこの構造遺伝子に隣接していない調節配列の制御下に発現されるか、あ るいはその構造遺伝子は改変されている。例えば、Ｅ１構造遺伝子が、酵母グリ セルアルデヒド−３−ポスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤｆｌ）プロモー ターの機能性フラグメントの制御下に配置されたベクターを形成し得る。酵母で の使用に好ましいプロモーターは、米国特許第４．８８０．７３４号に記載のハ イブリッドＡＤＨ２／ＧＡＰプロモーターであり、これは、アルコールデヒドロ ゲナーゼ２由来の上流の活性化配列と組み合わせてＧＡＰＤＨプロモーターのフ ラグメントを利用する。構造遺伝子の改変には、縮重コドンでの別のコドンの置 換（例えば、宿主に好ましいコドンの使用、制限酵素切断部位の削除あるいは形 成、ヘアピン形成の制御のためになど）、ならびに異なるアミノ酸をコードする 限定数のコドンの置換、挿入あるいは欠損（天然アミノ酸配列の、好ましくは約 １０％未満、より好ましくは約５ｚ未満が変えられるべきである）などが含まれ る。同様に、「組換え」レセプターとは、組換えポリヌクレオチドから発現され たレセプタータンパク質のことであり、レセプターをコードする構造遺伝子は、 天然では構造遺伝子に隣接しない調節遺伝子の制御下に発現されるか、あるいは その構造遺伝子は改変されている。

用語「単離されたポリペプチド」とは、他のＨＣＶウィルス成分、特にポリヌク レオチドを実質的に含まないポリペプチドのことである。組成物中のポリペプチ ドの重量が、そのポリペプチドと他の成分と合わせた重量の少なくとも７０％、 より好ましくは約８０％、さらに好ましくは約９０％、そして最も好ましくは９ ５％あるいはそれ以上である場合には、ポリペプチド組成物は、他の成分を「実 質的に含まない」。例えば、１００μｇ／ｓＬノＥＩＪ、Ｊ、び３μｇ／１Ｌｔ Ｄｂ（Ｄ他（ＤＨＣＶ成分（例えば、ＤＮＡ、脂質など）を含む組成物は、「他 のＨＣＶウィルス成分」を実質的に含まず、従って、この定義の範囲内の単離ポ リペプチドの組成物である。

用語「分泌リーダーｊとは、タンパク質のＮ末端でコードされるときに、翻訳後 に宿主細胞培養培地中にそのタンパク質を分泌されるようにするポリペプチドの ことである。分泌リーダーは、一般的に使用される宿主細胞に由来する。例えば 、酵母での使用に適した分泌リーダーには、５ａｃｃＩ匡肛並Ｌ」ｒｅｖｉｓ（ ａｅａ因子リーダー（米国特許第４．８７０．００８号を参照のこと）が含まれ る。

用語「下等真核生物」とは、酵母、真菌などの宿主細胞のことである。下等真核 生物は、一般的に（必ずというわけではないが）単細胞である。好ましい下等真 核生物は酵母であり１特に５ａｃｃｈａｒｏ＋ｅ　ｃｅｓｓ　５ｃｈ１ｚｏｓａ ｃｃｈａ　ａｍ　ｃｅｓ、■ｇ」、■並ｎ５Ｈａｎｓｅｎｕｌａなどの種である 。　Ｓａｃｃｈａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｆｓｆａｅ、　Ｓ、　ｃａｒｌｓ ｂｅｒ　ｅｎｓｉｓおよびに、Ｉａｃｔｉｓは、最も一般的に使用される酵母宿 主ならびに便利な真菌宿主である。

用語「高等真核生物」とは、哺乳類、は生類、昆虫類などの高等動物由来の宿主 細胞のことである。現に好ましい高等真核宿主細胞は、チャイニーズハムスター （例えば、　ＣＨＯ）、サル（例えば、ＣＯ５細胞）、ヒトおよび昆虫（例えば 、加白ｔｅｒａ　ｆｒｕ　ｉ　ｅ　ｄａ）由来である。宿主細胞は、懸濁あるい はフラスコ培養、組織培養、器官培養などで供給され得る。

用語「カルシウムモジュレータ−」とは、小胞体内にカルシウムイオンを隠ぺい あるいは結合し得るか、あるいはカルシウム調節タンパク質（例えば、カルシウ ムチャンネルタンパク質、カルシウムポンプなど）に作用することによりＥＲ内 のカルシウムイオン濃度に影響する化合物のことである。適切ナカルシウムモジ ュレーターには、例えば、サブシガルジン（ｔｈａｐｓｉｇａｒｇｊｎ）　、Ｅ ＧＴＡ　（エチレングリコールビス［β−アミノエチルエーテル］Ｎ、　Ｎ、　 Ｎ’　、　Ｎ’−テトラアセティ・ノクアッシド）が含まれる。現に好ましいモ ジュレータ−は、サブシガルジンであるＵｌえば、０．　Ｔｈａｓｔｒｕｐら、 Ｐｒｏｃ　Ｎａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｃ（ＵＳＡ（１９９Ｇ）　８７：２４６６−７ ０を参照のこと）。

用語「免疫原性」とは、アジュバントの存在あるいは非存在下で、単独あるいは キャリアと結合して、体液性および／または細胞性免疫応答をなす基質の能力の ことである。「中和」とは、感染性物質の感染性を部分的に、あるいは完全に抑 制する免疫応答のことである。「ワクチン」とは、ＨＣＶに対する、一部あるい は完全防御を誘起し得る、個体の治療に有用な免疫組成物のことである。

用語「生物学的液体」とは、血清、血漿、唾液、胃分泌物、粘液などの器官から 得られる流体のことである。一般的には、生物学的液体は、　ｎｃｖ粒子の存在 に対してスクリーニングされる。ある種の生物学的流体は、血液凝固因子（例え ば、因子Ｖｌｌｌ：Ｃ）　、血清アルブミン、成長ホルモンなどの他の産生物源 として使用される。このような場合には、生物学的液体源がＨＣＶのなどのウィ ルスに汚染されていないことが重要である。

Ｂ、二股ｎ久万蓬 ＨＣＶゲノムのＥ１領域は、欧州特許第３８８．２３２号にｒＥＪ領域として、 そして一方Ｅ２はｒＮｓＩＪとして記載されている。Ｅ１領域は、全長ウィルス ポリタンパク雪中の約１９２−３８３アミノ酸を有スル。Ｅ２Ｍ域は、約３８４ −８２０アミノ酸を有する。これらのタンパク質の原型の全配列（ＨＣＶ−１株 ）は、タンパク質の一般的なりローニングおよび発現法と同様に、当該分野では 入手可能である（欧州特許第３８８．２３２号を参照のこと）。ＥｌおよびＥ２ の両方は、ＨＣＶポリタンパク質の最初の８５０−９０−０アミノ酸をコードす るポリヌクレオチドから発現され得る。はとんどの真核宿主細胞中では翻訳後の プロセッシングで、最初のポリタンパク質が、Ｃ，ＥｌおよびＥｌに切断される 。コーディング領域の５°末端を切断して、産生されるＣタンパク質量を減少し 得る。

アシアロ糖タンパク質の発現は、多くの方法によりなされ得える。例えば、通常 はグリコジル化タンパク質にシアル酸残基を付加しない下等真核生物（酵母など ）中での発現が得れ得る。酵母発現系においては、タンパク質が翻訳後に培養培 地中に発現されるように、Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅα因子リーダーなどの分 泌リーダーを使用することが好ましい。さらに、ｐｍｒｌなどのグリコジル化欠 損変異体を使用することが好ましい。

なぜなら、これらの変異体は、コアグリコジル化のみ行い、かなり高効率に異種 タンパク質を分泌するからである（　Ｈ，Ｋ。

Ｒｕｄｏ　Ｌｐｈら、江且（１９８９）　Ｓ８：１３３−４５）。あるいは、Ｐ ｆｃｈｆａ」」±ｙｒｉｓなどの他の種の酵母を使用し得る。これは、哺乳類お よびＳ、　ｃｅｒｅｖｆｓｊａｅに見られるコアグリフシル化様式に類似すると 考えられている様式で、８−９マンノース残基を有する糖タンパク質を発現する 。

あるいは、哺乳類細胞中の発現を調整して末端グリコジル化（シアル酸付加）を ブロックし得る。組換え構築物は、タンパク質が小胞体へ方同づけられることを 確実にするために、好ましくは分泌シグナルを含む。ゴルジ体への移送は、Ｅｌ およびＥ２自身でブロックされるようである。哺乳類細胞でのＥｌあるいはＥｌ の高レベルの発現は、小胞体あるいは山ゴルジ体での全ての細胞タンパク質の分 泌を妨げるようである。さらに、グリコジル化欠損変異体を使用し得る。例えば 、Ｐ、　５ｔａ）　ｎ１ｅｙ、　Ａｎｎ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ　（１９８４）　 Ｌａ：５２５−５２を参照のこと。グリコジル化あるいは移送変異体が、シアル 化を伴ってＥｌあるいはＥｌを発現する場合には、ノイラミニダーゼによる処理 によって末端シアル酸残基を除去し得る。

収量は、小胞体内からのタンパク質の放出を得るためのカルシウムモジル−ター の使用により増加されるべきである。

適切なモジュレータ−には、サブシガルジン、　ＥＧＴＡ、ならびにＡ２３８１ ７（例えば、０、Ｔｈａｓｔｒｕｐら、Ｐ　ｏｃ　Ｎａｔ　ｃａｄ　Ｓｃ’　Ｕ Ｓ（１９９０）　Ｂ７：２４６６−７０を参照のこと）が含まれる。例えば、組 換えワクシニアウィルスベクターによるトランスフェクションにより、哺乳類細 胞（例えば、ＣＨＯ，ＣＯ３ならびにヘラ（ＨｅＬａ）細胞など）の細胞内に多 量のＥｌあるいはＥｌを発現させ得る。タンパク質の発現および小胞体内の蓄積 後、ＥＲ内容物の放出を起こすのに十分な濃度のカルシウムモジコレ−ターに細 胞を曝す。次に、培養培地からタンパク質を回収し、培地は次のサイクル用に取 り替える。

さらに、先端切断型のエンベロープタンパク質を発現させるのが好都合である。

ＥｌおよびＥｌの両方は、高疎水性ドメインを有するようであり、これは明らか にタンパク質を小胞体内のとどめ、効率よい放出を妨げる。従って、Ｅｌの１７ ０−１９０アミノ酸、２６（１−２９０アミノ酸あるいは３３０−３８０アミノ 酸（ポリタンパク質のはじめからの番号）の１つ以上の領域、並びにＥｌの６６ ０−８３０アミノ酸（例えば、欧州特許第３８８，２３２号の図２０−１を参照 ）の配列の部分を欠失することが望まれ得る。これらの疎水性ドメインの少なく とも１つは、そのタンパク質の抗原性に必須ではなく、不利な影響もなく欠失し 得る、トランスメンプラン領域を形成する。欠失に最も適した領域は、通常専門 家の技術による少数の欠失実験の実施により決定し得る。Ｅｌの疎水性３゛末端 の欠失により、発現された６２部分の分泌の結果になる。このとき、分泌された タンパク質のシアル化をともなう。

発現を得るために種々の任意のベクターが使用され得る。

酵母などの下等真核生物は、典型的には、カルシウムリン酸沈澱法を用いてプラ スミドにより形質転換されるか、あるいは組換えウィルスにより形質転換される 。ベクターは、独立して宿主細胞内で複製され得るか、あるいは宿主細胞ゲノム に組み込まれ得る。より高等な真核生物は、プラスミドにより形質転換され得る が、典型的には組換えウィルス、例えば、組換えワクシニアウィルスに感染され る。ワクシニアは、宿主細胞タンパク質の発現を停止させ得るので、ワクシニア が特に好ましい。まさに好ましい宿主細胞には、ヘラならびに形質細胞腫（ｐｌ ａｓｍａｃｙｔｏｍａ）細胞系が含まれる。この系では、宿主Ｅｌｒ中に主要な グリコジル化種としてＥｌおよびＥｌが蓄積することを意味する。ｒＥｌおよび ｒＥ２は、マンノース末端化されている主要な糖タンパク質であるので、末端マ ンノース残基に結合する虹口ｎｔｈｕｓ　ｎ１ｖａｌｕｓアグルチニン（（ＪＡ ）などのレクチンを使用して細胞から容易に精製され得る。

マンノース末端糖タンパク質として天然に発現されるタンパク質は、哺乳動物生 理学上比較的まれである。はとんどの場合において、哺乳動物の糖タンパク質は 、グリコジル化経路での一過的な中間産物としてのみマンノース末端化されてい る。組換え的に発現されたＨＣｖエンベロープタンパク質がマンノース末端グリ コジル、あるいは（より低い程度の）Ｎ−アセチルグルコサミンを有する事実は 、ＨＣＶＣタンパク質量全ヒ！Ｊ　ｔ　ン（ｖｉｒｏｎ）が分離され、そして末 端マンノースあるいはＮ−アセチルグルコサミンに特異的なレクチンを用いて、 内因性タンパク質から部分的に精製され得ることを意味する。

組換えタンパク質は真正であり、成熟遊離ピリオンに見いだされるエンベロープ タンパク質、あるいは細胞結合エンベロープタンパク質の形態と本質的に同じで あると考えられている。従って、ＧＮＡなどのレクチンを、マンノース末端タン パク質、ならびにＷＧＡ　（コムギ胚芽アグルチニン）およびＮ−アセチルグル コサミン末端タンパク質の等傷物に対して使用し得る。

例えばワクチンあるいはイムノアッセイに使用するために抗原を生成するときの 精製のために、ＥｌおよびＥｌを、細胞培養上清および他の液体から分離するた めに、固相に結合させたレクチンを使用し得る。

あるいは、ＨＣＶ感染が疑われる被検者からの液体あるいは組織サンプルから、 Ｅｌ、ＥｌあるいはＨＣＶピリオンを分離するために適切なレクチンを供給し得 る。マンノース末端糖タンパク質は比較的まれであるので、このような方法は、 実質的にバックグラウンドを減少させて、試料中に存在するタンパク質を精製す るのに役立つ。レクチンに結合後、）ＩｃＶタンパク質は抗ＨＣＶ抗体を用いて 検出され得る。あるいは、全ピリオンが存在する場合には、■Ｃｖゲノムの保存 領域（例えば、５°非コーデイング領域）に特異的なＰＣＲ法または他の核酸増 幅法によりＨＣＶ核酸を検出し得る。この方法で、例えば、新しい株が抗体の調 製に使用される株と免疫学的交差反応性でない場合には、抗原の変動あるいは変 化に関わらずＨＣＶの異なる株の分離および特徴づけができる。特定のレクチン による、マンノース末端糖タンパク質特有の認識を都合よく利用する多くの他の 方法がある。例えば、ＨＣｖピリオンあるいはタンパク質の夾雑が疑われる試料 を、ビオチンあるいはアビジン標識レクチンとインキュベートして、タンパク質 −レクチン複合体を沈澱させ得る。さらに、治療上の使用のために、例えば、　 ＧＮＡに抗ウィルス化合物を結合することにより、化合物をピリオンに標的づけ るために、レクチンのＨＣＶタンパク質に対する親和性を使用し得る。あるいは 、血清または血漿からマンノース末端糖タンパク質を除去するために適切なレク チンを使用して、ＨＣＶ汚染の危険性を軽減あるいは削除し得る。

固定化マンノース結合タンパク質、特にＣｏｎＡあるいはＧＮＡなどのレクチン とのインキュベーションにより、粗細胞溶解物からＥｌおよび／またはＥ２アシ アロ糖タンパク質を単離するのがまさに好ましい。例えば、細胞を低張緩衝液中 で機械的に破砕して溶解し、その後遠心分離して核溶解物を調製し、さらに遠心 分離して粗ミクロソーム膜画分を得る。次に、粗膜画分をトリトンＸ−１００、 ＮＰ４０などの界面活性剤を含む緩衝液に溶解する。この界面活性剤抽出物をさ らに遠心分離して不溶性粒子を沈降させ、得られた透明溶解物を、固定化マンノ ース結合タンパク質、好ましくはアガロースあるいはセファロース０などに結合 されたＧＮＡを有するクラマドグラフィーカラム中で、結合に十分な時間の間、 典型的には１６−２０時間インキュベートする。次に、この懸濁物を、Ｅｌ／Ｅ ２が溶出液中に現れるまでカラムにかけ、次に、結合に十分な時間の間、典型的 には約１２−２４時間の間カラム中でインキュベートする。次に、結合された物 質を界面活性剤（トリトンＸ−１００，、ＮＰ４０など）を含む別の緩衝液で洗 浄し、マンノースで溶出して、精製アシアロ糖タンパク質を供給する。溶出に際 しては、タンパク質が溶出物中に現れはじめるまでのみ溶出するこが好ましく、 その時点で溶出を停止し、そしてタンパク質の溶出を進める前にカラムを２−３ 時間平衡化させる。このことで、大きなタンパク質凝集体が徐々に離脱する速度 に対して十分な時間を与えると考えられる。ＥｌおよびＥｌが天然形態（すなわ ち、膜結合ドメインの切断なしに）でいっしょに発現される場合には、アシアロ 糖タンパク質の実質的な画分は、Ｅｌ：Ｅ２凝集体として現れる。電子顕微鏡で の試験では、この凝集体の有意部分は、直径約４Ｏｒ＋ｍのだいたい球状の粒子 であり、これは完全なウィルスと予測される大きさである。これらの粒子は、自 己構成サブウィルス粒子（ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍ＋ａｂｌｉｎｇ　５ｕｂｖｉｒ ａｌ　ｐａｒＨｃｌｅｓ）であるようだ。これらの凝集体は、真正ＨＣＶピリオ ン粒子に非常に類似した四次構造を示すことが予測され、従って、高免疫原性ワ クチンとして作用することが予測される。

Ｅｌ／Ｅ２１［合体はさらに、例えば、Ｆｒａｃ　ｔｏｇｅｌ−ＤＥＡＥあるい はＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓρの塩基性媒体上でのゲルクロマトグラフィーに より精製され得る。Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ−ＤＥＡＥゲルクロマトグラフィーを使 用して、純度約６０−８０％のＥｌ／Ｅ２複合体が得られる。さらｉ、：、Ｅｌ はＯ−１のＬｙｓ残基を有するので、リシンプロテアーゼ処理により精製され得 る。複合体のりシンプロテアーゼ処理は、Ｅｌを破壊してＥｌを容易に分離する 。

）ＩＣＶの組織特異性は、ＨＣＶエンベロープ糖タンパク質がマンノース末端化 されていることの観察と組み合わせて、そのウィルスが宿主細胞への入口を得る ために、マンノースレセプターあるいはアシアロ糖タンパク質レセプター（ＡＳ ＧＲ）を使用することを示唆する。マンノースレセプターは、マクロファージお よび肝ジヌンイド細胞（ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ　ｃｅｌｌｓ）上に、一方、ＡＳ ＧＲは実質肝細胞（ｐａｒｅｎｃｈｙｍａｌ　ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）上に見 られる。従って、これらのレセプターの１つあるいは両方を発現する宿主細胞の 使用により、ＨＣＹを培養することが可能である。レセプターが維持される条件 を用いて、天然にレセプターを発現する一次細胞培養物を使用するか、あるいは 、レセプター発現用のベクターで、ヘラ、ＣＨＯｌＣＯＳなどの他の細胞系をト ランスフェクトし得る。マンノースレセプターのクローニングならびにそのトラ ンスフェクション、および線維芽細胞での発現は、Ｍ、Ｅ、　Ｔａｙｌｏｒら、 Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｗ　（１９９０）　２６５：１２１５６−６２に実証され ている。ＡＳＧＲのクローニングおよび配列決定は、Ｋ、　Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ ら、Ｊ　Ｂ　ｏ　Ｃｅｍ　（１９８４）　２５９ニア７０−７８ならびにＭ、　 ５ｐｉｅｓｓら、Ｐ　ｏｃ　ｔ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　（１９８５）　＋ １２：６４６５−６９に、ラットＨＴＣ細胞での、機能性ＡＳＧＲのトランスフ ェクションおよび発現は、Ｍ、　ＭｃＰｈａｕｌおよびＰ、　Ｂｅｒｇ、　Ｐｒ ｏｃ　ａｔ　Ａｃａｄ　Ｓｅｔ　ＵＳＡ　（１９８６）　８３：８８６３−６７ ならびにＭ、　ＭｃＰｈａｕｌおよびＰ。

Ｂｅｒｇ、　Ｍｏｌ　Ｃｅ１ｌ　ｉｏｌ　（１９８７）　７：１８４１−４７に 記載されている。

従って、１つあるいは両方のレセプターを適切な細胞系にトランスフェクトする ことは可能であり、得られた細胞をＨＣＶの培養での増殖のために宿主として使 用することが可能である。

このような培養でのＨＣＶの継代により、生ワクチンとしての使用に適した弱毒 化株の開発がなされる。レセプターが維持される条件を用いて、天然にレセプタ ーを発現する一次細胞培養物を使用するか、あるいは、レセプター発現用のベク ターで、ヘラ、ＣＨＯ，ＣＯＳなどの他の細胞系をトランスフェクトし得る。マ ンノースレセプターのクローニングならびにそのトランスフェクション、および 線維芽細胞での発現は、Ｔａｙｌｏｒら、上記で示されており、一方、ラットＨ ＴＣ細胞での機能性ＡＳＧＲのトランスフェクションおよび発現は、ＭｃＰｈａ ｕｌら、上記に記載されている。１つあるいは両方の組換えレセプターでトラン スフェクトされた固定化細胞系を使用するのが好まし免疫原性組成物は、当該分 野に公知の方法に従って調製され得る。この組成物は、ポリペプチド、例えば、 Ｅｌ、Ｅｌ、あるいはＥｌ／Ｅ２粒子組成物の免疫原性量を、通常は薬学的に受 容可能なキャリアと組み合わせて含有し、好ましくはさらにアジュバントを含有 する。［カクテル”　ｃｏｃｋｔａｉｌ″」が所望である場合には、例えば、Ｅ ｌにＥｌを加えた抗原など、ＨＣＶポリペプチドの組み合わせ物を、効果を高め るためにともに混合し得る。Ｅｌ／Ｅ２凝集体のウィルス様粒子は、ことに有用 なワクチン抗原を提供すると考えられる。免疫原性組成物は、抗体の産生を誘発 するために、抗体原の提供あるいは動物内に防御免疫性を誘導するために、動物 に投与され得る。

薬学的に受容可能なキャリアには、組成物を受け入れる個体に対して、それ自身 が有害な抗体産生を誘発しない任意のキャリアが含まれる。適切なキャリアは、 典型的には、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミ ノ酸、アミノ酸コポリマーなどの、大きな、徐々に代謝される高分子および不活 性ウィルス粒子である。このようなキャリアは、当業者には公知である。

組成物の効果を促進する好ましいアジュ／＜ントには、限定はされないが、水酸 化アルミニウム（ａｌｕｍ）　、米国特許第４゜６０６．９１８号に記載されて いるＮ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ− ＭＤＰ）　、Ｎ−アセチル−ノルムラミルーミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグル タミニルーム−アラニン−２−（１’−２。

−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチ ルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）およびＲＩＢＩが含まれ、これには、２％ｓｑｕａｌ ｅｎｅ／　ＴｖｅＪ’　８０乳液中に細菌から抽出された３つの成分、モノホス ホリルリピッドＡ，　トレハロースジマイコレートおよび細胞壁組織（ＭＰＬ＋ ＴＤＭ＋ＣＷＳ）が含まれる。さらに、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ　（Ｃａ＋ｉｂｒｆｄ ｇｅ　Ｂｉｏｓｃｉｅｒ＋ｃｅ，　Ｗｏｒｅｅｓｔｅｒ．ＭＡ）などのアジュバ ントが使用され得る。そのうえに、完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）およ び不完全フロインドアジュバント（［ＦＡ）が、ヒト以外の適用ならびに研究用 に使用され得る。

免疫原性組成物は、典型的には、水、生理食塩水、グリセロール、エタノールな どの薬学的に受容可能な賦形剤を含有する。さらに、加湿剤あるいは乳化剤、ｐ Ｈ緩衝剤などの補助物質がこのような賦形剤に含有され得る。

典型的には、免疫原性組成物は、注射し得るように液体あるいは懸濁液のいずれ かに調製され得、注射前の液体賦形剤に、溶液または懸濁液にするのに適した固 形もまた調製され得る。この調製物はさらに、アジュバントの効果を促進するた めに乳化あるいはリポソーム中にカプセル化され得る。

ワクチンとして使用される免疫原性組成物は、免疫原性的に有効な量のＨＣＶポ リペプチド、および必要に応じて上記の任意の成分を含有する。「免疫原性的に 有効な量」とは、単回投与量あるいは一連の投与量の一部において、個体に投与 される量が、上記定義のように、治療に有効であることを意味する。この量は、 治療される個体の健康および生理的条件、治療される個体の分類学上の群（例え ば、ヒト以外の霊長類、霊長類など）、抗体を合成するための個体免疫系の能力 、所望の防御の程度、ワクチンの調剤、治療医の医学上の評価、感染させるＨＣ ’／の株、ならびに他の関連要因に依存して変化する。この量は、比較的に広範 囲にあるので、所定の試験により決定されることが期待される。

自己構成Ｅｌ／Ｅ２凝集体はまた、ワクチンキャリアとして働き、Ｂ型肝炎表面 抗原と同様の様式で、異種（非ＨＣＶ）ハブテンを提供し得る（欧州特許第１７ ４，　４４４号を参照のこと）。この使用においては、Ｅｌ／Ｅ２凝集体は、そ の凝集体に結合されたハブテンあるいは抗原に対して免疫応答を刺激し得る免疫 原性キャリアを提供する。抗原は、従来の化学的方法により結合されるか、ある いはＥｌおよび／またはＥｌをコードする遺伝子へ、そのタンパク質の親水性領 域に相当する配置に、クローン化され得る。

免疫原性組成物は、典型的には皮下注射あるいは筋肉内注射などによって、通常 非経口的に投与される。さらに、他の投与形態に適した処方剤には、経口処方剤 あるいは生薬が含まれる。投薬処置は、単回投与計画あるいは複数回投与計画で あり得る。ワクチンは、他の免疫調節剤と組み合わせて投与され得る。

（以下余白） ｃ．　′ＬｉＩＪｉ 以下に示されている実施例は、当該分野の専門家にさらに説明するために提供さ れていて、いかなる方法においても限定することを意味していない。

尖１」■− （クローニングおよび発現） （Ａ）ベクターを、欧州特許第３１８，　２１６号および欧州特許第３８８、　 ２３２号に記載されているように、ＨＣＶゲノムの５°部分を有するプラスミド から構築した。カセットＨＣＶ　（Ｓ／Ｂ）は、Ｍｅｔ，にあたる−６３ヌクレ オチドから始まる、Ｍｅｔ　、からＬｅｕ９ｓｓまでのポリタンパク質の５゛末 端をコードするＳｔｕｌ−Ｂｇｌ目ＤＮＡフラグメントを有する。これには、コ アタンノ（りＮ　（Ｃ）　、Ｅｌ９　：／ノくり質（またときにはＳと言う）、 Ｅ２タン／＜り質（またときにはＮＳ１と言う）、ならびにＮＳ２ａ領域の５° 部分が含まれる。構築物の発現に際しては、個々のＣ，　ＥｌおよびＥ２タン／ ４り質がタン／ｆり質分解プロセッシングにより産生される。

カセットＨＣＶ（Ａ／Ｂ）は、　Ｍｅｔ＋にあたる一６ヌクレオチドから始まる 、ＭｅｔｌからＬｅｔ＋９８ａまでのポリタンノくり質の５°末端をコードする ＡｐａＬｌ−Ｂｇｌｌｌ　ＤＮＡフラグメントを有する。これには、コアタンパ ク質（Ｃ）　、Ｅｌタンノｆり質（またときにはＳと言う）、Ｅ２タンパク質（ またときにはＮＳＩと言う）、ならびにＮＳ２ａ領域の５′部分が含まれる。構 築物の発現に際しては、個々のＣ，　ＥｌおよびＥ２タンパク質がタンパク質分 解ブロセ・ノシングにより産生される。

カセットＣ−Ｅｌ（Ｓ／Ｂ）　（Ｓｔｕｌ−ＢａｌＩ旧部分）は、Ｍｅｔ　１か らｌ１ｅ３４ａまでの５゛末端（遺伝子中のＢａｌ旧部位）を有する。このカセ ットの発現で、Ｃおよび多少の先端切断型のＥｌ　（Ｅｌ’）が発現される。３ °末端から切りだされた部分は、トランスロケーションシグナルとして作用する と考えられている疎水性領域である。

カセットＮ５Ｉ（Ｂ／Ｂ）　（ＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ１１部分）は、Ｅｌの小さな ３°部分（Ｎｅｔ３ａｎから）、全Ｅ２、ならびにＮ５２ａ部分（Ｌｅｕｓ＠ａ まで）を有する。この構築では、Ｅｌフラグメントはトランスロケーションシグ ナルとして作用する。

カセットＴＰＡ−ＮＳＩは、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ−（ｔＰＡ ）リーダーを、　Ｅｌの３°部分のかわりにトランスロケーションシグナルとし て使用する。このカセットは、ＧｌｙａｓａからＧ１ｕａａ＋までのＥｌの先端 切断型を有し、ここでは疎水性３゜末端は欠失されている。

各カセットを、Ｔ７およびインビトロにおけるウサギ網状赤血球発現による転写 および翻訳のための、合成β−グロビン５°非コーデイング配列をともなったベ クターｐＧＥＭ３Ｚと、この配列を伴わないベクターとに挿入した。組換えワク シニアウィル７、　（ｒＶ’／）ベクターを、Ｃｈａｒｋｒａｂａｒｔｙら、Ｍ ｏ’ｌ　Ｃｅ月二Ｂｉｏｌ　（１９８５）　５：３４０３−０９に記載されてい るように、そのカセットをプラスミド９ＳＣＬ１　（Ｄｒ、　Ｂ、　Ｍｏ５ｓ、 　ＮＩＨから得た）に挿入し、その後ワクシニアウィルスと再度組み合わせて調 製した。

（Ｂ）かわりの発現ベクターを、Ｃｈａｒｋｒａｂａｒｔｙら、Ｍｏｌ　Ｃｅ１ Ｌ肛ｏ１　（１９８５）　ｉ：３４０３−０９に記載されているように、ｐｓｃ ｓ９　（Ｄｒ、　Ｂ、　Ｍｏ５ｓ、　Ｎ［Ｈから得た）のＳｔｕ［部位とＳｐｅ ［部位との間にＨＣＶ（Ａ／Ｂ）を挿入し、その後ワクシニアウィルスと再度組 み合わせて構築した。

（Ｃ）ヘラＳ３細胞を、５００ｗＬの滅菌遠心ホト／Ｉ／　（ＪＡ−１００−タ ー）中で、室温にて、２０ＧＯｒｐｍ、　７分間遠心分離して回収した。

ベレットを、別の培養培地（Ｊｏｋｌｉｋ改変ＭＥＭ攪拌培地（５ｐｉｎｎｓｒ 　ｍｅｄｉｕ＋ｇ）　＋　５％ウマ血清およびゲンタマイシン）（ｒｆｆｉ拌培 地」）中に最終濃度２　ｘ　１０７細胞／■Ｌに再懸濁した。音波処理した粗ｖ ｖ／５Ｃ５９−ＨＣＶウィルスのストックを、細胞あたり８ｐｆｕの複数回感染 で加え、混合物を３７℃で３０分間攪拌した。

次に、感染細胞を８Ｌの攪拌培地を入れた攪拌フラスコに移し、３７℃で３日間 インキュベートした。

次に、培養細胞を遠心分離して回収し、ベレットを緩衝液（１０ＩＩＭトリスー ＨＣｌ、　ｐＨ９，０，１５２ｍＬ）・に再懸濁させた。次に、細胞を４０　ｍ ＬのＤｏｕｎｅｅ　Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ　（５０ストローク）によりホモジ ナイズし、核を遠心分離（５分間、１６００　ｒｐ＋＊、　４℃、ＪＡ−２０ロ ーター）してベレットにした。核ペレットをトリス緩衝液（２４ｍＬ）に再懸濁 し、再度ホモジナイズしてベレットにし、全上清を集めた。

集めた溶解物を、１Ｇ　＋ｇＬずつにわけ、カップホルンソニケーターＣｃｕｐ ｈｏｒｎ　５ｏｎｉｃａｔｏｒ）で、中程度の出力で、３　ｘ　３０分音波処理 した。音波処理された溶解物（１５ｍＬ）を、５Ｗ２８遠心チューブ中で、１７ ＩＬのスクロースクッション（３６％）に重ねて、４℃で８０分間、１３，５０ ０　ｒｐ■で遠心分離してウィルスをベレットにした。そのウィルスベレットを １　！ＳＬのトリス緩衝液（１ｍＭトリスＨＣＩ、　ｐＨ９，０）に再懸濁し、 −８０℃で凍結した。

支息史呈 （インビトロ産生物とインビボ産生物との比較）（Ａ）　ＥｌおよびＥｌを、上 記実施例１に記載のベクターを用いて、インビトロおよびインビボの両方で発現 させ、３５Ｓ−Ｍｅｔ標識した。Ｂ１０−４０およびヘラ細胞を、インビボ発現 用にｒＶＶベクターに感染させた。培地および細胞溶解物を組換えタンパク質に ついて試験した。産生物は、ヒトＨＣＶ免疫血清により免疫沈降させ、一方、イ ンビトロタンパク質は直接分析した。得られたタンパク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥに より分析した。

網状赤血球（ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ）発現系（ＨＣＶ（Ｓ／Ｂ＞ある４ｔは ＨＣＶ（Ａ／Ｂ）を有するｐＧＥＭ３Ｚ）は、それぞれ分子量１８　ｋＤ１３５ 　ｋＤおよび７２　ｋＤを有するＣ、　ＥｌおよびＥｌを産生した。Ｂ１０−４ ０およびヘラ細胞の溶解物を、同じタンパク質を提示するＨＣＶ（Ｓ／Ｂ＞、Ｈ ＣＶ　（Ａ／Ｂ）あルイはＣ−Ｅｌ（Ｓ／Ｂ）を有するｒｖｖテトランスフエト した。網状赤血球系は効率のよいゴルジブロセッシングを供給せず、従ってシア ル酸を供給しないので、インビトロおよびインビボ産生物が等しい移動度を示す 事実は、タンパク質がインビボにおいてシアル化されていないことを示唆する。

ＴＰＡ−ＮＳＩを有するｒＶＶベクターは、Ｅｌの細胞外分泌を促し、これはシ アル化に一致する移動度の変化を示した。

（Ｂ）　ＭＣＩ／（Ｓ／Ｂ）を、インビトロで発現させ、ピオチン化レクチンの パネルとインキユベートした。すなわち、ＧＮＡ、　ＳＮＡ。

ＰＮＡ、　ＷＧＡおよびＣｏｎＡｏ　イン＋１ベージコンの後、複合体をアビジ ン−アクリルビーズ上に集めて、洗浄し、Ｌａｅ■ｍｌｉ試料緩衝液で溶出し、 ５ＯＳ−ＰＡＧＥで分析した。結果は、ＥｌおよびＥｌがＧＮＡおよびＣｏｎＡ に結合したことを示した。このことはマンノースの存在を示している。ＧＮＡは 末端マンノース基に結合し、一方、ＣｏｎＡはα結合マンノースに結合する。５ ＮＡＳＰＮＡおよびＷＧＡに結合しないことは、タンパク質がシアル酸、ガラク トース−Ｎ−アセチルガラクトサミン、あるいはＮ−アセチルグルコサミンを含 まないことを示す。

（Ｃ）放射標識Ｅ１およびＥｌを、ＨＣＶ（Ｓ／Ｂ）　（ｖｖ／５ＣＩＩ−ＨＣ Ｖ）を有するｒＶＶに感染させることによりＢ１０−４０中に産生じ、ヒトＨＣ ｖ゛免疫血清で免疫沈降させた。免疫沈降させた物質の半分をノイラミニダーゼ で一晩処理して、すべてのシアル酸を除去した。処理後、処理および未処理タン パク質を５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。移動度には有意な差は観察されなかった 。このことはインビボではシアル化はされていないことを示す。

（Ｄ）放射標識Ｅ１およびＥｌを、■ｃｖ（Ａ／Ｂ）　（ｖｖ／５Ｃ５９−ＨＣ Ｖ）を有するｒＶＶに感染させることによりＢ１０−４０細胞中に産生し、コン トロールとしてＨＣＶ配列を含まないｖｖ／５ＣＩＩを用いて、ヒトＦｆＣＶ＋ 血清で免疫沈降さるか、あるいはアクリルビーズに結合されたビオチン化ＧＮＡ レクチンにより沈澱させた。沈澱物を５ＯＳ−ＰＡＧＥで分析した。データーは 、ＥｌおよびＥｌが、ｖｖ／５Ｃ５９−ＨＣｖ感染細胞中の主要なマンノース末 端タンパク質種であることを実証した。ＧＮＡは、ＥｌおよびＣ２を細胞培養培 地から沈澱させるのに、ヒト抗血清と同程度に有効である。２５　ｋＤの成分が 観察されたが、これはワクシニア感染細胞に特異的であるようだ。

実Ｗ主 （レクチンを用いた精製） （Ａ、）ヘラＳ３細胞に、精製高力価ｖｖ／５Ｃ５９−ＨＣＶウィルスのストッ クを、５　ｐｆｕ／細胞の感染多重度で接種し、混合物を３７℃で３０分間攪拌 した。次に、感染細胞を８Ｌの攪拌培地を入れた攪拌フラスクコに移し、３７℃ で３日間インキコベートした。再度、細胞を遠心分離により集めて、氷上で低張 緩衝液（２０■Ｍ　ＨＥＰＥＳ、　１０　ｄ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＭｇＣｌ２． １２０　ｍＬ）に再懸濁させた。

次に、細胞をＤｏｕｎｃｅ　Ｈｏ＋ａｏｇｅｎｉｚｅｒ　（５０Ｘトローク）で ホモジナイズし、核を遠心分離（５分間、１６００　ｒｐｍ、　４℃、ＪＡ−２ ００−ター）してベレットにした。ベレットを集めて、４８　ｒａＬの低張緩衝 液に再懸濁し、再度ホモジナイズし、再度遠心分離し、再度集めて、−８０°Ｃ で凍結した。

次に、凍結上清を解凍して、核溶解後のミクロソーム膜画分を、ＪＡ−２００− ターでの１３，５００　ｒｐｍ、　４℃における２０分間の遠心分離により単離 した。上清を吸引して除去した。

ベレットを、９６ｍＬの界面活性剤緩衝液（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００　 ＩＤＭ　ＮａＣ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１　ｍＭ　ＤＤＴ、０．５％トリ　トン Ｘ−１００、ｐ１１？、５）に取り出し、ホモジナイズ（５０ストローク）した 。生成物を、１３．５００　ｒｐ■、４℃における２０分間の遠心分離により透 明にし、上清を集めた。

ＧＮＡ−アガロースカラム（１ｃｍ　ｘ　３　ｃｍ、　３　Ｂ　ＧＮＡ／ｍｌ、 ヒ゛−ズ、６　ｍＬベッド容量、Ｖｅｃｔｏｒ　Ｌａｂｓ、　Ｂｕｒｌｉｎｇａ ｍｅ、　ＣＡ）を界面活性剤緩衝液で予め平衡化した。上清試料を４℃で１６− ２０時間、流速１　ｍＬ／分で繰り返し循環（ｒｅｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）に よりカラムにかけた。次に、カラムを界面活性剤緩衝液で洗浄した。

精製Ｅｌ／Ｅ２タンパク質を、流速０．５ｍＬ／分でα−Ｄ−マンノシド（界面 活性剤緩衝液中０．９Ｍ）により溶出した。Ｅ　１／Ｅ　２が溶出液中に出現し たとき溶出を停止し、カラムを２−３時間前度平衡化した。画分をウェスタンプ ロットおよび銀染色により分析した。ピーク画分を集め、ＵＶ照射して残存する ワクシニアウィルスを不活性化した。

（Ｂ）　ＧＮＡ−７カロース精製のＥｌおよびＣ２アシアロ糖タンパク質を２０ −６０％グリセロールグラジェントで沈澱させた。グラジェントにかけたものを 分画し、タンパク質を５Ｏ５−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングにより 分析した。プロットをＧＮＡでプローブしてＥｌおよびＣ２を同定した。得られ た結果により、Ｅｌ：Ｃ２ヘテロダイマーの存在が示され、これは予測された速 度で沈澱する（すなわち、１１０　ｋＤタンパク質の位置の特徴）。

ＨＣＶエンベロープタンパク質のより大きな凝集体もまた出現する。Ｃ２：Ｃ２ ホモダイマーもまた出現した。分別したＥｌ：Ｃ２種もまた検出されたが、　Ｃ ２が、Ｅｌに比較してより大きな種であって、重なって再出現したようであった 。より大きな凝集体は、チログロブリンマーカーより有意に速（沈澱した。

（Ｃ）　ＧＮＡ−アガロース精製の６１およびＥ、２を、ｌ　ｄ　ＥＤＴＡを含 有する２０−６０％グリセロールグラジェントにより沈澱させた。

画分を、β−メルカプトエタノール（βＭＥ）の存在および不存在で５ＤＳ−Ｐ ＡＧＥにより分析した。βＭＨの存在あるいは不存在でのＥｌおよびＣ２の外見 上の量には、はとんどあるは全く相違は観察されなかった。このことは、ヘテロ ダイマー間のジスルフィド結合がないことを示す。

（Ｄ）　Ｅｌ／２２ｍ合体く純度約４０％）を、Ｃｏｕｌｔｅｒ　ＤＭ−４サブ ミクロン粒子分析機で分析した。２２０−６０ｎレンジで物質を検出した。

（Ｅ）　Ｅｌ／Ｅ２？！！合体（純度約４０％）を、ホスホタングステン酸によ るネガティブ染色で電子顕微鏡により分析した。電子顕微鏡写真は、直径約４０ ｎｍの球状形の粒子の存在を示した。Ｅ１／Ｅ２複合体をＨＣＶ”　ヒト免疫血 清とインキユベートし、次に、ネガティブ染色でＥＭにより分析をした。大きな 凝集体を有する抗体複合体および小さな粒子を観察した。

尖鳳且ま （クロマトグラフフィーによる精製） （Ａ）実施例３に記載のように調製したＧＮＡレクチン精製物質（０，５−（１ ，１１ｍＬ）を１０　ｘ緩衝液Ａ（２０ｍＭ）リス−Ｃ１緩衝液、ｐＨ８，０， Ｉ　ＩＤＭ　ＥＤＴＡ）で希釈し、緩衝液Ａで平衡化した、１．８ｘ　１．５　 ＣｍのＦｒａｃｔｏｇｅｌ　ＥＭＤ　ＤＥＡＥ−６５０（ＥＭ　５ｅｐａｒａｔ ｔｏｎｓ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、　Ｎｅｗ　Ｊｅｒｓｅｙ、カタログ番号１６１ １１１３）にかけた。Ｅｌ／Ｅ２を含むタンパク質画分を、同じ緩衝液で流速０ ．２ｍＬ／分で溶出し、ｌ　ｍＬずつの画分を集めた。ＥｌおよびＣ２を含む画 分（５ＤＳ−ＰＡＧＥで決定した）を集めて、−８０℃で凍結した。

（Ｂ）上記パート（Ａ）で精製した物質は、５ＯＳ−ＰＡＧＥによる評価で、６ ０−８０％の純度を有する。推定Ｅ１およびＣ２のバンドの同定は、転移法（ｔ ｒａｎｓｆｅｒ　ｔｅｃｈｎｔｑｕｅ）を用いた後のト末端配列分析により確認 した。実際には、ｆｒａｃｔｏｇｅｌ−ＤＥＡＥ精製のＥｌ／Ｅ２物質を、Ｌａ ｅｉｔｌｆ緩衝液（ｐＨ６，８，０，０６Ｍ　＋−リス−ＣＩ、２．３％ＳＤＳ 、　１０％グリセロール、０．７２　Ｍβ−メルカプトエタノール）を加えて還 元し、３分間煮沸した。次に、試料を１０％ポリアクリルアミドゲルにのせた。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質を、０．２μｍのポリビニリデンジフルオライ ド（ＰＶＤＦ）　膜（Ｂｉｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｒｆｃｈ ｍｏｎｄ、　ＣＡ）に移した。予測される推定Ｅ１およびＣ２タンパク質のバン ドをプロットから切り出し、ト末端アミノ酸分析を行った。物質の調製の間のア ミノ末端のブロックを妨げることは特別にはしなかった。最初の１５サイクルで 、Ｅ１試料は、Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｘ−３ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ −Ｘ−Ｔｙｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｘ−Ａｓｎ−Ａｓｐの配列を有し、一方、Ｃ２ の配列は、Ｔｈｒ−Ｈｉ　５−Ｖａ　ｔ−Ｔ　ｈｒ−Ｇ　１　ｙ−Ｘ−Ｘ−Ａ　 ｌ　ａ−Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｈｉ　５−Ｘ−Ｖａ　１−Ｘ−Ｇ　１　ｙ−Ｐｈｅである ことを示した。このアミノ酸配列のデーターは、ＤＮＡ配列に対して予測された 配列と一致する。

上記のｆｒａｅｔｏｇｅｌ−ＤＥＡＥクロマトグラフィーによる精製Ｅｌ／Ｅ２ 産物は、ゲル透過クロマトグラフ　イーＢｆｏＳｆｉｌ　ＴＳＫ−４０００ＳＶ Ｉカラムの排除容積領域に、多重のＥｌおよびＣ２がともに溶出する事実によっ て明確にされるように、凝集されると考えられる。このことは、天然条件下では 、有意量のＥｌ／Ｅ２複合体は、少なくとも８００ｋＤの分子量を有することを 示す。分子量約６５０ｋＤのＥｌ／Ｅ２物質もまた観察された。

補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｅ１およびＥ２からなる群より選択される、単離ＨＣＶアシアロ糖タンパク 質。
2. ２．前記Ｅ１アシアロ糖タンパク質が、組換えＥ１である、請求項１に記載のア シアロ糖タンパク質。
3. ３．前記Ｅ１アシアロ糖タンパク質が、組換えＥ２である、請求項１に記載のア シアロ糖タンパク質。
4. ４．ワクチンあるいはイムノアッセイに使用するために適したＨＣＶアシアロ糖 タンパク質を産生する方法であって、Ｅ１およびＥ２からなる群より選択される ＨＣＶアシアロ糖タンパク質をコードする構造遺伝子で形質転換された下等真核 生物を適切な培養培地中で増殖させる工程；該構造遺伝子を発現させる工程；お よび該ＨＣＶアシアロ糖タンパク質を該細胞培養物から回収する工程； を包含する、方法。
5. ５．前記下等真核生物が酵母である、請求項４に記載の方法。
6. ６．ワクチンあるいはイムノアッセイに使用するために適したＨＣＶアシアロ糖 タンパク質を産生する方法であって、Ｅ１およびＥ２からなる群より選択される ＨＣＶアシアロ糖タンパク質をコードする構造遺伝子で形質転換された哺乳類宿 主細胞を適切な培養培地中で増殖させる工程；該構造遺伝子を、シアル化を阻害 する条件下で発現させる工程；および 該ＨＣＶナシアロ糖タンパク質を該細胞培養物から回収する工程； を包含する、方法。
7. ７．前記シアル化を阻害する条件が、小胞体からゴルジ体への糖タンパク質の移 送を阻害するのに十分な割合でのＥ１あるいはＥ２の発現を含む、請求項６に記 載の方法。
8. ８．前記シアル化を障害する条件が、 宿主細胞の小胞体内にタンパク質を放出するのに十分な量のカルシウムモジュレ ーターの存在；を含む、請求項６に記載の方法。
9. ９．ＨＣＶアシアロ糖タンパク質を精製する方法であって、ＨＣＶアシアロ糖タ ンパク質を含有する組成物をマンノース結合タンパク質に接触させる工程；およ び該マンノース結合タンパク質と結合する該組成物の部分を単離する工程； を包含する、方法。
10. １０．前記マンノース孝吉合タンパク質が、ＣｏｎＡおよびＧＮＡからなる群よ り選択されるレクチンである、請求項９に記載の方法。
11. １１．請求項９に記載の方法であって、前記接触させる工程が、支持体に固定化 されたマンノース結合レクチンを有するカラム中で、ＨＣＶアシアロ糖タンパク 質を含有する前記組成物を、少なくとも１時間の間インキュベートすることを包 含し；そして 前記単離する工程が、マンノースを有する該ＨＣＶアシアロ糖タンパク質を溶出 する工程； を包含する、方法。
12. １２．固体支持体、マンノース結合タンパク質、およびＨＣＶアシアロ糖タンパ ク質に特異的な抗体を含み、該抗体およびレクチンの１つが該固体支持体に結合 されている、ＨＣＶアシアロ糖タンパク質の存在を検出するためのアッセイキッ ト。
13. １３．ＨＣＶの露出あるいは感染を決定する方法において、体液試料中のいかな るＨＣＶも、アッセイ前に、マンノース結合タンパク質に接触させることにより 濃縮される、方法。
14. １４．ＨＣＶアシアロ糖タンパク質の組換え発現用のベクターで形質転換された 細胞であって、該ベクターが、グリコシル化シグナルＨＣＶアシアロ糖タンパク 質該宿主細胞中で機能し得、そしてＨＣＶアシアロ糖タンパク質の発現を調節し 得る調節配列および選択マーカーをコードする構造遺伝子を有し、該細胞が糖タ ンパク質をシアル化しない、細胞。
15. １５．前記細胞が、グリコシル化欠損酵母株である、請求項１４に記載の細胞。
16. １６．前記ベクターが、ワクシニアウイルスベクターを有する、請求項１４に記 載の細胞。
17. １７．血漿、血清または他の生物学的液体中のＨＣＶの存在を減少あるいは消滅 させる方法であって、該生物学的液体を、マンノース末端糖タンパク質に特異的 なマンノース結合タンパク質に接触させる工程；および 該生物学的液体を該マンノース結合タンパク質から分離する工程； を包含する、方法。
18. １８．動物中での免疫応答を誘発する方法であって、薬学的に受容可能な賦形剤 中にＨＣＶアシアロ糖タンパク質の有効量を含むワクチン組成物を提供する工程 ；該ワクチン組成物を該動物に投与する工程；を包含する、方法。
19. １９．精製ＨＣＶＥ１／Ｅ２アシアロ糖タンパク質凝集体を含む、ＨＣＶアシア ロ糖タンパク質組成物。
20. ２０．細胞培養でＨＣＶを増殖する方法であって、（ａ）マンノースレセプター およびアシアロ糖タンパク質レセプターからなる群より選択されるレセプターを 発現する細胞を供給する工程； （ｂ）該細胞をＨＣＶに感染させる工程；および（ｃ）該感染細胞を培養する工 程； を包含する、方法。